Publicação - PPGAlimentos FURG

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA
DE ALIMENTOS
GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS OBTIDOS ENZIMATICAMENTE NO
DESENVOLVIMENTO DE BEBIDAS LÁCTEAS COM POTENCIAL SIMBIÓTICO
ENGª DE ALIMENTOS RENATA ALINE DOS SANTOS DA FONSECA
Profª. Drª. Janaína Fernandes de Medeiros Burkert
Orientadora
RIO GRANDE, RS
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS OBTIDOS ENZIMATICAMENTE NO
DESENVOLVIMENTO DE BEBIDAS LÁCTEAS COM POTENCIAL SIMBIÓTICO
Engª Renata Aline dos Santos da Fonseca
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos necessários para obtenção do
título de Mestre em Engenharia e Ciência
de Alimentos.
Profa. Dra. Janaína Fernandes de Medeiros Burkert
Orientadora
Profa. Dra. Eliana Badiale-Furlong
Co-orientadora
RIO GRANDE, RS
2010
Aos meus pais Renato e Verena e meu irmão Thiago pelo zelo e amor incondicionais.
Ao meu grande amor e companheiro Pablo pelo incentivo.
Dedico.
ii
“Precisamos dar um sentido humano às nossas construções. E, quando o amor
ao dinheiro, ao sucesso nos estiver deixando cegos, saibamos fazer pausas
para olhar os lírios do campo e as aves do céu"
(Érico Veríssimo)
“Aprendi através da experiência amarga a
suprema lição: controlar minha ira e torná-la como o calor que é convertido
em energia. Nossa ira controlada pode ser convertida numa força capaz de
mover o mundo.”
(Mahatma Gandhi)
“Aprenda como se você fosse viver para sempre. Viva como se você fosse
morrer amanhã.”
(Mahatma Gandhi)
iii
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Renato e Verena que tanto me apoiaram e me incentivaram,
norteando-me sempre no caminho correto e estando ao meu lado de qualquer
forma. Obrigada pelo carinho, amor e confiança. Sem vocês não seria quem eu
sou e não estaria aqui.
Ao meu irmão/amigo Thiago que me acompanhou, ajudou e incentivou se
orgulhando dos meus passos. Obrigada por compartilhar tudo em minha vida
sempre.
Ao meu amado/companheiro/amigo Pablo pelo amor, carinho, dedicação,
preocupação e paciência. Obrigada por me dar tranqüilidade e me mostrar o
significado de amor e companheirismo verdadeiros.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Engenharia e Ciência de
Alimentos da FURG pelo aprendizado no exercício da docência, em especial: a
Professora Janaína pela orientação; ao Professor Carlos André pela assistência; a
Professora Maria Isabel pelas contribuições e sugestões na realização da análise
sensorial e a Professora Leonor, pessoa ímpar, dedicada e sempre disposta a me
auxiliar, profissional admirável que conduz o trabalho com paixão e demonstra o
verdadeiro sentido da pesquisa.
Aos funcionários, técnicos e alunos da FURG pelos serviços e disposição em
auxiliar, principalmente ao pessoal do LTA pela disponibilidade do texturômetro,
digestor e destilador de proteínas e a Lutiane, técnica do Laboratório de Análise
Sensorial e Controle de Qualidade.
Às Professoras Rosane e Mirian do Departamento de Ciência de Alimentos da
UFPel pela oportunidade e apoio na realização do ensaio biológico.
À todo pessoal do Biotério Central da UFPel pelo espaço, material e trabalho
possibilitando o desenvolvimento do ensaio biológico.
À Professora Carmem Lúcia do Hospital Veterinário da UFPel e Professora
Andréia da UCPel pelo auxílio nas análises pós-eutanásia.
Aos meus “ajudantes” Ruan e Kelly, sem os quais o trabalho teria sido
consideravelmente mais difícil.
À Lidiane, Valéria e Adriana pela ajuda e responsabilidade para conduzir o
acompanhamento biológico.
Aos meus amigos e companheiros do laboratório de Bioprocessos, Carolina,
Débora, Thaís e Mariano, que me proporcionaram dias mais leves, tornaram as
iv
dificuldades mais amenas e me apoiaram em todos os momentos estressantes;
especialmente a Elisane, admirável como pessoa e profissional.
À minha amiga Joana que sempre me apoiou e esteve ao meu lado. Que era minha
dupla de trabalhos e foi imprescindível quando estive no intercâmbio na URI em
Erechim, me enviando o material das aulas e os artigos os quais eu não tinha
acesso.
À minha prima/amiga Luana que sempre esteve “ao meu lado” mesmo de longe
pra me ajudar, ouvir, incentivar e se orgulhar.
À todos que se dispuseram a realizar a análise sensorial e que disponibilizaram
parte do seu tempo para isso.
À Silvana, Camila e Ieda pela estadia em Erechim.
Aos colegas e professores do mestrado em Engenharia de Alimentos da URI.
Às pessoas especiais que me apoiaram, motivaram e contribuíram, direta ou
indiretamente para execução deste trabalho e a continuar até o final desta
jornada.
Ao material gentilmente doado pelas empresas: Danisco Brasil Ltda., Elegê,
Novozymes Latin America Ltda., LINEA®, Borsato, Duas Rodas, Christian
Hansen, Duas Rodas e Germinal.
Ao Programa de Cooperação Acadêmica (PROCAD) da CAPES e à FAPERGS, pelo
apoio financeiro ao projeto.
À CAPES pela concessão de bolsa de pós-graduação.
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... ix
LISTA DE QUADROS .................................................................................................. xi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... xii
RESUMO ................................................................................................................... xiii
ABSTRACT ................................................................................................................ xiv
CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO GERAL........................................................................15
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 2
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 4
2.1. Objetivo geral ................................................................................................ 4
2.2. Objetivos específicos..................................................................................... 4
CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................. 5
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 6
1.1. Bebidas lácteas fermentadas............................................................................. 6
1.1.1. Mercado do iogurte..................................................................................... 7
1.1.2. Fermentação láctica ................................................................................... 8
1.1.3. Culturas utilizadas na fabricação de bebidas lácteas fermentadas ............. 9
1.2. Probióticos........................................................................................................11
1.2.1. Critérios de seleção ...................................................................................13
1.2.2. Características dos principais gêneros probióticos ....................................14
1.2.3. Consumo de probióticos ............................................................................16
1.2.4. Fatores de crescimento .............................................................................17
1.3. Prebióticos........................................................................................................18
1.3.1. Oligossacarídeos .......................................................................................20
1.3.2. Galacto-oligossacarídeos ..........................................................................22
1.4. Alimentos Funcionais .......................................................................................25
1.5. Soro de leite .....................................................................................................27
1.6. Avaliação biológica...........................................................................................28
CAPÍTULO III – DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO.............................................30
ARTIGO 1 – AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DO SORO DE LEITE E SORO DE LEITE
MODIFICADO ENZIMATICAMENTE RICO EM GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS...32
RESUMO ....................................................................................................................32
ABSTRACT .................................................................................................................33
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................34
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................35
2.1. Material ............................................................................................................35
2.1.1. Matérias-primas para síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS).............35
2.1.2. Ingredientes para ensaio biológico.............................................................35
2.1.3. Animais......................................................................................................35
2.2. Metodologia......................................................................................................35
2.2.1. Síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS) ..............................................35
2.2.2. Elaboração das dietas ...............................................................................36
2.2.3. Determinação da composição proximal das dietas ....................................38
2.2.4. Condições do experimento biológico .........................................................39
2.2.4.1. Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA) ............................................40
2.2.4.2. Quociente de Eficiência Protéica (PER)................................................40
2.2.4.3. Coleta de sangue, eutanásia e obtenção de órgãos .............................40
2.2.4.4. Medidas biométricas e retiradas dos órgãos .........................................41
2.2.4.5. Análise dos conteúdos dos cecos .........................................................42
2.2.5. Análise estatística......................................................................................42
vi
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................43
3.1. Composição proximal das dietas experimentais ...............................................43
3.2. Experimento biológico ......................................................................................44
3.2.1. Acompanhamento......................................................................................44
3.2.2. Avaliações biométricas ..............................................................................49
3.2.3. Avaliações dos conteúdos do ceco............................................................53
3.2.4. Avaliações hematológicas .........................................................................54
3.2.5. Determinações bioquímicas.......................................................................59
4. CONCLUSÕES .......................................................................................................64
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................65
ARTIGO 2 - BEBIDAS LÁCTEAS FERMENTADAS POTENCIALMENTE
SIMBIÓTICAS .............................................................................................................73
RESUMO ....................................................................................................................73
ABSTRACT .................................................................................................................74
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................75
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................76
2.1. Micro-organismos, matérias-primas e insumos.................................................76
2.2. Síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS) .....................................................77
2.3. Fermentação ....................................................................................................78
2.4. Análises físico-químicas ...................................................................................79
2.4.1. Determinação do pH ..................................................................................79
2.4.2. Determinação de acidez titulável ...............................................................79
2.4.3. Textura Instrumental..................................................................................79
2.4.4. Sinérese ....................................................................................................80
2.4.5. Composição proximal ................................................................................80
2.5. Análise sensorial ..............................................................................................80
2.5.1. Desenvolvimento das formulações ............................................................80
2.5.2. Levantamento de termos ...........................................................................83
2.5.3. Teste de ordenação...................................................................................83
2.5.4. Teste de diferença do controle...................................................................83
2.5.5. Comparação pareada ................................................................................83
2.5.6. Avaliação da intensidade do gosto salgado ...............................................84
2.5.7. Teste de aceitação e intenção de compra..................................................84
2.6. Avaliação da adição do prebiótico antes e após o processo fermentativo ........85
2.7. Análises microbiológicas ..................................................................................86
2.7.1. Contagem de Lactobacillus acidophilus .....................................................86
2.7.2. Contagem de Bifidobacterium spp. ............................................................86
2.8. Análise estatística.............................................................................................86
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................87
3.1. Caracterização da matéria-prima......................................................................87
3.2. Desenvolvimento das formulações ...................................................................88
3.2.1. Levantamento de termos ...........................................................................88
3.2.2. Teste de ordenação...................................................................................89
3.2.3. Teste de diferença do controle...................................................................91
3.2.4. Comparação pareada ................................................................................92
3.2.5. Avaliação da intensidade do gosto salgado ...............................................93
3.2.6. Teste de aceitação e intenção de compra..................................................94
3.3. Influência da adição de GOS na contagem de probióticos................................96
3.4. Caracterização das formulações finais .............................................................98
3.5. Influência da embalagem na viabilidade de probióticos durante o
armazenamento ....................................................................................................103
4. CONCLUSÕES .....................................................................................................109
vii
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................110
CAPÍTULO IV – CONCLUSÃO GERAL.....................................................................115
1. CONCLUSÃO GERAL...........................................................................................116
CAPÍTULO V – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................117
1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................118
CAPÍTULO VI – APÊNDICES E ANEXOS ................................................................118
APÊNDICE 1.............................................................................................................137
APÊNDICE 2.............................................................................................................138
APÊNDICE 3.............................................................................................................139
APÊNDICE 4.............................................................................................................140
APÊNDICE 5.............................................................................................................141
APÊNDICE 6.............................................................................................................142
APÊNDICE 7.............................................................................................................143
APÊNDICE 8.............................................................................................................144
ANEXO 1 ..................................................................................................................145
ANEXO 2 ..................................................................................................................146
viii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1. Alguns benefícios, aplicações terapêuticas e critérios de seleção atribuídos
aos micro-organismos probióticos. ..............................................................................13
Tabela 2. Exemplo de bactérias ácido lácticas com características probióticas...........14
CAPÍTULO III – DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO
MODIFICADO ENZIMATICAMENTE RICO EM GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS
Tabela 1. Ingredientes e nutrientes das dietas controle (C), com soro de leite (S) e com
soro de leite modificado rico em GOS (G). ..................................................................37
Tabela 2. Composição proximal (média ± desvio padrão) do soro de leite e dietas
controle (C), com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G)...43
Tabela 3. Pesos inicial e final; consumo alimentar total (28 dias) e diário, ganho de
peso total (28 dias) e diário, Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA) e Quociente de
Eficiência Protéica (PER) – média ± desvio padrão – para os para os grupos controle
(C), com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G). ...............46
Tabela 4. Distância braço a braço e comprimento do focinho a cauda dos animais
(média ± erro padrão) para os grupos controle (C), com soro de leite (S) e com soro de
leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias..........................................................49
Tabela 5. Valores médios ± desvio padrão dos pesos dos órgãos e porcentagens dos
pesos órgãos/pesos corporais dos hamsters para os grupos controle (C), com soro de
leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias. ....................51
Tabela 6. Contagem de micro-organismos probióticos e pH dos conteúdos presentes
nos cecos dos hamsters dos grupos controle (C), com soro de leite (S) e com soro de
leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias..........................................................53
Tabela 7. Valores hematológicos médios ± desvio padrão para os grupos controle (C),
com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias. 55
Tabela 8. Valores bioquímicos (média ± desvio padrão) para os grupos controle (C),
com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias. 59
ARTIGO
2
–
BEBIDAS
LÁCTEAS
FERMENTADAS
POTENCIALMENTE
SIMBIÓTICAS
Tabela 1. Composição proximal da matéria-prima (média ± erro padrão). .................87
Tabela 2. Somatório (média ± desvio padrão) da pontuação do teste de ordenação..89
Tabela 3. Doçura e sabor residual no teste de diferença do controle. ........................91
ix
Tabela 4. Intensidade do gosto salgado (média ± desvio padrão) para as bebidas
lácteas fermentadas sabor morango. ..........................................................................93
Tabela 5. Aceitação e intenção de compra das bebidas lácteas.................................94
Tabela
6. Contagem de micro-organismos probióticos e pH das bebidas lácteas
adicionadas de GOS antes e após o processo fermentativo. ......................................96
Tabela 7. Caracterização das bebidas lácteas (média ± erro-padrão) após 24 h de
maturação. ..................................................................................................................99
Tabela 8. Contagem de L. acidophilus em bebidas lácteas fermentadas sem GOS
(G0), 3% de GOS de soro leite modificado (S3) e 3% de GOS de lactose
monohidratada (L3) estocadas por 28 dias em embalagens de polietileno e de vidro.
..................................................................................................................................104
Tabela 9. Contagem de Bifidobacterium spp. em bebidas lácteas fermentadas sem
GOS (G0), 3% de GOS de soro leite modificado (S3) e 3% de GOS de lactose
..................................................................................................................................105
x
LISTA DE QUADROS
ARTIGO
2
–
BEBIDAS
LÁCTEAS
FERMENTADAS
POTENCIALMENTE
SIMBIÓTICAS
Quadro 1. Formulações elaboradas no desenvolvimento das bebidas lácteas............82
Quadro 2. Atributos levantados para as bebidas lácteas avaliadas. ............................88
xi
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Vias metabólicas na produção de ácido lático por bactérias (GARCÍA,
QUINTERO & LÓPEZ-MUNGUÍA, 1993 apud BERNAL, 2004).................................... 9
Figura 2. Relação entre bactérias intestinais e saúde humana. Esquema proposto por
Mitsouka (LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001). ................................................12
Figura 3. Representação esquemática de produção de oligossacarídeos não digeríveis
- ONDs (adaptado de SAKO; MATSUMOTO & TANAKA, 1999). ................................20
Figura 4. Rotas enzimáticas para a produção de GOS (MARTINS & BURKERT, 2009).
....................................................................................................................................23
MODIFICADO ENZIMATICAMENTE RICO EM GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS
Figura 1. Ilustração da confecção das dietas de acordo com Moreira, Marco & Feddern
(2009). a) Ingredientes misturados; b) Preparo dos cilindros; c) Corte dos pellets; d)
Pellets dispostos para secagem. .................................................................................38
Figura 2. a) Gaiola onde os animais foram mantidos; b) Sala com as gaiolas. ............39
Figura 3. a) Animal na Campânula; b) Venopunção e exanguinação. .........................41
Figura 4. a) Medição de membros torácicos; b) Medição de vértice-cóccix. ................41
Figura 5. Órgãos dos hamsters: a) fígado; b) ceco; c) rins e d) intestino delgado. ......42
Figura 6. Variação de peso dos hamsters para as dietas C, S e G durante 28 dias. ...44
ARTIGO
2
–
BEBIDAS
LÁCTEAS
FERMENTADAS
POTENCIALMENTE
SIMBIÓTICAS
Figura 1. a) Processo de síntese; b) Soro de leite em pó e lactose monohidratada
modificados enzimaticamente por β-galactosidase enriquecidas com GOS. ...............78
Figura 2. Processo fermentativo com controle automático de temperatura e
acompanhamento de pH. ............................................................................................79
Figura 3. Bebidas lácteas fermentadas com aditivos e natural, respectivamente. .......81
Figura 4. Frequência das pontuações das amostras comerciais B, C, D e E em relação
ao teste de ordenação.................................................................................................90
xii
RESUMO
A inclusão de fatores de crescimento em bebidas lácteas fermentadas com culturas
microbianas probióticas vem sendo recomendada para obtenção de um alimento
funcional. Desta forma, os galacto-oligossacarídeos (GOS), considerados novos
ingredientes, estão apresentando grande potencial para melhorar a qualidade destes
alimentos, sendo denominados como prebióticos devido às suas características
fisiológicas e tecnológicas. Podem ser produzidos a partir de lactose, através de uma
reação enzimática com o uso da enzima β-galactosidase. Devido ao fato de ainda não
possuir um número elevado de estudos, este trabalho teve como objetivos: a) avaliar o
potencial prebiótico e nutricional do soro de leite e do mesmo modificado
enzimaticamente rico em GOS através de ensaio biológico em hamsters, durante 28
dias; b) desenvolver de bebidas lácteas fermentadas potencialmente simbióticas que
apresentem aceitação sensorial e qualidade tecnológica característica; c) verificar as
contagens de probióticos durante 28 dias em bebidas armazenadas sob refrigeração e
embaladas em polietileno e vidro. As dietas elaboradas com soro de leite e soro de
leite modificado rico em GOS incrementaram o ganho de peso, o coeficiente de
eficiência alimentar e o quociente de eficiência protéica. Os pesos dos animais, as
relações dos pesos dos órgãos com os pesos corporais e as medidas braço a braço e
vértice-cóccix demonstraram a proporcionalidade e normalidade dos mesmos. Nos
conteúdos dos cecos obtidos no 28º dia, as contagens de 108 UFC g-1 (lactobacilos) e
107 UFC g-1 (bifidobactéria) não diferiram nos grupos estudados. Todavia, para o pH
foram alcançados valores menores que evidenciaram que a utilização do soro de leite
e do soro de leite modificado rico em GOS estimulou possivelmente o crescimento de
probióticos. As determinações hematológicas e os parâmetros bioquímicos avaliados
para os hamsters foram considerados dentro do recomendado. Desta forma, os
resultados sugeriram que o soro modificado enzimaticamente enriquecido com GOS e
o soro de leite, apresentaram efeitos favoráveis nutricionalmente possuindo potencial
em favorecer o crescimento de probióticos na microflora intestinal podendo tornar-se
uma alternativa no desenvolvimento de alimentos funcionais simbióticos. Assim, após
a realização de estudos sensoriais, foi possível obter bebidas lácteas fermentadas
adicionadas de GOS obtidas do soro de leite e da lactose monohidratada com
aceitação sensorial em torno de 70%, com contagem de lactobacilos e bifidobactérias
acima do preconizado pela legislação vigente e com características físico-químicas e
tecnológicas dentro dos Padrões de Identidade e Qualidade. Um estudo da adição de
GOS antes e após a fermentação mostrou que o GOS, durante o processo
fermentativo, dificultou o decréscimo do pH, enquanto as formulações com adição de
GOS, após a fermentação, alcançaram o pH e contagens de probióticos
característicos para o produto lácteo fermentado funcional. Em estocagem refrigerada,
foi possível recuperar contagens de probióticos acima do requerido pela legislação,
durante 28 dias, apenas nas embalagens de vidro. Neste contexto, foi possível obter
bebidas lácteas fermentadas sabor morango aceitáveis sensorialmente e com
potencial simbiótico, assim como alcançar por 28 dias bebidas lácteas consideradas
probióticas, se armazenadas em embalagens de vidro.
Palavras-chaves: ensaio biológico, galacto-oligossacarídeos, probióticos, análise
sensorial.
xiii
ABSTRACT
The growth factors inclusion in fermented dairy beverages with probiotic microbial
cultures has been recommended for obtaining a functional food. Thus the
galactooligosaccharides (GOS), regarded as new ingredients are showing great quality
improve potential of those being referred to as probiotics due to their physiological
characteristics and technology. It can be produced from lactose by an enzymatic
reaction using the enzyme β-galactosidase. However more studies need to be found, in
this sense, the objective of this work is: a) evaluate the potential prebiotic and nutrition
whey and even modified enzymatically rich in GOS by bioassay in hamsters for 28
days, b) development of potentially symbiotic fermented milk beverages which have
sensory acceptance and technological quality characteristic c) verify the probiotics
counts for 28 days when stored under refrigeration and beverages in polyethylene and
glass packages. Diets with whey and modified whey rich in GOS increased the weight
gain, feed efficiency coefficient and the protein efficiency ratio. The animals weights,
the organ weights relationships with body weights and measures to arm-arm and
vertex-coccyx demonstrated the same normality proportionality. The contents of cecum
obtained on day 28 counts of 108 CFU g-1 (lactobacilli) and 107 CFU g-1 (bifidobacteria)
did not differ between groups. However, for pH, lower values were achieved showing
that the whey use and modified whey rich in GOS possibly probiotics growth
stimulates. Measurements of the hematologic and biochemical parameters for
hamsters evaluated were seen within recommended. Therefore, the results suggest
that the modified whey rich in GOS and whey, have nutritionally favorable effects
having potential to encourage the probiotics growth in the intestinal microflora may
become an alternative in developing functional foods symbiotic. So, after sensory
studies, was obtained fermented milk beverages with added GOS obtained from whey
and lactose monohydrate with sensory acceptance around 70% with counts of
lactobacilli and bifidobacteria above recommended by existing legislation and with
physical-chemical and technological within the Identity and Quality Standards. An
addition study of GOS before and after fermentation showed that the GOS during the
fermentation process hindered the pH decrease while the formulations with GOS
addition after fermentation pH and reached probiotics counts for the characteristic
functional fermented milk product. In refrigerated storage was possible to retrieve
scores of probiotics above required by law for 28 days only in glass packages. In this
context, it was possible to obtain fermented milk beverages strawberry acceptable
sensory and symbiotic potential, as achieved by 28 days considered probiotic dairy
beverages, if stored in glass packages.
Key-Words: biological assay, galactooligosaccharides, probiotics, sensory analysis.
xiv
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO GERAL
CAPÍTULO I 2
1. INTRODUÇÃO
A crescente exigência dos consumidores preocupados com a manutenção
da saúde e bem-estar motiva o interesse em pesquisa e desenvolvimento de novos
produtos lácteos que, além de satisfazerem requerimentos sensoriais e nutricionais
básicos, desempenham uma terceira função com efeitos fisiológicos benéficos, os
alimentos funcionais, em que se destacam os probióticos e os prebióticos (VILELA,
2002; RISSO, 2004; MARTINS & BURKERT, 2009).
Bebida Láctea Fermentada é o produto obtido a partir de leite ou leite
reconstituído e/ou derivados de leite, reconstituídos ou não, com ou sem adição de
outros ingredientes, onde a base láctea represente pelo menos 51% (m/m) do total de
ingredientes do produto, fermentado mediante a ação de cultivo de micro-organismos
específicos, e/ou adicionado de leite fermentado e/ou outros produtos lácteos
fermentados, e que não poderá ser submetido a tratamento térmico após a
fermentação. A contagem total de bactérias lácticas viáveis no produto final, em
unidades formadoras de colônia (UFC), deve ser no mínimo de 106 g-1 para os cultivos
láticos específicos empregados, durante todo o prazo de validade (BRASIL, 2005).
Alimentos funcionais, além de suas funções nutricionais possuem em sua
composição uma ou mais substâncias que atuam modulando e ativando os processos
metabólicos, melhorando as condições de saúde pelo aumento da efetividade do
sistema imune, promovendo o bem-estar das pessoas, prevenindo o aparecimento
precoce de alterações patológicas e doenças degenerativas, que levam a redução da
longevidade. Entre estes estão os probióticos e prebióticos que afetam beneficamente
a composição da microbiota do intestino e aportam ganhos fisiológicos atraindo a
atenção de pesquisadores, indústrias e consumidores (CHOCKCHAISAWASDEE et
al., 2005; THAMER & PENNA, 2006; MARTINS & BURKERT, 2009).
Entre eles estão os probióticos, que são micro-organismos vivos que
beneficiam o hospedeiro por melhorar seu equilíbrio intestinal (BRASIL, 2002). Esses
organismos não são patógenos, nem toxigênicos, devem sobreviver ao processo de
armazenamento e a passagem pelo estômago e intestino delgado (CRITTENDEN &
PLAYNE, 1996). Os probióticos são responsáveis pelos seguintes efeitos benéficos:
manutenção normal da microbiota intestinal, atividade anticarcinogênica, estímulo ao
sistema imunológico e melhora no valor nutricional de alimentos (MARX, WINKLER &
HARTMEIER, 2000).
CAPÍTULO I 3
Os prebióticos são considerados alimentos não digeríveis que beneficiam o
hospedeiro estimulando seletivamente o crescimento e/ou a atividade das bactérias
benéficas, resistentes no cólon intestinal, com efeito antagônico, reduzindo compostos
tóxicos dos grupos menos desejáveis (CHOCKCHAISAWASDEE et al., 2005).
Os oligossacarídeos são prebióticos formados de três a dez unidades de
monômeros de hexoses ligados covalentemente através de ligações glicosídicas,
podendo ser produzidos enzimaticamente. Segundo Fooks & Gibson (2002), os
oligossacarídeos estão entre os compostos que proporcionam efeito positivo na
composição da microbiota intestinal, principalmente quando consumidos associados a
micro-organismos
probióticos.
Dentre
os
oligossacarídeos
que
possuem
características prebióticas, somente os fruto-oligossacarídeos (FOS) e os galactooligossacarídeos (GOS) são comprovados (ROBERFROID, 2007).
Considerados oligossacarídeos não digeríveis (ONDs), os GOS são
resistentes à hidrólise das enzimas digestivas intestinais e possuem efeitos fisiológicos
semelhantes aos das fibras dietéticas (MORISHITA et al., 2002). Um benefício
resultante da transformação de lactose em GOS é a produção de um leite com baixa
concentração de lactose. Visto que, é reconhecido o grande número de pessoas que
sofrem de problemas gastrointestinais, devido ao elevado índice de lactose nos
produtos lácteos - intolerância a lactose (CURDA et al., 2005). Os GOS facilitam a
digestão, produzem ácidos graxos de cadeia curta, tem efeito anticarcinogênico por
diminuir substâncias putrefativas originadas pela ingestão de alimentos em geral
(CRITTENDEN & PLAYNE, 1996; CHEN, HSU & CHIANG, 2002; SANTOS, 2006).
Os GOS podem ser produzidos a partir da lactose através de uma reação
enzimática
com
o
uso
da
β-galactosidase
(E.C.3.2.1.23)
conhecida
como
transgalactosilação (CHEN; HSU & CHIANG, 2002). Os produtos obtidos desta reação
são os GOS, glicose e galactose (ALMEIDA, 2003; LISBOA, 2008). O soro de queijo
contém aproximadamente 93% de água, 4,9% de lactose, 1,1% de proteínas, 0,2 a
0,9% de lipídios, 0,25% de ácido lático e 0,6% de sais (SCOTT, 1993; BEM-HASSAN
& GHALY, 1994), e pode ser utilizado em reações enzimáticas catalisadas por βgalactosidase, obtendo GOS da lactose contida no mesmo (LISBOA, 2008).
De acordo com o exposto, este trabalho propõe a avaliação biológica do soro
de leite modificado enzimaticamente rico em GOS e a sua incorporação na elaboração
de bebidas lácteas fermentadas saborizadas podendo tornar-se uma alternativa de
alimento funcional simbiótico.
CAPÍTULO I 4
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Elaboração de bebidas lácteas potencialmente simbióticas fermentadas
com probióticos e adicionadas de galacto-oligossacarídeos, avaliando parâmetros
microbiológicos, tecnológicos, sensoriais e nutricionais.
2.2. Objetivos específicos
- Investigar, através de ensaio biológico, a influência do soro de leite e do
soro de leite modificado rico em GOS na dieta de hamsters durante 28 dias;
- Desenvolver bebidas fermentadas com potencial simbiótico adicionadas
de GOS obtidos do soro de leite e da lactose monohidratada modificados
enzimaticamente;
- Avaliar as contagens de micro-organismos probióticos em bebidas
lácteas fermentadas adicionadas de GOS de soro de leite e de lactose monohidratada
durante 28 dias de estocagem refrigerada.
CAPÍTULO II
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
CAPÍTULO II 6
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. Bebidas lácteas fermentadas
O processo de fermentação é um dos métodos mais antigos de
conservação de alimentos, é considerada uma técnica de fácil execução e custo
reduzido, sendo o seu uso bastante adequado quando outros métodos como o
congelamento e a aplicação de calor se tornam inacessíveis (PORTES, PEREIRA &
COUTINHO 2005).
A exata origem do leite fermentado é difícil de ser estabelecida, entretanto
algumas evidências arqueológicas sugerem que ocorreu entre 5000 e 15000 anos
atrás, em que civilizações de sumérios e babilônios na Mesopotâmia, Faraós no
nordeste da África e indianos na Ásia demonstraram avanços em vários setores
alimentícios, como na agricultura e na produção de fermentados para estender a vida
útil dos alimentos, sendo a acidificação um dos primeiros métodos que visavam a sua
preservação. A palavra "iogurte" é derivada da palavra turco "jugurt" e é um alimento e
bebida tradicional nos Bálcãs e na Ásia Mediterrânea, sendo conhecida por uma
variedade de nomes em diferentes países (TAMIME & ROBINSON, 2000).
No início do século XX, a teoria de Metchnikoff, denominada “Teoria da
Longevidade”, atribuiu ao iogurte vários efeitos benéficos à saúde humana. Para
Metchnikoff, a longevidade dos povos dos Bálcãs era resultado de uma dieta rica em
leite fermentado, contendo um lactobacilo que por muito tempo foi considerado como
L. bulgaricus. Posteriormente, verificou-se que o L. acidophilus deveria ser o microorganismo contido em tais produtos pela afinidade deste com o trato intestinal
humano. Embora esta teoria tenha exagerado no valor do iogurte, influenciou de forma
significativa na sua difusão em vários países da Europa (TAMIME, 2002).
