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CAPÍTULO VII
MÉTODOS ANALÍTICOS APLICADOS À
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA CELULOSE
Luiz Pereira Ramos / Mirtha Maximino / M. Graça Carvalho
1. Introdução
O setor de celulose e papel, em muitas de suas atividades de controle operacional, investigação científica e inovação, depende da existência de métodos analíticos
rápidos, seguros e acessíveis que orientem o desenvolvimento de seus produtos e
processos. Neste sentido, é indiscutível a relação entre o sucesso de decisões estratégicas do setor e a confiabilidade e/ou veracidade dos métodos empregados para
comprovar as tendências eventualmente identificadas no laboratório. Sendo assim,
a existência ou disponibilidade de acesso a uma infraestrutura analítica adequada, e
o cuidado com a implantação e execução de métodos analíticos de alta sensibilidade, são absolutamente fundamentais para a reorganização ou reorientação técnica
do setor.
O caráter altamente recalcitrante da lignocelulose nativa pode ser justificado
pela associação íntima que existe entre os três componentes da parede celular de
plantas superiores (Puri, 1984; Sinitsyn et al., 1991; Ramos, 1992a,b). Estruturas
microfibrilares de celulose encontram-se embebidas em uma matrix composta por
hemicelulose e lignina, cuja função estrutural é de agir como barreira natural contra a degradação enzimática e/ou microbiana (Fan et al., 1987). Neste contexto, as
polioses ou hemiceluloses, que são heteropolissacarídeos estruturais que ocorrem
na parede celular das plantas, atuam como uma interface entre a celulose e uma
matrix não polissacarídica constituída majoritariamente pela lignina, um polímero
tridimensional que resulta da condensação de várias formas ressonantes de radicais
livres gerados pela oxidação de derivados do álcool p-hidroxicinâmico com vários
graus de metoxilação (Fengel and Wegener, 1989). Assim como as hemiceluloses,
o tipo e distribuição da lignina no tecido vegetal depende da espécie em questão
e do modo de extração. Via de regra, a lignina do tipo guaiacílica predomina nas
gimnospermas e a do tipo siringílica, em angiospermas, enquanto que a lignina
de gramíneas e certas angiospermas ainda contém quantidades expressivas de
unidades p-hidroxicinâmicas não metoxiladas e outras unidades aromáticas dela
derivadas. Já as hemiceluloses de gramíneas e resíduos de cereais são geralmente
caracterizadas pela presença de arabinoxilanas, enquanto que 4-O-metil-glucuronoxilanas predominam em madeiras duras (angiospermas ou folhosas) e madeiras
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Panorama de la industria de celulosa y papel en Iberoamérica 2008
moles (gimnospermas ou coníferas) contêm um alto teor de glucomananas. Como
resultado desta íntima associação, a caracterização e quantificação destes três componentes é uma difícil tarefa experimental que muitas vezes exige a utilização de
mais de um tipo de metodologia analítica, quer puramente química (como em
métodos de extração seletiva para preparação de alfa-celulose e holocelulose), quer
cromatográfica ou espectroscópica.
1.1. CELULOSE
A celulose é a substância natural de maior importância na natureza por constituir a base estrutural da parede celular de plantas. Desta forma, considerando-se
que os vegetais correspondem à grande maior parte dos organismos vivos existentes
na crosta terrestre, a celulose representa o polímero de maior ocorrência natural,
com uma disponibilidade total da ordem de 20 a 30 x 1010 t (Fengel and Wegener,
1989).
A celulose encontra-se presente nas mais variadas formas de vida terrestre,
desde vegetais superiores a organismos primitivos como bactérias. Entretanto, a
quantidade de celulose encontrada nestes organismos varia significativamente,
desde os 95 a 99% do algodão e os 80 a 85% da fibra de rami até a faixa dos 20
a 25% de vários tipos de bactérias, protozoários e algas-marinhas (Young, 1986).
Dentre os microorganismos aeróbicos e anaeróbicos capazes de sintetizar celulose
extracelular, são dignas de menção os do gênero Acetobacter spp. (A. xylinum e A.
pasteurianus estunensis) e as espécies Valonia ventricosa e Sarcina ventriculi.
A madeira constitui a maior fonte de celulose na natureza. Nela, a celulose encontra-se em proporções da ordem de 45%, tanto em coníferas como em folhosas
(Roelofsen, 1959; Butterfield and Meylan, 1980; Fengel and Wegener, 1989). No
entanto, a separação e extração da celulose existente na madeira é complicada pela
sua íntima associação com hemicelulose e lignina, razão pela qual processos como
aqueles utilizados na indústria papeleira necessitam de condições operacionais bastante drásticas, necessárias e suficientes para produzir fibras com a qualidade necessária à confecção do papel (Roelofsen, 1959). No que diz respeito à indústria têxtil,
o algodão constitui a principal fonte de fibras celulósicas, necessitando apenas de
etapas seqüenciais de delipidação e branqueamento para servirem aos diversos segmentos desta atividade industrial (Preston, 1986).
Para os leigos no assunto, é importante salientar que a utilização industrial
de celulose não se resume ao papel e derivados têxteis. Apesar da existência e utilização seculares deste material de propriedades únicas, novas aplicações vêm sendo
suscessivamente sugeridas na literatura ao longo das últimas décadas, atendendo
a uma grande variedade de segmentos da indústria, tais como as de alimentos,
de cosméticos e de novos materiais para uma infinidade de aplicações. É importante salientar que vários destes segmentos utilizam-se de materiais derivados da
celulose por modificação química (éteres, ésteres de ácidos orgânicos e ésteres de
ácidos minerais) ou fisico-química (celulose regenerada), enquanto que outros fa-
Métodos analíticos aplicados à caracterização química da celulose
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zem uso apenas das propriedades estruturais e grande homogeneidade que certas
preparações celulósicas oferecem (celulose microcristalina). Um resumo da vasta
diversidade de aplicações da celulose e seus derivados pode ser encontrado em várias publicações da literatura especializada (Fengel and Wegener, 1989; Kuhad and
Singh, 1993).
