desenvolvimento in vitro de cattleya tigrina a. richard (orchidaceae)

Transcrição

Ensaios e Ciência
Ciências Biológicas,
Agrárias e da Saúde
Vol. XIII, Nº. 2, Ano 2009
Cristiano Pedroso de Moraes
Centro Universitário Hermínio Ometto
Uniararas
[email protected]
Natália Santambrosio Santos
Uniararas
[email protected]
Raquel Massaro
Uniararas
[email protected]
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE CATTLEYA
TIGRINA A. RICHARD (ORCHIDACEAE)
UTILIZANDO FERTILIZANTES COMERCIAIS
RESUMO
A semeadura in vitro representa, em relação à germinação em condições
naturais, uma alternativa importante para a propagação de várias espécies
de orquídeas, sobretudo para as ameaçadas de extinção, por ser um
protocolo para produção de orquídeas em curtos períodos de tempo. O
presente trabalho teve como objetivo estudar a influência do meio de cultura
MS e de dois meios à base de fertilizantes, Hyponex e Kristalon Laranja, no
desenvolvimento in vitro de Cattleya tigrina A. Richard, espécie ameaçada de
extinção. Após 180 dias de cultivo, o meio de cultura à base do fertilizante
Kristalon Laranja mostrou-se mais eficiente para a germinação e o
desenvolvimento das sementes, uma vez que apresentou as maiores médias
para as seguintes variáveis: altura das plântulas, número de raízes, massa
fresca e comprimento da maior raiz. O meio de cultura à base do fertilizante
Kristalon Laranja pode ser utilizado tanto de maneira comercial quanto para
recomposição de áreas degradadas via programas de semeadura, uma vez
que apresenta baixo custo e maior facilidade de produção.
Germana Marcelino Cordeiro
Uniararas
Palavras-Chave: semeadura
micropropagação.
[email protected]
ABSTRACT
Thiago de Souza Leal
Uniararas
[email protected]
Anhanguera Educacional S.A.
Correspondência/Contato
Alameda Maria Tereza, 2000
Valinhos, São Paulo
CEP 13278-181
[email protected]
in
vitro;
Kristalon
Laranja;
orquídeas;
In vitro seed germination constitutes an important alternative for the
propagation of several orchid species, especially those that are threatened
with extinction, such as Cattleya tigrina A. Richard, since it represents a way
to produce orchids in shorter time periods. The present paper aimed to
study the influence of the MS culture medium and of two fertilizer media
(one composed of Hyponex and the other of Kristalon Laranja) on the in
vitro development of Cattleya tigrina. After 180 days of in vitro culture, the
Kristalon Laranja fertilizer culture medium showed to be the most effective
one for the germination and the development of seeds, presenting the
highest averages for the following measures: heigh of the plantules, number
of roots, fresh mass and length of the longest root. The Kristalon Laranja
fertilizer culture medium can be used not only commercially, but also for the
recomposition of degraded areas through seeding programs since it shows
low cost and easeness of production.
Keywords: in vitro seed germination; Cattleya; Kristalon Laranja.
Coordenação
Instituto de Pesquisas Aplicadas e
Desenvolvimento Educacional - IPADE
Relato de Pesquisa
Recebido em: 26/11/2009
Avaliado em: 13/7/2010
Publicação: 6 de outubro de 2010
57
58
Desenvolvimento in vitro de Cattleya tigrina A. Richard (Orchidaceae) utilizando fertilizantes comerciais
1.
INTRODUÇÃO
As orquídeas destacam-se como importantes plantas ornamentais, de grande interesse
botânico e econômico, em função da beleza e exuberância de suas flores (SHEEHAN,
1992). Além desses atributos, Zanenga-Godoy e Costa (2003) explicitam que o cultivo de
orquídeas do gênero Cattleya é de grande importância para o agronegócio florícola
mundial, devido à ampla capacidade de recombinação genética, além de características de
suas flores como forma, tamanho e durabilidade.
As orquídeas são comumente retiradas de seus habitates, sendo alvos constantes
de exploração por meio de coletas indiscriminadas. A retirada de orquídeas de seu
ambiente natural vem aumentando devido a diversos fatores como a urbanização,
aumento das atividades agrícolas e extrativismo predatório (MENEZES, 1987; 1995). Entre
as orquídeas brasileiras, o gênero Catlleya merece destaque, sendo considerado por Arditti
e Ernst (1992) como um sinônimo de orquídea e por Menezes (1987), como a rainha das
orquídeas pela sua exuberância e tamanho da flor. Adicionalmente, apresenta alto valor
comercial (VENTURA et al., 2002), tornando-se com isso um importante alvo de coleta
predatória no Brasil.
