Identificação fenotípica de Dientamoeba fragilis e Blastocystis
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Identificação fenotípica de Dientamoeba fragilis e Blastocystis
Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 Artículo de Original Identificação fenotípica de Dientamoeba fragilis e Blastocystis hominis em pacientes atendidos no ambulatório do Hospital Universitário de Brasília: Caracterização molecular preliminar de isolados diagnosticados MINUZZI T. T. C. S.1 e CUBA CUBA C. A.1 1 Laboratório de Parasitologia Médica e Biologia de Vetores, Área de Patologia Faculdade de Medicina - UnBrasilia Brasil. ABSTRACT PHENOTYPIC IDENTIFICATION OF DIENTAMOEBA FRAGILIS AND BLASTOCYSTIS HOMINIS IN PATIENTS ASSISTED AT THE UNIVERSITY HOSPITAL OF BRASÍLIA: MOLECULAR CHARACTERIZATION OF PRIMARY SAMPLES ISOLATES A high prevalence of Dientamoeba fragilis and Blastocystis hominis are reported on faecal samples collected from patients attending the ambulatory service of the University of Brasilia teaching hospital in Brasilia, Federal District, Brazil. Samples were collected directly into sodium acetate–acetic acid– formalin (SAF) and also as unfixed specimens. During a period of may 2008 and january 2009 a D. fragilis frequency of 31.5% (n = 89) among positive parasites samples and B. hominis 49.4% (n = 89), respectively, was recorded. From 46 individuals an association of D. fragilis and B. hominis were identified in 8 patients. Attempts of molecular identification were done and succesful results only achieved with the PCR/DNA of B. hominis. These results confirm a high frequency of both intestinal protozoa among a selected outpatient population. Of note, the higher presence of D. fragilis infections recorded is probably related to the diagnostic methods used, which are rarely followed in laboratories for the diagnosis of intestinal parasites. Clinical information was only available for a few of the patients with D. fragilis. For further work on its pathogenic role and prevalence among patients with gastrointestinal symptoms, immediate collection of fixed and unfixed specimens followed by staining routine procedures should be the mandatory procedures into diagnostic laboratories. The authors emphasize also the importance and need of Ferric haematoxylin staining assays on smears of faecal samples, on the basis of previous good direct microscopic observations Recibido: 5 de Diciembre de 2009. Aceptado: 30 de Abril de 2010. Correspondência: Thaís Tâmara Castro e Souza Minuzzi. Campus Universitário Darcy Ribeiro, Laboratório de Parasitologia Médica e Biologia de Vetores, Área de Patologia, Faculdade de Medicina - Universidade de Brasília - UnB. Brasília - DF. CEP 70.910-900. E-mail: [email protected]. 124 DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA of faecal specimens, for correct and accurate diagnosis of intestinal infections of these protozoan. Key words: Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis, Survey, Brazil. RESUMO Dientamoeba fragilis e Blastocystis hominis são parasitas do trato gastrointestinal de humanos que podem estar associados a infecções intestinais e diarréias, porém são negligenciados nos testes de diagnóstico hospitalar. Amostras fecais foram coletadas de pacientes atendidos no ambulatório do Hospital Universitário de Brasília (HUB), durante o período de maio de 2008 a janeiro de 2009, com objetivo de identificar a presença de protozoários parasitas com ênfases em D. fragilis e B. hominis. Exames coprológicos, auxiliados com técnicas de concentração, de preparação de lâminas permanentes coradas com Hematoxilina Férrica e biometria de trofozoítos de D. fragilis e cistos e trofozoítos de B. hominis, foram realizados para sua caracterização fenotípica. A técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) foi utilizada com primers específicos e otimizada com sucesso somente para B. hominis. Das 158 amostras fecais coletadas, 69% foram do sexo