Circulating Cancer Cells and Their Clinical

Clinical Chemistry
Q&A
Circulating Cancer Cells and Their Clinical Applications
Moderator: Eleftherios P. Diamandis1,2,3*
Experts: Klaus Pantel,4 Howard I. Scher,5,6 Leon Terstappen,7 and Evi Lianidou8
Células Cancerígenas Circulantes e Suas Aplicações Clínicas
Eleftherios P. Diamandis, Moderators1,2,3,*
Klaus Pantel, Experts , Howard I. Scher, Experts5,6, Leon Terstappen, Experts7 and Evi Lianidou, Experts8
4
1
Department of Laboratory Medicine and Pathobiology,
Department of Pathology and Laboratory Medicine, Mount Sinai Hospital, and
3
Department of Clinical Biochemistry, University Health Network, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada;
4
Institute of Tumour Biology, Centre of Experimental Medicine, University Medical Centre Hamburg Eppendorf, Hamburg,
Germany;
5
Genitourinary Oncology Service and
6
Department of Urologic Oncology, Sidney Kimmel Center for Prostate and Urologic Cancers, Memorial Sloan-Kettering Cancer
Center, New York, NY;
7
Faculty of Science and Technology, MIRA Research Institute, Department of Medical Cell BioPhysics, University of Twente,
Enschede, the Netherlands;
8
Department of Chemistry, University of Athens, Athens, Greece.
2
*Envie correspondência para esse autor para: University of Toronto, Canada Mount Sinai Hospital, 60 Murray St., 6th Floor,
Toronto, Ontario, M5G 1X5 Canada. Fax 416-586-8628; e-mail [email protected].
Câncer residual mínimo é definido como “a presença de células tumorais que não são detectáveis pelos atuais procedimentos diagnósticos de
rotina usados para classificação do tumor em
pacientes com câncer após remoção cirúrgica
do tumor primário.” Dados dos grupos Norte
Americano e Europeu demonstraram o impacto
no prognóstico de pacientes com câncer de seio
das células tumorais disseminadas (DTCs)9 na
medula óssea. Detecção das células tumorais
circulantes (CTC) e enumeração no sangue periférico foram examinadas em estudos prospectivos de multicentros de cânceres metastáticos
de próstata, colorretal e de seio e foram associadas com reduzida sobrevivência geral e livre de
progressão. Um número crescente de estudos
de pesquisa clínica está validando essas observações e as estendendo para outros cânceres e
para estágios mais iniciais da doença. CTCs são
altamente heterogêneas, e sua caracterização
molecular é importante, não apenas para confirmar sua origem maligna como também para
seguir mudanças imune-fenotípicas com a progressão do tumor e identificar diagnosticamente e terapeuticamente alvos relevantes que
ajudarão a estratificar pacientes com câncer
para terapias individualizadas. A raridade das
CTCs — e desse modo a quantidade muito limitada de amostra disponível — apresenta um
formidável desafio analítico e técnico. Recentes
avanços técnicos na detecção e caracterização
da CTC incluem métodos PCR (RT-qPCR) quantitativos e de transcrição reversa, abordagens
baseadas na imagem, e dispositivos de micro
filtro e de microchip. CTCs representam um novo e promissor campo diagnóstico para pacientes em estágios avançados no qual as plataformas sensíveis de detecção da CTC permitem o
monitoramento da doença e a eficácia do tratamento. O desenvolvimento de tecnologias de
células únicas pode permitir a realização do perfil dessas células com o propósito de adaptar os
regimes de tratamento. Técnicas de detecção e
caracterização da CTC têm grande promessa de
desempenhar um papel como uma “biópsia líquida” que permitirá que os médicos sigam as
mudanças do câncer durante o tempo e moldem o tratamento. Pesquisa atual sobre as
CTCs está focando a identificação de novos biomarcadores diagnósticos e terapêuticos produzidos por essas células. CTCs são promissoras
como novos biomarcadores de tumores porque
elas são alvos bem definidos para se entender a
biologia tumoral e a disseminação das células
Clinical Chemistry
tumorais que podem abrir novas avenidas para
a detecção precoce da metástase e seu bemsucedido tratamento. Nós discutimos as CTCs e
seu potencial diagnóstico com 4 cientistas e
clínicos líderes nesse campo. Uma lista de leitura sugerida sobre esse tópico é fornecida no
Suplemento de Dados que acompanha a versão
online
dessa
Q&A
em
http://www.clinchem.org/content/vol57/issue1
1.
Quais são os atuais métodos analíticos para
detectar CTCs? Quão confiáveis são esses métodos? Importa qual método é usado clinicamente?