Entre as orquídeas desse gênero vulneráveis à extinção (BIOTA, 2009) está
Cattleya tigrina A. Richard. Essa espécie, anteriormente conhecida como Cattleya guttata,
habita trechos de matas ribeirinhas, caracterizados pela alta umidade, estando distribuída
pelo litoral atlântico, desde o sul do Brasil até o estado do Rio de Janeiro (PRIDGEON et
al., 2005). Seu período de floração ocorre em janeiro, época da alta temporada turística no
litoral brasileiro, tornando-a alvo constante de coleta por mateiros, que exploram os lucros
de sua venda (VENTURA et al., 2002).
A cultura assimbiótica ou semeadura in vitro de orquídeas é utilizada no Brasil há
cerca de 25 anos, com o principal objetivo de aumentar a produção de mudas, o que reduz
seu custo e contribui para evitar a extinção de diversas espécies de orquídeas
(STANCATO; BEMELMANS; VEGRO, 2001). Este tipo de cultura resulta em maiores
percentuais de germinação, em comparação com a germinação em condições naturais, a
qual é dependente da infecção por fungos micorrízicos simbiontes (MARTINI et al., 2001).
A resposta às condições do cultivo in vitro varia fortemente entre gêneros,
espécies, cultivares e até mesmo plantas de um mesmo genótipo cultivadas sob diferentes
condições ambientais. Além disso, em plantas que sofrem alterações anuais ou mesmo
diárias de fatores climáticos, parecem existir ritmos fisiológicos endógenos que podem se
tornar críticos para o estabelecimento da cultura (ARDITTI; ERNST, 1992). Não há, ainda,
Ensaios e Ciência: C. Biológicas, Agrárias e da Saúde • Vol. XIII, Nº. 2, Ano 2009 • p. 57-65
Cristiano Pedroso de Moraes, Natália Santambrosio Santos, Raquel Massaro, Germana Marcelino Cordeiro, Thiago de Souza Leal
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um meio de cultura específico que se adeque às exigências de um gênero, espécie, híbrido
ou clone. Em geral, é difícil definir os motivos pelos quais certas combinações de meio e
condições de cultivo obtém sucesso, ao passo que outras fracassam (VENTURA et al.,
2002). Em relação ao gênero Catlleya, Arditti e Ernst (1992) descrevem as seguintes
formulações de meio: KC, (KNUDSON, 1946); VW (VACIN; WENT, 1949); H (HELLER,
1953); MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962); LS (LISMAIER; SKOOG, 1965); e RM
(REINERT; MOHR, 1967). Cada um desses meios possui uma composição própria de
macro e micronutrientes, assim como diferentes fontes de carbono, vitaminas e
reguladores de crescimento (VENTURA, 2007). Essa complexidade tende a dificultar sua
preparação e elevar os custos dessa forma de propagação (PEDROSO DE MORAES et al.,
2009).
Estudos in vitro realizados por Stancato, Bemelmans e Vegro (2001) e Pedroso-deMoraes et al. (2009), demonstram que a diminuição de custos é possível através da
simplificação dos meios de cultura atuais, principalmente com o emprego de fertilizantes
como base de meios de cultura. Este tipo de procedimento tem como objetivo a produção
em larga escala de alguns representantes do gênero Cattleya que requerem condições de
cultivo específicas.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desenvolvimento de plântulas de
Cattleya tigrina em meio de cultura MS com metade da concentração de macronutientes
(MURASHIGE; SKOOG, 1962), e em dois meios complexos à base dos fertilizantes
Hyponex e Kristalon laranja, durante o período de 180 dias de cultivo in vitro.
2.
MATERIAL E MÉTODOS
Para a realização do presente trabalho, cinco flores de plantas de diferentes genótipos de
Cattleya tigrina foram autopolinizadas artificialmente em janeiro de 2008. Seis meses após
a autopolinização, foram coletados frutos maturos, os quais foram levados ao Laboratório
de Botânica e Análises Ambientais do Centro Universitário Hermínio Ometto – Uniararas,
para obtenção das sementes.
No laboratório, foram preparados três tipos de meios de cultura, sendo o
primeiro composto por meio MS com metade da concentração de macronutrientes
(MURASHIGE; SKOOG, 1962), o qual foi usado como controle. Adicionalmente, dois
meios de cultura à base de fertilizante Hyponex (NPK 6,5-9-19) ou Kristalon laranja (NPK
6-12-36) a 2 g.L-1, acrescidos de 1 g.L-1 de carvão ativado, 30 g.L-1 de sacarose com pH
ajustado para pH 5,8 antes da adição de 7 g.L-1 de agar-banana foram utilizados para o
60
experimento. Os meios à base de fertilizantes não foram suplementados com a solução de
micronutrientes do meio MS. Finalmente, quatro frascos por tratamento receberam 50 mL
de cada um dos meios de cultura e, em seguida, foram esterilizados em autoclave a 121ºC
e 1 atm de pressão durante 20 minutos (ARDITTI; ERNEST, 1992).