feminino e 31% do sexo masculino. Destas, 56,3% das amostras (n = 89) foram positivas para algum parasita intestinal, sendo que 28 amostras foram positivas para D. fragilis e 44 para B. hominis. Ainda, 51,7% das amostras apresentaram mais de um parasita, verificando-se associação entre D. fragilis e B. hominis em 8 amostras. Estudos moleculares confirmaram a presença de B. hominis em 6 das 8 amostras positivas em microscopia de luz e em 2 das 5 amostras negativas. Estes resultados evidenciam o que a literatura especializada relata: Um desconhecimento real da prevalência destes protozoários, tanto pela falta do uso de técnicas adequadas de coloração, quanto pela não utilização de ferramentas moleculares complementares. Palavras chaves: Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis, Brasil. INTRODUÇÃO Dientamoeba fragilis é um parasita trichomonadideo do trato gastrointestinal de humanos que pode estar associado a infecções intestinais e diarréias (Stark et al., 2005, 2008), além de ser um agente causador de enterite severa em pessoas imunossuprimidas (especialmente em pacientes HIV positivos) ( Lainson e Silva 1999). O diagnóstico de D. fragilis pode ser feito por meio da análise de fezes frescas ou fezes conservadas (Peek et al., 2004). Para um diagnóstico definitivo torna-se necessária a fixação e preparação de lâminas permanentes. A identificação deste parasita não é tarefa das mais fáceis, em razão de sua semelhança com outros protozoários patogênicos ou não( Stark et al., 2006), como, por exemplo, o Endolimax nana, Blastocystis hominis e Trichomonas hominis (Yang e Scholten 1977). Ademais, sua dificuldade de sobrevivência no meio ambiente ou em meios de cultura por tempo prolongado é outro fator que dificulta sua identificação (Menghi et al., 2006). Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 No Brasil há estudos que comprovam a ocorrência do parasita D. fragilis em portadores do vírus HIV/AIDS3 e em populações indígenas (Lawrence 1983). Em Fortaleza (CE), há um único estudo relatando a presença do D. fragilis com outras enteroparasitoses (Ridel et al., 1987). No DF não foi encontrado na literatura revista nenhum estudo sobre este parasita. O outro objeto deste estudo é o enteroparasita denominado B. hominis. B. hominis é provavelmente o protozoário mais comum encontrado no intestino humano (Clark 1997). Tal parasita também pode ser encontrado em uma gama de animais como porcos, aves e anfíbios (Abe et al., 2002, Stensvold et al., 2006). Não existe consenso sobre o potencial patogênico deste organismo. Atualmente, assim como acontece com o D. fragilis, considera-se mais prudente considerá-lo como patogênico (Zaman e Howe 1995, Stenzel e Boreham 1996). Ademais, os sintomas da infecção por B. hominis são semelhantes àqueles causados pelo D. fragilis. 125 T. T. CASTRO e C. A. CUBA No Brasil, alguns estudos de frequência e prevalência foram realizados em São Paulo, Bahia e Paraná (Brites et al., 1997, Santos 2004, Nascimento e Montinho 2005, Martins et al., 2007). Nenhum estudo, porém, foi encontrado no DF. De fato, a falta de informação e de pesquisas relacionadas com o diagnóstico laboratorial de D. fragilis e B. hominis contribuem para a ocorrência de inexplicáveis casos de diarréia crônica, dor abdominal, fadiga, flatulência, e tantos outros sintomas. Justifica-se, nesse ponto, o objetivo principal deste trabalho, qual seja, estabeler no Laboratório de Parasitologia da UnB a capacidade de diagnóstico fenotípico e molecular de ambos os protozoários. MATERIAL E MÉTODOS 158 amostras fecais foram obtidas no Hospital Universitário de Brasília (HUB), na seção de parasitologia, durante o período maio de 2008 a janeiro de 2009. As fezes ainda frescas foram levadas para o Laboratório de Parasitologia da Universidade de Brasília (UnB) onde foram analisadas. Aproximadamente, 2 g de fezes, de cada paciente, foram fixadas em SAF (acetato de sódio, ácido acético e formol) e guardadas em