Klaus Pantel: Métodos analíticos atuais para detectar
CTCs sempre incluem um
passo de enriquecimento e
um passo de detecção. Enriquecimento das CTCs pode
ser baseado no tamanho
(dispositivos de filtração),
densidade (por exemplo, centrifugação Ficoll),
capacidade de invadir uma matriz de colágeno,
e imuno seleção positiva [por exemplo, enriquecimento baseado nos anticorpos das moléculas de adesão das células epiteliais (EpCAM)
das CTCs] ou imuno seleção negativa (isto é,
depleção dos leucócitos por anticorpos CD45 ).
As subsequentes abordagens usadas para detectar CTCs são (i) imunocitoquímica com anticorpos anticitoqueratina (anti-CK); (ii) RT-PCR
tendo como alvo vários mRNAs epiteliais, incluindo CK-19 mRNA; e (iii) testes de immunospot
epiteliais (EPISPOT) que detectam proteínas
específicas dos tumores liberadas pelas CTCs
[por exemplo, antígeno específico da próstata
(PSA)].
Todos os métodos de enriquecimento são tendenciosos porque células tumorais são heterogêneas e alguma fração das CTCs pode ser perdida (por exemplo, imuno seleção com anticorpos EpCAM não pode pegar CTCs de EpCAM
negativa). Detecção com anticorpos anti-CK é
atualmente a abordagem mais validada e padronizada, que também permite interpretação
Q&A
morfológica de eventos positivos. Diferentes
métodos de detecção levam a diferentes resultados, como mostrados pela análise comparativa das mesmas amostras do paciente com diferentes tecnologias. Desse modo, os resultados
clínicos grandemente dependem da tecnologia
usada para detectar CTCs. A tecnologia que
tem produzido a maior quantidade de dados
clínicos sobre a relevância prognóstica das CTCs
nos cânceres de seio, de próstata, e de cólon é
o sistema CellSearch (Veridex) aprovado pela
Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos.
Howard I. Scher: Nesse ponto, não há definição
padronizada de uma CTC, e as várias técnicas
usadas para enriquecer e caracterizar essas células não
medem ou relatam o mesmo
biomarcador da “CTC”. A ampla gama de testes e dispositivos em uso e em desenvolvimento inclui aqueles baseados em: diferenças físicas, por
exemplo, centrifugação do gradiente de densidade, filtração, ou a plasticidade das CTCs relativa às células não malignas; anticorpos de células de superfície conjugados com pérolas magnéticas, microposts, ou ferrofluidos para “positivamente selecionar/capturar” células tumorais; e esvaziar a população de células não malignas primeiro, deixando as CTCs para trás —
um processo chamado de “seleção negativa.”
Os vários passos do enriquecimento são então
seguidos por diferentes métodos para detectar
e caracterizar as células via várias técnicas moleculares ou citométricas.
Confiabilidade do teste deve considerar 2 componentes. O primeiro é o desempenho analítico
do teste. Na maioria dos relatórios, detalhes
dos passos da validação analítica que foram realizados estão faltando. Muitos dos testes foram
estudados apenas em um cenário de um único
laboratório, e a maioria desses testes não são
certificados pelo CLIA. Conhecer tanto a capacidade do teste quanto o que ele está realmente medindo e relatando é crítico antes de prosseguir para o teste clínico. O segundo compo-
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nente é a avaliação clínica, isto é, o nível de evidência que foi gerado até agora com respeito
ao contexto no qual o teste pode ser usado na
clínica.
Importa qual método está sendo usado clinicamente? Sim, e a primeira consideração é o
“contexto de uso” para o qual o teste está sendo desenvolvido. Declarado diferentemente,
qual é a decisão médica que o resultado do teste precisa informar? Contextos de uso incluem
diagnóstico, prognóstico, previsão, indicadores
de resposta, ou substitutos de eficácia/resposta. Como exemplos, conhecimento de
uma contagem celular não informa a escolha de
uma terapia específica pela outra, as passo que
a detecção de uma mutação quinase nas CTCs
poderia. Nenhum teste único fornecerá informação sobre todos esses contextos.
Leon Terstappen: Atualmente, o sistema CellSearch é o único sistema validado para enumeração da
CTC e como tal é o único
sistema que pode ser usado
na clínica. Embora uma variedade de métodos analíticos esteja sendo explorada
para a detecção das CTCs, apenas uns poucos
estão disponíveis para uso laboratorial rotineiro. As definições usadas para definir CTCs variam grandemente entre os diferentes métodos e
resultam em uma grande variedade nos números relatados das CTCs detectadas, assim como
na proporção de pacientes nos quais CTCs são
detectadas. Como consequência, um método de
detecção de CTC precisa ser não somente preciso e reproduzível, mas estudos clínicos prospectivos também precisarão ser conduzidos
para determinar as implicações das CTCs detectadas para cada método analítico.
