Biocatálise em solventes orgânicos

Biocatálise
Biocatálise em solventes orgânicos
Maria Raquel Aires-Barros
Centro de Engenharia Biológica e Química
Instituto Superior Técnico, Av. Rovisco Pais, 1049-001 Lisboa.
1. Introdução
bioprocesso não seja condicionado pelo biocatalisador.
Os termos biocatálise ou biotransformação abrangem os
processos em que um catalisador biológico é utilizado
para converter um substrato num número limitado de
etapas enzimáticas. Por forma a estabelecer um processo
de biotransformação eficaz, é necessária a análise detalhada
dos factores que condicionam o desenvolvimento e optimização integrados de um processo biotecnológico
A Bioconversão, inclui a selecção do meio reaccional, que
pode ser um meio convencional (meio aquoso) ou meios
não-convencionais, e o projecto do reactor. As características do biorreactor a utilizar devem compreender simplicidade de concepção, flexibilidade, segurança de operação
e possibilidade de monitorização e controlo de parâmetros
operacionais. A concepção do biorreactor requer um
conhecimento adequado da cinética reaccional, da hidrodinâmica do sistema e dos mecanismos de transferência de
massa. No caso de bioconversões em sistemas multifásicos
devem ser ainda tomados em conta os fenómenos interfaciais, a partição do substrato e do produto entre as duas
fases e a facilidade de separação das duas fases, com vista
a uma integração eficaz das etapas de bioconversão e de
recuperação do produto.
A estratégia de desenvolvimento e optimização de um
Bioprocesso depende de três contribuições: Biocatalisador,
Bioconversão e Isolamento e Purificação do Produto
(Figura 1).
Uma vez identificada a matéria prima mais adequada para
substrato da bioconversão pretendida, deve seleccionar-se
o biocatalisador que apresente níveis adequados de actividade catalítica, selectividade e estabilidade para operar nas
condições seleccionadas de temperatura, força iónica, pH
e natureza da solução tampão, concentração de substrato
e produto e ainda na eventual presença de solventes orgânicos. Três abordagens podem ser consideradas visando a
triagem e selecção de um biocatalisador para a conversão
pretendida: (i)biocatalisadores existentes; (ii) modificação
de biocatalisadores existentes recorrendo a técnicas de
engenharia genética; e (iii) rastreio para isolamento de
novos biocatalisadores (células inteiras de extremófilos ou
de enzimas derivados destes organismos).
O biocatalisador é produzido por fermentação, e neste
passo geralmente é requerido um hospedeiro robusto, com
um crescimento rápido, levando a densidades celulares
elevadas e níveis de expressão elevados, o que facilita a
recuperação do produto e minimiza o volume de fermentação. O crescente desenvolvimento da tecnologia de DNA
recombinado, possibilitando a expressão de enzimas em
diferentes hospedeiros, tem permitido a obtenção de biocatalisadores mais adequados. Enzimas isolados ou células
inteiras, quer na forma livre quer na forma imobilizada,
têm sido usados como biocatalisadores. O isolamento e
purificação do biocatalisador (enzimas), consiste em
geral numa etapa de concentração, seguida da purificação
propriamente dita, por processos cromatográficos.
A obtenção de novos biocatalisadores, baseados na
Engenharia do Biocatalisador permite modificar e melhorar as características do biocatalisador de forma a que o
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O Isolamento e Purificação do produto obtido da bioconversão, depende das características do produto que vão
influenciar a sua recuperação, e a qualidade, pureza e escala
pretendidas.
2. Principais razões para a utilização de
meios não-convencionais
Atendendo a que o conceito de biotransformação está
associado ao uso de biocatalisadores, nas quais a água é o
solvente preponderante, é fácil compreender que a mesma
função tenha sido desempenhada por este solvente em
inúmeros estudos de cinética enzimática. Observou-se,
no entanto, que o uso exclusivo de água como solvente de
meios de biotransformação restringia a gama de aplicações
da biocatálise, bem como limitava a produtividade de
diversos processos, nomeadamente os que envolviam
substratos hidrófobos. Por outro lado, a constatação de
que muitos enzimas operam in vivo em ambientes ricos em
lípidos hidrófobos, levou a conclusão de que estes meios
predominantemente não-aquosos são igualmente adequados à expressão de actividade biocatalítica. A convergência
destes dois aspectos conduziu à incorporação no meio
reaccional, de solventes orgânicos, fluidos supercríticos,
fases gasosas ou fases sólidas, aos quais se convencionou
atribuir a designação de meios não-convencionais.
As principais razões para a utilização de meios não-con-
Biocatálise
Figura 1- Bioprocesso para obtenção de bioprodutos.
vencionais são essencialmente o facto destes permitirem:
1) a solubilização de substratos e/ou produtos hidrófobos
, levando ao desenvolvimento de processos com produtividade volumétrica elevada.; 2) a redução de possíveis
efeitos inibitórios ou/e tóxicos por parte do substrato
e/ou produto, em que o solvente orgânico pode ser seleccionado de modo a funcionar como diluente, reduzindo a
concentração interfacial e na fase aquosa (por partição) de
substratos e/ou produtos; e 3) o deslocamento do equilíbrio
químico, nomeadamente no caso de enzimas hidrolases,
que em meio aquoso catalisam reacções de hidrólise, e o
equilíbrio pode ser deslocado no sentido do favorecimento
de reacçóes de síntese, através do controlo da actividade da
água. O equilíbrio da reacção pode ser também deslocado
no sentido do favorecimento da formação do produto,
mediante a remoção contínua deste para a fase orgânica.