temperatura ambiente para posterior técnica de sedimentação espontânea de Hoffman, Pons e Jenner, ligeiramente modificada. Os sedimentos de fezes, fixadas em SAF, foram utilizadas para preparação de lâminas permanentes coradas com Hematoxilina Férrica, com o intuito de proceder a identificação de D. fragilis, B. hominis e outros protozoários, por meio da visualização por microscópio binocular óptico com lentes de 1.000X. Para definir os tamanhos aproximados das formas coradas de D. fragilis e B. hominis, foram realizadas medições em microns (µm) do maior e menor diâmetro utilizando-se um microscópio calibrado (Leitz binocular) com uma ocular micrométrica. Análises estatísticas foram realizadas por intermédio do programa SPSS, versão 17. Outros 2 g de fezes, dos mesmos indivíduos, foram diretamente sedimentadas utilizando-se a técnica modificada de Hoffman, Pons e Jenner e congeladas a - 20oC em tubos de eppenddorf 1,5 mL, com 400 µl de fezes sedimentada sem re-suspender. 126 Este material foi utilizado para os ensaios moleculares. Das 158 amostras, 8 positivas e 5 negativas para D. fragilis e B. hominis, congeladas a - 20oC, foram escolhidas para extração do DNA utilizando-se o kit de extração de DNA em fezes da INVETEK (PSP Spin Stool DNA Kit - Invetek - USA). A extração de DNA seguiu o protocolo do kit e cada amostra extraída obteve um volume final de 150 µl. Após a extração de DNA, o material foi amplificado por PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando-se a enzima Taq polimerase (Invitrogen), conforme instruções do fabricante. A PCR, utilizada para confirmar a presença de D. fragilis, foi amplificada utilizando-se primers desenhados especificamente para ampliar somente a região de genes trichomonadidae do rRNA subunidade 16S. Estes primers foram chamados de TRD3 e TRD5 (Johnson e Clark 2000). O fragmento resultante deveria apresentar tamanho em torno de 1.700 pares de bases. Uma segunda ronda de PCR foi realizada utilizando com os primers DF3 e DF5 (Menghi et al., 2005). O resultado, desta segunda ronda, deveria apresentar tamanho em torno de 412 pares de bases. O DNA de D. fragilis usado como controle positivo foi gentilmente cedido pelo Dr. C. Graham Clark (London School of Hygiene & Tropical Medicine, Londres, Inglaterra). O ciclo de amplificação da PCR para os primers TRD3/TRD5 apresentou a seguinte reação: uma desnaturação e ativação da enzima à 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos com 95ºC por 1 minuto, 52ºC por 40 segundos e 72ºC por 1,5 minutos e finalmente, com uma extensão de 72ºC por 7 minutos. E a PCR para os primers DF3/DF5 apresentou a seguinte reação: uma desnaturação e ativação da enzima à 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos com 95ºC por 1 minuto, 54ºC por 40 segundos e 72ºC por 1,5 minutos e finalizando com uma extensão de 72ºC por 5 minutos. Na PCR que foi utilizada para confirmar a presença de B. hominis, utilizou-se os primers desenhados especificamente para ampliar a região de genes do rRNA subunidade (SSU) 16S do gene de Blastocystis. Estes primers foram chamados de F1 (Bohm-Gloning et al., 1997) e BHCRseq3 (Girginkardesler et al., 2003). O fragmento resultante deveria apresentar tamanho em torno de 550 - 590 pares de bases. Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA O ciclo de amplificação da PCR para os primers F1/BHCRseq3 apresentou a seguinte reação: uma desnaturação da enzima e ativação da enzima à 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos com 95ºC por 1 minuto, 54ºC por 40 segundos e 72ºC por 1,5 minutos e finalizando com uma extensão de 72ºC por 7 minutos. Os fragmentos amplificados resultantes foram analisados em eletroforese com gel de agarose 1%, 0,5 X Tampão TBE (Tris Borato EDTA) e Brometo de Etídeo. Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília (UnB). RESULTADOS Caracterização do parasitismo: Das 158 amostras fecais coletadas, 109 foram do sexo feminino (69%) e 49 foram do sexo masculino (31%). Não houve diferença estatística significativa em relação ao sexo na amostra estudada (c2 = 0,890 p > 0,005). Das 89 amostras positivas para algum parasita intestinal, 44 amostras foram positivas para B. hominis, sendo que 30 foram do sexo feminino e 14 do sexo masculino. Já para D. fragilis, 28 amostras foram positivas. Destas, 19 do sexo feminino e 9 do sexo masculino. Ademais, foram encontrados outros protozoários parasitas intestinais além do D. fragilis e B. hominis (Figura. 1). Das 89 amostras positivas, verificou-se a ocorrência de poliparasitismo em 46 amostras (51,7%). Destas amostras, 8 apresentaram associação entre D. fragilis e B. hominis (Tabela 1). Das 158 amostras coletadas, apenas 109 informaram a idade (57 pacientes positivos e 52 pacientes negativos indicaram a idade) (Figura 2). Tendo por base o teste estatístico ANOVA, relacionando a idade x resultados positivos (monoparasitismo e poliparasitismo) e negativos, verificou-se a ocorrência de resultado não significativo de 0,713 (p > 0,005). Conclui-se, portanto, que não há relação direta entre a idade do paciente e a positividade (entre monoparasitismo e poliparasitismo) das amostras analisadas. Caracterização morfológica de D. fragilis: A análise morfológica de D. fragilis evidenciou a existência de diferenças relativas às formas e ao tamanho deste parasita. Assim, verificou-se variações de tamanho que vão de 3 µm do menor diâmetro e 3 µm do maior diâmetro (3 x 3) a 10 µm do menor diâmetro ao 17 µm do maior diâmetro (10 x 17). O tamanho mais frequente foi de 5 µm do menor diâmetro e 6 µm do maior diâmetro (5 x 6). Figura 1. Gráfico relacionando as protozooses encontradas nas amostras fecais e sua frequência. Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 127 T. T. CASTRO e C. A. CUBA Figura 2. Gráfico relacionando a frequência das idades dos 89 pacientes positivos com as protozooses encontradas, D. fragilis e B. hominis. Tabela 1. Associações de parasitismo nas 46 amostras em que ocorreu mais de um protozoário Poliparasitismo Quantidade Blastocystis hominis e Dientamoeba fragilis 8 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis e Entamoeba coli 2 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis e Iodamoeba bütschilii 4 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba coli e Giardia lamblia 1 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Endolimax nana e Iodamoeba bütschilii 2 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Giardia lamblia e Iodamoeba bütschilii 2 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Endolimax nana, Entamoeba coli e Iodamoeba bütschilii 3 Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Chilomastix, Endolimax nana, Entamoeba coli e Iodamoeba bütschilii 1 Blastocystis hominis e Endolimax nana 3 Blastocystis hominis e Iodamoeba bütschilli 3 Blastocystis hominis, Endolimax nana e Entamoeba coli 1 Blastocystis hominis, Endolimax nana, Iodamoeba bütschilii 4 Blastocystis hominis, Entamoeba coli e Iodamoeba bütschilii 1 Dientamoeba fragilis e Endolimax nana 3 Dientamoeba fragili, Endolimax nana e Iodamoeba bütschilii 1 Endolimax nana e Iodamoeba bütschilli 3 Endolimax nana e Entamoeba coli 3 Entamoeba coli e Iodamoeba büstichilii 1 Total 46 Também foram encontradas formas mais arredondadas e ovaladas, além de formas com apenas um núcleo (3 das 28 amostras) e com dois núcleos (25 das 28 amostras) (Figura 3). Caracterização morfológica de B. hominis: Já com relação ao B. hominis, ocorreram variações de tamanho de 3 µm do menor diâmetro e 4 µm do maior diâmetro (3 x 4) até 12 µm do menor diâmetro 128 e 12 µm do maior diâmetro (12 x 12). O tamanho mais frequente foi de 5 µm do menor diâmetro e 5 µm do maior diâmetro (5 x 5). Nestas amostras, também, foram observadas formas diferentes para B. hominis, como a forma vacuolar e multivacuolar. A forma vacuolar foi a mais frequente, estando presente em todas as amostras positivas. Já a forma multivacuolar foi encontrada em apenas uma amostra (Figura 4). Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA Figura 3. Caracterização morfológica de D. fragilis em lâminas, com coloração de Hematoxilina férrica, visualizadas em microscópio óptico em aumento 1000X. Em A: Formas arredondadas e alongadas com dois núcleos; B: Forma arredondada com dois núcleos permitindo observar os grânulos nucleares; C: Forma arredondada com apenas um núcleo; D: Forma alongada e ameboíde com dois núcleos bem corados. Figura 5. Gel de agarose 1% das 8 amostras positivas em lâminas coradas com Hematoxilina Férrica para D. fragilis. M: Marcador molecular (Kb+); 1-7 e 9: amostras positivas em lâminas; 8: Controle Positivo cedido pelo C. Graham Clark; 10: Controle negativo. Caracterização molecular de D. fragilis: Não foi possível amplificar as amostras fecais positivas para D. fragilis identificadas em microscopia de luz, não obstante as várias tentativas realizadas com o objetivo de confirmar a presença deste parasita por intermédio da PCR. Numerosos ensaios de PCR foram realizados modificando-se as temperaturas de anelamento, porém, não foram obtidos resultados satisfatórios Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 Figura 4. Caracterização morfológica de B. hominis em lâminas, com coloração de Hematoxilina férrica, visualizadas em microscópio óptico com aumento 1000X. Em A: Forma vacuolar com dois núcleos e vacúolo sem granuações; B: Forma multivacular com dois núcleos e vacúolo com granulações; C: Forma vacuolar com dois núcleos e vacúolo sem granulações; D: Forma vacuolar com quatro núcleos e vacúolo sem granulações. Figura 6. Gel de agarose 1 % das 8 amostras positivas em lâminas para B. hominis. M: Marcador molecular (Kb+); 1-7: amostra positivas em lâminas; 9: Controle negativo. e apenas houve a amplificação do controle positivo cedido pelo C. Graham Clark (Figura 5). Além disso, foram realizados procedimentos de sedimentação com isopropanol, conforme citado por MENGHI et al., (2006)7, para ajudar na amplificação do DNA, porém com resultado negativo. Caracterização molecular de B. hominis: A caracterização molecular de B. hominis demonstra 129 T. T. CASTRO e C. A. CUBA Figura 7. Caracterização molecular das 5 amostras negativas em lâminas corada com Hematoxilina Férrica para B. hominis. M: Marcador molecular (Kb+); 1-5: amostras negativas em lâminas; 6: Controle negativo. que das 8 amostras positivas em lâminas, 6 foram confirmadas com a PCR (Figura 6). No gel de agorose 1% verificou-se a ocorrência de uma banda de 550 - 590 pb diagnóstica de B.hominis. Ainda, das 5 amostras negativas em lâminas, duas foram positivas para B. hominis (Figura 7). DISCUSSÃO Embora a amostragem estudada neste trabalho não seja representativa da população em geral do Distrito Federal, a frequência de D. fragilis encontrada neste estudo, 31,5% das amostras, foi considerada elevada. O resultado encontrado é compatível com o citado por Johnson et al., (2004) que variou entre 0% a 52%, dependendo da localidade pesquisada. No Brasil, existem outros estudos que se enquadram nos referidos valores podendo-se citar o de Lainson e Silva (1999), realizado com pacientes HIV/AIDS positivos que apresentou uma frequência de 3%. Em outros países, como na Austrália, observouse a prevalência de 0,9% de D. fragilis. Já na Venezuela foi encontrada a prevalência de 0,5% (Valle et al., 2006). Resultado diverso foi obtido em estudo com crianças, em que foi reportada a presença de D. fragilis em 82% dos casos (Preiss et al., 1991). Verifica-se que, não obstante a frequência da infecção por D. fragilis encontrada por nosso estudo (31,5%), referente aos pacientes atendidos no HUB 130 (DF), ser superior aos resultados encontrados, como por exemplo, na Austrália, na Venezuela e até mesmo em outros estudos realizados no Brasil, ainda assim, ela está dentro dos limites citados acima. Os fatores que podem ter influenciado no resultado