Evi Lianidou: Atualmente existe uma grande
quantidade de métodos analíticos para detectar
CTCs. Entretanto, como indicado anteriormente, a principal abordagem analítica com releção
à detecção das CTCs sempre inclui 2 passos: (a)
isolameto/enriquecimento e (b) detecção. CTCs
Q&A
são eventos raros que seguem uma distribuição
Poisson, e esse fato tem que ser levado em conta para sua detecção. O volume de amostra do sangue
periférico usado para seu
isolamento é crítico, especialmente no caso de doença
precoce. As abordagens de
enriquecimento mais amplamente usadas são baseadas (a) na diferente densidade das CTCs, uma
característica explorada com tais métodos como centrifugação na presença de Ficoll; (b) filtração; e (c) isolamento imunomagnético (positivo ou negativo) através de anticorpos específicos para marcadores epiteliais tais como
EpCAM ou leucócitos (CD45), respectivamente.
Uma combinação de métodos de enriquecimento é também usada, por exemplo, dispositivos
de filtração em combinação com isolamento
EpCAM positiva, enriquecimento Ficoll, e então
isolamento imune magnético positivo. Abordagens de detecção são baseadas em (a) imagem
(imunocitoquímica e imunofluorescência) através do uso de marcadores específicos para CTCs
tais como CKs (principalmente CK-8, −18, e
−19), leucócitos tais como CD45, e viabilidade
celular via coloração 4′,6-diamidino-2-fenilindol
dicloridrato (DAPI) — principalmente pelo sistema CellSearch aprovado pela FDA; (b) métodos moleculares baseados na expressão gênica
de marcadores específicos tais como CK-19; e
(c) métodos baseados na detecção de proteínas
secretadas por CTCs imobilizadas, tais como o
teste EPISPOT. Apesar do fato da maioria desses
métodos ser altamente específica e sensível,
até agora não existem estudos extensos destinados a comparar sua eficácia quando usamos
as mesmas amostras clínicas. Essa é uma importante questão para seu uso clínico já que, especialmente na doença precoce, diferenças na
sensibilidade analítica entre esses métodos desempenham um papel muito crítico.
Existe necessidade de um sistema de controle
de qualidade para enumeração da CTC?
Klaus Pantel: Existe uma clara necessidade de
um sistema de controle de qualidade para
Clinical Chemistry
enumeração da CTC. Sistemas automatizados
de detecção da CTC (por exemplo, CellSearch)
incluíram controles embutidos positivos e negativos que permitiram a distribuição de imagens
entre os centros laboratoriais participantes.
Visto que os sistemas de detecção microscópica
são dependentes do observador, o desenvolvimento de padrões internacionais para enumeração e caracterização da CTC é da máxima importância.
Howard I. Scher: Existe mais do que uma necessidade; é essencial. Sem controle de qualidade,
os resultados relatados e os dados clínicos que
podem ser derivados deles são virtualmente
não interpretáveis e são de limitado até nenhum valor. Neste momento, como indicado
anteriormente, o único teste CTC que foi liberado pela FDA para uso, CellSearch, define uma
CTC como uma célula que está morfologicamente intacta, possui um núcleo cercado por
citoplasma após coloração DAPI, expressa CK-8,
−18, ou −19, e é CD45 negativo. Digno de nota
é que como parte do processo de validação,
que mostrou a reprodutibilidade e consistência
do teste nos laboratórios de referência e locais,
mais de 450 amostras de pacientes com câncer,
além das amostras de controle, foram avaliadas.
Leon Terstappen: Cada sistema CTC deve ser
validado e acompanhado com um sistema de
controle de qualidade.
Evi Lianidou: Numerosos estudos de uma única
instituição sugerem que CTCs podem desempenhar um importante papel na estratificação do
risco e monitoramento da eficácia terapêutica.
Esses achados precisam ser avaliados em testes
para verificar esse conceito no cenário clínico.
Acordo sobre a detecção padronizada das CTCs
é absolutamente necessário. Questões críticas
incluem: (a) a padronização da fase préanalítica, tal como a própria amostragem (por
exemplo, volume da amostra, evitar a coamostragem de células epiteliais epidérmicas
em caso de marcadores epiteliais tais como CK19 será usada mais tarde para detecção da
CTC), envio da amostra (estabilidade das CTCs
Q&A
sob diferentes condições) e condições de armazenagem (uso de preservativos ou anticoagulantes); (b) padronização do isolamento da CTC
através do uso de controles marcados no sangue periférico; (c) padronização dos sistemas de
detecção; e (d) estudos comparativos interlaboratoriais e intralaboratoriais para as mesmas
amostras. O desenvolvimento de padrões internacionais para enumeração e caracterização da
CTC também é muito importante, especialmente nos sistemas de detecção de imagem que são
dependentes do observador. Um recente estudo mostrou a viabilidade da garantia da qualidade externa da enumeração da CTC usando o
sistema CellSearch. Métodos moleculares baseados no RT-qPCR podem ser usados nos laboratórios clínicos de rotina e podem ser padronizados, já que as questões necessárias de qualidade, tais como valores do ciclo de quantificação
(Cq), limite de detecção, precisão, acurácia, e
experimentos de recuperação, foram claramente descritos. Estudos que compararam métodos
moleculares baseados no RT-PCR e imunocitoquímica mostraram uma significativa correlação, ao passo que num recente estudo de comparação do teste CellSearch e um teste molecular (AdnaTest BreastCancer), resultados concordantes com relação à positividade do HER2
(receptor do fator de crescimento epidérmico
humano 2) foram obtidos em apenas 50% dos
pacientes. Em conclusão, um sistema universal
de controle de qualidade interna e externa para
detecção e enumeração da CTC é urgentemente
necessário antes de sua aplicação na clínica.