Leite fermentado é resultante do processo de fermentação láctica,
adicionado ou não de frutas, açúcar e outros ingredientes que melhorem sua
apresentação e modifiquem seu sabor. O leite fermentado mais importante
economicamente é o iogurte, obtido da coagulação do leite pela ação de dois microorganismos, Streptococcus salivarius spp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii
spp. bulgaricus, estes fornecem ao organismo uma melhor assimilação de certos
componentes, principalmente a lactose e proteínas (BRANDÃO, 1995). Enquanto
bebida láctea fermentada tem sentido amplo e pode englobar uma série de produtos
fabricados com leite e soro (THAMER & PENNA, 2006) e é definido como o produto
CAPÍTULO II 7
lácteo obtido a partir de leite ou leite reconstituído e/ou derivados de leite,
reconstituídos ou não, com ou sem adição de outros ingredientes, onde a base láctea
represente pelo menos 51% (m/m) do total de ingredientes do produto, fermentado
mediante a ação de cultivo de micro-organismos específicos, e/ou adicionado de leite
fermentado e/ou outros produtos lácteos fermentados, e que não poderá ser
submetido a tratamento térmico após a fermentação (BRASIL, 2005).
O iogurte constitui uma rica fonte de proteínas, cálcio, fósforo, vitaminas e
carboidratos. O consumo deste produto está relacionado à imagem positiva de
alimento saudável e nutritivo, associado as suas propriedades sensoriais (TEIXEIRA et
al., 2000). Também pode ser atribuído à preocupação crescente de consumo de
produtos naturais, e os benefícios que o iogurte traz ao organismo, como: facilitar a
ação das proteínas e enzimas digestivas no organismo humano; promover a absorção
de cálcio, fósforo e ferro; ser fonte de galactose – importante na síntese de tecidos
nervosos e cerebrosídeos em crianças; bem como ser uma forma indireta de ingerir
leite. Além disso, devido à ação metabólica das bactérias sobre os componentes do
leite, estes são transformados em substâncias mais simples, podendo ser consumidos
por pessoas com deficiência da enzima lactase em seu organismo e que não toleram a
lactose presente no leite (FERREIRA & TESHIMA, 2000).
1.1.1. Mercado do iogurte
Segundo Tamime & Robinson (2000), existem atualmente no mercado
vários tipos de iogurte classificados de acordo com o processo de elaboração, adição
de ingredientes, composição, consistência e textura, são alguns deles:
• Iogurte tradicional (set yogurt): no qual o processo de fermentação ocorre
dentro da própria embalagem, não sofre homogeneização e o resultado é um produto
firme, mais ou menos consistente;
• Iogurte batido (stirred yogurt): o processo de fermentação ocorre em
fermentadores ou incubadoras com posterior quebra do coágulo;
• Iogurte líquido (fluid yogurt): a fermentação é realizada em tanques e é
comercializado em embalagens plásticas tipo garrafa ou do tipo cartonadas.
As propriedades físicas do iogurte, como consistência/viscosidade do
coágulo, são de grande importância, pois quanto maior o conteúdo em sólidos da
mistura destinada à elaboração do iogurte, maior a consistência e viscosidade do
produto final. A prática utilizada nas indústrias é a adição de leite em pó (integral,
CAPÍTULO II 8
semi-desnatado ou desnatado), com o objetivo de alcançar a concentração de sólidos
necessária para a melhor consistência do iogurte (TAMIME & ROBINSON, 2000).
O iogurte é considerado um derivado do leite que apresenta uma das
melhores margens de rentabilidade para o fabricante de produtos lácteos, devido ao
fato de não passar por nenhum processo de concentração, ou seja, começa com um
volume de matéria-prima e termina com o mesmo volume ou até um pouco mais, já
que alguns ingredientes, como polpas de frutas, são acrescentados. Seu mercado, em
suas diversas categorias, vem demonstrando grande potencial de crescimento nos
últimos 20 anos, registrando em 2004 uma produção média de 400 mil toneladas por
ano, o que representa 76% do total de produtos lácteos no país. No entanto, o seu
consumo no Brasil (3 kg por ano) apresenta-se pequeno quando comparado a países
como a França, Uruguai e Argentina, onde o consumo per capita do produto é de 7 a
19 kg ao ano. Um incremento do consumo deste produto pode ser promovido com o
emprego de técnicas sensoriais que ajustem as características fundamentais deste
alimento, de forma a atender às expectativas do consumidor (SANTANA et al., 2006).
1.1.2. Fermentação láctica
Todas as bactérias lácticas são sacarolíticas e deficientes em muitas rotas
biossintéticas. Em conseqüência, apresentam requerimentos nutricionais complexos
que as forçam a se restringirem a meio ambientes ricos em nutrientes, como o trato
intestinal e o leite. Estas variedades são anaeróbias, mas essencialmente
aerotolerantes. Associado ao crescimento celular se encontra o consumo de
substratos que, no caso dos probióticos, podem ser as diferentes fontes de açúcares
como mono, di e oligossacarídeos e a liberação de produtos finais do seu metabolismo
no meio. Os lactobacilos liberam ácido lático e alguns aldeídos, as bifidobactérias
produzem tanto acetato como lactato (TAMIME, MARSHALL & ROBINSON, 1995).
Existem três vias metabólicas de degradação de carboidratos a ácido
lático, como ilustra a Figura 1. A rota homofermentativa gera lactato com um
rendimento de 2 mols para cada mol de glicose e é, por conseguinte, a de interesse na
produção. A rota heterofermentativa resulta na produção de etanol e gás carbônico
(em alguns casos também ácido acético) em quantidades equimolares a lático, esta
transformação acontece através do metabolismo das pentoses. Alguns microorganismos probióticos utilizam outras rotas metabólicas, como a via do bifidum que
produz 1,5 mols de acetato e 1 de lactato por mol de glicose (TAMIME & ROBINSON,
2000; GARCÍA, QUINTERO & LÓPEZ-MUNGUÍA, 1993 apud BERNAL, 2004).
CAPÍTULO II 9
Figura 1. Vias metabólicas na produção de ácido lático por bactérias (GARCÍA,
QUINTERO & LÓPEZ-MUNGUÍA, 1993 apud BERNAL, 2004).
1.1.3. Culturas utilizadas na fabricação de bebidas lácteas fermentadas
No processo de fabricação de iogurtes, as bactérias lácticas tradicionais
que caracterizam este produto são: Streptococcus salivarius spp. thermophilus (cocos
unidos, geralmente em cadeias curtas) e Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus
(bastonetes unidos em cadeias longas). Ambos os micro-organismos utilizam a lactose
como substrato energético com liberação de ácido lático e são termofílicos e
homofermentativos (SABOYA, OETTERER & OLIVEIRA, 1997).
O crescimento associado destas duas culturas resulta em menor tempo de
coagulação do leite, maior produção de ácido lático e desenvolvimento de sabor e
aroma no iogurte, o S. thermophilus é muito menos acidificante que o L. bulgaricus. A
atividade proteolítica dos bacilos promove a liberação de pequenos peptídeos e
aminoácidos que favorecem o crescimento dos cocos que, por conseguinte estimula o
crescimento dos bacilos pela produção de ácido fórmico, gás carbônico e a redução da
quantidade de oxigênio disponível no meio (SABOYA; OETTERER & OLIVEIRA, 1997;
TAMIME & ROBINSON, 2000; SHAH, 2001).
O balanço adequado da cultura é importante para a obtenção de um
iogurte com boas características sensoriais relativas ao sabor, aroma e textura sendo
CAPÍTULO II 10
considerada ótima a relação de aproximadamente 1:1 entre cocos e bacilos. Quando
ocorre uma associação entre S. thermophilus e L. bulgaricus a temperatura ótima de
crescimento fica entre 40–45 ºC e a coagulação ocorre em torno de 4 h, dependendo
da porcentagem de inóculo adicionada. Após o iogurte ter atingindo o pH desejável
(geralmente pH 4,6), o mesmo é resfriado a temperatura menor que 10 ºC. O pH final
da maioria dos iogurtes varia entre 4,6-4,0 (LUCEY & SINGH, 1998; TAMIME &
ROBINSON, 2000; SILVA, 2007).
O S. thermophilus e L. bulgaricus, não pertencem à flora intestinal, não são
resistentes à bile e consequentemente não sobrevivem à passagem através do trato
gastrointestinal, portanto não são consideradas como probióticas. No entanto, essas
bactérias possuem efeitos positivos como ação inibidora contra bactérias patogênicas
no trato gastrointestinal e melhoramento da digestão da lactose devido à presença de
enzima β-galactosidade nas células das bactérias tradicionais de iogurte (LOURENSHATTINGH & VILJOEN, 2001).
Contudo, outros produtos podem exigir uma combinação diferente, por
exemplo, o buttermilk búlgaro é produzido utilizando somente L. delbrueckii spp.
bulgaricus, enquanto que dahi em Portugal é produzido utilizando uma cultura mista de
S. thermophilus, Lactococcus lactis biovar. diacetylactis e Lactococcus lactis spp.
cremoris (TAMIME & ROBINSON, 2000).
Os iogurtes têm sido reformulados para incluir linhagens vivas de L.
acidophilus e espécies de Bifidobacterium além dos organismos da cultura tradicional
de iogurte. Assim, o bio-iogurte é o iogurte que contém micro-organismos probióticos
vivos que proporcionam o aumento dos efeitos benéficos a saúde do hospedeiro e são
elaborados com diferentes culturas starter contendo os micro-organismos de iogurte
(simples ou misto) e/ou espécies de Lactobacillus, Bifidobacterium e Enterococcus
(DAVE & SHAH, 1997; TAMIME & ROBINSON, 2000; VINDEROLA, BAILO &
REINHEIMER, 2000; LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001; SHAH, 2001).
Segundo os mesmos autores, fermentar o leite usando apenas microorganismos probióticos não e viável economicamente devido ao maior tempo de
fermentação requerido para reduzir o pH do leite para 4,6 e também ao sabor
desagradável obtido por algumas linhagens de bactérias probióticas. Portanto, a
mistura de cepas vivas de L. acidophilus e espécies do gênero Bifidobacterium usadas
em produção de bio-bebidas, são conhecidas recentemente como cultivos-AB que
associados ao S. thermophilus produz os chamados produtos fermentados ABT.
CAPÍTULO II 11
Diferentes produtos existentes no mercado contem bifidobactérias os quais
B. bifidum e B. longum são altamente empregados como mistura de culturas starter
em combinação com L. acidophilus e culturas de iogurte, em alguns casos
Lactococcus spp. e Pediococcus acidilactici também são usados. Bebidas como
Yakult®, Biogurt®, Biokys®, Mil-Mil®, AKTIFITplus®, Piá Essence®, ACTIVIA® entre
outros contém probióticos e são comercializados no mundo (BERNAL, 2004).
1.2. Probióticos
“Probiótico” é uma palavra derivada do grego e significa “para a vida”
apesar do termo e definição precisa de probiótico terem origem nos anos 1990, o
interesse por micro-organismos potencialmente benéficos à saúde é de tempos
remotos (LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001; TAMIME, 2002).
Tissier, em 1899, isolou bifidobactérias a partir das fezes de um recémnascido e verificou que elas eram o componente predominante da flora intestinal de
humanos Em 1910, Metchnikoff foi o primeiro a colocar a idéia de que o consumo
regular de leites fermentados oferecia benefícios à saúde (LOURENS-HATTINGH &
VILJOEN, 2001; TAMIME, 2002).
O termo probiótico foi introduzido por Lilly e Stillwell (1965) para descrever
“substâncias secretadas por um micro-organismo, o qual estimula o crescimento do
outro” (SUSKOVIC et al., 2001). Porém, redefinido por Fuller (1989) como “suplemento
alimentar composto de células microbianas vivas, as quais têm efeitos benéficos para
o hospedeiro, por melhorar ou manter o equilíbrio microbiano no intestino” (LOURENSHATTINGH & VILJOEN, 2001; SCHREZENMEIR & VRESE, 2001; SARKAR, 2008).
De acordo com o Regulamento Técnico de Substâncias Bioativas e
Probióticos Isolados com Alegação de Propriedades Funcionais e/ou de Saúde,
Resolução RDC nº 2 de janeiro de 2002, entende-se por probióticos os microorganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo
efeitos benéficos à saúde do indivíduo (BRASIL, 2002).
Segundo Ferreira & Teshima (2000), as diarréias hospitalares vem
aumentando nas últimas décadas, devido ao emprego crescente de antibióticos de
última geração de amplo espectro de atuação. Estes antibióticos, além de eliminarem
o agente etiológico para o qual a droga é direcionada, eliminam também microorganismos benéficos, causando distúrbio da microbiota intestinal do hospedeiro.
Como resultado, micro-organismos como Clostridium difficile, resistentes à maioria dos
CAPÍTULO II 12
antibióticos, aumentam em número, e suas toxinas correspondem a maioria das
diarréias hospitalares. Enterococcus e Eschericchia coli são outros grupos microbianos
que causam problemas devido à resistência adquirida.
Em 1987, Mitsuoka propôs um esquema hipotético, no qual ilustra as
interações entre as bactérias intestinais e a saúde humana, conforme Figura 2. As
bactérias intestinais foram classificadas em três categorias: prejudiciais, benéficas ou
neutras com relação à saúde humana. Entre as bactérias benéficas estão
Bifidobacterium e Lactobacillus e entre as bactérias nocivas estão Escherichia coli,
Clostridium, Proteus e tipos de Bacteróides. Estas bactérias produzem uma variedade
de substâncias nocivas, tais como aminas, gás sulfídrico, indol, ou fenóis, a partir de
componentes dos alimentos e causarem certos problemas intestinais (LOURENSHATTINGH & VILJOEN, 2001). O uso de probióticos tem sido adjunto dietético, para
repor e/ou prevenir o desbalanceamento da microbiota intestinal humana. As principais
espécies que têm sido empregadas para fins probióticos são bactérias do gênero
Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus), linhagens de Enterococcus,
Bacillus e Bifidobacterium (FERREIRA & TESHIMA, 2000).
Figura 2. Relação entre bactérias intestinais e saúde humana. Esquema proposto por
Mitsouka (LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001).
CAPÍTULO II 13
1.2.1. Critérios de seleção
O rigoroso critério de seleção e avaliação dos micro-organismos
probióticos foi resultado das pesquisas institucionais e de universidades juntamente
com as indústrias de alimentos. As linhagens de bactérias para se classificarem como
probióticas devem cumprir certos requisitos, pois existirão várias barreiras a
ultrapassar até o lugar em que deverão atuar, ou seja, aderir à superfície da mucosa
intestinal (SUSKOVIC et al., 2001). A Tabela 1 demonstra os principais efeitos
benéficos e terapêuticos atribuídos ao consumo de probióticos.
Tabela 1. Alguns benefícios, aplicações terapêuticas e critérios de seleção atribuídos
aos micro-organismos probióticos.
Efeitos benéficos
Critérios para a seleção de probióticos
Manutenção da microflora intestinal normal
Origem humana
Antagonista ao crescimento de patogênicos
Resistência aos sucos gástricos
Estimulação do sistema imunológico
Capacidade de aderir à mucosa
Redução da intolerância a lactose, dos níveis intestinal
de colesterol e doenças coronárias
Resistência a bílis e lisozima
Impedimentos de reabsorção de compostos
*Persistência no intestino humano
aminados indesejáveis
*Produção de antimicrobianos
Desconjugação de ácidos biliares
*Antagonistas a bactérias patogênicas
Atividade antimutagênica, anticarcinogênica
e carcinogênicas
e antitumorogênica
*Seguros para uso clínico e alimentício
Melhora o valor nutricional dos alimentos
Números
Efeitos nutricionais
organismos probióticos, no momento
Aplicações terapêuticas
de seu consumo, devendo resistir a
Prevenção de infecção urogenital
condições de processamento
Alívio da constipação
*Validade clínica e com documentação
Proteção contra a diarréia dos viajantes
dos efeitos à saúde
elevados
de
Prevenção de diarréia infantil
Redução de diarréia induzida por antibióticos
Prevenção de hipocolesterimia
Prevenção contra câncer de colo e bexiga
Prevenção da osteoporose
Fonte: Fooks, Fuller & Gibson (1999); Lourens-Hattingh & Viljoen (2001); *Saarela et al. (2000).
micro-
CAPÍTULO II 14
Algumas variedades de lactobacilos e bifidobactérias fermentam a lactose
produzindo ácido lático mantendo-se vivos no produto fermentado e sobrevivendo à
passagem pelo trato gastrointestinal, fixando-se no intestino e trazendo melhorias no
balanço da flora microbiana de indivíduos que consumam periodicamente esses
produtos (BEHRENS, ROIG & SILVA, 2000). Na Tabela 2, estão listados exemplos de
bactérias lácticas que têm sido usadas em preparações de probióticos sozinhos ou em
combinação.
Tabela 2. Exemplo de bactérias ácido lácticas com características probióticas.
Lactobacillus
Bifidobacterium
Enterococci
1
Ent. faecalis4
L. paracasei spp. casei1, 2
B. bifidum1
Ent. faecium4
L. johnsonii1, 2
B. lactis1, 3
Lactococcus lactis4
L. fermentum1
B. breve1
L. plantarum1
B. infantis1
L. lactis1
B. adolescentis3
L. acidophilus
1, 2
B. longum
L. rhamnosus1, 2
L. gasseri1
L. crispatus2
L. salivarus1, 2
L. paracasei biovar. Shirota2
1
2
3
Fonte: Kopp-Hoolihan (2001); McCartney, Wenzhi & Tannock (1996); Tamime & Robinson (2000) e
4
Saxelin et al. (1999).
1.2.2. Características dos principais gêneros probióticos
As bifidobactérias são habitantes naturais do intestino humano e animal e
requerem nutrientes especiais, o que dificulta seu isolamento e crescimento em
laboratórios. Sua população é influenciada pela idade, dieta, antibióticos, estresse
entre outros fatores. Todas as espécies de bifidobactérias fermentam a lactose e
crescem bem em leite. Sua temperatura de crescimento situa-se entre 20 ºC e 46 ºC e
morrem a 60 ºC e a faixa ótima de pH é entre 6,5-7,0 (MODLER, McKELLAR &
YAGUCHI, 1990; ARUNACHALAM, 1999).
É considerado o mais importante gênero de bactérias para a saúde
humana, representando entre 85 a 99% da flora intestinal de crianças. Em adultos, as
CAPÍTULO II 15
bifidobactérias representam o terceiro ou quarto maior grupo de micro-organismos,
enquanto coliformes, clostrídios e lactobacilos apresentam-se, normalmente, em torno
de 15%. Ao longo da vida de um indivíduo, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium
breve são substituídos por Bifidobacterium adolecentis, enquanto Bifidobacterium
longus persistem por toda vida. As bifidobactérias são consideradas mais importantes
no organismo de bebês, enquanto lactobacilos e Escherichia coli são mais numerosas
em adultos, pois a contagem de bifidobactérias diminui com o avanço de idade, como
resultado da diminuição da secreção de sucos gastrintestinais, o que causa a perda de
imunidade e doenças como o câncer (TOMOMATSU, 1994). Assim torna-se claro que
bifidobactérias são um dos principais grupos de organismos na flora intestinal de seres
humanos, e a sua redução ou desaparecimento no intestino indica um estado “não
saudável” (MITSUOKA, 1990).
As bifidobactérias apresentam efeitos benéficos para humanos e animais
através de vários mecanismos, como imunopotenciação, acidificação intestinal através
da produção de ácidos orgânicos e competição com bactérias menos desejáveis por
nutrientes e sítios de ligação na parede intestinal. A produção de ácidos orgânicos
(acético e lático) limita o crescimento de bactérias putrefativas e patogênicas,
consequentemente reduzindo a presença de substâncias nocivas ao hospedeiro como
amônia e aminas (toxinas no fígado), nitrosaminas (carcinógenos), fenóis e cresóis
(promotores de câncer), estrógenos (promotores de câncer de mama), ácidos biliares
secundários (promotores de câncer de cólon) e agliconas (mutagênicos) (MODLER,
1994; TOMOMATSU, 1994).
Os L. acidophilus são bastonetes, gram-positivos, não esporulados,
anaeróbios e aerotolerantes, que se dispõem em forma de cadeias de diferentes
tamanhos. Estes micro-organismos são residentes naturais do intestino humano e de
animais. São fracos formadores de ácidos, e por esta razão, são especialmente
utilizados em iogurtes suaves. Crescem entre 20 a 48 ºC, sendo a temperatura ótima
de crescimento 37 ºC (FRANCO, LANDGRAF & DESTRO, 1996; SAARELA et al.
2000). Os lactobacilos contribuem com o sabor e aroma em alimentos fermentados,
produzindo vários compostos voláteis, como o diacetil e seus derivados (SILVA &
STAMFORD, 2000).
O lactato (DL) é o principal componente do aroma característico durante a
fermentação por L. acidophilus. Lactobacillus johnsonni (acidophilus) regula a flora
intestinal, intensifica atividade imunológica. O Lactobacillus casei Shirota, modula a
CAPÍTULO II 16
flora intestinal, diminuindo a atividade enzimática fecal, tem efeito positivo sobre o
câncer de bexiga e câncer cervical e não influencia no sistema imune de sujeitos
saudáveis. L. rhamnosus GG (ATCC 53103), diminui a atividade enzimática fecal,
reduz a diarréia associada a antibióticos em crianças, serve no tratamento e
prevenção de rotavírus e diarréias agudas em crianças, auxilia no tratamento da
diarréia reincidente causada por Clostridium difficile, modula a resposta imune, alivia
os sintomas de dermatite atópica em jovens. L. plantarum DSM9843 (299v), modula a
flora intestinal e incrementa a excreção de ácidos graxos de cadeia curta nas fezes. O
L. reuteri (BioGaia Biologics) diminui a diarréia causada por rotavírus em crianças,
protege e dá boa tolerância em adultos HIV-positivos (SAARELA et al. 2000).
1.2.3. Consumo de probióticos
Não está estabelecida a quantidade ótima de consumo de produtos
contendo bactérias probióticas necessárias para promover benefícios nutricionais aos
consumidores, no entanto, possivelmente as contagens sejam ainda efetivas no caso
de
produtos
lácteos
consumidos
com
freqüência
regular
(VINDEROLA
&
REINHEIMER, 2000; GILLILAND et al., 2002). Vinderola & Reinheimer (2000)
sugerem níveis acima de 107 UFC g-1 ou UFC mL-1 do produto para serem garantidos
os efeitos funcionais fisiológicos.
Uma questão ainda não conclusa pela literatura é a quantidade e
freqüência de consumo de probióticos necessários para assegurar os benefícios
funcionais a eles atribuídos (GILLILAND et al., 2002). Saxelin et al. (1999)
recomendam a ingestão semanal mínima de 300 a 500 g de produtos lácteos
fermentados contendo entre 106 a 107 UFC mL-1, ou seja, entre 1 milhão e 10 milhões
das células probióticas por mL de produto. As embalagens de leites fermentados
comercializados no Brasil apresentam geralmente 80 mL de produto, as quais essas
pequenas garrafas fazem parte do conceito de “dose diária” de companhias
multinacionais e totalizam em um consumo semanal de 560 mL. É necessário, no
entanto, que estes produtos tenham sido fabricados adequadamente e estocados na
temperatura de refrigeração correta para de fato apresentarem quantidade alta de
micro-organismos probióticos viáveis.
De acordo com os Padrões de Identidade e Qualidade (PIQ) de Leites
Fermentados, da Resolução Nº 5 de 13 de novembro de 2000, estabelece que em
iogurtes a contagem total de bactérias lácticas viáveis no produto final deve ser no
mínimo de 107 UFC mL-1, durante todo o prazo de validade e, no caso em que
CAPÍTULO II 17
mencione(m) o uso de Bifidobactérias, a contagem será de 106 UFC mL-1 (BRASIL,
2000). Em relação aos probióticos, o produto deve constar a quantidade dos microorganismos viáveis que garanta a ação alegada dentro do prazo de validade do
produto (BRASIL, 2002).
1.2.4. Fatores de crescimento
Diversos fatores afetam o crescimento e a viabilidade das bactérias
probióticas no produto. Entre eles, pode-se destacar o ácido e peróxido de hidrogênio
produzidos pelas bactérias do iogurte, a redução do pH, o aumento da acidez durante
armazenamento, a temperatura de armazenamento, a presença de conservantes e de
outros micro-organismos, a concentração de oxigênio contida no produto e
permeabilidade do oxigênio através da embalagem e a disponibilidade de fatores de
crescimento (DAVE & SHAH, 1998; GUEIMONDE et al., 2004).
Vários
fatores
influenciam
a
sobrevivência
dos
micro-organismos
probióticos no meio de fermentação que são: tipo de linhagens usadas; interação entre
espécies presentes; quantidade de inóculo; condições de cultivo; oxigênio dissolvido
(especialmente para bifidobactérias); temperatura de incubação; composição química
do meio; acidez final; conteúdo de sólidos; promotores e inibidores de crescimento;
concentração de açúcares (pressão osmótica); tempo de fermentação e temperatura
de armazenamento (LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001).
Inúmeros estudos têm sido realizados com bifidobactérias in vitro para o
seu desenvolvimento no leite e a obtenção de altos números de células, encontrando
muitos fatores promotores de crescimento, como, por exemplo, os ácidos graxos de
cadeia curta (formato, acetato, proprionato e butirato), que estimulam o crescimento
destes probióticos (TAMIME, MARSHALL & ROBINSON, 1995). Como os fatores
citados a seguir:
• Fator Bífidus 1: é um componente presente no leite e no colostro, que
consiste em glicoproteínas, como a N-acetilglucosamina. A k-caseína humana ou seus
derivados de tripsina são promotores de B. bifidum, a hidrólise da tripsina resulta em
um glicomacropeptídeo que contém açúcares como a glucosamina e galactosamina,
os quais têm atividade de fator bífidus. Um fator similar foi achado no muco secretado
pelas glândulas salivares. O intestino delgado e o cólon contêm glicoproteínas como
N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina e ácido salicílico, que também estimulam
o crescimento de bifidobactérias.
CAPÍTULO II 18
• Fator Bífidus 2: as glicoproteínas do leite e do soro parecem ser efetivas,
e parecem ser peptídeos não glicosilados de caseína, depois de serem hidrolisados
com proteinases.
• Oligossacarídeos: tem sido amplamente estudados por sua habilidade
promotora de crescimento, são encontrados naturalmente no leite humano e podem
ser os responsáveis pelo crescimento de B. bifidum, a espécie predominante nas fezes
de crianças alimentadas com leite materno; e na soja, como rafinose e estaquiose que
são promotores naturais do crescimento de bifidobactérias (TAMIME, MARSHALL &
ROBINSON, 1995).
Em geral, compostos que não são metabolizados pelo hospedeiro e
alcançam o intestino para serem metabolizados por bifidobactérias são considerados
fatores bifidogênicos. Basicamente, estes compostos são carboidratos que são
utilizados pela bifidobactérias como fonte de energia (ALMEIDA & PASTORE, 2001).
Fermentar o leite usando apenas micro-organismos probióticos não é
viável do ponto de vista econômico e comercial devido ao maior tempo de fermentação
requerido para reduzir o pH do leite para 4,6 e também o sabor desagradável
provocado por algumas linhagens de bactérias probióticas. Os micro-organismos da
cultura tradicional de iogurte (S. thermophilus e L. bulgaricus) têm sido empregados
em combinação com as bactérias probióticas para reduzir o tempo de fermentação e
melhorar aspectos sensoriais como o sabor, corpo e textura do produto final (DAVE &
SHAH, 1997).
1.3. Prebióticos
Gibson e Roberfroid, em 1953, introduziram o termo prebiótico que é
definido como sendo um ingrediente alimentar não digerível pela maioria dos microorganismos do intestino, que resulta em benefício ao hospedeiro pela estimulação
seletiva do crescimento e/ou ativação do metabolismo de uma ou de um número
limitado de bactérias no cólon. Entretanto, a participação da dieta na composição da
microbiota intestinal pode ser mais eficiente quando ocorre a utilização de substratos
específicos para determinadas bactérias que contribuem para aumento da quantidade
de bifidobactérias no cólon (KNORR, 1998; FOOKS, FULLER & GIBSON, 1999;
BENGMARK, LORENZO & CULEBRAS, 2001).
Os prebióticos não somente proporcionam aumento potencial do número
de bactérias benéficas no intestino grosso de humanos, predominantemente os
CAPÍTULO II 19
lactobacilos e as bifidobactérias, mas também aumentam sua atividade metabólica
através do fornecimento de substrato fermentescível (BIELECKA et al., 2002).
Fooks, Fuller & Gibson (1999) descrevem que um ingrediente alimentar
para ser considerado como um prebiótico é necessário apresentar as seguintes
características:
• Precisam passar pela parte superior do trato gastrointestinal sem sofrer
hidrólise e nem ser absorvido;
• Apresentarem-se como substrato seletivo por um número limitado de
bactérias potencialmente benéficas no cólon, ou seja, deve promover
seletivamente o crescimento e/ou estimular a atividade metabólica de
bactérias promotoras da saúde e não a de outras bactérias;
• Promoverem alteração na composição da microflora do cólon a favor de
uma composição mais saudável, restringindo a proliferação de microbiota
patógena;
• Induzirem efeitos no lúmen intestinal que sejam favoráveis para a saúde
do hospedeiro, beneficiando-o.
Os componentes da fibra da dieta não são absorvidos, eles penetram no
intestino grosso e fornecem substrato para as bactérias intestinais. As fibras solúveis
são normalmente fermentadas rapidamente, enquanto as insolúveis são lentamente ou
apenas parcialmente fermentadas (PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002). A extensão da
fermentação das fibras solúveis depende de sua estrutura física e química. A
fermentação é realizada por bactérias anaeróbicas do cólon, levando à produção de
ácido lático, ácidos graxos de cadeia curta e gases. Conseqüentemente, há redução
do pH do lúmen e estimulação da proliferação de células epiteliais do cólon, condições
consideradas ótimas para probióticos e inibidoras de bacteróides, clostrídia e
coliformes (CARABIN & FLAMM, 1999; COLLINS & GIBSON, 1999; GIBSON,
McCARTNEY & RASTALL, 2005).
Alguns autores descrevem exemplos de substâncias prebióticas, sendo
estas oligossacarídeos em produção comercial, como a lactulose, galactooligossacarídeos (GOS), fruto-oligossacarídeos (FOS), isomalto-oligossacarídeos
(IMO), malto-oligossacarídeos (MOS), transgalacto-oligossacarídeos (TOS), lactitol,
lactossacarose, rafinose, β-d-frutanos, e polissacarídeos como a inulina e o amido
resistente (ZIEMER & GIBSON, 1998; FOOKS, FULLER & GIBSON, 1999).
CAPÍTULO II 20
1.3.1. Oligossacarídeos
Os oligossacarídeos são os prebióticos mais difundidos sendo encontrados
naturalmente em muitos alimentos e em tecidos vegetais, bem como são sintetizados
no metabolismo de animais e micro-organismos, portanto, podem ser obtidos por
extração de tecidos vegetais, por fermentação microbiana, por catálise enzimática ou
por reação química (Figura 3). Estes são definidos como carboidratos, compostos de
monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas, em número que variam de três a
dez unidades. Entretanto, muitos dissacarídeos possuem propriedades similares aos
açúcares de moléculas maiores, e são freqüentemente os principais componentes de
produtos de oligossacarídeos de grau alimentar (SAKO, MATSUMOTO & TANAKA,
1999; MEHRA & KELLY, 2006; MUSSATTO & MANCILHA, 2007).
Figura 3. Representação esquemática de produção de oligossacarídeos não digeríveis
- ONDs (adaptado de SAKO; MATSUMOTO & TANAKA, 1999).