Quimicamente, a celulose é um homopolissacarídeo linear composto por
unidades de D-glucopiranose ligadas por ligações glicosídicas do tipo β-(1→4).
As evidências da grande uniformidade observada na molécula de celulose foram
primeiramente obtidas por técnicas de hidrólise ácida, metilação e degradação parcial ainda no início do século passado (décadas de 20 e 30). Tal estrutura primária
confere à celulose características e propriedades bastante peculiares, que podem ser
facilmente justificadas pela análise conformacional das unidades que constituem o
homopolímero e do tipo de ligação glicosídica envolvida em sua composição (Roelofsen, 1959; Fengel and Wegener, 1989; Solomons, 1996). Apesar de constituída
apenas por unidades de glucose, estudos mais elaborados da estrutura deste homopolímero demonstraram que a celobiose (O-4-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranose) é o seu verdadeiro elemento estrutural (Sarko, 1986). Isto se deve ao fato de
que a estereoquímica da ligação β-(1→4) exige que cada nova unidade de glucose
sofra uma rotação de 180o em torno de seu eixo longitudinal, fazendo com que o
elemento básico de simetria da celulose se repita a cada segunda unidade de glucose
substituída ao longo da molécula (Figura 1).
Uma importante característica de polissacarídeos como a celulose é a diferenciação que existe entre os seus grupamentos terminais, a exemplo de quaisquer
outros polissacarídeos existentes na natureza. Em uma das extremidades, encontra-se o grupamento hidroxílico do carbono C-4 e a baixa reatividade deste álcool
secundário, comparada a outros centros reativos da molécula, confere ao terminal
o nome de terminal não redutor. Em contrapartida, na outra extremidade da molécula encontra-se o seu terminal redutor e nele pode-se observar a mutarrotação,
fenômeno bastante conhecido que caracteriza esta classe de compostos orgânicos
(Baker and Engel, 1992; Solomons, 1996).
Genericamente, o carbono que possui propriedades redutoras em um carboidrato é denominado de carbono anomérico e o princípio da anomericidade ou
mutarrotação é caracterizado pela abertura e fechamento do anel hemiacetálico
em meio aquoso, gerando dois isômeros de posição em C-1 (epímeros), ou seja,
a possibilidade de haver substituições hidroxílicas axiais e equatoriais em C-1, resFIGURA 1.
Elementos estruturais
da celulose.
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pectivamente gerando as formas anoméricas alfa e beta. É importante salientar que,
devido a sua maior reatividade, reações não enzimáticas de degradação ou despolimerização ocorrem comumente a partir do terminal redutor da molécula (Fengel
and Wegener, 1989; Solomons, 1996).
Sabe-se que a β-D-glucose (massa molecular de 180 unidades de massa atômica, u.m.a.) é o carboidrato ou poli-hidroxialdeído mais estável que se encontra na
natureza. Isto se deve basicamente ao fato de que todas as hidroxilas existentes no
anel hemiacetálico assumem uma posição equatorial ao plano do anel, condição
esta de muito maior estabilidade conformacional que a posição axial cuja orientação perpendicular ao plano do anel gera tensões comumente interpretadas como
fatores de instabilidade conformacional (Solomons, 1996). Com a orientação equatorial das hidroxilas, distribuídas lateralmente a uma conformação piranosídica do
anel em cadeira do tipo 4C1, a molécula da D-glucopiranose adquire uma disposição
quasi-planar que, ligada a outras unidades D-glucopiranosídicas por ligações do tipo
β-(1→4), permite a obtenção de oligômeros (ou oligossacarídeos) lineares capazes
de alinharem-se uns aos outros formando estruturas organizadas estabilizadas por
ligações de hidrogênio inter e intramoleculares (Figura 2) (Preston, 1986; Young,
1986; Fengel and Wegener, 1989). Quanto maior a extensão do oligômero, medida através de seu grau de polimerização (número de unidades glucopiranosídicas
existentes na molécula), maior a estabilidade do agregado formado cuja estrutura
supramolecular confere ao seu interior uma característica bastante hidrofóbica,
enquanto que a sua superfície possui caráter hidrofílico pronunciado. Termodinamicamente, existe um limite para a organização e manutenção deste agregado
molecular para-cristalino, a partir do qual a organização supra-molecular é perdida
e as moléculas passam a assumir uma orientação e direcionamento randômico (ao
acaso). A estas regiões desordenadas da organização estrutural da celulose dá-se o
nome de regiões amorfas e o processo de conversão gradual de celulose cristalina
em celulose amorfa é denominado amorfogênese ou mercerização.
1.1.3. NATUREZA FIBRILAR DA CELULOSE E SUA OCORRÊNCIA NA PAREDE CELULAR DE PLANTAS
A celulose, em nível molecular, é definida como um polímero linear constituído por unidades de D-anidroglucopiranose unidas por ligações glicosídicas do
tipo β-(1→4), sendo, portanto, uma (1→4)-β-D-glucana cuja unidade de repetição
estrutural corresponde à celobiose (Figura 2) (Fengel e Wegener, 1989).
