INVESTIGAÇÃO DE Brucella abortus NO SÊMEN E ANTICORPOS

XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP
INVESTIGAÇÃO
ANTICORPOS
DE
ANTI-
Brucella
Brucella
abortus
spp.
NO
NO
SÊMEN
SORO
E
DE
GARANHÕES
INVESTIGATION OF Brucella abortus IN SEMEN AND
ANTIBODIES ANTI- Brucella spp. IN SERUM OF STALLIONS
Kamila Pinheiro Paim1(1)
Mayara Mafra Soares(2)
Paula Caroline Pereira(3)
Danilo Guedes Junqueira Júnior(4)
Mariana Assunção de Sousa(5)
Rafael Quirino Moreira(6)
Anna Monteiro Correia Lima(7)
Resumo
Este estudo teve por objetivo investigar a presença da Brucella abortus no sêmen de oito
garanhões criados em haras do Município de Uberlândia MG, e de anticorpos anti- Brucella
spp. no soro sanguíneo dos mesmos animais. Foram empregadas as técnicas de Antígeno
Acidificado Tamponado (AAT) no soro sanguíneo, e a Reação em Cadeia pela Polimerase
(PCR) no sêmen. Das oito amostras testadas pela técnica de AAT nenhum animal foi
reagente, e das oito amostras submetidas à PCR, em nenhuma amplificou-se os fragmentos de
DNA de Brucella abortus. Pode-se concluir que os resultados encontrados reforçam a
hipótese que a coabitação com bovinos seja o principal fator de risco para a ocorrência da
brucelose em equinos, e infere-se a possibilidade da Brucella abortus não ter predileção pelo
sistema reprodutivo de garanhões.
Palavras-chave: Brucelose. Equino. PCR. AAT.
Abstract
The aim of this research was to investigate the presence of Brucella abortus in the semen of
stallions from stables municipality of Uberlândia, and antibodies to Brucella spp. blood serum
of the same animals. It was apllied the Techniques Buffered Acidified antigen (TAA) in blood
serum, and the Polymerase Chain Reaction (PCR) were used in semen. Of the eight samples
tested by AAT no animal was positive, and eight samples submitted to PCR, none were found
Brucella abortus DNA fragments. It can be concluded that the results support the hypothesis
that the cohabitation with cattle is the main risk factor for the occurrence of brucellosis in
1 1,2
Graduandas em Medicina Veterinária pela FAMEV/UFU. 3 Médica Veterinária autônoma formada pela FAMEV/UFU. 4,5,6Doutorandos
em Ciências Veterinárias em Ciências Veterinárias FAMEV/UFU. 7 Doutora em Engenharia Agrícola pela Universidade Estadual de
Campinas, Professor Associado I na Universidade Federal de Uberlândia. E-mail de contato: [email protected]
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, 2014. Número especial.
XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP horses, and infers the possibility of Brucella abortus have no predilection for stallion’s
reproductive system.
Keywords: Brucelosis. Equine. PCR. AAT.
1 Introdução
Uma das espécies mais importantes na agropecuária brasileira são os equinos, animais
são utilizados como meio de transporte, tração, lazer, esporte, equoterapia e até na
alimentação humana (RIBEIRO et al., 2008). Essa espécie pode sofrer infecção pela Brucella
abortus, bactéria causadora de doença com caráter zoonótico e distribuição cosmopolita.
Existem poucas pesquisas com brucelose equina no Brasil, os dados epidemiológicos
disponíveis são escassos, tornando limitado o conhecimento do papel do equino na
epidemiologia da doença (ACHA e SZYFRES, 2003, ARAUJO et al., 2009).
A inseminação artificial em equinos vem crescendo, pois com ela foi possível uma
maior distribuição da genética de animais de alta qualidade, além de ser uma técnica de baixo
custo. E buscando-se índices de fertilidade próximos à da monta natural, tem-se utilizado com
frequência sêmen fresco ou resfriado (CARDOSO, 2010), o que aumenta o risco de
transmissão de patógenos que tem o sêmen como via de eliminação.
Este trabalho teve por objetivo identificar a soroprevalência de brucelose em
garanhões criados em haras do Município de Uberlândia, e investigação da presença da
Brucella abortus no sêmen desses animais pela técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR).
2 Material e Métodos
Colheu-se amostras de sêmen e soro sanguíneo de oito garanhões de haras do
Município de Uberlândia, MG. As amostras de sangue foram coletadas por meio da
venopunção da veia jugular em tubos sem anticoagulante, posteriormente centrifugados a 500
G para separação do soro, os quais foram armazenados a -20° C. O sêmen foi coletado com
vagina artificial do tipo Missouri utilizando-se uma égua no cio para estimulação do
garanhão. Após a coleta, 2 ml do sêmen de cada animal foi armazenado a -80° C.
Como não existe um exame padrão a ser aplicado para diagnóstico de brucelose na
espécie equina, optou-se por adotar o teste de triagem preconizado pelo Ministério da
Agricultura brasileiro no Programa Nacional de Combate e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose, o exame do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) (BRASIL, 2006;
ARAÚJO et al., 2009).
XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP Nas amostras de sêmen foram aplicadas técnicas de Extração de DNA conforme
relatado por Biase et al. (2002), seguido da amplificação do DNA de Brucella abortus, e
finalmente a análise do produto amplificado. Buscando identificar o DNA desta bactéria,
procurou-se amplificar um fragmento de 223 pb, a partir do par de primers B4 (5’TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’) e B5 (5ʼ-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG -3’)
(BAILY et al., 1992).
Para amplificação dos fragmentos foi utilizado o seguinte protocolo de PCR para cada
amostra: Tampão 10x (20 mM Tris-HCl em pH 8.0, 40 Mm NaCl, 2 mM Fosfato de Sódio,
0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glicerol (v/v)] 2µL; Taq DNA polimerase 5U/µL 0,2µL
(Invitrogen®); 5,0 pmol de cada primer (Invitrogen®) 1µL; dNTPs 10mM 0,4 µL [dCTP,
dATP, dGTP, dTTP] (Anresco®); Água pura estéril 9,6 µL, 6 µL de DNA genômico estoque,
20 µL para cada reação.
O processo de amplificação foi conduzido em um termociclador SelectCycler (Select
BioProducts) programado para realizar uma desnaturação inicial a 94° C por 5 minutos e, ao
final, uma extensão a 72ºC por 10 minutos. Foram empregados 40 ciclos, divididos em três
fases: desnaturação a 94° C por 60 segundos, hibridização a 60° C por 60 segundos e extensão
a 72°C por 60 segundos. Como controle positivo da Brucella abortus foi utilizado o DNA
desta bactéria extraído da vacina B19.
A análise do produto amplificado foi feita por meio do gel de agarose com a técnica de
eletroforese em cuba horizontal com tampão de corrida adicionando o corante SYBR® Safe.
O gel foi analisado sob luz UV em fotodocumentor Alpha Digi Doc (Alpha Innotech)
(SAMBROOK e FRITSCH, 1989).
3 Resultados e Discussão
Nenhuma das amostras de soro dos oito animais foi reagente ao AAT, e em nenhuma
amostra de sêmen testadas na PCR detectou-se Brucella abortus (figura 1). O mecanismo de
transmissão da brucelose equina ainda não está bem esclarecido, por isso considera-se que a
infecção seja resultante da coabitação dos equinos com outras espécies domésticas,
principalmente bovinos, bubalinos e suínos (ACHA e SZYFRES, 2003). Hipótese essa
reforçada pelos estudos de Aguiar et al. (2008) em Rondônia, e Araujo et al. (2009) na Zona
da Mata Mineira, os quais encontraram, respectivamente, 7 e 39 equinos que coabitavam com
bovinos positivos na prova de AAT.
XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP Carraza et al. (2009) analisando 120 amostras de equinos de tração na área urbana de
Uberlândia, portanto de animais com pouca probabilidade de convívio com bovinos, não
encontrou nenhum animail sororreagente. Entretanto, na microrregião do Brejo Paraibano
foram coletadas 257 amostras e nenhum animal foi reagente a prova do AAT. Destes 84,4%
dos animais eram criados consorciamente com bovinos (OLIVEIRA FILHO, 2013).
Figura 1 – Gel de agarose para análise do produto amplificado, Uberlândia, 2014.
*Na sequência foram colocados marcador (M), controle positivo extraido de vacina B19 (+); controle
positivo de cepa de campo (+C); controle negativo (-); água miliq controle negativo (-A); e amostras
1,2,3,4,5,6,7,8.
Furquim et al. (2012) coletaram 107 amostras de soro sanguíneo em um frigorífico do
Município de Araguari e cinco animais foram reativos no teste confirmatório do 2mercaptoetanol. Junqueira Júnior (2012) analisou 6.439 amostras de equídeos de serviço de
todas as mesorregiões do estado de Minas Gerais e encontrou uma prevalência de animais de
2,39% no estado, e para a região do Triângulo Mineiro e Alto Paranaiba 1,17%.
Pode-se verificar que os dados da literatura não são conclusivos sobre os mecanismos
de transmissão da brucelose em equinos. Todavia espera-se uma prevalência maior em
equinos que convivam com bovinos, visto que estudos soroepidemiológicos também
constataram a maior prevalência de brucelose em equinos criados juntamente com bovinos.
Os animais utilizados para a coleta de amostras nesta pesquisa eram criados em haras, ou seja,
não tinham contato com nenhuma das espécies que se considera transmissoras da brucelose, o
que pode justificar a não reação de nenhum dos soros ao AAT, e a não amplificação de
fragmentos de DNA de Brucella abortus em nehuma das amostras de sêmen.
4 Conclusão
Nenhum animal apresentou reação positiva em qualquer uma das técnicas utilizadas.
Os resultados encontrados reforçam a hipótese que a coabitação com bovinos seja o principal
fator de risco para a ocorrência da brucelose em equinos, haja vista que os animais estudados
XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP não o tinham. Pode-se ainda inferir que a bactéria não tenha predileção pelo sistema
reprodutivo de garanhões.
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