CAPÍTULO II 21
A produção e aplicação de oligossacarídeos e polissacarídeos têm sido
muito estudadas devido às suas propriedades fisiológicas e tecnológicas, sendo que
os oligossacarídeos não digeríveis (ONDs) mais utilizados como ingredientes em
alimentos são os FOS e GOS, produzidos por transglicosilação enzimática. As
propriedades fisico-químicas e bioquímicas dos oligossacarídeos vêm incentivando o
interesse em encontrar novas formas de aplicação destes na indústria de alimentos,
como:
• Alimentação humana com seu uso em bebidas, adoçantes, formulação
de leite em pó infantil;
• Alimentação animal, principalmente em rações com potencial inibidor de
salmonela;
• Aplicação medicinal em cosméticos, produtos farmacêuticos e produtos
para diabéticos.
Porém, o principal interesse de produzir oligossacarídeos é no estímulo da
produção de bifidobactérias e não no seu uso como adoçante alternativo. Esta
propriedade tem os introduzido como ingredientes funcionais em alimentos durante
algumas décadas e as aplicações industriais estão continuamente crescendo. O maior
foco de uso está em bebidas (sucos de frutas, café, chocolates, chás, refrigerantes,
bebidas saudáveis e alcoólicas), produtos lácteos (leites fermentados, pós
instantâneos, leite em pó e sorvetes), iogurtes probióticos (com micro-organismos que
promovem benefícios ao balanço intestinal) e produtos simbióticos (contendo uma
mistura de probióticos e prebióticos) (CRITTENDEN & PLAYNE, 1996; SAKO,
MATSUMOTO & TANAKA, 1999; MUSSATTO & MANCILHA, 2007).
Os oligossacarídeos são solúveis em água e possuem um baixo poder
adoçante, correspondendo a aproximadamente 0,3 a 0,6 vezes em relação à
sacarose. A doçura dos produtos contendo oligossacarídeos está diretamente
relacionada com a estrutura química, a massa molecular e níveis de mono e
dissacarídeos presentes na mistura. É importante ressaltar que a doçura dos
oligossacarídeos relativamente baixa torna-os bastante desejáveis como ingredientes
em produtos onde existe necessidade de acentuar a textura, o sabor e outras
propriedades de alimentos com doçura reduzida (CRITTENDEN & PLAYNE, 1996).
Os benefícios funcionais para prebióticos reconhecidos pela atual
legislação brasileira é o de contribuir para o equilíbrio da flora intestinal e auxiliar no
CAPÍTULO II 22
funcionamento do intestino (BRASIL, 2005). No entanto Mussatto & Mancilha (2007)
declaram que a fermentação de fibras prebióticas no interior do ceco propicia
benefícios para a saúde, como:
• Incremento na excreta de massa seca;
• Redução da constipação intestinal;
• Inibição da diarréia;
• Modificação da colonização por microflora benéfica;
• Decréscimo do pH;
• Produção de nutrientes como as vitaminas do complexo B e ácido fólico;
• Melhora no metabolismo de carboidratos e lipídios;
• Aumento da capacidade de absorção de sais minerais;
• Redução do risco de câncer;
• Proteção dos tratos gastrointestinal, urogenital e respiratório de
infecções, entre outros benefícios.
Destaca-se como propriedade principal com ação benéfica para a saúde
humana, o efeito de barreira que os oligossacarídeos propiciam junto à superfície da
mucosa do intestino humano contribuindo para minimizar a invasão e colonização de
micro-organismos indesejáveis a esse órgão vital é (FOOKS & GIBSON, 2002).
1.3.2. Galacto-oligossacarídeos
Entre os ONDs estão incluídos os GOS que estão licenciados como
ingredientes de alimentos FOSHU (Foods for Specified Health Use) pelo Ministério da
Saúde do Japão.
Os GOS são resistentes à hidrólise das enzimas digestivas
intestinais e possuem efeitos fisiológicos semelhantes ao das fibras dietéticas
(MORISHITA et al., 2002). A ingestão destes oligossacarídeos estimula a proliferação
de bifidobactérias e lactobacilos no intestino, ocasionando um considerável benefício à
saúde humana (ALANDER et al., 2001).
Comercialmente os GOS são misturas de várias espécies moleculares de
oligossacarídeos com no mínimo 55% destes, aproximadamente 20% de lactose,
aproximadamente 20% de glicose e uma pequena quantidade de galactose, sendo
comercializados na forma líquida ou em pó (SAKO, MATSUMOTO & TANAKA, 1999).
CAPÍTULO II 23
Os GOS podem ser produzidos enzimaticamente a partir da conversão de
lactose (Figura 4), em que a ligação entre as unidades de galactose, a eficiência da
transgalactosilação e os componentes dos produtos finais dependem da enzima e das
condições
empregadas
na
reação.
Ainda
que
sejam
formados
de
tri
a
hexassacarídeos com duas a cinco unidades de galactose, é muito comum encontrar
dissacarídeos transgalactosilados, consistindo em galactose e glicose com ligações βglicosídicas diferentes de lactose ou com duas unidades de galactose, que são
considerados ONDs desde que tenham características fisiológicas similares as dos
GOS (SAKO, MATSUMOTO & TANAKA, 1999).
Figura 4. Rotas enzimáticas para a produção de GOS (MARTINS & BURKERT, 2009).
Na indústria alimentícia, os GOS podem ser usados como adoçantes, em
produtos de leite fermentado, pães, geléias, bebidas e produtos de confeitaria. As
vantagens dos oligossacarídeos sobre as fibras estão em requererem menores doses
recomendadas, serem levemente adocicados, não apresentarem textura e sabor
desagradáveis, serem completamente solúveis em água, não se ligarem com minerais,
serem fisicamente estáveis e mais fáceis de incorporar em alimentos e bebidas
processados. O pão é um alimento apropriado para a inclusão destes, pois durante a
fermentação com a levedura e o cozimento não são degradados melhorando o sabor e
CAPÍTULO II 24
a textura. Produtos fermentados de laticínios são outros bons exemplos de sua
inclusão. Leites fermentados adicionados de GOS estão comercialmente disponíveis
no Japão e na Europa. Alimentos infantis e alimentos especiais para idosos e
hospitalizados são promissores para aumentar a aplicação de GOS, pois estas
pessoas são mais susceptíveis a mudanças intestinais. (TOMOMATSU, 1994; SAKO,
MATSUMOTO & TANAKA, 1999).
O estabelecimento de bifidobactérias na microbiota intestinal de lactantes
tem sido atribuído à presença de oligossacarídeos contendo galactose em leite
humano. Assim, a inclusão de GOS como ingredientes de alimentos prebióticos tem
tido considerável interesse comercial, e várias companhias estão envolvidas com a
sua produção. Sua ingestão estimula a proliferação de micro-organismos probióticos
no intestino humano e como conseqüência facilita a digestão e produz ácidos graxos
de cadeia curta - como o ácido acético e lático - o que estimula a maior absorção de
cálcio no intestino. Também contribui para diminuir a glicose e a pressão sanguínea e
ainda tem efeito anticarcinogênico, pois diminui as substâncias putrefativas originadas
pela
ingestão
de
alimentos
em
geral.
(LÓPEZ-LEIVA
&
GUZMAN,
1995;
CRITTENDEN & PLAYNE, 1996; MAHONEY, 1998; GOPAL, SULLIVAN & SMART,
2001; CHEN, HSU & CHIANG, 2002; CZERMAK et al., 2004; SANTOS, 2006).
A dose recomendada para que não ocorra diarréia com a ingestão de
oligossacarídeos é estimada em aproximadamente 0,3 g kg–1 corpóreo (dados
baseados em estudos com japoneses adultos), embora esse valor possa variar
dependendo de vários fatores como estilo de vida, hábito alimentar, casos de doenças
cardíacas, diabetes, colesterol sérico, entre outros (SANTOS, SIMIQUELI &
PASTORE, 2009). Anthony, Merriman & Heimbach (2006) estudaram os efeitos
adversos e toxicológicos dos GOS por 90 dias em ratos Sprague Dawley alimentados
com dietas adicionadas de GOS Vivinal® (45% de GOS, 15% de lactose, 14% de
glicose e 1% de galactose) na faixa de 2,5 a 5,0 g kg-1 de peso corporal ao dia a fim de
estimar possíveis patamares admissíveis de uso desses oligossacarídeos em
alimentos formulados para consumo infantil demonstrando que os GOS na faixa e
tempo estudados não demonstraram toxicidade e efeitos antagônicos.
A indigestibilidade dos GOS se dá porque apresentam configuração β e as
enzimas digestivas gastrointestinais humanas são principalmente específicas para
ligação α, isto faz os GOS resistentes à digestão e absorção no intestino permitindo
que atinjam o ceco e o cólon, onde são fermentados por bactérias. O fato dos
CAPÍTULO II 25
oligossacarídeos não serem digeridos pelos sucos digestivos humanos leva à
comparação destas com as fibras, e os benefícios à saúde assemelham-se aos
atribuídos às dietas ricas nas mesmas. Entretanto, não apresentam aumento na
viscosidade,
sendo
que
sua
contribuição
ocorre
devido
às
características
fermentativas. Os açúcares prebióticos são os mais efetivos, principalmente para
crianças, evitando diarréia e cólicas e aumentando a imunidade dos bebês, assim
como são uma alternativa para alimentação de pacientes críticos e com riscos de
infecção. Também apresentam um menor residual de açúcares metabolizáveis,
reduzindo cáries e teor calórico (SANTOS, 2006; MARTINS & BURKERT, 2009).
Outro benefício que deve ser salientado é o efeito antiadesivo dos GOS
com respeito a agentes patogênicos, especificamente com a Escherichia coli
enteropatogênica. Entre alguns tipos de fruto-oligossacarídeos comerciais, entre os
quais foram estudados os GOS e a rafinose, foi observado que os GOS demonstraram
o melhor desempenho, inibindo a aderência desse micro-organismo em 48% quando
comparado ao controle (SAARELA et al., 2000; SHOAF et al., 2006)
1.4. Alimentos Funcionais
Alimentos funcionais, além de suas funções nutricionais possuem em sua
composição uma ou mais substâncias que atuam modulando e ativando os processos
metabólicos, melhorando as condições de saúde pelo aumento da efetividade do
sistema imune, promovendo o bem-estar das pessoas, prevenindo o aparecimento
precoce de alterações patológicas e doenças degenerativas, que levam a redução da
longevidade. Entre estes estão os probióticos e prebióticos que afetam beneficamente
a composição da microbiota do intestino e aportam ganhos fisiológicos atraindo a
atenção de pesquisadores, indústrias e consumidores (CHOCKCHAISAWASDEE et
al., 2005; THAMER & PENNA, 2006; MARTINS & BURKERT, 2009).
O termo simbiótico é utilizado quando o ingrediente alimentar contém tanto
os probióticos (lactobacilo e/ou bifidobactéria) quanto os prebióticos que, do mesmo
modo, afetam o hospedeiro de maneira benéfica (ROBERFROID, VAN LOO &
GIBSON,
1998;
SCHREZENMEIR
&
VRESE,
2001;
SILVA,
2007).
No
desenvolvimento de produtos simbióticos é necessária a seleção de linhagens de
micro-organismos com melhor capacidade de utilização de um determinado prebiótico,
para se obter um efeito sinérgico na implantação e proliferação das bactérias
desejáveis (FERREIRA & TESHIMA, 2000).
CAPÍTULO II 26
Não existem muitos estudos específicos da interação entre probióticos e
prebióticos devido ao conceito de simbióticos ser novo. Geralmente, prebióticos
possuem propriedades que podem influenciar o crescimento e sobrevivência dos
micro-organismos probióticos, afetando o crescimento tanto de probióticos como de
culturas starter em conjunto. Esta interação, quando in vivo, pode ser favorecida para
uma adaptação do probiótico ao prebiótico, condicionando seu metabolismo
simultaneamente com um dado substrato, resultando numa vantagem competitiva para
o probiótico. Porém, alguns estudos têm mostrado que os probióticos podem crescer
sem este tipo de adaptação (SAARELA et al., 2000; PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002).
As bifidobactérias são complexas como culturas probióticas, visto que são
difíceis de serem isoladas e manipuladas, pois são anaeróbias. Ao serem isoladas
demonstram intolerância a ambientes ácidos, tornando difícil a sua utilização em
produtos lácteos fermentados, considerados os carreadores universais de bactérias
lácteas. Deste modo, uma alternativa para o aumento de bactérias bífidas no trato
gastrointestinal é o emprego de prebióticos (FERREIRA & TESHIMA, 2000).
Prebióticos e probióticos podem ser empregados na profilaxia e tratamento
de uma série de condições patológicas, a maior parte na área da gastroenterologia, se
consumidos regularmente (MARTEAU et al., 2001; CHERMESH & ELIAKIM, 2006).
Muitos benefícios relacionados ao consumo de prebióticos e probióticos
que estão em fase de estudo por diversos grupos de pesquisa estão sendo
evidenciados (SALMINEN, OUWEHAND & ISOULARI, 1998; SCHEINBACH, 1998;
ARUNACHALAM, 1999; ROBERFROID, 2000; SCHOLZ-AHRENS et al., 2001; REID,
2001; LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001; VRESE et al., 2001; MARTEAU et al.,
2001; MARTEAU & BOUTRON-RUALT, 2002; CRUCHET et al., 2003; ANTHONY,
MERRIMAN & HEIMBACH, 2006; MACHADO, 2007). Dentre estes: redução de
sintomas de alergias alimentares; regularização da função intestinal, combatendo a
constipação intestinal; redução de infecção por Helicobacter pylori, que está associado
a gastrites e úlceras pépticas; atenuação da síndrome do intestino irritável e doença
de Crohn; eliminação dos sintomas da intolerância à lactose; efeitos benéficos no
metabolismo mineral, particularmente na densidade e estabilidade óssea; prevenção
do câncer de cólon e outros tipos de câncer; redução do colesterol e concentração de
triglicerídeos plasmáticos; resistência à infecções do trato urogenital; entre outros.
CAPÍTULO II 27
Entretanto, os benefícios à saúde que estão bem estabelecidos pela
literatura atualmente são (SCHREZENMEIR & VRESE, 2001):
• Redução da freqüência e duração da diarréia associada ao uso de
antibióticos (Clostridium dificile), quimioterapia, infecção por rotavírus, e,
em menor grau, diarréia do viajante;
• Estimulação humoral e imunidade celular; e
• Diminuição de metabólitos desfavoráveis, como amônia e enzimas prócarcinogênicas do cólon.
1.5. Soro de leite
O soro de leite é o principal co-produto da indústria de laticínios
apresentando-se como um líquido opaco, amarelo-esverdeado, obtido da coagulação
do leite resultante da precipitação de gorduras e caseína do leite durante a fabricação
de queijos. O seu sabor, ligeiramente ácido ou doce, e sua composição dependem do
tipo do processo da fabricação do queijo. Sua composição é de aproximadamente
93% de água, 5% de lactose e pequenas quantidades de vitaminas (SCOTT, 1993;
BEM-HASSAN & GHALY, 1994) e seu volume representa em torno de 80 a 95% do
leite, retendo 55% dos seus nutrientes (SISO, 1996; ANDRADE & MARTINS, 2002).
Por possuir na sua constituição proteínas e carboidratos, o soro de leite é
considerado uma importante fonte nutritiva, e é caracterizado por elevados valores de
DBO (Demanda Bioquímica de Oxigênio), na faixa de 30-60 kg m-3. Seu descarte
diretamente em rios ou esgotos públicos atualmente não é permitido, mas, em média,
cada tonelada do soro não tratado é equivalente à poluição diária de cerca de 470
pessoas
(MOSQUIM
et
al.,
1999;
AUDIC,
CHAUFER
&
DAUFIN,
2003;
HATZINIKOLAOU et al., 2005).
O Brasil é o sexto maior produtor mundial de leite bovino, com uma taxa de
aumento anual da produção em torno de 4%. Grande parte da produção é destinada à
fabricação de queijos, em que as maiores produções são de queijo mussarela, prato e
minas frescal (MESOMO, 2007).
É de grande interesse global a utilização do soro em termos de aspectos
econômicos,
ambientais
e
de
saúde.
Consequentemente,
a
produção
dos
oligossacarídeos a partir de lactose existente no soro tem atraído a atenção dos
CAPÍTULO II 28
pesquisadores e da indústria de alimentos, pelo potencial destes prebióticos como
ingredientes em alimentos funcionais (RUSTOM, FODA & LOPEZ-LEIVA, 1998).
A lactose é um carboidrato característico do leite e seus derivados e está
presente no soro de leite na concentração de aproximadamente 5%. Trata-se de um
dissacarídeo com baixo poder adoçante, em comparação com os outros açúcares
(sacarose), formado por glicose e galactose, tendo sua utilização na fabricação de
produtos derivados do leite (BOBBIO & BOBBIO, 2003; OLIVEIRA, 2006).
Suas principais utilizações são, na indústria de alimentos, como
ingrediente em fórmulas infantis, e na indústria farmacêutica, como excipiente de
medicamentos. Entretanto, possui sua aplicação limitada em produtos alimentícios
devido à sua baixa digestibilidade e solubilidade, evidenciada pela tendência a
cristalização, desta forma apenas uma pequena fração que é produzida anualmente é
utilizada na elaboração de alimentos. Contudo, a lactose do soro de leite pode ser
utilizada como substrato na fermentação por micro-organismos selecionados,
originando diversos produtos, como bebida láctea fermentada e também na hidrólise
enzimática gerando glicose e galactose que forma uma quantidade considerável de
oligossacarídeos (LOPEZ-LEIVA & GUZMAN, 1995; OLIVEIRA, 2006; LISBOA, 2008).
1.6. Avaliação biológica
Qualquer ser vivo pode ser utilizado como modelo nas avaliações
científicas. No entanto, para ser definido como animal de laboratório, a espécie deve
ser criada e produzida em condições ideais e mantida em ambiente rigorosamente
controlado, com acompanhamento microbiológico e genético seguros, obtidos por
monitoração constante. Levantamentos estatísticos mostram uma predominância do
uso de camundongos (64%), contra 26% de ratos, somando 90% só para estas duas
espécies. Juntando-se a elas cobaias e coelhos, chega-se a 99%. O 1% restante é
constituído por cães, gatos, macacos, e outras espécies (ANDERSEN et al., 2004).
Há inúmeras razões para o amplo uso de roedores: a facilidade de cuidado
e manuseio, o tamanho e o custo reduzido, a alta capacidade reprodutiva, gerações
com curta duração, fácil adaptação a ambientes variados e sociabilidade, baixo
consumo alimentar, resistência a doenças, são fisiologicamente semelhantes aos
demais animais monogástricos, possuem baixo custo de manutenção, além de muitas
informações disponíveis e a existência de linhagens geneticamente bem definidas,
sem a diversidade de características que resultam em muitos modelos animais.
CAPÍTULO II 29
Informações científicas acumuladas, especialmente sobre ratos e camundongos,
tornaram-se melhor conhecidas cientificamente e ofereceram maior segurança nas
análises e interpretações dos resultados experimentais obtidos. Os ratos para
experimentos nutricionais fornecem respostas interessantes através de seus órgãos
(fígado, baço, ceco, pele e anexos), além de material orgânico como sangue, urina e
fezes (JONG 1996; ANDERSEN et al., 2004).
O hamster é um animal que é frequentemente usado em estudos de
avaliação biológica que envolva experimentos em que se deseja obter respostas de
drogas e dietas sobre o metabolismo lipídico, assim como a aterosclerose, pois possui
o perfil de lipoproteínas bastante semelhante ao dos humanos apresentando a
lipoproteína LDL como principal carreador de colesterol plasmático (NAVAROO et al.,
2005; FROTA, 2007).
Além dos requerimentos nutricionais, que cercam os animais utilizados
para este fim, é importante que os pesquisadores estejam atentos ao aspecto sanitário
dos mesmos e intimamente ligados aos padrões fisiológicos, os quais não devem
escapar ao conhecimento de quem os manipula, pois, alterações ocasionadas por
dietas insuficientes, deficientes ou com excesso de nutrientes, poderão refletir sob a
forma de distúrbios metabólicos nestes animais e conseqüente erro na interpretação
de dados e resultados obtidos. Os técnicos e profissionais envolvidos com o manuseio
de animais devem ter conhecimento da espécie em questão, pois nos ratos, por
exemplo, movimentos bruscos e ruídos muito altos, podem determinar alterações
imediatas de temperatura corpórea, alterações cardiorrespiratórias, podendo chegar à
morte dos animais de acordo com a intensidade dos estímulos (NEVES, 1996).
CAPÍTULO III
DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO
ARTIGO 1
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DO SORO DE LEITE E SORO DE LEITE MODIFICADO
ENZIMATICAMENTE RICO EM GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS
CAPÍTULO III 32
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DO SORO DE LEITE E SORO DE LEITE MODIFICADO
ENZIMATICAMENTE RICO EM GALACTO-OLIGOSSACARÍDEOS
RESUMO
Galacto-oligosacarídeos (GOS) são carboidratos não digeríveis seletivamente
fermentados por bactérias da microflora intestinal que contribuem para a saúde do
hospedeiro. Sua adição em alimentos pode conferir propriedades funcionais
agregando valor econômico ao produto. Hamsters machos da linhagem Golden Syrian
(Mesocricetus auratus), recém desmamados, mantidos, em gaiolas individuais, com
controle de luz e temperatura, durante um período de 7 dias de adaptação, com dieta
controle e água ad libitum foram pesados e distribuídos, por sorteio, em três grupos,
com 7, 6 e 6 animais, respectivamente: dieta controle AIN-93G (C), dieta à base de
soro de leite (S) e soro de leite modificado enzimaticamente por β-galactosidase (G)
rico em GOS. Durante 28 dias foi realizado um acompanhamento de ganho de peso e
consumo de dietas. Os resultados médios para os grupos C, S e G, nesta ordem,
foram: consumo alimentar total - 164,51±21,95; 169,01±15,44 e 189,94±16,86 g,
ganho de peso total - 35,40±7,64; 45,32±5,86 e 56,75±10,04 g, Coeficiente de
Eficiência Alimentar (CEA) - 21,60±4,39; 26,79±1,96 e 29,72±3,16% e Quociente de
Eficiência Protéica (PER) - 1,08±0,22; 1,59±0,12 e 1,54±0,16. Foi observado que os
três grupos não diferiram em relação ao consumo, entretanto para o ganho de peso o
grupo G foi superior e diferiu do C enquanto o S não diferiu dos demais. Os grupos G
e S diferiram positivamente do C no CEA e no PER. As relações dos pesos dos órgãos
com os pesos corporais demonstraram a proporcionalidade dos mesmos. Nos
conteúdos dos cecos obtidos após eutanásia, as contagens de 108 UFC g-1
(lactobacilos) e 107 UFC g-1 (bifidobactéria) não diferiram nos grupos estudados.
Entretanto, para o pH, foram alcançados 7,90, 7,16 e 7,45 para os grupos C, S e G,
respectivamente, evidenciando que a utilização do soro de leite e do soro de leite
modificado rico em GOS estimula o crescimento de probióticos. Para as
determinações hematológicas dos grupos C, S e G, respectivamente, foram
encontrados para eritrócitos (7,38±0,40; 7,35±0,44; 7,84±0,29 106 mm-3), hemoglobina
(15,86±0,68; 15,28±1,05; 16,80±1,03 mg mL-1), hematócrito (42,50±1,88; 41,68±2,82;
45,46±2,56%), VCM (57,64±1,19; 56,80±1,64; 57,92±1,15%) e leucócitos totais
(4,44±1,58; 3,58±1,39; 3,77±0,66 103 mm-3) que estão de acordo com a literatura,
enquanto o CHCM (37,33±0,39; 36,65±0,44; 36,96±0,54%) apresentou-se inferior ao
valor de referência. Os parâmetros bioquímicos avaliados para os hamsters não
diferiram entre si para as 3 dietas utilizadas, com exceção da glicemia, contudo dentro
do recomendado, com 5% de significância. Os resultados sugeriram que a dieta G,
contendo soro modificado rico em GOS, poderia substituir a dieta padrão com
eficiência nutricional similar e, juntamente com a dieta S, elaborada com soro de leite,
possuem o potencial de favorecer o crescimento de probióticos na microflora intestinal
podendo tornar-se uma alternativa no desenvolvimento de alimentos funcionais
simbióticos.
Palavras-chaves: hamsters, prebióticos, β-galactosidase, probióticos.
CAPÍTULO III 33
BIOLOGICAL ASSESSMENT OF WHEY AND MODIFIED WHEY ENZYMATIC RICH
ON GALACTOOLIGOSACCHARIDES
ABSTRACT
Galactooligosaccharides (GOS) are non-digestible carbohydrates selectively fermented
by bacteria of the intestinal microflora that contribute to the host health. Their foods
addition may confer functional properties adding economic product value. Male Golden
Syrian hamsters (Mesocricetus auratus), recently weaned, kept in individual cages with
controlled light and temperature for of 7 days period adaptation, with control diet and
water ad libitum were weighed and randomly assigned in three groups, with 7, 6 and 6
animals each: control diet AIN-93G (C) diet based on whey (S) and enzymatically
modified whey by β-galactosidase (G). During 28 days was carried out monitoring of
weight gain and feed intake. The average results for groups C, S and G, in order, were:
total food consumption – 164.51±21.95; 169.01±15.44 e 189.94±16.86 g, total gain
weight – 35.40±7.64; 45.32±5.86 e 56.75±10.04 g, Food efficiency ratio (FER) 21.60±4.39; 26.79±1.96 e 29.72±3.16% and Protein efficiency ratio (PER) – 1.08±0.22;
1.59±0.12 e 1.54±0.16. It was observed that the three groups did not differ in
consumption relation, but to the weight gain group G was higher and differed from C
while the S did not differ from the others. G and S groups differed in the FER positive C
and PER. The organ weights relationship with body weights showed the same
proportionality. The contents of the cecum obtained after euthanasia, counts of 108
CFU g-1 (lactobacilli) and 107 CFU g-1 (bifidobacteria) did not differ between groups.
However, for pH, were obtained 7,90, 7,16 e 7,45 for groups C, S and G respectively,
showing that use of whey and modified whey stimulates probiotics growth. For
hematological determinations in groups C, S and G, respectively, were found to
erythrocytes (7.38±0.40; 7.35±0.44; 7.84±0.29 106 mm-3), hemoglobin (15.86±0.68;
15.28±1.05; 16.80±1.03 mg mL-1), hematocrit (42.50±1.88; 41.68±2.82; 45.46±2.56%),
MCV (57.64±1.19; 56.80±1.64; 57.92±1.15%) and total leukocytes (4.44±1.58;
3.58±1.39; 3.77±0.66 103 mm-3) that are consistent with the literature, while the MCHC
(37.33±0.39; 36.65±0.44; 36.96±0.54%) presented below the reference value.
Biochemical hamsters parameters did not differ for the three diets used, except
glucose, yet within the recommended 5% significance level. The results suggest that
diet G, containing enzyme-modified whey enriched with GOS, can replace the standard
diet with similar nutritional efficiency and, together with the S diet, prepare with whey,
have the potential to enhance probiotics growth on the intestinal microflora may
become an alternative in developing functional foods symbiotic.
Key-Words: hamsters, prebiotics, β-galactosidase, probiotics.
CAPÍTULO III 34
1. INTRODUÇÃO
O termo alimentos funcionais foi inicialmente introduzido pelo governo do
Japão em meados de 1980, como o resultado de esforços para desenvolver alimentos
que possibilitassem a redução dos gastos com saúde pública, considerando a elevada
expectativa de vida no país (ARAI, 1996; HASLER, 1998; ARAYA & LUTZ, 2003).
O soro de queijo, rico em matéria orgânica, possui elevado potencial
poluidor que, pela imposição de controles rígidos no descarte de efluentes no meio
ambiente e o reconhecimento deste como fonte de nutrientes tem estimulado o
interesse no desenvolvimento de processos comercialmente viáveis em converter soro
em
bioingrediente
alimentar
de
valor
agregado
(MOSQUIM
et
al.,
1999;
HATZINIKOLAOU et al., 2005; BELEN & LEE, 1998). Lisboa (2008) e Martins (2009)
estudaram a conversão da lactose do soro de leite em galacto-oligossacarídeos (GOS)
a fim de aproveitá-lo na produção de xarope rico no mesmo e em bebidas lácteas
simbióticas de baixo teor de lactose e menor tempo de fermentação, respectivamente.
Contudo,
para
a
elaboração
destes
alimentos,
micro-organismos
probióticos necessitam de estímulo ao seu desenvolvimento em substrato lácteo, que
é alcançado a partir dos fatores bifidogênicos e de crescimento (SAKO; MATSUMOTO
& TANAKA, 1999). Segundo Mussato & Mancilha (2007), os GOS são citados na
literatura como fatores bifidogênicos. Os GOS podem ser usados como adoçantes, em
produtos de leite fermentado, pães, geléias, bebidas e produtos de confeitaria.
Bebidas lácteas adicionadas de GOS estão comercialmente disponíveis no Japão e
Europa. Alimentos infantis e alimentos especiais para idosos e hospitalizados são
promissores para aumentar a aplicação de GOS, pois estas pessoas são mais
suscetíveis a mudanças no desenvolvimento intestinal. Assim, os GOS apresentam
características ímpares para utilização em alimentos industrializados, porém pesquisas
científicas substanciais sobre seus efeitos biológicos são necessárias para que isto se
torne realidade (SAKO; MATSUMOTO & TANAKA, 1999). Santos (2006) demonstrou
que os açúcares prebióticos são os mais efetivos, principalmente em crianças,
aumentando a imunidade fisiológica de bebês e evitando diarréia e cólicas.
Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi preparar e avaliar a influência
da inclusão do soro de leite e do soro de leite modificado rico em GOS nas dietas de
hamsters através de avaliações biológicas e nutricionais.
CAPÍTULO III 35
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material
2.1.1. Matérias-primas para síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS)
Foram utilizados como matéria-prima para a síntese de GOS o soro de
leite e a enzima β-galactosidase comercial de Kluyveromyces lactis Lactozym® 6500L
por cortesia das indústrias ELEGÊ, RS Brasil e Novozymes da Latin America Ltda,
respectivamente.
2.1.2. Ingredientes para ensaio biológico
As dietas foram elaboradas a fim de suprir as necessidades básicas dos
animais na fase de crescimento. Foram utilizados os seguintes ingredientes e
nutrientes: Caseína (Synth), L-cistina, cloridrato de colina, as misturas vitamínica e
mineral, obtida por manipulação farmacêutica e elaborada no Departamento de
Ciência dos Alimentos (DCA) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel),
respectivamente; o amido de milho, o óleo de soja, a sacarose e farelo de trigo (43%
de fibras) adquiridos no comércio local.
2.1.3. Animais
Foram utilizados 19 hamsters machos da espécie Mesocricetus auratus da
linhagem Golden Syrian, desmamados aos 21 dias e cedidos pelo Biotério Central da
UFPel foram distribuídos em grupos de forma a apresentar o mínimo de variação entre
eles apresentando um peso médio de 49,4 g.