encontrado por este estudo, estão relacionados, principalmente, ao emprego de técnicas de diagnóstico coprológicas apropriadas na coleta e processamento das amostras e à falta de bons hábitos de higiene da população pesquisada, falta de saneamento básico e ao desconhecimento de técnicas adequadas de manuseios de alimentos dos indivíduos parasitados. O resultado obtido neste trabalho não é compatível com a realidade encontrada na maioria dos laboratórios de análises clínicas do Brasil. Verificase que muitos destes laboratórios possuem técnicos sem familiaridade com a morfologia do D. fragilis, outros não possuem infra-estrutura laboratorial para manter o organismo vivo (in vitro) ou, simplesmente, não realizam uma identificação adequada do D. fragilis (Lainson e Silva 1999). É importante ressaltar que a coloração de Hematoxilina Férrica é a mais indicada para realização de lâminas permanentes para o parasita D. fragilis, já que a membrana nuclear deste protozoário é delicada e não apresenta cromatina periférica( Stark et al., 2006b) e, portanto, alguns autores consideram seu uso obrigatório (Girginkardesler et al., 2003). Outro ponto importante observado por este estudo, diz respeito à frequência de D. fragilis levando-se em conta o sexo dos pacientes contaminados. Das 28 amostras positivas para D. fragilis, 19 foram do sexo feminino (67,9%) e 9 do sexo masculino (32,1%). De acordo com Yang e Scholten (1977), a infecção é maior em representantes do sexo feminino do que no sexo masculino, isso também foi observado neste estudo. A totalidade dos casos positivos para D. fragilis foram encontrados na faixa etária de 1 a 65 anos, sendo que a de maior frequência foi entre a faixa de 6 a 10 anos, corroborando os dados encontrados da literatura (Yang e Scholten 1977, Norberg et al., 2003, Girginkardesler et al., 2008). Os resultados foram variados no que se refere à forma e ao tamanho de D. fragilis. Em relação ao tamanho, o menor diâmetro encontrado foi entre 3 µm a 10 µm e o maior diâmetro foi de 3 µm a 17 µm. Considera-se o tamanho de D. fragilis entre a Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 DIENTAMOEBA FRAGILIS E BLASTOCYSTIS HOMINIS EM BRASÍLIA faixa de 3,5 (Johnson et al., 2004) a 20 µm, sendo típicos entre 5-15 µm (Stark et al., 2006b). Em relação ao número de núcleos, verificou-se que os trozofoítos de D. fragilis são, geralmente, binucleares. Todavia, de 30 a 40% são mononucleados (Menghi et al., 2005). Nas séries observadas foram identificadas 3 amostras com trofozoítos com apenas 1 núcleo. A frequência de B. hominis neste estudo foi de 49,4% das amostras fecais positivas. Em estudos realizados no Brasil, foram observadas frequências mais baixas entre 15,1% e 16,7% (Nascimento e Montinho 2005, Martins et al., 2007). Na Venezuela, em estudo sobre predomínio de B. hominis, foi de 47% (Valle et al., 2006). Outro estudo revelou que a prevalência de B. hominis é superior a 50% nos países em desenvolvimento (Stenzel e Boreham 1996). A totalidade dos casos positivos para B. hominis está dentro da faixa etária de 1 a 81 anos, sendo que a faixa de idade mais frequente foi a de 51 a 55 anos. Alguns autores reportaram as faixas etárias de 0 a 6 (Martins et al., 2007) e a de 30 a 40 (Doyle et al., 1990) anos como as mais freqüentes. Em B. hominis, a forma vacuolar foi frequente em todas as amostras positivas. O tamanho observado variou de 3 µm a 12 µm do menor diâmetro e 4 µm a 12 µm do maior diâmetro, sendo que o tamanho mais frequente foi 5 µm do menor diâmetro e 5 µm do maior diâmetro. O tamanho da forma vacuolar pode variar significamente entre 2 a 200 µm em diâmetro, com médias de 4 a 15 µm de diâmetro) Stenzel e Boreham 1996). A forma multivacuolar foi encontrada em apenas uma amostra, seu diâmetro foi de 5 µm do menor diâmetro e 5 µm do maior diâmetro. Geralmente esta forma apresenta seu tamanho entre 5 a 8 µm (Abe et al., 2002). O poliparasitismo ocorreu em 46 amostras (51,7%). Desta