Para qual câncer foi feito mais trabalho com
CTCs e por quê?
Klaus Pantel: Câncer de seio tem sido o foco
das atividades internacionais nas CTCs porque é
aceito que disseminação precoce de origem
sanguínea de células tumorais desempenha um
papel importante no câncer de seio, como sublinhado pelo trabalho anterior sobre a relevância clínica das DTCs na medula óssea. Mais recentemente, dados sobre monitoramento das
CTCs em câncer de próstata avançado resistente à prostatectomia têm fornecido importantes
pistas dessa abordagem como uma “biópsia
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líquida,” particularmente no contexto das novas
terapias.
Howard I. Scher: Uma procura na literatura da
PubMed por células tumorais circulantes e tipo
de tumor produziu os seguintes números de
publicações: seio, 275; melanoma, 181; pulmão,
155; próstata, 117; colorretal, 116; sarcoma, 53;
cabeça e pescoço, 41; linfoma, 41; leucemia, 21;
rim, 22; e bexiga, 16. O número de publicações
é apenas um aspecto do “trabalho” feito numa
área específica da doença. Mais importante é a
qualidade, que nos traz de volta à validade analítica do(s) teste(s) usado(s) nos relatórios e o
nível de evidência que tem sido gerado para
apoiar um específico contexto de uso. Uma
questão reside no passo de detecção. Por
exemplo, usando-se CellSearch, encontramos
contagens celulares desfavoráveis acima de
50%–70% dos pacientes com doença metastática progressiva resistente à prostatectomia; para
câncer colorretal, essa taxa é de 15%. Em casos
onde as taxas de detecção são baixas, novos
testes são necessários para aumentar a proporção de pacientes nos quais os biomarcadores da
CTC podem ser avaliados.
O documento de liberação da FDA para enumeração da CTC com a CellSearch declara: “A presença de CTC no sangue periférico, como detectado pelo kit de Células Tumorais Circulantes do
CellSearch ™, está associada com reduzida sobrevivência livre de progressão e reduzida sobrevivência geral em pacientes tratados para
câncer metastático de seio, colorretal ou de
próstata. O teste é para ser usado como uma
ajuda no monitoramento de pacientes. Testes
em série para CTC devem ser usados em conjunção com outros métodos clínicos para monitoramento”
(http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf
7/K073338.pdf).
Liberação, entretanto, não significa que os resultados possam ser usados como um “substituto” da resposta de eficácia para sobrevivência
em arquivos reguladores. Essa questão específica pode ser abordada apenas incorporando a
questão do biomarcador à sobrevivência basea-
Q&A
dos em ensaios de fase 3. Tal iniciativa está em
curso na linha de base e nos testes da fase 3 de
registro da enumeração da CTC de acompanhamento pós-tratamento do acetato abiraterona (Ortho Biotech, uma Divisão da Cougar
Biotecnologia), no teste do MDV3100 (Medivation), e no teste do ipilimumab (Bristol-Myers
Squibb) e TAK-700 (Millenium). Um documento
formal resumido descrevendo essa iniciativa foi
apresentado ao Centro de Avaliação e Pesquisa
de Drogas (CDER) uma subdivisão da FDA, e
análises da associação da enumeração da CTC
com a sobrevivência está em curso.
A significância prognóstica do número da CTC
após o tratamento também está sendo estudada no câncer de seio como um indicador de
resposta para mudar o tratamento. De particular interesse nos cânceres de pulmão e colorretal está a capacidade de detectar mutações
quinase que prevêem a resistência do tratamento, tanto no começo da terapia quanto durante a terapia. Para esses contextos, o teste
providencia levar uma amostra sanguínea facilmente adquirida para delinear o tumor na
ocasião que um tratamento for considerado,
potencialmente substituindo a necessidade de
uma biópsia invasiva e cara que é difícil de realizar repetidamente.
CellSearch como atualmente configurado não
pode ser usado para detectar CTCs em pacientes com melanomas e carcinomas celulares renais, porque esses tumores não expressam
EpCAM. Para detectar CTCs nesses contextos,
alguns grupos estão estudando a detecção da
CTC usando metodologias baseadas no qPCR
para antígenos específicos do melanoma. Com
base nos dados promissores da fase 2 , os testes
da fase 3 estão em curso.