2.2. Metodologia
2.2.1. Síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS)
As reações de síntese enzimática de GOS em meio aquoso foram
realizadas no Laboratório de Engenharia de Bioprocessos da Universidade Federal do
Rio Grande (FURG) em reatores em batelada nas condições de 180 rpm de agitação e
40 ºC de temperatura, previamente otimizadas por Lisboa (2008).
O sistema de reação foi composto pelo soro de leite desidratado,
caracterizado quanto à composição (AOAC, 2000), suspenso em tampão fosfato pH
7,0 de forma apropriada para resultar na concentração de 40% de lactose
CAPÍTULO III 36
(considerada o total dos carboidratos presente no soro de leite) e 10 U mL-1 de
atividade da enzima β-galactosidase Lactozym 6500L (Novozymes).
A atividade da enzima foi determinada segundo Inchaurrondo, Yantorno &
Voget (1994), em que uma unidade de β-galactosidase é definida como a quantidade
de enzima que libera 1 µmol de o-nitrofenol por minuto nas condições do ensaio.
Estas condições levam a obtenção de um produto contendo 35,9 g L-1 de
galactose, 119,12 g L-1 de glicose, 122,1 g L-1 de lactose e 119,8 g L-1 de GOS
determinado por Lisboa (2008) através do sistema Dionex DX-500 (Sunnyvale, CA,
USA) utilizando uma coluna de troca aniônica CarboPac PA1 (250x4 mm) e uma précoluna CarboPac PA1.
2.2.2. Elaboração das dietas
As dietas e o complexo mineral foram elaboradas no DCA da UFPel de
acordo com o recomendado pelo American Institute of Nutrition – AIN-93G (REEVES,
1997; REEVES, NIELSEN & FAHEY JR, 1993) e com adaptações de acordo com
Moreira, Marco & Feddern (2009). Após foram armazenadas sob refrigeração (4 ºC).
Foram adotados 7% de lipídios e 20% de proteínas presentes na dieta
controle, sendo ambos substituídos parcialmente pela modificação de suas fontes,
estando presentes no soro de leite e no soro de leite modificado rico em GOS das
dietas estudadas. Os minerais (3,5%) e o dissacarídeo (10%) das dietas elaboradas
foram totalmente substituídos devido ao soro de leite e soro de leite modificado rico
em GOS apresentarem o teor requerido intrinsecamente. As fibras (2,15%) foram
adicionadas apenas na dieta controle a fim de verificar na alimentação a influência do
potencial prebiótico dos GOS frente ao soro de leite não modificado. Na Tabela 1
encontram-se as 3 formulações utilizadas no ensaio biológico.
Os 19 animais foram divididos em grupos experimentais de acordo com a
alimentação a ser recebida:
• Grupo Controle (C): 7 animais alimentados com 13 g diárias da dieta
formulada com caseína (dieta padrão);
• Grupo Soro de leite (S): 6 animais alimentados com 13 g diárias da
dieta formulada com soro de leite;
• Grupo GOS (G): 6 animais alimentados com 13 g diárias da dieta com
soro de leite modificado enzimaticamente rico em GOS.
CAPÍTULO III 37
Tabela 1. Ingredientes e nutrientes das dietas controle (C), com soro de leite (S) e
com soro de leite modificado rico em GOS (G).
Ingredientes (g)
Controle (C)
Soro (S)
GOS(G)
Soro de leite rico em GOS
-
-
388
Soro de leite
-
412
-
Caseína
200
169,5
168,3
Óleo de soja
70
68,5
68,5
Mix vitamínico*
10
10
10
L-Cistina
3
3
3
Cloridrato de colina
2,5
2,5
2,5
Mix mineral**
35
Intrínsecos
Intrínsecos
Farelo de trigo 43%
50
Intrínsecas
Intrínsecas
Sacarose /dissacarídeo
100
Intrínseco
Intrínseco
Amido (q.s.p.)***
529,5
334,5
359,7
Total
1000
1000
1000
*Mix de vitaminas: ácido nicotínico (0,3%), pantotenato de cálcio (0,16%), piridoxina HCl (0,07%), tiamina
HCl (0,06%), riboflavina (0,06%), ácido fólico (0,2%), vitamina B12 (0,25%), vitamina E (1,5%), vitamina A
(0,08%), vitamina D3 (0,025%), vitamina K (0,0075%), biotina (0,002%) e sacarose (q.s.p.***);
** Mix mineral (g/kg): carbonato de cálcio (357,0), fosfato de potássio (196,0), citrato de potássio (70,78),
cloreto de sódio (74,0), sulfato de potássio (46,60), óxido de magnésio (24,0), citrato férrico (6,06),
carbonato de zinco (1,65), carbonato de manganês (0,63), carbonato de cobre (0,30), iodeto de potássio
(0,01), selenito de sódio anidro (0,01025) e paramobilidato de amônio (0,00795) (REEVES, NIELSEN &
FAHEY,1993 apud MOREIRA, MARCO & FEDDERN, 2009);
***Quantidade suficiente para.
Os ingredientes das dietas foram misturados a partir dos menores para os
maiores e umedecidos com gel de amido a 8% até obter-se uma massa coesa e firme,
apropriada para peletização, e dispostos em tabuleiros em aço inoxidável gradeados
para a secagem em estufa com circulação de ar a 50 °C por 24 h. A Figura 1 ilustra a
confecção das dietas.
CAPÍTULO III 38
Figura
1. Ilustração da confecção das dietas de acordo com Moreira, Marco &
Feddern (2009). a) Ingredientes misturados; b) Preparo dos cilindros; c) Corte dos
pellets; d) Pellets dispostos para secagem.
Fonte: O AUTOR, 2009.
A quantidade de dieta fornecida (13 g) foi estabelecida com base nas
recomendações diárias de ingesta do animal obtidas em estudos desenvolvidos com
hamsters (BLAIR et al., 2002; MACHADO, 2007).
2.2.3. Determinação da composição proximal das dietas
Foram realizadas determinações em triplicata de umidade, lipídios, cinzas,
fibras e proteínas nas dietas elaboradas, através do método oficial (AOAC, 2000). O
fator utilizado para a conversão do nitrogênio em proteína foi de 6,25.
CAPÍTULO III 39
2.2.4. Condições do experimento biológico
O ensaio foi conduzido na sala de Experimentação Biológica do DCAUFPel de acordo com as condições recomendadas (BENITES, 2009a; JAECKEL,
2009; MACHADO, 2009; SOUZA-SOARES & AMADO, 2009; TAVARES, 2009).
Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de polipropileno,
autoclaváveis, resistentes a ácidos, nas medidas de 41x34x16 cm, com tampa de
arame galvanizado, malha 7,5 mm, comedouro embutido em “V” e orifício com arruela
dupla para a introdução do bico do bebedouro, separados por divisória (Figura 2).
O piso da gaiola foi coberto por uma camada de maravalha (cama) para a
absorção de urina e água, servindo também como isolante térmico. Durante o período
experimental total de 35 dias, em que na primeira semana os animais foram adaptados
às condições do experimento e mantidos com dieta controle (a base de caseína) e
água ad libitum, o ambiente foi mantido a temperatura de 25 ± 2 °C e ciclo de
iluminação claro-escuro de 12 h havendo troca de cama e rodízio de local nas
prateleiras de 2 em 2 dias.
Durante todo o período experimental, a água e as dietas foram trocadas
diariamente no período inicial da manhã. Foram acompanhados a ingestão diária de
cada animal através da pesagem das sobras de dieta remanescentes e,
semanalmente, o ganho de peso.
Figura 2. a) Gaiola onde os animais foram mantidos; b) Sala com as gaiolas.
CAPÍTULO III 40
2.2.4.1. Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA)
O Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA) foi calculado pela razão entre
o ganho de peso e a quantidade total de dieta ingerida durante 28 dias, metodologia
oficial adaptada e descrita por Moreira, Marco & Feddern (2009).
2.2.4.2. Quociente de Eficiência Protéica (PER)
Foi determinada a relação entre o ganho de peso dos animais e a proteína
consumida até 28 dias, chamado de Quociente de Eficiência Protéica adaptada de
metodologia oficial (MOREIRA, MARCO & FEDDERN, 2009).
2.2.4.3. Coleta de sangue, eutanásia e obtenção de órgãos
Após o término do período experimental os animais foram submetidos a
jejum de 12 h para a coleta das amostras e realização da eutanásia conforme Figura 3
(BENITES, 2009b; SILVEIRA, 2009).
Os hamsters, após pesados, individualmente, foram anestesiados por
inalação em campânula com éter etílico. As amostras sanguíneas foram coletadas por
punção cardíaca em seringas com agulhas heparinizadas. As alíquotas de sangue
foram destinadas, imediatamente para: a) análise de hemograma (1 mL em tubo com
EDTA); b) análise de glicemia direta utilizando o monitor Accu-Chek Advantage IIRoche® dotado de fitas indicadoras de glicose e c) o restante do mesmo coletado em
ependorfes para obtenção de soro sanguíneo. As amostras sanguíneas de cada
animal foram submetidas à centrifugação a 1000 x g por 15 min a 4 ºC e o soro
armazenado a -18 °C para posterior análise (LEMOS, 1999). Para a obtenção do
hemograma foi utilizado um contador hematológico automático (POCH-100IVDIFF,
SYSMEX). Da série branca foram determinados: basófilos, eosinófilos, monócitos,
linfócitos, neutrófilos (n) bastonetes, neutrófilos (n) segmentados e leucócitos totais; e
da série vermelha: eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, VCM (volume corpuscular
médio) e CHCM (concentração da hemoglobina corpuscular média). No soro
sanguíneo foram realizadas as seguintes determinações bioquímicas: magnésio,
fósforo, cálcio, ferro, uréia, albumina, creatinina, proteínas totais, colesterol, glicose,
triglicerídeos, colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade), TGP (alanina
aminotransferase), TGO (aspartato aminotransferase), gama GT (glutamil transferase)
e fosfatase alcalina.
CAPÍTULO III 41
Figura 3. a) Animal na Campânula; b) Venopunção e exanguinação.
2.2.4.4. Medidas biométricas e retiradas dos órgãos
Ao final do experimento, os animais tiveram seus pesos e comprimentos
medidos. Para obter o comprimento entre membros torácicos foi realizada a medida
entre as patas dianteiras; e para o comprimento vértice-cóccix foi medida a porção
inicial do focinho ao início da cauda, conforme Figura 4. Também foram realizadas as
medidas dos pesos dos órgãos (fígado, ceco, rins e intestino delgado) (Figura 5).
Figura 4. a) Medição de membros torácicos; b) Medição de vértice-cóccix.
CAPÍTULO III 42
Figura 5. Órgãos dos hamsters: a) fígado; b) ceco; c) rins e d) intestino delgado.
2.2.4.5. Análise dos conteúdos dos cecos
Os conteúdos do interior dos cecos dos animais foram submetidas às
contagens de micro-organismos probióticos foram realizadas de acordo com Vinderola
& Reinheimer (1999) e expressas em unidades formadoras de colônia (UFC) utilizando
a técnica de semeadura em profundidade e análise de pH, os quais foram realizados
nos pools de cada grupo estudado.
Para enumeração de L. acidophilus foi realizada utilizando o meio MRS
(MAN, ROGOSA & SHARP) e incubadas invertidas a 37 ºC por um período de 72 h na
presença de oxigênio.
Para a enumeração de Bifidobacterium spp. foi utilizando o meio MRS
adicionado de propionato de sódio (0,3%) e cloreto de lítio (0,2%) e incubadas
invertidas em câmara com gerador e indicador de anaerobiose (PROBAC) a 37 ºC por
72 h.
A determinação do pH dos conteúdos dos cecos foi realizada
potenciometricamente utilizando potenciômetro digital modelo HI221 da marca Hanna
Instruments, em que as amostras foram diluídas em água destilada.
2.2.5. Análise estatística
Os resultados obtidos foram expressos em média ± desvio-padrão e
submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e aplicado o teste de Tukey para
comparação de médias (p<0,05). Em análises em duplicata foi aplicado o teste t de
Student.
Para a realização destas análises foi utilizado o software Statistica 7.0
(StatSoft, 2004).
CAPÍTULO III 43
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Composição proximal das dietas experimentais
A composição proximal do soro de leite e das dietas C, S e G estão
apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. Composição proximal (média ± desvio padrão) do soro de leite e dietas
controle (C), com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G).
Umidade
Proteína*
Lipídios*
Cinzas*
Fibras*
Lactose*1
(g%)
(g%)
(g%)
(g%)
(g%)
(g%)
8,0±0,8
10,8±1,1
0,6±0,1
7,9±0,2
-
72,7
8,6±0,9c
20,0±0,5ª
7,1±0,2b
3,3±0,1b
2,70±0,60ª
Soro (S)
10,5±0,8b
19,2±0,7ª
7,9±0,1ª
5,5±0,3ª
0,13±0,06b
-
GOS (G)
15,3±0,5a
16,8±0,1b
7,1±0,2b
1,3±0,2c
1,70±0,60ª
-
Amostra
Soro de
leite
Controle
(C)
-
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre as dietas através do teste de
Tukey (p<0,05; n=3);
*Base seca;
1
considerada o total dos carboidratos presente no soro de leite.
Todas as dietas diferiram com relação à umidade, o que pode ter ocorrido
devido ao processo de secagem não ter sido uniforme, visto que a temperatura e o
tempo foram os mesmos (50 ºC por 24 h) para todas independente do teor inicial de
umidade. A umidade mais elevada na dieta G provavelmente ocorreu devido ao soro
de leite modificado rico em GOS apresentar-se no estado líquido, seguida da dieta S
que, possivelmente, é pela da alta higroscopicidade do soro de leite.
Com relação à proteína, as dietas C e G apresentaram valores de acordo
com o calculado. A dieta G diferiu significativamente das dietas C e S, apresentando
um menor teor, entretanto, dentro dos 17% esperados e ainda superior a 14%
conforme recomendado pela AIN-93 e ao redor de 16% como preconizado por
Mezadri, Tomás & Amaral (2004) para suprir as necessidades protéicas dos hamsters.
A dieta S forneceu porcentagem acima do calculando, ocorrido possivelmente devido à
proteína intrínseca do soro de leite. Valores experimentais de proteína em diferentes
dietas não atingindo o valor calculado, foram relatados por alguns autores (TOAIARI et
al., 2005; MELO et al., 2007; SILVA, 2009).
CAPÍTULO III 44
Todas as dietas apresentaram teores de lipídios acima de 7,0% conforme
calculado. As dietas C e G não apresentaram diferença, enquanto a dieta S
apresentou um teor mais elevado provavelmente porque o soro de leite possui
gorduras em seu conteúdo, em torno de 0,60% (Tabela 2).
O teor de minerais existentes nas dietas difere significativamente uma das
outras (p<0,05), com dieta C apresentando um teor próximo ao calculado. A dieta
contendo soro de leite está acima dos valores calculados (3,5%), provavelmente é
devido ao teor elevado de cinzas do soro de leite, o qual apresenta aproximadamente
8% (Tabela 2). A dieta a base de GOS apresenta valores de cinzas abaixo do teor
esperado, entretanto, Silva (2009) encontrou valores abaixo de 2% para as dietas
padrão (1,94%), a base de leite bovino (1,95%) e de leite caprino (1,96%).
Os teores de fibras das dietas C e G apresentaram-se com teores
próximos ao calculado e similares entre elas (p<0,05), entretanto, a dieta S obteve
porcentagem inferior, mas de acordo com o esperado, visto que não foi adicionada
nenhuma fonte de fibras, assim como o soro não as possui intrinsecamente.
3.2. Experimento biológico
3.2.1. Acompanhamento
No acompanhamento do experimento durante 28 dias, foi avaliado o ganho
de peso dos animais semanalmente e o consumo de ração diário. A Figura 6
apresenta a variação de peso (g) dos hamsters para as 3 dietas em estudo, C, S e G.
Figura 6. Variação de peso dos hamsters para as dietas C, S e G durante 28 dias.
CAPÍTULO III 45
O perfil de ganho de peso para todos os grupos apresentou um modelo de
comportamento semelhante, partindo de um peso médio no primeiro dia de
experimento de 49,4 g e progredindo de forma crescente a cada semana.
No tempo inicial e na primeira semana os pesos dos hamsters não
diferiram estatisticamente (p<0,05). A partir da segunda semana até a quarta semana
é possível perceber que os pesos dos animais apresentam diferença significativa,
demonstrando que o grupo que recebeu a dieta G difere da dieta C e a dieta S não
difere das dietas C e G. Da terceira para a quarta semana percebe-se que as dietas G
e S apresentam uma tendência a estabilização da peso dos animais, comportamento
esperado, pois a variação de peso ocorre até que o animal atinja a fase adulta
(MELLO et al., 2007). Segundo Chaud, Sgarbieri e Vicente (2008) a redução da
eficiência alimentar ocorre devido à diminuição metabólica do organismo, causando
estagnação ou redução do peso corporal devido ao consumo da dieta ser menos
efetivo no mesmo.
Ao final dos 28 dias de experimento (4 semanas), os animais
apresentaram os pesos de (g) 84,73 ± 14,79b, 94,45 ± 8,07ab e 106,52 ± 10,97a para os
grupos C, S e G, nesta ordem. Portanto, pode se considerar que a dieta à base de
GOS (G) forneceu maior ganho de peso aos animais comparado às demais dietas,
enquanto a dieta com soro de leite (S) não diferiu das dietas C e G.
Na Tabela 3 é possível verificar os valores dos pesos dos animais no início
do experimento (após 7 dias de adaptação em que todos os animais foram
alimentados com dieta controle) e dos pesos no final de 28 dias de ensaio, com
hamsters alimentados com as dietas C, S e G.
O consumo total e diário, o ganho de peso total e diário, o CEA e o PER
após 28 dias de ensaio para os grupos C, S e G estão apresentados na Tabela 3. O
consumo diário e o ganho de peso diário são valores médios obtidos a partir do
consumo total e ganho de peso total divididos pelo período de experimento (28 dias).
CAPÍTULO III 46
Tabela 3. Pesos inicial e final; consumo alimentar total (28 dias) e diário, ganho de
peso total (28 dias) e diário, Coeficiente de Eficiência Alimentar (CEA) e Quociente de
Eficiência Protéica (PER) – média ± desvio padrão – para os para os grupos controle
(C), com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G).
Resposta nutricional
Controle (C)
Soro (S)
GOS (G)
Peso inicial (g)*
49,33±14,31a
49,13±8,92a
49,77±5,00a
Peso final (g)**
84,7±14,8b
87,8±16,2ªb
106,5±11,0a
Consumo alimentar total (g)**
164,51±21,95ª
169,01±15,44ª
189,94±16,86ª
Consumo alimentar diário (g)**
5,87±0,78a
6,25±0,57a
6,78±0,60a
Ganho de peso total (g)**
35,40±7,64b
45,32±5,86ab
56,75±10,04a
Ganho de peso diário (g)**
1,26±0,27b
1,62±0,21ab
2,03±0,36a
CEA**
0,22±0,04b
0,27±0,02a
0,30±0,03a
PER**
1,08±0,22b
1,59±0,12ª
1,54±0,16ª
Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos através do
teste de Tukey (p<0,05);
*Após 7 dias de adaptação com dieta controle;
** Após 28 dias de experimento.
Os três grupos não diferiram em relação a ingestão total (p<0,05),
demonstrando que as dietas foram igualmente aceitas pelos animais. Machado (2007)
alcançou um consumo alimentar total, após 90 dias de experimento, inferior ao
encontrado neste trabalho, com valores entre 99,86 e 114,97 g para hamsters
alimentados com dietas comerciais complementadas com bebida de soja nas
seguintes combinações: acrescidas ou não de probiótico e enriquecidas ou não de
colesterol. Silva (2009) relata uma ingestão total (g) no período de 28 dias de 225,81,
238,64 e 304,28 para as rações elaboradas com leite bovino, leite caprino e dieta
padrão, respectivamente, em ratas Wistar.
O mesmo comportamento foi obtido no consumo alimentar diário, com
valores de 5,87, 6,25 e 6,78 g para as dietas C, S e G, respectivamente não
apresentando diferenças entre si (p<0,05). Estes valores foram inferiores aos de
Machado (2007) que obteve entre 8,32 e 9,58 g em 90 dias de estudo de dietas com
bebida de soja, probióticos e colesterol administradas em hamsters. Entretanto, Araújo
(2009) verificou uma similaridade entre o consumo por hamsters das dietas controle e
com adição de néctar de amora-preta, encontrando valores em torno de 6,5 g
considerados próximos dos deste trabalho.
CAPÍTULO III 47
Todavia, Silva (2009) apresenta comportamento em que ratas Wistar
apresentaram preferência em consumir a dieta padrão com relação às dietas com leite
caprino e bovino, conforme os respectivos resultados: 10,86ª, 8,52b e 8,06b g. A
preferência pela dieta padrão sobre as dietas a base de leite pode estar relacionado
com as características sensoriais, principalmente no leite caprino. Contudo, o soro de
leite e o soro de leite modificado rico em GOS forneceram melhorias sensoriais
comparadas à dieta controle.
Entretanto para o ganho de peso total o grupo G foi superior e diferiu do C
com 56,75 ± 10,04 g enquanto o S não diferiu dos demais grupos, podendo-se inferir
que a dieta G forneceu um aproveitamento digestivo elevado, demonstrando que para
um consumo alimentar diário e total sem diferenças entre os grupos, foi obtido um
maior ganho de peso. Este comportamento pode ter ocorrido devido às proteínas
presentes no soro de leite e no soro de leite modificado rico em GOS, pois do ponto de
vista de aminoacídico as proteínas do soro apresentam quase todos os aminoácidos
essenciais em excesso às recomendações, exceto pelos aminoácidos aromáticos
(fenilalanina,
tirosina)
recomendações
para
que
todas
não
as
aparecem
idades
em
assim
excesso,
como
mas
atendem
apresentam
às
elevadas
concentrações de triptofano, cisteína, leucina, isoleucina e lisina. Assim como as
proteínas do soro de leite são altamente digeríveis e rapidamente absorvidas pelo
organismo, estimulando a síntese de proteínas sangüíneas e teciduais sendo também
classificadas como proteínas de metabolização rápida, muito adequadas para
situações de estresses metabólicos, em que a reposição de proteínas no organismo se
torna emergencial (SGARBIERI, 2004)
Outra possibilidade seria pelo soro de leite modificado rico em GOS conter
monossacarídeos que são mais bem metabolizados frente ao amido em maior
quantidade na dieta controle e a sacarose não adicionada nas dietas S e G.
Lemos (1999) alcançou um ganho de peso em 28 dias de 61,00 g com
rações à base de farelo de arroz e farelo de arroz desengordurado nas dietas de ratas
Wistar. Feddern (2007) obteve um ganho de peso de 49,67 g para ratas Wistar com
ração confeccionada com multimistura com farelo de trigo e folha de mandioca em um
período de 28 dias. Silva (2009) obteve um incremento de 45,31a, 30,26b e 27,36c g
em ratas Wistar no período de 28 dias para as dietas padrão, de leite caprino e leite
bovino. Em dietas adicionadas de 5 mL de bebida de soja o ganho de peso de
hamsters após 90 dias alcançou 52,00 g, semelhante ao obtido pela dieta G estudada
CAPÍTULO III 48
neste trabalho (MACHADO, 2007). Contudo, Jaekel (2008) obteve o máximo em
ganho de peso em hamsters alimentados por 68 dias com dieta padrão acrescida de 5
mL de bebida de soja e arroz e 0,2% de colesterol com um valor de 49,95 g.
O ganho de peso diário forneceu, estatisticamente, o mesmo desempenho
que o ganho de peso total, demonstrando que as dietas pesquisadas de soro de leite e
soro de leite modificado rico em GOS obtiveram maiores valores, com a dieta G
diferindo da dieta C (p<0,05). Comportamento que difere do encontrado por Silva
(2009) em ratas Wistar, que obteve os menores valores de ganho de peso diário para
as dietas estudadas (leite caprino e leite bovino) com valores de 1,09 g e 0,97 g,
enquanto para a dieta controle foi de 1,61 g.
O CEA está relacionado com o ganho de peso corporal total e a ingestão
das dietas durante todo o período de experimento. Através da Tabela 3, é possível
verificar que os grupos S e G diferiram positivamente do C (p<0,05) no CEA
alcançando 0,27 e 0,30, respectivamente, demonstrando melhor conversão do
alimento ingerido. Por outro lado, Feddern, Badiale-Furlong & Souza-Soares (2008)
alcançaram menor conversão do alimento em peso corporal, pois, após 28 dias, um
CEA de 0,12 para ratas Wistar com dieta à base de multimistura com farelo de trigo e
folha de mandioca fermentada, vista como um modo de aumentar a disponibilidade de
nutrientes e melhorar a digestibilidade alimentar. Assim como Silva (2009) teve valores
de 0,15, 0,13 e 0,12 para as dietas padrão, de leite caprino e de leite bovino, nesta
ordem. Jaekel (2008) ao avaliar dietas suplementadas com bebida de soja e arroz e de
colesterol também obteve menores valores de CEA, apresentando 0,01 para todos os
grupos de hamsters alimentados durante 68 dias mesmos valores encontrados por
Araújo (2009) em hamsters que consumiram dietas adicionadas de néctar de amorapreta por 98 dias. Todavia, Machado (2007) encontrou valores superiores em 90 dias
de ensaio com hamsters, em que o menor foi de 0,32 para a dieta padrão e o maior foi
de 0,45 para a dieta com 5 mL de bebida de soja.
Avaliando dietas suplementadas com GOS Vivinal® (45% de GOS, 15% de
lactose, 14% de glicose e 1% de galactose) na faixa de 2,5 a 5,0 g kg-1 de peso
corporal ao dia Anthony, Merriman & Heimbach (2006) alcançaram um CEA de 0,19
para ratos Sprague Dawley alimentados durante 28 dias de experimento para ambas
as rações, enquanto para a dieta padrão RODI (reverse osmosis deionized) encontrou
0,17 e 0,20 para a dieta controle contendo FOS. Estes resultados corroboram a
CAPÍTULO III 49
potencialidade das dietas deste trabalho elaboradas com soro de leite e soro de leite
modificado rico em GOS.
Um comportamento similar foi observado no PER, onde os grupos S e G
também diferiram positivamente do C ao nível de confiança de 95%, demonstrando
que a incorporação de soro de leite modificado rico em GOS e de soro de leite poderia
substituir parte da fonte de proteínas à dieta controle evidenciada pela melhor
eficiência protéica, comparada à dieta controle. Feddern, Badiale-Furlong & SouzaSoares (2008) encontraram valores que variam entre 1,27 e 1,65 em ratas Wistar que
ingeriram durante 21 dias dietas de diferentes multimisturas, fermentadas ou não,
compostas de farelo de trigo, farelo de arroz e folha de mandioca, entretanto estes
foram menores e diferentes estatisticamente (p<0,05) do PER de 2,30 da dieta padrão
à base de caseína utilizada como controle.
Os resultados nutricionais obtidos sugerem que o soro de leite e o soro de
leite modificado rico em GOS apresentam características que possibilitam a sua
utilização na alimentação de acordo com as propriedades apresentadas na Tabela 3.
3.2.2. Avaliações biométricas
Na Tabela 4 estão dispostos os parâmetros ponderais relativos ao
crescimento dos animais dos grupos C, S e G.
Tabela 4. Distância braço a braço e comprimento do focinho a cauda dos animais
(média ± erro padrão) para os grupos controle (C), com soro de leite (S) e com soro de
leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias.
Medida
Controle (C)
Soro (S)
GOS (G)
Membros torácicos (cm)*
10,1±0,4b
10,5±0,3ab
10,6±0,3a
Vértice-cóccix (cm)**
14,2±0,6b
14,4±0,3ab
14,9±0,3a
*Medida entre patas dianteiras;
** Medida da porção inicial do focinho ao início da cauda.
É preconizado por Sanchis & Silbgert (1986) citado por Machado (2009)
um tamanho médio de 16 cm do focinho a cauda em hamsters adultos, portanto,
próximo ao valor encontrado nos grupos estudados.
CAPÍTULO III 50
Observando as medidas corporais dos animais, o grupo que obteve maior
distância braço a braço (10,6 cm) e do vértice ao cóccix (14,9 cm) foi o que se
alimentou com dieta à base de GOS, diferindo estatisticamente apenas do grupo C
(p<0,05). Estes parâmetros ponderais relativos ao crescimento são proporcionais aos
resultados relacionados ao ganho de peso demonstrado na Tabela 3, onde foi
verificado que o grupo que apresentou o maior desenvolvimento de suas extremidades
corporais apresentou também o mesmo em relação ao ganho de peso.
Visto que, através da Figura 6 foi verificado que após os 28 dias as curvas
demonstravam uma tendência a um ganho de peso pelos animais após o período
experimental, presume-se que estes hamsters alcançariam valores mais próximos do
requerido por Sanchis & Silbgert (1986) citado por Machado (2009).
Este comportamento de proporcionalidade juntamente com o CEA e o PER
mostra a eficiências das dietas em serem metabolizadas e convertidas no crescimento
dos animais. O ganho de peso adequado às medidas biométricas indica que as dietas
não forneceram acúmulo de gordura assim como não conferiram obesidade aos
hamsters que se alimentaram com as dietas estudadas (C, S e G) durante o período
de 28 dias.
Comportamento este confirmado por Silva (2009) que obteve o maior
desenvolvimento de ratas Wistar alimentadas com a dieta padrão, onde os valores de
ganho de peso e do comprimento das extremidades diferiram das dietas estudadas
utilizando leite caprino e bovino.
Araújo (2009) ao avaliar hamsters machos alimentados com dietas
adicionadas de néctar de amora-preta durante 98 dias obteve medidas do vértice ao
cóccix de 16 cm em todos os grupos estudados, considerados semelhantes os obtidos
neste trabalho e de acordo com o preconizado Sanchis & Silbgert (1986) citado por
Machado (2009).
Na Tabela 5 estão descritas as avaliações biométricas para os animais dos
grupos C, S e G, expressas pelos pesos dos órgãos e pelas relações dos mesmos
com o peso dos animais. O cálculo das relações dos pesos dos órgãos com os pesos
corporais é fundamental para a interpretação segura dos resultados, as quais
demonstram a proporcionalidade dos mesmos.
CAPÍTULO III 51
Tabela 5. Valores médios ± desvio padrão dos pesos dos órgãos e porcentagens dos
pesos órgãos/pesos corporais dos hamsters para os grupos controle (C), com soro de
leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias.
Peso
Controle (C)
Soro (S)
GOS (G)
Fígado (g)
3,2±0,7ª
3,1±0,5a
3,6±0,7a
Intestino delgado (g)
2,0±0,2a
2,3±0,4a
2,2±0,4a
Ceco com conteúdo (g)
1,8±0,6b
3,6±0,5ª
2,6±0,9b
Rins (g)
0,8±0,2a
0,9±0,3a
0,9±0,2a
Fígado (g)/animal (g)*
3,7±0,4a
3,5±0,5a
3,4±0,004a
Intestino delgado (g)/animal (g)* (%)
2,4±0,3ab
2,7±0,6a
2,1±0,3b
Ceco (g)/animal (g)* (%)
2,2±0,9b
4,2±0,7a
2,4±0,9b
Rins (g)/animal (g)* (%)
1,0±0,1a
1,1±0,4a
0,9±0,2a
*Peso corporal dos animais de acordo com o grupo correspondente.