3. Biocatálise em solventes orgânicos
As bioconversões em sistemas multifásicos em que uma das
fases é um solvente orgânico tem vantagens e desvantagens
associadas ao uso de uma fase orgânica. Uma vez que
após a etapa de bioconversão se seque a recuperaçãodo
produto, em termos de integração eficaz das duas etapas de
forma a optimização do bioprocesso global, é importante
considerar as potenciais vantagens e desvantagens destes
sistemas em termos de operação do reactor e recuperação
do produto (Tabela 1).
Relativamente à operação do reactor, há vantagens em usar
um solvente orgânico, pois este vai permitir a solubilização
de compostos hidrófobos (substratos e produtos), a redução
de efeitos inibitórios/tóxicos de substratos e/ou produtos,
e o deslocamento do equilíbrio da reacção através do
Os meios não convencionais para biocatálise podem ser controlo da actividade da água. As principais desvantagens
solventes orgânicos, fluídos supercríticos, sistemas em associadas ao uso de solventes orgânicos como meios de
que não são utilizados solventes orgânicos (fases sólidas, bioconversão, são o aumento das limitações difusionais à
transferência de massa de substratos e/ou produtos, uma
líquidas e gasosas), e recentemente fluídos iónicos.
vez que se introduz mais uma fase (orgânica) além da fase
aquosa (e de uma fase sólida se o biocatalisador estiver
imobilizado), e a toxicidade
do solvente orgânico para o
Tabela 1: Vantagens e limitações do uso de solventes orgânicos
biocatalisador.
Características do processo
Operação do reactor
Vantagens e desvantagens
(+) Solubilização de substratos/produtos hidrófobos
(+) Redução da inibição/toxicidade de substratos/produtos
(+) Deslocamento do equilíbrio químico
(-) Limitações à transferência de massa
(-) Toxicidade para o biocatalisador
Isolamento e purificação
(+) Recuperação de substratos/produtos
(+) Concentrações elevadas de produtos
(-) Formação de emulsões
Em termos de isolamento
e purificação do produto
da bioconversão , esta é
facilitada se o substrato e
o produto estiveram em
fases diferentes (nomeadamente se o produto
for hidrófobo), e por se
obterem
concentrações
mais elevadas de produto. A
principal desvantagem, são
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3
Biocatálise
a formação de emulsões estáveis, normalmente devido a
efeitos interfaciais. A presença de áreas interfaciais elevadas
pode levantar sérios problemas na etapa de recuperação do
produto do reactor, podendo tornar-se o factor limitante do
processo global.
Adicionalmente a estes factores temos também de considerar os custos adicionais para a segurança do processo,
no processamento dos efluentes do processo incluindo a
possível reutilização do solvente orgânico.
Tabela 2 : Critérios para a selecção do solvente
orgânico
Físico Químicos
- Capacidade para solubilização do substrato e do produto
- Coeficiente de partição
- Densidade
- Pontos de fusão e de ebulição
- Tensão superficial
- Viscosidade
Biológicos
- Toxicidade para o biocatalisador
3.1 Selecção do solvente orgânico
As bioconversões em sistemas multifásicos dependem
da escolha do solvente mais adequado para o sistema
biocatalítico.
Os principais critérios a considerar na selecção de um
solvente orgânico são apresentados na Tabela 2, e incluem
critérios físico-químicos, biológicos, de segurança, logísticos e económicos. Do ponto de vista físico-químico, os
aspectos mais importantes são a capacidade de extracção
(coeficiente de partição) e solubilização de substratos e/ou
produtos pelo solvente orgânico, e as suas propriedades
que vão determinar a facilidade de separação das fases
e a transferência de massa. O solvente orgânico deve
ser química e termicamente estável, não deve formar de
emulsões em meio aquoso, por forma a facilitar a separação
de fases, a sua viscosidade deve ser reduzida, de forma a
facilitar a transferência de massa, e não ser degradado pelo
biocatalisador. Do ponto de vista de segurança, o solvente
orgânico não deve apresentar toxicidade ambiental nem ser
prejudicial para a saúde, e não ser inflamável .Em termos
logísticos, a sua disponibilidade deverá ser elevada e a sua
reciclagem deve ser possível. Em termos económicos, o seu
custo deve ser baixo. O critério biológico, toxicidade do
solvente orgânico para o biocatalisador é, de todos estes, o
que se apresenta mais restritivo.
3.1.1 Toxicidade molecular e toxicidade
de fase
O efeito tóxico do solvente pode ser devido a dois processos:
um resultante da difusão de moléculas de solvente através
da membrana citoplásmática (toxicidade molecular); e
outro associado ao contacto directo entre o biocatalisador
e o solvente orgânico (toxicidade de fase).
