EFAR - Diss - Priscila Gomes Reis - Teses e Dissertações

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
(CIPHARMA)
TOXI CI DADE DO ARSÊNI O E DO ANTI M ÔNI O
TRI VALENTES: I NFLUÊNCI A DA ENCAPSULAÇÃO
EM LI POSSOM AS E DA ASSOCI AÇÃO AO ÁCI DO
ASCÓRBI CO
PRISCILA GOMES DOS REIS
Ouro Preto ± MG ± Brasil
2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
(CIPHARMA)
TOXI CI DADE DO ARSÊNI O E DO ANTI M ÔNI O TRI VALENTES:
I NFLUÊNCI A DA ENCAPSULAÇÃO EM LI POSSOM AS E DA ASSOCI AÇÃO
AO ÁCI DO ASCÓRBI CO
PRISCILA GOMES DOS REIS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da
Universidade Federal de Ouro Preto para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Drª Neila Márcia Silva Barcellos
Co-orientadoras: Profa. Dra. Andrea Grabe Guimarães
Profa. Dra. Mônica Cristina Teixeira
Ouro Preto ± MG ± Brasil
2010
Priscila Gomes dos Reis
I
R375TReis, Priscila Gomes dos.
Toxicidade do arsênio e do antimônio trivalentes[manuscrito]: influência da
encapsulação em lipossomas e da associação ao ácido ascórbico / Priscila
Gomes dos Reis–2010.
xxi, 122f.: il. color.; graf.; tab.
Orientadora: ProfªDrªNeila Márcia Silva Barcellos.
Coorientadoras: ProfªDrªAndréa Grabe Guimarães.
ProfªDrª Mônica Cristina Teixeira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
1. Toxicidade - Teses. 2. Arsênio - Teses. 3. Antimônio - Teses. 4.
Lipossomas - Teses. I. Barcellos, Neila Márcia Silva. II. Guimarães, Andréa
Grabe. III. Teixeira, Mônica Cristina. IV. Universidade Federal de Ouro
Preto. V. Título.
CDU: 615.9:602.628
Catalogação: [email protected]
´Que cada um considere a si mesmo, não como um homem
procurando satisfazer sua própria sede de conhecimento,...
mas como um colaborador numa grande obra comum
UHODFLRQDGDFRPRVLQWHUHVVHVVXSUHPRVGDKXPDQLGDGHµ
Hermann Von Helmholtz
II
Dedico este trabalho:
Aos meus pais, Celso e Lourdes,
com quem posso contar e compartilhar todos os momentos
e a quem devo profunda admiração e respeito.
Muito obrigada pela educação que me deram
e por terem feito de mim a pessoa que hoje sou;
À minha irmã, Daniela,
que sempre me dedicou profunda amizade
e esteve ao meu lado em todos os momentos
de alegrias e de dificuldades nesta trajetória.
III
AGRADECI M ENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a DEUS, que está comigo em todos os momentos,
principalmente nos mais difíceis, e por ter-me guiado a mais esta conquista;
À minha orientadora Profa. Neila Márcia Silva Barcelos que, com sua extrema sabedoria e
sensatez, me ensinou a extraordinária beleza em acreditar naquilo que se faz e fazer da ciência uma
ferramenta para ajudar a humanidade;
Às minhas co-orientadoras Profa. Andrea Grabe Guimarães e Profa. Mônica Cristina Teixeira
pela dedicação, discernimento, amizade e imprescindível colaboração durante a realização deste
trabalho. Sem vocês a conclusão deste não seria possível;
Aos colaboradores Profa. Cláudia, Profa. Jacqueline, Prof. Alexandre, equipe do laboratório
LGQA, em especial Adriana, Julio e Leonardo, equipe do LAPAC, em especial Roney, Cássio e
Adão, pela disponibilização de equipamentos e esclarecimentos durante este trabalho.
Aos membros da banca, Prof. Fréderic Frézard e Profa. Raquel Pilar, pela disponibilidade em
contribuir com este trabalho.
Aos alunos do Laboratório de Farmacologia Experimental, pelo auxílio precioso nos
experimentos e na análise dos dados e principalmente pela amizade , em especial Alessandra,
Camila, Carol Licio, Carol Moreira, Dani, Eduardo, Gustavo, Kelly, Kemile, Mariana, Miguel, Nívia
e Tâmara.
Aos colegas do mestrado pela amizade e companheirismo, em especial Renata, Patrícia e
Paola.
Ao Wilson pela ajuda no manejo dos animais e pela amizade.
À república Drosófila por ter me acolhido com tanto carinho durante a graduação e o
mestrado.
Aos amigos e familiares pelo apoio, compreensão e carinho dedicados.
A todas as instituições que possibilitaram a conclusão deste trabalho:
- Capes pela concessão da bolsa de estudos;
- Fapemig pelo suporte financeiro ao projeto (CDS - APQ-01186-09);
- Rede Mineira de Nanotecnologia pelos equipamentos e reagentes;
- UFOP por toda a minha formação acadêmica;
- Cipharma
IV
Resumo
RESUM O
O arsênio (As) e o antimônio (Sb) são semimetais há muito utilizados na terapêutica de enfermidades
sendo que estudos recentes demonstram sua efetividade no tratamento de leishmaniose,
esquistossomose e certos tipos de câncer. Estes fármacos apresentam várias semelhanças químicas e
biológicas que possivelmente explicam o fato de a forma trivalente destes ser considerada a mais
ativa na terapêutica e por outro lado a mais tóxica, principalmente sobre o sistema cardiovascular.
Esta toxicidade muitas vezes inviabiliza o uso terapêutico, provoca altos índices de não adesão dos
pacientes ao tratamento ou ainda torna necessário o uso de baixas doses, o que acarreta a
possibilidade do aparecimento de formas resistentes de agentes infecciosos. Sabe-se que o
desenvolvimento de novas formas farmacêuticas e a associação medicamentosa podem promover o
rejuvenescimento de fármacos através da diminuição de seus efeitos tóxicos e/ou aumento do
potencial terapêutico. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar, no modelo rato Wistar,
a possibilidade de redução da toxicidade, principalmente a cardiovascular, do arsênio e antimônio
trivalentes por administração concomitante com ácido ascórbico (AA) ou veiculação destes em
lipossomas. As preparações lipossomais contendo As ou Sb foram realizadas pelo método de
congelamento/descongelamento seguido de extrusão. Para identificação do teor de encapsulação
destes nos lipossomas um método de quantificação foi desenvolvido e validado utilizando
espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado. A eficiência de
encapsulação do arsênio nos lipossomas foi de 8,92%, com vesículas de tamanho médio de 232 nm,
índice de polidispersão 0,17 e potencial zeta ± 37,8 mV. A formulação lipossomal de Sb foi realizada
pelo nosso grupo de pesquisa, anteriormente a este trabalho, e apresentou coeficiente de
encapsulação de 14,5% com vesículas de tamanho médio de 149 nm e índice de polidispersão 0,014.
Alterações cardiovasculares nos sinais de pressão (PA) e eletrocardiograma (ECG) foram avaliadas
em protocolo agudo, através da administração, por via endovenosa em dose única, da dose máxima
tolerada pelos animais (6,5mg/Kg de As e 17,0mg/kg de Sb), dos compostos semi-metálicos em
estudo nas formas livre, lipossomal e associada ao ácido ascórbico. Foram identificados no grupo
que recebeu As livre, prolongamento do intervalo PR com variação máxima de 22,49%, redução da
pressão arterial sistólica e diastólica com variações percentuais máximas de -39,24% e -41,96%,
respectivamente, além de redução de 8 a 27% na freqüência cardíaca, não sendo, no entanto, esta
redução significativamente diferente do controle. Os animais que receberam As+AA apresentaram
prolongamento do intervalo PR com variação percentual máxima de 17,73% não tendo sido
observadas, porém, variações na pressão e freqüência cardíaca. Já nos animais tratados com a
V
Resumo
formulação lipossomal de As não foram observadas alterações significativas nos parâmetros do ECG
e pressão. Nos animais que receberam o Sb livre foi observado prolongamento do intervalo QT e
aumento do índice QTc com variações máximas de 21,95 e 19,42%, respectivamente, alem disso
observou-se redução na pressão arterial sistólica e diastólica com variações máximas de -41,56 e 50,35%, respectivamente. Por outro lado, nos grupos tratados com Sb associado ao AA e com o Sb
lipossomal não foram observadas alterações nos parâmetros avaliados. Realizou-se ainda, em
protocolo subagudo, a administração do As ou do Sb via intraperitoneal (doses de 3,8 mg/Kg e
3,5mg/Kg, respectivamente) durante 30 dias e posterior avaliação das toxicidades cardiovascular,
hepática, renal e hematológica, através de avaliação de ECG e pressão, dosagens bioquímicas,
realização de hemograma e analise histopatológica. No grupo que recebeu As livre foram observados
indícios de toxicidade cardiovascular tais como prolongamento dos intervalos QT, QTc e PR, na
ordem de variação de 44.49, 44,13 e 5,5% respectivamente, além de degeneração hialina, edema,
discreta inflamação e vacuolização de vasos no tecido cardíaco. Na avaliação da toxicidade hepática
observou-se diminuição de fosfatase alcalina e presença de alargamento de sinusóides, congestão e
discreta inflamação no tecido. Já na análise hematológica observou-se redução de linfócitos. No
grupo que recebeu AA juntamente com o As, observou-se prolongamento de QT e Qtc com variações
de 24,09 e 21,89% respectivamente as quais se mostraram significativamente menores quando
comparadas às variações do grupo que recebeu somente As, além disso, não foram observadas
quaisquer alterações no tecido cardíaco. A análise do tecido hepático também mostrou normalidade e
ocorreu diminuição de fosfatase alcalina. Na análise hematológica observou-se aumento de linfócitos
e diminuição de neutrófilos. No grupo tratado somente com Sb também foram observados indícios
de toxicidade cardiovascular como prolongamento dos intervalos QT, QRS e índice QTc, na ordem
de 33,67, 11,62 e 21,6%, respectivamente, e na análise do tecido cardíaco foram observadas as
mesmas alterações relatadas para o arsênio só que em maior intensidade, além de necrose. Alterações
indicativas de toxicidade hepática foram encontradas na análise histopatológica (necrose, congestão
e inflamação discreta) e na análise bioquímica com o aumento de fosfatase alcalina. O grupo que
recebeu Sb e AA também apresentou alterações em QT e QTc, com variação de 26,44 e 19,46%
respectivamente. No entanto, estas são significativamente menores quando comparadas às do grupo
tratado somente com Sb. Além disso, não foram observadas alterações histológicas, bioquímicas e
hematológicas neste grupo. Assim, foi possível concluir que a veiculação do As e do Sb em
lipossomas e a associação destes com o AA podem ser consideradas potenciais ferramentas na
diminuição dos efeitos tóxicos provocados por estes semimetais no estado trivalente.
VI
Abstract
ABSTRACT
Arsenic (As) and antimony (Sb) are semimetals that were widely used to treat diseases and recent
studies have demonstrated its effectiveness in the treatment of leishmaniasis, schistosomiasis and
some specific types of cancer. These compounds have many chemical and biological similarities that
may explain the therapeutics activity and also the toxic effects, especially on the cardiovascular
system, of their trivalent form. This toxicity often restrain the therapeutic use, causes treatment
abandonment by patients and requires the use of low doses, resulting in long-term treatments and
greater possibility of infectious agents resistant form occurence. It is known that the development of
new pharmaceutical forms and therapy using drugs combination can promote the drugs rejuvenation
by reducing their toxic effects and / or enhancing its therapeutic potential. The present study aimed
to evaluate, model, the possible toxicity reduction, mainly the cardiovascular toxicity in Wistar rats,
of As and Sb trivalent forms administrated simultaneously with ascorbic acid or encapsulated in
liposomes. The encapsulation of As or Sb was carried out by freeze-thawed and extrusion. To
identify the content of As and Sb encapsulation in liposomes, a method of quantification was
developed and validated using inductively coupled plasma/optical emission spectrometry (ICPOES). The encapsulation efficiency of 15,5% of As into liposomes was obtained, with a medium size
of 232 nm, polydispersity index of 0.17 and zeta potential -37.8 mV. The liposomal formulation of
antimony was carried out by our research group, prior to this work, and showed encapsulation
efficiency of 14.5 %, with a medium size of 149 nm, polydispersity index of 0.014. Cardiovascular
FKDQJHV LQ WKH SUHVVXUH¶V VLJQV $3 DQG HOHFWURFDUGLRJUDP (&* ZHUH HYDOXDWHG in acute and
subacute protocols. The first was carried out using a single dose administration of 6.5 mg/Kg of As
and 17 mg/kg of Sb, in free or liposomal form or associate with ascorbic acid (AA). In animals that
received As in free form was observed PR interval increases of 22.49 %, reduction of systolic (ASP)
and diastolic pressure (ADP) of 39.24% and 41.96%, respectively. The animals that received As with
AA presented 17.73 % of PR interval increasing, but AP did not change. The animals that received
liposomal As did not presented significant changes in ECG parameters and AP. The free antimony
induced 21.95 % and 19:42 % of QT interval and QTc index increase respectively, and reduction of
SAP and DAP, maximum of -41.56 and -50.35 %, respectively. Moreover, the groups treated with
Sb and AA, and liposomal Sb did not present significant changes of the cardiovascular parameters
evaluated. In the subacute protocol, As or Sb were i.p. administrated at dose 3.8 mg/kg and
3.5 mg/kg, respectively, during 30 days and after that it was evaluated the cardiovascular (AP and
ECG), and hematological (hemogram) toxicities, and for liver and kidney, the biochemical and
VII
Abstract
histopathological analysis were done. As free form induced cardiovascular toxicity, observed by the
increase of QT (44.49 %), QTc (44.13 %) and PR (5.5 %), and hyaline degeneration, oedema, mild
vacuolization and inflammation of heart tissue blood vessels. The blood analysis showed a reduction
of lymphocytes. The liver evaluation showed decrease of alkaline phosphatase and presence of
enlargement of sinusoids, congestion and mild inflammation in the tissue. AA was able to reduce the
increase of QT (24.09 %) and QTc (21.89 %) induced by As, and there was not histological
alterations of cardiac tissue. The AA also contributed to normal liver tissue and significant decrease
of alkaline phosphatase. The blood analysis revealed an increase of lymphocytes and decreased
neutrophils in AA with As treated animals. The Sb free form also increased QT (33.67 %), QTc
(21.6 %) and QRS (11.62 %) intervals, and the cardiac tissue presented the same changes reported
for As, however with greater intensity and with necrosis. The liver toxicity was observed by the
presence of necrosis, congestion and mild inflammation, and alkaline phosphatase increase. AA The
group that received Sb with showed increase of QT and QTc of 26.44 and 19.46 % respectively,
values significantly smaller than the group treated only with Sb. In addition, there were no
histological, biochemical and hematological changes in this group. Thus, we conclude that the
delivery of As and Sb in liposomes and their association with ascorbic acid may be considered
potential tools in reducing the toxic effects caused by these semimetals in the trivalent oxidation
state.
VIII
Í ndice de figuras
Í NDI CE DE FI GURAS
Figura 1: Mecanismo de ação e resistência dos antimoniais pentavalentes em amastigotas de
Leishmania. Adaptado: Leishmaniasis: drugs in the clinic, resistance and new developments.
Marc Ouellette, Jolyne Drummelsmith, Barbara Papadopoulou (2004).........................................10
Figura 2: Desenho esquemático da metabolização intracelular do ácido ascórbico. APX
(ascorbato peroxidase), ASC (ascorbato), MDA (monodehidroascorbato), MDAR (
monodehidroascorbato redutase), DHA ( dehidroascorbato), DHAR ( dehidroascorbato redutase),
GSSG (glutationa oxidada), GR (glutationa redutase), GSH (glutationa)......................................12
Figura 3: Aparelho ICP/OES da Spectro Ciros.............................................................................21
Figura 4: Desenho esquemático do processo de preparação dos lipossomas................................22
Figura 5: Leituras de arsênio (A) e antimônio (B) em ICP OES. A leitura correspondente à
amostra de lipossomas vazios é a verde em (A) e a azul escuro em (B)........................................25
Figura 6: Sistema de aquisição dos sinais de ECG e PA...............................................................37
Figura 7: Traçado normal do ECG e seus intervalos ....................................................................38
Figura 8: Desenho esquemático do protocolo experimental agudo. (A) Protocolo agudo para os
grupos As, Sb, PBS, AA, Lipossoma As, Lipossoma Sb, Lipossoma Branco; (B) Protocolo agudo
para os grupos, Sb+AA, As+AA.....................................................................................................41
Figura 9: Desenho esquemático do protocolo experimental subagudo.........................................42
Figura 10: Curva padrão de arsênio obtido por ICP/ OES............................................................43
Figura 11: Registro gráfico da análise de tamanho dos lipossomas contendo Arsênio.................44
Figura 12: Registro gráfico do potencial zeta dos lipossomas contendo Arsênio.........................45
Figura 13: Espectro Xanes de amostras de lipossomas contendo arsênio. Eo ± Borda de absorção
do As...............................................................................................................................................47
IX
Í ndice de figuras
Figura14: Parâmetros do ECG em animais antes e após administração IV de As (A) As+AA (B) e
Lipossoma As (C). .........................................................................................................................49
Figura 15: Variação percentual dos intervalos PR e QRS do ECG. Os valores representam a
média ± e.p.m.* P < 0,05 em relação ao grupo PBS e #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma
branco ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ...............................................................................50
Figura 16: Variação percentual do intervalo QT do ECG e índice QTc. Os valores representam a
média ± e.p.m. ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ..................................................................51
Figura 17: Exemplos de registro de pressão arterial ao longo do tempo após administração IV de
PBS (A); As (B); As+AA (C); e Lipossoma As (D). ......................................................................52
Figura 18: Variação percentual de PAD, PAS e FC. Os valores representam a média ± e.p.m. * P
< 0,05 em relação ao grupo PBS; #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco e + P< 0,05 em
relação ao grupo As± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ...........................................................53
Figura 19: Ilustração de ECG obtido após administração IP. de As (A) e As+AA (B). ................55
Figura 20: Variação percentual dos parâmetros, PR, QRS, QT, QTc, após tratamento sub-agudo.
Os valores representam a média ± e.p.m. * P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.........56
Figura 21: PAS PAD e FC após tratamento subagudo.Os valores representam a média ± e.p.m.57
Figura 22: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e
AA (B), As (C), As+AA (D). Hematoxilina Eosina, 40X. .............................................................58
Figura 23: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA
(B), As (C), As+AA (D). Observa-se em A, B, e D aspecto histológico compatível com
normalidade. Em C observa-se foco inflamatório discreto, alargamento de sinusóides e congestão
(setas). Hematoxilina Eosina, 40X. ................................................................................................60
Figura 24: Parâmetros do ECG antes e após administração IV de Sb (A), e Sb+AA (B).............64
Figura 25: Variação percentual dos intervalos PR e QRS do ECG. Os valores representam a
média ± e.p.m.± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ...................................................................65
X
Í ndice de figuras
Figura 26: Variação percentual do intervalo QT do ECG e do índice QTc. Os valores representam
a média ± e.p.m. * P < 0,05 em relação ao grupo PBS, #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma
branco e + P < 0,05 em relação ao grupo Sb+AA ± ANOVA, seguido de teste de Tukey..............66
Sb (A) e Sb+AA (B). ......................................................................................................................67
Figura 28: Variação percentual de PAS, PAD eFC. Os valores representam a média ± e.p.m* P <
0,05 em relação ao grupo PBS, #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco e + P < 0,05 em
relação ao grupo Lipossoma Sb e &P<0,05 em relação ao grupo Sb+AA ± ANOVA, seguido de
teste de Tukey. ................................................................................................................................68
Figura 29: Parâmetros do ECG antes e após tratamento subagudo com Sb (A), e Sb+AA(B).....69
Figura 30: Variação percentual dos intervalos do ECG e FC, após tratamento subagudo. Os
valores representam a média ± e.p.m..* P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey...............70
Figura 31: PAS, PAD E FC após tratamento subagudo dos grupos Sb e Sb +AA . Os valores
representam a média ± e.p.m.*P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.............................71
Figura 32: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e
tratados com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Hematoxilina
Eosina, 40X. *Degeneração hialina em várias células musculares; Setas indicam pequeno grupo
de células inflamatórias (seta) e o pontilhado área de necrose em C..............................................72
Figura 33: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados
com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Observa-se em A, B, D
aspecto histológico compatível com normalidade. Em C observa-se área de necrose e inflamação
(pontilhada), alargamento de sinusóides e congestão (setas). Hematoxilina Eosina, 40X.............74
XI
Í ndice de tabelas
Í NDI CE DE TABELAS
Tabela 1: Parâmetros instrumentais do ICP/OES ...............................................................................20
Tabela 2: Curva analítica do antimônio (Sb) ......................................................................................26
Tabela 3: Curva analítica do arsênio (As) ..........................................................................................26
Tabela 4: Teste de variância para a linearidade...................................................................................27
Tabela 5: Resultados do estudo de repetibilidade ...............................................................................28
Tabela 6: Resultados do estudo de precisão intermediária .................................................................28
Tabela 7: Dados estatísticos do teste t de Student ..............................................................................28
Tabela 8: Dosagem de Arsênio em amostras de lipossomas. Valores expressos em média± erro
padrão. .................................................................................................................................................43
Tabela 9: Diâmetro médio e índice de polidispersão da população de lipossomas. Valores expressos
em média± erro padrão. .......................................................................................................................44
Tabela 10: Potencial zeta das amostras de lipossomas. Valores expressos em média± erro padrão...45
Tabela 11: Parâmetros indicadores de estabilidade da formulação de lipossomas contendo arsênio no
período de 30 dias. ..............................................................................................................................46
Tabela12: Parâmetros indicadores da liberação do arsênio dos lipossomas a 37°C. .........................46
Tabela 13: Percentagem (%) de óbitos de animais que receberam solução de arsênio via IV............48
Tabela 14: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar
submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico. ...........59
Tabela 15: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar
submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico.............59
XII
Í ndice de tabelas
Tabela 16: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade renal avaliados em ratos Wistar
submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico.............61
Tabela 17: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos tratados com As submetidos ao
tratamento subagudo. ..........................................................................................................................62
Tabela 18: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar
submetidos ao tratamento subagudo com Sb. .....................................................................................73
Tabela 19: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar
Tabela 20: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade renal avaliados em ratos Wistar
Tabela 21: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos submetidos ao tratamento
subagudo com Sb. ...............................................................................................................................76
Tabela A1: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de PBS. Média
± e.p.m. ..............................................................................................................................................111
Tabela A2: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Lipossoma
branco. Média ± e.p.m. ......................................................................................................................112
Tabela A3: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de AA . Média
± e.p.m.. .............................................................................................................................................113
Tabela A4: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de As. Média ±
e.p.m.. ................................................................................................................................................114
arsênio. Média ± e.p.m. .....................................................................................................................115
Tabela A6: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de As+AA.
Média ± e.p.m. ...................................................................................................................................116
XIII
Í ndice de tabelas
Tabela A7: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos de As do
protocolo subagudo. Média ± e.p.m. ............................................................................................... 117
Tabela A8: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Sb. Média ±
e.p.m. .................................................................................................................................................118
Sb. Média ± e.p.m. ...........................................................................................................................119
Tabela A10: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Sb+AA.