Analisando os valores para a peso de fígado verifica-se que o mesmo não
apresentou diferença significativa entre os grupos (p<0,05), o que demonstra que não
houve alterações neste órgão. Entretanto, é necessário observar a relação do peso do
mesmo com o peso corporal do animal, o que confirma o citado anteriormente, pois
todos os grupos apresentaram resultados que não diferem entre si. Em trabalhos
desenvolvidos com dietas adicionadas de colesterol é possível verificar que este
aumenta a relação em peso fígado/animal, Jaekel (2008) ao estudar dietas
suplementadas com bebida de soja e arroz obteve valores de 3,0%, entretanto, ao
acrescentar 0,2% de colesterol, a relação aumentou para 4,0%, foi evidenciado que
estas dietas hipercolesterolêmicas causam um aumento de 28% no peso dos fígados
de hamsters alimentados por 68 dias. Machado (2007) ratifica este fato através de
seus estudos com hamsters alimentados durante 90 dias com dietas suplementadas
com bebidas de soja com e sem probiótico, obtendo relações de 3,2% para ambas e
quando estas mesmas bebidas foram adicionadas de 0,2% de colesterol houve um
aumento significativo neste parâmetro com valores de 5,2%. Em dietas elaboradas
com leites caprino e bovino, as respectivas relações foram de 4,0 e 3,0%, confirmando
a proposição de que o colesterol aumenta o peso deste órgão (SILVA, 2009).
Por outro lado, a baixa relação do peso do fígado/peso do animal associase à perda de peso hepática para garantir a disponibilidade de energia a órgãos
importantes, como coração e cérebro. Os valores encontrados, para hamsters adultos
CAPÍTULO III 52
(com idade próxima a 60 dias), sugerem que estão dentro do esperado visto os de
outros trabalhos (MACHADO, 2007; JAEKEL, 2008; SILVA, 2009) e, que em
condições normais de alimentação, aos 30 dias de idade, o fígado de ratos machos
evidencia peso médio de 2,80 g (GUMÁN-SILVA et al., 2004).
O peso do intestino delgado não apresentou diferença significativa entre os
grupos avaliados (p<0,05), no entanto a relação deste órgão com o peso do corpo do
animal demonstra que hamsters alimentados com dietas à base de GOS obtiveram
menores valores diferindo do grupo S em 28,57%, mas semelhante ao grupo C,
apesar de ser 14,29% menor. Estes resultados proporcionam constatar que o
prebiótico possui maior capacidade em melhorar o trânsito intestinal incrementando a
excreção de massa seca devido ao aumento na umidade do bolo fecal através da
pressão osmótica, diminuindo a retenção das fezes no interior do intestino. Segundo
Fooks & Gibson (2002) este fato contribui para minimizar a invasão e colonização de
micro-organismos indesejáveis a esse órgão vital, é conhecido como efeito de barreira
que os oligossacarídeos propiciam junto à superfície da mucosa do intestino humano,
sendo citado como sua principal ação benéfica para a saúde humana.
Os resultados de peso do ceco (3,6 g) e da relação deste com o peso do
animal (4,2%) demonstram que o grupo S diferiu dos demais grupos apresentando-se
75,00 e 90,91% maiores que os grupos G e C, respectivamente; o que deve ter
ocorrido pela ausência de fibras na dieta diminuindo o fluxo intestinal e aumentando a
quantidade de conteúdo presente no seu interior, visto que este órgão é responsável
pelo acondicionamento destas. A relação mássica entre o ceco e o animal para as
dietas C e G são 47,62 e 42,86% menores que as obtidas pelo grupo S.
Mussatto & Mancilha (2007) alegam que a fermentação de fibras
prebióticas - como o farelo de trigo utilizado na dieta C e os GOS da dieta G - no
interior do ceco produzem benefícios para a saúde, como: incremento na excreta de
massa seca; redução da constipação intestinal; inibição da diarréia; modificação da
colonização por microflora benéfica; decréscimo do pH; produção de nutrientes como
as vitaminas do complexo B e ácido fólico; melhora no metabolismo de carboidratos e
lipídios; aumento da capacidade de absorção de sais minerais; redução do risco de
câncer; proteção dos tratos gastrointestinal, urogenital e respiratório de infecções;
entre outros benefícios. Porém, os benefícios funcionais para prebióticos reconhecido
pela atual legislação brasileira é o de contribuir para o equilíbrio da flora intestinal,
como FOS e inulina, e auxiliar no funcionamento do intestino (BRASIL, 2005).
CAPÍTULO III 53
Os pesos dos rins não apresentaram diferenças significativas entre os
grupos C, S e G, ao nível de confiança de 95%, assim como sua relação com o peso
corporal dos hamsters avaliados. Sendo que os rins de ratos machos de 30 dias de
idade e em condições normais de alimentação possuem peso médio de 0,71 g não
houve alterações neste órgão, como cálculos renais ou deficiência de funcionamento
do mesmo (GUZMÁN-SILVA et al., 2004).
3.2.3. Avaliações dos conteúdos do ceco
Foram realizadas avaliações nos conteúdos dos cecos dos animais após a
eutanásia. Na Tabela 6 estão apresentados os resultados das contagens de
lactobacilos e de bifidobactéria assim como a determinação do pH.
Tabela 6. Contagem de micro-organismos probióticos e pH dos conteúdos presentes
nos cecos dos hamsters dos grupos controle (C), com soro de leite (S) e com soro de
leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias.
Medida
Controle (C)
-1
b
Soro (S)
b
GOS G)
L. acidophilus (log UFC g )
8,30
8,30
8,70a
Bifdobacterium sp. (log UFC g-1)
7,00a
7,00a
7,00a
pH*
7,90±0,01a
7,16±0,06c
7,45±0,04b
teste t de Student (p<0,05);
*Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos através do
teste de Tukey (p<0,05) para os resultados de média ± desvio padrão (n=3).
Muitos fatores afetam a composição da flora intestinal humana, como a idade,
suscetibilidade para infecções, exigências nutricionais, estado imunológico do
hospedeiro, assim como o pH, tempo de trânsito, disponibilidade de material
fermentescível no intestino, e interações entre a flora e os componentes presentes.
Bifidobactérias e lactobacilos juntamente com a mucosa intestinal podem agir
como barreira à invasão de potenciais patogênicos, como E. coli, Campylobacter e
Salmonella spp. A microflora láctica do trato gastrointestinal humano é capaz de inibir
patógenos, interferindo na colonização através dos seguintes mecanismos: produção
de metabólitos finais, como ácidos excretados diminuindo o pH formando um
micronicho com condições em que os patogênicos são incapazes de competir; efeito
competitivo natural de ocupação do espaço; antagonismo natural direto através da
CAPÍTULO III 54
excreção de antimicrobianos; competição por nutrientes; incremento no sistema imune
(GIBSON, McCARTNEY & RASTALL, 2005).
De acordo com a Tabela 6, é possível verificar as contagens de microorganismos probióticos presentes nos conteúdos dos cecos, em que se percebe que
para bifidobactéiras não houve diferença entre os grupos estudados.
A presença de prebióticos reduz o risco de micro-organismos associados a
gastrenterites, influenciando positivamente na flora benéfica e incrementando a
colonização com potencial resistência. Conforme a Tabela 6, é possível verificar que o
grupo alimentado com dieta G apresentou maior contagem para lactobacilos ao
comparar com os grupos C e S, diferindo significativamente (p<0,05), isto pode ter
ocorrido devido ao processo metabólico de fermentação, em que os GOS são fonte de
energia com efeito estimulador para micro-organismos probióticos e exercendo um
severo mecanismo antipatogênico. Visto que os GOS resistem ao processo digestivo
no intestino delgado e são hidrolisados a pequenos oligômeros ou monômeros pelas
bactérias anaeróbias do cólon, como os lactobacilos (GIBSON, McCARTNEY &
RASTALL, 2005; ROBERFROID, 2007).
Contudo, outros autores ao estudarem dietas adicionadas de bebidas vegetais,
como soja e arroz, na alimentação de hamsters, obtiveram contagens de L.
acidophilus acima de 9 log UFC g-1, inclusive para o grupo controle (MACHADO, 2007;
JAEKEL, 2008).
Entretanto, nas determinações de pH dos conteúdos dos cecos dos animais
foram obtidos os valores médios de 7,90a, 7,16c e 7,45b para ao grupos C, S e G,
respectivamente. Pode-se verificar que todos os grupos diferiram entre si (p<0,05), os
quais os grupos S e G apresentaram menores valores de pH, provavelmente devido à
lactose ser metabolizada pelos micro-organismos láticos favorecendo a produção de
ácidos, o que reduz o pH. Algumas condições ótimas para probióticos são inibidoras
de bacteróides, clostrídia e coliformes, nestas incluímos o baixo pH, ou seja, o pH
reduzido possui efeito antagônico a proliferação dos micro-organismos patogênicos,
beneficiando o hospedeiro (COLLINS & GIBSON, 1999; GIBSON, McCARTNEY &
RASTALL, 2005).
3.2.4. Avaliações hematológicas
A Tabela 7 mostra os valores obtidos com as análises realizadas no
sangue dos animais para os grupos C, S e G.
CAPÍTULO III 55
Tabela 7. Valores hematológicos médios ± desvio padrão para os grupos controle (C),
com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias.
Parâmetro
Controle (C)
Soro (S)
GOS (G)
7,38±0,40a
7,35±0,44a
7,84±0,30a
Hemoglobina (mg 100 mL-1)
15,86±0,68ab
15,28±1,05b
16,80±1,03a
Hematócrito (%)
42,50±1,89ab
41,68±2,82b
45,46±2,56a
VCM (%)
57,64±1,19a
56,80±1,64a
57,92±1,15a
CHCM (%)
37,33±0,39a
36,66±0,44b
36,96±0,54ab
Leucócitos totais (103 mm-3)
4,44±1,58a
3,58±1,39a
3,77±0,66a
Basófilos (mm-3)
6,86±18,14a
0,00±0,00a
16,33±17,91a
Eosinófilos (mm-3)
642,86±275,59a
372,22±161,91b
313,67±115,15b
Monócitos (mm-3)
37,29±35,94a
60,78±27,91a
47,50±50,75a
Linfócitos (103 mm-3)
3,22±1,08a
2,53±1,41a
3,01±0,52a
n bastonetes (mm-3)
7,29±19,28a
3,56±10,67a
6,50±15,92a
522,43±302,29a
607,89±779,72a
370,83±93,38a
Série vermelha
Eritrócitos (106 mm-3)
Série branca
n segmentados (mm-3)
teste de Tukey (p<0,05).
A série vermelha apresentou o mesmo comportamento para os eritrócitos,
hemoglobina e hematócrito nos três grupos estudados, em que os hamsters
alimentados com a dieta G forneceram maiores valores, seguidos do grupo C e,
finamente, o grupo S. Estes resultados demonstram o papel das fibras na alimentação
que proporcionam: maior absorção de minerais reduzindo a incidência de anemias,
além do aumento da síntese de vitaminas (principalmente do grupo B), aumento da
produção de compostos imunoestimulantes, entre outros (PASSOS & PARK, 2003).
Para os grupos C, S e G foram encontrados para eritrócitos valores que
estão dentro da faixa sugerida por Sanchis & Silgbert (1986), citado por Machado
(2009) de 6 a 10 milhões em 1 mm3 e não apresentam diferenças entre si (p<0,05).
Anthony, Merriman & Heimbach (2006) ao avaliar por 90 dias ratos Sprague Dawley
alimentados com dietas adicionadas de GOS Vivinal® (45% de GOS, 15% de lactose,
14% de glicose e 1% de galactose) na faixa de 2,5 a 5,0 g kg-1 de peso corporal ao dia
encontraram valores de 8,75 e 8,68 106 mm-3 de eritrócitos, apresentando-se também
na faixa da espécie.
CAPÍTULO III 56
O valor de hemoglobina para o grupo G apresenta-se maior, entretanto os
grupos G e S não diferiram do grupo C e estão dentro dos padrões de referência
(HARKNESS & WAGNER, 1993; SANCHIS & SILGBERT, 1986 apud MACHADO,
2009), em que os valores médios de hemoglobina para roedores variam de 11 a 18 mg
100 mL-1 e para hamsters fica entre 10 e 16 mg 100 mL-1. Os valores encontrados por
Boaventura et al. (2003), entre 13,13 e 16,16 mg 100 mL-1, para ratos Wistar que
ingeriram durante 28 dias dietas de Quissamã e controle com ou sem suplemento e
por Anthony, Merriman & Heimbach (2006), de 16,80 e 17,00 mg 100 mL-1, ao avaliar
por 90 dias ratos Sprague Dawley alimentados com dietas adicionadas de diferentes
concentrações de xarope de GOS foram semelhantes aos deste trabalho. Contudo,
Marco (2008) encontrou valores menores, entre 11,6 e 14,5 mg 100 mL-1, em ratas
Wistar alimentadas com dietas à base de multimisturas e Spirulina durante 21 dias,
entretanto, em trabalhos experimentais, foram relatadas médias de hemoglobina para
ratos Wistar variando segundo a idade do animal (BOAVENTURA et al., 2003).
A hemoglobina é um indicativo de anemia, conforme evidenciado em um
estudo com açaí e farinha de mandioca com ratos Wistar, após o período de depleção
receberam dietas com a finalidade de demonstrar a recuperação da desnutrição,
entretanto, o maior resultado de hemoglobina (13,4 mg em 100 mL) foi do grupo
controle alimentado com dieta comercial e constituído por animais considerados
normais desde o início do experimento, os grupos estudados apresentaram os
respectivos valores de 5,2 e 11,9 mg em 100 mL para rações à base de açaí e
mandioca, evidenciando que estes não foram capazes de recuperar os animais da
deficiência nutricional (TOAIARI et al., 2005).
Valores de hematócritos para roedores variam entre 36 e 48% (HARKNESS
& WAGNER, 1993), enquanto os específicos para hamsters se encontram na faixa
entre 36 e 55% (SANCHIS & SILGBERT, 1986 apud MACHADO, 2009), estes
sugerem que os resultados encontrados estão dentro dos parâmetros para esses
animais. O grupo G apresentou valores superiores às demais dietas (p<0,05),
sugerindo sua eficiência sobre as demais, apesar de não diferir do controle.
Boaventura et al. (2003) obtiveram porcentagem entre 40,66 e 46,00, para ratos Wistar
nutridos por 28 dias com dietas de Quissamã e controle com ou sem suplemento e
Anthony, Merriman & Heimbach (2006) alcançaram em torno de 40%, em
ratos
Sprague Dawley submetidos a 90 dias de dietas confeccionadas com diferentes
concentrações de xarope de GOS.
CAPÍTULO III 57
Com relação ao VCM, as dietas não apresentaram diferenças ao nível de
confiança de 95%, demonstrando que a suplementação das dietas com soro de leite e
soro de leite modificado rico em GOS não interferiu neste parâmetro, assim como os
encontrados em estudos com GOS realizados por 90 dias em ratos Sprague Dawley
(ANTHONY, MERRIMAN & HEIMBACH, 2006)
Entretanto, para o CHCM, foram obtidos resultados em que o grupo S diferiu
do grupo controle, todavia o grupo G não diferiu de nenhum dos grupos estudados
(p<0,05). Anthony, Merriman & Heimbach (2006) demonstraram no seu estudo para
avaliar a toxicidade de diferentes teores de GOS na dieta de ratos Sprague Dawley
que o CHCM se manteve acerca de 40%, valor acima do encontrado neste estudo.
Os valores hematológicos para a série branca demonstraram que a maioria
das respostas está de acordo com a faixa requerida para hamsters (SANCHIS &
SILGBERT, 1986 apud MACHADO, 2009). O soro de leite possui quase que
integralmente as imunoglobulinas do leite que continuam desempenhando sua função,
não somente no sistema gastrointestinal, mas sistemicamente em todo o organismo.
Além da lactoferrina, presente no soro, que ainda pode estimular o crescimento de
vários tipos de células do sistema imune implicando diretamente na resposta imune
humoral e na produção de anticorpos aumentando, por sua vez, os glóbulos brancos
(SGARBIERI, 2004).
Assim como os prebióticos, que também podem influenciar na série branca,
pois promovem o crescimento das populações de bactérias benéficas com capacidade
de produzir substâncias com propriedades imunoestimulatórias e interagir com o
sistema imune em vários níveis, incluindo a produção de citocinas, a proliferação de
células mononucleares, a fagocitose macrofágica, a eliminação e a indução de síntese
de grandes quantidades de imunoglobulinas (BUDIÑO et al., 2004).
De acordo com a Tabela 7, foram encontrados para leucócitos totais em
hamsters alimentados com as dietas estudadas (C, S e G) valores que não diferem
entre si (p<0,05) e estando dentro do indicado entre 3000 e 11000 mm-3. Podendo-se
verificar que todos os animais não apresentaram problemas neste parâmetro para
todas as dietas estudadas.
Os basófilos são células efetoras predominantes nas reações alérgicas.
Durante a inflamação alérgica, os basófilos migram para os tecidos afetados, e
contribuem com diversos mediadores. Eles são orientados na produção de citocinas
CAPÍTULO III 58
Th2 (IL-4 e IL-13), estimulando a síntese de IgE e a atopia (LOPES et al., 2006). Os
valores de basófilos (mm-3) 6,86a, 0,00a e 16,33a para os referentes grupos C, S e G
não apresentaram diferença entre si e se encontram dentro da faixa de 0-1% dos
leucócitos totais para hamsters, representando 0,15, 0,00 e 0,43%, respectivamente.
O eosinófilo desempenha também um papel central na patogenia das
doenças alérgicas e é conhecido como potente célula efetora citotóxica. São glóbulos
brancos que têm o poder de destruição de parasitas e tecidos, sendo, no entanto,
susceptível de causar doença. A sua função é estimulada por mediadores lipídicos e
citocinas libertadas por outras células (AMERICAN ACADEMY OF ALLERGY,
ASTHMA AND IMMUNOLOGY – AAAAI, 2007). Seus valores, no grupo C diferiram
dos demais, apresentado aproximadamente o dobro dos outros grupos. Contudo
representam 14,48, 10,40 e 8,32% do total de leucócitos para os grupos C, S e G e o
valor preconizado para hamsters se encontra entre 0 e 4,5% de acordo com os
encontrados por Anthony, Merriman & Heimbach (2006), com valores de 60 a 70 mm-3,
para um estudo em ratos Sprague Dawley após 90 dias de dieta com rações à base de
GOS e de 20 mm-3 para dieta controle, que equivalem a menos de 1%.
O fato da porcentagem de eosinófilos estar acima do requerido,
principalmente no grupo alimentado com dieta controle que se apresenta mais de
300% superior a este, pode ser explicado devido ao leite bovino ser uma mistura de
mais de 20 componentes e entre eles estão as proteínas implicadas nas reações
imunológicas. Os principais alérgenos encontrados neste alimento são: a caseína, αlactoalbumina e a ß-lactoglobulina (CASTELLO et al., 2004). Isso demonstra que a
caseína pode ter afetado o sistema imune fornecendo alterações nos eosinófilos, visto
que a mesma se encontra nas três dietas do estudo. Os teores de caseína
adicionados nas dietas seguem o mesmo comportamento dos eosinófilos, os quais o
menor é o da dieta G, seguido da S, por último, o da dieta C.
Os monócitos devem estar entre 0 e 3%, conforme os obtidos neste estudo
em que os valores de 37,29, 60,78 e 47,50 mm-3 equivalem a 0,84, 1,70 e 1,26% para
os grupos C, S e G, respectivamente, não apresentando diferenças ao nível de
significância de 5%.
Os leucócitos totais possuem como maior teor os linfócitos, que representam
de 50 a 95%, portanto, os valores encontrados se enquadram com o recomendado,
visto que os grupos C, S e G apresentam 72,47, 70,76 e 79,89% e os encontrados
para ratos Wistar após 90 dias de dieta com rações à base de GOS foram de 64%.
CAPÍTULO III 59
Dentro dos neutrófilos, existem os bastonetes e os segmentados, no qual a
soma deles se enquadra entre 10 e 42%, sendo que os n segmentados representam
praticamente todo o valor total do somatório. Deste modo, os valores semelhantes
estatisticamente, ao nível de significância de 5%, alcançados neste trabalho, do
somatório dos n bastonetes e n segmentados equivalem a 11,93% para o grupo C,
17,08% para o grupo S e 10,01% para o grupo G.
3.2.5. Determinações bioquímicas
Na Tabela 8, estão dispostos os valores das análises bioquímicas
realizadas nos hamsters para os grupos C, S e G após 28 dias de experimento.
Tabela 8. Valores bioquímicos (média ± desvio padrão) para os grupos controle (C),
com soro de leite (S) e com soro de leite modificado rico em GOS (G), após 28 dias.
Parâmetro
-1
Controle (C)
Soro (S)
GOS (G)
TGP (IU L )
109,50±56,79
105,63±35,03
90,83±22,21a
TGO (IU L-1)
289,50±206,42a
203,88±130,39a
175,83±60,24a
Gama GT (IU L-1)
6,67±1,21a
8,50±2,83a
8,50±1,87a
Fosfatase (IU L-1)
152,67±14,28a
187,50±54,70a
175,67±23,64a
Proteínas totais (g dL-1)
5,98±0,63a
5,78±0,43a
5,68±0,26a
Albumina (g dL-1)
3,29±0,56a
3,32±0,58a
3,23±0,41a
Creatinina (mg dL-1)
0,24±0,03a
0,23±0,05a
0,25±0,04a
Uréia (mg dL-1)
55,50±5,39a
50,25±17,89a
42,00±6,20a
Glicose (mg dL-1)
87,50±32,24ab
56,13±25,09b
101,33±38,74a
Colesterol total (mg dL-1)
142,00±14,51a
116,75±27,72a
120,33±10,48a
Colesterol LDL (mg dL-1)
36,40±12,21a
29,63±11,70a
30,00±4,73a
Colesterol HDL (mg dL-1)
105,50±15,62a
87,13±23,04a
90,33±8,80a
0,35a
0,34a
0,33a
124,33±55,42a
117,50±26,13a
139,83±42,24a
Magnésio (mg dL-1)
3,62±0,71a
3,52±0,93a
3,52±0,37a
Fósforo (mg dL-1)
9,77±2,55a
8,51±2,13a
8,38±1,26a
Cálcio (mg dL-1)
10,63±0,50a
9,58±1,94a
9,80±1,33a
319,33±47,81a
292,63±88,88a
262,00±75,75a
Relação LDL/HDL
Triglicerídeos (mg dL-1)
Ferro (µg dL-1)
a
a
teste de Tukey (p<0,05).
CAPÍTULO III 60
Todos os parâmetros bioquímicos avaliados para os hamsters não
diferiram entre si para as 3 dietas utilizadas, com exceção da glicose (p<0,05).
Os testes bioquímicos específicos usados para avaliar a função hepática
podem ser separados por grupos: os testes indicativos de lesão hepatocelular,
representados pela TGP e TGO; aqueles indicativos de colestase, representados pela
fosfatase alcalina e gama GT; enquanto albumina, glicose e uréia avaliam a síntese
hepática (DIAL, 1995).
As transaminases elevadas no sangue são indicadores de problemas no
fígado, portanto, como os grupos S e G estudados não diferiram do grupo controle, os
mesmos demonstram não terem sido detectados problemas hepáticos com a sua
utilização, confirmando o exposto anteriormente com a relação do peso fígado pelo
peso corporal, o qual demonstrou não apresentar anormalidades.
Em estudos citados por Boaventura et al. (2003) utilizando ratos
desnutridos recebendo ração com 2% de proteína e, posteriormente, realimentados
com a Dieta de Quissamã adicionada da multimistura ou de componentes isolados da
mesma como suplemento, foram observados uma recuperação moderada da
desnutrição implantada, com uma diminuição nos indicadores da concentração de
proteínas totais e albumina.
Os valores de proteínas totais são bons indicadores do estado nutricional,
Marco (2008) encontrou valores entre 5,7 e 5,9 g dL-1 em ratas Wistar alimentadas
com dietas de diferentes multimisturas adicionadas de Spirulina durante 21 dias, os
quais se assemelham aos valores encontrados no presente trabalho que ficaram entre
5,68 e 5,98 g dL-1.
Os níveis médios de albumina devem ficar em torno de 4,1 mg dL-1
(HARKNESS & WAGNER, 1993), entretanto os teores encontrados para os hamsters
para os 3 grupos estudados foram todos inferiores ao recomendado, apresentando
valores respectivos de 3,29, 3,32 e 3,23 mg dL-1 para os grupos C, S e G, semelhantes
ao valores médios de 3,09 mg dL-1 encontrados por Anthony, Merriman & Heimbach
(2006) em ratos Sprague Dawley que ingeriram por 90 dias dietas com diferentes
teores de GOS.
A creatinina e a uréia são parâmetros quantificados para avaliar o
funcionamento dos rins. Ambos encontram-se dentro dos valores requeridos para
roedores complementando o resultado da relação mássica dos rins com corpo do
CAPÍTULO III 61
animal que evidencia a normalidade do órgão. Anthony, Merriman & Heimbach (2006)
avaliaram o nível máximo de ingestão de GOS e demonstraram em ratos Sprague
Dawley por 90 dias alimentados com dietas de diferentes teores deste, que não há
aumentos consideráveis na creatinina (mg dL-1) apresentando 0,51 frente ao grupo
controle RODI de 0,48 e 0,49 para a dieta controle com FOS. Urdaneta et al. (2007)
encontraram valores de uréia inferiores de 39,80 mg dL-1 para ratas Wistar
alimentadas com kefir durante 22 dias.
Harkness & Wagner (1993) sugerem que os valores de glicemia podem
variar entre 50 e 135 mg dL-1 para roedores, portanto todos os grupos avaliados
tiveram teores dentro do recomendado de 87,50ab, 56,13b e 101,33a para as
respectivas dietas: C, S e G. Feddern (2007) encontrou valores de glicose entre 60,33
e 123,33 mg dL-1 em ratas Wistar alimentadas por 28 dias com multimisturas,
enquanto Anthony, Merriman e Heimbach (2006) encontraram 139 a 141 mg dL-1 em
ratos Sprague Dawley alimentados por 90 dias com dietas com diferentes teores de
xarope de GOS, superiores ao sugerido.
O teor mais elevado de glicose sanguínea dos hamsters que ingeriram as
dietas à base de soro de leite modificado rico em GOS se justifica pela presença
superior de monossacarídeos, visto que o produto obtido da síntese é composto de
35,9 g L-1 de galactose, 119,12 g L-1 de glicose, 122,1 g L-1 de lactose e 119,8 g L-1 de
GOS, caracterizado por Lisboa (2008). Logo, é possível observar o elevado conteúdo
de glicose livre que proporciona um aumento glicêmico direto no sangue dos animais,
seguido pelo teor de galactose.
Os valores de colesterol total dos animais alimentados com as dietas
estudadas variaram, em média, de 116,75 a 142,00 mg dL-1, encontrando-se acima
dos valores descritos por Lemos (1999) para ratas Wistar alimentadas com dietas de
farelo de arroz que foram de 83,48 a 89,19 mg dL-1. Machado (2007) demonstrou em
seus estudos com hamsters alimentados durante 90 dias com dietas controle e
adicionada de bebida de soja com probiótico os respectivos valores para o colesterol
total de 133,80 e 126,06 mg dL-1, os quais podemos verificar a semelhança entre os
resultados.
Semelhante aos obtidos para níveis de triglicerídeos (triacilgliceróis) os
quais os hamsters apresentaram de 117,50 a 139,83 mg dL-1 e Lemos (1999)
encontrou valores inferiores que variam entre 84,90 a 97,73 mg dL-1. Para hamsters
que ingeriram por 90 dias dietas controle e com adição de bebida de soja probiótica os
CAPÍTULO III 62
valores encontrados foram 133,75 e 177,15 mg dL-1, respectivamente, ambos
superiores ao deste trabalho (MACHADO, 2007).
Os triglicerídeos são lipídios com a função de armazenamento de todo o
excesso de nutrientes ingeridos, seja na forma de carboidratos, proteínas ou dos
próprios lipídios. Representam a maior parte da dieta, com cerca de 95%, e constituem
a mais abundante reserva energética do organismo, sendo em média 20% do peso
corporal, equivalente a uma peso 100 vezes maior que a do glicogênio hepático (VAZ
et al., 2006).
Níveis séricos elevados de colesterol LDL estão associados ao risco de
doenças arteriais coronarianas, como a aterosclerose e a trombose, ao contrário do
colesterol HDL e dos triacilgliceróis. Portanto, é importante a redução dos níveis de
LDL em indivíduos hipercolesterolêmicos. Tais patologias ocorrem quando o colesterol
LDL permanece no sangue por não penetrar nas células e, acumula-se nas paredes
das artérias (GIRIBELA, 2007). Neste estudo, foram obtidos para o colesterol LDL os
valores de: 36,40a, 29,63a e 30,00a mg dL-1 para as dietas C, S e G, enquanto
Urdaneta et al. (2007) encontraram 65,40 mg dL-1 para ratas Wistar alimentadas com
kefir durante 22 dias.
O colesterol HDL é considerado como o “bom” colesterol, por isso os
valores obtidos de 87,13 a 105,50 mg dL-1, superiores aos encontrados por Urdaneta
et al. (2007) que foi de 51,80 mg dL-1 para ratas Wistar alimentadas com kefir durante
22 dias, foram considerados positivos.
O risco de doenças coronárias é frequentemente avaliado através da
relação entre o colesterol LDL e o colesterol HDL, em que uma elevada concentração
do colesterol LDL é considerada de alto risco para doenças cardiovasculares,
enquanto que alto nível do colesterol HDL tem efeito cardioprotetor. Embora ainda não
tenha sido determinada a relação LDL/HDL ideal para roedores de laboratório e o valor
estipulado para humanos não possa ser comparado diretamente, convenciona-se que
esta relação deve ser a mais reduzida possível para indicar uma característica
benéfica. Foram encontrados valores semelhantes estatisticamente (p<0,05) de 0,35,
0,34 e 0, 33 para hamsters dos grupos C, S e G. Silva (2009) encontrou valores de
0,43, 0,30 e 0,29 para as dietas padrão, de leite caprino e bovino. Visto que, em
ambos os trabalhos, as dietas C e padrão, que apresentaram valores superiores aos
das dietas avaliadas e que foram elaboradas somente com caseína como fonte
CAPÍTULO III 63
protéica, percebe-se que a mesma carreia gordura animal podendo influenciar no
colesterol LDL em relação ao colesterol HDL.
Visto que as dietas S e G não foram suplementadas com o mix mineral de
acordo com a AIN-93G, através dos resultados da Tabela 8 é possível verificar que os
minerais intrínsecos foram suficientes para manter os níveis de magnésio, fósforo
cálcio e ferro de acordo com o grupo C.