A presença de solvente orgânico dissolvido na fase aquosa
(toxicidade molecular), pode provocar inibição enzimática,
desnaturação de proteínas e alteração do DNA, e modificação da fluidez da membrana citoplasmática. A toxicidade de fase, que origina, para além da desorganização da
membrana citoplasmática, a sua permeabilização do que
resulta a perda de metabolitos essenciais e de co-factores,
pode levar à extracção de nutrientes, agregação celular e
formação de emulsões.
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Segurança
- Toxicidade
- Inflamabilidade
Logísticos
- Facilidade de obtenção
- Eliminação de resíduos
Económicos
- Custo
A toxicidade molecular do solvente é usualmente avaliada
através do logaritmo do coeficiente de partição do solvente
num sistema padrão n-octanol/água (log Po/w), conhecido
como parâmetro de Hansch, o qual é um indicador do grau
de hidrofobicidade do solvente em causa. O valor de log Po/w
de um dado solvente pode ser determinado experimentalmente ou calculado através do método das constantes
hidrófobas fragmentadas de Rekker. Trabalhos realizados
com diferentes sistemas biocatalíticos, envolvendo, em cada
caso, o uso de solventes com diferentes hidrofobicidades,
confirmaram a existência de uma tendência generalizada
para a relação entre a actividade catalítica e a hidrofobicidade do solvente, traduzida por uma curva sigmoidal. Em
média, solventes com log Po/w inferior a 2-3 são considerados tóxicos, enquanto aqueles com log Po/w superiores a 4-5
são considerados biocompatíveis, muito embora os pontos
de inflexão sejam dependentes do biocatalisador, nomeadamente do microrganismo, considerado. O deslocamento do
ponto de inflexão também pode ser motivado pelo grau de
agitação do meio.
A acção tóxica de solventes orgânicos hidrófobos
é essencialmente devida à toxicidade de fase, dada a sua
baixa partição para o filme aquoso que rodeia o biocatalisador. Este factor minimiza a possibilidade de ser atingido
um valor de concentração crítica do solvente na membrana
celular, a partir da qual é observada a acção tóxica.
A toxicidade de fase pode ser reduzida, através da
utilização de nutrientes e inóculos mais concentrados,
para compensar a extracção de nutrientes, e diminuindo
a área interfacial, usando uma agitação mais suave e/ou
diminuindo a razão volumétrica de fases orgânica/aquosa,
de modo a reduzir os fenómenos de agregação e emulsão. A
imobilização do biocatalisador e a utilização de membranas
hidrófobas, que evitam o contacto do biocatalisador com a
interface líquido-líquido, e a engenharia do biocatalisador,
através do design de biocatalisadores mais resistentes e
Biocatálise
Figura 2 - Classificação de sistemas biocatalíticos englobando solventes orgânicos:
(a) sistemas de duas fases líquidas orgânico-aquosas: emulsão de meio aquoso
(disperso) em meio orgânico (contínuo);
(b) sistemas de duas fases líquidas orgânico-aquosas: emulsão de meio orgânico
(disperso) em meio aquoso (contínuo);
(c) e (d) biocatalisador imobilizado
num suporte poroso, em presença de
um sistema bifásico; (e) biocatalisador
microencapsulado numa micela invertida; (f) biocatalisador modificado com
polietileno glicol e dissolvido em meio
orgânico; (g) biocatalisador imobilizado
ressuspenso em meio orgânico; (h) biocatalisador liofilizado e na forma de cristais,
ressuspenso em meio orgânico.
apropriados a solventes orgânicos, são outras alternativas
possíveis para diminuição da toxicidade de fase.
3.2.2 Sistemas de duas fases líquidas
orgânico-aquosas
3.2 Classificação dos sistemas biocatalíticos
A estabilidade do biocatalisador num solvente orgânico
pode ser melhorada usando um solvente imiscível em água
(log P >4). Obtém-se um sistema bifásico com o enzima
e compostos hidrófilos na fase aquosa e os substratos e
produtos hidrófobos na fase orgânica (Figura 2, a,b,c,d).
Os sistemas biocatalíticos que utilizam solventes orgânicos
podem ser agrupados de acordo com a natureza da mistura: (1) mistura homogénea de meio aquoso e solventes
orgânicos miscíveis com água; (2) mistura de duas fases
líquidas orgânico-aquosas; (3) biocatalisadores dissolvidos
em solventes orgânicos: micelas invertidas e enzimas modificados covalentemente e (4) biocatalisadores ressuspensos
em solventes orgânicos com baixos teores de água: enzimas
em pó (obtidos por liofilização ou cristalização) ou biocatalisadores imobilizados, na ausência de fase aquosa (Figura
2,a, b, c, d ,e, f , h).
3.2.1 Mistura homogénea de meio
aquoso e solventes orgânicos miscíveis
com água
Uma forma simples de aumentar a solubilidade de um
substrato hidrófobo em meio aquoso, consiste na adição de
um solvente orgânico miscível com água (metanol, etanol,
dimetilformamida) ao meio de biotransformação. Dada
a sua homogeneidade, as resistências à transferência de
massa são geralmente negligenciáveis. Todavia a polaridade
elevada destes solventes, com valores de log Po/w inferiores
a 2, confere-lhes um carácter tóxico, acentuando-se este
efeito tóxico para concentrações elevadas de solvente.