Média ± e.p.m. ...................................................................................................................................120
Tabela A11: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos Sb do
protocolo subagudo. Média ± e.p.m. .................................................................................................121
XIV
Í ndice de abreviaturas
Í NDI CE DE ABREVI ATURAS
AA
Ácido ascórbico
ALT
Aspartato alaninatransferase
APL
Leucemia promielocítica aguda
APX
Ascorbato peroxidase
AQP1
Aquaglicerporina de tipo 1
As
Arsênio
ASC
Ascorbato
AST
Aspartato aminotransferase
ATP
Adenosina trifosfato
bpm
Batimentos por minuto
BPR
Vermelho de Bromopirogalol
CDC
Centro de controle de doenças
CHOL
Colesterol
CKMB
Creatino quinase fração MB
DHA
Dehidroascorbato
DHAR
Dehidroascorbato redutase
DNA
Ácido desoxiribonucleotídeo
DSPC
Distearoil-fosfatidilcolina
DSPE
Distearoil-fosfatidiletanolamina
ECG
Eletrocardiograma
EE
Eficiência de encapsulação
EPM
Erro padrão médio
FA
Fosfatase Alcalina
FC
Frequência cardíaca
FDA
Food and Drug Administration
XV
GR
Glutationa redutase
GSH
Glutationa reduzida
GSSG
Glutationa oxidada
GTP
Guanosina trifosfato
GVS
Lipossomas gigantes
HE
Hematoxicilina-Eosina
ICH
Harmonised Tripatite Guideline
ICP-MS
Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado
ICP-OES
Espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado
INCA
Instituto Nacional do Câncer
IP
Intraperitoneal
IV
Intravenoso
LD
Limite de detecção
LQ
Limite de quantificação
LQTS
Síndrome do intervalo QT longo
LUVs
Lipossomas unilamelares grandes
MDA
Monodehidroascorbato
MDAR
Monodehidroascorbato redutase
MLVs
Vesículas mutilamelares pequenas
MRP
Proteína associada a multirresistência a fármacos
NADH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
OMS
Organização Mundial da Saúde
PA
Pressão arterial
PAD
Pressão arterial diastólica
PAS
Pressão arterial sistólica
XVI
PC
Fosfatidil colina
PE
Fosfatidiletanolamina
PEG
Polietilenoglicol
PLGA
Copolímero de ácido lático e glicólico
PML
Proteína de leucemia promielocítica
ROS
Espécies reativas de oxigênio
Sb
Antimônio
SCV
Sistema Cardiovascular
SIDA
Doença da imunodeficiência adquirida
SNA
Sistema Nervoso Central
SUVs
Lipossomas unilamelares pequenos
T(SH)2
Tripanotiona reduzida
TDR1
Enzima redutase dependente de tiol
TOA ou ATO
Trióxido de arsênio
XVII
Sumário
SUM ÁRI O
RESUM O.............................................................................................................................................V
ABSTRACT......................................................................................................................................VII
LI STADE FI GURAS.........................................................................................................................IX
LI STA DE TABELAS.......................................................................................................................XII
LI STADE ABREVI ATURAS..........................................................................................................XV
1.I NTRODUÇÃO.................................................................................................................................1
2. REVI SÃO DA LI TERATURA........................................................................................................5
2.1. Arsênio............................................................................................................................................6
2.2. Antimônio........................................................................................................................................8
2.3. Ácido Ascórbico............................................................................................................................11
2.4. Lipossomas ...................................................................................................................................13
3. OBJETI VOS...................................................................................................................................16
3.1. Objetivo Geral ..............................................................................................................................17
3.2. Objetivos Específicos....................................................................................................................17
4. CAPÍ TULO 1: Validação de método analítico para quantificação de arsênio e antimônio em
lipossomas através de espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente
acoplado..............................................................................................................................................18
4.1 Introdução......................................................................................................................................19
4.2 Materiais e Métodos.......................................................................................................................20
4.2.1 Reagentes..................................................................................................................................20
4.2.2 Equipamentos...........................................................................................................................20
4.2.3 Lipossomas...............................................................................................................................21
4.2.4 Especificidade..........................................................................................................................23
4.2.5 Linearidades.............................................................................................................................23
4.2.6 Precisão....................................................................................................................................23
XVIII
Sumário
4.2.7 Exatidão....................................................................................................................................23
4.2.8 Robustez...................................................................................................................................24
4.2.9 Limites de detecção e quantificação.........................................................................................24
4.3 Resultados......................................................................................................................................25
4.3.1 Especificidade..........................................................................................................................25
4.3.2 Linearidade...............................................................................................................................26
4.3.3 Precisão....................................................................................................................................27
4.3.4 Exatidão....................................................................................................................................29
4.3.5 Robustez...................................................................................................................................29
4.3.6 Aplicação do método................................................................................................................29
4.4 Discussão........................................................................................................................................30
5. CAPÍ TULO 2: Avaliação da toxicidade do arsênio e antimônio trivalentes............................31
5.1 Introdução.....................................................................................................................................32
5.2 Métodos..........................................................................................................................................32
5.2.1. Lipossomas.................................................................................................................................32
5.2.1.1. Caracterização da preparação dos lipossomas........................................................................32
5.2.1.1.1. Determinação da eficiência de encapsulação.......................................................................32
5.2.1.1.2. Determinação do tamanho dos lipossomas..........................................................................33
5.2.1.1.3. Determinação da carga superficial dos lipossomas..............................................................33
5.2.1.1.4. Perfil de liberação in vitro a partir dos lipossomas..............................................................33
5.2.1.1.5. Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas......................................................34
5.2.1.1.6. Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostra de lipossomas .....................34
5.2.2. Experimentos in vivo..................................................................................................................36
5.2.2.1.Animais ...................................................................................................................................36
5.2.2.2. Obtenção da dose máxima tolerada (DMT) ...........................................................................36
5.2.2.3.Obtenção dos parâmetros cardiovasculares.............................................................................37
XIX
Sumário
5.2.2.4. Avaliação dos parâmetros cardiovasculares............................................................................38
5.2.2.5. Avaliação Hematológica..........................................................................................................38
5.2.2.6.Avaliação Bioquímica..............................................................................................................39
5.2.2.7. Avaliação Histopatológica.......................................................................................................39
5.2.2.8. Protocolos Experimentais........................................................................................................40
5.2.2.8.1. Protocolo Agudo...................................................................................................................40
5.2.2.8.2. Protocolo Subagudo.............................................................................................................41
5.2.2.9. Análise estatística ...................................................................................................................42
5.3. Resultados.....................................................................................................................................43
5.3.1. Arsênio.......................................................................................................................................43
5.3.1.1. Lipossomas..............................................................................................................................43
5.3.1.1.1. Caracterização da preparação de lipossomas.......................................................................43
a Determinação da eficiência de encapsulação....................................................................................43
b Determinação do tamanho dos lipossomas.......................................................................................44
c Determinação da carga superficial dos lipossomas...........................................................................45
d Perfil de liberação in vitro a partir dos lipossomas...........................................................................46
e Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas...................................................................46
f Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostra de lipossomas.. .................................47
5.3.1.2. Experimentos in vivo ..............................................................................................................48
5.3.1.2.1. Obtenção da dose máxima tolerada (DMT) ........................................................................48
5.3.1.2.2.Protocolo agudo....................................................................................................................48
a. Avaliação da toxicidade cardiovascular............................................................................................54
b. Avaliação da toxicidade hepática.....................................................................................................59
c. Avaliação da toxicidade Renal..........................................................................................................61
d. Avaliação da toxicidade Hematológica............................................................................................62
XX
Sumário
5.3.2. Antimônio...................................................................................................................................63
5.3.2.1. Lipossomas..............................................................................................................................63
5.3.2.2. Experimentos in vivo...............................................................................................................63
5.3.2.2. Obtenção da dose máxima tolerada (DMT) ...........................................................................63
5.3.2.2.2.Protocolo agudo....................................................................................................................63
a. Avaliação da toxicidade cardiovascular........................................................................................... 69
b. Avaliação da toxicidade hepática.................................................................................................... 73
c. Avaliação da toxicidade Renal..........................................................................................................75
d. Avaliação da toxicidade Hematológica............................................................................................76
5.4. Discussão.......................................................................................................................................77
5.4.1. Lipossomas.................................................................................................................................77
5.4.2. Avaliação das alterações cardiovasculares ................................................................................79
5.4.3. Avaliação Hepática ....................................................................................................................84
5.4.4. Avaliação Renal..........................................................................................................................86
5.4.5. Avaliação Hematológica.............................................................................................................87
6. CONCLUSÃO................................................................................................................................89
7. REFERÊNCI AS BI BLI OGRÁFI CAS.........................................................................................91
8. ANEXOS ......................................................................................................................................109
XXI
I ntrodução
1. I NTRODUÇÃO
1
I ntrodução
Diversos e milenares são os relatos do uso de compostos de metais e semi-metais como
agentes terapêuticos, dentre estes se encontram o arsênio (As) e o antimônio (Sb), os quais
apresentam várias semelhanças químicas e biológicas: ambos possuem os mesmos estados
oxidativos, interagem com grupos tiois intracelulares no organismo e aparentemente são
transportados pelas mesmas famílias de proteínas nas células humanas. Sabe-se, ainda, que a forma
trivalente destes é considerada a forma mais ativa no tratamento das enfermidades em que atuam,
sendo por outro lado a mais tóxica.
Na antiguidade, o As foi utilizado no tratamento de diversas doenças na forma de trióxido em
XPDVROXomRGHQRPLQDGD³)RZOHU´HDWXDOPHQWHYHPVHQGRHPSUHJDGRFRPVXFHVVRQRWUDWDPHQWR
de neoplasias mielóides. Já o Sb, na forma de tártaro emético (composto de antimônio trivalente), foi
o primeiro medicamento sintético utilizado no tratamento da esquistossomose. Atualmente este é
utilizado no tratamento da leishmaniose, entretanto, somente através de compostos pentavalentes
devido aos efeitos adversos atribuídas à sua forma trivalente. No entanto, estudos sugerem que o
Sb(V), na realidade, se trata de um pró-fármaco e que, in vivo, é ionizado e reduzido a Sb(III) para
somente assim exercer sua atividade.
As enfermidades que são ou têm potencial de voltarem a ser tratadas com As e Sb, como o
câncer, leishmaniose e esquistossomose, apresentam elevada incidência mundial. O câncer é
responsável por aproximadamente 13% das mortes, cerca de sete milhões de pessoas a cada ano,
sendo que, no Brasil constitui a segunda maior causa de morte por doença (INCA, 2009). A
leishmaniose é endêmica em 88 países (Desjeux, 2005) e está associada a 2-4 milhões de casos com
incapacitação de vida durante anos, além de cerca de 70.000 mortes por ano (Desjeux, 1996). Já a
esquistossomose mansônica é uma endemia mundial, ocorrendo em 52 países e territórios,
principalmente na América do Sul, Caribe, África e Leste do Mediterrâneo. No Brasil, a transmissão
ocorre em 19 estados (Brasil, 2005) onde se estima que haja 8 milhões de portadores (Neves, 2004).
Por outro lado, é conhecido que estes fármacos induzem marcantes efeitos tóxicos,
principalmente sobre o sistema cardiovascular e renal. Esta toxicidade muitas vezes inviabiliza o uso
terapêutico, provoca altos índices de desistência do tratamento pelos pacientes ou ainda torna
necessário o uso de baixas doses, o que acarreta em tratamentos longos e em maior possibilidade de
aparecimento de formas resistentes de agentes infecciosos. Neste contexto, justifica-se a pesquisa e
otimização de formulações que possam atenuar a toxicidade destes fármacos, como recomendado
pela Organização Mundial de Saúde, OMS (Liew, et al., 1993).
Há dois métodos de abordagem para fazer induzir melhorias na quimioterapia. Em primeiro
2
I ntrodução
lugar, há a necessidade óbvia de continuar a busca de novos fármacos, o que muitas vezes é um
processo demorado e de elevado custo, e que nem sempre resulta na descoberta de algo mais eficaz.
Em segundo lugar, há a possibilidade de melhorar o potencial terapêutico e reduzir a toxicidade dos
fármacos já estabelecidos e devidamente testados modificando sua formulação ou associando-os a
outros que induziriam atividade sinérgica.
No que diz respeito à associação de fármacos, estudos têm demonstrado aumento da
atividade, diminuições de efeitos tóxicos e da resistência do As em pacientes tratados
concomitantemente com ácido ascórbico (AA) (Bahlis et al.,2002; Singh, 2007). Tal ação
provavelmente está relacionada à depleção de glutationa, tiol intracelular, provocada por este
composto. A ação do AA sobre o Sb, fármaco cujo mecanismo de ação também envolve grupos tiois,
ainda não foi investigada, até onde se tem conhecimento.
Já com relação à modificação de formulações, uma evolução é o transporte desses fármacos
através de nanocarreadores (Bungaard, Hasan e Kofod, 1982), que oferecem não só um meio de
alterar a distribuição tecidual, mas são também capazes de alterar a toxicidade, farmacocinética e
consequentemente a excreção renal desses fármacos.
Lipossomas, vesículas nanométricas constituídas de fosfolipídios, possuem a propriedade de
veicular substâncias ativas hidrofílicas ou lipofílicas, podendo conferir distribuição corporal
diferenciada, lenta liberação, baixa excreção renal, maior estabilidade e modificadas interações com
células hospedeiras e patogênicas (Blume e Cevic, 1990). Permitem, ainda, o direcionamento a alvos
específicos, como células e tecidos, aumento da potência e/ou redução da toxicidade da substância
encapsulada (Chon e Cullis, 1995; Lasic, 1998).
Compostos de As e Sb trivalentes, substâncias hidrossolúveis, possuem elevado potencial
para serem veiculados no compartimento aquoso dos lipossomas e, a partir deste compartimento ser
liberado lentamente induzindo o prolongamento de seu tempo de ação, bem como redução de
possíveis efeitos tóxicos.
Recentemente nosso grupo de pesquisa avaliou a redução da cardiotoxicidade do tártaro
emético, através de análise de traçado do eletrocardiograma e pressão arterial, quando encapsulado
em lipossomas estabilizados estericamente, obtendo resultados relevantes (dados não publicados).
Com relação ao As, desde que o TRISENOX (marca comercial do trióxido de arsênio) foi
aprovado para uso no tratamento da LPA (Leucêmia promielocítica aguda), vários estudos têm sido
realizados no intuito de desenvolver formulações deste medicamento encapsulado em lipossomas.
No entanto, estudos in vivo da atividade e/ou efeitos adversos destas formulações ainda não foram
3
I ntrodução
descritos.
Face ao exposto, este trabalho teve por objetivo avaliar a possibilidade de redução da
toxicidade, principalmente a cardiovascular, do As e do Sb trivalentes por administração
concomitante com AA ou veiculação em lipossomas.
4
Revisão Bibliográfica
2. REVI SÃO DE LI TERATURA
5
2.1. Arsênio
O uso medicinal do arsênio e seus derivados data de 2400 anos (Antman, 2008). Sua fase
áurea como agente terapêutico foi entre o final do século XIX e meados do século XX, através do
XVR GH XPD IRUPXODomR FRQWHQGR DUVrQLR WULYDOHQWH FRQKHFLGD FRPR ³6ROXomR GH )RZOHU´ (VWD
solução era empregada no tratamento de enfermidades tão numerosas quanto distintas, tais como a
psoríase, pênfigo, dermatite herpetiforme, leishmaniose, sífilis dentre outras (Gontijo e Bittencourt,
2005). Além disso, no final de 1800's o arsênio foi relatado como o primeiro agente terapêutico
eficaz no tratamento da leucemia (Kwong e Todd, 1997).
Atualmente, o arsênio vem sendo utilizado no tratamento de tripanossomíases que acometem
o sistema nervoso central (Kuzoe, 1993), como agente antineoplásico no tratamento da leucemia
promielocítica aguda (LPA) recidiva ou refratária e em casos de pacientes com múltiplos mielomas
resistentes às quimioterapias convencionais (Bahlis et al., 2002). Em 25 de setembro de 2000, o FDA
(Food and Drug administration) aprovou o trisenox, nome comercial do TOA (trióxido de arsênio)
injetável, como agente terapêutico no tratamento de LPA nos Estados Unidos da América. No estudo
pivô multicêntrico deste medicamento, 70% dos pacientes apresentaram completa remissão do
quadro patológico (Jean, 2001). Além disso, estudos in vitro com linhagens de células e culturas de
tumores primários demonstraram sensibilidade ao TOA o que mostra possível ação em outros tipos
de neoplasias (Borad et al, 2005; Bahlis et al, 2002; Wang, 2001). No entanto, a expansão de sua
utilidade clínica tem sido limitada pela toxicidade provocada quando utilizado em doses maiores
(Evens et al, 2004).
São diversos os efeitos tóxicos do arsênio trivalente. Há aqueles que, apesar de incômodos,
não comprometem o tratamento com estes compostos, dentre os quais podem ser citados as reações
cutâneas, perturbações gastrointestinais, hepatite e ocasionalmente leucocitose. No entanto, o efeito
sobre o sistema cardiovascular muitas vezes limita a terapia com compostos contendo este metal. A
principal alteração cardiovascular é o prolongamento do intervalo QT do eletrocardiograma o qual
pode vir a induzir arritmias graves, principalmente quando pacientes apresentam doenças
cardiopulmonares ou distúrbios eletrolíticos como hipocalemia e hipomagnesemia. Tal efeito parece
ser dependente da dose e mediado por inibição dos canais de íon potássio (Au e Kwong, 2008).
Possível mecanismo que explicaria este efeito adverso seria a afinidade do arsênio por grupos
sulfidrilas de proteínas, inibição da respiração mitocondrial e a competição com o fosfato durante a
fosforilação oxidativa (Verstovsek et al, 2006).
São variadas as vias pelas quais o TOA atua sobre células cancerígenas. Estudos têm
6
demonstrado que o TOA induz a célula a apoptose, estimula a diferenciação e inibe a angiogênese no
interior de tumores. Segundo Chen e colaboradores, 1998 a apoptose se daria através da indução da
célula tumoral ao stress oxidativo, visto que, o TOA interage com a glutationa (GSH) intracelular,
um tripeptídeo responsável pela inativação de compostos reativos de oxigênio, ao diminuir a
regeneração desta através da glutationa redutase, e, conseqüentemente, ativa enzimas e co-fatores
que são redox-sinalizados como a p53, proteína que regula a restauração de danos no DNA celular e
leva a célula a apoptose em casos nos quais estes são irreparáveis (Akay e Gazitt , 2003; Karlsson et
al., 2004; Kircelli et al., 2007) . Já o estímulo à diferenciação celular seria através da degradação da
proteína PML-RAR-alfa (Miller et al., 2002) ,que é o que também ocorre com células neoplásicas na
presença de antimônio trivalente.
A semelhança observada entre o antimônio e o arsênio não se limita ao anteriormente citado e
a muito vem sendo relatada na literatura (Muller et al, 2009; Salerno e Garnier-Suillerot, 2003;
Rosen et al, 2002; Gebel, 1998). Ambos possuem os mesmos estados de oxidação (-3, 0, +3 e +5) e
em ambientes redutores as espécies pentavalentes destes íons podem ser convertidas nas espécies
trivalentes. A elevada toxicidade dos compostos trivalentes desses metais parece estar associada ao
fato de que estas espécies apenas se dissociam em valores de pH superior ao fisiológico e portanto
permeiam mais facilmente as membranas celulares (Frézard, et al., 2001). Sofrem, também, efluxo
celular por mecanismos dependentes de glutationa e de proteínas de membrana da família MRP
(Ashutosh e Goyal, 2007). Também deve ser destacada a afinidade do arsênio e antimônio pelos
grupamento sulfidrol encontrado em moléculas de glutationa e cisteína, importantes no combate
intracelular de radicais livres, a qual pode estar associada ao mecanismo de ação e de toxicidade
destes semimetais (Frézard et al., 2001 e Teixeira et al, 2005 ).
A interação do arsênio com grupos tióis é bem estabelecida na literatura (Duncan et al., 2006;
Jiang et al., 2003; Kala et al., 2000; Shimizu et al., 1998; Kreppel et al.,1993; Scott et al., 1993).
Alguns estudos em células resistentes ao TOA comprovam a relação entre esta interação e sua ação
antineoplásica. Células leucêmicas desenvolveram resistência a este fármaco devido à elevação do
GSH in vitro (Kitamura et al., 2000; Seo et al. , 2007) e em modelo animal (Lee et al., 2006). Uma
vez que a interação espontânea de arsênico com GSH é lenta, a conjugação celular mostrou-se
principalmente catalisada pela GSH S-transferase (GST) (Leslie et al., 2004 ; Wang e Lee, 1993), o
que está de acordo com a super expressão desta enzima em várias linhagens de células resistentes ao
arsênio (Brambila et al., 2002, Kojima et al., 2006, Liu et al., 2001 ; Wang e Lee, 1993).
Baseado no conhecimento que a diminuição dos níveis de GSH tornam as células neoplásicas
7
mais sensíveis ao TOA (Heffete et al.,2008; Duechler et al., 2007; Grad et al., 2001 e Huang e Lee,
1996) e que o ácido ascórbico (AA) é conhecido por empobrecer reservatórios celulares de GSH ,
este tem sido utilizado em combinação com o AA (Qazilbash et al, 2008). Além disso, alguns estudos
têm demonstrado possíveis diminuições de efeitos tóxicos causados pelo arsênio em pacientes
tratados com esta associação (Bahlis et al.,2002 e Singh, 2007). Diante disso, pode se esperar que
fármacos semelhantes ao arsênio, como o antimônio, que também interagem com tióis intracelulares,
poderiam ter o seu índice terapêutico e atividade melhorados, além da diminuição de resistência, se
associados ao ácido ascórbico.
2.2. Antimoniais
O uso de antimoniais, data da antiguidade, sendo que seu estabelecimento como fármaco
ocorreu em 1657 quando Louis XIV relatou ter-se curado de febre tifóide com o uso de tártaro
emético, um antimônio trivalente. Há relatos, até o século XVIII, do uso deste composto no
tratamento de diversas enfermidades como sífilis, lepra, peste, dentre outras, sendo sua utilização
interrompida devido aos efeitos adversos que provocava (MacCallum, 1999). No século XX, no
entanto, Gaspar Vianna testou o tártaro emético no tratamento da leishmaniose cutânea obtendo
resultados extremamente satisfatórios (Leonidas, 1985) e três anos mais tarde, em 1915, na Itália, foi
comprovada a eficácia deste no tratamento de leishmaniose visceral (Rath et al, 2003). Já em 1918,
Christopherson demonstrou a atividade esquistossomicida do tártaro emético no tratamento da
esquistossomose, o que foi um grande avanço e ponto de partida para a busca de novos fármacos
sintéticos (Harder, 2002).
Devido aos graves efeitos tóxicos associados aos antimoniais trivalentes estes foram sendo
substituídos por compostos pentavalentes no tratamento da leishmaniose (Marsden, 1985) e por
compostos não antimoniais no tratamento da esquistossomose (Harder, 2002). Atualmente, o
praziquantel é o fármaco de escolha nesta ultima doença (Cioli et al. 1995; Cioli, 1998) enquanto que
no tratamento da leishmaniose os antimoniais utilizados são complexos de SbV (antimoniato de
meglumina ou Glucantime® ou estibogluconato de sódio ou Pentostam®), com exceção na região
de Bihar, na Índia, onde foi detectada a ocorrência de cepas de Leishmania resistentes (Marsden,
1985; Murray, 2001). Há estudos que tentam explicar os mecanismos desta resistência. Ashutosh e
colaboradores (2007) e Haimeur e colaboradores (2000) propuseram que a diminuição do fármaco
ativo dentro da célula ocorre por diferentes mecanismos: uma possível redução da captação de Sb
através da regulação negativa do transportador de membrana AQP1 (Aquaglicerporina de tipo 1);
8
aumento do efluxo do fármaco causado por regulação positiva de transportadores da família MRP
(Proteína de Multirresistêcia a drogas) e família ABC; menor conversão de Sb(V) a Sb (III) através
da diminuição da GSH no macrófago e T(SH)2 no parasita.
Nos últimos anos, na tentativa de evitar o surgimento de cepas de leishmania com resistência
primária aos antimoniais, principalmente em países como Sudão, Quênia e Índia, doses
progressivamente maiores, tem sido recomendadas pela OMS e pelo Centro de Controle de Doenças
± CDC dos Estados Unidos da América. A taxa de resistência aos antimoniais pentavalentes na Índia
pode chegar a 50% (Brasil, 2004; Medeiros et al., 2005). Por outro lado, os efeitos tóxicos limitam o
aumento das doses destes fármacos sendo o efeito cardiotóxico o maior responsável (Marsden, 1985;
Murray, 2001). Em pacientes que receberam compostos pentavalentes alterações dose-dependente
nos eletrocardiogramas (ECG) foram encontradas (Chulay, et al, 1985; Katlama, et al,1985; Muller,
et al., 1982; Saenz, et al., 1987; Antezana, et al., 1992), sendo as mais comuns, o achatamento ou
inversão da onda T e o prolongamento do intervalo QT, que pode ser observado até mesmo em
terapias de curto prazo e em baixas doses. Em alguns casos, esse aumento no intervalo QT é de mais
de 500 ms, aumento este que pode ser relacionado à morte súbita durante o tratamento, ocorrendo
também uma pequena redução de duração da onda P (Ribeiro, et al. 1999).
Em contradição à maior toxicidade atribuída a compostos trivalentes, Lacerda-junior e
colaboradores (1965) em estudo comparativo das alterações eletrocardiográficas entre tratamentos
com antimoniais trivalentes e pentavalentes, demonstraram que não há qualquer correlação entre o
tipo de composto e a alteração encontrada no ECG, determinando que ambos provocam as mesmas
alterações. Neste mesmo estudo, além das alterações já citadas, foram observados também alteração
difusa da repolarização ventricular, isquemia subepicárdica e traçado sugestivo de pericardite aguda.
Visto que os antimoniais trivalentes, apesar de causar inúmeros efeitos colaterais, apresentam
grande eficácia, estudos recentes buscam a redução desses efeitos para que este possa novamente ser
utilizado em terapêutica. De Melo e colaboradores em 2003, demonstraram o aumento da eficácia e
redução dos efeitos adversos do tártaro emético, em camundongos infectados com schistossomas,
através de sua encapsulação em lipossomas furtivos. Há também fortes indícios da possível
utilização destes compostos no tratamento do câncer (Müller et al, 2009; Sharma et al, 2008; Hsu et
al, 1963; Hsu et al, 1963).
Quanto ao mecanismo de ação dos antimoniais, apesar de serem utilizados na terapêutica a
mais de meio século, até o presente momento não foi completamente elucidado (Marsden, 1985,
9
Ephros et al., 1999, Frézard, et al., 2001), permanecendo dúvidas quanto à espécie ativa do
antimônio e organelas ou moléculas alvo.
Com relação à ação antiparasitária dos compostos pentavalentes, supõe-se que o complexo
organometálico sofra, inicialmente, uma reação de dissociação para que o antimônio, na sua forma
iônica, seja reduzido à forma trivalente e, assim, exerça a sua atividade (Figura 1). Recentemente, foi
demonstrado que a glutationa (GSH) poderia ser o agente redutor humano envolvido na redução in
vivo do Sb(V) e que essa reação é mais rápida em pH 5 - que corresponde ao valor de pH dos
compartimentos celulares, onde o parasita Leishmania se aloja - do que em pH 7,2, pH do citosol
(Wyllie et al, 2004; Frézard, et al., 2001). Já Yan e colaboradores (2002), Ferreira e colaboradores
(2003) e Denton e colaboradores (2004) demonstraram que essa reação provavelmente ocorre através
da tripanotiona (T(SH)2), tiol mais abuntante encontrado na Leishmania. Outra possibilidade de
mecanismo de ação seria a inibição de enzimas envolvidas no metabolismo do DNA e do RNA do
parasita (Lucumi, et al., 1998) ou ainda há a hipótese de que ocorra por inibição dos adenosina (ATP)
e guanosina trifosfatos (GTP ou AGP) (Berman, 1988), através do bloqueio da atividade glicolítica e
oxidativa de ácidos graxos de amastigotas, uma vez que esta diminui a capacidade de fosforilação de
ADP a ATP levando à depleção de ATP intracelular (Berman, 1988; Koff e Rosen, 1994).
Figura 1: Mecanismo de ação e resistência dos antimoniais pentavalentes em amastigotas de
Leishmania. Adaptado: Leishmaniasis: drugs in the clinic, resistance and new developments. Marc
Ouellette, Jolyne Drummelsmith, Barbara Papadopoulou (2004)
10
Estudos buscam explicar ainda o possível mecanismo de ação envolvido na atividade
antineoplásica dos compostos antimoniais. Müller e colaboradores (2009) observaram que ao expor
clones de células encontradas na leucemia promielocítica aguda (LPA), como a NB4 e NB4R4
(sendo a primeira linhagem sensível ao ácido retinóico, medicamento de escolha em LPA, e a
segunda resistente) ao trióxido de antimônio ou ao tártaro emético, ocorre a degradação da enzima
responsável pela não diferenciação das células mielóides progenitoras (PML-RAR-alfa),
reorganização dos corpos nucleares de PML e aumento da apoptose dessas células, que como já
citado, é o que acontece em células tratadas com trióxido de arsênio o que nos leva a crer que o
mecanismo de ação destes seja semelhante.
2.3. Ácido ascórbico
O ácido ascórbico (AA) é uma vitamina hidrossolúvel que se constitui em um suplemento
natural na nossa dieta, sendo a forma naturalmente encontrada o L-isômero. A metabolização do
ácido ascórbico intracelular se dá por intermédio da ação da glutaredoxina com conversão de
glutationa a glutationa dissulfeto. Esta via desintoxica o peróxido de hidrogênio (H2O2), que é uma
das espécies reativas de oxigênio produzidas pelo metabolismo humano.