Com relação aos teores de magnésio o estudo com os hamsters
alimentados com as dietas C, S e G apresentou valores entre 3,52 e 3,62 mg dL-1 que
foram superiores aos encontrados por Marco (2008) em ratas Wistar alimentadas com
dietas de multimisturas e Spirulina que obtiveram valores em torno de 2,5 mg dL-1
após 21 dias de ensaio, valor este recomendado para hamsters (SANCHIS &
SILGBERGER, 1986 apud MACHADO, 2009).
Machado (2009), baseado em dados de Sanchis & Silgberger (1986),
indica que teores médios de fósforo devem ser de 5,9 mg dL-1, portanto os valores
encontrados para as dietas C, S e G entre 8,38 e 9,77 mg dL-1apresentam-se
satisfatórios. Lemos (1999) encontrou valores entre 8,01 e 11,38 mg dL-1 para as
dietas com farelo de arroz em ratas Wistar após 49 dias.
Os teores de cálcio encontrados no plasma foram semelhantes aos
descritos por Feddern (2007) que obteve valores entre 9,8 e 10,9 mg dL-1 para as ratas
Wistar alimentadas com dietas à base de diferentes multimisturas por 28 dias,
próximos aos encontrado por Anthony, Merriman & Heimbach (2006) encontraram
valores ao redor de 10 mg dL-1 em ratos Sprague Dawley que ingeriram rações com
teores distintos de GOS por 90 dias. Em humanos, o nível de cálcio no sangue varia
entre 9 e 11 mg dL-1, de acordo com Cisternas, Varga & Monte (2001) semelhante a
faixa requerida para hamsters de 5 a 12 mg dL-1 (SANCHIS & SILGBERGER, 1986
apud MACHADO, 2009).
Quanto aos níveis de ferro, os valores encontrados neste estudo foram
abaixo dos obtidos por Marco (2008) que relatou valores entre 455,8 a 506,5 µg dL-1
em ratas Wistar que ingeriram por 21 dias dietas com multimisturas e Spirulina. No
entanto, são suplementos com a finalidade de induzir a recuperação de desnutrição,
possuindo um alto potencial nutritivo conforme demonstram vários estudos
(FEDDERN, BADIALE-FURLONG & SOUZA-SOARES, 2008; MARCO, 2008).
CAPÍTULO III 64
4. CONCLUSÕES
Através dos resultados obtidos foi possível concluir que a adição do soro
de leite e soro de leite modificado rico em GOS a dietas de hamsters obteve aceitação
através dos resultados de consumo; promoveu o desenvolvimento dos animais visto
através do ganho de peso, quociente de eficiência protéica e o coeficiente de
eficiência alimentar; não alterou os pesos dos órgãos e o tamanho dos animais;
reduziu o pH dos conteúdos dos cecos dos animais; forneceu valores hematológicos e
bioquímicos adequados, demonstrando a qualidade nutricional sem causar efeitos
antagônicos.
Portanto, o GOS obtido da síntese enzimática utilizando a lactose presente
no soro de leite como substrato pode-se tornar uma alternativa potencial no
desenvolvimento de alimentos funcionais simbióticos.
CAPÍTULO III 65
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ARTIGO 2
BEBIDAS LÁCTEAS FERMENTADAS POTENCIALMENTE SIMBIÓ TICAS
CAPÍTULO III 73
BEBIDAS LÁCTEAS FERMENTADAS POTENCIALMENTE SIMBIÓTICAS
RESUMO
A demanda dos consumidores por novos produtos lácteos que desempenham efeitos
fisiológicos benéficos vem aumentando o interesse na pesquisa por alimentos
funcionais. Para um efeito sinérgico na implantação e proliferação de probióticos a
seleção de micro-organismos e prebióticos são necessárias. Assim, os galactooligossacarídeos (GOS) vêm sendo considerados como alternativa de grande
potencial. Entretanto, na adição de novos ingredientes para elaboração de alimentos,
é importante verificar possíveis alterações empregando técnicas sensoriais que
ajustem os atributos de qualidade deste alimento. Portanto, o objetivo deste trabalho
foi a elaboração de bebidas lácteas fermentadas adicionadas de probióticos e GOS
presentes no soro de leite e na lactose modificados pela enzima β-galactosidase a fim
de obter produtos aceitáveis sensorialmente e um número elevado de células viáveis.
O desenvolvimento das formulações através da análise sensorial foi realizado em
várias etapas: levantamento de termos característicos do produto; escolha de um
padrão comercial; ajuste dos atributos defeituosos o qual forneceu 2 formulações
utilizando a cultura ABT (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp. e
Streptococcus salivarius spp. thermophilus), adicionada de GOS de soro de leite e
ácido cítrico e outra com GOS sintetizado a partir de lactose, que obtiveram 66,22 e
79,78% de índice de aceitação. Foi estudada a influência da etapa de adição do GOS
em que após a fermentação foram obtidas bebidas lácteas com pH característico e
contagens de probióticos acima do requerido pela legislação de 6 log UFC mL-1.
Parâmetros para caracterização foram obtidos para as bebidas lácteas com GOS de
soro de leite, GOS de lactose e sem GOS, respectivamente: umidade (%) 86,59±0,21,
86,94±0,07 e 88,83±0,07; lipídios (%) 0,61±0,01, 0,45±0,02 e 0,58±0,01; proteínas (%)
2,47±0,10, 1,92±0,06 e 2,21±0,11; cinzas (%) 2,14±0,00, 0,92±0,07 e 0,97±0,04;
carboidratos (%) 8,19, 9,77 e 7,41; pH 5,03, 4,66 e 4,48; acidez (% ácido lático)
1,20±0,05, 1,14±0,05 e 1,41±0,08; sinérese (%) 75,39±0,46, 76,12±0,21 e 76,12±1,19;
firmeza (g) 6,62±0,16, 6,23±0,22 e 5,87±0,41; consistência (g x s) 2,23±0,29,
2,46±0,73 e 2,04±0,72; L. acidophilus (log UFC mL-1) 7,79±0,05, 7,92±0,02 e
7,46±0,10 e Bifidobacterium spp. (log UFC mL-1) 9,00±0,13, 9,04±0,04 e 8,91±0,05.
Estes resultados demonstram que as formulações possuem características de bebidas
lácteas, onde o GOS influenciou positivamente na qualidade tecnológica e probiótica.
O estudo do armazenamento em embalagens de polietileno mostrou que as mesmas
não são apropriadas para bebidas lácteas, entretanto as embalagens de vidro
demonstraram manter a viabilidade dos probióticos durante 28 dias de estocagem
refrigerada. A adição de GOS influenciou positivamente na contagem de lactobacilos e
bifidobactérias em 28 dias de armazenamento. Deste modo, a utilização do prebiótico
obtido através de síntese enzimática proporcionou a obtenção de bebidas lácteas
características e demonstrou incrementar as contagens de micro-organismos
probióticos durante 28 dias de estocagem sob refrigeração em embalagens de vidro.
Palavras-chaves: galacto-oligossacarídeos, análise sensorial, probióticos.
CAPÍTULO III 74
BEVERAGES MILK FERMENTED SYMBIOTIC POTENTIALLY
ABSTRACT
Consumer demand for new dairy products that play beneficial physiological effects has
been increasing interest in searching for functional foods. For a synergistic effect in the
deployment and proliferation of micro-organisms probiotic selection and prebiotics are
needed. Thus, galactooligosaccharides (GOS) are considered as an alternative of
great potential. However, the addition of new ingredients for food processing, it is
important to verify changes using techniques which adjust the sensory attributes of
food quality. Therefore, the objective of this work was the preparation of fermented
dairy beverages containing added probiotics and GOS present in whey and lactose
modified by the enzyme β-galactosidase in order to get sensory acceptable products
and a high number of viable cells. The formulations development through the sensory
analysis was carried out in several stages: terms identification of product
characteristics, choosing a comercial standard, the defective set of attributes which
yielded two formulations using the ABT culture (Lactobacillus acidophilus,
Bifidobacterium spp. and Streptococcus salivarius spp. thermophilus), with added GOS
whey and citric acid and another with GOS synthesized from lactose, who obtained
66.22 and 79.78% of acceptance rate. The influence of the addition step in which the
GOS was obtained after fermentation, milk beverages with a pH characteristic of
probiotics and scores above the law required by 6 log CFU mL-1. Parameters for
characterization were obtained milk drinks with GOS of whey, with GOS of lactose and
without GOS, respectively: moisture (%) 86.59±0.21, 86.94±0.07 and 88.83±0,07; lipids
(%) 0.61±0.01, 0.45±0.02 and 0.58±0.01; protein (%) 2.47±0.10, 1.92±0.06 and
2.21±0.11, ash (%) 2.14±0.00, 0.92±0.07 and 0.97±0.04; carbohydrates (%) 8.19, 9.77
and 7.41, pH 5.03, 4.66 and 4.48 and acidity (% lactic acid) 1.20±0.05, 1.14±0.05 and
1.41±0.08; syneresis (%) 75.39±0.46, 76.12±0.21 and 76.12±1.19; firmness (g)
6.62±0.16, 6.23±0.22 and 5.87±0.41; consistency (g x s) 2.23±0.29, 2.46±0.73 and
2.04±0.72 L. acidophilus (log CFU mL-1) 7.79±0.05, 7.92±0.02 and 7.46±0.10 and
Bifidobacterium spp. (log CFU mL-1) 9.00±0.13, 9.04±0.04 and 8.91±0.05. These
results demonstrate that both formulations have milk beverages characteristics, where
the GOS has positively influenced the quality technological and probiotic. The study of
storage in polyethylene bags showed that they are not suitable for dairy beverages, but
glass packaging demonstrated to maintain the probiotics viability during 28 days of
storage. The addition of GOS positive influence on the count of lactobacilli and
bifidobacteria at 28 days of storage. Thus, the use of prebiotic obtained by enzymatic
synthesis rate was obtained for milk drinks and characteristics shown to increase the
counts of probiotic micro-organisms during 28 days of storage under refrigeration in
glass packages.
Key-Words: galactooligosaccharides, sensory analysis, probiotics.
CAPÍTULO III 75
1. INTRODUÇÃO
Além dos iogurtes considerados tradicionais, a evolução tecnológica vem
conduzindo à entrada de novos conceitos como os iogurtes aromatizados, líquidos,
com pedaços de frutas e magros, bem como leites fermentados com culturas
microbianas consideradas probióticas e adição de fibras prebióticas. Estes alimentos
rápidos e práticos, também conquistam consumidores por suas qualidades sensoriais
e nutricionais. Alguns são considerados alimentos funcionais que, por sua vez, tem
impulsionado o mercado de produtos lácteos no Brasil, em especial no que diz
respeito a leites fermentados (GIMENEZ, 2002; MARTINS & BURKERT, 2009).
Dentre os prebióticos se encontram os galacto-oligossacarídeos (GOS)
que são resistentes à hidrólise pelas enzimas digestivas intestinais e possuem efeitos
fisiológicos semelhantes ao das fibras dietéticas (MORISHITA et al., 2002). A ingestão
de oligossacarídeos estimula a proliferação de probióticos no intestino, causando um
considerável benefício à saúde humana (ALANDER et al., 2001).
Os GOS podem ser produzidos a partir da lactose através de uma reação
enzimática com o uso da β-galactosidase conhecida como transgalactosilação (CHEN,
HSU & CHIANG, 2002), obtendo como produtos GOS, glicose e galactose (ALMEIDA,
2003; LISBOA, 2008).
O soro de leite, co-produto da indústria de laticínios, tem na sua
constituição proteínas, carboidratos, gordura e sais, correspondendo à fração aquosa
do leite que se obtém durante a coagulação nos processos de produção de queijos ou
caseína; apresenta altos teores de lactose, podendo ser utilizado como substrato na
síntese enzimática de GOS (GHALY, KAMAL & CORREIA, 2004; LISBOA, 2008).
Para um efeito sinérgico na implantação e proliferação de probióticos a
seleção de micro-organismos e prebióticos são necessárias (FERREIRA & TESHIMA,
2000). Assim, os GOS vêm sendo considerados com alto potencial como ingredientes
funcionais. Contudo, na adição de novos ingredientes na elaboração de alimentos, é
importante verificar possíveis alterações sensoriais no produto.
De acordo com os fatos expostos anteriormente, o objetivo deste trabalho
foi a elaboração de bebidas lácteas fermentadas simbióticas utilizando o GOS
presente no soro de leite e na lactose modificados por β-galactosidase, apresentando
qualidade tecnológica e sensorial.
CAPÍTULO III 76
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Micro-organismos, matérias-primas e insumos
Como matéria-prima para a síntese de GOS foram utilizados a lactose
monohidratada (Synth), o soro de leite e a enzima comercial β-galactosidase de
Kluyveromyces lactis Lactozym® 6500L, gentilmente cedidos pelas indústrias ELEGÊRS Brasil e Novozymes Latin America Ltda., nesta ordem.
Para realizar as fermentações foi utilizado mix de cultura de microorganismos probióticos ABT (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp. e
Streptococcus salivarius spp. thermophilus) e leite em pó desnatado, cedidos
gentilmente pela Danisco Brasil Ltda. e ELEGÊ-RS Brasil, respectivamente.
As formulações das bebidas lácteas foram elaboradas de acordo com as
respostas sensoriais obtidas em cada etapa de trabalho. Para isso foram utilizados
ingredientes, como: goma carragena (71205 Dairy mix BL da Germinal), edulcorante
sucralose (LINEA®), preparado de frutas (Borsato e Duas Rodas), corante natural
carmim de cochonilha (Christian Hansen), aroma natural de morango (Duas Rodas),
doados pelos fabricantes, sacarose e polpa de fruta de morango (mais fruta),
adquiridos no comércio local, e ácido cítrico (Vetec).
Cinco marcas comerciais de bebidas lácteas sabor morango adquiridas no
comércio local foram utilizadas para a realização de análise sensorial e escolha de
uma bebida láctea padrão, descritas a seguir:
• A- Bebida láctea fermentada light com teor de açúcares reduzido
em 50%: leite, soro de leite, açúcar, preparado de morango (açúcar líquido
invertido, polpa de morango, aroma sintético, corante natural carmim,
corante artificial ponceau, estabilizante pectina, amido modificado e
conservante sorbato de potássio) fermento lácteo, gelatina, espessante
goma guar, composto edulcorante (ciclamato, aspartame, acesulfame k,
sacarina e dextrose) e conservante sorbato de potássio;
• B- Leite fermentado parcialmente desnatado com polpa de
morango: leite parcialmente desnatado, xarope de açúcar, preparado de
morango (açúcar, morango, água, amido modificado, corante natural
carmim, acidulante ácido cítrico, conservador sorbato de potássio,
aromatizante e espessante goma xantana) soro de leite em pó, fibra
alimentar, goma acácia, fermento lácteo e B. animalis;
CAPÍTULO III 77
• C- Bebida láctea fermentada light com polpa de morango e soro de
leite: leite desnatado, soro de leite, açúcar, polpa de morango (açúcar,
morango, aroma, ácido lático, espessantes caboximetilcelulose e polvilho
de mandioca, conservante sorbato de potássio e corantes carmim e azul
brilhante) amido modificado, estabilizante (gelatina, amido modificado de
milho, pectina cítrica, goma guar e açúcar), espessante gelatina e cultura
microbiana;
• D- Bebida láctea fermentada com soro de leite e polpa de morango:
leite, soro de leite, água, açúcar, preparado de morango (polpa de
morango sem semente, açúcar refinado, água, aroma idêntico ao natural,
espessante carragena, ácido cítrico, conservante sorbato de potássio,
corante artificial ponceau e corante natural carmim), espessante (amido
modificado e gelatina), conservante sorbato de potássio e fermentos
lácteos;
• E- Bebida láctea fermentada com soro de leite: leite, soro de leite,
preparado de frutas (sacarose, polpa de morango, água, aroma natural,
corante natural carmim, estabilizante pectina cítrica, conservante sorbato
de potássio), espessante goma guar e cultura láctea.
2.2. Síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS)
As reações de síntese enzimática de GOS em meio aquoso foram
realizadas em reatores em batelada, com agitação e temperatura controlada. O
sistema de reação composto pelo soro de leite desidratado, previamente caracterizado
quanto à composição (AOAC, 2000), suspenso em tampão fosfato pH 7,0 de forma
apropriada, para resultar na concentração de 40% de lactose e 10 U mL-1 de atividade
da enzima β-galactosidase Lactozym® 6500L (Novozymes), a temperatura utilizada foi
de 40 °C e agitação de 180 rpm durante 4 h (LISBOA, 2008). Estas condições levam a
obtenção de um contendo 3,59% de galactose, 11,91% de glicose, 12,21% de lactose
e 11,98% de GOS.
Na síntese utilizando a lactose, as condições foram: 30 °C, 40% de
lactose, 10 U mL-1 de atividade enzimática, pH 7,0 em tampão fosfato e agitação de
180 rpm por 16 h, obtendo-se um produto com 17,53% de GOS, 27,7% de glicose e
28,5% de lactose(LISBOA, 2008). Na Figura 1 estão apresentados o processo de
síntese e os produtos obtidos.
CAPÍTULO III 78
A atividade da enzima foi determinada segundo Inchaurrondo, Yantorno &
Voget (1994), em que uma unidade de β-galactosidase é definida como a quantidade
de enzima que libera 1 µmol de o-nitrofenol por minuto nas condições do ensaio e a
composição dos produtos foi determinada por Lisboa (2008) através do sistema
Dionex DX-500 (Sunnyvale, CA, USA) utilizando uma coluna de troca aniônica
CarboPac PA1 (250x4 mm) e uma pré-coluna CarboPac PA1.
Figura 1. a) Processo de síntese; b) Soro de leite em pó e lactose monohidratada
modificados enzimaticamente por β-galactosidase enriquecidas com GOS.
2.3. Fermentação
Para o preparo das fermentações foi utilizado leite em pó desnatado em
concentração que corresponde a 12% de sólidos solúveis não gordurosos sendo
realizado um tratamento térmico a 93 °C por 3 minutos. Após, o leite foi resfriado até
42 °C e adicionado do mix de cultura ABT que corresponda a 0,035 g L-1, conforme
recomendado pela Danisco Brasil Ltda. Durante as fermentações a temperatura foi
mantida em 42 °C e ao longo do tempo de processamento o pH foi determinado até
atingir valores de 4,7-4,8 (Figura 2). Após o processo foi cessado via resfriamento com
banho de gelo até aproximadamente 8 °C (THAMER & PENNA, 2006).
CAPÍTULO III 79
Figura 2. Processo fermentativo com controle automático de temperatura e
acompanhamento de pH.
2.4. Análises físico-químicas
2.4.1. Determinação do pH
A determinação do pH das amostras foi realizada potenciometricamente
em pHmetro digital modelo HI221 da marca Hanna Instruments (AOAC, 2000).
2.4.2. Determinação de acidez titulável
A acidez titulável foi determinada ao longo do processo fermentativo,
utilizando amostras de 10 mL do fermentado, em triplicata, por titulação com solução
de NaOH (0,111 mol L-1) - soda Dornic - e expressa em ácido lático (INSTITUTO
ADOLPHO LUTZ, 1985).
2.4.3. Textura Instrumental
A análise da textura dos leites fermentados foi realizada no Laboratório de
Tecnologia de Alimentos (LTA) da Universidade Federal do Rio Grande (FURG) - em
analisador de textura modelo TA-XT2i (Stable Micro Systems, Godalming, Inglaterra)
controlado por microcomputador a partir do método adaptado de Hauly, Fuchs &
Prudencio-Pereira (2005). As amostras foram preparadas em recipientes de polietileno
(25x30 mm) e foram percorridas por um probe cilíndrico de acrílico de diâmetro de 1,2
cm (P 0,5), força de 4,5 g, velocidade pré-teste de 1 mm s-1, velocidade de penetração
do probe de 2 mm s-1, velocidade pós-teste de 10 mm s-1 e distância de penetração de
CAPÍTULO III 80
3 mm. A partir das análises de textura foram obtidos os parâmetros de firmeza (g) e
consistência (g x s) para a bebida láctea padrão e para as bebidas lácteas
desenvolvidas neste trabalho.
2.4.4. Sinérese
As amostras de bebidas lácteas foram homogeneizadas com um bastão de
vidro, sendo agitados 20 vezes no sentido horário e 20 no sentido anti-horário. Foram
pesados aproximadamente 30 g em tubos de centrífuga de 50 mL e armazenados por
2 h a 4 ºC para estabilização. Após, foram centrifugadas a 10 ºC (centrífuga modelo
CT500R-CIENTEC) 6000 x g por 20 minutos equivalente a 3313 x g por 15 minutos,
conforme descrito na metodologia adotada. O soro separado foi pesado e a sinérese
expressa como relação (%) de massa do soro/massa inicial (AMATAYAKUL,
SHERKAT & SHAH, 2006).
2.4.5. Composição proximal
As análises de lipídios, proteínas, umidade e cinzas para a composição
proximal do soro de leite, leite em pó e bebidas lácteas fermentadas foram realizadas
segundo a metodologia oficial da AOAC (2000). Os carboidratos foram determinados
por diferença.
2.5. Análise sensorial
Os testes foram realizados em cabines individuais no Laboratório de
Análise Sensorial e Controle de Qualidade (LASCQ-FURG) e todos os julgadores das
análises eram professores, técnicos e estudantes do curso de Engenharia de
Alimentos da FURG não treinados de ambos os sexos e possíveis consumidores das
bebidas lácteas fermentadas sabor morango.
Para estas avaliações foram utilizados 25 mL de cada amostra servida
refrigerada em copos plásticos descartáveis e codificados com números aleatórios de
três dígitos. As amostras foram apresentadas aos julgadores utilizando o delineamento
experimental completo em quadrado latino sendo avaliadas da esquerda para direita.
2.5.1. Desenvolvimento das formulações
Após obtenção dos leites fermentados (item 2.3) e a incorporação dos
aditivos, foi realizada a maturação das bebidas lácteas por 24 h e posterior análise
sensorial.
CAPÍTULO III 81
De acordo com os resultados obtidos nos testes sensoriais ao longo de
todas as etapas de desenvolvimento dos produtos foram sendo elaboradas diferentes
formulações, a fim de encontrar a melhor resposta dos julgadores em relação aos
atributos característicos de uma bebida láctea fermentada sabor morango sendo esta
avaliada com relação aos parâmetros microbiológicos e tecnológicos.
No Quadro 1 estão dispostas as codificações utilizadas e a composição de
cada formulação confeccionada para a obtenção de um produto com aceitação
sensorial satisfatória. A Figura 3 apresenta uma bebida láctea com aditivos e outra
natural, respectivamente.
Salienta-se que o teor de GOS adicionado visa obter um produto com um
teor acima do mínimo requerido para apresentar potencial prebiótico. A quantidade
adicionada de sacarose, corante natural carmim de cochonilha, aroma natural de
morango e polpa de morango foi de acordo em estudos de Moraes et al. (2007). O teor
de edulcorante baseou-se na sua relação da doçura que é de 600 vezes quando
comparada a sacarose, conforme informações do fabricante (LINEA®) convertendo-se
para o estudado para o dissacarídeo (MORAES et al., 2007). Os demais ingredientes
da formulação foram baseados em indicações do fabricante, estudos preliminares e
nos limites indicados pela legislação (BRASIL, 2005).
Figura 3. Bebidas lácteas fermentadas com aditivos e natural, respectivamente.
CAPÍTULO III 82
Quadro 1. Formulações elaboradas no desenvolvimento das bebidas lácteas.
Codificação
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
Formulação
• 3,5% de GOS (soro de leite modificado 11,98% GOS)1;
• 0,02% de edulcorante sucralose;
• 1% de preparado de frutas Borsato*.
• 3% de GOS (soro de leite modificado 11,98% GOS)1;
• 2% de preparado de frutas Borsato*;
• 0,25% de goma carragena.
• 12% de sacarose;
• 6% de preparado de frutas Duas Rodas**;
• 12% de sacarose;
• 6% de preparado de frutas Duas Rodas**;
• 0,15% de corante natural carmim de cochonilha;
• 0,4 g/L aroma natural de morango;
• 5% polpa de morango congelada;
• 0,25% de goma carragena;
• 0,0025% de ácido cítrico2.
• 0,015% de edulcorante sucralose
• 0,25% de goma carragena;
• 0,0060% de ácido cítrico3.
• 3% de GOS (lactose modificada 17,53% GOS)1;
Memorial descritivo do produto: Anexos 1* e 2**;
1
Teor determinado por Lisboa (2009);
2
limiar absoluto do ácido cítrico (ASTM, 1968);
3
limiar de reconhecimento do ácido cítrico (ASTM, 1968).
CAPÍTULO III 83
2.5.2. Levantamento de termos
Inicialmente, para determinar as características mais relevantes das
bebidas lácteas comerciais (A e B) e de uma bebida láctea elaborada como teste
(Formulação I do Quadro 1), foi utilizado um grupo de 11 julgadores.
O questionário e a ficha utilizada para o reconhecimento dos hábitos dos
julgadores e levantamento de termos encontram-se nos Apêndices 1 e 2,
respectivamente.
2.5.3. Teste de ordenação
Para seleção de uma bebida láctea padrão foram utilizadas 4 amostras
comerciais de bebidas lácteas sabor morango (B, C, D e E) mediante aplicação do
teste discriminativo de ordenação segundo a NBR 13170 (ABNT, 1994a), usando uma
equipe composta por 31 julgadores para ordenar quanto a preferência (em ordem
crescente), salientando que o sabor morango e o sabor residual a edulcorante seriam
as características mais relevantes. Uma escala de 4 pontos foi usada, onde 1
representou menos preferida e 4 foi referente a mais preferida, segundo a ficha
avaliativa (Apêndice 3).
2.5.4. Teste de diferença do controle
Após a escolha da bebida láctea padrão (D), frente a este, foi utilizado um
teste de diferença do controle ou comparação múltipla de acordo com a NBR 13526
(ABNT, 1995) com 35 julgadores avaliando 4 diferentes formulações de bebidas
lácteas elaboradas (II, III, IV e V do Quadro 1). As modificações nas formulações
destas bebidas foram às concentrações de preparado de frutas, edulcorante e
sacarose para avaliação do dulçor e sabor residual, utilizando escala de 9 pontos
(Apêndice 4).
2.5.5. Comparação pareada
Foram realizados sequencialmente três testes de comparação pareada,
conforme NBR 13088 (ABNT, 1994b) em que foram utilizadas fichas para os dois
primeiros de acordo com o Apêndice 5 e para o terceiro conforme Apêndice 6.
1º) Foi realizado um teste com 35 julgadores avaliando novamente a
formulação II (Quadro 1), que mais se aproximou do padrão no teste de diferença do
controle, com o padrão comercial selecionado;
CAPÍTULO III 84
2º) O teste foi realizado com 36 julgadores, que avaliaram a formulação II
com a formulação VI, conforme Quadro 1, na qual a VI foi elaborada com corante,
aroma e polpa nas concentrações estudadas por Moraes et al. (2007) em substituição
ao preparado de frutas Borsato, intencionando a possível correção de alguns termos
levantados como “defeitos”;
3º) Com a finalidade de melhorar alguns atributos “defeituosos” foi
realizado uma terceira Comparação Pareada utilizando 36 julgadores para avaliar as
formulações II e VII (Quadro 1), em que se diferem apenas por esta última ser
adicionada de 0,0025% de ácido cítrico, que corresponde ao seu limiar absoluto
(ASTM, 1968).
2.5.6. Avaliação da intensidade do gosto salgado
Após as avaliações de comparação pareada ainda foi levantado o gosto
salgado nas formulações. Portanto, foi utilizado o Tetraedro de Henning, que
demonstra que existem relações entre os quatro gostos básicos podendo-se verificar
que há sinergia entre os gostos doce, ácido e salgado em uma das superfícies.
Portanto, ao aumentar os gostos ácido e doce se verifica um deslocamento para a
aresta que corresponde aos mesmos (QUEIROZ & TREPTOW, 2006).
Por isso foi realizado um teste de escala não-estruturada (9 cm) com 37
julgadores para quantificação da intensidade do gosto salgado. Para obter estas
respostas foram elaboradas 4 formulações (II, VII, VIII e IX do Quadro 1), em que se
utilizou ácido cítrico nos limiares absoluto e de reconhecimento (ASTM, 1968) e o
GOS sintetizado a partir da lactose monohidratada. A ficha utilizada na realização do
teste se encontra no Apêndice 7. A concentração de ácido cítrico, recomendada de
acordo com Brasil (2005) não determina uma concentração específica, sendo
considerada quantum satis.
2.5.7. Teste de aceitação e intenção de compra
Para avaliar a aceitabilidade das formulações referente à aceitação global,
foi realizado um teste afetivo conforme as NBRs 12994 e 14141 (ABNT, 1994c; ABNT,
1998), com escala hedônica de 9 pontos (Apêndice 8).
O teste foi realizado com mais de 100 julgadores inseridos na população
consumidora de bebidas lácteas e em momentos diferentes para que os julgadores
não as amostras não fossem comparadas entre si.
CAPÍTULO III 85
Pediu-se aos provadores que avaliassem as amostras VII e IX (Quadro 1)
quanto à aceitação das mesmas. Com este teste foi possível calcular o índice de
aceitação das bebidas lácteas pelos julgadores e a média a fim de caracterizar o nível
de acordo com a escala hedônica (Apêndice 8).
Juntamente, foi avaliada a intenção de compra dos julgadores em relação
às amostras analisadas através de uma escala assinalada, a qual corresponde à
seguinte pontuação: 1- Eu certamente não compraria este produto; 2- Eu
provavelmente não compraria este produto; 3- Tenho dúvidas se compraria ou não
este produto; 4- Eu provavelmente compraria este produto e 5- Eu certamente
compraria este produto.
2.6. Avaliação da adição do prebiótico antes e após o processo fermentativo
Foi avaliada a influência do momento da adição do GOS obtido a partir do
soro de leite e da lactose monohidratada modificados enzimaticamente antes e após o
término do processo fermentativo, o qual foi conduzido conforme item 2.3, resultando
em quatro formulações distintas, estimando-se um teor mínimo de 3% do prebiótico,
conforme a seguir:
• Bebida láctea fermentada adicionada de GOS de lactose antes da
fermentação;
• Bebida láctea fermentada adicionada de GOS de lactose após a
fermentação;
• Bebida láctea fermentada adicionada de GOS de soro de leite antes da
fermentação;
• Bebida láctea fermentada adicionada de GOS de soro de leite após a
fermentação.
Neste estudo foi realizado o acompanhamento durante o processo
fermentativo analisando o pH e logo após o término da mesma foram feitas contagens
de micro-organismos probióticos (lactobacilos e bifidobactérias), de acordo com os
itens 2.7.1 e 2.7.2.
CAPÍTULO III 86
2.7. Análises microbiológicas
2.7.1. Contagem de Lactobacillus acidophilus
Para a enumeração de Lactobacillus acidophilus, em unidades formadoras
de colônia (UFC), foi utilizado o meio de cultura MRS (MAN, ROGOSA & SHARP) com
técnica de semeadura em profundidade. As placas de Petri, após a inoculação, foram
incubadas em estufa invertidas a 37 ºC por um período de 72 h na presença de
oxigênio (VINDEROLA & REINHEIMER, 1999).