Finalmente, o nível da atividade de pesquisa
será determinado pela necessidade não satisfeita que o teste será usado para abordar o desempenho técnico dos testes disponíveis e os
resultados da sequência de testes necessários
para gerar suficiente evidência para possibilitar
uso rotineiro num cenário de prática clínica.
Clinical Chemistry
Leon Terstappen: Estudos prospectivos de multicentros têm sido conduzidos para cânceres
metastáticos de seio, colorretal, e de próstata.
O patrocinador escolheu conduzir estudos nos 3
carcinomas mais frequentes.
Evi Lianidou: CTCs são principalmente estudadas no câncer de seio. A razão é que a relevância clínica das DTCs na medula óssea de pacientes com câncer de seio foi claramente mostrada. Visto que disseminação precoce de origem
sanguínea das células tumorais desempenha
um importante papel no câncer de seio, muito
trabalho tem que ser feito nesse tipo de câncer
tanto com as amostras da medula óssea quanto
com as do sangue periférico. Usando RT-qPCR,
nosso grupo mostrou que no câncer de seio inicial a detecção das células CK-19 mRNA positivas no sangue periférico é um fator prognóstico
independente para um reduzido intervalo livre
de doença e sobrevivência geral para pacientes
com câncer de seio de nodo negativo. Além disso, a detecção das células mamaglobina 1
(MGB1) mRNA positivas e CK-19 mRNA positivas no sangue periférico antes que quimioterapia adjuvante preveja má sobrevivência livre de
doença, embora a detecção das CTCs CK-19
mRNA positivas no sangue após quimioterapia
adjuvante seja um fator de risco independente
que indica a presença de doença residual resistente à quimioterapia. A importância da enumeração da CTC no câncer avançado de seio foi
mostrada usando o sistema CellSearch. Mais
recentemente, dados sobre o monitoramento
das CTCs em outros tipos de câncer, tais como
câncer avançado de próstata resistente à prostatectomia, têm fornecido importantes pistas
como uma “biópsia líquida,” particularmente no
contexto de novas terapias.
Quais são as principais questões clínicas e necessidades não satisfeitas a serem abordadas
com as CTCs?
Klaus Pantel: (i) Estimativa do risco de reincidência metastática ou progressão metastática
(informação prognóstica); (ii) estratificação e
monitoramento em tempo real das terapias; (iii)
Q&A
identificação dos alvos terapêuticos e dos mecanismos de resistência (terapias biológicas).
Howard I. Scher: Com foco no câncer de próstata em particular, questões-chave no desenvolvimento da droga e no tratamento do paciente
são as dificuldades de avaliar os efeitos do tratamento. Isso é porque metástases esqueléticas, que são difíceis de analisar quantitativamente, representam o local mais frequente da
disseminação metastática e uma das principais
causas da morbidade relacionada com a doença, e embora medições em série do PSA guiem
o tratamento, existem circunstâncias onde um
paciente pode estar respondendo favoravelmente quando o PSA está subindo ou não estar
respondendo quando ele está diminuindo. Indicadores precoces de resposta que podem ser
rapidamente avaliados na fase 2 dos testes são
essenciais, tanto para os pacientes individuais,
assim como para informar a decisão de prosseguir para a fase 3 mais avançada do teste.
Um problema adicional é que é difícil obter tumor metastático para perfil molecular do osso,
o local mais comum da disseminação, e até
mesmo quando é viável, poucos testes usados
foram analiticamente validados. Utilizar uma
terapia direcionada requer uma demonstração
de que o “alvo” está presente quando o tratamento é considerado: biópsias são invasivas,
caras, e difíceis de repetir.
Virtualmente todos os tumores de próstata inicialmente respondem à ablação do andrógeno e
eventualmente progridem para um estado resistente à prostatectomia (referido como “câncer de próstata resistente à castração” ou
CRPC), que é quase invariavelmente letal. Concentrações de PSA são frequentemente usadas
como um indicador de doença progressiva assim como um indicador de resposta tanto para
agentes hormonais quanto citotóxicos. Entretanto, mudanças pós-terapia do PSA não são
um desfecho substituto para sobrevivência geral. Esses achados sugerem a necessidade de
identificar e definir medidas de resultados de
eficácia que mais precisamente reflitam o verdadeiro benefício clínico.
Clinical Chemistry
Leon Terstappen: Uma ferramenta para determinar qual terapia ou combinação de terapias
promete ser a mais eficaz para o paciente individual. Uma ferramenta para eficazmente determinar a eficácia do tratamento uma vez administrado.
Evi Lianidou: Principais questões clínicas: (a)
estudos clínicos para mostrar que detecção da
CTC pode levar a uma mudança no tratamento
dos pacientes com câncer que resulta num melhorado resultado clínico (o teste randomizado
da fase 3 do Southwest Oncology Group 0500 é
especialmente destinado a testar a estratégia
de mudar a terapia contra manter a terapia para pacientes com câncer de seio metastático
que possuam elevados níveis de CTC na primeira avaliação de acompanhamento e se espera
que seja completado logo); e (b) medicina personalizada: o uso de CTCs para estratificação
dos pacientes e monitoramento em tempo real
das terapias.