Na primeira etapa desta via, H2O2 é reduzido à água pela ascorbato peroxidase, usando o
ascorbato como doador de elétrons. O ascorbato oxidado (monodehidroascorbato) é regenerado pela
monodehidroascorbato redutase (Wells e Xu, 1994). No entanto este é um radical e, caso não seja
rapidamente reduzido, se dissocia em ascorbato e dehidroascorbato, o qual é, então, reduzido a
ascorbato pela enzima dehidroascorbato redutase à custa de GSH, produzindo glutationa oxidada
(GSSG). Finalmente GSSG é reduzido pela glutationa redutase, usando NADPH como doador de
elétrons (Whitbread et al, 2005; Rouhier et al, 2002) (Figura 2).
11
Figura 2: Desenho esquemático da metabolização intracelular do ácido ascórbico. APX (ascorbato
peroxidase), ASC (ascorbato), MDA (monodehidroascorbato), MDAR ( monodehidroascorbato
redutase), DHA ( dehidroascorbato), DHAR ( dehidroascorbato redutase), GSSG (glutationa
oxidada), GR (glutationa redutase), GSH (glutationa).
O ácido ascórbico é importante na síntese de colágeno e carnitina. Ajuda a manter os vasos
capilares, ossos e dentes além de auxiliar na absorção de ferro (Sies e Stahl, 1995; Levine et al.,
1995), porém é principalmente reconhecido por sua atividade antioxidante agindo como redutor de
espécies reativas de oxigênio (Weber, Bendich e Schalch, 1996).
Estudos epidemiológicos sugerem que a ingestão do AA está negativamente correlacionada
com a incidência de doença vascular. Tal atividade pode ser atribuída à ação antioxidante e a
regulação do metabolismo do colesterol, visto que, o ácido ascórbico evita a oxidação das
lipoproteínas de baixa densidade e regula a enzima responsável pela conversão do colesterol em
ácidos biliares. Além disso, este protege células vasculares de músculo liso e células endoteliais da
citotoxicidade pelo estresse oxidativo (Arakawa et al, 2003).
A ação deste composto na prevenção e combate do câncer é há muito relatada (Kaegi, 1998).
Segundo revisão realizada por Cameron e colaboradores (1979), o ácido ascórbico é essencial para a
integridade da matriz intercelular e sua resistência ao crescimento infiltrativo de células malignas,
além de permitir que o organismo produza uma barreira de tecido fibroso em volta do tumor. Há,
ainda, fortes indícios de envolvimento deste na inibição de enzimas neoplásicas e estimulação do
12
sistema imunológico contra essas células malignas. Oferece, também, proteção contra uma variedade
de agentes cancerígenos químicos, físicos e biológicos.
Estudos têm demonstrado que o ácido ascórbico pode ter um papel inesperado no tratamento
do câncer quando administrado via endovenosa em concentrações farmacológicas. Trabalho
realizado por Chen e colaboradores (2005) investigaram, em experimento in vitro, a mortalidade de
células neoplásicas e de células normais quando expostas ao arsênio associado ao ácido ascórbico.
As células normais não foram afetadas, o que não ocorreu com as neoplásicas, sendo a morte celular
destas correlacionada com a formação de H2O2 extracelular uma vez que a geração deste foi
dependente da concentração de ácido ascórbico, tempo de incubação e presença de soro. Além disso,
tem sido observado o aumento da atividade e redução de desenvolvimento de resistência à
antineoplásicos, que tem seu mecanismo de ação envolvido com tióis intracelulares, quando estes
estão associados ao ácido ascórbico. Este é o caso do TOA, como citado anteriormente, que além
desses benefícios apresentou redução de sua toxicidade em rins, miocárdio e fígado de ratos (Rana et
al., 2006; Single et al., 2006).
Diante disso, pode se esperar que fármacos semelhantes ao arsênio, como o antimônio, que
também interagem com tióis intracelulares, poderiam ter o seu índice terapêutico e atividade
melhorados, além da diminuição de resistência, se associados ao ácido ascórbico.
2.4. Lipossomas
Outra possível tentativa de contornar os efeitos adversos do arsênio e do antimônio seria a
possibilidade de encapsulação desses semimetais em sistemas de vetorização de fármacos, como os
lipossomas, vesículas esféricas compostas por uma bicamada fosfolipídica concêntrica, que encerram
no seu interior um determinado volume de solução aquosa. Inicialmente usados como modelos de
membranas biológicas (Bangham et al., 1965), estes vetores têm sido freqüentemente utilizados s no
transporte e liberação de fármacos, podendo encapsular substâncias hidrofílicas em seu interior,
hidrofóbicas em suas bicamadas lipídicas e anfifílicas na interface lipídio/água (Lasic, 1998).
Existe uma ampla variedade de lipossomas no que diz respeito à composição, estrutura e
tamanho. Assim, de acordo com a lamelaridade e tamanho, os lipossomas convencionais são
classificados em (Gregoriadis, 1993): lipossomas unilamelares pequenos (SUVs); lipossomas
unilamelares grandes (LUVs); lipossomas multilamelares (MLVs) e lipossomas gigantes (GVs).
O processo de preparação dos lipossomas é crucial para delinear o tipo de estrutura a ser
obtida. O desenvolvimento bem sucedido de uma formulação depende de fatores como seleção dos
13
lipídios, natureza da substância encapsulada, método utilizado na incorporação do agente a ser
encapsulado e metodologia de obtenção das vesículas. Existem várias metodologias (Hope et al.,
1986) para a preparação de lipossomas, as quais, de modo geral, são compostas por três etapas
básicas: 1) diluição dos fosfolipídios em solvente orgânico seguida de evaporação deste para
obtenção do filme lipídico; 2) hidratação do filme lipídico em meio aquoso; 3) redução do tamanho
da vesícula e/ou do número de camadas, se for o caso
A encapsulação de substâncias em lipossomas permite sua distribuição corporal diferenciada,
podendo demonstrar maior estabilidade, excreção reduzida, modificadas interações com células
hospedeiras e patogênicas (Blume e Cevic, 1990), além de atingir alvos específicos, como células e
tecidos, aumentando a potência e/ou reduzindo a toxicidade da substância encapsulada. O tipo de
lipossoma utilizado para uma determinada finalidade está diretamente relacionado à sua composição
e estrutura e, dependendo da forma de administração, pode alcançar diferentes sítios no organismo
(Lasic, 1998).
Após administração endovenosa, os lipossomas convencionais são rapidamente removidos da
corrente circulatória e intensamente capturados no fígado pelos macrófagos. A remoção desses
lipossomas da corrente circulatória depende do tamanho, carga de superfície e estabilidade.
Geralmente, vesículas grandes e carregadas positivamente são fagocitadas mais rapidamente que
aquelas com carga negativa (Patel, 1992). A adição de polietilenoglicol (PEG) à superfície
lipossomal origina estruturas furtivas, estericamente estabilizadas, as quais escapam do sistema
fagocitário devido à redução da opsonização das vesículas pelas proteínas plasmáticas,
proporcionando maior tempo de circulação (Klibanov et al., 1990; Woodle, 1995).
Experimentos de Palmer e colaboradores (1984) demonstraram que o acúmulo de lipossomas
em tecidos com isquemia, como a que ocorre no câncer e em tecidos infartados, é um fenômeno
geral, que pode ser explicado por menor filtração nestas áreas. Ao estudar o acúmulo de imuno
lipossomas no tecido infartado de coelho, Torchilin e colaboradores (1992) observaram que
lipossomas de circulação prolongada, estabilizados estericamente com PEG, sofrem maior acúmulo
no tecido infartado de coelhos em relação aos lipossomas convencionais. A dimensão deste acúmulo
dependeria, ainda, do tamanho das vesículas (Torchilin et al., 1996). Maruyama (1998) relata que
elevado acúmulo de lipossomas revestidos com PEG foi observado em modelos de tumor em ratos e
que resultados de estudos clínicos de tratamentos com a doxorrubicina encapsulada em lipossomas
PEG-(DOXIL), em sarcoma de Kaposi relacionado com a Síndrome de Imunodeficiência Adquirida
(SIDA), revelou um aumento de eficácia terapêutica com a droga livre.
14
Os compostos antimoniais, incluindo o Glucantime®, já foram testados sob a forma
encapsulada em lipossomas contra a leishmaniose visceral experimental, em hamster, camundongo e
cão. O efeito da encapsulação destes compostos em lipossomas na sua eficiência contra a
leishmaniose visceral foi espetacular, com um aumento de até 700 vezes (Alving, 1986; Croft, 1986).
Frézard e colaboradores (2000) desenvolveram um novo método para encapsulação do antimoniato
de meglumina em lipossomas, o qual apresenta várias vantagens em relação ao método
convencional, pois, permite a encapsulação do fármaco com maior rendimento e, além disso, a
formulação resultante não apresenta os problemas de estabilidade encontrados na formulação
convencional, por poder ser liofilizada e reconstituída no momento do uso. Outros fármacos, cuja
atividade foi aumentada por sua administração na forma encapsulada em lipossomas, são a
pentamidina e a anfotericina B.
Como já citado, De Melo e colaboradores (2003) avaliaram o tartarato emético encapsulado
no tratamento da esquistossomose, em modelos de camundongos infectados com Shistosoma
mansoni. Lipossomas de circulação prolongada foram identificados como mais efetivos que
lipossomas convencionais, provavelmente por reduzir a toxicidade do antimônio e liberar
efetivamente este fármaco em estágios avançados da infecção pelo parasita.
Com relação ao arsênio, vários são os estudos do desenvolvimento de formulações deste
composto em lipossomas. Kallinteri e colaboradores (2004) testaram a encapsulação do ATO em
lipossomas constituídos de duas composições lipídicas diferentes (EggPC/Chol (1:1) e DSPC/Chol
(1:1)) e através três técnicas diferentes (hidratação de filme, sonicação e método DRV), obtendo
taxas de encapsulação que variaram de 0,003 a 0,506 mol de TOA/mol de lipídeo. Chen e
colabodores (2006) avaliaram o aumento da estabilidade de lipossomas através da liberação lenta de
compostos de arsenito ligados a metais de transição. No entanto, não foram encontrados na literatura
trabalhos que avaliassem a atividade ou redução da toxicidade do arsênio veiculado em lipossomas.
15
Objetivos
3. OBJETI VOS
16
Objetivos
3.1. Objetivo Geral:
Avaliar a possibilidade de redução da toxicidade do arsênio e antimônio, no modelo rato, por
administração concomitante com ácido ascórbico ou ainda pela encapsulação do arsênio trivalente
em lipossomas.
3.2. Objetivos Específicos:
z
Desenvolver e Validar método analítico de quantificação de arsênio e antimônio em
lipossomas através espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado
(ICP OES).
z
Encapsular o arsênio trivalente em lipossomas e realizar sua caracterização físico-química.
z
Identificar, no modelo rato, as alterações cardíacas agudas advindas da administração da dose
única, por via endovenosa (IV), da dose máxima tolerada do arsênio e do antimônio
trivalentes nas formas livre, administrados concomitante com ácido ascórbico e encapsulados
em lipossomas
z
Avaliar as alterações cardíacas, hematológicas, renais e hepáticas indicativas de toxicidade,
advindas da administração por via intraperitonial (IP), de doses utilizadas na terapêutica, em
regime subagudo (30 dias), dos compostos em estudo, nas formas livre e concomitante com
ácido ascórbico.
17
Capítulo 1
4. CAPÍ TULO 1:
Validação de método analítico para quantificação
de arsênio e antimônio em lipossomas através de
Espectrometria de Emissão Atômica com Plasma
I ndutivamente Acoplado
18
Capítulo 1
4.1. I ntrodução
Neste capítulo é apresentada a validação de um método analítico para quantificar os
compostos de arsênio e antimônio em matriz lipossomal. Em geral, métodos espectrométricos e
espectrofotométricos são utilizados para a quantificação destes compostos, como espectrofotômetro
de absorção atômica acoplado a gerador de hidretos, espectrometria de massa com plasma
indutivamente acoplado (ICP-MS), espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente
acoplado (ICP OES), dentre outros (Rath et al, 1997; Kallinteri et al, 2004; Antimisiaris et al, 2005;
Langdon et al, 2005, Schettini et al, 2006). No entanto, de acordo com a matriz no qual o composto
está inserido, há a necessidade de processo de digestão da amostra, reações de acoplamento com
outras substâncias, dentre outros procedimentos os quais muitas vezes tornam a metodologia
trabalhosa e onerosa. Neste contexto, ao trabalharmos com estes compostos veiculados em
lipossomas, identificamos a necessidade de desenvolver uma técnica simples, rápida e econômica
que nos permitisse avaliar rotineiramente o teor de encapsulação de As e Sb em nossas amostras.
Para alcançar este objetivo, utilizou-se o ICP/OES, um tipo de espectroscopia de emissão que
utiliza o plasma indutivamente acoplado para a excitação de íons e átomos que emitem radiação
eletromagnética em comprimentos de onda característicos de um elemento em particular (Stefánsson
et al, 2007). A intensidade desta emissão é indicativa da concentração do elemento na amostra. Este é
um método usado para a detecção de traços de metais e tem vantagens relevantes como a análise de
pequenos volumes de amostras, baixas concentrações, a determinação simultânea de muitos
elementos, alta sensibilidade e curto tempo de análise (Giné-Rosias, 1998).
Para garantir a confiabilidade de métodos aplicáveis a análises quantitativas é imprescindível
que estes sejam previamente validados (Bressolle et al., 1996; Causon, 1997; Shah et al., 2000;
Brasil, 2003; Bansal e DeStefano, 2007; Chandran e Singh, 2007). A validação do método em questão
foi estabelecida através da avaliação dos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão,
robustez e limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) segundo os critérios estabelecidos pela
Resolução 899 da ANVISA (Agência de Vigilância Sanitária no Brasil) e normas do ICH (Harmonised
Tripatite Guideline).
19
Capítulo 1
4.2. M ateriais e M étodos
4.2.1. Reagentes
Tartarato Emético, Arsenito de sódio e colesterol foram adiquiridos da Sigma (USA). L-Įdistearoylphosphatidylcholine (DSPC) e PEG (2000)-distearoylphosphatidyl-ethanolamine (DSPEPEG) foram fornecidos pela Lipoid GmBh (Ludwigshafen, Alemanha). Todos os solventes utilizados
foram de grau analítico.
4.2.2. Equipamentos
O equipamento utilizado foi o espectrômetro ótico Ciros CCD (Spectro) com plasma acoplado
indutivamente (ICP/OES) (Figura 3). Neste a amostra é nebulizada em plasma de argônio através de
um nebulizador cross-flow para ICP e as leituras da radiação eletromagnética emitida pelos
elementos estudados são realizadas em linhas específicas. Diferentes linhas de emissão foram
avaliadas para identificação daquelas que permitiriam melhores leituras das emissões originárias das
amostras lipossomais de As e Sb. Demais parâmetros utilizados pelo aparelho encontram-se descritos
na tabela 1.
Tabela 1: Parâmetros instrumentais do ICP/OES
Potência do Plasma
1350 W
Fluxo de Refrigeração
12,0 l/min
Fluxo do Gás Auxiliar
1,0 l/min
Fluxo de gás nebulizador
0,90 l/min
20
Capítulo 1
Figura 3 ± Aparelho ICP/OES da Spectro Ciros.
4.2.3. Lipossomas
Foram preparados lipossomas de arsenito de sódio e de tártaro emético compostos pelos
lipídios distearoil-fosfatidilcolina (DSPC) (Lipoid GmBh, Alemanha) colesterol (CHOL) (Sigma,
EUA), e distearoil-fosfatidiletanolamina acoplado a um polímero de etilenoglicol (DSPE-PEG)
(Lipoid GmBh, Alemanha) na relação molar 5:4:0,3 em um total de lipídios de 76,9g/L.
Os lipossomas foram obtidos através da metodologia de congelamento/descongelamento
proposta por Mayer e colaboradores. (1985) seguida de extrusão através de membranas de
policarbonato de 200 nm como proposta por Nayar e colaboradores (1989). Os lipídios foram
solubilizados em clorofórmio e este evaporado com auxílio de um evaporador rotatório
(Laborota4000®, Heidolph Instruments, Alemanha) a 70 rpm e 60°C por 10 minutos, levando à
formação de um fino filme lipídico nas paredes do balão. Após completa remoção do solvente
orgânico, o filme lipídico foi hidratado por solução de arsenito de sódio (39,0 mg/ml) ou tártaro
emético (80 g/l) isotônica em relação ao plasma
para obtenção de lipossomas multilamelares
contendo a substância ativa, ou por solução salina tamponada para a obtenção de lipossomas
³EUDQFRVRXYD]LRV´
As soluções obtidas foram, então, homogeneizadas por 5 minutos em evaporador rotatório e
21
Capítulo 1
submetidas a 10 ciclos de congelamento e descongelamento utilizando nitrogênio líquido e banho a
60°C, o que favorece a encapsulação da substância ativa hidrofílica no compartimento aquoso
lipossomal. Em seguida, pDUD REWHQomR GH YHVLFXODV XQLODPHODUHV /89¶V FRP GLVSHUVmR GH
tamanho uniforme, a solução de lipossomas foi filtrada sob pressão em extrusora (Lipex
Biomembranes, Canadá). Foram realizados dez ciclos de extrusão através de duas membranas de
policarbonato de 25 mm de diâmetro e poros de 0,2ȝm, sob pressão de 200 a 300 psi e temperatura
controlada a 60°C. A separação dos compostos encapsulados do não encapsulado nos lipossomas foi
realizada mantendo-se a preparação em diálise em tampão fosfato (150mM NaCl, 10mM fosfato,
pH 7.2) durante 24 horas, utilizando membrana de celulose de 10 mm x 6mm de diâmetro (Sigma
Aldrick, EUA). Pequena fração da preparação antes da diálise foi separada para determinação da
eficiência de encapsulação. A figura 4 apresenta esquematicamente o processo de preparação dos
lipossomas descrito.
Figura 4: Desenho esquemático do processo de preparação dos lipossomas.
Para análise do teor de encapsulação por ICP/OES as amostras foram preparadas através da
transferência de uma alíquota de 100 µl da formulação de lipossomas de As ou Sb para um balão aferido
de 10 ml. Em seguida, adicionou-se 0,5 ml de metanol. A solução foi então submetida à agitação para
romper a estrutura lamelar dos lipossomas e liberar o conteúdo encapsulado. Por último, o volume foi
completado com água ultra-pura.
22
Capítulo 1
4.2.4. Especificidade
Para identificar possíveis interferências da matriz lipossomal nas análises de As e Sb, foi
observado se a linha base na formulação de lipossomas brancos coincidia com a linha base do
aparelho. Para isso foram analisadas formulações com e sem os semimetais.
4.2.5. Linearidade
A linearidade foi estabelecida pela análise estatística de três curvas padrão elaboradas a partir
da diluição de soluções estoques de concentração de 100,0 mg/l. As soluções de trabalho foram
obtidas a partir dessas soluções e foram diluídas em diferentes concentrações dos metais, 3,0 a 50,0
mg/l de antimônio e 3,0 a 40,0 mg/l para o As. A linearidade foi avaliada através de análise de
regressão, utilizando ajuste dos dados pelo método dos mínimos quadrados. Para avaliar
numericamente a qualidade do ajuste do modelo, utilizou-se a análise de variância (ANOVA), p <
0,05.
4.2.6. Precisão
Para o estudo da precisão foram avaliadas a repetibilidade (intra-dia) e a precisão
intermediária (inter-dia). Ambos foram obtidos através da determinação de três concentrações de As
e Sb (5,0, 10,0 e 30,0 mg/l) que abrange o intervalo linear do método, com três réplicas cada. Para a
repetibilidade as determinações ocorreram em um curto período de tempo e de precisão intermediária
em dois dias diferentes. Os resultados foram avaliados pelo teste t de Student ( p <0,05).
4.2.7. Exatidão
A exatidão foi avaliada através da recuperação de quantidades conhecidas dos semimetais As e Sb
adicionada às formulações lipossomais placebo em três diferentes concentrações: 5,0, 10,0 e 30,0 mg/l.
Todas as amostras foram preparadas em triplicata (n = 9). O coeficiente de variação e a porcentagem de
recuperação
foram
utilizados
para
avaliar
a
exatidão,
a
qual
foi
definida
como:
Exatidão = (concentração obtidos experimental / teórico de concentração) x 100
23
Capítulo 1
4.2.8. Robustez
A robustez do método proposto foi verificada pela variação do analista na preparação da
amostra (A1 e A2) e pela variação do fabricante do metanol (Merck (A) e OmniSolv (B)). A
concentração de 20,0 mg/l das substâncias foi determinada em triplicata e a avaliação da robustez
foi realizada pela análise dos coeficientes de variação utilizando o teste t de Student (teste bicaudal, p
<0,05).
4.2.9. Limites de Detecção e de Quantificação
Os limites de quantificação foram obtidos através da avaliação de concentrações decrescentes
das amostras. Estes foram experimentalmente estabelecidos como a menor concentração quantificada
com precisão e exatidão.
Os limites de detecção foram determinados, matematicamente, a partir da curva analítica
resultante da média das três curvas analíticas. O cálculo para determinar os valores baseia-se no
desvio padrão residual da linha de regressão e sua relação com a inclinação da reta (coeficiente
angular) na curva analítica, seguindo a relação:
LD = (D.P./I) x 3,3 , Onde:
D.P.: desvio padrão do intercepto com relação ao eixo dos Y;
I: valor da inclinação da curva analítica.
24
Capítulo 1
4.3.Resultados
No desenvolvimento do método as linhas de emissão identificadas com melhor emissão
foram 189,042 para o arsênio e 206,833 para o antimônio, sendo as mesmas utilizadas para
determinação dos parâmetros de validação.
4.3.1. Especificidade
A leitura da amostra composta somente por matriz lipossomal representado pela linha verde
na leitura de arsênio (figura 5A) e azul na leitura do antimônio (figura 5B) coincidiu com a linha
base do aparelho.
(A)
(B)
Figura 5: Leituras de As (A) e Sb (B) em ICP OES. A leitura correspondente à amostra de
lipossomas vazios é a verde em (A) e a azul escuro em (B).
25
Capítulo 1
4.3.2. Linearidade
Os dados das curvas analíticas, resultantes de três curvas padrão, foram ajustados por análise
de regressão linear (Tabelas 2 e 3). A equação da reta de As é dada por: Emissão = 2052,23 [As]
(mg/l) + 464,41, com coeficiente de correlação de 0,9997. Já a equação da curva do Sb é: Emissão=
3704,30 [Sb] (mg/l) -1523,48 com coeficiente de correlação de 0,9996. O teste de análise de
variância (ANOVA) avaliou a qualidade do ajuste do modelo linear (tabela 4), visto que, os valores
de F calculados apresentaram-se menores que os valores de F teóricos, com 95% de confiança.
Tabela 2: Curva analítica do antimônio (Sb)
Concentração de Sb
Média da Emissão
Concentração calculada de Sb
(mg/l)
(±D.P.)*
(±D.P.)*
3,0
10987,3 ± 441,98
3,4 ± 0,12
5,0
17525,7 ± 97,59
5,1 ± 0,03
7,5
26586,3 ± 250,80
7,6 ± 0,07
10,0
35279,7 ± 659,70
9,9 ± 0,18
20,0
70324,3 ± 1727,97
19,4 ± 0,47
30,0
107721,7 ± 132,07
29,5 ± 0,04
40,0
147485,0 ± 1984,69
40,2 ± 0,54
50,0
184798,3 ± 4326,50
50,3 ± 1,17
*DP = Desvio Padrão, n=3
Tabela 3: Curva analítica do arsênio (As)
Concentração de As
Média da Emissão
Concentração calculada de
(mg/l)
(± D.P.)*
As (± D.P.)*
3,0
6094,7 ± 32,52
2,7 ± 0,01
5,0
10450,7 ± 109,82
5,0 ± 0,05
7,5
15937,0 ± 73,37
7,5 ± 0,04
10,0
21012,0 ± 73,61
10,0 ± 0,04
20,0
41858,3 ± 416,06
20,2 ± 0,20
30,0
62771,7 ± 167,86
30,4 ± 0,08
40,0
81835,3 ± 463,75
39,7 ± 0,22
*DP = Desvio Padrão, n=3
26
Capítulo 1
Tabela 4: Teste de variância para a linearidade
Sb
As
Variáveis
dfa
SS
F calculado b
F Teórico c
Regressão
2
2026000
0,0002364
3,37
Resíduos
24
102900000000
Total
26
Regressão
2
375200
0,0002216
3,42
Resíduos
21
17780000000
Total
23
a Graus de liberdade.
b Fl = s2l/s2e and Fnl = s2nl/s2e.
c Valor teórico de F [1, p(n-1), 1-Į@
4.3.3. Precisão
A precisão foi avaliada através dos estudos de repetibilidade e precisão intermediária. O
estudo de repetibilidade demonstrou coeficientes de variação entre 0.12 e 1.81% para o antimônio e
0.88 e 1.60 % para o arsênio (Tabela 5). O estudo de precisão intermediária, que avalia a variação de
ensaios realizados em dias diferentes, demonstrou coeficiente de variação entre 1.01 e 2.85% para o
antimônio e 1.12 e 1.90% para o arsênio (Tabela 6). Ambos abaixo do valor máximo exigido de 5%.
Através do teste t de Student, foi avaliada a possível existência de uma diferença estatisticamente
significativa entre os resultados obtidos nos ensaios realizados em dias diferentes e com diferentes
analistas. Como se pode observar na tabela 7, em todos os casos o t calculado foi menor que o t
teórico, com 95% de confiança.