Neste tipo de sistemas a fase orgânica pode constituir
ela própria o substrato da bioconversão ou servir de
reservatório a substratos e/ou produtos hidrófobos.
Podemos considerar sistemas em que a fase orgânica é
contínua e a fase aquosa dispersa na fase orgânica, sendo o
biocatalisador solúvel na fase aquosa;ou a fase contínua é a
fase aquosa e a fase orgânica está dispersa na fase aquosa,
com o biocatalisador solúvel na fase aquosa (Figura 2, a,b).
Podemos ter também, considerando as duas situações
anteriores, a presença de uma terceira fase sólida devido ao
biocatalisador imobilizado (Figura 2 c , d).
Nestes sistemas é necessário assegurar que a área interfacial
seja suficientemente elevada para facilitar a transferência
de massa de substratos/produtos através da interface
líquido-líquido e líquido-sólido (se o biocatalisador estiver
imobilizado), através do controlo adequado da velocidade
de agitação e da razão volumétrica das fases aquosa e orgânica. A partição de substrato(s) e produto(s) entre as duas
fases pode ser controlada mediante a selecção adequada
do solvente orgânico. A partição de produto(s) para a fase
orgânica permite deslocar o equilíbrio da reacção no sentido da formação do(s) mesmo(s). A acumulação preferencial de substrato(s) e produto(s) na fase orgânica minimiza
a sua potencial acção inibitória sobre o biocatalisador. A
razão volumétrica entre as duas fases pode ser escolhida
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com vista a optimizar a operação do reactor.
3.2.5 Classificação dos sistemas biocatalíticos: Perfis de concentração
3.2.3 Biocatalisadores dissolvidos em
solventes orgânicos
Para a selecção do sistema biocatalítico e do reactor mais
adequado para uma dada bioconversão é importante classificar os vários sistemas descritos de acordo com os perfis
de concentração do substrato e o volume relativo de fases
orgânico/aquosa.
Os sistemas de micelas invertidas constituem casos
particulares de microemulsões, em que a fase aquosa não
é macroscopicamente discernível da fase orgânica (fase
contínua) (Figura 2 e). Estes sistemas reaccionais consistem
em agregados formados por moléculas de agentes tensioactivos na presença de solventes apolares e de pequenas
quantidades de água. A natureza anfipática das moléculas
dos agentes tensioactivos, compostas por um grupo polar
(hidrófilo) e uma cauda apolar (hidrófoba), faz com que
elas se agrupem de modo a que as caudas hidrófobas se
encontram em contacto com o solvente apolar, enquanto
os grupos polares se direccionam para o interior do agregado, formando um núcleo interior aquoso. Deste modo
as micelas invertidas permitem a solubiização de enzimas
no núcleo interior aquoso e a partição de substratos
e/ou produtos entre o núcleo aquoso e o solvente orgânico,
dependendo da sua hidrofobicidade.
A área interfacial elevada das micelas invertidas, minimiza
as limitações à transferência de massa. No entanto a presença do tensioactivo pode provocar alguma inactivação
do enzima e causar problemas na estapa de recuperação
do produto.
Alternativamente, os enzimas podem ser solubilizados
em solventes orgânicos por modificação covalente com
polietileno glicol (Figura 2 f).
3.2.4 Biocatalisadores ressuspensos em
solventes orgânicos
A redução até valores praticamente vestigiários do teor de
água presente no meio de biotransformação pode revelarse útil em alguns sistemas biocatalíticos. A selecção do
solvente é um aspecto particularmente crítico neste tipo de
sistemas, na medida em que se estabelece uma competição
entre este e o enzima para as moléculas de água. A utilização de solventes hidrófilos pode levar à remoção da camada
de hidratação da molécula do enzima, resultando na sua
alteração estrutural e consequente perda de actividade
catalítica.
A utilização destes meios quase anidros em bioconversões
implica o uso de enzimas imobilizados num suporte sólido
(Figura 2 g) ou na forma de pó (liofilizados ou em cristais)
(Figura 2 h).
Nos critérios de selecção do suporte de imobilização, deve
ser tomada em conta a sua afinidade para a água, na medida
em que a água presente no meio se particionará entre a
matriz de imobilização, o enzima e o meio reaccional,
afectando o micro-ambiente deste.
 Boletim de Biotecnologia
Podemos considerar três tipos de perfis de concentração
teóricos para o substrato, considerando um substrato
hidrófobo, e que as fases líquidas (aquosa e orgânica) se
encontram bem misturadas, isto é não há limitações à
transferência de massa dentro das fases (Figura-3,a), b)
e c)).
