Apresentação do PowerPoint

Identificação de alvos terapêuticos
para desenvolvimento de novas drogas
anti-esquistossomóticas
Dr. Rafael Ferreira Dantas
Assistente de Pesquisa em Saúde Pública
Laboratório de Bioquímica Experimental e Computacional de Fármacos
Praziquantel
 Resistência
Laboratório: Fallon & Doenhoff, 1994; Ismail et al., 1994; Couto et al., 2011;
Liu et al., 2011; Liang et al., 2011.
Campo: Fallon et al., 1994; Ismail et al., 1996; Bonesso-Sabadini & Souza Dias,
Início da
infecção
~4 semana
A
I
A
Atividade do PZQ
A
A – ativo; I – baixa atividade/inativo
2002; Lawn et al., 2003; Melman et al., 2009.
Ação proposta
para o PZQ
 Baixa atividade contra vermes imaturos
Cioli et al., 2012; You et al., 2015; Danso-Appiah & De Vlas, 2002
 Alvos moleculares ainda não completamente elucidados
Greenberg et al., 2005; Pica-Matoccia et al. 2008,2009.
Canal de
Ca2+
Bomba de
efluxo
You et al., 2015; Cioli et al., 2012; Wang et al., 2012
Descoberta de compostos anti-esquistossomóticos
Substrato
Substrato
Enzima
Enzima
Inibidor
Produto
In vivo
Anos 60-70:
Principais fármacos
Ensaios fenotípicos
Medicina Veterinária
Microscopia – Campo claro e fluorescência
Metabolismo – Colorimetria, fluorescência e
luminescência
Geary et al., 2015
Paveley et al., 2012; Marcelino et al., 2012;
Mansour & Bickle, 2010, Panic et al., 2015
Ensaios bioquímicos
Ex: ensaios enzimáticos
Castilho et al., 2010; Lee et al., 2008
Liu et al., 2013; Kannan et al., 2014.
Como identificar os alvos moleculares?
+ resistente x não resistente
Cruzamento genético
Composto com alvo molecular conhecido em outras espécies
resistente
não resistente
X
Ex: hycanthone
Pica-Mattocia et al., 1993
Ref: Skinner-Adams et al., 2016
Métodos computacionais
 Vantagens: seleção mais racional dos compostos
diminui o número de ensaios experimentais
baixo custo
 Duas estratégias computacionais gerais são usadas:
X
Estrutura
Requer o conhecimento
da estrutura molecular do
alvo (ou homólogo)
Ex: docking molecular
Ligante
Requer dados de
atividade biológica
Ex: QSAR
PDB
Ferreira e Andricopulo, 2015
https://summerofhpc.prace-ri.eu/re-ranking-virtual-screeningresults-in-computer-aided-drug-design/
Alvos em potencial
Enzimas
 Cinases envolvidas na sinalização intracelular
(SmPlk1, SmPKA-C2, SmcGK13, SmAbl4, SmTKs5,6)
 Metabolismo de xenobióticos (CYP305A17)
 Metabolismo redox (SmTGR8, Peroxiredoxin9)
 Peptidases (SmPOP10, SmCB11, SmCD12)
 Histonas desacetilases (SmHDAC813)
 Biossíntese de purinas (PNP14)
 Biossíntese de lipídeos (OAR15)
Gametogênese
Mitose
Transmissão
nervosa
Estado redox
Interação
parasito-hospedeiro
Receptores
 Receptor TGFβ5
 Tirosina cinases (insulina16 e semelhantes17)
 SmFGFR18
Transportadores
 Neurotransmissores (serotonina19-SmSERT,dopamina20-SmDAT)
Sobrevivência
Morfologia
Biossíntese
de lipídeos
Organização
do citoesqueleto
Motilidade
Ref: 1Long et al., 2012; 2Swierczewski & Davies,2009; 3Leutner et al., 2011; 4Buro et al., 2014; 5Buro et al., 2013, 6Beckmann et al., 2011; 7Ziniel et al., 2014; 8Li
et al., 2015; 9Sayed et al., 2006; 10Fajtová et al., 2015; 11Jilková et al., 2014; 12Morales et al., 2008; 13Merek et al., 2015; 14Castilho et al., 2010; 15Liu et al., 2013;
16You et al., 2014; 17Dissous et al., 2014; 18Hahnel et al., 2014; 19Patocka & Ribeiro, 2013; 20El-Shehabi et al., 2012.