Um grande número de modelos têm sido postulados para explicar a natureza
cristalina da celulose e como esta organização estrutural é rompida, formando regiões amorfas onde uma menor orientação molecular é observada. A estrutura cristalina da celulose pode ser representada esquematicamente pela associação ordenada de fibrilas elementares, cuja espessura varia de 2 a 6 nm dependendo da origem e
da metodologia usada para extração (Figura 2). Estima-se que o número médio de
cadeias de celulose por fibrila elementar seja de aproximadamente 40 unidades.
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FIGURA 2.
Associação dos
principais componentes
da parede celular.
1- Esqueleto da
cadeia de celulose,
com a indicação do
comprimento da sua
unidade estrutural
básica, a celobiose;
2- arranjo das cadeias
de celulose na
formação da fibrila
elementar;
3- cristalito de celulose;
4- seção transversal
da microfibrila da
celulose, mostrando
cristalitos de celulose
embebidos na matriz
de hemicelulose e
protolignina (Ramos,
2003).
A associação entre estas unidades estruturais fibrilares é garantida por uma interface polissacarídica de natureza amorfa, cuja constituição química é majoritariamente composta por polioses ou hemiceluloses (e.g., xiloglucanas e heteroxilanas),
substâncias pécticas (e.g., rhamnogalacturonanas) e, eventualmente, proteínas. Da
associação de quatro ou mais destas unidades elementares, com a interveniência de
uma matriz amorfa de constituição análoga à anterior, formam-se então as microfibrilas, cuja seção transversal possui 10 a 30 nm de lado (Fengel and Wegener, 1989)
(Figura 2). Finalmente, a partir da organização progressiva das microfibrilas, e de
seus estados intermediários de transição cristalina, formam-se estruturas contínuas
que resultam na distribuição lamelar observada na parede celular de plantas, mais
notavelmente a camada S-2, onde concentra-se a maior quantidade de celulose da
célula. A este nível, a interposição de lignina (ou protolignina) é também fator de
vital importância para a manutenção da estabilidade do agregado. Dados de microscopia eletrônica sugerem que zonas “amorfas” ou não cristalinas não devem
exceder a 5 nm em comprimento, enquanto que moléculas de água podem ocorrer
no interior desta estrutura em espaços interfibrilares com cerca de 1,2 a 5 nm de
largura (Young, 1986).
Nas regiões cristalinas do agregado, as cadeias de celulose são lineares e as unidades glicosídicas estão arranjadas em planos superpostos. Três razões justificam
este arranjo supramolecular: (a) a estereoquímica da ligação β-(1→4) glicosídica;
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(b) a conformação piranosídica assumida pelo anel, disposto em cadeira do tipo
4
C1 (conformação de menor energia potencial e/ou maior estabilidade); e (c) as
interações inter e intramoleculares existentes entre as cadeias de celulose, que determinam grande parte de suas propriedades físicas e químicas (Nevell e Zeronian.,
1985; Fengel e Wegener, 1989; Sjöström, 1993; Dence e Reeve, 1996). Mudando-se
a ligação glicosídica entre unidades de D-glucopiranose para o tipo α-(1→4), a disposição espacial das moléculas assumiria uma forma helicoidal devido à orientação
axial da hidroxila anomérica. Esta estrutura helicoidal encontra-se presente na natureza na forma de amilose que, juntamente com a amilopectina, constituem a mais
importante substância de reserva do reino vegetal, o amido. A única diferença entre
estes dois componentes do amido se deve ao fato de que a amilopectina também
apresenta ligações glicosídicas do tipo α-(1→6), razão pela qual trata-se de um
polissacarídeo altamente ramificado (Solomons, 1996).
A estabilização das cadeias moleculares longas e lineares da celulose em sistemas organizados com propriedades para-cristalinas é primariamente devida uma
rede bastante rígida de ligações ou pontes de hidrogênio inter e intramoleculares.
Sabe-se que a energia associada a uma ligação de hidrogênio (10 a 25 kJ.mol-1) é dez
a vinte vezes mais fraca que uma ligação covalente, e aproximadamente 100 vezes
mais forte que uma interação de van der Waals. No entanto, devido à periodicidade
existente entre as unidades de glucose ao longo da cadeia, um grande número de
ligações de hidrogênio são formadas em função da vicinalidade entre grupos hidroxílicos, gerando uma estrutura de alto grau de associação molecular.
As ligações de hidrogênio são sem dúvida as maiores responsáveis pelo caráter
cristalino da celulose. Existem várias proposições na literatura sobre quais os tipos
de ligações de hidrogênio que contribuem mais intensamente para a manutenção
dos agregados moleculares de celulose. Uma das proposições mais aceitas envolve uma ligação de hidrogênio intramolecular entre a hidroxila O-3 (hidroxila do
carbono C-3) e o oxigênio do anel da unidade vizinha (O-5) e uma ligação intermolecular entre a hidroxila O-6 e a hidroxila O-3 de uma unidade adjacente, ou
seja, pertencente a outra cadeia de celulose existente no mesmo plano (Sarko, 1986;
Young, 1986). O único grupamento hidroxílico suficientemente livre para efetuar
interligações entre os diferentes planos adjacentes é a hidroxila em C-6 (O-6), que
supostamente interage com os planos logo superior (ou logo inferior) através de
uma ligação de hidrogênio do tipo O-6...O-4. O resultado líquido destas interações
é um arranjo altamente organizado de cadeias de celulose onde nada, nem sequer
um próton, pode penetrar com facilidade.