27
Capítulo 1
Tabela 5: Resultados do estudo de repetibilidade
Concentração (mg/l)
Teórica
Sb
As
D.P. *
C.V.% * Exatidão
Experimental
(%)
5,0
5,0
5,1
5,0
0,03
052
101,32
10,0
9,8
10,1
9,8
0,04
1,81
98,72
30,0
29,5
29,5
29,4
0,08
0,12
98,26
5,0
4,9
5,0
4,8
0,08
1,60
100,36
10,0
9,9
9,8
9,7
0,09
0,88
100,03
30,0
29,6
29,8
29,8
0,09
1,48
99,98
*DP = Desvio Padrão: C.V.= Coeficiente de Variação
Tabela 6: Resultados do estudo de precisão intermediária
Concentração
Média da Emissão
(mg/l)
Dia 1
Dia 2
Média da
Coefficient of
Concentração
Variation
calculada
(C.V.%)
(± S.D.)*
Sb
As
5,0
17525,7
16883,0
5,0 ± 0,14
2,85
10,0
35279,7
34644,0
9,9 ± 0,10
1,02
30,0
107721,7
103237,0
29,7 ± 0,30
1,01
5,0
11531,0
10450,7
5,0 ± 0,14
1,12
10,0
22560,0
21012,0
9,8 ± 0,19
1,90
30,0
67359,7
62771,7
30,0 ± 0,43
1,42
Tabela 7: Dados estatísticos do teste t de Student
t cauculado
t teórico
Inter-Analistas
Metanol
Inter-dia
Intra-dia
Sb
0,23
1,33
2,88
0,01
As
0,18
0,93
0,66
0,01
2,92
28
Capítulo 1
4.3.4. Exatidão
A exatidão foi verificada para três níveis de concentração: baixo, médio e alto. Os dados
experimentais obtidos revelaram uma recuperação porcentual que variou entre 98,26 e 101,32% para
o antimônio e 99,98 e 100.36% para o arsênio (Tabela 5).
4.3.5. Robustez
A mudança de analistas no preparo das amostras não provocou variação nas emissões do As e
do Sb. As concentrações obtidas pelas analises realizadas pelo analista 1 foram de 19,8 ± 0,60 mg/l
de antimônio e 20,3 ± 0,55 mg/l de As, enquanto pelo analista 2 foi de 19,9 ± 0,13 mg/l de Sb e
20,3 ± 0,15 mg/l de As. A mudança da fonte fornecedora de metanol resultou em concentrações
médias de antimônio de 20,2 ± 0,07 mg/l para o tipo A e 19,8 ± 0,41 mg/l para o tipo B e as
concentrações de As foram 20,2 ± 0.53 mg/l para o tipo A e 20,46 ± 0.50 mg/l para o tipo B. Dentre
todos os resultados o maior coeficiente de variação encontrado foi de 1,22%. De acordo com o teste t
de student (Tabela 7) não há diferença entre os resultados obtidos, com 95,0% de confiança.
4.3.6. Limite de detecção e Limite de Quantificação
Os valores de limite de detecção foram 0,02 mg/l para o Sb e 0,06 mg/l para o As, o que
corresponde a 0,11% e 0,29% da concentração teste, respectivamente. Já o valor do limite de
quantificação, estabelecido experimentalmente, foi de 3,0 mg/l para ambos.
4.3.7. Aplicação do método
Em nosso laboratório foram desenvolvidas formulações de arsenito de sódio e tártaro emético
de acordo com a metodologia proposta acima e em seguida realizou-se a quantificação dos
semimetais utilizando a técnica aqui validada. Foram obtidos coeficientes de encapsulação de 9,87%
de encapsulação para a formulação de arsenito de sódio e 13,65% para a formulação de tártaro
emético.
29
Capítulo 1
4.4. Discussão
A literatura apresenta diversos métodos para quantificar As e Sb em matrizes como solo,
amostras de material biológico dentre outras, no entanto, em muitos há complexidade no preparo das
amostras como etapas de purificação e digestão ou utilização de grandes volumes de solventes. Além
disso, métodos validados para quantificação destes semimetais em matriz lipossomal são escassos,
dentre estes pode ser citado o trabalho de Oliveira e colaboradores (2006) que validaram um método
fotométrico para quantificação de Sb em lipossomas.
Neste sentido, um método sensível, simples e adequado para quantificação de As e Sb em
lipossomas, foi aqui validado o que garantiu a qualidade e a confiabilidade dos resultados obtidos na
caracterização das formulações utilizadas no estudo de cardiotoxicidade.
O método validado pode ser considerado específico, visto que, a leitura da amostra somente
com lipossomas brancos coincidiu com a linha base do aparelho o que demonstra que não haverá
interferência da matriz nas leituras das amostras com As ou Sb.
Os coeficientes de correlação de 0,9997 e 0,9996 para As e Sb, respectivamente,
demonstraram que 99,97% e 99,96% da variação total em torno da média é explicada pela regressão
linear e a análise de variância (ANOVA) demonstrou ser a regressão altamente significativa, bem
como não foi evidenciada a falta de ajuste do modelo, uma vez que, os valores de F calculados foram
menores do que os valores de F críticos no nível de 95,0% de confiança.
Os resultados do estudo de exatidão demonstram que pequenas variações da concentração dos
semimetais estudados podem ser prontamente quantificadas pelo método, bem como não há
interferência dos excipientes da forma lipossomal na dosagem do produto final, portanto, o método
analítico desenvolvido é suficientemente exato. O método demonstrou também ser preciso, visto que,
não ocorreu diferença estatística entre as dosagens realizadas intra e inter dia.
Os limites de quantificação e detecção estão abaixo das concentrações encontradas em
formulações de lipossomas com estes compostos, como a formulação de Wang e colaboradores
(2007) cuja formulação de As em nanoparticulas com PEG apresentou concentração de 73,6 mg/l,
Chen e colaboradores (2006) cuja formulação apresentou concentração de l6,73 g/l de arsênio e De
Melo e colaboradores (2003) cuja formulação de Sb possui concentração de 950,0mg/L. No caso das
formulações desenvolvidas em nosso laboratório as concentrações são de 1,74 g/l para o As e 11,6 g/l
para o Sb. Isso torna o método viável para a quantificação destes semimetais em formulações
lipossomais.
30
Capítulo 2
5. CAPÍ TULO 2:
Avaliação da Toxicidade do Arsênio e do Antimônio
trivalentes
31
Capítulo 2
5.1.I ntrodução
Como anteriormente citado, apesar da aplicabilidade dos semimetais As ou Sb na terapêutica
de doenças endêmicas relevantes, sua utilização é limitada devido à indução de marcantes efeitos
tóxicos, principalmente sobre o sistema cardiovascular.
Diante das já relatadas semelhanças entre estes semimetais e tendo em vista que em estudos
anteriores com pacientes leucêmicos tratados com As concomitante ao AA foram demonstrados
aumento da eficácia e redução da toxicidade (Bahlis et al.,2002; Singh, 2007), foi idealizado a
avaliação da possível redução da toxicidade de Sb pela administração concomitante com AA. Além
disso, diante da ausência de estudos de avaliação da proteção do AA contra a toxicidade
cardiovascular do As, este também foi avaliado neste trabalho.
Por outro lado, a demonstração anterior por nosso grupo de pesquisa de redução da
cardiotoxicidade do tártaro emético veiculado em lipossomas gerou também o objetivo de avaliar a
possível redução da cardiotoxicidade do As trivalente veiculado em lipossomas. Assim, este capítulo
apresenta a metodologia empregada e os resultados e discussão dos dados obtidos visando atender
aos objetivos acima propostos.
5.2. M étodos
5.2.1. Lipossomas
Lipossomas
de
arsenito
de
sódio
foram
obtidos
utilizando-se
a
metodologia
de
congelamento/descongelamento como descrito por Mayer e colaboradores. (1985), seguida de
extrusão através de membranas de policarbonato de 200 nm como proposto por Nayar e
colaboradores (1989) e descrita no capitulo 1.
5.2.1.1. Caracterização da preparação de lipossomas de arsênio
5.2.1.1.1. Determinação da eficiência de encapsulação
Para a quantificação de As encapsulado nos lipossomas, 100,0 µl de amostra foram
solubilizados em 0,5 ml de metanol, para o rompimento da membrana vesicular e a conseqüente
liberação do conteúdo encapsulado. O volume foi completado para 10,0 ml com água ultra-pura. As
dosagens foram realizadas em triplicata por ICP OES utilizando metodologia descrita no capítulo 1.
As leituras das emissões das amostras lipossomais contendo As foram corrigidas pelas leituras de
32
Capítulo 2
emissão de amostras de lipossomas brancos ou vazios, utilizando-se como referência a curva padrão
de As, linear no intervalo de concentração entre 3,0 e 40,0 ppm.
A eficiência de encapsulação (EE) foi calculada como o teor de substância presente na
formulação após diálise de 24 horas, em relação ao total encontrado na preparação não submetida à
diálise, através da equação abaixo:
EE% = Concentração da substância nos lipossomas x 100
Concentração total de arsênio
5.2.1.1.2. Determinação do tamanho dos lipossomas
O tamanho das vesículas e o índice de polidispersão da preparação foram determinados por
espectroscopia de correlação de fótons, utilizando Nanosizer N5 (Beckman Coulter, EUA). As
preparações contendo As ou salina tamponada foram diluídas na proporção de 1:250 em água ultrapura e a distribuição de tamanho e a polidispersão foram avaliadas efetuando-se a leitura de 4
amostras em triplicata.
5.2.1.1.3. Determinação da carga superficial dos lipossomas
O potencial zeta foi determinado pela mensuração da mobilidade eletroforética, utilizando o
Zetasizer 3000 HS (Malvern Instruments, Reino Unido). As preparações contendo As ou salina
tamponada foram diluídas na proporção de 1:250 em água ultra-pura e as leituras efetuadas em
triplicata para o total de 4 amostras.
5.2.1.1.4. Perfil de liberação in vitro do Arsênio a partir dos lipossomas
Com o objetivo de avaliar a capacidade dos lipossomas reterem o As em condições
fisiológicas, amostras de 100,0 µl de formulação lipossomal de As foram incubadas em 1,0 ml de
solução de plasma humano a 5,0 % e a 3,07 °C, de forma a garantir a condição sink (excesso de
volume de meio que irá permitir que o ativo dissolva-se continuamente), e após 0,5, 1, 3, 6, 12, 24, 36 e
72 horas, alíquotas de 200,0 ȝl foram colocados em ultra filtros de celulose (Microcon® 50,000
MWCO) e centrifugados por 30 minutos a 12000 rpm, de modo a permitir que a fração livre passasse
livremente pela membrana de filtração e a fração encapsulada fosse retida sob o filtro.
Ambas as amostras, filtradas ou não, coletadas nos diferentes tempos, foram solubilizadas em
33
Capítulo 2
0,5 ml de metanol e diluídas para 10,0 ml. Em seguida foram submetidos à dosagem por ICP/OES,
sendo os valores obtidos comparados àqueles referentes à preparação inicial, a fim de determinar o
perfil de liberação in vitro do As a partir dos lipossomas.
5.2.1.1.5. Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas
Com o objetivo de avaliar o percentual de As liberado do interior das vesículas em condições
de armazenamento e em função do tempo, formulação lipossomal contendo ou não As foi
armazenada em geladeira, a 4,0°C, por 30 dias. Nos tempos 3, 7, 14, 21 e 30 dias, uma amostra de
100,0 ȝl da formulação lipossomal contendo arsênio e da preparação de lipossomas brancos foram
colocados em ultrafiltros de celulose (Microcon® 50,000 MWCO) e centrifugados por 30 minutos a
12000 rpm, de modo a permitir que a fração não encapsulada passasse livremente pela membrana de
filtração e a fração encapsulada fosse retida.
Amostras do filtrado ou retido coletadas nos diferentes tempos foram solubilizados em 0,5 ml
de metanol, diluídos para 10,0 ml e, em seguida, submetidos a dosagem do semimetal por ICP/OES,
sendo os valores obtidos comparados àqueles referentes à preparação inicial, para fim de cálculo do
percentual de liberação do As a partir dos lipossomas, através da equação:
Liberação% = 100 -
Concentração de arsênio na preparação armazenada
x 100
Concentração de arsênio na preparação inicial
5.2.1.1.6. Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostra de lipossomas
Com o objetivo de confirmar a permanência do As no estado de oxidação trivalente após a
técnica de encapsulação deste em lipossomas, realizou-se a análise de uma amostra da formulação
através de Espectroscopia de Absorção de Raio-X (X-Ray Absorption Fine Spectroscopy, XAFS).
Foram analisados e comparados os espectros XANES (X-Ray Near-Edge Structure) das preparações
lipossomais contendo arsênio e de padrões deste elemento. Estas análises foram realizadas por meio
de parceria com a Professora Mônica Cristina Teixeira da Universidade Federal de Ouro Preto, em
colaboração com pesquisadores do Departamento de Metalurgia da Universidade Federal de Minas
Gerais no Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS) em Campinas, SP.
O princípio básico da espectroscopia de absorção de raios-X é a excitação de elétrons
34
Capítulo 2
localizados nos níveis atômicos K, L e M do átomo absorvedor de raios-X. Se a energia do fóton
incidente é suficiente para retirar os elétrons localizados nos níveis internos, a absorção aumenta
drasticamente, mostrando um salto no espectro de absorção. Esse aumento observado no espectro é
chamado de borda (E0) da banda de absorção e a energia com que isso acontece depende da absorção
de energia de ligação dos elétrons do átomo, sendo, portanto, característica de cada elemento
químico. O espectro XAFS é dividido em duas regiões: EXAFS (Extended X-Ray Absorption Fine
Structure), que fornece informações sobre o número de coordenação, as distâncias interatômicas e a
natureza dos átomos vizinhos ao átomo absorvedor e XANES (X-Ray Absorption Near Edge
Structure) que fornece informações sobre o estado de oxidação do átomo ao apresentar alterações
estreitas e intensas na borda de absorção. Em nosso trabalho analisamos apenas a região XANES dos
espectros coletados (Ciminelli et al,2009).
Para isso foram analisadas as seguintes amostras sólidas: pó resultante da liofilização da
formulação lipossomal contendo arsênio, arsenato de sódio (Na2HAsO4.7H2O ) e arsenito de sódio
(NaAsO2) ambos com teor de pureza superior a 99% fornecidos pela Sigma.
Os espectros XANES referentes a borda K de absorção característica do Arsênio (E0=11868
eV, para o As0) foram coletados na linha XAFS2. As amostras sólidas foram colocadas em portaamostras acrílicos selados com fita Kapton®. Todos os espectros foram coletados à temperatura
ambiente, com uma corrente de aproximadamente 250mA, utilizando-se detectores monocromadores
6LDQG6L³double crystal´FRPXPa abertura de feixe vertical de 0,5mm. Os espectros dos
padrões e da amostra foram medidos pelo monitoramento da energia transmitida e também da
fluorescência emitida utilizando-se um detector Ge multielementos. (15-element Ge detector,
Canberra Industries) e ar na câmara de ionização. A calibração da energia foi obtida pela medida
simultânea da absorção do Ouro (Au) na borda L3 utilizando-se para isso uma amostra de folha de
ouro metálico (que atua como um branco). As resoluções de energia empregadas foram: 3,0 eV na
região pré borda, entre 11670 e 11840 eV com tempo de aquisição de 1 segundo; 0,5 eV na região do
espectro XANES situada entre 11840 e 11900eV com tempo de aquisição de 1 segundo; 1,0 eV na
região compreendida entre 11900 eV e 12070, com tempo de aquisição de 2s; 2,0 eV entre 12070 e
12270 Ev, com tempo de aquisição de 4 segundos e finalmente na região compreendida entre 12270
e 12570 foi empregado um passo de energia de 3,0 eV e tempo de contagem de 4 segundos.
As médias dos espectros coletados foram matematicamente tratadas para remoção do
³background´ e a determinação do valor da borda de absorção do As utilizando-se os softwares
Origin 6.0TM e Athena 0.8.056. A borda de absorção do elemento é obtida após a derivação de cada
35
Capítulo 2
curva experimental. O valor da borda de absorção equivale ao ponto máximo da primeira derivada de
cada espectro. Este valor é mais facilmente obtido pela análise da segunda derivada de cada curva,
considerando-se que o máximo da primeira derivada equivale ao zero da segunda derivada da curva,
assim, basta identificar, para cada curva, o ponto exato onde a curva da segunda derivada de cada
espectro corta o eixo de x, sendo y=0. O valor da borda de absorção E0 de um elemento será tanto
maior quanto maior for o seu estado de oxidação e difere um pouco do valor observado no espectro
original.
5.2.2. Experimentos in vivo
5.2.2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 200 e 250 g, fornecidos pelo biotério
central da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os animais foram mantidos no biotério da
Escola de Farmácia da UFOP até sua utilização, sob ciclo de 12 horas claro/escuro e recebendo água
e ração (Socil®) ad libitum.
5.2.2.2. Determinação da dose máxima tolerada (DM T)
A dose máxima tolerada do As e Sb pelos animais foi determinada pela administração por via
endovenosa de diferentes doses (n=6 para cada dose) destes semimetais contidas em soluções de
arsenito de sódio e tártaro emético. As soluções foram preparadas utilizando como veículo solução
salina tamponada, pH 7,2.
Os animais receberam tiopental sódico na dose de 60,0 mg/kg, por via intraperitonial (IP).
Após a anestesia ter alcançado a profundidade necessária, foi inserido catéter de polietileno na veia
femoral esquerda para administração intravenosa (IV) da solução de As ou de Sb. Os catéteres foram
confeccionados, unindo-se por aquecimento 5,0 cm de tubo de PE10 a 15,0 cm de tubo de PE50,
preenchidos com solução salina heparinizada e ocluídos por agulhas 25x7 cortadas. Após este
procedimento, a porção do catéter exterior ao vaso foi deslocada abaixo da pele do animal e sua
extremidade exteriorizada através de uma incisão realizada em seu dorso. As incisões foram
suturadas ao final do procedimento.
Após a recuperação cirúrgica (24 horas), os animais receberam as soluções dos semimetais
via catéter endovenoso e foram observados por 72 horas sendo dose máxima tolerada definida como
a maior dose que não causou morte ou sinal visível de toxicidade (motilidade intestinal, piloereção e
emese).
36
Capítulo 2
5.2.2.3. Obtenção dos sinais cardiovasculares
Os animais receberam tiopental sódico na dose de 60,0 mg/kg, por via IP. Após a anestesia ter
alcançado a profundidade necessária, os animais foram traqueostomizados e deixados sob respiração
espontânea. Foram inseridos cateteres de polietileno na artéria e veia femorais esquerdas para
obtenção dos sinais da pressão arterial (PA) e administração IV das formulações, respectivamente.
Após a cateterização, a extremidade PE10 se localizava na aorta abdominal, abaixo das artérias
renais, para registro da pressão arterial, e veia cava inferior, para injeção das formulações.
A extremidade PE50 do catéter inserido na artéria femoral foi acoplada a um transdutor de
pressão TruWave® (Edwards Lifescience, Canadá) para aquisição do sinal de PA. Para a obtenção da
diferença de potencial relativa à derivação DII do ECG, agulhas hipodérmicas de aço inoxidável
foram inseridas no tecido subcutâneo dos animais. Os sensores de ECG e transdutor de PA foram
acoplados a um sistema condicionador que fornecia sinais em tempo real a uma freqüência de 1200
Hz, processados por uma placa conversora analógico-digital (DaqBoard/2001, EUA).
Figura 6: Sistema de aquisição dos sinais de ECG e PA.
37
Capítulo 2
5.2.2.4. Análise dos parâmetros cardiovasculares
Os registros digitais dos experimentos foram convertidos através do software Matlab 7.0
(MathWorks, EUA) e analisados por inspeção visual com o auxílio do software WinDaq (DATAQ
Instruments, EUA). Foram selecionados segmentos de 2,0 segundos em instantes específicos dos
quais foram extraídos os seguintes parâmetros cardiovasculares: pressão arterial sistólica (PAS) e
diastólica (PAD), freqüência cardíaca (FC), intervalos QT, RR, PR e complexo QRS do ECG e
correção do intervalo QT pelo índice de Fridericia (1920): QTc = QT/(RR)1/3.
Figura 7: Traçado normal do ECG e seus intervalos
5.2.2.5. Avaliação Hematológica
A avaliação dos parâmetros hematológicos foi realizada nos animais dos grupos submetidos
ao tratamento subagudo no dia seguinte ao termino do tratamento, após obtenção dos parâmetros
cardiovasculares, quando foram coletadas amostras de sangue total em tubo contendo heparina
sódica.
Os parâmetros hematológicos avaliados incluíram contagem de hemácias, hemoglobina,
hematócrito, contagem de leucócitos (total e diferencial) e contagem de plaquetas. Estes foram
realizados em um analisador automatizado (VET2800-MINDRAY, Brasil) com exceção da contagem
diferencial de leucócitos que foi realizada pela análise de esfregaço sanguíneo, corado com corante
panótica rápida (Instant Prov) , em microscópio óptico Olympus CX 21 do LAPAC, UFOP..
38
Capítulo 2
5.2.2.6. Avaliação Bioquímica
Para as dosagens de parâmetros bioquímicos também realizadas nos animais dos grupos
submetidos ao tratamento subagudo, o procedimento foi o mesmo para o item anterior, porém a
coleta de sangue para a obtenção de soro, ou seja, sem anticoagulante. O soro foi obtido através da
centrifugação da amostra sanguínea a 3000 rpm por 15 minutos e congelado a -18 0C até o momento
da análise.
Os parâmetros bioquímicos avaliados incluíram aspartato alaninatransferase(ALT), aspartato
aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA), proteína total para avaliação da função hepática,
creatinina e uréia para avaliação da nefrotóxicidade e creatino quinase fração MB (CKMB) para
avaliação de lesão cardíaca. As quantificações foram realizadas espectrofotometricamente utilizando
um analisador automatizado (Airone 200, pais) e Kits diagnósticos do laboratório Bioclin.
5.2.2.7. Avaliação Histopatológica
Análise histopatológica foi realizada no coração e fígado dos animais dos grupos submetidos
ao tratamento subagudo por meio de parceria com a Professora Claudia Martins Carneiro da
Universidade Federal de Ouro Preto.
Após obtenção dos parâmetros cardiovasculares e coleta de sangue os órgãos foram
removidos, lavados com solução de NaCl 0,9% (p/v) e fixados em formaldeído 10% (v/v)
tamponado (pH 7,2), com o objetivo de preservar a morfologia e a composição do tecido até a
confecção das lâminas no Laboratório de Imunopatologia, NUPEB, UFOP.
Os tecidos foram submetidos à desidratação para remover toda a água presente nos mesmos.
O processo foi realizado em concentrações crescentes de álcool (alcoóis 70, 80, 90 e absoluto),
deixando-se os tecidos imersos por um período de 20 minutos em cada concentração.
Após a desidratação, seguiu-se a diafanização a fim de tornar o tecido translúcido. Para isso,
os tecidos foram submetidos a dois banhos de xilol com duração de 10 minutos cada. Seguiu-se
então a inclusão dos tecidos em parafina, utilizando dois banhos de parafina para sua penetração nos
vasos e espaços intercelulares. Foram confeccionados blocos contendo cada um o fígado, e o coração
de cada animal.
Os blocos de parafina contendo os tecidos impregnados foram, então, submetidos à
microtomia obtendo-se dois cortes seriados com 4 µm de espessura cada um, para cada bloco. Os
cortes foram colocados em banho-maria para que as fitas fossem esticadas e colocadas sobre as
39
Capítulo 2
lâminas de vidro que foram mantidas em estufa a 60o C para secarem.
Com os tecidos já aderidos às lâminas, foi realizada a coloração Hematoxilina-Eosina para
proporcionar uma análise geral das alterações histopatológicas. O processo de coloração se inicia
com a imersão das lâminas em dois banhos de xilol de 15 minutos cada, para desparafinização. Em
seguida, essas lâminas foram imersas em banhos de álcool (alcoóis absoluto, 90, 80 70) e água, cada
um de 5 minutos, para re-hidratação. Seguiu-se um banho de 10 minutos no corante hematoxilina
(corante ácido), em seguida as lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos. Foi realizada
então a diferenciação com a passagem rápida das lâminas em álcool-acidulado. Novamente as
lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos e imersas no corante eosina (corante básico)
por 30 segundos e em seguida lavadas em água corrente por 1 minuto.
Para finalizar o processo, as lâminas foram imersas em três banhos de álcool absoluto
rapidamente e levadas à estufa a 60o C por alguns minutos para secagem. Depois de secas, as lâminas
foram imersas em xilol e montadas com Entellan (Merck) e lamínula.
As avaliações foram feitas utilizando-se objetiva de 40X do microscópio Olympus BX50,
pentaocular localizado na Escola de Farmácia, UFOP. A fotodocumentação foi realizada no
Laboratório Multiusuários do NUPEB, UFOP utilizando-se a objetiva de 40X de um microscópio
Leica, DM5000, acoplado a câmera digital e computador.
5.2.2.8. Protocolos Experimentais
5.2.2.8.1. Agudo
Alterações cardiovasculares, avaliadas pelos sinais de ECG e PA, foram avaliadas após
administração por via endovenosa e em dose única dos compostos semimetálicos em estudo, nas
formas livre, lipossomal e livre associada ao ácido ascórbico. Os tempos avaliados foram de 0,5, 1,0,
1,5, 2,0, 2,5, 5,0, 7,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0 60,0 minutos. Os animais
foram divididos em nove grupos (n=6 em cada grupo) que receberam: 1) Controle: salina
tamponada; 2) As: solução de arsenito de sódio na dose de 6,5 mg/kg; 3) Sb: solução de tártaro
emético na dose de 17mg/kg; 4) AA: solução de ácido ascórbico na dose de 650mg/kg; 5) As+AA:
solução de arsenito de sódio + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas; 6) Sb+AA: solução
de tártaro emético + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas; 7) Lipossoma Arsênio:
formulação lipossomal de arsenito de sódio na dose de 6,5 mg/kg; 8) Lipossoma Branco:
formulação lipossomal de PBS; 9) Lipossoma Sb: formulação lipossomal de Sb (realizado em
trabalho anterior).
40
Capítulo 2
O protocolo experimental está esquematizado em etapas abaixo, sendo os tópicos 3 e 4
somente para os grupos As+AA e Sb+AA (grupos 5 e 6).
1. Anestesia dos animais
2. Procedimento cirúrgico
3. Registro controle por 5 minutos de ECG e PA
4. Administração endovenosa de ácido ascórbico
5. Intervalo de 5 minutos
6. Administração do semimetal
7. Registro de ECG e PA por 60 minutos
(A)
(B)
Figura 8: Desenho esquemático do protocolo experimental agudo. (A) Protocolo agudo para os
grupos As, Sb, PBS, AA, Lipossoma As, Lipossoma Sb, Lipossoma Branco; (B) Protocolo agudo
para os grupos, Sb+AA, As+AA.