A figura 3 a) representa o perfil de concentração do
substrato, para o sistema de duas fases líquidas orgânicoaquosas, com o biocatalisador dissolvido na fase aquosa,
em que a fase aquosa pode ser a fase contínua ou a fase
dispersa (sistemas da Figura 2 a, b). Evidencia-se a variação
da concentração de substrato na interface quer devido às
resistências à transferência de massa através da interface,
quer a efeitos de partição. Uma vez que o substrato é
hidrófobo, tem pouca afinidade para a fase aquosa e a sua
concentração na interface diminui, não só devido a efeitos
de transferência de massa, mas também devido a efeitos de
partição.
Quando o biocatalisador se encontra imobilizado, além das
duas fases líquidas aquosa/orgânica temos de considerar
uma terceira fase, uma fase sólida, que corresponde a um
enzima ou células imobilizadas. Na Figura 3 b), apresentase o perfil de concentração teórico para o substrato num
sistema de duas fases líquidas orgânico-aquosas, com o
biocatalisador insolúvel na fase aquosa, considerando o
biocatalisador imobilizado num suporte hidrófobo poroso
(sistemas representados na Figura 2 c, d).
Deste modo, além dos efeitos de transferência de massa e
efeitos de partição na interface líquido-líquido, temos também de considerar os efeitos de partição e de transferência
de massa relativamente ao biocatalisador imobilizado.
Neste caso, são importantes as características do suporte
(suporte hidrófilo ou hidrófobo) e o facto de o suporte ser
ou não poroso. O facto de o suporte ser hidrófobo, permitiu
aumentar a concentração de substrato junto ao enzima.
Se o volume de fase aquosa é reduzido relativamente ao
volume da fase orgânica do biocatalisador insolúvel, deixamos de ter uma fase aquosa discreta, entre a fase orgânica
e o biocatalisador. Esta situação corresponde ao terceiro
perfil (Figura 3 c)), e engloba os sistemas de biocatalisadores ressuspensos em solventes orgânicos (Figura 2 g, h).
Neste caso a transferência de massa entre a fase orgânica e
a fase aquosa não-discreta vai depender da área específica
das partículas de biocatalisador, e não da área interfacial
entre as fases líquidas.
Os sistemas de biocatalisadores solubilizados em solventes
orgânicos, micelas invertidas e modificação química com
Biocatálise
Figura 3 - Perfis de concentração teóricos do substrato para os vários sistemas biocatalíticos
PEG, são casos particulares dos sistemas
bifásicos, em que macroscopicamente se
vê uma única fase, correspondendo ao
primeiro perfil (Figura 3 a)).
3.2 Efeito da água na
actividade e estabilidade do
biocatalisador
Mesmo num meio não-convencional
constituído essencialmente por uma fase
orgânica, a quantidade de água no sistema
influencia fortemente a actividade catalítica
do enzima. Para baixos teores de água, a
actividade enzimática é geralmente baixa.
Normalmente, a actividade enzimática
aumenta com o aumento da camada de
hidratação do enzima, o que é devido à
acção lubrificante da água que aumenta a
flexibilidade interna do enzima A curva típica de variação
da actividade específica do enzima em função da actividade
da água, normalmente, apresenta um máximo. A diminuição
de actividade pode ser devida a limitações à transferência de
massa devido ao transporte do substrato através de uma fase
aquosa, ou agregação das partículas de catalisador.
A estabilidade enzimática, normalmente diminui com o
aumento da quantidade de água. A água participa numa
variedade de mecanismos que causam a desnaturação da
proteína conduzindo à inactivação dos enzimas.
Em micelas invertidas consegue-se uma estabilidade elevada
através do controlo da actividade da água. Para biocatalisadores resuspensos em solventes orgânicos, obtém-se em
geral estabilidades elevadas, uma vez que a quantidade de
água é muito pequena (valores de actividade de água >1)
e os enzimas adquirem uma maior rigidez conformacional
(num estado desidratado, sem água). Além disso não ocorre
proteólise, outra causa comum de desnaturação em água.
Figura 4 - Engenharia do Biocatalisador
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7
Biocatálise
Por fim, a água actua como um substrato nas reacções de
hidrólise e deste modo este tipo de reacções são favorecidas
com o aumento da quantidade de água, e inversamente o
rendimento das reacções de síntese é menor.
3.3
Engenharia do Biocatalisador
O desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinado
criou vias para a obtenção de novos biocatalisadores,
baseados na engenharia de proteínas, e que podem ser
utilizados em solventes orgânicos. Esta metodologia consiste
na modificação de proteínas existentes ou na síntese de novo
de proteínas, apresentando um conjunto de propriedades
pré-definidas. O design racional de proteínas, levado a cabo
por mutagénese dirigida, requer a identificação da relação
estrutura-função na molécula. O número reduzido de
enzimas cuja estrutura tridimensional está perfeitamente
resolvida limita consideravelmente a aplicação desta metodologia. Actualmente, as metodologias mais utilizadas, para
a pesquisa de novos biocatalisadores, são a evolução dirigida
por mutagénese aleatória e/ou a recombinação de um ou
mais genes homólogos (DNA shuffling)
O desenvolvimento do biocatalisador “ideal” para uma
dada bioconversão (identificada a característica que se quer
modificar) resulta de uma aproximação multidisciplinar e
integrada de conhecimentos e tecnologias desenvolvidas nas
áreas da biologia, química e engenharia (Figura 4). As disciplinas envolvidas incluem a Bioinformática (que compila
toda a informação relativamente aos dados proteína-função
e genoma-proteína), a Química de Proteínas que através
de várias técnicas nos dá informações acerca das relações
estrutura-função e estrutura –actividade de proteínas; a
Engenharia Metabólica que iclui a análise dos fluxos metabólicos; a Engenharia de Proteínas através diversas técnicas
de recombinação genética (nomeadamente, error-prone PCR
e DNA suffling) combinadas com a metodologia da evolução
dirigida, permitem a criação de bibliotecas de mutantes e,
após a aplicação de métodos de selecção e triagem, isolar
o melhor mutante (com a característica melhorada necessária); a Engenharia de Processos, que permite optimização
e integração das operações de fermentação e recuperação do
biocatalisador.