Para a desinfestação das sementes, optou-se pela utilização de hipoclorito de
sódio a 5%. Em seguida à desinfestação, as sementes foram submetidas à agitação na
solução durante cinco minutos, em tubos Eppendorf®. Posteriormente, os tubos foram
mergulhados em álcool 70% e levados à câmara de fluxo laminar, onde as sementes foram
lavadas quatro vezes em água destilada com o auxílio de seringa de 1 mL. Ainda
utilizando-se a seringa, as sementes foram depositadas, juntamente com 1 mL de água
destilada, nos frascos contendo os meios de cultura (ARDITTI; ERNEST, 1992).
Os frascos semeados foram fechados com tampa plástica transparente e mantidos
durante 180 dias em câmara climática (B.O.D. MA 403), à temperatura de 25 ± 2 °C, com
um fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de aproximadamente 40 µmol.m-2.s-1.
Foram semeados quatro frascos por tratamento sendo inoculadas, por recipiente, 1g de
sementes, com desenvolvimento de cerca de 50 plântulas por frasco (PEDROSO DE
MORAES et al., 2009).
Para
a
análise
estatística,
foram
utilizadas
vinte
plântulas
retiradas
aleatoriamente de cada um dos quatro recipientes, sendo cada um deles considerado uma
repetição (PEDROSO DE MORAES et al., 2009). Os dados referentes à altura das plântulas
(AP), comprimento da maior raiz (CMR) e comprimento da maior folha (CMF), foram
obtidos pelo uso de paquímetro digital (Digimess 100A). Para a obtenção da massa de
matéria fresca (MFR) e massa de matéria seca (MSR) de raízes foi utilizada balança
analítica (Gehaka BG 400). Para inferência da massa de matéria seca, as plântulas foram
submetidas à estufa com circulação de ar forçada a 60° C por 24 horas. Após resfriamento
espontâneo, em dessecador, obteve-se o peso da biomassa seca. O número de raízes (NR)
também foi contabilizado. Os dados obtidos foram submetidos a análises de variância
(ANOVA) pela utilização do aplicativo BioEstat 5.0, sendo a comparação das médias
realizada pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para a análise estatística, foram
utilizados os dados brutos.
3.
RESULTADOS
Os resultados demonstraram que as plântulas de Cattleya tigrina cultivadas em meio de
cultura à base de fertilizante Kristalon laranja apresentaram as maiores médias, que
61
diferiram significativamente das médias obtidas para plântulas cultivadas em meio à base
de Hyponex, para as seguintes variáveis: altura das plântulas (AP), número de raízes
(NR), massa fresca (MFR) e comprimento da maior raiz (CMR). Para massa de matéria
seca de raízes (MSR) e comprimento da maior folha (CMF), não houve diferença
significativa entre os meios de cultivo à base de Hyponex e Kristalon laranja. O meio de
cultivo MS com metade da concentração de macronutrientes apresentou as menores
médias para todas as variáveis analisadas, com exceção da variável massa da matéria
fresca (MFR), na qual o resultado da média não apontou diferença significativa quando
comparado ao meio Hyponex (Tab. 1).
Tabela 1 - Valores médios referentes à altura das plântulas (AP), número de raízes (NR), massa fresca
(MFR), massa seca (MSR), comprimento da maior raiz (CMR) e comprimento da maior folha (CMF) de
Cattleya. tigrina, após 180 dias cultivo, nos meios de cultura ½ MS, Hyponex e Kristalon laranja.
Variáveis Avaliadas
Meios de Cultura
NR
MFR (g)
MSR (g)
CMR (cm)
CMF (cm)
½ MS
1
2.05 c
1.39 c
0.34 b
0.07 b
1.61 b
0.95 b
Hyponex
2.53 b
1.63 b
0.38 b
0.14 a
1.94 a
1.21 a
Kristalon laranja
2.85 a
1.86 a
0.54 a
0.15 a
2.35 a
1.29 a
CV %
11.28
15.72
17.06
19.12
13.67
9.73
1
4.
AP (cm)
Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de significância.