O arranjo espacial das cadeias de celulose, em suas regiões de alta organização
estrutural, confere ao agregado a definição de planos cristalográficos de simetria
cuja intensidade, medida por difração de raios-X, é proporcional ao caráter cristalino do material. Em função destes estudos, várias formas alomórficas da celulose já
foram descritas na literatura e cada uma delas é gerada em função de uma alteração
da estrutura cristalina da celulose nativa, caracteristicamente designada como celu-
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lose I (rede cristalina monoclínica). As celulose II, III e IV (e suas subdivisões) são,
portanto, o resultado de uma ação química e/ou fisico-química sobre a estrutura
fina da celulose nativa (Fengel and Wegener, 1989).
Quanto ao sentido das cadeias de celulose nos agregados moleculares, o modelo atualmente aceito é o de que a celulose nativa (forma alomórfica I), ou seja, o
produto da biossíntese, apresenta uma disposição paralela das cadeias lineares, isto
é, todas encontram-se orientadas em um mesmo sentido. Por outro lado, a celulose
II ou celulose regenerada, obtida pela reorganização das cadeias de celulose após
uma amorfogênese alcalina, é considerada de natureza anti-paralela, tendo assim as
cadeias dispostas em sentido oposto. A única forma alomórfica pura da celulose é a
celulose nativa. Todos os outros tipos de arranjo cristalino apresentam polimorfismo, isto é, consistem de uma mixtura de duas ou mais formas alomórficas diferentes (Sarko, 1986; Fengel and Wegener, 1989). Por exemplo, à celulose I apresenta
duas formas alomórficas distintas, Iα e Iβ, sendo que a segunda constitui cerca de
80% da celulose presente em vegetais superiores.
A principal diferença entre as estruturas paralela e anti-paralela reside no empacotamento tri-dimensional das várias camadas de celulose. O empacotamento
anti-paralelo permite a formação de uma malha mais rígida de ligações de hidrogênio, resultando em uma estrutura mais estável e de menor energia. Na verdade, este
fato explica o por quê de não ser possível reverter uma transformação de celulose
I em celulose II - tal transformação é considerada termodinamicamente proibida,
pois resulta em uma diminuição da entropia do sistema (Sarko, 1986).
É importante salientar que a estrutura da celulose I forma-se apenas sob circunstâncias muitos especiais, como aquelas presentes na biossíntese. A condição
fundamental parece ser a síntese simultânea e unidirecional de várias cadeias de
celulose, imediatamente seguida por um mecanismo que permita o fenômeno da
cristalização ou ordenação molecular (Sarko, 1986). Na verdade, este parece ser o
mecanismo utilizado por bactérias como o Acetobacter xylinum, um microorganismo capaz de produzir celulose de alta cristalinidade. Já outros autores sugerem que a
formação biológica de celulose I depende da associação extracelular de (1→4)-β-Dglucanas pré-sintetizadas, cuja progressiva estabilização supramolecular é conferida
pela formação de ligações de hidrogênio em uma etapa de natureza não-enzimática.
Neste modelo, a microfibrila nascente formar-se-ia a partir de associações laterais
entre cadeias adjacentes, envolvendo ligações de hidrogênio entre as hidroxilas O-3
e O-6 de cadeias vizinhas. Tais associações formariam camadas cujas faces seriam
hidrofóbicas com bordas hidrofílicas. O subsequente empacotamento entre camadas (lamelas monomoleculares) estabilizar-se-ia através de interações hidrofóbicas
(Young, 1986).
A observação de que a estrutura supramolecular da celulose (microfibrila)
possui bordas iminentemente hidrofílicas é de extrema importância para a compreensão de várias de suas propriedades intrínsecas. Considerando-se a existência
de bordas hidrofílicas e interações hidrofóbicas interplanares, supõe-se que a
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microfibrila permita ambos os tipos de interação através destas duas “superfícies”
distintas.
Estima-se que cerca de 40% da hidroxilas totais existentes em microfibrilas
celulósicas estejam na superfície. Sabendo-se, portanto, que um número apreciável
de moléculas encontram-se confinadas no interior da estrutura cristalina, não é
difícil imaginar que as principais reações de modificação da celulose dependam de
sua área superficial e que o aumento da eficiência de um processo de hidrólise ou
conversão dependa do aumento da área superficial disponível para interação com
o agente externo, quer químico ou biológico (Fan et al., 1987; Ooshima et al., 1990;
Singh et al., 1991; Ramos, 1992a).
1.2. HEMICELULOSES
As hemiceluloses constituem cerca de 20 a 30% da madeira, sendo predominantemente encontradas nas paredes celulares primárias e secundárias, podendo
ainda ocorrer na lamela média (Lewin e Goldstein, 1991).
Da madeira deslignificada, muitas vezes referida como holocelulose, as hemiceluloses podem ser extraídas por soluções alcalinas aquosas, sendo classificadas
em dois grupos: precipitável ou não precipitável mediante neutralização a partir
da adição de ácido mineral diluído (Sjöström, 1993; Biermann,1996). Portanto, as
hemiceluloses representam uma classe bastante heterogênea de polissacarídeos.
Fisicamente, as hemiceluloses são sólidos brancos raramente cristalinos e,
quimicamente, compõem uma classe de polissacarídeos cujos blocos construtivos
se constituem de carboidratos de 5 e 6 átomos de carbono, sendo xilose e arabinose
(pentoses) e glucose, manose, galactose e ácido 4-O-metil-D-glucurônico (hexoses)
seus principais constituintes (Lewin e Goldstein, 1991; Sjöström, 1993; Biermann,
1996).