Deste modo, e com todas estas ferramentas os cientistas
são hoje em dia capazes de fazer o design do biocatalisador
“ideal”.
Alguns exemplos de várias tecnologias que são usadas para
melhorar uma ou mais características do biocatalisador,
além das técnicas de recombinação genética e evolução
dirigida são apresentados na Tabela.3.
3.4. Reactores multifásicos
A selecção do reactor mais apropriado para um dado bioprocesso, depende das características da bioconversão e de
constrangimentos reaccionais, cinéticos e do biocatalisador,
que vão determinar o modo de operação e as características
do fluxo (Figura.5).
As características da bioconversão incluem, as propriedades
dos substratos/produtos (pontos de fusão e ebulição,
solubilidade em água, estabilidade ao pH e temperatura); as
características reaccionais (nomeadamente, pH, temperatura, controlo da actividade da água) e ; as características do
biocatalisador, que incluem a utilização de enzimas (desin-
Tabela 3: Tecnologias disponíveis para melhorar as características do biocatalisador
Objectivo
Tecnologia
Exemplo
Solubilização do enzima
Solubilização de subtilisina em micelas invertidasde AOT
Modificação química
Modificação da catalase com um tensioactivo (Brij 35)
Aplicação de hidrolases e lipases recobertas com lípidos em meio
orgânico
Aumento da actividade
Alteração da enantioselectividade
Alteração da funcionalidade
Melhoramento da enantioselectividade de lipases
Evolução dirigida
Recombinação de genes obtendo-se um enzima recombinante
capaz de degradar benzeno e tolueno
Conversão de substratos não naturais
Aumento da estabilidade
Alteração da actividade de isomerases, hidrolases e ß-galactosidase
Evolução dirigida
Esterase termoestável sem perda de actividade, subtlisina E
Ligação multicovalente/imobilização
Hiperestabilização de uma esterase termófila
Modificação química
(Formação CLEC)
Reticulação e modificação química de subtilisina cristalizada
Evolução dirigida
Aumento da actividade da subtilisina em meio aquoso/orgânico
(40% DMF)
Enzima liofilizada na presença de NaCl
O sal induz a activação do enzima em hexano anidro
Modificação do meio reaccional
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Biocatálise
Figura 5 - Selecção de reactores multifásicos
tegração celular) ou células (necessidade de cofactores),
livres ou imobilizadas, a localização da actividade enzimática
(normalmente na fase aquosa, excepto para as lipases que são
activadas por interfaces), e por fim os requisitos em água por
parte do biocatalisador para manutenção da sua actividade
catalítica É também importante considerar as interacções
entre o biocatalisador e os substratos e produtos
Os constrangimentos a considerar na selecção e operação
do reactor são constrangimentos reaccionais, cinéticos e do
biocatalisador.
Os constrangimentos reaccionais, incluem o tipo de
sistema biocatalítico; a razão de fases aquosa-orgânica
que condiciona a produtividade volumétrica no reactor e
a área interfacial disponível para a transferência de massa
de substratos/produtos; a transferência de massa através da
interfase líquido-líquido, sólido-líquido, gás-líquido, e dentro da mesma fase; e efeitos de partição substratos/produtos.
Os constrangimentos cinéticos comprendem a inibição pelo
substratos e/ou produtos.
Os constrangimentos do biocatalisador, incluem a concentração máxima de biocatalisador permitida no reactor, a
desnaturação por agitação mecânica (no caso de reactores
mecanicamente agitados) e a baixa estabilidade do biocatalisador, devido a efeitos de temperatura, pH, presença de
compostos tóxicos, necessidades de co-factores, nutrientes,
co-substratos, e a toxicidade do solvente orgânico.
Os requisitos essenciais para selecção do reactor mais apropriado para uma dada bioconversão são, uma área interfacial
elevada, de modo a permitir uma transferência adequada de
substratos/produtos através da interface e um controlo eficaz
da área interfacial.
Dentro dos reactores usados em sistemas multifásicos destacam-se, os reactores agitados mecanicamente (descontínuos
ou contínuos), os reactores de membranas, os reactores de
leito fixo e os reactores agitados por uma fase líquida.