5.2.2.8.2. Subagudo
As alterações cardiovasculares avalidas pelos sinais de ECG e PA, e as alterações
hematológicas, bioquímicas e histopatológicas foram avaliadas após administração, dos compostos
semimetálicos por via IP durante 30 dias, nas formas livre e juntamente com o ácido ascórbico. Os
animais foram divididos em seis grupos (n=6 em cada grupo): 1) Controle: salina tamponada; 2) As:
solução de arsenito de sódio na dose de 3,5 mg/kg; 3) Sb: solução de tártaro emético na
41
Capítulo 2
concentração de 3,8 mg/kg; 4) AA: solução de ácido ascórbico na concentração de 15 mg/kg; 5)
As+AA: solução de arsenito de sódio + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas; 6) Sb+AA:
solução de tártaro emético + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas.
O protocolo experimental está esquematizado em etapas abaixo:
1. Anestesia dos animais
2. Registro controle de ECG por 5 minutos
3. 24 horas de intervalo para recuperação dos animais
4. Tratamento por 30 dias
5. Anestesia e procedimento cirúrgico no dia seguinte ao término do tratamento
6. Registro por 5 minutos de ECG e PA
7. Coleta de sangue e retirada de órgãos para análises posteriores
Figura 9: Desenho esquemático do protocolo experimental subagudo
5.2.10. Análise Estatística
Após atenderem ao teste de normalidade os parâmetros foram analisados por One-way
ANOVA seguida do pós-teste de Turkey. Os dados não paramétricos foram analisados por teste de
Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Duns. O software GraphPad Prism® 5.0 (GraphPad
Software, EUA) foi utilizado como ferramenta para as análises estatísticas. Os dados foram
expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m) e as diferenças foram consideradas
significativas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P < 0,05).
42
Capítulo 2
5.3. Resultados
Para melhor entendimento, os dados foram divididos em tópicos de acordo com o semimetal
analisado.
5.3.1. Arsênio
5.3.1.1. Lipossomas
5.3.1.1.1. Caracterização da preparação de lipossomas de arsênio
a. Determinação da eficiência de encapsulação
As concentrações de As nas amostras foram determinadas por ICP/OES a partir equação da
reta obtida de curva padrão visualizada na figura 10. A tabela 8 apresenta a média da eficiência de
encapsulação de 4 amostras de formulações de As lipossomal após diálise da preparação por 24
Emissão
horas.
Média
R2 = 0.9996
Linear
Equação da reta: Emissão= 2052.23 [As] (mg.L-1) + 464.41
Figura 10: Curva padrão de arsênio obtido por ICP/ OES
Tabela 8: Dosagem de Arsênio em amostras de lipossomas. Média ± e.p.m.
Concentração de arsênio na
preparação
sem diálise (mg/ml)
Concentração de arsênio na
amostra de
lipossomas após diálise
(mg/ml)
Eficiência de Encapsulação
(% )
22,2 ± 2,13
2,0± 0,05
9,0 ± 0,12
43
Capítulo 2
b. Determinação do tamanho dos lipossomas
A tabela 9 apresenta os valores do diâmetro médio das vesículas lipídicas e índice de
polidispersão do tamanho da população, determinados por espectroscopia de correlação de fótons,
dos lipossomas brancos e contendo arsênio. A figura 11 apresenta graficamente os resultados
apresentados na tabela.
Tabela 9: Diâmetro médio e índice de polidispersão da população de lipossomas. Valores expressos
em média ± e.p.m.
Amostras
Diâmetro médio (nm)
Í ndice de polidispersão
Arsênio
231,8 ± 6,42
0,167 ± 0,0189
PBS
204,5 ± 3,38
0,146 ± 0,0112
% in class
Size distribution(s)
15
10
5
50
100
500
1000
Diameter (nm)
Figura 11: Registro gráfico da análise de tamanho dos lipossomas contendo As.
44
Capítulo 2
c . Determinação da carga superficial dos lipossomas
A tabela 10 apresenta os valores da determinação da carga superficial (potencial zeta) para a
preparação de lipossomas contendo As e para a preparação de lipossomas brancos. A figura 12
apresenta graficamente os valores de potencial zeta apresentados na tabela.
Tabela 10: Potencial zeta das amostras de lipossomas. Valores expressos em média ± erro padrão da
média.
Amostras
Potencial Zeta (mV)
Arsênio
- 37,80 ± 0,8
PBS
- 41,75 ± 0,3
Intensity
Zeta Potential(mV)
15
10
5
-200
0
Zeta Potential(mV)
200
Figura 12: Registro gráfico do potencial zeta dos lipossomas contendo As.
45
Capítulo 2
d Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas
Os valores obtidos na avaliação da estabilidade da formulação de arsênio encapsulada em
lipossomas e armazenada em geladeira (4,0°C) estão apresentados na tabela abaixo.
Tabela 11: Parâmetros indicadores de estabilidade da formulação de lipossomas contendo As no
período de 30 dias.
Período após preparação (dias)
Concentração (mg/ml)
%Liberação
0
1,74
-
3,0
1,31
24,71
7,0
0,91
47,92
14,0
0,58
66,76
21,0
0,38
77,93
30,0
0,38
78,23
e. Perfil de liberação in vitro do Arsênio a partir dos lipossomas
Os valores obtidos na avaliação da liberação in vitro do As a partir dos lipossomas incubados
com solução de plasma a 5,0% a 37,0°C estão apresentados na tabela 12.
Tabela12: Parâmetros indicadores da liberação do arsênio dos lipossomas a 37°C.
Tempo de incubação (horas)
Concentração (mg/ml)
% Liberação
0
1,81
-
0,5
1,80
0,55
1,0
1,78
1,66
3,0
1,78
1,66
6,0
1,76
2,76
12,0
1,73
4,42
24,0
1,69
6,63
36,0
1,57
13,26
72,0
1,34
25,97
46
Capítulo 2
f. Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostras lipossomais
A figura 13 apresenta graficamente os espectros XANES obtidos para a amostra de
lipossomas contendo As e os padrões. A energia de absorção (Eo) da amostra foi de 11867,96 eV,
muito próxima do valor obtido para o padrão de As III que apresentou valor de E 0 de 11868,79.
Além disso, as características dos dois espectros foram muito semelhantes. Em contra partida, o pico
de absorção do padrão de AsV apresentou valor mais elevado, de 11870,50, condizente com um
estado de oxidação maior, além de características um pouco diferentes, os espectros de AsV
geralmente apresentam uma segunda elevação na região após a borda de absorção, o que não se
observa na amostra de lipossoma, nem no padrão de AsIII. As linhas retas acrescentadas à figura
servem apenas como base de comparação, mostrando o deslocamento da borda de absorção do As
em função do seu estado de oxidação e não representam os valores reais do E0 do elemento visto que,
a borda de absorção real encontra-se alguns eV abaixo do pico máximo de cada espectro.
Espectro Xanes Lipossoma/As
2,0
1,8
1,6
AsIII E0
U.A. Intensidade do Sinal
1,4
1,2
Padrão AsIII sólido
1,0
0,8
0,6
As Lipossomal
0,4
0,2
Padrão AsV
0,0
-0,2
AsV E0
-0,4
-0,6
11840
11860
11880
11900
11920
11940
Energia (eV)
Figura 13: Espectro Xanes de amostras de lipossomas contendo Arsênio e padrões de arsênio trivalente e
arsênio pentavalente. Eo ± Borda de absorção do arsênio da amostra.
47
Capítulo 2
5.3.1.2. Experimentos in vivo
5.3.1.2.1. Dose máxima tolerada (DM T) do arsênio
Para a determinação da dose máxima tolerada do As inicialmente foi utilizada a dose de
10,0 mg/kg, a qual causou a morte de 100% dos animais. Foram avaliadas, então, doses decrescentes
até àquela na qual não se observou óbito (6,0 mg/kg). Doses entre as que causaram 100,0% (7,0
mg/kg) e 0% (6mg/kg) de óbitos foram então avaliadas e a DMT do As determinada como
6,5 mg/Kg. A tabela 12 apresenta os valores da percentagem de mortes observadas para cada dose de
solução de As administrada IV nos animais experimentais.
Tabela 13: Percentagem (%) de óbitos de animais que receberam solução de As IV.
Dose de arsênio (mg/Kg)
M ortalidade (% )
10,0
100,0
9,0
100,0
8,0
100,0
7,0
65,0
6,7
12,0
6,5
0,0
6,0
0,0
5.3.1.2.2. Protocolo agudo
Para melhor visualização dos resultados, os dados de variação percentual após administração
dos compostos são apresentados em forma de gráfico (figuras 15 a 17) e os valores absolutos em
tabelas em anexo. Na figura 14 representação de ECG dos grupos em estudo.
Ao analisar conjuntamente os parâmetros obtidos do ECG dos diferentes grupos, foi
observado prolongamento significativo do intervalo PR no grupo As a partir de 25,0 minutos com
variação máxima de 22,49% em comparação aos grupos controle PBS e Lipossoma Branco. Já os
parâmetros QT, QTc, e QRS não apresentaram alterações estatisticamente significativas.
Os animais que receberam AA simultaneamente ao As demonstraram prolongamento do
intervalo PR com variação percentual máxima de 17,73%, não sendo observadas alterações nos
demais parâmetros do ECG. Já o grupo que recebeu somente ácido ascórbico não apresentou
48
Capítulo 2
alterações significativas em nenhum dos parâmetros avaliados.
O grupo que recebeu a formulação lipossomal de arsênio não apresentou alterações
significativas nos parâmetros do ECG quando comparados aos controles PBS e Lipossoma Branco,
apenas um ligeiro e não significativo aumento no intervalo PR foi observado.
Figura14: Parâmetros do ECG em animais antes e após administração IV em dose única da dose
máxima tolerada de arsênio (A) arsênio+ácido ascórbico (B) e Lipossoma contendo arsênio (C).
49
Capítulo 2
% Variação do intervalo PR
25
#
20
*
#
*
#
#
*
#
*
15
#
#
*
#
*
*
*
10
5
0
-5
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
PBS
Lipossoma Branco
AA
As
Lipossoma As
As+AA
% Variação do intervalo QRS
10
5
0
-5
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
Figura 15: Variação percentual dos intervalos PR e QRS do eletrocardiograma dos grupos tratados
em protocolo agudo com arsênio (As; As+AA e Lipossoma As) e controles (PBS, AA e Lipossoma
branco). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6). * P < 0,05 em relação ao grupo PBS e #P<
0,05 em relação ao grupo lipossoma branco ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.
50
Capítulo 2
% Variação do intervalo QT
10
5
0
-5
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
PBS
Lipossoma Branco
AA
As
Lipossoma As
As+AA
% Variação do índice QTc
10
5
0
-5
-10
-15
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
Figura 16: Variação percentual do intervalo QT do eletrocardiograma e índice QTc dos grupos
tratados com arsênio em protocolo agudo (As; As+AA e Lipossomas As) e controles (PBS, AA e
Lipossoma branco). Os valores representam a média ± e.p.m.(n=6) ± ANOVA, seguido de teste de
Tukey.
Ao serem avaliadas as variações percentuais de PA, intensa queda da PAS e PAD foi
observada apenas no grupo tratado com As livre, sendo que, as variações percentuais máximas foram
51
Capítulo 2
de -39,24% para PAS e -41,96%, para PAD e diferenças significativas em relação ao grupo PBS
ocorreram entre 2,5 e 15,0 minutos e não significativas, mas expressivas, após 20,0 minutos. Foram
também identificadas diferenças significativas entre 5,0 e 15,0 minutos na PAS, quando os grupos As
e lipossoma As foram comparados. Vale salientar que nos grupos AA, As+AA, lipossoma branco e
lipossoma As não foram observados variações percentuais significativas quando comparadas ao
controle PBS.
Foi observada redução de 8 a 27% na FC em todos os momentos avaliados no grupo As, no
entanto, esta não foi significativamente diferente dos controles.
Abaixo representação de registro de PA dos grupos analisados (figura 17) e gráficos das
variações percentuias de PA e FC (figura 18).
salina (A); arsênio (B); arsênio + ácido ascórbico (C); e Lipossoma contendo arsênio (D).
52
Capítulo 2
45
% Variação de PAS
30
15
+ + +
+
#
*
0
-15
*
-30
#
#
* * #
*
-45
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
20
% Variação de FC
10
0
-10
-20
-30
Figura 18: Variação percentual de pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial sistólica (PAS) e freqüência cardíaca
(FC) dos grupos tratados com arsênio e controles em protocolo agudo. Os valores representam a média ± e.p.m.(n=6).
Diferença estatisticamente significativa representada por * em relação ao grupo PBS;
#
em relação ao grupo lipossoma
branco e + em relação ao grupo As ± P < 0,05 ANOVA, seguido de teste de Tukey.
53
Capítulo 2
5.3.1.2.3. Protocolo subagudo
a. Avaliação da toxicidade cardiovascular
A Figura 19 abaixo ilustra ECG típico obtido em animais dos grupos As e As+AA. As Figuras
20 e 21 apresentam os resultados obtidos nos experimentos do protocolo subagudo referentes aos
parâmetros do ECG e PA.
Ao avaliar os grupos, diferenças significativas foram identificadas no grupo As em relação ao
grupo PBS nos parâmetros QT, Qtc e PR, com variações percentuais médias de 44,13; 5,5 e 44,49%,
respectivamente, sendo que nos dois primeiros ocorreu aumento quando comparado ao grupo
controle e no intervalo PR redução. Já nos percentuais de variação do complexo QRS e na FC não
foram observadas diferenças significativas
No grupo As+AA foram identificadas diferenças significativas no intervalo QT (variação de
24,09%) e QTc (variação de 21,86%) em relação ao grupo PBS (variação de -1,74% e 1,73% de QT
e QTc, respectivamente). Variações percentuais em média 50% menores que as observadas no grupo
As. Nos demais parâmetros do ECG avaliados não foram observados alterações significativas.
No grupo AA não foram observadas alterações significativas nas variações percentuais dos
parâmetros do ECG quando comparado com o grupo controle PBS.
54
Capítulo 2
Figura 19: Ilustração de ECG obtido antes e após tratamento em protocolo subagudo de arsênio (A)
e arsênio + ácido ascórbico (B).
55
Capítulo 2
15
% Variação de QRS
% Variação de PR
20
15
10
#
&
*
5
10
5
0
0
#
&
*
&
30
15
0
*
*
50
40
30
&
*
20
10
0
1
% Variação de QT
45
#
&
% Variação de QTc
60
60
PBS
AA
As
As + AA
-15
Figura 20: Variação percentual dos parâmetros do eletrocardiograma, PR, QRS, QT, QTc , dos grupos após tratamento sub-agudo com arsênio (As)
arsênio + ácido ascórbico (As+ AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m (n=6) .Valores
estatisticamente diferentes (ANOVA/ Tukey , P < 0,05) representados por * comparado com PBS, & comparado com AA e # comparado com As+ AA.
56
Capítulo 2
Com relação aos parâmetros PAS, PAD e FC, não foram identificadas diferenças
significativas após comparação entre os grupos (Figura 21).
160
140
PAS (mmHg)
120
100
80
60
40
20
0
PBS
AA
160
As
140
As + AA
PAD (mmHg)
120
100
80
60
40
20
0
% Variação de FC
0
-5
-10
-15
-20
-25
Figura 21: Valores absolutos de pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD) e
variação percentual da freqüência cardíaca (FC) após tratamento subagudo com arsênio (As), arsênio
+ácido ascórbico (As+AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam
a média ± e.p.m (n=6).
57
Capítulo 2
Com relação à análise histopatológica do tecido, foi observado que o grupo As+AA mostrou
aspecto compatível com os grupos PBS e AA (controles). Por outro lado, no grupo As ocorreu
degeneração hialina em várias células musculares, edema, inflamação discreta e vacuolização nos
vasos sangüíneos regionais; podendo ainda ser ressaltado o espaçamento entre as células e a perda de
densidade citoplasmática em várias células (figura 22C).
A
*
*
B
*
*
C
D
Figura 22: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA
(B), As (C), As+AA (D). Hematoxilina Eosina, 40X.
58
Capítulo 2
Em relação aos parâmetros bioquímicos, a administração subaguda de As e As+AA não
induziram alterações significativas nos parâmetros CKMB sérico e AST, indicadores de lesão
miocárdica (Tabela 14).
Tabela 14: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar
submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico, (n=6).
Parâmetros
Controle
AA
As
As+AA
AST
(UI /L)
267,8 ± 48,05
165,5 ± 11,77
223,5 ± 35,89
233,1 ± 58,00
CKM B
(UI )
966,9 ± 145,7
920,0 ± 186,4
416,8 ± 34,48
1146,0 ± 203,9
AST (aspartato aminotransferase),
b
a
Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle.
Representa diferença significativa entre os tratamentos com arsênio e arsênio concomitante com ácido ascórbico.
b. Avaliação da toxicidade hepática
A administração subaguda de As e As+AA não induziu alterações significativas nos
parâmetros ALT, AST, albumina e proteínas totais. Por outro lado, diminuição significativa da FA,
foi observada (Tabela 15).
Tabela 15: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar
Parâmetros
Controle
AA
As
As+AA
ALT
(UI /L)
79,5 ± 26,03
45,0 ± 6,61
57,7 ± 11,96
62,2 ± 17,93
AST
(UI /L)
267,8 ± 48,05
165,5 ± 11,77
223,5 ± 35,89
233,1 ± 58,00
Albumina
(g/dL)
3,0 ± 0,06
2,8 ± 0,07
3,1 ± 0,10
3,5 ± 0,12
Proteína Total
(g/dL)
5,6 ± 0,17
5,7 ± 0,16
5,9 ± 0,19
6,0 ± 0,29
FA
(UI /L)
123,4 ± 14,09
112,1 ± 10,96
61,5 ± 5,91 a
60,4 ± 4,84 a
ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), FA (Fosfatase Alcalina).
a
b
59
Capítulo 2
A análise histológica do tecido hepático demonstrou, como na análise histopatológica do
coração, alterações unicamente no grupo As sendo observados alargamento de sinusóides, congestão
e discreta inflamação (Figura 23).
A
C
B
D
Figura 23: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA
(B), As (C), As+AA (D). Observa-se em A, B, e D aspecto histológico compatível com normalidade.
Em C observa-se foco inflamatório discreto, alargamento de sinusóides e congestão (setas).
Hematoxilina Eosina, 40X.
60
Capítulo 2
c. Avaliação da toxicidade renal
A administração subaguda de As e As+AA não induziu alterações significativas nos
parâmetros bioquímicos creatinina sérica, uréia sérica e relação creatinina/uréia sérica que são
indicativos de toxicidade renal (Tabela 16).
Tabela 16: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade renal avaliados em ratos Wistar
a
b
Parâmetros
Controle
AA
As
As+AA
Uréia Sérica
(g/dL)
49,6 ± 2,04
50,3 ± 1,37
61,0 ± 3,19
56,3 ± 2,74
Creatinina
(mg/dL)
0,5 ± 0,03
0,5 ± 0,04
0,5 ± 0,03
0,5 ± 0,035
Í ndice
Ureia/Creatinina
116,8 ± 10,87
108,8 ± 5,64
125,7 ± 7,78
121,4 ± 13,31
61
Capítulo 2
d. Avaliação Hematológica
Os parâmetros hematológicos obtidos ao serem avaliadas as amostras sanguineas dos
diferentes grupos submetidos ao protocolo subagudo encontram-se sumarizadas na tabela 17.
Não foram observadas diferenças significativas dos grupos tratados quando comparados com
o grupo controle, com exceção da diminuição da contagem de leucócitos no grupo tratado com
arsênio, caracterizando leucopenia. Foi observado aumento do número de linfócitos e diminuição de
neutrófilos no grupo tratado As+AA quando comparado com o grupo As.
Tabela 17: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos tratados com As submetidos ao
tratamento subagudo, (n=6).
Parâmetros
Controle
AA
As
As+AA
Hemácia
(109/L)
8,6 ± 0,78
7,9 ± 0,2
7,1 ± 0,4
7,4 ± 0,49
Hemoglobina
(g/dl)
14,1 ± 1,59
13,3 ± 0,42
13,5 ± 1,28
12,2 ± 0,48 a
Hematócrito
(% )
41,1 ± 2,84
32,2 ± 1,29
35,0 ± 1,92
30,8 ± 1,13
Leucócito
(109/L)
6,8 ± 1,17
4,5 ± 0,2
3,4 ± 0,4 a
5,0 ± 0,47
Linfócito
(% )
69,1 ± 3,51
69,3 ± 3,33
51,9 ± 5,93
75,0 ± 4,77 b
Neutrófilo
(% )
33,3 ± 3,45
29,7 ± 3,82
45,6 ± 5,66
22,1 ± 5,08 b
M onócito
(% )
0,7 ± 0,33
1,0 ± 0,34
1,1 ± 0,35
2,6 ± 1,04
Eosinófilo
(% )
0,1 ± 0,09
0,0 ± 0,00
0,5 ± 0,38
0,0 ± 0,00
Bastonete
(% )
0,4 ± 0,22
0,0 ± 0,00
0,1 ± 0,13
0,0 ± 0,00
Basófilo
(% )
0,1 ± 0,09
0,0 ± 0,00
0,3 ± 0,16
0,0 ± 0,00
Plaquetas
(% )
399,8 ± 40,71
291,7 ± 16,24
401,6 ± 36,89
339,6 ± 20,36
Os valores representam a média ± EPM (erro padrão da média), o nível de significância foi considerado para valores de P
a
< 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. Diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle.
b
Diferença significativa entre os tratamentos com arsênio e arsênio concomitante com ácido ascórbico.
62
Capítulo 2
5.3.2. Antimônio
5.3.2.1. Lipossomas
Os dados relativos ao estudo da possível redução de cardiotoxicidade do tártaro emético
encapsulado em lipossomas estão apresentados nesta dissertação para a comparação aos dados
obtidos com a administração do tártaro emético livre ou na forma livre associado ao ácido ascórbico
e ainda para comparar aos dados do arsênio nos diferentes tratamentos. Esses dados foram
anteriormente obtidos em nosso laboratório e submetidos para publicação no periódico Toxicology
Letters. A técnica utilizada no preparo da formulação lipossomal foi a mesma utilizada para a
formulação de arsênio. A eficiência de encapsulação foi de 14,5% e o tamanho das vesículas foi de
149nm (índice de polidisperção 0,014).
5.3.2.2 Experimentos in vivo
5.3.2.2.1. Obtenção da dose máxima tolerada (DM T)
A dose máxima tolerada de tártaro emético foi obtida a partir de experimentos também
anteriormente realizados por este grupo de pesquisa (dados submetidos para publicação). Esta foi
estabelecida como sendo de 17 mg/kg de Sb na forma de tártaro emético.
5.3.2.2.2. Protocolo agudo
A figura 24 ilustra seguimentos de ECG obtidos de animais dos grupos Sb e Sb+AA. E as
figuras 25 e 26 apresentam os dados obtidos das variações percentuais dos parâmetros QT, QTc, PR e
QRS em função do tempo para os grupos Sb, Sb+AA e lipossoma Sb.
Ao serem analisados conjuntamente os parâmetros obtidos do ECG dos diferentes grupos,
apenas o grupo Sb apresentou alteração significativa em relação aos controles PBS e Lipossoma
branco. Foi observado prolongamento significativo do intervalo QT e do índice QTc (Figura 26)
sendo a variação máxima de QT de 21,95% e QTc de 19,42% em todos os tempos avaliados a partir
de 0,5 minutos após a administração. Ao comparar o grupo Sb livre com o grupo lipossoma Sb
observou-se diferença significativa a partir de 1,5 minutos.
A análise das variações dos demais parâmetros do ECG (PR e QRS) não indicou a ocorrência
de diferenças significativas entre os demais grupos estudados.
63
Capítulo 2
Figura 24: Parâmetros do ECG antes e após administração IV de antimônio (A), e antimônio + ácido
ascórbico (B), em protocolo agudo.
64
Capítulo 2
% Variação de PR
15
10
5
0
-5
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
% Variação de QRS
10
PBS
Lipossoma Branco
AA
Sb
Sb+AA
Lipossoma Sb
5
0
-5
Figura 25: Variação percentual dos intervalos do eletrocardiograma PR e QRS dos grupos tratados
em protocolo agudo com antimônio (Sb), antimônio + ácido ascórbico (Sb+AA), Lipossoma
contendo antimônio (Lipossoma Sb), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores
representam a média ± e.p.m. (n=6) ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.
65
Capítulo 2
30
+
+ + #
+# # * +
#
*
**
% Variação de QT
20
#
*
+
#
*
*
+
#
+
*
+
#
*
*
*
#
*
*
+
*
#
*
10
+
+
0 ++ + +
+
+
+
+
+
-10
0
10
20
30
Tempo (min)
30
% Variação de QTc
++#
20
+# +#
* * +#
#
**
*
*
++ +
++
+
+
#
*
*
*
50
+
+
#
40
#
*
*
*
60
+
+
#
*
PBS
Lipossoma Branco
AA
Sb
Sb+AA
Lipossoma Sb
*
#
*
10
0
+
+
+
+
+
-10
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
Figura 26: Variação percentual dos intervalos do eletrocardiograma QT e QTc dos grupos tratados
em protocolo agudo com antimônio (Sb), antimônio + ácido ascórbico (Sb+AA), Lipossoma
contendo antimônio (Lipossoma Sb), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores
representam a média ± e.p.m. (n=6). Diferenças estatisticamentes significativas (ANOVA/ Tukey,
com P<0,05) representadas por * em relação ao grupo PBS, # em relação ao grupo lipossoma branco
e + em relação ao grupo Sb+AA.
66
Capítulo 2
Quanto ao parâmetro pressão arterial, o Sb livre induziu significativa hipotensão logo após
sua administração (figura 27), sendo as variações máximas de ± 41,56% para o parâmetro PAS e 50,35% para PAD. As diferenças significativas entre as variações percentuais deste grupo quando
comparado com os grupos PBS e lipossoma branco ocorreram entre 1,5 e 15,0 minutos na pressão
arterial sistólica e entre 1,0 e 10,0 minutos na pressão arterial diastólica (figuras 28).
O grupo Sb apresentou, ainda, diferenças significativas entre 1,5 e 10 minutos em PAS e PAD
quando comparado ao grupo Lipossoma Sb e 2,5 e 10 minutos em PAS e entre 1,5 e 7,5 minutos em
PAD quando comparado ao grupo Sb+ AA. Não foram observadas alterações na FC.
antimônio (A) e antimônio+ácido ascórbico (B), em protocolo agudo.