2.7.2. Contagem de Bifidobacterium spp.
Para a enumeração UFC de Bifidobacterium spp. foi utilizado o meio de
cultura MRS adicionado de propionato de sódio (0,3%) e cloreto de lítio (0,2%) para
inibir as outras bactérias anaeróbias. A técnica utilizada para inoculação foi por
semeadura em profundidade. Após a inoculação, as placas de Petri foram incubadas
invertidas em câmara com gerador e indicador de anaerobiose (PROBAC) a 37 ºC por
72 h (VINDEROLA & REINHEIMER, 1999).
2.8. Análise estatística
Todos os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente de acordo
com o método utilizado e a resposta requerida. Todas as análises foram realizadas no
mínimo em triplicata.
Os resultados dos testes de ordenação foram analisados através do teste
não paramétrico de Friedman (p<0,05) utilizando-se a tabela de Newell e MacFarlane,
para verificar se havia diferença significativa entre as amostras de acordo com o
exposto por Queiroz & Treptow (2006).
Para o teste de diferença do controle foi aplicado o teste de Dunnett
(p<0,05). Nos testes de comparação pareada a análise estatística foi realizada
utilizando a tabela de Roessler (p<0,05). O teste t de Student foi utilizado no teste de
aceitação e intenção de compra.
Foi realizada Análise de Variância (ANOVA) e as médias das réplicas
comparadas entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05).
Para a realização destas análises foi utilizado o software Statistica 7.0
(StatSoft, 2004).
CAPÍTULO III 87
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Caracterização da matéria-prima
Para caracterizar o soro de leite e o leite em pó foram realizadas as
análises para determinação de proteínas, lipídios, cinzas e umidade; o teor de lactose
foi obtido através do método da diferença, considerando como sendo o total dos
carboidratos. Os resultados estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Composição proximal da matéria-prima (média ± erro padrão).
Determinações*
Soro de leite
Leite em pó desnatado
Leite em pó desnatado**
Umidade (%)
7,99±0,41
4,31±0,12
3,1
Proteínas (%)
10,84±0,66
34,18±1,08
34,7
Lipídios (%)
0,53±0,07
0,55±0,04
0,9
Cinzas (%)
7,93±0,10
8,04±0,16
8,2
72,71
52,92
53,0
Lactose*** (%)
*Base seca;
**Valores de acordo com a Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2006);
***Considerada como o total de carboidratos.
Lisboa (2008) ao caracterizar o soro de leite em pó encontrou 4,67% de
umidade, enquanto, de acordo com a Tabela 1, é possível observar que o soro de leite
deste trabalho possui maior teor, com 7,99%, demonstrando alta higroscopicidade,
evidenciando a necessidade de determinação da mesma antes da realização da
síntese enzimática para obter um cálculo do teor de lactose mais exato. Esta alteração
na porcentagem da umidade interfere nos outros teores da composição da amostra.
Através dos resultados da Tabela 1, é possível verificar um teor de
proteínas relativamente baixo para o soro de leite, frente ao teor do leite visto que o
mesmo e obtido da coagulação das proteínas no processo de elaboração de queijos;
entretanto para lipídios e cinzas não são observadas diferenças entre eles. O soro de
leite é rico em lactose, justificando sua utilização como substrato na síntese de GOS.
Segundo o Codex Alimentarius (2006) o soro de leite em pó deve
apresentar aproximadamente 61% de lactose e 2% de lipídios; no mínimo 10% de
proteínas e, no máximo, 5% de umidade e 9,5% de cinzas. Assim, o soro utilizado
apresentou composição dentro de esperado, diferindo somente no teor de umidade.
CAPÍTULO III 88
Com relação ao leite, é possível verificar que para as concentrações de
proteínas, cinzas e lactose os valores foram semelhantes comparados com a Tabela
Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2006), entretanto para umidade foi
obtido teor maior, o que pode ser explicado devido ao leite ser altamente higroscópico
e para o teor de lipídios, foram encontrados experimentalmente valores inferiores.
3.2. Desenvolvimento das formulações
3.2.1. Levantamento de termos
Após analisar as respostas obtidas através do questionário (Apêndice 1)
foram selecionados 11 julgadores que consumiam bebidas lácteas sabor morango
frequentemente e tinham interesse em participar da equipe sensorial.
Foram levantados os atributos para aparência, aroma, sabor, gosto e
textura das bebidas lácteas comerciais A e B e formulação I, elaborada de acordo com
o Quadro 1, que estão dispostos no Quadro 2.
Quadro 2. Atributos levantados para as bebidas lácteas avaliadas.
Atributos
Formulação I
Aparência Cor alaranjada
Aroma
Morango
Bebida comercial A
Bebida comercial B
Cor rosa claro e artificial
Cor rosa forte
Pouca viscosidade
Partículas (polpa)
Morango (fraco)
Morango (forte)
Adocicado (leve)
Sabor
Gosto
Morango
Morango (fraco)
Leite (residual)
“Remédio” (residual)
Leite (residual)
Morango
Doce (forte)
Doce (fraco)
Doce
Salgado
Textura
Viscosidade
(característica)
Ácido
Viscosidade (baixa)
Viscosidade
(característica)
Com relação às características presentes na bebida láctea de formulação I
(Quadro 1) foi verificado cor alaranjada, aroma de morango, sabor de morango, sabor
residual a “remédio” e textura viscosa característica do tipo de produto (Quadro 2).
Ao avaliar iogurtes líquidos sabor morango de quatro marcas comerciais
na versão tradicional (adoçadas com sacarose) e as mesmas marcas adoçadas com
CAPÍTULO III 89
substitutos da sacarose (edulcorantes), Moraes (2004) obteve os seguintes termos
levantados sensorialmente: para aparência - cor rosa, presença de polpa, viscosidade;
aroma - morango natural, doce, ácido, artificial; sabor - doçura, ácido, doçura residual,
amargo residual, morango, artificial, adstringente; textura - homogeneidade,
consistência.
Os termos encontrados por Moraes (2004) demonstram o perfil sensorial
de uma bebida láctea sabor morango. Portanto, a partir dos resultados obtidos para a
formulação I (Quadro 1), foi necessário modificar a composição a fim de melhorar as
características consideradas “defeituosas” no produto, que são: cor alaranjada, gosto
muito doce, gosto salgado e sabor residual a “remédio”. Para isso a formulação I foi
modificada: reduzindo o teor de soro de leite modificado rico em GOS devido a
coloração e o gosto salgado; aumentando a concentração do preparado de frutas já
estudado; testando outro preparado de frutas e a sacarose como alternativa adoçante;
e diminuindo a porcentagem de edulcorante, que provoca o sabor residual a “remédio”.
3.2.2. Teste de ordenação
A fim de selecionar uma amostra comercial como um padrão de referência
foi realizado um teste de ordenação com 4 amostras comerciais de bebidas lácteas
sabor morango (B, C, D e E), as quais os somatórios e as médias das suas
pontuações neste teste encontram-se na Tabela 2.
A bebida láctea comercial A não foi utilizada devido aos termos levantados
que caracterizam o perfil sensorial para a mesma não ter sido satisfatório, optando por
avaliar a bebida comercial B juntamente com outras do mercado.
Tabela 2. Somatório (média ± desvio padrão) da pontuação do teste de ordenação.
Amostras
Pontuação Total
Pontuação média
B
78
2,52±1,06ª
C
83
2,68±0,91ª
D
98
3,16±0,97ª
E
51
1,64±1,02b
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatísticas significativas entre os grupos através
do teste de Friedman (p≤0,05);
Escala: 1 - menos preferida e 4 - mais preferida.
CAPÍTULO III 90
De acordo com a Tabela 2 as amostras B, C e D não apresentaram
diferença estatística significativa (p≤0,05) em relação à preferência, porém todos
diferiram da amostra E que apresentou a menor pontuação com relação aos sabores
morango e residual.
Foi realizado o teste de Friedman, a fim de averiguar se as amostras são
provenientes de populações análogas ou se provêm de populações distintas. Através
da Tabela de Newell & MacFarlane (QUEIROZ & TREPTOW, 2006), com o número de
amostras (4) e o número de julgadores (31), a diferença crítica entre os totais de
ordenação de 27 (p<0,05). Assim, todas as amostras que diferirem entre si por um
valor maior ou igual a 27 são significativamente diferentes (p≤0,05).
A Figura 4 demonstra a freqüência das pontuações (1, 2, 3 e 4) dadas
pelos julgadores para as amostras comerciais B, C, D e E no teste de ordenação.
Figura 4. Frequência das pontuações das amostras comerciais B, C, D e E em
relação ao teste de ordenação.
Através dos resultados expressos na Figura 4 é possível observar que a
amostra D recebeu a maior nota (4) o maior número de vezes. A segunda posição foi
ocupada em maior freqüência pela amostra comercial B, seguida da amostra C. A
amostra E recebeu pontuação 1 em uma frequência elevada (20 julgamentos) e
apresentou menor preferência com relação ao sabor morango e sabor residual de
edulcorante, sendo considerados pouco característico quando comparado às demais
amostras em estudo.
CAPÍTULO III 91
A diferença entre as bebidas D e E, de acordo com seus rótulos, está
principalmente nos tipos de espessantes, o que pode ter influenciado nas respostas
sensoriais, assim como os teores de cada ingrediente dos produtos.
A amostra D foi selecionada por apresentar pontuação total e média
maiores, e freqüência de nota máxima superior às demais amostras no teste de
ordenação, sendo utilizada como amostra padrão para sequência do trabalho.
3.2.3. Teste de diferença do controle
Após a identificação dos termos relevantes para a correção do produto em
desenvolvimento e a escolha de uma referência comercial foram realizadas alterações
na formulação I em que se reduziu em todas as bebidas elaboradas a quantidade de
soro de leite modificado para o que correspondesse a 3,0% de GOS, assim como a
redução do dulçor diminuindo a porcentagem de sucralose para 0,015% e aumentando
a quantidade de preparado de frutas já utilizado. Foram estudadas formulações com
sacarose e outro preparado de frutas.
Então, foi realizada uma comparação com 4 formulações diferentes (II, III,
IV e V, conforme Quadro 1) e o padrão selecionado no teste anterior (bebida láctea
comercial D) para se obter uma formulação elaborada que mais se aproxime do
padrão comercial. Na Tabela 3 estão dispostas as respostas para os atributos
avaliados de doçura e sabor residual.
Tabela 3. Doçura e sabor residual no teste de diferença do controle.
Amostra
Média ± desvio padrão
Doçura
Sabor residual
Padrão
4,66 ± 0,97a
5,06 ± 1,00a
II
5,49 ± 2,33a
6,40 ± 2,21b
III
6,03 ± 2,43b
6,69 ± 2,25b
IV
6,49 ± 2,02b
6,49 ± 1,95b
V
6,77 ± 2,16b
7,03 ± 1,93b
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatísticas significativas entre as amostras e o
padrão através do teste de Dunnet (p<0,05).
Através do teste de Dunnet apenas a formulação II no dulçor não
demonstrou diferença significativa do padrão, porém, para o sabor residual todas as
amostras diferiram do padrão, entretanto a bebida láctea fermentada II foi a que
CAPÍTULO III 92
obteve menor diferença sendo selecionada para continuidade dos estudos para o
desenvolvimento das formulações.
3.2.4. Comparação pareada
A formulação II foi utilizada, juntamente com o padrão a fim de se
determinar a amostra preferida e os atributos sensoriais relevantes. Após o teste, foi
observada uma preferência de 34 dos 35 julgadores pelo padrão, logo, através da
Tabela de Roessler para o teste pareado bicaudal a 5% de significância (QUEIROZ &
TREPTOW, 2006) o mínimo necessário seria de 24 painelistas, resultando numa
preferência significativa pelo padrão. Ainda foi verificada a descrição frequente do
gosto salgado e sabor residual de “remédio”, provavelmente característicos do soro de
leite e do edulcorante, respectivamente, na Formulação II.
Portanto, foi necessário dar continuidade elaborando testes com outras
formulações com o objetivo de melhorar os aspectos sensoriais e diminuir o gosto
salgado e o sabor residual de edulcorante. Foi realizada novamente uma comparação
entre as formulações II e VI (Quadro 1), em que houve a substituição dos aditivos
artificiais presentes no preparado de frutas por aditivos naturais.
De
acordo
com
a
Tabela
de
Roessler,
não
houve
diferença
estatisticamente significativa entre as amostras II e VI a 95% de confiança, entretanto
a amostra II apresentou maior pontuação (22 dos 35 julgadores), optando por realizar
uma terceira comparação entre as formulações II e VII elaboradas conforme Quadro 1,
em que se utilizou o ácido cítrico na concentração do limiar absoluto para determinar
se existe um sinergismo entre os gostos ácidos e salgado. Os julgadores foram
instruídos a verificar se existia diferença entre as formulações ou não.
Os resultados obtidos neste último teste apontaram 19 acertos e 16 erros
por parte dos julgadores e, a partir da Tabela de Roessler para teste bicaudal, foi
possível afirmar, ao nível de 5% de significância, que não há diferenças significativas
entre as amostras analisadas.
Através dos comentários foi possível determinar que o ácido cítrico
mascarou parcialmente o gosto salgado, fornecendo um alternativa para a elaboração
de uma formulação aceitável sensorialmente.
Queiroz & Treptow (2006) afirmam que o gosto amargo de certos sais,
como cálcio, presente no soro de leite, pode ser atribuída aos seus cátions, e o gosto
salgado, aos ânions de outros minerais e cloretos presentes em solução. A inserção
CAPÍTULO III 93
de 0,0025% de ácido cítrico na formulação pode contribuir para o mascaramento do
gosto salgado atribuído aos sais, através da interação entre íons.
Segundo o Tetraedro de Henning, existem relações entre os quatro gostos
básicos podendo-se verificar que há sinergia entre os gostos doce, ácido e salgado em
uma das superfícies. Portanto, ao aumentar os gostos ácido e doce se verifica um
deslocamento para a aresta que corresponde aos mesmos (QUEIROZ & TREPTOW,
2006).
3.2.5. Avaliação da intensidade do gosto salgado
Na Tabela 4 estão dispostos os resultados da quantificação do gosto
salgado em escala não-estruturada de 9 pontos para 4 formulações de bebidas lácteas
sabor morango (II, VII, VIII e IX) elaboradas de acordo com o exposto no Quadro 1.
Tabela 4. Intensidade do gosto salgado (média ± desvio padrão) para as bebidas
lácteas fermentadas sabor morango.
Formulação
Intensidade do gosto salgado
II
6,89 ± 2,12a
VII
5,32 ± 2,68b
VIII
5,94 ± 2,81ab
IX
1,03 ± 1,52c
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatísticas significativas entre as amostras
através do teste de Tukey (p<0,05).
A partir dos resultados obtidos da intensidade do gosto salgado para as
formulações elaboradas com GOS proveniente da síntese enzimática utilizando a
lactose do soro de leite como substrato (II, VII e VIII), é possível verificar que todas
obtiveram os maiores valores.
A formulação VIII, a qual continha maior concentração de ácido cítrico
(0,0060%), de acordo com os comentários obtidos pelos julgadores, foi a que mais
diferiu das características de bebidas lácteas, pois apresentou arenosidade, acidez
acentuada, menor viscosidade e, ainda, o gosto salgado. A queda na viscosidade e a
presença de grânulos pode ter ocorrido devido a precipitação de algumas proteínas
em virtude da maior concentração de ácido, assim como a separação de fases
também constatada. Segundo Bobbio & Bobbio (2003), as proteínas possuem uma
estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades
CAPÍTULO III 94
físicas e biológicas, que, quando alteradas as estruturas quaternária, terciária e
secundária ocorre a desnaturação. Entre os vários agentes de desnaturação de
proteínas estão os ácidos que levam a diminuição da solubilidade, perda de atividade
biológica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, entre outros. Com
relação à intensidade do gosto salgado a mesma não diferiu das outras formulações
elaboradas com soro de leite rico em GOS. Portanto essa concentração não é
adequada para o “mascaramento” do gosto salgado assim como descaracteriza o
produto quanto bebida láctea.
A formulação II (elaborada com soro modificado rico em GOS e sem
adição de ácido) obteve maior intensidade do gosto salgado, evidenciando a hipótese
de que o gosto ácido possui a capacidade de interagir com os gostos doce e salgado.
Enquanto a formulação VII, que continha 0,0025% de ácido cítrico, dentre todas as
bebidas lácteas elaboradas com soro de leite modificado rico em GOS, obteve menor
intensidade do gosto salgado, sendo selecionada para dar continuidade no trabalho.
A formulação IX foi a que obteve menor intensidade do gosto salgado
diferindo das demais bebidas lácteas (p<0,05%), isto ocorreu provavelmente devido ao
GOS adicionado que foi obtido a partir da síntese enzimática realizada com lactose
monohidratada. Enquanto as formulações II, VII e VIII foram elaboradas com GOS
proveniente da conversão da lactose presente no soro de leite que é rico em minerais,
a estes sais atribuímos a procedência do gosto salgado. Portanto, a formulação IX
também foi selecionada para a realização da continuidade do trabalho.
3.2.6. Teste de aceitação e intenção de compra
Para avaliar a aceitabilidade das formulações VII e IX, elaboradas de
acordo com o Quadro 2, foi realizado um teste afetivo, com escala hedônica de 9
pontos e intenção de compra com escala de 5 pontos, cujos resultados estão
dispostos na Tabela 5.
Tabela 5. Aceitação e intenção de compra das bebidas lácteas.
Formulação
Aceitação
Intenção de compra
(%)
(%)
VII
66,22a
5,96±1,55a
64,60a
3,23±0,83a
IX
79,78a
7,18±1,52a
77,40a
3,87±0,87a
através do teste t de Student (p<0,05).
CAPÍTULO III 95
Observando-se a análise estatística dos resultados expostos na Tabela 5 é
possível constatar que não houve diferença significativa (p<0,05) para as amostras
avaliadas quanto à aceitação e intenção de compra. Entretanto a formulação
elaborada com GOS a partir da síntese utilizando a lactose monohidratada obteve
maior índice nestas avaliações. Devido a esta semelhança entre as formulações
analisadas, pode-se constatar que bebidas lácteas fermentadas sabor morango
adicionadas de soro de leite modificado rico em GOS pode ser uma alternativa
comercial com apelo de ser um produto simbiótico de baixo custo econômico devido a
sua aceitação sensorial se apresentar em torno de “gostei ligeiramente” (Apêndice 8).
Apesar da formulação IX apresentar um custo elevado os resultados
sugerem que bebidas elaboradas com lactose monohidratada, por apresentar uma
avaliação acima do “gostei regularmente” (Apêndice 8) poderia ser comercializada
para um público mais exigente com maior poder aquisitivo, entretanto concorreria com
ao atuais produtos existentes no mercado.
Moraes (2004) demonstra que em seu trabalho, houve uma menor
preferência e aceitação do consumidor por bebidas lácteas adoçadas com
edulcorantes, ao avaliar a impressão global de iogurtes líquidos comerciais sabor
morango, obtendo uma maior média de aceitação para amostra com sacarose, de
6,94; enquanto que para amostra com edulcorante, foi de 4,62, que quando
comparada aos valores obtidos neste trabalho pelas formulações elaboradas com
GOS e adoçadas com o edulcorante sucralose é possível verificar que ambas
obtiveram valores médios maiores de aceitação.
Bebidas de soja foram avaliadas afetivamente através do teste de
aceitação por Machado (2007) com relação a adição de açúcar e a fermentação com
micro-organismo probiótico. Neste trabalho, a maior média foi de 5,25 para impressão
global da bebida de soja fermentada probiótica adicionada de 5% de sacarose.
Entretanto, Antunes, Cazzeto & Bolini (2005) obtiveram as médias para
aceitação de 6,58 e 6,46 para impressão global de iogurtes probióticos, avaliando a
relação de adição de proteína de leite em pó desnatado e concentrado protéico de
soro de leite. Sendo, estes valores superiores ao encontrado neste trabalho para a
bebida láctea de formulação VII, porém menores que o obtido para a formulação IX.
A intenção de compra apresenta um valor próximo de 3 para a formulação
VII e 4 para a IX, demonstrando que o comportamento respectivo do consumidor seria
CAPÍTULO III 96
de “Tenho dúvidas se compraria ou não este produto” e “Eu provavelmente compraria
este produto” (Apêndice 8), sendo estes considerados satisfatórios.
3.3. Influência da adição de GOS na contagem de probióticos
Um ensaio preliminar foi realizado para avaliar a contagem de microorganismos probióticos nas bebidas lácteas recém fermentadas, a fim de verificar a
influência da proveniência do GOS (soro de leite ou lactose monohidratada) e da
adição deste prebiótico antes ou logo após o processo fermentativo. Visto que a
sobrevivência das bactérias probióticas em leites fermentados depende de vários
fatores, tais como: cepas utilizadas, a interação entre as espécies presentes, as
condições da cultura, da composição química do meio de fermentação, acidez final,
teor de sólidos, a disponibilidade de nutrientes, promotores de crescimento e
inibidores, da concentração de açúcares (osmótica pressão), oxigênio dissolvido,
quantidade de inóculo, a temperatura de incubação, tempo de fermentação e
temperatura de armazenamento (LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001).
Foram realizadas 4 fermentações distintas quanto o momento da adição
do prebiótico (antes ou após a fermentação) e a origem do GOS (conversão da lactose
do soro de leite ou da lactose monohidratada), em que suas respectivas contagens de
Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium spp. estão dispostos na Tabela 6, assim
como o pH final dos fermentados.
Tabela
6. Contagem de micro-organismos probióticos e pH das bebidas lácteas
adicionadas de GOS antes e após o processo fermentativo.
Adição de GOS
Substrato
L. acidophilus
Bifidobacterium spp.
convertido em GOS
(log UFC mL-1)
(log UFC mL-1)
7,49b
5,52b
6,1
7,60a
7,45a
4,7
Soro de leite
5,66c
5,52b
5,8
Soro de leite
7,50b
7,45a
4,7
Antes da
Lactose
fermentação
monohidratada
Após
Lactose
fermentação
monohidratada
Antes da
fermentação
Após
fermentação
pH
CAPÍTULO III 97
O término da fermentação é caracterizado por alcançar pH 4,7 (THAMER
& PENNA, 2006), o que ocorreu em no máximo 2,5 h em todas as fermentações
realizadas durante a realização deste trabalho em sua totalidade. Entretanto, nos
ensaios em que se utilizou os GOS antes do processo fermentativo não foram
alcançados pHs característicos do produto permanecendo estagnados das 3 h até 5 h
de fermentação, optando, então, por cessar a mesma. Este fato pode ter ocorrido
devido a inibição pelo excesso de substrato que influencia no crescimento celular e,
consequentemente, no decréscimo do pH; pelo efeito tamponante dos sais presentes
no xarope de GOS ou ainda pelo aumento da pressão osmótica no meio pela
presença dos sais e das fibras prebióticas (LOURENS-HATTINGH & VILJOEN, 2001).
Desta forma, as bebidas lácteas adicionadas de GOS antes do processo
fermentativo não foram consideradas por não se apresentarem características com o
produto, dando continuidade ao trabalho com fermentações realizadas sem adição de
prebiótico, incorporando-se o mesmo após o término do processo fermentativo.
De acordo com os resultados da Tabela 6 é possível verificar que as
bebidas lácteas enriquecidas com GOS após o processo fermentativo foram as que
apresentaram pH de 4,7 em um tempo médio de 2,5 h sendo o valor característico
para o termino a fermentação.
Com relação às contagens de L. acidophillus e Bifidobacterium spp.,
ambas bebidas se encontram dentro das especificações requeridas para um produto
alimentício ser considerado probiótico, visto que o preconizado pela legislação
brasileira (BRASIL, 2002) é de 106 UFC mL-1 de micro-organismos probióticos viáveis
quando da aquisição do mesmo, tal valor equivale a 6,0 log UFC mL-1, tornando os
produtos obtidos neste estudo como potenciais probióticos.
A formulação que foi acrescida de soro de leite modificado após a
fermentação, apresentou a contagem de 7,50 log UFC mL-1 para lactobacilos, por
outro lado, a bebida que foi adicionada de GOS de lactose monohidratada após o
término da fermentação se diferiu da mesma demonstrando um aumento na contagem
alcançando 7,60 log UFC mL-1.
Para a contagem de Bifidobacterium spp. foi possível verificar que nas
formulações em que foi adicionado o GOS após fermentação não diferiram em relação
a origem do substrato (soro de leite ou lactose monohidratada) alcançando valores de
7,45 log UFC mL-1 para ambos.
CAPÍTULO III 98
Barreto et al. (2003), averiguaram a contagem dos micro-organismos
lácteos presentes em bebidas lácteas fermentadas comerciais, ao avaliar as
contagens de micro-organismos probióticos em uma bebida láctea fermentada com L.
acidophilus e bifidobactérias, verificou que haviam 5,70 e 5,20 log UFC mL-1,
respectivamente, expressando que a perda de viabilidade desses micro-organismos
nos produtos fermentados parece não depender apenas do tempo de estocagem, mas
também da própria sensibilidade das cepas às condições de processo, visto que foi
considerado a validade e o tempo decorrido da mesma.
Um Delineamento Composto Central Rotacional foi realizado por Castro
(2007) com o objetivo de avaliar o efeito de diferentes teores de soro de leite líquido
(27,93 a 42,07%v/v) e de oligofrutose Raftilose, Beneo P95® (1,379 a 5,621%m/v) em
bebidas ABT, e, dentre as respostas obtidas foi avaliado o número de probióticos, que
não variou entre os ensaios efetivados, estando entre 6,12 e 6,84 log UFC mL-1 após
o término da fermentação.
Entretanto, Machado (2007) alcançou contagens superiores às deste
trabalho e próximas a 10,00 log UFC mL-1 de lactobacilos em bebidas elaboradas a
partir de extrato de soja.
Como conseqüência, os resultados mostraram que com a utilização de
GOS após o processo fermentativo se obtém produtos caracterizados como
potencialmente simbióticos, apresentando contagem suficiente para promover efeitos
benéficos à saúde do consumidor, além de contribuir para os efeitos tecnológicos, fato
evidenciado pela ação de L. acidophilus e Bifidobacterium spp. (ANTUNES, 2007).
3.4. Caracterização das formulações finais
Frente a uma bebida controle (elaborada com as mesmas concentrações
de aditivos das formulações VII e IX, mas sem adição de GOS e ácido cítrico), foram
realizadas determinações para verificar a influência da adição de GOS obtido
enzimaticamente nas características das bebidas lácteas fermentadas.
Após a maturação por 24 h das bebidas fermentadas VII e IX, de
formulação conforme Quadro 1, e na bebida controle, foram realizadas as análises de
composição proximal (umidade, proteínas, lipídios, cinzas e carboidratos), parâmetros
pós-acidificação (pH, acidez e sinérese), textura (firmeza e consistência) e contagem
de micro-organismos probióticos (L. acidophilus e Bifidobacterium spp.), dispostos na
Tabela 7.
CAPÍTULO III 99
Tabela 7. Caracterização das bebidas lácteas (média ± erro-padrão) após 24 h de
maturação.
Determinações
Formulação VII Formulação IX
Controle
Composição proximal
Umidade (%)
86,59±0,12c
86,94±0,04b
88,83±0,04a
Lipídios (%)
0,61±0,01a
0,45±0,01b
0,58±0,01a
Proteínas (%)
2,47±0,06a
1,92±0,03c
2,21±0,06b
Cinzas (%)
2,14±0,00a
0,92±0,04b
0,97±0,02b
8,19b
9,77a
7,41c
5,03a
4,66b
4,48c
Acidez (% ácido lático)
1,20±0,03b
1,14±0,03b
1,41±0,04a
Sinérese (%)
75,39±0,27a
76,12±0,12a
76,12±0,69a
Firmeza (g)
6,62±0,09a
6,23±0,13a,b
5,87±0,24b
Consistência (g x s)
2,23±0,17a
2,46±0,42a
2,04±0,41a
L. acidophilus (log UFC mL-1)
7,79±0,03a
7,92±0,01a
7,46±0,06b
Bifidobacterium spp. (log UFC mL-1)
9,00±0,08a
9,04±0,02a
8,91±0,03a
Carboidratos (%)
Parâmetros pós-acidificação
Ph
Textura
Probióticos
Nas análises de umidade verifica-se que as formulações adicionadas de
GOS apresentam valores inferiores, com 86,59 e 86,94% para as formulações VII e IX,
enquanto a controle 88,83%, sendo todas diferindo entre si. Comportamento
semelhante ao encontrado por Castro (2007), que ao adicionar 0, 2 e 5% de
oligofrutose observou uma redução de umidade diretamente proporcional a quantidade
adicionada do prebiótico, obtendo 85,10, 82,80 e 80,23%, respectivamente,
demonstrando que a adição de fibras influencia nesta determinação. Porém, Oliveira
(2006) obteve um aumento na porcentagem de umidade com relação à adição de soro
de leite com 83,16, 83,51 e 85,06 para os teores de 10%, 30% e 50%, nesta ordem.
As porcentagens de lipídios apresentaram valores coerentes com a
matéria-prima utilizada, sendo a formulação VII a que mostrou um teor acima das
demais (0,61%), entretanto não diferindo da bebida controle (0,58%), o que pode ter
ocorrido devido a ter a incorporação de 25% do total da bebida com soro de leite
modificado (que possui 11,98% de GOS correspondendo a 3% de prebiótico na
CAPÍTULO III 100
bebida), contendo um pequeno teor de gordura. A amostra Controle demonstra
semelhança significativa com a Formulação VII por apresentar a mesma concentração
de leite em pó e diferindo da formulação IX (0,45%) que contém 17% do seu total de
xarope de GOS (que possui 17,53% de GOS, teor este correspondendo a 3% na
bebida) obtido a partir da lactose isenta de gorduras. Este teor de lipídios é
considerado favorável, visto que consumidores que demandam por produtos mais
nutritivos, em geral, preferem aqueles menos calóricos. Castro (2007) encontrou um
teor em torno de 2,20% em bebidas lácteas elaboradas com leite pasteurizado (3% de
gordura) adicionado de 30% de soro de leite e diferentes concentrações de
oligofrutose.
De acordo com os resultados de proteínas, todas as formulações estão
conforme o recomendado pelo Padrão de Identidade e Qualidade – PIQ, de no mínimo
1,2% (BRASIL, 2005). Através do exposto na Tabela 7, é possível constatar
novamente a influência da matéria-prima utilizada na confecção das bebidas, em que
a formulação VII apresenta maior teor protéico (2,47%), diferindo das demais, estando
de acordo, pois o soro de leite possui aproximadamente 11% de proteínas. Após,
encontra-se a bebida controle com 2,21% e a formulação IX com 1,92% a qual é
adicionada de GOS obtido de lactose que não possui proteínas na sua composição.
Todos os valores de proteínas obtidas para as formulações elaboradas (VII, IX e
Controle), foram inferiores aos encontrados por Castro (2007), que obteve bebidas
probióticas acrescentadas de soro de leite e oligofrutose com teor em torno de 2,70%.