Laboratório de Bioquímica Experimental
e Computacional de Fármacos
Pavilhão Leonidas Deane
LaBECFar – sala 309
Plataforma de Bioensaios e Triagem de
Fármacos – sala 605
Coordenação: Dr. Floriano Paes Silva Júnior
Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz
Av. Brasil, 4365. Campus Manguinhos - Rio de Janeiro, RJ - Brasil
Fluxo de trabalho
Síntese
Modelagem
Molecular
Ensaios
Moleculares
Mol
2
Mol
1
Mol
3
Hits
Ensaios
biológicos
Caracterização
cinética,
estrutural e
termodinâmica
Grand Chalenges Explorations 2013
Título do Projeto:
New Approaches to Neglected Tropical Diseases: An automated drug screening platform for helminthes
Parcerias internacionais:
X
Ramirez et al., 2007.
Metodologia
2x
• Parasitos
450 cercarias
6 semanas
DMEM
37oC / 5% CO2
Perfusão portal
Distribuição dos
vermes em placas
de 96 poços
• 300 uL DMEM/poço
• 1 verme adulto/poço
• Machos X fêmeas
Leitura HCA
100 imagens/poço
Interface do CellProfiler
Módulos
de análise
Identificação do poço
Remoção de bolhas
Identificação do objeto
Quantificação
Resumo do pipeline de análise
A
E
B
F
C
D
G
H
male
female
Combinação de estratégias
computacionais
Dra Carolina Horta Andrade
Professora Adjunta da UFG
• Da análise fenotípica à molecular
• In silico Quimiogenômica
• Reposicionamento do fármaco Paroxetina
• Descoberta de fármacos baseados no ligante
• Novos inibidores de SmTGR
• Da análise molecular à fenotípica
• Descoberta de fármacos baseados no alvo
• SmTGR
• SmCDs
Panic et al., 2014
Transportadores de serotonina (SmSERT)
 Responsável pela receptação de serotonina.
 Controla a resposta motora do parasito.
Detecção da SmSERT (marcação verde) em vermes adultos e
esquistossômulo. Figuras adaptadas de Patocka e Ribeiro, 2013.
In silico quimogenômica
• Reposicionamento
Paroxetin
Undefined
spaces
Chemical space of
known actives
40 active compounds
31 inactive compounds
13 predicted compounds
PC2
215 active compounds
19 inactive compounds
115 predicted drugs
Chemical space of
known inactives
115 predicted
drugs
100 active compounds
291 inactive compounds
40 predicted compounds
PC1
Paroxetin
S. mansoni serotonin transporter
(SmSERT) inhibitor
8 potential drug targets in
S. mansoni
80.9% Drugs with
expired patents
61 drugs with potential
activity on the
neuromuscular function
European Patent Office,
Google Patents e
SciFinder
Paroxetina X S. mansoni
 Antidepressivo Paroxetina como inibidor de SmSERT (Neves
et al., 2015).
Vermes adultos
+
paroxetina
Esquistossômulos
+
Paroxetina
+
resazurina
Fêmeas
Machos
Resultados
Tabela – Valores de EC50 (µM) para paroxetina em vermes adultos de S. mansoni.
Paroxetine
PZQ
Time/Gender
Male
Female
Male
Female
0h
23.5
17.4
0.11
0.13
24h
5.1
9.9
0.12
0.30
48h
3.8
11.5
0.13
No fit
72h
2.7
11.9
No fit
0.66
EC50 para esquistossômulos (72h): 2,5 µM
Modelagem molecular da
SmSERT (a) e hSERT(b).
Interação da paroxetina
com o sítio catalítico da
SmSERT (a) e hSERT (b) e
comparação entre os dois
modelos (c).
Tioredoxina glutationa redutase (SmTGR)
 Um dos principais componentes do sistema
antioxidante do Schistosoma spp.
 Estudos com RNAi mostram que a atividade
enzimática é essencial para a sobrevivência do
S. mansoni (Kuntz et al., 2007) e S. japonicum
(Han et al., 2014) em modelos in vitro e in vivo.
Esquema adaptado de Cioli et al. , 2008
GSH – glutationa reduzida
Trx - tioredoxina
Principais classes de inibidores de SmTGR
Phosphoric amides
IC50 =0.025 µM
oltipraz
IC50 = 80.0 µM
isoxazolones
IC50 =0.15 µM
fosforamidites
IC50 =0.2 µM
Kuntz, A. N. et al, PLoS Med. 2007, 4, e206.