Hemiceluloses foram por muito tempo consideradas como intermediários na
biossíntese da celulose, mas hoje sabe-se que são heteropolissacarídeos formados
por rotas sintéticas distintas (Sjöström, 1993; Biermann, 1996).
Galactoglucomananas são as principais hemiceluloses de coníferas, correspondendo a cerca de 20% em massa. Conforme a Figura 3, possuem cadeia linear
FIGURA 3.
Estrutura de uma
galactoglucomanana,
com a ligação
β–(1→4) em evidência
(Biermann, 1996).
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formada por ligações do tipo β−(1→4) entre unidades de D-glucopiranose e D-manopiranose, (Sjöström, 1993; Biermann, 1996).
Arabinoglucuronoxilanas também estão presentes em coníferas, (5-10%) e
possuem cadeia principal com ligações do tipo β−(1→4) entre moléculas de Dxilopiranose, com substituição parcial em C-2 pelo ácido 4-O-metil-D-glucurônico
e em C-3 pela L-arabinofuranose. A estrutura genérica desses polissacarídeos encontra-se na Figura 4, onde as ligações α e β dos principais substituintes estão em
evidência (Sjöström, 1993; Biermann, 1996).
O-Acetil-4-O-metil-glucuronoxilanas são as principais hemiceluloses de folhosas e, dependendo da espécie, correspondem a 15 a 30% de seu peso seco. A cadeia
principal é composta de unidades de D-xilopiranose unidas por ligações β−(1→4),
com substituição parcial da xilose pelo ácido 4-O-metil-glucurônico em C-2 e por
grupamentos O-acetil em C-2 e C-3 da xilose. São em média 7 substituições acetílicas para cada grupo de 10 unidades de xilose na cadeia principal, conforme a Figura
5 (Sjöström, 1993).
Além das xilanas, as folhosas contêm cerca de 2 a 5% de glucomananas, as
quais são compostas por unidades de D-glucopiranose e D-manopiranose unidas
por ligações β−(1→4), conforme a Figura 6. A relação glucose:manose varia entre
1:2 e 1:1, dependendo da espécie de madeira (Biermann, 1996).
1.3. LIGNINA
A palavra lignina vem do latim “lignum”, que significa madeira. Trata-se de
um dos principais componentes dos tecidos de gimnospermas e angiospermas,
ocorrendo em vegetais de tecidos vasculares. Sabe-se que a lignina tem um importante papel no transporte de água, nutrientes e metabólitos, sendo responsável pela
resistência mecânica de vegetais, além de proteger os tecidos lignificados contra o
ataque de microorganismos. Vegetais primitivos como fungos, algas e líquenes, não
são lignificados (Carioca, 1984; Mesquita, 1990).
A literatura, durante os últimos cento e cinqüenta anos, tem demonstrado interesse científico sobre a lignina. Neste longo tempo de estudo, foi possível concluir
que a lignina é uma substância amorfa, de natureza aromática e complexa, que
constitui parte das paredes celulares e da lamela média dos vegetais.
FIGURA 4.
Estrutura de uma
arabinoglucuronoxilana.
Em detalhe, a ligação
β–(1→4) e as ligações
α–(1→2) e α–(1→3)
do ácido 4-O-metilglucurônico e da
L-arabinose, (Biermann,
1996).
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FIGURA 5.
Estrutura da Oacetil-4-O-metilglucuronoxilana. Em
detalhe a ligação
β−(1→4) da cadeia
principal e a ligação
α−(1→2) do ácido
4-O-metil-glucurônico
(Biermann, 1996).
FIGURA 6.
Estrutura da
glucomanana, com a
ligação β-(1→4) em
detalhe (Biermann,
1996).
Anselme Payen foi o primeiro a reconhecer a natureza complexa da madeira
(Payen, 1821, citado por Sjöström, 1993). Através de tratamentos da madeira com
ácido nítrico, foi o primeiro a identificar a existência de duas substâncias diferentes: a primeira, um resíduo fibroso e que possuía a mesma composição do amido,
o qual denominou de “celulose”, e a segunda, um material rico em carbono, a que
se referiu como “material incrustante”, que supostamente intermeava a celulose
na madeira. O termo “lignina” foi somente introduzido por Schulze em 1865. Três
anos mais tarde, Erdmann observou que catecol e ácido protocatequínico eram
formados na fusão alcalina da madeira e concluiu que o constituinte não celulósico
era de natureza aromática. Em 1890, Benedikt e Bamberger demonstraram que
grupos metoxílicos estavam presentes nos tecidos da madeira, mas, eram ausentes
em amostras de celulose pura (Sjöström, 1993).
O desenvolvimento de alguns processos de polpação, especialmente o processo sulfito, despertou um grande interesse sobre as reações envolvendo a lignina e,
em conexão com seus estudos sobre a composição de ligninas sulfonadas, Klason
introduziu em 1897 a idéia de que a lignina estava quimicamente relacionada ao
álcool coniferílico. Sua hipótese foi baseada no fato de que o aquecimento do álcool coniferílico com soluções de bissulfito acidificado produzia o ácido sulfônico
correspondente, que Klason acreditava ser similar à estrutura das ligninas sulfonadas
(Sjöström, 1993).