67
Capítulo 2
40
% Variação de PAS
30
20
10
0
-10
&
-20
&
+# +# + + +
#
** *
* *
#
-30
-40
#
+
*
+
*
-50
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
40
% Variação de PAD
30
PBS
Lipossoma Branco
AA
Sb
Sb+AA
Lipossoma Sb
20
10
0
-10
+&
#
&
&& & +
#
-20
*+
-30
#
+
#
*
**
-40
*
+
#
*
-50
-60
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
0
10
20
30
Tempo (min)
40
50
60
10
% Variação de FC
5
0
-5
-10
-15
Fi
gura 28: Variação percentual dos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e freqüência
cardíaca (FC) dos grupos tratados em protocolo agudo com antimônio (Sb), antimônio + ácido ascórbico (Sb+AA),
Lipossoma contendo antimônio (Lipossoma Sb), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores
representam a média ± e.p.m. (n=6). Diferenças estatisticamentes significativas (ANOVA/ Tukey, com P<0,05)
representadas por * em relação ao grupo PBS, # em relação ao grupo lipossoma branco e + em relação ao grupo Sb+AA e
& em relação ao grupo AA.
68
Capítulo 2
3.2.2.3. Protocolo subagudo
a. Análise dos parâmetros cardiovasculares
A figura 29 ilustra ECG obtido dos grupos tratados com Sb e Sb+AA. Por outro lado, a figura
30 apresenta os resultados obtidos nos experimentos do protocolo subagudo referentes à variação
percentual e valores absolutos dos parâmetros do ECG avaliados. Ao serem avaliados
conjuntamente, diferenças significativas foram identificadas no grupo tratado somente com
antimônio livre (Sb) em relação ao grupo controle (PBS) nos parâmetros QT, QTc e QRS com
variações percentuais médias de 33,67; 21,6 e 11,62 %, respectivamente.
O grupo Sb+AA também apresentou variações significativas no intervalo QT (26,44%) e em
QTc (19,46%), quando comparado ao grupo controle PBS. No entanto, a variação no intervalo QT
deste grupo foi significativamente menor quando comparada ao grupo Sb. Por outro lado, não foram
observadas diferenças significativas nos parâmetros avaliados no grupo AA quando comparado aos
demais.
Figura 29: Parâmetros do ECG antes e após tratamento subagudo com antimônio (A), e antimônio +
ácido ascórbico (B).
69
Capítulo 2
#
&
15
*
% Variação de QRS
% Variação de PR
20
15
10
5
10
5
0
0
#
&
% Variação de QT
50
*
40
&
*
30
20
10
0
% Variação de QTc
30
PBS
AA
Sb
Sb + AA
&
*
25
&
*
20
15
10
5
0
1
-10
Figura 30: Variação percentual dos parâmetros do eletrocardiograma, PR, QRS, QT e QTc , dos grupos após tratamento sub-agudo com antimônio (Sb)
antimônio + ácido ascórbico (Sb+ AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6) .Valores
estatisticamente diferentes (ANOVA/ Tukey , P < 0,05) representados por * comparado com PBS, & comparado com AA e # comparado com Sb+ AA.
70
Capítulo 2
Com relação ao parâmetro pressão arterial não foi identificada diferença significativa nos
valores absolutos de PAS e PAD ao realizar comparação entre os grupos. (Figura 31). O mesmo foi
observado no parâmetro de FC.
150
PAS (mmHg )
125
100
75
50
25
0
150
PBS
AA
Sb
Sb + AA
PAD (mmHg)
125
100
75
50
25
0
% Variação de FC
0
-10
-20
-30
Figura 31: Valores absolutos de pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD) e
variação percentual da freqüência cardíaca (FC) após tratamento subagudo com antimônio (Sb),
antimônio +ácido ascórbico (Sb+AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores
representam a média ± e.p.m. (n=6).
71
Capítulo 2
A análise histológica do tecido cardíaco do grupo Sb mostrou alterações como degeneração
hialina em várias células musculares (*), pequeno grupo de células inflamatórias (seta) e área de
necrose (pontilhado). Por outro lado o grupo Sb+AA apresentou aspecto histológico compatível com
os grupos tratados com PBS e AA (controles) (figura 32).
A
B
A
*
C
*
*
D
*
C
D
Figura 32: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados
com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Hematoxilina Eosina, 40X.
*Degeneração hialina em várias células musculares; Setas indicam pequeno grupo de células
inflamatórias (seta) e o pontilhado área de necrose em C.
72
Capítulo 2
Quanto às dosagens bioquímicas dos de CKMB e AST, indicadores de lesão miocárdica, não
foram observadas quaisquer alterações significativas.
Tabela 18: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar
submetidos ao tratamento subagudo com Sb, (n=6).
Parâmetros
Controle
AA
Sb
Sb+AA
AST
(UI /L)
267,8 ± 48,05
165,5 ± 11,77
228,3 ± 37,22
312,1 ± 61,77
CKM B
(UI )
966,9 ± 145,70
920,0 ± 186,40
692,5 ± 106,60
892,9 ± 139,80
a
AST (aspartato aminotransferase) Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle.
b
Representa diferença significativa entre os tratamentos com antimônio e antimônio concomitante com ácido ascórbico.
b. Avaliação da toxicidade hepática
Os parâmetros bioquímicos indicativos de toxicidade hepática, ALT, AST, albumina e
proteínas totais não apresentaram alterações. Por outro lado, ocorreu aumento da FA no grupo Sb
quando comparado aos grupos controle e Sb+AA .
Tabela 19: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar
Parâmetros
Controle
AA
Sb
Sb+AA
ALT
(UI /L)
79,5 ± 26,03
45,0 ± 6,61
217,8 ± 118,9
96,9 ± 18,61
AST
(UI /L)
267,8 ± 48,05
165,5 ± 11,77
228,3 ± 37,22
312,1 ± 61,77
Albumina
(g/dL)
3,0 ± 0,06
2,8 ± 0,07
3,3 ± 0,07
3,0 ± 0,09
Proteína Total
(g/dL)
5,6 ± 0,17
5,7 ± 0,16
5,9 ± 0,25
5,6 ± 0,23
FA
(UI /L)
123,4 ± 14,09
112,1 ± 10,96
Í ndice
Ureia/Creatinina
116,8 ± 10,87
108,8 ± 5,64
174,1 ± 15,52 ª,
b
101,5 ± 7,24
89,4 ± 5,87
117,7 ±7,69
ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), FA (Fosfatase Alcalina).
a
b
73
Capítulo 2
A análise histológica do tecido hepático demonstrou alterações unicamente no grupo Sb onde
foi observada necrose, congestão e discreta inflamação. (figura 33)
A
A
B
C
C
D
D
Figura 33: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados
com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Observa-se em A, B, D
aspecto histológico compatível com normalidade. Em C observa-se área de necrose e inflamação
(pontilhada), alargamento de sinusóides e congestão (setas). Hematoxilina Eosina, 40X.
74
Capítulo 2
c. Avaliação da toxicidade renal
A administração subaguda de Sb e Sb+AA não induziu alterações significativas nos
parâmetros bioquímicos indicativos de toxicidade renal que são creatinina sérica, uréia sérica e
relação creatinina sérica/uréia sérica.
Tabela 20: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade renal avaliados em ratos Wistar
a
b
Parâmetros
Controle
AA
Sb
Sb+AA
Uréia Sérica
(g/dL)
49,6 ± 2,04
50,3 ± 1,37
51,6 ± 1,51
52,3 ± 1,76
Creatinina
(mg/dL)
0,5 ± 0,03
0,5 ± 0,04
0,5 ± 0,04
0,5 ± 0,03
Í ndice
Ureia/Creatinina
116,8 ± 10,87
108,8 ± 5,64
101,5 ± 7,24
117,7 ±7,69
75
Capítulo 2
d. Avaliação Hematológica
Os parâmetros hematológicos obtidos ao serem avaliadas as amostras sanguíneas dos
diferentes grupos submetidos ao protocolo subagudo encontram-se sumarizadas na tabela 21.
Não foram observadas diferenças significativas após comparação entre os grupos.
Tabela 21: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos submetidos ao tratamento
subagudo com Sb, (n=6).
Parâmetros
Controle
AA
Sb
Sb+AA
Hemácia
(109/L)
8,6 ± 0,78
7,9 ± 0,2
9,6 ± 0,94
9,2 ± 0,87
Hemoglobina
(g/dl)
14,1 ± 1,59
13,3 ± 0,42
16,2 ± 1,32
16,2 ± 1,58
Hematócrito
(% )
41,1 ± 2,84
32,2 ± 1,29
42,3 ± 4,7
40,2 ± 3,18
Leucócito
(109/L)
6,8 ± 1,17
4,5 ± 0,2
7,2± 0,94
7,2 ± 0,87
Linfócito
(% )
69,1 ± 3,51
69,3 ± 3,33
76,2 ± 4,05
78,3 ± 2,94
Neutrófilo
(% )
33,3 ± 3,45
29,7 ± 3,82
19,2 ± 4,29
18,0 ± 2,59
M onócito
(% )
0,7 ± 0,33
1,0 ± 0,34
2,9 ± 1,05
2,9 ± 0,60
Eosinófilo
(% )
0,1 ± 0,09
0,0 ± 0,00
0,6 ± 0,24
0,5 ± 0,34
Bastonete
(% )
0,4 ± 0,22
0,0 ± 0,00
0,1 ± 0,11
0,0 ± 0,00
Basófilo
(% )
0,1 ± 0,09
0,0 ± 0,00
0,0 ± 0,00
0,0 ± 0,00
Plaquetas
(% )
399,8 ± 40,71
291,7 ± 16,24
607,7 ± 143,45
386,3 ± 57,48
Os valores representam a média ± e.p.m. O nível de significância foi considerado para valores de P < 0,05 ± ANOVA,
seguido de teste de Tukey..
76
Capítulo 2
5.4. Discussão
5.4.1. Lipossomas
O As em sua forma trivalente tem demonstrado atividade antineoplásica significativa no
tratamento do mieloma múltiplo refratário recidivante (Bahlis et al., 2002). No entanto, a expansão
da utilidade clínica para outros tipos de câncer tem sido limitada pela toxicidade deste quando
utilizado em maiores doses e à baixa biodisponibilidade no local do tumor (Chen et al,2002; Evens et
al, 2004; Dilda et al, 2007).
Sistemas carreadores de fármacos, como os lipossomas, asseguram um tempo de circulação
sanguínea prolongado, lenta liberação do composto encapsulado, menor acúmulo em tecidos normais
e maior em áreas com tumor, o que diminui efeitos adversos e aumenta a efetividade do fármaco
(Allen e Cullis, 2004). Diante disto, trabalhos têm sido realizados na tentativa de obter-se uma
formulação lipossomal de arsênio desde a aprovação, pela FDA, do trisenox como medicamento
anticancerígeno. Kallinteri e colaboradores (2004) avaliaram a encapsulação do TOA em lipossomas,
constituídos de diferentes lipídeos e através de diferentes técnicas, obtendo taxas de encapsulação
que variaram de 0,003 a 0,506 mol de TOA/mol de lipídeo. Wang e colaboradores (2007)
encapsularam TOA em nanopartículas com PEG e PLGA. Aumento da estabilidade de lipossomas
através da liberação lenta de compostos de arsenito ligados a metais de transição foi pesquisado por
Chen e colaboradores (2006).
A metodologia de preparação lipossomal utilizada neste trabalho demonstrou eficiência de
encapsulação do arsenito de sódio, aproximadamente 9%, compatível com as descritas nos estudos
nos estudos acima citados. E foi considerada viável para atender ao objetivo de avaliação da
possível redução da cardiotoxicidade do arsênio, tendo em vista possuir concentração suficiente do
fármaco que possibilite a administração endovenosa da DMT de 6,5 mg/kg em volume de até 1,0 ml.
A eficiência de encapsulação pode variar dependendo da dimensão dos lipossomas, do peso
molecular das moléculas encapsuladas, composição lipídica das vesículas e procedimento de
preparação dessas (Monnard et al, 1997; Crossasso et al 2000). Assim, após a obtenção de resultados
satisfatórios de redução de toxicidade e, até mesmo, aumento de atividade dos compostos de arsênio
quando veiculados em lipossomas, seria justificável trabalhos futuros que tenham por objetivo a
otimização dessas formulações, viabilizando-as para o uso terapêutico.
Em média, o tamanho das partículas obtidas foi condizente com o esperado, uma vez terem
sido calibradas, no processo de extrusão, através de membranas com poros de 200 nm. Além disso, o
baixo índice de polidispersão obtido reflete a homogeneidade de tamanho das partículas, sendo as
77
Capítulo 2
amostras consideradas monodispersas quando o IP é inferior a 0,3 (Hunter e Frisken, 1998).
O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas, o qual é influenciado pelas
mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da dissociação de grupos funcionais na
superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão
(Schaffazick e Guterres, 2003; Magenheim e Benita, 1991; Mosqueira et al, 2000). Um valor de
potencial zeta relativamente alto (em módulo) é importante para uma boa estabilidade físico-química
da suspensão coloidal, pois grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação em função das
colisões ocasionais de nanopartículas adjacentes (Schaffazick e Guterres, 2003). Logo, o obtido neste
trabalho paras as preparações de lipossomas contendo arsênio (-37,80 ± 0,8 mV) ou lipossomas
vazios (- 41,75 ± 0,3 mV) foram considerados satisfatórios. A carga negativa provavelmente é
proveniente do lipídeo PEG e influenciado pelo solvente utilizado.
Em relação à avaliação da estabilidade da formulação em condições de armazenamento, os
resultados obtidos mostraram que os lipossomas contendo arsênio quando armazenados a 4 °C
conservaram por três dias 75 % da substância ativa em seu interior, indicando que, para garantir sua
eficácia, esta formulação deve ser utilizada em curto período. Assim, nos experimentos realizados no
presente trabalho, a formulação foi utilizada até 24 horas após o preparo, visando à confiabilidade
dos resultados obtidos. Sabe-se que as formulações de lipossomas provenientes de soluções
concentradas de arsênio liberam quantidades significativas do princípio ativo em poucas horas
(Kallinteri et al, 2004) principalmente devido a fácil difusão da espécie neutra As(OH)3 pela
membrana. Estudos buscando a melhora da estabilidade das formulações de lipossomas contendo
arsênio estão obtendo sucesso em um sistema no qual são empregados gradientes transmembrana de
íons de metal de transição para produzir nanopartículas com o AsIII dentro dos lipossomas (Chen et
al 2006; Chen et al 2009).
A análise do perfil de liberação in vitro mostrou a habilidade dos lipossomas reterem 95% do
arsênio até 12 horas de incubação a 37 °C em condições sink, com liberação exponencial a partir
deste tempo. O experimento realizado neste trabalho avaliou a cardiotoxicidade do arsênio até uma
hora de experimento, assim os resultados obtidos podem ser atribuídos à lenta liberação do arsênio a
partir dos lipossomas.
Ainda no intuito de garantir uma formulação viável para a análise da cardiotoxicidade do
arsênio trivalente, uma análise qualitativa do arsênio encapsulado foi realizada por EXAFS após
liofilização das amostras, tendo sido constatada a manutenção do estado de oxidação trivalente do
arsênio encapsulado a partir de soluções de arsenito de sódio.
As características de superfície das partículas também podem alterar a resposta biológica do
78
Capítulo 2
fármaco associado. Quando se administram intravenosamente sistemas de nanopartículas
convencionais, estes são rapidamente removidos da circulação sanguínea pela ação de células do
sistema fagocitário mononuclear, dificultando a chegada do fármaco ao sítio de ação. Diferentes
estratégias têm sido propostas para modificar a distribuição in vivo das nanopartículas, baseadas
principalmente na redução da hidrofobicidade da superfície dessas através da adsorção física de um
polímero hidrofílico, como polimero de etilenoglicol (PEG) utilizado em nossa formulação. O PEG é
capaz de influenciar o potencial zeta tornando-o negativo e prevenindo a agregação das vesículas
(Harasym et al., 1995), além de contribuir para o direcionamento destas a sítios onde ocorre menor
filtração, como no caso do câncer (Gacizon e Papahadjapoulos, 1988; Papahadjopoulos, 1991).
A obtenção da formulação lipossomal contendo arsênio neste trabalho foi considerada
satisfatória para a avaliação da possibilidade de redução de toxicidade cardiovascular proveniente do
uso destes nanocarreadores.
5.4.2. Avaliação das alterações cardiovasculares
Alterações cardiovasculares são freqüentemente observadas em tratamentos que utilizam
metais e semimetais, como é o caso dos compostos de arsênio e antimônio. Tal toxicidade é
considerada fator limitante para tratamento com antimoniais em pacientes que utilizam betabloqueadores ou anti-arrítmicos, e em casos de ocorrência no ECG, de intervalo QTc superior a
400 ms em homens e 450 ms em mulheres (Brasil, 2006). No caso do arsênio, interrupções do
tratamento ou uso de subdoses são necessárias em casos de pacientes que apresentam arritmias
(Yamazaki et. al., 2006).
As principais alterações no ECG induzidas em humanos pelo arsênio são prolongamento do
intervalo QT e do índice QTc. A prevalência de pacientes tratados com trióxido de arsênio que
apresentam essas alterações está por volta de 60% (Vizzardi et al, 2008; Unnikrishnan et al, 2004;
Ohnishi et al, 2000). Barbey e colaboradores (2003) realizaram um estudo com 56 pacientes tratados
com TOA, dentre os quais 38 apresentaram prolongamento de QT e QTc maior que 500 ms, além de
aumento na frequência cardíaca maior que 100 bpm.
O antimônio também induz a alterações no ECG, principalmente inversão do segmento ST,
prolongamento do intervalo QT e conseqüentemente torsades de pointes e morte cardíaca súbita
(Lacerda-Júnior et al., 1965, Chulay et al., 1985).
Primariamente, este trabalho identificou no modelo experimental, rato Wistar macho, as
alterações no ECG e na pressão arterial induzidas pelo arsenito de sódio livre e indicativas de sua
toxicidade. Esta caracterização permitiu posterior avaliação da possível redução da cardiotoxicidade
79
Capítulo 2
do arsênio ao ser veiculado em lipossomas ou administrado concomitantemente ao AA. No
tratamento agudo, aumento do intervalo PR, bradicardia e diminuição da pressão arterial foram
detectados, já no subagudo foram identificados prolongamento dos parâmetros QT, QTc e QRS.
Estas alterações encontradas no tratamento subagudo refletiram aquelas encontradas em pacientes
tratados com TOA. Já no tratamento agudo, ao contrário, isto não ocorreu o que sugere que estas
alterações sejam dependentes do tempo de tratamento.
Em relação aos dados obtidos com a administração de tártaro emético livre foram observados
prolongamento de QT e QTc em ambos os protocolos agudo e subagudo. Sendo ainda observada
forte hipotensão no protocolo agudo e prolongamento de QRS no subagudo.
Possíveis mecanismos que expliquem as alterações no intervalo QT induzidas são descritos
na literatura. Ribeiro e colaboradores (1999) e Ohnishi e colaboradores (2000) descreveram o retardo
da repolarização ventricular como possível causa do prolongamento deste intervalo. Smits e
colaboradores (2008) relacionaram a síndrome de QT longo com disfunções nos canais de sódio.
Kuryshev e colaboradores (2006) demontraram em porcos guinea que o tártaro emético pode
prolongar o potencial de ação de miócitos ventriculares via aumento de correntes de calcio
apresentando um papel pró-arrítmico, como verificado pela presença de prolongamento do intervalo
QT. Recentemente, Dennis e colaboradores (2007) descreveram a inibição do tráfego de canais
hERG/IK para a superfície da célula, e consequentemente redução da corrente de potássio, como um
possível mecanismo para o aumento de intervalo QT induzido por fármacos (LQTS), tendo atribuído
esse novo mecanismo ao TOA, pentamidina, probucol, fluoxetina e tártarato emético (SbIII).
O prolongamento do intervalo PR, identificado neste trabalho, nos animais tratados com
arsênio possivelmente demonstra a ocorrência de bloqueio atrioventricular de primeiro grau, no qual,
todas as ondas P são conduzidas sempre com retardo (Myerburg et al, 1998). Sabe-se que fatores
transitórios, como isquemia miocárdica e a ação de drogas que deprimem a condução atrioventricular
(ex: betabloqueadores, antiarrítmicos, digital e bloqueadores dos canais de cálcio) podem precipitar
ou agravar os bloqueios atrioventriculares (Myerburg et al, 1998). Wey e colaboradores (1997) e
Ohnishi e colaboradores.(2000) demonstraram que o arsênio e o antimônio causariam a sobrecarga
de cálcio intracelular o que seria fator predisponente para a morte de miócitos cardíacos.
Além dos parâmetros de ECG e pressão, a função cardíaca foi também avaliada através da
dosagem de CKMB e AST, bem como por análise histopatológica dos corações.
A elevação da atividade plasmática da CKMB é o indicador mais específico de lesão
miocárdica, particularmente, de infarto agudo do miocárdio (Motta et al, 2003). Assim, avaliação da
atividade de CKMB sérica é importante ferramenta que auxilia não apenas no diagnóstico precoce de
80
Capítulo 2
infarto do miocárdio, como também a identificação de injúrias locais (Liu et al., 2008). Alterações
significativas na dosagem destes parâmetros não foram identificadas nos diferentes grupos estudados
(para As e Sb). Também as dosagem de AST, enzima que se eleva em casos de necrose cardíaca
(Alarcón-Corredor et al, 2000), não apresentaram alterações significativas nos grupos em estudo.
Estes resultados indicam a não indução pelos compostos de As e Sb estudados de lesões cardíacas
suficientes para causarem alterações nas dosagens bioquímicas.
Em relação à análise histopatológica, pequenas alterações foram identificadas no tecido
cardíaco de animais tratados com arsênio, tais como degeneração hialina, edema, inflamação discreta
e vacuolização de vasos. Já no grupo tratado com antimômio, além do já citado para o arsênio,
também foi observada necrose tecidual. Como as dosagens de CKMB e AST não foram indicativas
da ocorrência de lesões extensas no miocárdio dos animais tratados com arsênio ou antimônio e, no
entanto, a análise histológica dos corações destes animais demonstrou alterações, mesmo que
singelas, no tecido cardíaco, sendo que nos animais tratados com antimônio foram encontradas áreas
de necrose, provavelmente outros fatores contribuiram paras as alterações eletrocardiográficas
encontradas. Para melhor correlação das alterações no tecido cardíaco com aquelas ocorridas na
pressão e ECG seria necessário análise em locais específicos do coração. Análise esta que será
realizada em trabalhos futuros por este grupo de pesquisa.
É descrito que tanto o arsênio como o antimônio são responsáveis por induzir estress
oxidativo, através de depleção de agentes redutores como a glutationa, provocando injúrias ao
miocárdio (Tirmenstein et al., 1997; Li et al, 2002). O arsênio provoca, também, injúrias nas células
endoteliais o que resultaria em isquemia do miocárdio e finalmente fibrose cardíaca e disfunção (Li,
2002, Ohnishi et al, 2000; Gyenes, 1998). Em contra-partida, doses não-letais do tártaro emético
reduziram a capacidade de miócitos cardíacos para mobilizar cálcio durante uma excitação-contração
(Toraason et al., 1997).
A freqüência cardíaca pode ser alterada principalmente por ações reflexas conseqüente a
ações regulatórias da pressão arterial, por mediadores do SNA (Sistema Nervoso Autônomo) ou
como conseqüência direta da ação de fármacos na atividade marcapasso cardíaca (Herring et
al.,2002; Guyton e Hall, 2002). Neste trabalho foi observada bradicardia, a qual provavelmente não
poderia ser explicada pela hipótese de ação reflexa, uma vez que a pressão arterial apresentou
redução, assim pode ser proposta uma ação direta na atividade cardíaca.
Reduções na pressão arterial em geral podem ser devidas ao mau funcionamento cardíaco
causado por arritmias, lesões, perda ou mau funcionamento do músculo cardíaco ou ainda por uma
possível dilatação dos vasos sanguíneos (Manual Merck, 2010). Assim, a acentuada queda na PA nos
81
Capítulo 2
experimentos realizados no protocolo agudo por não apresentarem descrição previa na literatura,
pode ser atribuída a uma destas causas. É possível ainda atribuir esta redução de pressão à elevada
dose utilizada, a qual é muito maior que a utilizada em terapêutica e publicada. Diante dos relatos de
injúria cardíaca provocada por estes semimetais e dos dados apresentados na análise histopatológica
do grupo subagudo, a primeira hipótese de presença de arritmias e lesões pode ser considerada como
a mais provável, sendo a recuperação da pressão arterial, dentro do período de uma hora para o
antimônio, ou a quase normalidade, no caso do arsênio, reflexo de mecanismos compensatórios.
O ácido ascórbico (vitamina C), um suplemento natural na nossa dieta, há muito encontra-se
envolvido na prevenção do câncer. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que, apesar do TOA, por
si só matar células leucêmicas quando esse é associado ao ácido ascórbico há o aumento significativo
desta atividade (Qazilbash et al, 2008; Bahlis et al.,2002). Além dessa potencialização da atividade,
possível ação protetora sobre os efeitos adversos provocados pelo arsênio tem sido relatada. Singh e
colaboradores (2007) e Rana e colaboradores (2006) observaram o efeito protetor do ácido ascórbico
sobre o estresse oxidativo induzido pelo arsênico inorgânico no fígado e rins de ratos.
A redução ou eliminação da maioria das alterações cardiovasculares no ECG, pressão e
análise histológica induzidas pela administração concomitante do AA ao As e Sb na forma livre, vêm
demonstrar a potencial ação cardioprotetora exercida pelo AA não só sobre os efeitos do arsênio, mas
também do antimônio, sendo que, para o grupo agudo Sb + AA os valores de variação reduziram até
a normalidade e nos grupos subagudos Sb + AA (p<0,05) e As + AA (p<0,0001), as variações, apesar
de serem maiores que as do grupo controle, foram significativamente menores quando comparados a
aquelas dos grupos tratados somente com arsênio ou antimônio. O prolongamento do intervalo PR
observado no grupo As+AA agudo, não apresentou diferença significativa quando comparado ao
grupo tratado somente com arsênio, no entanto, diminuiu o suficiente para também não apresentar
diferença com relação ao grupo controle. Já as alterações encontradas nos grupos subagudo nos
intervalos PR e QRS foram eliminadas quando AA foi administrado concomitantemente.
As alterações na freqüência cardíaca e pressão arterial, caracterizadas nos grupos agudos As e
Sb, não foram observadas nos grupos tratados simultaneamente com ácido ascórbico. Há indícios
que a cardioproteção observada com a administração concomitante de AA, seja oriunda da ação
antioxidante do ácido ascórbico sobre o estress oxidativo provocado pelo arsênio ou antimônio.
Taglialatela e colaboradores (1997) demonstraram que o aumento na produção de radicais livres
(ROS), associado a condições de isquemia, influencia a mobilização de potássio realizada pelos
canais hERG/IK
.