3.4.1 Reactor descontínuo perfeitamente
agitado
Este tipo de reactores são geralmente usados em, processos
em que intervêm biocatalisadores solúveis (Figura 6).
Os reactores agitados mecanicamente permitem um
controlo adequado da área interfacial através da velocidade
de agitação (e da razão volumétrica das fases), de forma a
obterem-se velocidades de transferência de massa elevadas.
No entanto, áreas interfaciais elevadas podem levar à formação de emulsões estáveis, dificultando o passo seguinte de
separação do produto. A maior parte dos exemplos referidos
na literatura são com este tipo de reactores.
3.4.2 Reactor contínuo perfeitamente
agitado
Este tipo de reactores são geralmente usados em processos
em que intervêm biocatalisadores imobilizados, de modo
Boletim de Biotecnologia
9
Biocatálise
a reter o biocatalisador no interior do reactor
(Figura 7).
A imobilização do biocatalisador pode reduzir
a formação de emulsões estáveis, facilitando a
separação posterior das fases. A presença de uma
terceira fase sólida (biocatalisador imobilizado
num suporte, geralmente um suporte poroso)
implica que além da transferência de massa
através das fases e da interface aquosa/orgânica,
temos de considerar a difusão do substrato no
interior do suporte. A agitação mecânica pode
também, provocar destruição das partículas de
suporte.
Figura 6 - Reactor descontínuo perfeitamente agitado (BSTR).
Estes reactores são pouco usados para bioconversões em sistemas multifásicos devido à sua
baixa eficiência.
3.4.3 Reactores de membrana (CSTR com
recirculação)
Este tipo de configuração em que é acoplada uma membrana
de ultrafiltração ao reactor contínuo com agitação (CSTR)
permite a utilização de sistemas em que microscopicamente
temos duas fases líquidas, nas quais o biocatalisador pode
estar solúvel (micelas invertidas) ou insolúvel (células,
enzima liofilizado ou em cristais) (Figura 8). A membrana
permite a retenção do biocatalisador dentro do reactor, uma
vez que não é permeável ao biocatalisador, podendo também
apresentar alguma selectividade relativamente aos substratos
e produtos, permitindo por exemplo a recuperação selectiva
do produto no permeado.
3.4.4 Reactores de leito fixo
Os reactores de leito fixo são mais adequados para sistemas
correspondentes ao último perfil de concentração (Figura 3
c)), que corresponde aos sistemas de biocatalisadores ressuspensos em solventes orgânicos (Figura 9). São cineticamente
mais favoráveis que os reactores contínuos com agitação, e
não têm a desvantagem das elevadas tensões de corte devido
à agitação mecânica. No entanto, a sua aplicação é limitada
pelo tipo de substrato (viscoso, coloidal, partículas sólidas
em suspensão) e a forma do biocatalisador imobilizado. É
usado para reacções de síntese de ésteres, mono, di e triglicéridos por lipases de Rhizomucor miehei, e resolução óptica
de fenilalanina por α-quimotripsina.
3.4.5 Reactores agitados por uma fase
líquida
Este tipo de reactores tem como base os princípios do reactor agitado por uma fase gasosa (air-lift), em que em vez
de uma fase gasosa, é uma fase líquida dispersa que induz
a circulação de uma fase líquida contínua (Figura 10).
Quando a fase do solvente é menos densa que a água, esta
é adicionada através dum difusor na parte de baixo do
reactor. Este tipo de reactor é mais adequado para sistemas
constituídos por duas fases líquidas macroscopicamente
distintas, nas quais o biocatalisador pode estar dissolvido
na fase aquosa ou imobilizado.
Neste tipo de reactores combinam-se a mistura das fases
através do controlo das condições do fluxo e baixas tensões
de corte (decorrentes da agitação mecânica), com as solubilidades elevadas para substratos/produtos hidrófobos,
obtendo-se velocidades de reacção elevadas e sendo facilitados a recuperação do produto por extracção. A diferença
de densidades entre as duas fases líquidas
é pequena, o que dificulta a concepção da
zona de decantação no topo do reactor. Este
problema é agravado na presença de agentes
emulsificantes (presentes na solução inicial
ou segregados pelas células). Usado a nível
laboratorial para a produção de L-triptofano.
3.4.6 Reactores de membrana
Figura 7 - Reactor contínuo perfeitamente agitado (CSTR)
 Boletim de Biotecnologia
Este tipo de reactores permite numa única
operação em contínuo, a integração da
bioconversão com a separação/concentração
do produto e recuperação do biocatalisador
Biocatálise
Figura 8 - Reactor de
membrana (CSTR com
recirculação)
(Figura 11). A membrana vai funcionar
como interface entre
as duas fases líquidas
imiscíveis (evitando o
seu contacto) e como
suporte para a imobilização do biocatalisador (aumento da área
interfacial de contacto
enzima/substrato).
Neste tipo de reactores
as fases aquosa e orgânica são mantidas separadas pela
membrana, o que evita o problema de formação de
emulsões, e inactivação do enzima devido ao contacto
com o solvente. As principais desvantagens destes
reactores são: a nível do biocatalisador de diminuição
da actividade catalítica por perdas do enzima da membrana, e diminuição da eficiência de transferência de
massa devido à diminuição de fluxo de permeado. Os
dois fenómenos responsáveis por esta diminuição, são
a concentração de polarização e o fouling da membrana, que levam aos baixos coeficientes de transferência
de massa e ao entupimento da membrana.