O estudo químico de ligninas evoluiu a partir da análise dos produtos de suas
reações de hidrólise, oxidação com nitrobenzeno (Freudenberg, 1968; Adler, 1977)
e etanólise (Cramer, 1939), que permitiram concluir que as ligninas são formadas a
partir de unidades básicas arilpropanóides (Freudenberg, 1968) (Figura 7). Através
da análise dos produtos dessas reações, foi possível elucidar os principais tipos de
subestruturas das ligninas e constatar que estas realmente variam em concentração
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de espécie para espécie e, até mesmo, dentro da mesma espécie, dependendo da
natureza e de seu modo de obtenção (Adler, 1977).
As ligninas podem ser classificadas segundo sua origem (nativa ou industrial),
tipo de procedimento utilizado para extraí-la (seja diretamente do vegetal, por
reação química ou por extração com solventes após moagem) e, finalmente, pelo
tipo de planta industrial que a produz (como as indústrias de celulose e de produção de furfural a partir de madeira ou de cana-de-açúcar) (Casey, 1982).
A lignina é um dos três constituintes principais da madeira. É um polímero
natural proveniente da condensação desidrogenativa de três álcoois precursores:
álcool coniferílico, álcool sinapílico e álcool p-cumarílico (Figura 7). Sendo assim,
define-se a lignina como um polímero constituído de unidades arilpropanóides, do
tipo C6C3 ou, simplesmente, C9, denominadas de guaiacilpropano, siringilpropano
e p-hidroxifenilpropano, respectivamente.
Diferentemente da celulose e de outros polímeros naturais, as ligninas apresentam uma estrutura macromolecular em que as unidades monoméricas não se repetem de forma regular e encontram-se entrelaçadas por diferentes tipos de ligações
(Freudenberg, 1968), tais como ligações carbono-carbono entre as cadeias alifáticas
C3 (β-β’, α-α’, α-β’), entre as cadeias alifáticas e os anéis aromáticos (β-5’, β-1’,
α-1’, β-6’) e entre carbonos aromáticos (5-5’), além de ligações etéreas envolvendo
cadeias alifáticas e anéis aromáticos (β-O-4’, α-O-4’, α-γ’).
Em 1974, Nimz propôs um arranjo para a lignina de faia (Nimz, 1974) (Fagus
silvatica), que é um tipo de folhosa. Em 1992, Morais propôs um fragmento representativo da lignina do Eucalyptus grandis (Morais, 1993), o qual está mostrado na
Figura 8.
Apesar de todos os estudos realizados até hoje sobre a lignina, muitos pontos
relativos à sua estrutura ainda não se encontram esclarecidos, mesmo considerando-se a grande contribuição trazida pela aplicação de técnicas modernas de análise
instrumental. Ela difere nitidamente dos polissacarídeos por ser um composto aromático, amorfo e isotrópico, que está presente em maior concentração nos espaços
FIGURA 7.
Estrutura dos álcoois
precursores de ligninas:
A: álcool coniferílico,
B: álcool sinapílico e C:
álcool p-cumarílico.
287
288
|
intercelulares, também chamados de lamela média (Sjöström, 1993; Freudenberg,
1968).
1.4. COMPONENTES MINORITÁRIOS
Os componentes minoritários da madeira incluem uma variedade de compostos orgânicos, sendo que nenhuma espécie vegetal os contém em sua totalidade. A
presença relativa destes é governada por uma série de fatores, entre os quais merece
maior destaque os de natureza genética e climática (D’Almeida, 1988).
Os constituintes menores não residem na parede celular da planta e dividemse, basicamente, em duas classes. A primeira classe engloba materiais conhecidos
como extrativos por serem extraíveis em água, solventes orgânicos neutros, ou
volatilizados por arraste de vapor. A segunda classe engloba materiais que não são
comumente extraíveis com os agentes mencionados, como, por exemplo, compostos inorgânicos, proteínas e substâncias pécticas. Esses constituintes minoritários
são freqüentemente responsáveis por determinadas características da planta, como
cor, cheiro, resistência natural ao apodrecimento, sabor e propriedades abrasivas
(D’Almeida, 1988).
É comum a denominação de resina para uma determinada classe de extrativos. Este termo, no entanto, caracteriza mais a condição física do que designa
compostos químicos. Chama-se de resina uma série de compostos diferentes que
inibem a cristalização. Deste modo, os seguintes compostos podem ser encontrados
FIGURA 8.
Fragmento da estrutura
proposta para a lignina
do E. grandis (Morais,
1992).
|
como componentes de resinas: terpenos, lignanas, estilbenos, flavonóides e outros
aromáticos. Além dessas substâncias, outros compostos orgânicos podem estar
presentes nos extrativos, como gorduras, ceras, ácidos graxos, álcoois, esteróides e
hidrocarbonetos de elevada massa molar.
Os terpenos podem ser considerados múltiplos de unidades do isopreno
(2-metil-butadieno). De acordo com o número destas unidades, podem ser subdivididos em várias classes como: monoterpenos (2 unidades); sesquiterpenos
(3 unidades); diterpenos (4 unidades); sesterpenos (5 unidades); e triterpenos (6
unidades).
Os extrativos de coníferas contêm, geralmente, todas as classes de terpenos,
exceto os sesterpenos, que são raros (D’Almeida, 1988). Como exemplo, a terebintina, óleo volátil das coníferas, consiste principalmente de monoterpenos, sendo os
mais importantes o α-pineno, o β-pineno e o limoneno.
Graxas são definidas como ésteres de ácidos graxos com glicerol (ésteres glicerídicos), enquanto que ceras são ésteres de ácidos graxos com álcoois de alta massa
molecular. Graxas e ceras são extraíveis da madeira com solventes orgânicos (éter
de petróleo, acetona, éter etílico etc.), sendo que nas substâncias extraíveis de folhosas ainda se podem encontrar aminoácidos, carboidratos e alcalóides (D’Almeida,
1988).