Sabe-se que em tecidos excitáveis o potássio desempenha papel crucial na
modulação do potencial da membrana em repouso, na freqüência de disparo e na definição do
82
Capítulo 2
potencial de ação, influenciando a freqüência cardíaca e o tônus muscular.
Bhandari e colaboradores (2004) observaram o papel do ácido ascórbico como um redutor de
radicais livres na proteção contra os efeitos deletérios da perda excessiva de sangue, uma situação
isquêmica. Já Nandi e colaboradores (2005) observaram em ratos tratados com arsênio que a
administração de vitaminas e aminoácidos resultava em reversão do estresse oxidativo e melhora do
nível de peróxido lipídico e da atividade das enzimas antioxidantes como a glutationa. Tais relatos
estão de acordo com a ausência de alterações no tecido cardíaco de animais tratados
concomitantemente com ácido ascórbico, visto neste trabalho.
Outra hipótese a ser levantada para um possível mecanismo de cardioproteção do AA, seria a
indução da liberação de acetilcolina. Kuo e colaboradores (1979) e Pinchasi e colaboradores (1979),
observaram que o ácido ascórbico estimulava a liberação de acetilcolina em vesículas sinápticas
isoladas. Baseado no benefício da estimulação vagal em proteger o coração contra episódios de
fibrilação ventricular, alterando favoravelmente a automaticidade cardíaca (Waxman et al., 1988;
Eliakim et al., 1961) e a refratariedade in vivo (Schwartz et al., 1977; Martins e Zipes, 1980), foi
proposto que fármacos colinérgicos também poderiam atuar como cardioprotetores (De Ferrari et al.,
1992).
Quanto a avaliação de diminuição da cardiotoxicidade através da encapsulação de As e Sb em
lipossomas, os resultados obtidos no experimento agudo demonstram uma efetiva normalização nos
parâmetros do ECG e pressão arterial demonstrando a efetiva e potencial ação protetora dos
lipossomas. Como anteriormente relatado, os experimentos de liberação in vitro da formulação
lipossomal de arsênio identificaram uma retenção de 95% do As até 12 horas de incubação a 37 0C
em condições Sink. Como os experimentos agudos foram realizados até 1 hora após a administração
de As e Sb livre ou encapsulados, a não ocorrência de alterações no ECG após administração da
forma lipossomal destes semi metais pode, então, ser atribuída a lenta liberação dos semimetais
induzida pelos lipossomas, a qual levaria à menor concentração de arsênio ou antimônio disponível
para associação com o tecido cardíaco em comparação com estes na forma livre e conseqüente
menor toxicidade.
Diante desses resultados, pode-se concluir que as condições experimentais utilizadas neste
trabalho mostraram-se satisfatórias para o estudo da toxicidade cardíaca causada pelos compostos
trivalentes do arsênio e do antimônio e que o uso concomitante de ácido ascórbico e a encapsulação
dos compostos de arsênio e antimônio em lipossomas apresentaram potencial ação cardioprotetora.
5.4.3. Avaliação hepática
83
Capítulo 2
A aspartato alaninatransferase (ALT) e a aspartato aminotransferase (AST) são enzimas
intracelulares presentes em grandes quantidades nos hepatócitos. A ALT é encontrada principalmente
no citoplasma do hepatócito, enquanto 80% da AST está presente nas mitocôndrias. Lesões ou
destruição das células hepáticas liberam estas enzimas para a circulação. Em dano hepatocelular
leve, a forma predominante no soro é a citoplasmática, e em lesões graves, há liberação da enzima
mitocondrial, elevando a relação AST/ALT (Motta, 2003).
A ALT é utilizada para diagnóstico das enfermidades hepatobiliares agudas, já a AST eleva-se
em casos de necrose cardíaca. O predomínio da ALT indica somente uma alteração na membrana,
enquanto o predomínio da AST revela lesão das organelas citoplasmáticas (Alarcón-Corredor et al,
2000).
A FA localiza-se nas membranas de revestimento dos canalículos biliares, assim, a enzima
encontra-se elevada em desordens do trato biliar, nas hepatites virais e cirrose e pode também elevarse em resposta a alguns fármacos e insuficiência renal crônica (Motta, 2003).
A Albumina é uma proteína produzida especificamente pelo fígado, e pode ser medida de
forma barata e fácil. É o principal constituinte da proteína total; a fração restante é chamada de
globulina (incluindo as imunoglobulinas). Os níveis de albumina estão diminuídos em doenças
crônicas do fígado, como a cirrose. A disfunção hepática é comum em pacientes que apresentam
hipoalbuminemia com edema ou ascite (Davidson, 1998).
Fibrose não cirrótica no fígado é comum em indivíduos expostos cronicamente ao arsênio
presente na água. Santra e colaboradores (2000) no intuito de investigar os possíveis mecanismos
dessa alteração realizaram experimentos com camudongos Balb C. Estes receberam água potável
com arsênio (3,2mg/L) e foram sacrificados entre 3 e 15 meses. Observou-se a partir de 12 meses
aumento do peso do fígado, das dosagens de ALT e AST e diminuição de glutationa hepática,
glicose- 6-fosfato e glutationa peroxidase, além de infiltração gordurosa após 12 meses. Observações
semelhantes de redução na atividade da superoxido desmutase e catalase foram também encontradas
em células de mamíferos V79 CH com o tratamento com As III (Sinha et al, 2005; Mukherjee, 2006).
Aumento nos teores das enzimas hepáticas tem sido observado em pacientes com o uso de
compostos antimoniais (Chulay et al., 1983; Lawn et al., 2006; Lima et al., 2007) sendo que
elevações de duas a três vezes em relação aos valores basais são freqüentemente observados durante
a terapia (Berman, 1988).
Estibogluconato de sódio, composto antimonial pentavalente, está associado a danos
hepáticos agudos e diminuição na capacidade funcional metabólica do fígado, as quais são
normalmente reversíveis com interrupção do tratamento (Hepburn et al., 1993). Dieter (1992)
84
Capítulo 2
observou em ratos, após administração de tartarato emético nas doses de 0, 1.5, 3, 6, 11, ou 22
mg/kg, degeneração hepatocelular e necrose que foram associados com as elevações dosedependente nas atividades das enzimas hepáticas específicas, sorbitol desidrogenase e alanina
aminotransferase.
Estudo realizado por Alkhawajah e colaboradores (1992) mostraram aumento no nível de
fosfatase alcalina em ratos tratados por 30 dias com a dose de 300 mg/kg de antimoniato de
meglumina e, aumento AST e ALT em animais tratados com estibogluconato de sódio na mesma
dose. Já Ikeda-Garcia e colaboradores (2007) observaram aumento de ALT, AST e FA em cães após
30 dias de tratamento com 75 mg/kg de antimoniato de meglumina, mas com ausência de sinais
clínicos.
Em nosso estudo observou-se, curiosamente, redução nos níveis de FA nos grupos As e
As+AA o que demonstra que não há danos hepatobiliares sérios, no entanto, essa diminuição pode
ser encontrada no hipotireoidismo, na anemia perniciosa e nas hipofosfatemias. Leves alterações no
tecido hepático foram observadas no grupo tratado somente com arsênio, o que não ocorreu com o
grupo As+AA.
Já o grupo Sb apresentou elevação da FA o que pode demonstrar possível lesão hepatotóxica
neste grupo, o que é compatível com a presença de necrose e células inflamatórias observadas na
análise histopatológica. No entanto, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de
ALT, AST, albumina e proteínas totais. Pode-se ainda, observar que o ácido ascórbico promoveu
proteção contra esta toxicidade ao observarmos que não ocorreu o aumento de FA, nem alterações
nos cortes histológicos.
Ramanathan e colaboradores (2002) mostraram que a administração combinada de alfatocoferol e ácido ascórbico preveniu e protegeu o sistema orgânico da intoxicação provocada pelo
arsênio e que esta combinação pode melhorar as alterações moleculares induzidas pelo arsênio.
Em estudos com ratos, Singh e Rana (2007) observaram que o arsênio promove a depleção do
ácido ascórbico e esta deficiência inibiria as funções antioxidantes do organismo. Observou também
que a suplementação deste aumenta a excreção de arsênio, inibi a peroxidação lipídica, melhora os
níveis de GSH e restaura a atividade de glutationa-S-transferases no fígado e rins. Banerjee e
colaboradores (2009) em estudo com ratos demonstraram o potencial hepatoprotetor da vitamina C
através da capacidade deste de restaurar os níveis de dosagens bioquímicas para próximas do normal,
além de danos histopatológicos e até mesmo aberrações cromossômicas dentre outras.
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os estudos que mostram que o ácido
ascórbico apresenta potencial efeito protetor sobre os efeitos do estresse oxidativo provocado pelo
85
Capítulo 2
arsênio e antimônio no fígado.
5.4.4. Avaliação Renal
É descrito na literatura que os compostos de arsênio e antimônio causam efeitos tóxicos nos
rins. Estes são excretados via renal e, portanto, podem se acumular neste local. Goodwin e
colaboradores (1943) apontaram a membrana tubular como sítio de predição dos efeitos funcionais
dos metais pesados no rim, embora estes formem complexos intracelulares com proteínas.
Os compostos antimoniais alteram reversivelmente a capacidade de concentração urinária,
porém o mecanismo de ação ainda está sob investigação (Veiga et al., 1985).O tratamento de ratos
com antimoniais pentavalentes na dose de 30,0 mg/kg do antimoniato de meglumina ou
estibogluconato de sódio, durante trinta dias, induziu disfunção tubular caracterizada por diminuição
da capacidade de concentração urinária, porém tais alterações parecem ser reversíveis após
suspensão do uso desses fármacos e, nessa dose não foram observadas alterações histopatológicas
renais. Por outro lado, a dose de 200,0 mg/100g/dia do Pentostam® induziu alterações
histopatológicas renais na medida em que demonstrou necrose aguda tubular (Veiga et al., 1990).
Um relato de caso em um paciente de 60 anos mostrou quadro de insuficiência renal aguda,
com necrose tubular acompanhada de aumento plasmático de uréia, creatinina, proteinúria e queda
da depuração de creatinina com o uso de 30,0 gramas de Glucantime®/dia. A biópsia renal revelou
aspecto histopatológico de acometimento renal caracterizado por agressão e necrose dos túbulos
renais. No entanto, com a suspensão da terapia, a função renal retornou à normalidade (Cuce et al.,
1990). Outro relato de caso em um paciente masculino de 50 anos com leishmaniose cutânea
generalizada mostrou necrose tubular aguda com a administração de Glucantime® após 15 dias de
tratamento seguido de óbito (Rodrigues et al., 1999).
Em relação ao arsênio, Keith e colaboradores (1995) mostraram que este semimetal é
citotóxicos ao tecido renal em concentrações elevadas. Haung e colaboradores (1995) e Hussein
(2003) descreveram lesões renais, creatinina sérica elevada, uréia no sangue e proteinúria, em
estudos clínicos de pacientes em uso de TOA, medicamento utilizado na leucemia promielocítica
aguda. A morte celular provocada pelo arsênio pode ser a causa destas alterações, e esta pode ser
induzida por um ou mais mecanismos, incluindo a ativação da caspase, geração maior de espécies
reativas de oxigênio, aumento de expressão do gene HMOX1, dentre outros (Zheng et al, 2005;
Sasaki et al, 2007).
Saxena e colaboradores (2008) avaliaram, em ratos, a nefrotoxicidade do TOA através da
estimativa dos níveis séricos de uréia, creatinina e ácido úrico. As doses, por via oral, foram de
86
Capítulo 2
0,007, 0,01, 0,02 e 0,15 mg para cada 100g de peso corporal para tratamentos subagudo (21,14 e 7
dias) e agudo (1 dia), respectivamente. Foi observado aumento significativo dos níveis séricos dos
parametros bioquímicas em comparação ao controle, devido à disfunção renal.
Em nosso trabalho não foram observados alterações significativas nas dosagens de creatinina
e uréia sérica. Alguns estudos relatam que o comprometimento renal também pode ser expresso em
função do aumento dos níveis plasmáticos de uréia e creatinina. Entretanto, na fase inicial de injúria
renal não poderia, pois ocorreria um aumento da secreção de creatinina, conseqüentemente evitando
um aumento dos níveis plasmáticos da mesma (Asna et al, 2005). Assim, nessa fase inicial é comum
expressar o dano renal pelo índice uréia/creatinina, uma vez que o valor elevado desse índice reflete
a redução da perfusão renal bem como da taxa de filtração glomerular. No entanto, neste trabalho
também não foram observadas diferenças significativas na relação uréia/creatinina nos grupos
tratados com antimônio ou arsênio. Isto demonstra que as doses e protocolo utilizado não foram
capazes de causar alterações renais, em contradição à literatura.
5.4.5. Avaliação hematológica
Alterações hematológicas são observadas em pacientes tratados com trióxido de arsênio,
sendo leucocitose a principal delas, normalmente reversível podendo ocorrer juntamente com febre,
dispnéia, ganho de peso, infiltrados pulmonares e derrames pleurais ou pericárdicos, caracterizando
uma síndrome de diferenciação que pode ser fatal. Em um estudo de fase II do medicamento
Trisenox, 55% dos pacientes (26 de 47) desenvolveram hiperleucocitose em um tratamento de
duração média de 17 dias (Tallman, 2001).
Leucocitose provavelmente ocorre devido a um efeito do TOA de induzir a diferenciação
parcial dos clones leucêmicos (Au e Kwong, 2008), ao degradar a proteína PML-RAR-alfa (Miller
et al, 2002). No entanto, contraditoriamente, a continuação do tratamento com o trióxido de arsênio
leva à supressão dos clones leucêmicos podendo causar leucopenia.
Tendo em vista que o modelo utilizado neste trabalho constituiu-se do uso de animais
saudáveis, e que por isto não havia células leucêmicas que estariam com a diferenciação celular
incompleta, não poderia ter sido observado o efeito do aumento de leucócitos presente em pacientes
com LPA. Foi observado leucopenia no grupo tratado com arsênio livre quando comparado com o
grupo controle, o que pode ter ocorrido devido à indução a apoptose celular provocada pelo arsênio
trivalente.
A leucopenia não foi observada no grupo que recebeu o ácido ascórbico, no entanto, não há
diferença significativa entre esses dois grupos. Sabe-se que o ácido ascórbico vem sendo utilizado
87
Capítulo 2
em terapêutica juntamente com o arsênio por aumentar a ação apoptótica deste último, ao diminuir o
GSH intracelular (Grad et al, 2009). No entanto, não foi observado o efeito desta combinação em
células normais demonstrando que, provavelmente, há seletividade para as células malignas, sem
causar toxicidade grave aos tecidos normais (Dai et al, 1999), o que poderia explicar os resultados
encontrados neste trabalho.
Além disso, os resultados de contagem diferencial de leucócitos obtidas neste trabalho
demonstraram aumento significativo de linfócitos e diminuição significativa de neutrófilos do grupo
As+AA quando comparado com o grupo As. Não foram encontradas tais alterações descritas na
literatura.
É importante salientar que o tratamento diário contínuo com TOA (10 mg) em pacientes com
outras doenças malignas que envolvem a medula óssea, além da LPA, como a leucemia aguda,
mielodisplasia, mieloma e linfoma, pode causar pancitopenia de leve a grave caracterizando a
mielossupressão como o principal efeito dose-limitante do trióxido de arsênio nos pacientes com
estas enfermidades. Além disso, a administração concomitante de outros mielo supressores pode
agravar, ainda mais, a mielo toxicidade o que torna necessário a redução da dosagem de TOA
quando é utilizado outra quimioterapia ou radioterapia concomitante (Au e Kwong, 2008).Diante
disto, o ácido ascórbico ao aumentar a atividade do trióxido de arsênio, pode vir a viabilizar o seu
uso em outras neoplasias além da LPA, visto que, este tornaria viável o uso de menores doses do
medicamento em questão e conseqüentemente diminuiria os efeitos adversos hematológicos que
limitam o seu uso.
Ao contrário do grupo As, não foram observadas alterações no grupo tratado com antimônio.
O que condiz com o estudo do programa de toxicologia do departamento de saúde e serviços
humanos dos EUA realizado por Dieter em 1992, o qual demonstrou que o tártaro emético não
produzia mudanças significativas nos parâmetros hematológicos mensurados em camundongos e
ratos tratados 3 vezes por semana com injeção IP das doses de 0, 1,5, 3, 6, 12 ou 24 mg / kg de peso
corporal durante 3 semanas.
A ausência de alterações no grupo tratado com Sb no presente trabalho pode vir a demonstrar
uma seletividade deste composto às células neoplásicas visto que já foi demonstrada a seletividade
da ação apoptótica somente sobre estas (Müller et al, 2009; Sharma et al, 2008; Hsu et al, 1960; Hu
et
al,
1995).
88
Referências Bibliográficas
6. CONCLUSÕES
89
De acordo com os objetivos propostos e os resultados obtidos, pode-se concluir que:
O método de análise por espectrometria aplicada para quantificação de arsênio e antimônio
encapsulado em lipossomas foi validado. Este mostrou ser simples, rápido, preciso, exato e
reprodutível e com a vantagem de utilizar pequenos volumes de amostra, tornando-se uma
ferramenta alternativa para o controle de qualidade de formulação de lipossomas contendo arsênio ou
antimônio.
A formulação de lipossomas contendo arsênio foi satisfatória para administração in vivo, o
que permitiu a avaliação da redução de toxicidade deste semimetal quando encapsulado.
O modelo animal utilizado reproduziu as alterações cardíacas observadas em pacientes
tratados com compostos de arsênio e antimônio viabilizando o seu uso na avaliação de toxicidade
destes metais.
O ácido ascórbico demonstrou potencial ação cardioprotetora quando administrado
concomitantemente aos metais avaliados neste trabalho ao reduzir as alterações provocadas por estes
sobre a PA e ECG, parâmetros bioquímicos e histológicos.
A encapsulação do arsênio e antimônio em lipossomas atenuou a cardiotóxicidade induzida
pela forma livre.
O estudo aqui apresentado, portanto, foi apenas o início de uma investigação com o intuito de
viabilizar redução da toxicidade de arsênio e antimônio trivalente para uso. Em continuidade são
necessários estudos visando estabilidade da formulação lipossomal de arsênio, avaliação de eficácia
da mesma e da associação As e Sb com AA, além de toxicidade em animais acometidos de
enfermidades.
90
7. REFERÊNCI AS BI BLI OGRÁFI CAS
91
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109
Anexos
8. ANEXOS
110
Anexos
Tabela A1: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de PBS. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
66,60 ± 1,24
122,29 ± 1,83
52,10 ± 2,46
25,54 ± 0,60
372,91 ± 15,43
113,66 ± 4,86 119,11
87,91 ± 4,20
0,5
67,21 ± 1,24
122,11 ± 2,26
52,59 ± 2,35