Necessidades não satisfeitas a serem abordadas: (a) validação cruzada dos achados entre os
laboratórios; (b) caracterização molecular das
CTCs possibilitará a identificação de novas terapias que terão como alvo a disseminação micro
metastática e elucidarão sua conexão com as
células tronco do câncer.
A detecção da heterogeneidade entre as CTCs
é importante?
Klaus Pantel: CTCs e DTCs mostram uma acentuada heterogeneidade em termos de aberrações genéticas e padrões de expressão gênica.
Para determinar essa heterogeneidade é importante, por exemplo, estimar a “agressividade”
da carga do tumor residual e obter informação
sobre a seleção dos clones específicos da CTC
durante a terapia (por exemplo, status do HER2
das CTCs que se submetem à terapia anti-HER2
com trastuzumab.
Howard I. Scher: Sim. Sensibilidade e especificidade são uma questão com as técnicas específicas de enriquecimento da CTC, devido à heterogeneidade do tumor no tamanho da célula,
densidade, e expressão do marcador. Consequentemente, alguma perda de células tumo-
Q&A
rais é provável de ocorrer, independentemente
da técnica de enriquecimento usada. Tumores
primários são conhecidos por serem heterogêneos, e as CTCs possuem um perfil citogenético
molecular reflexivo desse fenômeno. A seleção
dos múltiplos marcadores na detecção das CTCs
é crítica. Além disso, uma mutação que seja
preditiva para resposta a uma droga específica
pode ser detectada numa população de CTCs,
mas se a mutação estiver presente em apenas
uma pequena proporção de CTCs, o benefício
clínico pode ser limitado. A mesma consideração se aplica aos biomarcadores baseados nas
proteínas.
Leon Terstappen: Sim, heterogeneidade com
respeito à presença dos alvos de tratamento em
particular pode se tornar importante para moldar o coquetel ideal de terapias.
Evi Lianidou: CTCs são altamente heterogêneas,
como já foi mostrado através de métodos moleculares e de microscopia de exame a laser.
Isso é altamente importante, particularmente
quando alvos terapêuticos são expressos em
CTCs mas não no tumor primário. Uma vez que
CTCs HER2 positivos foram detectadas em um
número substancial de pacientes com tumores
primários HER2 negativos, avaliação do status
do HER2 avaliando-se a expressão do HER2 nas
CTCs é uma estratégia com potencial aplicação
clínica. Entretanto, a importância da heterogeneidade da CTC não foi até agora totalmente
explorada clinicamente.
Quando é melhor se avaliar as CTCs? Antes ou
depois do tratamento primário?
Klaus Pantel: A meia-vida estimada das CTCs é
curta. Desse modo, pode-se presumir que a
avaliação das CTCs após terapia primária (por
exemplo, após o término da quimioterapia adjuvante) fornece informação sobre depósitos
micro metastáticos ocultos, ao passo que a detecção no diagnóstico primário (e remoção cirúrgica do tumor) pode ser grandemente determinada pela capacidade de disseminação do
tumor primário. Embora dados que comparam
a relevância clínica de se enumerar as CTCs nesses 2 pontos de tempo ainda estejam faltando,
Clinical Chemistry
a enumeração das CTCs que sobreviveram à
terapia (neo)adjuvante pode ser mais relevante
para o prognóstico do paciente do que a detecção das CTCs no diagnóstico primário.
Howard I. Scher: Ambos, contudo, uma vez
mais, a questão se resume ao contexto. Por
exemplo, se um teste específico detectar doença em apenas 5% ou menos dos pacientes que
se apresentam para terapia primária, seria mais
apropriado procurar por novos testes que aumentam as taxas de detecção, porque a “falha
em detectar” CTCs não garante um resultado
favorável. Isso dito, existe dados de múltiplos
tipos de tumores indicando que a detecção de
células no diagnóstico está associada com um
prognóstico inferior, mas ainda não existe dados que apóiem decisões sobre o tratamento
definitivo de um tumor primário com base na
presença ou ausência de células. Para o contexto de usar CTCs para perfil molecular para guiar
a seleção do tratamento, é essencial se ter uma
amostra pré-tratamento, ao passo que para o
contexto da resposta ambos são importantes.
Leon Terstappen: Antes da administração da
terapia, a presença e o número de CTCs devem
ser usados para avaliar o prognóstico e determinar a presença ou ausência dos alvos de tratamento. Depois do primeiro ciclo de terapia,
CTCs devem ser usadas para determinar se a
terapia administrada é eficaz ou não.
Evi Lianidou: A presença de DTCs na medula
óssea foi claramente mostrada ser de significância prognóstica em pacientes com câncer de
seio antes do tratamento primário. Nosso grupo
mostrou que no câncer de seio inicial, a detecção das CTCs CK-19 mRNA positivas é um fator
prognóstico independente tanto antes quanto
depois da quimioterapia adjuvante.