Nos extrativos de coníferas, também se encontram vários compostos fenólicos, dos quais alguns são resíduos e subprodutos da biossíntese da lignina. Estes
compostos podem ser classificados em: (a) fenóis simples, como a vanilina, p-hidroxibenzaldeído e coniferaldeído; (b) lignanas, que são estruturas formadas por
acoplamento oxidativo de duas unidades fenilpropanóides; (c) estilbenos, que são
derivados do 1,2-difeniletileno contendo ligações duplas conjugadas; (d) flavonóides, que são derivados da flavona (2-fenil-benzopirona) com esqueleto carbônico
do tipo C6C3C6; e (e) taninos, que correspondem a compostos fenólicos que vão
desde fenóis simples até sistemas de flavonóides condensados.
Substâncias não extraíveis são, na sua grande maioria, formadas por compostos inorgânicos e estão presentes na madeira em teores inferiores a 1%. São constituídos, principalmente, por sulfatos, fosfatos, oxalatos, carbonatos e silicatos de
cálcio, de potássio e de magnésio, além de um grande número de outros elementos
em quantidades muito pequenas (traços) (D’Almeida, 1988).
A maioria dos compostos inorgânicos está combinada com substâncias orgânicas e possui funções fisiológicas, exercendo, assim, papel importante no metabolismo da planta. Além dos minerais, se encaixam nesta série as pectinas que
são, essencialmente, polímeros de ácido galacturônico não extraíveis em solventes
orgânicos neutros.
2. Métodos Analíticos Convencionais para Caracterização de Materiais Celulósicos
Toda biomassa celulósica residual é composta em sua maioria por três substâncias naturais, a celulose, a hemicelulose e a lignina (Roelofsen, 1959; Butterfield
289
290
|
and Meylan, 1980). Conforme o exposto acima, as moléculas de celulose formam
uma estrutura altamente organizada cuja estabilização depende principalmente de
ligações de hidrogênio intra- e intermoleculares (Figura 2). Tal associação resulta
em uma estrutura rígida altamente resistente a agentes químicos e biológicos (Puri,
1984; Fan et al., 1987; Sinitsyn et al., 1991). Porém, apesar de suas propriedades paracristalinas, a estrutura da celulose apresenta regiões amorfas que correspondem a
aproximadamente 30-40% de sua massa. Por esta razão, vários autores têm postulado que a decomposição da celulose ocorre inicialmente através destas regiões amorfas e que o aumento de sua reatividade, durante o processo de pré-tratamento, pode
ser correlacionado com o aumento relativo de seu caráter amorfo (amorfogênese).
Em termos práticos, a composição química de materiais celulósicos nativos e
pré-tratados é comumente baseada na determinação de lignina de Klason (lignina
insolúvel em ácido sulfúrico), através do método “TAPPI T222 os-74”. Esta análise,
embora relativamente simples, deve ser precedida por uma etapa de remoção dos
extrativos existentes na matéria, principalmente devido ao envolvimento destas
substâncias de baixa massa molecular em reações de condensação cujos produtos,
devido a critérios de insolubilidade em soluções ácidas diluídas, podem ser erroneamente quantificados como lignina (Puls, 1993).
Segundo a técnica original, aproximadamente 1 g do material seco e moído
(20-40 mesh) deve ser tratado com 15 mL de uma solução de ácido sulfúrico 24
± 0,1 N (72%) por 2 h a 20 ± 1°C. Durante esta fase de pré-hidrólise, a mistura
deve ser constantemente agitada com um bastão de vidro para que ocorra melhor
solubilização (e/ou hidrólise parcial) dos polissacarídeos constituintes da matéria.
Em seguida, a mistura deve ser diluída cuidadosamente a uma concentração de
aproximadamente 3% em ácido sulfúrico e mantida sob refluxo por 4 h (alternativamente, pode-se substituir esta etapa pela hidrólise em autoclave a 121°C por 1 h)
(Gomide e Demuner, 1986; Barnett et al., 1992). Após o refluxo, o hidrolizado total
deve ser filtrado através de um filtro de porcelana com porosidade média e o material insolúvel em ácido (lignina) lavado a quente e posteriormente quantificado
gravimetricamente. A lignina parcialmente solubilizada em ácido durante o processo também pode ser determinada por espectrofotometria, utilizando o método
“TAPPI Useful 250” (Barnett et al., 1992; Silva, 1995).
Dando continuidade ao procedimento de Klason, a composição em carboidratos monoméricos do material celulósico é determinada no produto de hidrólise
ácida por cromatografia a líquido de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia a gás
após derivatização dos açúcares a acetatos de alditóis. No entanto, em ambos os
casos, as concentrações de açúcares obtidas cromatograficamente devem ser corrigidas por um fator correspondente à labilidade ácida de cada um dos carboidratos
quantificados. É importante salientar que, devido a heterogeneidade de materiais
de natureza celulósica, a significância estatística de cada análise exige um número
mínimo de três repetições, de forma a permitir que o cálculo de coeficientes de
variação representativos (Puls, 1993).
|
Devido à maior simplicidade em sua execução, métodos de HPLC têm sido
mais comumente empregados na caracterização dos hidrolisados decorrentes da
análise de Klason. Como o hidrolisado é ácido, colunas de troca iônica podem ser
empregadas para a análise de modo a não exigir nenhuma etapa de neutralização.