25,46 ± 0,56
362,96 ± 19,92
± 3,44 123,25 ± 3,61
81,75 ± 3,75
1,0
67,23 ± 1,24
122,20 ± 1,95
52,53 ± 2,37
25,34 ± 0,53
362,15 ± 16,69
116,13 ± 5,46
85,48 ± 3,45
1,5
67,36 ± 1,11
122,43 ± 1,79
52,61 ± 2,38
25,52 ± 0,58
361,96 ± 15,78
118,45 ± 5,97
80,60 ± 4,41
2,0
67,29 ± 1,21
122,22 ± 1,84
52,72 ± 2,44
25,52 ± 0,68
361,75 ± 15,42
119,14 ± 6,28
85,69 ± 5,15
2,5
67,32 ± 1,04
122,17 ± 1,79
52,72 ± 2,48
25,51 ± 0,68
360,25 ± 17,40
114,45 ± 4,71
90,54 ± 5,68
5,0
67,51 ± 1,38
122,70 ± 2,07
52,96 ± 2,37
25,80 ± 0,68
362,66 ± 17,35
123,38 ± 6,37
89,70 ± 4,73
7,5
67,66 ± 1,27
122,80 ± 2,00
52,77 ± 2,46
25,60 ± 0,67
361,44 ± 19,47
122,45 ± 7,16
64,27 ± 6,74
10,0
68,24 ± 1,34
123,71 ± 2,04
52,66 ± 2,50
25,61 ± 0,62
360,95 ± 20,43
118,30 ± 5,99
74,02 ± 6,64
15,0
67,72 ± 1,44
122,63 ± 2,13
52,83 ± 2,42
25,50 ± 0,64
358,63 ± 17,33
117,61 ± 6,21
83,93 ± 5,54
20,0
68,04 ± 1,46
123,29 ± 2,16
52,72 ± 2,43
25,45 ± 0,72
360,55 ± 20,82
116,95 ± 8,45
74,06 ± 6,00
25,0
67,90 ± 1,39
122,17 ± 2,32
52,75 ± 2,44
25,76 ± 0,69
353,84 ± 22,64
118,61 ± 6,45
74,01± 6,81
30,0
68,10 ± 1,37
122,56 ± 2,42
52,58 ± 2,44
25,61 ± 0,71
354,05 ± 24,37
118,64 ± 6,98
85,13 ± 6,72
35,0
67,78 ± 1,65
121,24 ± 2,69
52,69 ± 2,47
25,67 ± 0,73
347,87 ± 23,66
120,23 ± 6,81
72,25 ± 5,95
40,0
68,07 ± 1,46
121,53 ± 2,47
52,88 ± 2,36
25,59 ± 0,70
346,31 ± 25,79
119,44 ± 6,32
64,51 ± 6,10
45,0
67,67 ± 1,55
119,83 ± 2,97
52,51 ± 2,48
25,72 ± 0,58
343,58 ± 28,06
114,97 ± 6,27
71,24 ± 6,53
50,0
67,94 ± 1,46
120,51 ± 2,59
52,81 ± 2,42
25,55 ± 0,74
338,71 ± 22,15
111,96 ± 6,89
80,23 ± 5,24
55,0
67,92 ± 1,48
120,21 ± 2,66
52,69 ± 2,45
25,74 ± 0,64
339,59 ± 28,87
119,43 ± 5,99
74,33 ± 6,17
60,0
68,06 ± 1,34
120,29 ± 2,84
52,78 ± 2,35
25,66 ± 0,67
336,98 ± 27,33
82,17 ± 5,95
111
Anexos
Tabela A2: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Lipossoma branco. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
70,62 ±1,83
128,64 ± 3,16
49,89±1,61
18,28±1,64
360,72±10,39
117,82±4,54
85,55±5,64
0,5
72,86 ±1,90
131,81± 3,55
50,03±1,3
18,66±1,53
356,11±9,84
115,44±4,52
86,17±4,83
1,0
72,26 ±1,03
130,17±2,80
50,00±1,38
18,75±1,34
350,66±10,29
118,02±4,06
89,85±5,69
1,5
72,77 ±1,03
130,80±2,94
50,68±1,24
18,59±1,45
350,56±9,92
117,12±3,72
90,45±5,55
2,0
71,69 ±1,02
129,19±2,70
50,85±1,35
18,70±1,55
352,91±9,29
117,81±3,73
90,40±6,35
2,5
72,78 ±1,03
131,55±2,75
51,09±1,42
18,62±1,36
355,63±9,55
113,16±6,94
85,31±8,08
5,0
72,61 ±1,58
130,61±3,01
52,22±1,73
18,58±1,45
353,78±11,28
113,59±4,53
82,42±3,05
7,5
70,54 ±2,13
127,30±3,89
51,23±1,47
18,58±1,47
357,20±10,65
114,29±5,52
80,58±4,68
10,0
71,88 ±1,36
130,26±2,63
51,08±1,55
17,94±1,34
360,28±8,77
108,52±5,71
76,64±4,56
15,0
74,40 ±1,87
134,08±3,14
50,62±1,49
17,99±1,35
352,98±13,42
111,06±4,80
77,80±3,96
20,0
74,86 ±1,68
137,52±2,60
50,17±1,19
18,03±1,16
352,48±7,84
108,11±5,09
75,21±3,91
25,0
74,90 ±1,68
133,25±2,65
50,17±1,00
18,13±1,42
340,79±23,49
108,43±4,72
76,21±8,00
30,0
74,43 ±1,69
133,88±3,19
50,31±1,21
18,04±1,33
352,51±17,29
106,38±5,39
76,10±7,48
35,0
73,79 ±1,56
137,94±3,00
50,28±0,87
17,98±1,28
378,96±28,29
115,60±4,88
77,22±4,25
40,0
73,31 ±1,45
132,28±4,03
50,82±0,77
18,11±1,25
361,66±15,53
111,18±6,91
73,86±6,30
45,0
74,03 ±1,34
128,99±3,07
50,11±1,13
18,25±1,28
342,49±25,97
118,75±5,25
81,19±6,81
50,0
72,02 ±1,16
131,97±3,66
50,94±0,83
18,08±1,33
370,21±16,59
109,70±5,96
79,15±6,09
55,0
72,28 ±1,56
128,29±2,80
51,43±1,16
18,27±1,27
352,56±22,57
119,23±4,77
82,35±7,15
60,0
73,37 ±1,47
134,53±3,48
50,92±1,84
18,05±1,44
372,05±15,95
117,76±3,89
81,69±5,75
112
Anexos
Tabela A 3: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de AA . Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
60,5 ± 1,69
108,4 ± 3,38
49,8 ± 1,20
19,7 ± 0,30
380,3 ± 20,56
122,7 ± 2,94
87,9 ± 4,20
0,5
60,3 ± 1,69
107,9 ± 2,63
49,8 ± 1,07
19,8 ± 0,33
365,5 ± 19,92
128,9 ± 9,96
97,3 ± 2,35
1,0
60,1 ± 1,77
107,7 ± 3,18
50,8 ± 0,85
19,6 ± 0,23
366,7 ± 19,40
135,9 ± 10,51
99,4 ± 5,47
1,5
58,9 ± 1,39
106,0 ± 2,90
50,8 ± 0,91
19,8 ± 0,26
367,2 ± 17,66
138,8 ± 9,49
99,2 ± 7,89
2,0
60,4 ± 1,65
108,5 ± 2,43
51,5 ± 0,93
19,8 ± 0,11
366,1 ± 16,88
138,4 ± 13,37
98,3 ± 6,24
2,5
59,9 ± 1,42
107,1 ± 2,07
51,2 ± 1,18
19,6 ± 0,33
375,3 ± 16,35
137,2 ± 8,17
91,1 ± 6,89
5,0
61,0 ± 1,22
106,1 ± 3,20
54,1 ± 2,24
20,0 ± 0,19
359,4 ± 25,33
127,1 ± 2,91
91,5 ± 1,93
7,5
60,0 ± 1,54
107,6 ± 2,84
51,6 ± 1,46
19,9 ± 0,36
371,0 ± 16,78
127,7 ± 2,98
90,3 ± 16,96
10,0
60,6 ± 1,77
109,9 ± 3,36
50,9 ± 1,20
19,8 ± 0,31
382,0 ± 14,61
126,1 ± 5,95
89,3 ± 5,77
15,0
60,7 ± 1,31
110,1 ± 2,65
51,6 ± 1,80
19,9 ± 0,27
379,4 ± 19,29
124,6 ± 5,71
87,6 ± 6,22
20,0
60,4 ± 1,87
110,1 ± 4,12
50,2 ± 2,08
19,8 ± 0,22
389,6 ± 16,69
122,2 ± 2,62
84,5 ± 2,73
25,0
59,4 ± 2,06
107,1 ± 4,76
52,6 ± 2,83
20,2 ± 0,29
376,9 ± 19,20
118,1 ± 2,69
79,6± 2,56
30,0
61,3 ± 1,76
109,4 ± 3,48
51,5 ± 1,82
19,9 ± 0,37
374,5 ± 18,67
111,2 ± 4,20
78,4 ± 3,94
35,0
62,4 ± 1,22
113,3 ± 2,28
51,5 ± 1,61
19,9 ± 0,39
375,4 ± 13,24
109,5 ± 4,45
82,6 ± 9,73
40,0
61,7 ± 1,65
111,7 ± 2,72
52,4 ± 2,34
20,0 ± 0,31
384,3 ± 14,78
115,4 ± 10,36
82,6 ± 9,73
45,0
61,1 ± 1,82
105,4 ± 0,15
51,4 ± 1,98
20,1 ± 0,36
351,5 ± 5,66
115,3 ± 10,36
85,6 ± 13,10
50,0
61,7 ± 1,72
110,4 ± 2,30
52,0 ± 2,09
20,3 ± 0,35
369,8 ± 13,86
119,5 ± 12,69
87,4 ± 12,92
55,0
62,1 ± 1,12
110,3 ± 0,15
52,5 ± 2,34
20,1 ± 0,23
390,4 ± 8,62
122,1 ± 14,37
84,4 ±15,58
60,0
62,4 ± 1,26
110,7 ± 2 ,33
53,2 ± 2,63
20,1 ± 0,39
363,8 ± 14,70
117,8 ± 2,23
85,0 ±13,73
113
Anexos
T abela A4: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de As. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
62,9 ± 1,55
110,3 ± 3,43
52,1 ± 3,10
23,0 ± 0,48
339,9 ± 16,62
130,6 ± 4,47
87,1 ± 6,58
0,5
63,0 ± 1,85
110,4 ± 2,82
52,4 ± 3,25
23,1 ± 0,52
328,1 ± 17,07
120,2 ± 8,63
75,5 ± 9,66
1,0
63,7 ± 1,75
111,8 ± 3,18
53,3 ± 3,21
23,3 ± 0,46
326,4 ± 17,19
110,8 ± 9,47
67,2 ± 9,63
1,5
62,4 ± 1,78
108,3 ± 2,94
53,4 ± 3,43
22,8 ± 0,58
321,0 ± 16,87
104,2 ± 10,43
62,5 ± 10,02
2,0
62,4 ± 2,14
108,5 ± 3,45
54,1 ± 3,52
22,8 ± 0,52
317,2 ± 17,13
97,8 ± 9,95
59,2 ± 9,29
2,5
62,5 ± 1,35
107,7 ± 2,71
54,5 ± 3,37
22,9 ± 0,81
314,5 ± 17,73
93,9 ± 9,29
58,0 ± 9,11
5,0
63,2 ± 1,40
108,0 ± 3,53
55,7 ± 3,30
23,1 ± 0,71
300,8 ± 20,96
87,8 ± 8,62
53,8 ± 8,49
7,5
61,9 ± 1,69
103,9 ± 4,18
57,4 ± 4,25
22,7 ± 0,81
285,9 ± 25,31
82,3± 11,08
51,8 ± 9,79
10,0
62,8 ± 1,92
104,5 ± 4,26
57,7 ± 4,22
23,0 ± 1,15
278,0 ± 24,83
79,4 ± 11,30
50,6 ± 9,50
15,0
63,1 ± 2,20
103,4 ± 3,98
57,6 ± 4,20
23,1 ± 1,00
267,5 ± 22,90
87,3 ± 11,24
55,0 ± 9,38
20,0
64,0 ± 2,23
105,1 ± 4,08
58,1 ± 4,64
23,4 ± 8,75
265,4 ± 23,79
97,6 ± 9,87
62,9 ± 8,41
25,0
63,6 ± 2,36
102,7 ± 4,43
62,1 ± 5,89
23,3 ± 1,45
255,1 ± 25,90
101,6 ± 11,02
66,6 ± 9,78
30,0
62,6 ± 2,39
101,2 ± 5,27
62,1 ± 5,72
22,9 ± 2,12
252,4 ± 30,50
100,1 ± 10,35
65,6 ± 11,65
35,0
63,0 ± 2,36
101,5 ± 5,57
62,4 ± 5,92
23,0 ± 1,92
255,3 ± 29,21
103,2 ± 10,02
69,6 ± 9,26
40,0
63,2 ± 2,48
102,0 ± 5,56
61,9 ± 5,90
23,1 ± 1,50
255,4 ± 28,38
104,1 ± 8,95
69,4 ± 9,21
45,0
62,8 ± 2,31
100,3 ± 4,00
61,1 ± 5,44
23,0 ± 1,29
249,1 ± 25,82
99,6± 10,11
66,9 ± 22,71
50,0
63,2 ± 1,69
102,4 ± 4,53
61,5 ± 7,26
23,1 ± 1,58
254,3 ± 30,48
101,1 ± 11,01
67,4 ± 9,37
55,0
63,6 ± 1,74
102,4 ± 4,06
63,1 ± 7,28
23,3 ± 1,64
256,0 ± 21,71
99,2 ± 8,72
67,9 ± 9,37
60,0
63,7 ± 1,99
102,8 ± 4,30
62,6 ± 6,80
23,3 ± 1,97
256,0 ± 27,94
101,1 ± 11,13
69,2 ± 9,33
114
Anexos
Tabela A5: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Lipossoma arsênio. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
71,8±2,24
130,0±3,34
53,5±2,70
19,7±0,53
300,9±24,90
97,3±11,06
86,0±10,01
0,5
72,4±2,41
131,1±3,17
53,9±2,87
19,6±0,65
300,9±23,86
97,3±8,26
91,5±7,11
1,0
70,5±2,20
127,9±2,25
54,5±3,02
19,5±0,64
302,3±24,04
97,7±10,93
87,1±9,58
1,5
71,8±2,01
129,9±3,14
53,4±3,21
20,0±0,56
302,2±22,24
97,7±6,60
85,2±7,26
2,0
71,9±2,35
130,8±2,52
54,8±3,28
19,6±0,64
305,2±21,78
98,7±8,70
83,7±7,12
2,5
72,6±2,16
131,9±2,60
54,5±3,10
19,6±0,65
305,7±18,93
98,8±12,55
87,2±11,17
5,0
72,7±1,82
132,5±2,09
54,7±3,36
19,7±0,62
309,1±14,71
99,9±11,04
87,5±11,92
7,5
72,9±2,89
133,8±4,61
55,3±3,08
19,7±0,54
314,1±16,81
101,9±10,17
88,9±11,21
10,0
71,3±2,94
130,9±6,01
55,6±2,87
19,6±0,47
311,6±16,05
101,0±8,57
87,6±9,48
15,0
71,5±3,48
131,0±4,55
56,2±2,89
19,9±0,48
314,5±14,24
101,7±5,06
88,0±5,37
20,0
70,2±2,81
129,0±4,34
56,0±2,86
19,9±0,51
315,2±15,02
102,1±8,27
91,0±9,74
25,0
71,0±3,15
129,6±4,95
57,0±2,97
19,9±0,55
307,3±13,48
99,2±3,57
89,0±6,12
30,0
71,0±3,29
129,0±5,60
57,6±2,34
20,2±0,49
306,0±14,54
98,3±10,91
90,6±10,69
35,0
71,1±3,68
128,3±4,08
58,2±2,73
20,1±0,42
300,7±14,24
97,1±2,54
85,2±6,51
40,0
72,1±2,82
129,8±4,05
59,0±2,77
20,2±0,49
298,9±13,54
96,0±9,67
84,6±9,67
45,0
73,3±2,91
131,1±3,85
59,6±2,77
20,1±0,47
291,8±12,86
94,3±2,28
82,8±9,67
50,0
70,5±2,68
125,9±3,65
59,9±2,90
20,1±0,58
288,1±12,30
93,1±8,97
80,2±8,18
55,0
72,2±2,95
127,5±3,85
60,1±2,63
20,0±0,60
283,2±12,37
91,6±2,11
84,4±2,30
60,0
72,4±2,65
128,4±3,32
60,4±2,77
19,8±0,45
283,3±12,67
91,6±7,38
81,8±7,11
115
Anexos
Tabela A 6: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de As+AA. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
66,4 ± 1,56
116,0 ± 1,60
48,2 ± 1,92
22,5 ± 0,72
310,5 ± 13,72
125,3 ± 4,77
86,5 ± 4,09
0,5
64,5 ± 1,62
109,6 ± 2,79
51,2 ± 2,42
22,9 ± 0,84
307,0 ± 11,33
130,8 ± 5,46
90,1 ± 3,74
1,0
64,8 ± 1,41
111,0 ± 1,18
51,2 ± 2,50
23,2 ± 0,65
317,5 ± 15,12
120,2 ± 7,05
84,8 ± 4,68
1,5
66,4 ± 1,65
113,4 ± 1,98
51,2 ± 2,66
23,1 ± 0,76
304,8 ± 14,54
117,8 ± 12,80
78,4 ± 9,41
2,0
66,6 ± 1,80
113,1 ± 1,99
51,3 ± 2,55
22,7 ± 0,71
310,4± 17,33
111,5 ± 12,93
79,3 ± 9,61
2,5
65,4 ± 1,50
111,8 ± 1,93
51,5 ± 2,87
23,2 ± 0,75
315,0 ± 15,22
121,0 ± 7,04
81,8 ± 6,84
5,0
65,7 ± 1,70
111,1 ± 3,40
51,5 ± 2,43
22,2 ± 0,48
301,5 ± 19,29
114,7 ± 10,58
82,9 ± 9,49
7,5
67,0 ± 1,67
112,9 ± 2,03
52,7 ± 2,55
22,7 ± 1,11
290,6 ± 16,75
110,3 ± 12,97
78,7± 11,14
10,0
63,9 ± 1,52
106,7 ± 2,63
53,3 ± 2,81
22,6 ± 0,96
283,9 ± 13,42
104,8 ± 12,13
75,4 ± 10,50
15,0
64,5 ± 1,47
105,9 ± 2,98
53,6 ± 3,19
23,5 ± 0,60
282,3 ± 14,34
108,1 ± 9,50
79,1 ± 9,19
20,0
64,0 ± 1,44
106,7 ± 2,26
54,2 ± 2,72
15,0 ± 8,22
280,6 ± 14,56
110,4 ± 9,37
79,4 ± 9,35
25,0
64,3 ± 1,32
103,6 ± 2,93
54,8 ± 2,71
23,4 ± 0,57
270,4 ± 19,74
103,1 ± 7,63
75,2 ± 7,47
30,0
65,3 ± 1,42
108,3 ± 2,05
54,7 ± 2,57
24,0 ± 0,91
278,1 ± 14,98
110,9 ± 6,64
82,5 ± 7,48
35,0
64,4 ± 1,23
108,3 ± 1,40
54,5 ± 2,64
23,7 ± 1,07
283,0 ± 11,67
109,9 ± 7,44
81,2 ± 8,45
40,0
65,0 ± 1,07
107,8 ± 2,54
54,6 ± 2,59
23,8 ± 1,12
276,6 ± 18,00
108,1 ± 7,73
76,1 ± 7,45
45,0
65,5 ± 1,33
110,9 ± 2,44
54,0 ± 2,73
23,9 ± 0,99
293,3 ± 10,41
109,5 ± 8,68
75,0 ± 9,95
50,0
64,5 ± 1,62
108,4 ± 2,05
54,9 ± 2,88
23,8 ± 0,98
290,4 ± 11,14
110,9 ± 6,75
80,6 ± 7,95
55,0
64,7 ± 1,27
111,1 ± 1,32
55,1 ± 2,95
23,7 ± 0,93
299,3 ± 10,46
112,0 ± 6,27
78,6 ± 7,04
60,0
64,3 ± 0,98
108,5 ± 2,10
56,1 ± 3,13
23,6 ± 0,87
292,8 ± 11,81
113,5 ± 6,13
82,7 ± 7,83
116
Anexos
Tabela A 7: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos de As do protocolo subagudo. Os valores representam a média ±
e.p.m. (n=6).
Grupos
Tratamento
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
Controle
Antes
51,8 ± 1,50
95,8 ± 3,07
48,0 ± 1,73
14,4 ± 0,61
438,3 ± 5,30
Depois
51,0 ± 0,92
97,7 ± 2,15
54,6 ± 1,30
13,9 ± 0,51
385,8 ± 7,00
Antes
57,9 ± 0,23
114,4 ± 1,03
43,7 ± 0,19
18,8 ± 0,20
462,2 ± 9,64
Depois
61,4 ± 0,68
113,0 ± 1,35
49,5 ± 0,67
20,3 ± 0,15
376,1 ± 15,79
Antes
64,2 ± 1,14
119,0 ± 1,58
45,4± 1,36
22,4 ± 0,70
386,6 ± 18,77
Depois
92,7 ± 2,11
175,6 ± 2,29
47,9 ± 1,58
22,6 ± 0,50
316,7 ± 20,41
Antes
57,8 ± 1,23
113,9 ± 2,48
42,5 ± 0,80
16,8 ± 0,43
465,0 ± 6,75
Depois
71,7 ± 1,85
136,6 ± 19,62
48,9 ± 1,06
18,4 ± 0,13
369,6 ± 17,15
AA
As
As+AA
117
Anexos
Tabela A 8: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Sb. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
63,8 ± 2,40
111,3 ± 1,44
57,0 ± 1,50
20,2 ± 0,88
351,2 ± 20,72
123,5 ± 3,98
93,5 ± 6,21
0,5
71,3 ± 3,89
124,9 ± 3,33
57,7 ± 1,50
21,4 ± 1,08
335,3 ± 17,23
102,6 ± 6,51
78,7 ± 5,84
1,0
75,5 ± 3,88
128,3 ± 3,91
58,0 ± 1,34
20,7 ± 1,10
335,0 ±16,64
86,4 ± 8,15
62,5 ± 7,34
1,5
75,5 ± 1,47
131,7 ± 2,36
59,7 ±1,02
21,6 ± 1,07
318,3 ± 15,70
74,0 ± 10,82
52,9 ± 9,52
2,0
75,5 ± 1,93
132,9 ± 2,36
60,2 ± 1,02
22,1 ± 1,24
319,4 ± 15,46
70,7 ± 10,41
47,8 ± 10,33
2,5
75,4 ± 0,80
132,0 ± 2,36
59,2 ± 0,99
21,5 ± 1,23
322,4 ±16,11
72,6 ± 9,20
48,9 ± 9,50
5,0
74,3 ± 0,68
127,9 ± 1,99
58,0 ± 1,32
20,6 ± 0,84
322,9 ± 14,85
80,7 ± 2,73
57,8 ± 2,82
7,5
76,6 ± 2,91
130,7 ± 2,36
58,4 ± 1,46
22,1 ± 1,16
319,5 ± 14,86
75,3 ± 2,14
57,3 ± 5,79
10,0
74,0 ± 1,98
124,5 ± 4,96
58,2 ± 1,72
24,0 ± 2,20
318,8 ± 15,62
82,2 ± 5,64
58,2 ± 4,32
15,0
74,5 ± 1,78
127,1 ± 3,91
64,1 ± 4,63
23,1 ± 1,67
294,8 ± 24,45
87,9 ± 5,12
70,7 ± 4,34
20,0
74,9 ± 3,03
126,0 ± 3,65
59,6 ± 1,94
18,7 ± 1,34
313,1 ± 12,97
91,5 ± 7,09
72,8 ± 4,89
25,0
76,1 ± 1,33
127,5 ± 3,91
65,7 ± 4,69
23,0 ± 1,18
288,5 ± 23,07
97,2 ± 5,89
75,1 ± 6,85
30,0
73,3 ± 1,73
121,8 ± 4,01
64,8 ± 5,25
22,8 ± 1,19
313,1 ± 12,25
101,8 ± 6,08
78,1 ± 4,90
35,0
76,6 ± 1,01
127,9 ± 4,08
61,0 ± 2,47
22,0 ± 0,88
313,3 ± 13,08
104,3 ± 5,42
83,3 ± 4,26
40,0
75,0 ± 3,52
129,0 ± 3,42
61,6 ± 2,73
21,7 ± 0,88
311,9 ± 13,54
106,0 ± 3,99
87,4 ± 3,69
45,0
77,8 ± 1,69
132,0 ± 2,89
62,0 ± 2,54
22,2 ± 1,04
302,4 ± 16,36
108,5 ± 4,85
84,6 ± 4,10
50,0
75,4 ± 2,54
130,3 ± 6,45
61,7 ± 2,60
21,9 ± 1,06
309,3 ± 15,24
109,7 ± 1,13
94,8 ± 1,62
55,0
75,6 ± 1,60
126,6 ± 2,36
61,8 ± 2,73
22,2 ± 1,09
306,3 ± 15,87
112,3 ± 1,39
93,5 ± 0,43
60,0
74,3 ± 0,52
123,6 ± 5,32
62,4 ± 3,00
22,2 ± 0,87
308,8 ± 16,18
115,2 ± 0,89
93,2 ± 0,52
118
Anexos
Tabela A 9: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Lipossoma Sb. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
0,0
64,1±1,19
0,5
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
121,3±2,19
48,5±0,92
25,1±0,70
406,9±6,30
131,3±6,51
97,6±3,55
64,7±0,83
122,0±1,57
48,9±0,84
26,0±0,66
401,8±6,76
137,3±11,1
107,0±6,47
1,5
63,8±0,90
120,5±1,61
49,3±0,80
25,5±0,68
405,3±6,68
139,6±8,35
105,8±5,33
2,5
64,1±1,31
121,2±2,08
50,7±0,94
25,1±0,52
406,5±6,93
134,9±9,64
106,7±4,84
5,0
63,5±1,37
120,2±2,23
50,4±0,75
25,3±0,59
407,4±7,04
133,1±8,18
99,7±5,71
7,5
63,3±1,26
119,6±2,12
49,7±0,78
25,7±0,67
405,4±6,89
125,8±8,12
93,8±5,36
10,0
64,5±1,18
121,9±2,03
50,0±0,81
25,4±0,59
405,3±7,59
125,9±7,22
92,6±4,10
15,0
63,6±0,96
120,4±1,71
49,5±0,75
25,6±0,81
407,9±7,18
120,8±8,75
88,8±6,47
20,0
63,7±1,26
120,6±2,03
49,6±0,50
24,9±0,59
407,7±7,48
124,5±7,80
90,6±5,71
30,0
63,9±0,81
121,2±1,27
49,0±0,62
25,5±0,60
409,0±7,02
124,4±9,34
91,1±8,19
40,0
63,5±1,31
120,0±2,37
50,5±0,60
25,2±0,63
405,1±6,09
122,3±10,2
89,728,66
50,0
66,2±1,52
124,3±2,66
49,8±0,60
25,8±0,66
397,2±7,55
113,5±12,1
82,8±10,7
60,0
64,9±1,97
120,1±2,66
50,9±0,85
25,2±0,44
382,8±15,07
118,6±13,0
85,7±11,1
Qtc
(ms)
119
Anexos
Tabela A 10: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Sb+AA. Média ± e.p.m. (n=6).
Tempo
(min)
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
PAS
(mmHg)
PAD
(mmHg)
0,0
70,6 ± 2,14
116,4 ± 1,93
60,9 ± 2,16
24,8 ± 3,59
266,2 ± 13,32
96,7 ± 5,85
68,6 ± 5,10
0,5
74,9 ± 2,85
120,1 ± 4,12
64,2 ± 1,97
22,0 ± 0,28
250,2 ± 4,03
94,9 ± 4,84
72,4 ± 3,52
1,0
74,9 ± 2,84
120,8 ± 3,86
63,6 ± 1,97
21,9 ± 0,50
254,1 ± 6,14
85,5 ± 3,77
71,2 ± 4,66
1,5
75,3 ± 2,72
121,9 ± 3,79
64,2 ± 1,72
22,3 ± 0,50
255,8 ± 4,78
88,97 ± 7,66
69,7 ± 4,54
2,0
75,2 ± 3,41
121,7 ± 4,92
64,4 ± 1,60
21,8 ± 0,28
256,4 ± 5,45
84,3 ± 8,56
67,9 ± 4,70
2,5
76,9 ± 3,20
124,9 ± 4,47
63,3 ± 1,58
21,8 ± 0,25
257,1 ± 5,07
90,3 ± 7,09
69,7 ± 4,95
5,0
79,9 ± 2,51
125,6 ± 5,11
62,6 ± 1,85
22,0 ± 0,52
238,9 ± 15,66
87,3 ± 5,79
71,2 ± 5,47
7,5
78,9 ± 1,46
128,1 ± 2,65
62,4 ± 1,97
21,7 ± 0,23
258,6 ± 7,26
85,7 ± 5,13
67,3 ± 5,66
10,0
77,0 ± 1,54
125,2 ± 2,95
61,8 ± 1,49
21,8 ± 0,22
260,9 ± 8,11
86,2 ± 5,58
64,2 ± 5,91
15,0
76,5 ± 0,89
125,5 ± 2,48
63,9 ± 2,03
22,4 ± 0,57
259,8 ± 8,36
81,7 ± 3,38
65,3 ± 2,57
20,0
76,5 ± 0,99
124,4 ± 2,13
64,3 ± 1,62
11,8 ± 8,98
261,1 ± 8,96
78,2 ± 1,47
61,3 ± 2,96
25,0
76,9 ± 1,27
124,9 ± 1,72
64,5 ± 1,50
21,9 ± 0,34
256,5 ± 11,37
81,1 ± 7,56
60,1 ± 4,49
30,0
75,7 ± 0,35
121,5 ± 1,52
64,1 ± 1,61
22,0 ± 0,54
257,8 ± 10,70
79,1 ± 9,43
57,4 ± 6,76
35,0
77,2 ± 1,23
123,4 ± 0,66
65,7 ± 2,37
22,4 ± 0,67
251,1 ± 12,62
88,2 ± 6,55
61,7 ± 4,98
40,0
78,0 ± 1,32
125,3 ± 1,66
65,6 ± 2,48
22,3 ± 0,50
252,8 ± 11,58
84,5 ± 7,72
66,4 ± 2,84
45,0
77,6 ± 0,78
126,1 ± 2,55
67,0 ± 2,69
22,6 ± 0,45
255,2 ± 14,27
87,2 ± 11,03
61,3 ± 7,24
50,0
77,5 ± 0,56
124,6 ± 2,16
67,2 ± 2,63
22,5 ± 0,40
252,8 ± 11,54
86,2 ± 7,15
62,3 ± 4,89
55,0
77,8 ± 0,94
124,1 ± 1,17
66,4 ± 3,02
22,8 ± 0,65
245,3 ± 16,80
90,2 ± 9,37
64,4 ± 6,17
60,0
75,5 ± 1,64
121,3 ± 3,40
66,0 ± 3,07
22,5 ± 0,75
249,6 ± 12,63
90,5 ± 5,71
69,7 ± 3,10
120
Anexos
Tabela A 11: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos Sb do protocolo subagudo. Média ± e.p.m. (n=6).
Grupos
Tratamento
QT
(ms)
Qtc
(ms)
PR
(ms)
QRS
(ms)
FC
(bpm-1)
Controle
Antes
51,8 ± 1,50
95,8 ± 3,07
48,0 ± 1,73
14,4 ± 0,61
438,3 ± 5,30
Depois
50,9 ± 0,92
97,7 ± 2,15
46,3 ± 1,30
13,9 ± 0,51
385,8 ± 7,00
Antes
57,9 ± 0,23
114,4 ± 1,03
43,7 ± 0,19
18,8 ± 0,20
462,2 ± 9,64
Depois
61,8 ± 0,68
113,0 ± 1,35
49,7 ± 0,67
20,3 ± 0,15
376,1 ± 15,79
Antes
58,3 ± 0,58
115,6 ± 1,35
42,2 ± 0,55
19,7 ± 0,27
453,3 ± 9,93
Depois
77,9 ± 2,70
140,57 ± 4,95
47,5 ± 3,30
20,8 ± 0,89
355,9 ± 16,01
Antes
58,5 ± 1,18
113,3 ± 2,09
42,2 ± 0,38
19,8 ± 0,85
436,5 ± 9,82
Depois
74,0 ± 0,98
135,4 ± 1,92
47,1 ± 1,25
21,7 ± 0,86
360,9 ± 11,63
AA
Sb
Sb + AA
121
Resumos apresentados em congresso
Reis, P.G., Guimarães, H.N., Teixeira, M.C., Grabe-Guimarães, A., Silva-Barcellos, N.M..
EVALUATI ON
OF
CARDI OVASCULAR
CHANGES
I NDUCED
BY
CHRONI C TREATM ENT WI TH TRI VALENT ARSENI C I N RATS I N VI VO .
In: VII International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2009, Ribeirão Preto.
Reis, P.G., Almeida, W.M., Guimarães, H.N., Leite, R., Teixeira, M.C., Grabe-Guimarães, A,
Silva-Barcellos,
N.M..EVALUATI ON
OF
CARDI OVASCULAR
CHANGES
I NDUCED BY CHRONI C TREATM ENT WI TH TRI VALENTS ARSENI C AND
ANTI M ONY I N RATS I N VI VO. In: 41 Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapêutica Experimental, 2009, Ribeirão Preto.
Reis, P.G., Guimarães, H.N., Teixeira, M.C., Grabe-Guimarães, A., Silva-Barcellos, N.M..
ALTERAÇÕES CARDI OVASCULARES I NDUZI DAS PELO TRI ÓXI DO DE
ARSÊNI O EM RATOS I N VI VO. In: 40 Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapêutica Experimental, 2008, Ribeirão Preto.
122

EFAR - Diss - Priscila Gomes Reis - Teses e Dissertações

Transcrição

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