O teor de carboidratos demonstrou estar coerente com o esperado, já que
a formulação IX forneceu o maior valor com 9,77%, diferenciando-se das demais
bebidas e concordando com o fato da adição de 17% de xarope de GOS obtido da
lactose, que é composto de 27,7% de glicose e 28,5% de lactose e 17,5% de GOS
(LISBOA, 2008), evidenciando o aumento dos carboidratos do produto. Após, tem-se a
formulação VII com 8,19% de carboidratos, demonstrando que a incorporação do soro
modificado - 3,59% de galactose, 11,91% de glicose, 12,21% de lactose e 11,98% de
GOS, além das proteínas, lipídios e cinzas (LISBOA, 2008) - incrementa
significativamente quando comparado ao controle com 7,41%.
O mesmo
comportamento, devido à adição de fibras, foi obtido nas bebidas lácteas com soro de
leite e diferentes teores de prebióticos (0, 2 e 5%), apresentando 9,43, 11,70 e 14,33%
(CASTRO, 2007) sendo superiores aos das bebidas elaboradas neste estudo.
A determinação de cinzas nas bebidas lácteas ratificou o fato do soro de
leite possuir um alto teor de minerais, e que, possivelmente não sejam metabolizados
CAPÍTULO III 101
pelos micro-organismos lácteos; visto que o leite em pó também possui uma grande
concentração de sais, mas que não se mantém após fermentação e não confere gosto
salgado identificado sensorialmente nas bebidas adicionadas de soro. De acordo com
a Tabela 7, é possível observar que a formulação VII se diferencia das demais com um
teor de cinzas de 2,14%, enquanto as formulações IX e Controle apresentaram os
valores de 0,92 e 0,97%. No entanto, concentrações em torno 0,60% foram obtidas
por Castro (2007) em bebidas lácteas probióticas adicionadas de fibras e soro de leite.
O pH obtido logo após a fermentação foi de 4,70, entretanto verifica-se que
após a adição do soro de leite modificado enzimaticamente rico em GOS o pH
apresenta um aumento alcançando um valor de 5,03 para a formulação VII que difere
das demais. Nas bebidas IX e controle os pHs mantiveram-se abaixo de 4,70 mesmo
após a incorporação dos aditivos. Moraes (2004) cita que iogurtes com pHs na faixa
3,9-4,1 são desagradáveis ao paladar devido à sua elevada acidez. Fuchs et al. (2006)
obtiveram pHs de 4,33 para iogurtes com Lactobacillus casei com e sem
suplementação de inulina e oligofrutose. Iogurtes ABY com lactulose (2,5%)
apresentaram pH de 4,67 e sem 4,64 não demonstrando a influência deste prebiótico
utilizado (ÖZER, AKIN & ÖZER, 2005).
A acidez das bebidas após o término da fermentação e elaboração das
formulações forneceu valores de 1,20, 1,14 e 1,41% de ácido lático para as bebidas
VII, IX e controle, respectivamente; em que se pode observar que a adição do xarope
de GOS nas bebidas conferiu menor porcentagem em acido lático, diferindo, ambas,
da bebida controle. Humphreys & Plunkett (1969) recomendam uma acidez titulável de
1,05 a 1,25%, estando as formulações elaboradas com GOS nesta faixa. Entretanto,
todos os teores de ácido lático obtidos por Castro (2007) nas bebidas lácteas com
prebióticos e probióticos foram 0,78%, apresentando-se inferiores. Contudo, Fuchs et
al. (2006) obtiveram porcentagem de ácido lático de 1,27 e 1,15 para iogurtes com
Lactobacillus casei com e sem suplementação de inulina e oligofrutose, nesta ordem.
A sinérese ou separação espontânea do soro na superfície de bebidas
lácteas são consideradas como um defeito, este problema pode ser reduzido ou
eliminado pelo aumento no nível de sólidos solúveis no leite até 15% (TAMIME &
ROBINSON, 2000). Alternativas incluem o uso de estabilizantes como amido, gelatina
e gomas vegetais ou exopolissacarídeos produzidos por culturas starter. Foram
realizadas análise de sinérese nas bebidas lácteas elaboradas obtendo porcentagens:
que não diferem umas das outras. Optou-se por avaliar a sinérese no padrão
comercial D escolhido sensorialmente neste trabalho a fim de obter um valor de
CAPÍTULO III 102
referência, encontrando um valor de 77,89 ± 2,76% que não diferiu das amostras VII,
IX e controle. A influência da adição de diferentes concentrações de sólidos solúveis
em iogurtes foi avaliada por Amatayakul, Sherkat & Shah (2006) que verificaram uma
queda no teor de sinérese de mais de 10% aumentando os sólidos solúveis de 9 para
14%, em que as bebidas apresentaram os respectivos valores em torno de 70 e 60%.
Vários fatores afetam a viscosidade, a consistência e a estabilidade do
iogurte, como a homogenização, o tratamento térmico, a acidificação, a temperatura
de incubação e as condições de armazenamento, conforme citado por Silva (2007).
A fim de obter valores para relacionar as formulações elaboradas foram
realizadas as mesmas análises de textura nas mesmas condições para a bebida
comercial D selecionada como padrão em teste sensorial anterior. Foram obtidos os
valores de 5,88 ± 0,62 g para firmeza e 2,75 ± 0,69 g x s para consistência.
A firmeza obtida no texturômetro é a substituição ao parâmetro dureza que
é definida como a força máxima durante o primeiro ciclo de compressão, análogo a
primeira mordida (BUENO, 2008). Ao observar a Tabela 7 é possível verificar que a
firmeza da bebida controle se apresenta inferior a formulação VII e IX, as quais foram
semelhantes.
Isto
pode
ter
ocorrido
devido
à
propriedade
conferida
aos
oligossacarídeos em acentuar a textura (CRITTENDEN & PLAYNE, 1996).
Comparando estes resultados com os da bebida comercial D (5,88 g) confirma-se a
influência da adição de GOS no aumento da firmeza.
Tamime & Robinson (2000) afirmaram, em estudos, que durante o
processo de elaboração de iogurtes há um aumento do teor de aminoácidos livres e
peptídeos. As proteínas desempenham um importante papel na formação do coágulo
e, portanto, a consistência e a viscosidade do produto são geralmente proporcionais à
concentração das mesmas. A coesividade medida pelo texturômetro é definida como a
proporção da área da curva da segunda compressão em relação à primeira
compressão, a resistência a tensão também é uma manifestação da coesividade
(MOHAPATRA & BAL, 2007). Os valores para este parâmetro, expostos na Tabela 7
não apresentam diferenças entre as amostras, porém são inferiores ao obtido pela
bebida comercial D (2,75 g x s), no entanto, as bebidas adicionadas de GOS mostram
ser mais consistentes que a bebida controle.
As bebidas lácteas elaboradas demonstraram altas contagens de
probióticos encontrando-se conforme o requerido pela legislação (BRASIL, 2002). Nas
quantidades de células viáveis de lactobacilos se observa que a bebida controle diferiu
das adicionadas de GOS que se apresentaram como semelhantes entre si,
CAPÍTULO III 103
comprovando que a adição do soro de leite e da lactose monohidratada ricos em GOS
aumenta a contagem deste micro-organismo, que pode ter ocorrido devido ao
processo de síntese enzimática além da transgalactosilação também quebra a lactose
em monossacarídeos aumentando a disponibilidade de nutrientes no meio. Esse
comportamento é evidenciado comparando as contagens das Tabelas 6 e 7 realizadas
logo após a fermentação e depois de 24h da mesma, respectivamente. Em ambas as
bebidas houve crescimento mesmo após o abaixamento da temperatura para cessar o
processo fermentativo.
Com relação às bifidobactérias é possível constatar que todas as amostras
analisadas tiveram contagens em torno de 9,00 log UFC mL-1 não diferindo umas das
outras, porém o comportamento foi semelhante ao dos lactobacilos, em que a bebida
IX obteve 9,04 log UFC mL-1, a VII 9,00 log UFC mL-1 e a controle 8,91 log UFC mL-1,
também fornecendo valores maiores para as bebidas adicionadas de GOS, explicado
pela maior quantidade de monossacarídeos disponíveis nas bebidas adicionadas de
lactose monohidratada e soro de leite modificados ricos em GOS que podem ter sido
metabolizados pelas bifidobactérias, aumentando significativamente suas contagens
de 7,45 log UFC mL-1 logo após o término da fermentação para valores em torno de
9,00 log UFC mL-1 24 h depois.
Fuchs et al. (2006) obtiveram contagens de probióticos semelhantes
encontrando 8,96 e 8,51 log UFC mL-1 o que demonstra que a suplementação de
inulina e oligofrutose para iogurtes com Lactobacillus casei influencia na viabilidade
celular. Enquanto Oliveira & Damin (2003) obtiveram em média 9,15 log UFC mL-1 de
L. acidophilus em bebidas lácteas com diferentes concentrações de sólidos solúveis e
sacarose.
Oliveira et al. (2009) avaliaram diferentes tipos de prebióticos nas
contagens de micro-organismos probióticos obtendo maiores valores de B. lactis nas
bebidas adicionadas de oligofrutose e polidextrose cerca de 8,5 log UFC mL-1,
enquanto a maltodextrina obteve menos que 8 log UFC mL-1 apresentando um pouco
acima da bebida sem adição de fibras.
3.5. Influência da embalagem na viabilidade de probióticos durante o
armazenamento
O armazenamento de produtos probióticos é considerado crítico devido à
baixa resistência destes micro-organismos, sendo necessário o controle de diversos
fatores para garantir a permanência mínima requerida de células viáveis.
CAPÍTULO III 104
Para isso, a embalagem deve seguir alguns critérios como: ser
impermeável aos sabores, corantes, odores do ambiente, oxigênio e contaminações
externas; resistir à acidez do iogurte, à umidade, golpes mecânicos a que o produto é
sujeito durante o transporte e armazenamento e não permitir exposição do produto à
luz. Uma opção para produção em pequena escala tem sido a embalagem de
polietileno termoformada que apresenta, também, facilidade para o fechamento
térmico, assim como a embalagem de vidro (SILVA, 2007).
Foram realizadas 3 diferentes bebidas lácteas a fim de verificar, durante o
armazenamento durante 28 dias a 4 ºC, a influência da adição de 3% de prebiótico e
do tipo de embalagem (vidro e polietileno) nas contagens de micro-organismos
probióticos, que estão apresentados nas Tabelas 8 e 9.
Aos leites fermentados foram adicionados: 0% de GOS (G0); soro de leite
modificado rico em GOS (S3) e lactose monohidratada modificada rica em GOS (L3),
as duas últimas com adição correspondendo a 3% do prebiótico.
Tabela 8. Contagem de L. acidophilus em bebidas lácteas fermentadas sem GOS
(G0), 3% de GOS de soro leite modificado (S3) e 3% de GOS de lactose
Tempo de estocagem (dias)
1
7
14
21
28
Embalagem
L. acidophilus (log UFC mL-1)
G0
S3
L3
Polietileno
7,69e,A
7,79c,A
7,87b,A
Vidro
7,62d,A
7,81c,A
7,91a,A
<4d,B
<4d,B
<4d,B
7,60c,A
7,79b,A,B
7,83a,B
<4d,B
<4d,B
<4d,B
Vidro
7,61c,A
7,78b,B
Polietileno
<4d,B
6,92c,B
<4d,B
7,83a,B
<4d,B
7,73b,C
7,77a,C
<4d,B
<4d,B
<4d,B
6,62c,C
7,72b,C
7,78a,C
Polietileno
Vidro
Polietileno
Vidro
Polietileno
Vidro
Letras minúsculas diferentes na mesma linha para cada tempo de estocagem indicam diferenças
estatísticas significativas entre as amostras através do teste de Tukey (p<0,05);
Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna para cada tipo de embalagem indicam diferenças
estatísticas significativas entre as amostras através do teste de Tukey (p<0,05).
CAPÍTULO III 105
Tabela 9. Contagem de Bifidobacterium spp. em bebidas lácteas fermentadas sem
GOS (G0), 3% de GOS de soro leite modificado (S3) e 3% de GOS de lactose
Tempo de estocagem (dias)
1
7
14
21
28
Embalagem
Bifidobacterium spp. (log UFC mL-1)
G0
S3
L3
Polietileno
8,78e,A
8,98d,A
9,08c,A
Vidro
8,79e,A
9,11b,A
9,20a,A
<4c,B
<4c,B
<4c,B
8,77b,A,B
9,08a,B
9,08a,B
<4c,B
<4c,B
<4c,B
Vidro
8,75b,B
8,98a,C
Polietileno
<4c,B
7,36b,C
<4c,B
8,99a,C
<4c,B
8,97a,C
8,98a,C
<4c,B
<4c,B
<4c,B
6,99b,D
8,98a,C
8,99a,C
Polietileno
Vidro
Polietileno
Vidro
Polietileno
Vidro
Letras minúsculas diferentes na mesma linha para cada tempo de estocagem indicam diferenças
estatísticas significativas entre as amostras através do teste de Tukey (p<0,05);
Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna para cada tipo de embalagem indicam diferenças
estatísticas significativas entre as amostras através do teste de Tukey (p<0,05).
Ao analisar os resultados referentes às contagens dos micro-organismos
probióticos, é possível observar um comportamento semelhante para as bebidas
lácteas com relação à viabilidade celular durante o período de 28 dias nas diferentes
embalagens estudadas. Percebe-se que nas embalagens de polietileno, a partir do
sétimo dia de estocagem não foi possível recuperar contagens acima de 104 UFC mL-1
tanto para os lactobacilos quanto para as bifidobactérias nas 3 bebidas lácteas
fermentadas (Tabelas 8 e 9), demonstrando a possibilidade da difusão de oxigênio
para o interior da embalagem ou ainda a possibilidade de migração de algum
componente do material para o conteúdo da mesma. Entretanto, nas bebidas
armazenadas em vidro se identifica a permanência de contagens acima do requerido
para ser considerada probiótica, demonstrando durante todo o acompanhamento a
primazia pela utilização deste tipo de material considerado inerte.
Com relação às contagens para lactobacilos (log UFC mL-1) nas bebidas
lácteas foi verificado que no primeiro dia todas as amostras possuem células de
probióticos viáveis acima do preconizado pela ANVISA (BRASIL, 2002) demonstrando
ser maior nas bebidas adicionadas de GOS de lactose, com maior número na
CAPÍTULO III 106
embalagem de vidro (7,91) e após na embalagem de polietileno (7,87); seguida das
bebidas com soro de leite modificado (7,81 e 7,79), consideradas iguais e das sem
adição de GOS (7,69 e 7,63) distintas quanto à embalagem, apresentando-se maior na
embalagem de polietileno.
Nos outros tempos de estocagem avaliados o comportamento se mantém
da mesma forma, em que todas as bebidas lácteas em embalagens de vidro se
diferem significativamente estando sempre com maior contagem a amostra L3, após a
S3 e por último a amostra G0.
Ao se observar os resultados ao longo do acompanhamento, ou seja, de
um tempo para o outro, uma queda ocorre em todas as amostras. Do primeiro para o
sétimo dia, somente as bebidas adicionadas de GOS apresentam um declínio que se
difere de modo significativo, enquanto a bebida controle permanece igual até os 14
dias. No vigésimo primeiro dia as contagens em todas as bebidas caem, sendo
distintas da semana anterior em que se salienta a queda apresentada pela bebida
controle que passa a fornecer valores inferiores a 7,0 log UFC mL-1. No entanto, as
amostras S3 e L3 permanecem iguais dos 21 para os 28 dias enquanto a amostra G0
demonstra uma tendência ao declínio, diferindo da semana antecedente.
A presença de maior quantidade de substratos nas bebidas elaboradas
com soro de leite e lactose monohidratada modificados ricos em GOS devido à ação
da enzima que quebra a lactose disponibilizando no meio monossacarídeos,
juntamente com a transgalactosilação, pode ter influenciado nas contagens de
lactobacilos ao longo do armazenamento, visto que aos 28 dias as bebidas S3 e L3
diferiram da G0 positivamente.
Antunes, Cazetto & Bolini (2005) ao estudarem a influência da adição de
concentrado protéico de soro de leite na contagem de probióticos em bebidas ABY
após 21 dias, verificaram um aumento de 1,8 ciclos logarítmicos nos lactobacilos
mantendo as contagens acima de 6,0 log UFC mL-1.
Em iogurtes elaborados com diferentes concentrações de culturas láticas
tradicionais e probióticas em iogurtes com caseinato de cálcio e inulina durante 28 dias
de estocagem, Silva (2007) obteve contagens em torno de 8,0 log UFC mL-1 para L.
acidophilus, entretanto, observou uma redução de aproximadamente 0,3, 0,2 e 0,6
ciclos logarítmicos para as amostras de iogurte com 0,5%, 1,0% e 1,5% de culturas
lácticas, respectivamente, após o término do tempo de armazenamento estudado,
CAPÍTULO III 107
demonstrando que um aumento na concentração de inóculo não inibe o decréscimo da
contagem, porém as bebidas com maior quantidade inicial fornecem uma contagem
maior após a estocagem.
As bifidobactérias, no primeiro dia, se apresentaram em maior número de
contagens (log UFC mL-1) nas amostras adicionadas de GOS diferindo entre elas
quanto à origem do substrato e o tipo de embalagem, conforme a ordem a seguir: L3
armazenada em vidro (9,20), após a amostra S3 em vidro (9,11) e as amostras L3 e
S3 em polietileno (9,08 e 8,98), por fim, a amostra G0 não diferiu com relação às
embalagens de polietileno e vidro (8,78 e 8,79).
Nas outras semanas, foram obtidas nas bebidas lácteas armazenadas em
recipientes de vidro, contagens semelhantes entre as amostras adicionadas de GOS
mostrando-se diferentes positivamente da bebida G0.
Nas análises semanais para as bebidas armazenadas em vidro é possível
perceber um declínio no número de UFC mL-1 do primeiro para o sétimo dia em todas
as amostras e do sétimo para o décimo quarto apenas nas amostras com adição de
prebiótico. No entanto, as bebidas L3 e S3 demonstraram constância nas contagens
até o dia 28, enquanto a amostra G0 permaneceu decaindo do dia 14 até a última
semana, demonstrando também uma tendência decrescente. Este fato evidencia a
influência do fator de crescimento promovida pelos GOS em manter as bifidobactérias
viáveis durante a estocagem refrigerada aumentando a probabilidade de alcançarem o
trato gastrointestinal com potencial capacidade de colonização (TAMIME, MARSHALL
& ROBINSON, 1995).
As bebidas adicionadas de soro de leite e lactose monohidratada
modificados ricos em GOS apresentam maior quantidade de substratos metabolizáveis
pelas bifidobactérias, pois a enzima β-galactosidase atuam na transgalactosilação e
quebra da lactose liberando no meio monossacarídeos que possivelmente
aumentaram as contagens quando comparadas a bebida G0 que se apresentou
estatisticamente diferente das demais ao nível de confiança de 95%.
A utilização de concentrado protéico de soro de leite em bebidas lácteas,
também possui um alto potencial em promover o aumento de bifidobactérias, devido à
presença de α-lactoalbumina e β-lactoglobulina, principais proteínas do soro de leite, o
que pode influenciar também no presente trabalho. Dave & Shah (1998) ratificaram
esta afirmativa através dos resultados obtidos para fermentados lácteos ABT que
CAPÍTULO III 108
obtiveram um incremento de 3 ciclos logarítmicos nas contagens de probióticos pela
adição do concentrado protéico de soro de leite quando comparados a uma bebida
controle, demonstrando um aumento substancial na viabilidade celular.
No desenvolvimento de buttermilk probiótico, Antunes et al. (2007)
pesquisaram se a adição de sacarose, edulcorante, aromatizantes e corantes
interferiria nas contagens microbiológicas de B. animalis spp. lactis mantendo-se
viáveis após 28 dias de armazenamento do produto; sendo observado que estes
ingredientes influenciam, mas ainda assim, o número de células viáveis atendeu à
legislação em todas as amostras com uma média de 8,11 log UFC mL-1.
A contagem do número de células viáveis do micro-organismo probiótico
Bifidobacterium spp. permaneceu entre 6,0 e 7,0 log UFC mL-1 para iogurtes ABY
adicionados de caseinato de cálcio e inulina, em que se verificou a influência da
concentração de inóculo, estudando 0,5%, 1,0% e 1,5% de cultura, que tiveram uma
redução de aproximadamente 0,4; 1,0 e 0,3 ciclos logarítmicos para os iogurtes,
respectivamente após 28 dias de estocagem (Silva, 2007). Apresentando-se menor do
que o encontrado neste trabalho para as bebidas lácteas adicionadas de GOS.
Akalin, Fenderya & Akbulut (2004) estudaram a influência da adição de
1,5% de FOS em iogurtes observando as contagens de B. animalis e B. longum
durante 28 dias de estocagem refrigerada, as quais apresentaram uma queda ao
longo do armazenamento em todas as bebidas elaboradas, visto que a concentração
inicial foi entre 7,46 e 7,61 log UFC mL-1. As B. longum tiveram uma queda de 1 ciclo
logarítmico nos primeiros 7 dias e a partir dos 21 dias já apresentaram valores
inferiores a 106 UFC mL-1. No vigésimo oitavo dia, o FOS incrementou a contagem de
B. animalis de 7,02 para 7,35 log UFC mL-1, quando comparado ao controle, embora
nas contagens de B. longum não se obteve diferença entre as bebidas controle e
adicionadas de FOS, apresentando 5,30 log UFC mL-1.
CAPÍTULO III 109
4. CONCLUSÕES
Os resultados apresentados mostraram que através da análise sensorial
foi possível determinar as características adequadas das bebidas lácteas sabor
morango adicionadas de GOS com índice de aceitação e intenção de compra
satisfatórios. Bebidas lácteas fermentadas com adição de GOS após a fermentação
alcançaram o pH característico do produto e contagens de micro-organismos
probióticos acima de 7,0 log UFC mL-1.
A
utilização
do
prebiótico
obtido
através
de
síntese
enzimática
proporcionou a obtenção de bebidas lácteas com composição proximal, parâmetros
pós-acidificação e textura característicos e, ainda, demonstrou aumentar as contagens
de micro-organismos probióticos. O estudo do armazenamento em diferentes
embalagens mostrou que as constituídas de polietileno não são apropriadas para o
armazenamento, entretanto as embalagens de vidro demonstraram manter a
viabilidade dos probióticos durante 28 dias de estocagem refrigerada sendo
influenciada positivamente em 1 ciclo logarítmico com a adição de soro de leite e
lactose monohidratada modificados rico em GOS.
Portanto o GOS obtido da síntese enzimática utilizando o soro de leite e a
lactose monohidratada pode tornar-se uma alternativa no desenvolvimento de bebidas
lácteas funcionais potencialmente simbióticas e aceitáveis pelo consumidor.
CAPÍTULO III 110
ABNT- ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS, NBR 13170: “Teste de
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CAPÍTULO IV
CONCLUSÃO GERAL
CAPÍTULO IV 116
1. CONCLUSÃO GERAL
Os resultados apresentados demonstraram que as dietas elaboradas com
soro de leite e soro de leite modificado oferecidas a hamsters durante 28 dias
favoreceram o ganho de peso, o coeficiente de eficiência alimentar e o quociente de
eficiência protéica, assim como evidenciaram a aceitação através dos resultados de
consumo, promovendo o desenvolvimento dos animais; não alterou os pesos dos
órgãos e o tamanho dos animais; reduziu o pH das fezes presentes no ceco dos
animais; forneceu valores hematológicos e bioquímicos adequados, demonstrando a
qualidade nutricional sem causar efeitos adversos. Portanto, os resultados sugerem
que o soro modificado rico em GOS, pode tornar-se uma alternativa no
desenvolvimento de alimentos funcionais com potencial simbiótico por favorecerem o
crescimento de probióticos na microflora intestinal.
Através da análise sensorial, foi possível obter formulações de bebidas
lácteas simbióticas com soro de leite e lactose modificados ricos em GOS
características físico-químicas e tecnológicas dentro dos Padrões de Identidade e
Qualidade e índice de aceitação em torno de 70%, além de contagens de microorganismos probióticos acima do preconizado pela legislação vigente.
A adição de GOS, antes da fermentação, dificultou o decréscimo do pH
enquanto as formulações com adição de GOS após a fermentação alcançaram o pH
característico do produto; através das análises microbiológicas e do pH pode-se
verificar que a adição de GOS após o processo fermentativo proporcionou alcançar um
produto simbiótico e característico.
O estudo do armazenamento em diferentes embalagens mostrou que as
embalagens de polietileno não são apropriadas para o armazenamento, enquanto que
embalagens de vidro demonstraram manter a viabilidade dos probióticos durante 28
dias de estocagem refrigerada. A adição de GOS influenciou positivamente na
contagem de lactobacilos e bifidobactérias em 28 dias de armazenamento.
Portanto, o GOS obtido da síntese enzimática utilizando o soro de leite e
lactose monohidratada pode tornar-se uma alternativa no desenvolvimento de bebidas
lácteas funcionais potencialmente simbióticas e aceitáveis pelo consumidor.
CAPÍTULO V
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CAPÍTULO V 118
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CAPÍTULO VI
APÊNDICES E ANEXOS
CAPÍTULO VI 137
APÊNDICE 1
LABORATÓRIO DE ANÁLISE SENSORIAL E CONTROLE DE QUALIDADE
Perfil dos julgadores para desenvolvimento de Bebidas Lácteas Fermentadas
Sabor Morango
Nome: __________________________________ Data: __________
Instruções: Leia atentamente as questões a seguir, e marque o nível de
concordância para cada uma das afirmativas.
1.
Qual sua freqüência de consumo de Bebidas Lácteas Fermentadas?
Diariamente ( )
2.
Semanalmente ( ) Quinzenalmente ( )
Esporadicamente ( ) Nunca ( )
Mensalmente ( )
Qual sua frequência diária de consumo de leite?
Café manhã/intervalo ( )
à noite ( )
Durante as refeições ( )
Outros ( )
3 . Qual sua frequência de consumo de Bebidas Lácteas Probióticas?
Diariamente ( )
Mensalmente ( )
4 . Qual sua frequência de consumo de Bebidas Lácteas com Fibras?
Diariamente ( )
Mensalmente ( )
5. Qual sua preferência em relação à Bebidas Lácteas Sabor Morango?
Gosto muitíssimo ( )
Gosto muito
( )
gosto ligeiramente ( )
desgosto ( )
6. Você possui interesse em participar de uma equipe sensorial para avaliação de
Bebidas Lácteas Sabor Morango?
Sim ( )
Não ( )
7. Você possui disponibilidade para participar de um treinamento de julgadores (2-3
vezes por semana) e posterior acompanhamento sensorial (semanal) de amostras
de Bebidas Lácteas Sabor Morango?
Sim ( )
Muito Obrigado!
Não ( )
CAPÍTULO VI 138
APÊNDICE 2
Levantamento de Termos para Desenvolvimento
Sensorial de Bebidas Lácteas Fermentadas Sabor Morango
Nome: __________________________________ Data: __________
Instruções: Por favor, observe, aspire e prove as amostras de Bebidas
Lácteas Sabor Morango e descreva as sensações percebidas em ordem de
aparecimento para cada atributo levantado.
Aparência: ____________________________________________________
____________________________________________________________
Aroma: ______________________________________________________
____________________________________________________________
Sabor: _______________________________________________________
____________________________________________________________
Textura: _____________________________________________________
_____________________________________________________________________
CAPÍTULO VI 139
APÊNDICE 3
Nome: __________________________________ Data: __________
Instruções: Você receberá 4 amostras de Bebidas Lácteas Sabor Morango.
Por favor, avalie as amostras da esquerda para direita quanto a preferência,
observando principalmente o sabor morango e o sabor residual e anote a
posição correspondente a cada uma para a ordem crescente dos atributos.
Código da
amostra:
______
______
______
______
1.menos preferida
2.
3.
4. mais preferida
Comentários:___________________________________________________
____________________________________________________________
CAPÍTULO VI 140
APÊNDICE 4
TESTE DE COMPARAÇÃO MÚLTIPLA
Nome: __________________________________ Data: __________
Instruções: Você está recebendo uma amostra padrão (P) e 5 amostras
codificadas. Compare cada amostra com o padrão (P) e indique se é mais,
igual ou menos intenso que o padrão (P) em relação à DULÇOR e SABOR
RESIDUAL. Em seguida assinale a diferença de acordo com a escala abaixo:
Escala
9 - Extremamente mais intenso que o padrão
8 – Muito mais intenso que o padrão
7 – Regularmente mais intenso que o padrão
6 – Ligeiramente mais intenso que o padrão
5 – Igual ao padrão
4 – Ligeiramente menos intenso que o padrão
3 – Regularmente menos intenso que o padrão
2 – Muito menos intenso que o padrão
1 – Extremamente menos intenso que o padrão
Código da
amostra
Valor
DULÇOR
Valor
SABOR
RESIDUAL
Comentários:___________________________________________________
_____________________________________________________________
CAPÍTULO VI 141
APÊNDICE 5
TESTE DE COMPARAÇÃO PAREADA
Nome: ___________________________ Data: __________ Produto: Bebida Láctea
Instruções: Por favor, avalie as amostras da esquerda para direita. Avalie
as duas amostras codificadas e assinale com “X” a amostra que você
prefere:
Código das Amostras Amostra preferida Comentários
Obs: Por que a amostra escolhida foi a preferida?______________________
_____________________________________________________________
CAPÍTULO VI 142
APÊNDICE 6
TESTE DE COMPARAÇÃO PAREADA
Nome: __________________________________ Data: __________ Produto:
Bebida Láctea
Instruções: Por favor prove as amostras da esquerda para direita. Avalie as duas
amostras codificadas e assinale se percebe ou não diferença entre elas:
Código das Amostras Não Sim
Comentários:___________________________________________________
_____________________________________________________________
CAPÍTULO VI 143
APÊNDICE 7
TESTE QUANTITATIVO
Nome: ____________________ Data: __________ Produto: Bebida Láctea
Instruções: Por favor, avalie as 4 amostras da esquerda para direita quanto
ao gosto salgado. Marque na linha horizontal o ponto que melhor expressa a
intensidade do gosto salgado.
Comentários_______________________________________________
______________________________________________________________
CAPÍTULO VI 144
APÊNDICE 8
TESTE DE ACEITAÇÃO E INTENÇÃO DE COMPRA
Nome: __________________________________ Data: __________
Instruções: Por favor, avalie a amostra de Bebida Láctea Sabor Morango
usando a escala abaixo para descrever o quanto gostou e desgostou do
produto:
1- Desgostei muitíssimo
2- Desgostei muito
Amostra
Valor
3- Desgostei regularmente
______
____
4- Desgostei ligeiramente
5- Indiferente
6- Gostei ligeiramente
7- Gostei regularmente
8- Gostei muito
9- Gostei muitíssimo
Instruções: Por favor, avalie a amostra de Bebida Láctea Sabor Morango
usando a escala abaixo assinale qual seria sua atitude quanto à compra do
produto:
(
(
(
(
(
)
)
)
)
)
Eu certamente compraria este produto
Eu provavelmente compraria este produto
Tenho dúvidas se compraria ou não este produto
Eu provavelmente não compraria este produto
Eu certamente não compraria este produto
Comentários:_____________________________________________
_______________________________________________________
CAPÍTULO VI 145
ANEXO 1
CAPÍTULO VI 146
ANEXO 2

Publicação - PPGAlimentos FURG

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