Qual é o papel das CTCs na “medicina personalizada”?
Klaus Pantel: Monitoramento em tempo real e
caracterização molecular das CTCs, particularmente para alvos terapêuticos (por exemplo,
HER2) ou mutações que conferem resistência às
terapias direcionadas [por exemplo, mutações
do KRAS (oncogene v-Ki-ras2 Kirsten rat sarco-
Q&A
ma viral homólogo)], podem contribuir para
uma melhor seleção dos pacientes com câncer
que podem se beneficiar das caras terapias com
consideráveis efeitos colaterais, e essas medições também podem permitir um mudança
precoce para terapias mais eficazes em pacientes individuais.
Howard I. Scher: Para muitos tipos de tumores,
os determinantes biológicos que contribuem
para a progressão mudam durante o tempo. Em
tais casos, perfis moleculares do tumor primário
obtidos para estabelecer um diagnóstico ou que
é removido como terapia definitiva pode não
serem informativos. Nesses casos, é essencial se
obter material do tumor na hora da primeira e
potencialmente de todas as subsequentes reincidências. Semelhantemente, é sabido que perfis moleculares também podem mudar em uma
terapia específica. Aqui, se obter material do
tumor para se fazer um perfil é essencial. Para a
maioria dos tumores, entretanto, o desempenho de uma biópsia de repetição após o diagnóstico inicial e tratamento não é uma parte da
prática rotineira e, como notado acima, também é invasiva, cara, e difícil de repetir. CTCs
obtidas de uma simples amostra de flebotomia
minimamente invasiva obtida no contexto do
tratamento rotineiro do paciente pode atender
a essa necessidade não satisfeita. Além disso,
estudos sequenciais que mostram a presença
ou ausência de CTCs provavelmente fornecerão
rápidas leituras da eficácia do tratamento, possibilitando que terapias que estejam beneficiando um paciente sejam continuadas e aquelas
que não estejam sejam interrompidas.
Leon Terstappen: Em pacientes nas quais as
CTCs podem ser detectadas e caracterizadas, as
CTCs podem substituir a biópsia tradicional.
Evi Lianidou: Caracterização molecular das CTCs
pode fornecer valiosa informação sobre a expressão dos receptores específicos tais como
HER2, ativando vias tais como angiogênese, e
mutações específicas, tais como no receptor do
fator de crescimento epidérmico, que confere
sensibilidade às terapias. Análise molecular da
CTC oferece a possibilidade de monitorar mu-
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danças durante o curso do tratamento e pode
servir como uma biópsia em tempo real para
guiar terapias moldadas no futuro próximo.
A evidência atualmente disponível é suficiente
para usar as CTCs na clínica? Se for, para qual
aplicação?
Klaus Pantel: Em pacientes com câncer avançado (em particular câncer de seio e de próstata),
existe suficiente evidência de que a enumeração das CTCs fornece informação prognóstica e
parece ser mais sensível do que as atuais tecnologias de imagem ou marcadores séricos (por
exemplo, PSA) usados para medir progressão.
Em pacientes em estágio inicial, o papel prognóstico das CTCs ainda está sob avaliação. Medições da CTC são parte de testes clínicos em
curso que testam novas drogas no câncer de
seio e de próstata, e os resultados desses testes
determinarão se a detecção da CTC (e caracterização) se tornarão uma ferramenta valiosa como um “diagnóstico companheiro” (isto é, marcador substituto para resposta ou fracasso da
terapia).
Howard I. Scher: Sim, a evidência até agora
apóia o uso da enumeração da CTC para o uso
clínico para o qual ela é liberada. Os dados são
suficientes para dizer que o teste pode ser usado no lugar da imagem, ou como um biomarcador preditivo para guiar o tratamento, embora
essa questão esteja sendo abordada prospectivamente em múltiplos testes.
Leon Terstappen: Sim, para a determinação do
prognóstico e do monitoramento da terapia de
pacientes tratados para câncer metastático de
seio, câncer colorretal, e câncer de próstata.
Evi Lianidou: Existe suficiente evidência de que
a enumeração das CTCs fornece informação
prognóstica em pacientes com certos tipos de
câncer avançado (seio, cólon, próstata). Detecção da CTC parece ser mais sensível do que as
atuais tecnologias de imagem ou os clássicos
biomarcadores séricos de tumor usados para
detectar reincidência inicial. Em pacientes com
câncer de seio em estágio inicial, nosso grupo
mostrou que a detecção de CTCs CK-19 mRNA
positivas é um fator prognóstico independente,
Q&A
tanto antes quanto depois da quimioterapia
adjuvante. Entretanto, essa é uma experiência
de um único centro que ainda não foi validada
por cruzamento em outros laboratórios, portanto o papel prognóstico das CTCs na doença inicial ainda está sob avaliação. Medição da CTC
pode desempenhar um papel para a avaliação
da eficácia de novas drogas no câncer de seio e
de próstata. Essa questão está agora sendo testada em testes clínicos, e seus resultados determinarão se as CTCs podem ser usadas como
marcadores substitutos para resposta da terapia.