Simeonov, A. et al, PLoS Negl. Trop. Dis. 2008, 2, e127.
Potassium
antimonium tartrate
IC50 =0.05 µM
oxadiazois
IC50 = 1.8 µM
Naftazarine
IC50 =2.5 µM
Auranofin
IC50 =0.007 µM
Molecular hybridization
IC50 =0.01 µM
Inibidores de SmTGR
 Edital Fundo Newton RCUK/FAPERJ 2014
150,000 compounds
Resultados
Esquistossômulos (48h de incubação)
Compound
Motility adjusted index (mean Phenotype adjusted index (mean ±
± SD)
SD)
LabMol-23
-0.74 ± 0.08
-0.64 ± 0.01
LabMol-28
-0.61 ± 0.09
-0.48 ± 0.05
LabMol-37
-0.92 ± 0.04
-0.58 ± 0.01
LabMol-49
-0.93 ± 0.02
-0.61 ± 0.09
LabMol-50
-0.89 ± 0.02
-0.40 ± 0.03
LabMol-51
-0.33 ± 0.13
-0.24 ± 0.05
PZQ
-0.48 ± 0.04
-0.17 ± 0.02
OLT
-0.90 ± 0.04
-0.34 ± 0.07
Compound
A – DMSO (0.625 %)
B – 49 (10 µM)
C – PZQ (10 µM)
D – OLT (10 µM)
LabMol-23
LabMol-28
LabMol-37
LabMol-49
LabMol-50
LabMol-51
PZQ
OLT
Schistossomula (µM)
Motility
Phenotype
>20
>20
3.23
2.62
>20
>20
N.D.
N.D.
>20
>20
6.60
3.41
>20
>20
N.D.
N.D.
WSS-1 (µM)
17.48
133.40
16.38
28.49
>400
>400
>400
>400
Selectivity index (SI)
Motility
Phenotype
<0.87
<6.7
5.07
10.87
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
<0.87
<6.7
2.48
8.35
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
L
L
L
a
L
a
L
a
L
b
a
b
a
b
a
b
o
M
M
b
o
M
M
b
o
M
M
b
o
M
M
b
l
o
l
o
l
o
l
o
4
l
3
l
2
l
2
l
9
4
7
3
8
2
3
2
4
0
0
(2
(1
9
0
(2
(1
7
0
(2
(1
8
0
(2
(1
3
(1
(2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
tr
o
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
n
0
o
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
l
0
a
a
-6
4
20
L
L
E
-6
C
Adultos
E
% a c t iv it y
Resultados
Efeito off-target ???
Ensaio da atividade de papaína
(cisteíno protease)
120
100
80
60
40
* *
Catabolismo de hemácias em S. mansoni
Hemácias
330.000/h
Hemolisina
ESÔFAGO
GASTRODERME
Hemoglobina
Endopeptidases
Polipeptídeos
Oligo- e
dipeptídeos
Aminoácidos
livres
SmCL1
SmCL2
SmCD
SmAE
S. mansoni
catepsina D-like
SmCB1
Exopeptidases
SmCC
Caffrey et al., 2004
Identificação de novas isoformas de SmCD
30-40% identidade nas sequências de bases
VALIDAÇÂO POR RNAi!!!
Inibidores de SmCD
Microformat
DIVERSet-EXP
Diversidade química
Triagem virtual
Aspartil proteases
(SmCD1-3)
10 para cada isoforma
20 para as três isoformas
50 compostos
• Podem ser multi-alvo;
• Via metabólica inibida.
Estudos com enzimas recombinantes
de S. mansoni
Expressão intracelular
Proteínas secretadas
SmTGR
SmCD2
SmCD1
 Avaliar e caracterizar parâmetros cinéticos e termodinâmicos de ligantes sobre SmTGR e SmCDs recombinantes
(em execução).
Cristais de SmTGR
• Condition: JCSG-plus HT-96 (D06)
• 0.1 M TRIS pH=8.50
• 0.2 M Magnesium Chloride
• 20.0% w/v Polyethylene glycol 8000
Day 0: 12.12.15
Day 1: 13.12.15
Cristais de SmCD1
• Condition: Index (H09)
• 0.05 M Zinc Acetate
• 20.0% w/v Polyethylene
Glycol 3350
Day 0: 08.01.16
Day 20: 28.01.16
Agradecimentos