Este tipo de reacrores é usado para a biotransformação
de lípidos (gorduras, óleos, triglicéridos, ácidos gordos
e ésteres). A maior parte dos exemplos incluem a
hidrólise de lípidos e gorduras para a produção de ácidos gordos, mono e di-glicéridos e glicerol, ou a síntese
de ésteres incluindo reacções de tranesterificação.
Figura 9 - Reactor de leito fixo (PFR)
3.5 Exemplos de
processos industriais
As aplicações de sistemas
biocatalíticos na presença de
solventes orgânicos abrangem
uma vasta gama de processos,
nomeadamente a síntese de
péptidos utilizando quimotripsina, termolisina ou pepsina;
reacções de esterificação, interesterificação, trans-esterificação
utilizando lipases; síntese de
compostos
enantioméricos
puros utilizando lipases ou
leveduras, desidrogenação de
esteróides utilizando desidrogenases ou células inteiras de
Arthrobacter simplex.
Na Tabela 4 apresentam-se
Figura 10 - Reactor agitado por uma fase líquida.
Boletim de Biotecnologia
11
Biocatálise
alguns exemplos de processos industriais.
3.6 Perspectivas futuras
As aplicasções de meios não-convencionais constituuídos
por solventes orgânicos, são adequadas para bioconversões
envolvendo:
- substratos/produtos pouco solúveis em água, que são
inibitórios ou tóxicos para o biocatalisador
- Quando existem diferenças de solubilidade entre os
substratos e/ou produtos
- Substratos e/ou produtos que são sólidos e inibitórios
ou tóxicos, e por isso difíceis de alimentar de uma
forma adequada ao reactor
- Deslocamento do equilíbrio químico no sentido de
favorecer reacções de síntese através do controlo da
actividade da água
A principal limitação das bioconversões em sistemas multifásicos, em que uma das fases é um solvente orgânico, é a
toxicidade do solvente orgânico, devido ao solvente orgânico
dissolvido na fase aquosa e à presença da interface líquidolíquido.
Os desenvolvimentos mais recentes em termos das bioconversões em sistemas multifásicos, envolvem o design de biocatalisadores mais adequados a solventes orgânicos, o design
de novos solventes, e a selecção do bioreactor multifásico e
do processo de recuperação do produto mais adequados de
modo a uma integração das duas etapas do bioprocesso.
Através da engenharia do biocatalisador, usando de técnicas
de engenharia genética, é possível o desenvolvimento de
células mais tolerantes a solventes orgânico e a redução de
excrecção ou lise de material e/ou permeabilização celular.
A metodologia da evolução dirigida permite a obtenção de
enzimas mais tolerantes a solventes orgânicos, e de enzimas
com actividades elevadas para substratos não-naturais.
A selecção de novos solventes, nomeadamente líquidos
iónicos (hexafluorofosfato de 1-butil-3-metil imidazole),
pode ser uma alternativa aos solventes orgânicos, devido a
constrangimentos ambientais.
Figura 11 - Reactor de membrana.
Em termos de reactores multifásicos, é importante o
desenvolvimento de reactores mais adequados, nomeadamente reactores agitados por uma fase líquida e reactores de
membrana, que permitem simultaneamente a solubilização
de substratos e produtos hidrófobos, obtendo-se velocidades
de reacção elevadas e a separação do produto, integrando a
etapa de bioconversão com a etapa de isolamento e recuperação do produto.
3.7 Bibliografia
Cabral, J.M.S., Mota, M. e Tramper, J., Multiphase Bioreactor
Design, Taylor and Francis Books, London, 2001.
Fernandes, P., Aires-Barros, M.R. e Cabral, J.M.S., “Biocatálise
Aplicada” em Biotecnologia: Fundamentos e Aplicações
(N-Lima e M.Mota, eds.), LIDEL-Edições Técnicas LDA, Cap.
10, 2001 (em impressão).
Petrounia, I.P., Arnold, F.H., Designed Evolution of Enzymatic
Properties, Curr. Op. Biotechnol., 11, 325-330.
Schmid, A, Dordick, J.S. et al., Industrial Biocatalysis Today
and Tomorrow, Nature 409, 258-268 (2000).
Straathof, A.J.J. e Adlercreutz, P., Applied Biocatalysis,
Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 2000.
Tabela 4: Exemplos de processos industriais
Reacção
Biocatalisador
Solvente
Companhia
Epoxidação 1-octeno
Noccardia corallina
n-hexadecano
Nippon Mining
Hidrólise de ésteres
Subtilisina (imobilizada)
Lipase
Vários
Bayer Sumitomo, Chemie Linz AG; BASF; Schering Plough
Desidrogenação de esteróides
Arthrobacter simplex
Tolueno
Upjonh
Dessulfurização
Rhodococcus sp.
Óleo (substrato)
Energy Biosystems
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