Qual é a sua previsão para a aplicabilidade clínica das CTCs daqui a 10 anos?
Klaus Pantel: Monitoramento em tempo real
das CTCs para avaliar a eficácia terapêutica
complementará as atuais determinações da
progressão do tumor por tecnologias de imagem ou medições dos marcadores séricos sanguíneos. Além disso, a análise molecular das
CTCs para alvos terapêuticos e/ou mutações nas
vias que conferem resistência às terapias moleculares (“biópsia líquida”) pode se tornar ferramentas valiosas para moldar terapias modernas às necessidades individuais de um paciente
com câncer.
Howard I. Scher: Além dos contextos discutidos
na pergunta anterior, múltiplos grupos estão
desenvolvendo a capacidade de consistentemente capturar células vivas e estabelecer culturas celulares de curto prazo. As últimas são
usadas para testar os efeitos do anti-tumor das
drogas específicas para melhor informar a escolha de uma terapia mais provável de beneficiar
aquele paciente, assim como para melhor entender os mecanismos de resistência e a biologia mutante da doença. Análises de células únicas também estão em desenvolvimento, e logo
os avanços tecnológicos nessa área possibilitarão a análise de números suficientes de células
num cenário em tempo real. Além dos avanços
tecnológicos antecipados, é essencial que novos
designs de testes sejam desenvolvidos, criados,
e executados para dar mais aerodinâmica ao
processo. Essa aerodinâmica é essencial para
Clinical Chemistry
encurtar o tempo de desenvolvimento da droga
e para minimizar o uso de estudos baseados na
sobrevivência que inscrevem “todos os que se
apresentam.” Tais estudos não são apenas ineficientes e caros, mas também possuem o detrimento adicionado de diminuir o desenvolvimento da droga e expor os pacientes ao ineficaz
tratamento tóxico.
Leon Terstappen: CTCs serão usadas em testes
de rotina para monitorar tratamento do câncer
e serão usadas para determinar quais terapias
podem ser eficazes no paciente individual.
Evi Lianidou: Uma combinação de sistemas
avançados de imagem e caracterização molecular das CTCs será muito útil para melhor refinar
o prognóstico, definir as estratégias de tratamento, e eliminar ou reduzir o risco de metástase. O uso de modernas e poderosas tecnologias tais como sequenciamento da próxima geração possibilitará a elucidação das vias moleculares nas CTCs e levará ao design de novas terapias moleculares que tenham como alvo especificamente as CTCs. Além disso, CTCs podem se
tornar o método preferido para monitorar a
eficácia das terapias adjuvantes do câncer.
Notas de Rodapé
9
Abreviações não padronizadas:
DTC, célula tumoral disseminada; CTC, célula
tumoral circulante; RT-qPCR, PCR quantitativo
de transcrição reversa; EpCAM, molécula de
adesão da célula epitelial; CK, citoqueratina;
EPISPOT, (teste) de immunospot epiteliais; PSA,
antígeno específico da próstata; FDA, Administração de Drogas e Alimentos dos Estados Unidos; DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenilindol dicloridrato ; Cq, ciclo de quantificação; HER2, receptor
do fator de crescimento epidérmico humano 2;
Q&A
CDER, Centro de Avaliação e Pesquisa de Drogas; MGB1, mamaglobina 1.
Contribuições dos Autores: Todos os autores
confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os
3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de
dados, ou análise e interpretação dos dados; (b)
rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo
publicado.
Revelações dos Autores de PotenciaisConflitos
de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de
Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse.
Potenciais conflitos de interesse:
Emprego ou Liderança: E.P. Diamandis, Clinical
Chemistry, AACC.
Consultor ou Papel Consultivo: H.I. Scher,
Veridex, Johnson & Johnson, and Ortho Biotech;
L. Terstappen, Johnson & Johnson.
Posse dos Valores: H.I. Scher, Johnson & Johnson.
Honorários: K. Pantel, Veridex, Roche, Novartis,
and Amgen.
Fundo de Pesquisas: K. Pantel, Veridex; H.I.
Scher, Ortho Biotech; L. Terstappen, Johnson &
Johnson.
Testemunho Hábil: Nada a declarar.
Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no
design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito.
Recebido para publicação em 19 de Abril de
2011.
Aceito para publicação em 25 de Abril de 2011.
© 2011 The American Association for Clinical
Chemistry
“This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views
presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2011; 57 no. 11
1478-1484, by permission of AACC. Original copyright © 2011 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article,
please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry.”
“Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2011; 57 no. 11 1478-1484, por
permissão da AACC. Cópia original © 2011 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se
à fonte de publicação original em inglês na revista,Clinical Chemistry.”