DISCUSSÃO
O uso de fertilizantes comerciais tem se intensificado como forma de facilitação para o
preparo de meios de cultura e redução de custos de produção em várias espécies de
orquídeas (PEDROSO-DE-MORAES et al., 2009). Oliveira e Faria (2005) em estudo
comparativo entre os meios MS, Knudson C, Vacin e Went e meios à base de adubos NPK
(10-5-5) e NPK (10-30-20) na concentração de 3,0 g.L-1, obtiveram as melhores médias para
comprimento da maior raiz nas espécies Catasetum fimbriatum e Cyrtopodium paranaensis
quando utilizaram o meio à base do adubo NPK (10-5-5). O meio à base do fertilizante
NPK (10-30-20) apresentou a melhor média em número de raízes para Catasetum
fimbriatum neste mesmo estudo. Ainda, em relação à massa da matéria seca da raiz e
massa da matéria seca da parte aérea, os autores obtiveram que os dois meios à base de
fertilizantes se destacaram para a espécie Cyrtopodium paranaensis. Tais resultados são
corroborados com os encontrados para orquídeas terrestres, em que fertilizantes
utilizados e possuidores de concentrações semelhantes das fontes de nitrogênio, quando
da análise do sistema radicular, apresentaram resultados positivos, tanto para o número,
quanto para o comprimento de raízes (WEN; HEW, 1993; PAN; CHEN, 1994). No entanto,
meios de cultura apropriados devem ser estabelecidos para cada espécie, o que deve
62
resultar em maior qualidade de plantas produzidas in vitro (Oliveira; Faria, 2005),
sugestão que pode ser apoiada também através dos resultados obtidos no presente
estudo.
Os resultados encontrados no presente trabalho estão de acordo com os descritos
para Cattleya loddigesii Lindl. por Pedroso-de-Moraes et al. (2009), nos quais o meio de
cultura à base de fertilizante Kristalon laranja apresentou as maiores médias para as
variáveis: altura das plântulas, massa da matéria fresca e seca, comprimento da maior raiz
e maior folha, quando comparados aos meios MS com metade da concentração de
macronutrientes e Hyponex. Para Cattleya forbesii Lindl., Unemoto et al. (2007) utilizando
meio de cultura à base de fertilizante NPK (6-6-8) na concentração de 3 mL.L-1, obteve os
melhores resultados para as variáveis: comprimento da maior raiz, número de raízes e
massa da matéria fresca total quando comparado aos meios MS tradicional e MS com
metade da concentração de macronutrientes. Também, Da Silva (2003), trabalhando com
Cattleya tigrina, obteve melhores resultados na propagação in vitro para todas as variáveis
biométricas analisadas, utilizando fertilizante Dyna Gro® (7-9-5) como base para meio de
cultura acrescido de tomate e água de coco quando comparado ao meio MS. Dronk (2004),
utilizando meio de cultura à base de fertilizante Dyna Gro® (7-7-7) acrescido com banana e
água de coco, também obteve os melhores resultados na propagação de Cattleya
ametistoglossa Linden & Rchb.f. principalmente com relação às variáveis massa da matéria
fresca e massa da matéria seca. Dessa forma, os resultados obtidos nesses trabalhos
comprovam a eficácia de meios à base de fertilizantes para o desenvolvimento de
plântulas do gênero Cattleya, assim como o encontrado para este ensaio.
Ainda que Da Silva (2003) e Dronk (2004) tenham obtido bons resultados em seus
estudos, vale ressaltar que a utilização de polpas de frutas e de endosperma líquido
servem como complemento para meios de cultura, sejam eles à base de fertilizantes ou
não, principalmente em relação a fontes de sais potássicos, fosfatos e fitormônios.
Malavolta et al. (1997) sugerem que a absorção de um dado nutriente pode ser
influenciada por outro. Em relação ao potássio, pressupõe-se uma correlação entre esse
elemento e o fósforo, sendo que a deficiência no meio de cultura conduz à hiperidricidade
e ao decréscimo na taxa de absorção de fosfato (Pasqual, 2001).
O meio MS possui baixas concentrações de sais contendo sódio e cloro, porém,
estudos para propagação em massa de orquídeas demonstraram a necessidade de se
adicionar ao meio concentrações maiores desses sais. Possivelmente, as baixas
concentrações representam o principal fator responsável pelas menores médias
apresentadas por esse meio de cultura em relação aos meios à base dos fertilizantes
63
Kristalon laranja e Hyponex, que apresentam maiores concentrações destes elementos em
suas formulações (CHEN; CHANG; CHANG, 2000).
O fertilizante Kristalon laranja, de acordo com os resultados para este trabalho,
pode ser utilizado tanto comercialmente quanto em programas de semeadura para
recomposição de áreas degradadas, por apresentar maior facilidade e baixo custo de
produção em relação ao meio MS com metade da concentração de macronutrientes e ao
meio à base de fertilizante Hyponex.
5.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O meio de cultura à base de fertilizante Kristalon laranja demonstrou maior eficácia no
desenvolvimento in vitro de plântulas de Cattleya tigrina considerando as variáveis: altura
da planta, número de raízes, matéria fresca e comprimento da maior raiz. Em relação às
variáveis: massa seca e comprimento da maior raiz não houve diferença significativa entre
os meios à base de fertilizantes analisados.
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Cristiano Pedroso de Moraes
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