amostras, 17,4% apresentaram associação entre D. fragilis e B. hominis. Associações entre D. fragilis e B. hominis também foram encontradas em outros estudos (Ayadi y Barri 1999, Sheehan et al., 1986, Girginkardesler et al., 2008). Pode-se, portanto, inferir que a co-infecção entre D. fragilis e B. hominis é comum. A caracterização molecular de D. fragilis foi mal sucedida. Apenas o controle positivo foi amplificado, mostrando a correspondente banda diagnóstica de 412 pb. Rev. Ibero-Latinoam. Parasitol. (2010); 69 (2): 124-133 Várias hipóteses podem ser levantadas para justificar este resultado: 1) A obtenção do resultado negativo pode estar associado à existência de grupos de D. fragilis geneticamente distintos, conforme estudo de análise baseado na sequência de genes do rRNA, pequena subunidade (16-S), no qual verificouse a existência de grupos geneticamente distintos de D. fragilis (Johnson e Clark 2000). Assim, as amostras estudas podem ser geneticamente diferentes de outras regiões. De modo que os primers desenhados por Johnson e Cark (2000) e empregados também por Menghi et al., (2005) podem não ter funcionado para as amostras deste estudo; 2) Outra justificativa decorre do fato de que, apesar de as amostras serem positivas em microscopia óptica, poucos protozoários de D. fragilis foram encontrados em cada uma delas, o que pode ter influenciado na quantidade de DNA extraído de cada amostra, não sendo possível, em razão da pouca quantidade, sua amplificação via PCR; 3) O insucesso da ferramenta molecular, pode ter relação com o fato de as amostras fecais não terem sido fixadas. Assim, por não apresentar cisto, mas apenas trofozoíto, pode ter ocorrido uma rápida degeneração do DNA do protozoário; 4) Pode-se, também, considerar a presença de inibidores de DNA nas amostras analisadas, mesmo com a utilização de BSA como bloqueador na PCR. A caracterização molecular de B. hominis demonstrou que das 8 amostras positivas em lâminas, 6 foram confirmadas com a PCR. A diferença entre o resultado de lâmina e molecular pode ter acontecido pelo fato de B. hominis apresentar uma extensiva diversidade genética (Stensvold et al., 2007). Em análises moleculares baseadas na sequência de genes do rRNA (SSU), pequena subunidade (16-S), isolados de humanos, são geneticamente diversificados em 9 subgrupos (Ozyurt et al., 2008). Portanto, os primers desenhados para identificação de B. hominis podem não ter funcionado nas 2 amostras positivas em lâminas, pois há a possibilidade de estas amostras serem geneticamente diferente das outras 6 amostras positivas. Das 5 amostras negativas em lâminas, duas fo- 131 T. T. CASTRO e C. A. CUBA ram positivas para B. hominis, fato que confirma a maior sensibilidade da ferramenta molecular. Outra justificativa encontrada pode estar relacionada com o fato de este parasito apresentar seis formas diferentes, o que dificulta sua identificação em lâmina (Abe et al., 2002). Vale ressaltar que algumas formas de B. hominis podem ser facilmente confundidas com trofozoítos de D. fragilis levando a erros de sua real prevalência nos inquéritos coprológicos. Concluí-se que B. hominis e D. fragilis são parasitas intestinais de grande importância para a saúde pública e este estudo revela que estes parasitas estão sendo negligenciados, pois sua freqüência é elevada e há escassez de estudos detalhados no Brasil. Além disso, a maioria dos laboratórios de diagnóstico clínico não sabem identificar ou não utilizam técnicas adequadas de coloração e de lâminas permanentes para diagnosticar estes parasitas. Por fim, cabe esclarecer que estudos moleculares com D. fragilis continuam a ser realizados em nosso laboratório, para um melhor diagnóstico e caracterização deste parasita. REFERÊNCIA 1. ABE N, NAGOSHI M, TAKAMI K, SAWANO Y, YOSHIKAWA H. 2002. A survey of Blastocystis sp. in livestock, pets, and zoo animals in Japan. Vet Parasitol 106: 203-212. 2. 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