A Figura 9 fornece um exemplo de corrida cromatográfica, utilizando uma coluna
Aminex HPX-87H (Bio-Rad) sob eluição com ácido sulfúrico 8 mM a 65°C, em
que os carboidratos foram detectados por refratometria diferencial (Ramos, 1992).
Esta técnica é perfeitamente aplicável a hidrolisados de folhosas ou angiospermas,
em que a hemicelulose predominante é uma heteroxilana, mas apresenta o inconveniente de não resolver entre os monossacarídeos manose, galactose e xilose. Por
esta razão, outras colunas cromatográficas (SugarPak, da Waters, ou Aminex HPX87P, da Bio-Rad), que exigem neutralização do hidrolisado para análise, precisam
ser empregadas para caracterizar materiais lignocelulósicos mais complexos, como
os derivados de coníferas.
A mesma análise cromatográfica mostrada acima também pode ser estendida
à quantificação de furfural e hidroximetilfurfural, que correspondem aos produtos
de desidratação de pentoses e hexoses, respectivamente. No entanto, para assegurar
uma boa análise quantitativa destes componentes, a detecção deve ser preferencialmente realizada por espectrofotometria no UV, no comprimento de onda de 280
nm. A Figura 10 apresenta um cromatograma característico deste procedimento
analítico, cujas curvas de calibração usualmente atendem aos critérios mais rígidos
de quimiometria.
A importância da quantificação do furfural e do hidroximetilfurfural já foi
enfatizada em muitos trabalhos associados à caracterização da fitobiomassa. No
entanto, os procedimentos empregados para este fim variam bastante. Silva (1995)
propôs o emprego de cromatografia a líquido de fase reversa quimicamente ligada
para a quantificação destes produtos de desidratação de açúcares. Neste procedimento, furfural e hidroximetilfurfural, além de compostos fenólicos eventualmente
presentes nos hidrolisados, são adsorvidos em matriz de fase reversa do tipo Seppack C18 (Waters) em que carboidratos como hexoses e pentoses não são retidos.
Com isto, a análise de carboidratos por cromatografia de troca iônica fornece cromatogramas mais limpos, com a vantagem adicional de que a coluna cromatográfica é preservada da contaminação com componentes de baixa polaridade presentes
nos hidrolisados. O material de baixa polaridade, retido no cartucho de adsorção,
é dessorvido por lavagem com metanol e o adsorbato analisado subsequentemente por cromatografia a líquido em coluna de fase reversa, fornecendo tempos de
retenção bem menores do que os eventualmente observados em colunas de troca
iônica (vide Figura 10). A diferença entre os dois métodos é a de que as Figuras 9
e 10 são oriundas de uma única corrida cromatográfica, enquanto que o método
descrito por Silva (1995) exige dois procedimentos cromatográficos precedidos
de uma etapa de extração em fase sólida para separar os componentes presentes nos hidrolisados da biomassa. Por outro lado, a principal desvantagem do
291
292
|
procedimento realizado por troca iônica é o tempo prolongado de análise, que
praticamente exige a disponibilidade de sistemas automáticos de injeção (“autosampler”) para permitir a análise seqüencial e ininterrupta de várias amostras de
hidrolisado.
A falta de resolução e/ou eficiência nos métodos de HPLC pode ser compensada pelo emprego de métodos de cromatografia a gás para a separação e quantificação individual dos carboidratos presentes na fitobiomassa. O procedimento
para esta análise é relativamente longo, mas o resultado é deveras compensador
5E+5
ácido sulfurico
glucose
Resposta do detector (RID)
FIGURA 9.
Análise cromatográfica
(HPLC) dos hidrolisados
de Klason de uma
amostra de bagaço de
cana. O pico majoritário
corresponde ao ácido
sulfúrico utilizado para
hidrólise, cuja remoção
não é necessária para
esta análise.
4E+5
3E+5
xilose
2E+5
1E+5
celobiose
arabinose
ácido acético
0E+0
4
6
8
10
12
14
16
Tempo de retençao (min)
600.000
furfural
500.000
400.000
A (280 nm)
FIGURA 10.
(HPLC) dos produtos
de desidratação de
pentoses e hexoses
presentes nos
hidrolisados de Klason
do bagaço de cana.
hidroximetilfurfural
300.000
200.000
100.000
0
10
18
26
34
42
50
58
|
293
(Figura 11). A coluna capilar geralmente empregada para esta análise corresponde a uma OV225 (ou outra similar) de 30 metros, onde o inositol é comumente
empregado como padrão interno (Blakeney et al., 1993). Na verdade, este procedimento é absolutamente fundamental porque acetatos de alditol apresentam
diferentes fatores de resposta para detectores de ionização de chama (FID). Outra
preocupação relevante é a recuperação dos açúcares ao longo do processo de derivatização, que envolve a hidrólise ácida dos polissacarídeos, seguida de redução
com boroidreto de sódio e preparo dos alditóis para acetilação com anidrido
acético em piridina.
Naturalmente, a evolução dos métodos cromatográficos de análise tem facilitado muito a caracterização de amostras complexas. Um exemplo disto está relacionado à detecção em cromatografia de alta resolução, muitas vezes empregando
métodos espectrométricos de vanguarda como a ressonância magnética nuclear e
a espectrometria de massas. Por exemplo, se a detecção de massas é feita através
do monitoramento de íons individuais previamente selecionados, informações
univariadas altamente fidedignas podem ser obtidas mesmo em situações onde a
resolução cromatográfica não seja satisfatória.
A análise da celulose por espectrometria no infravermelho com transformada
de Fourier (FTIR) pode fornecer dados interessantes sobre a sua estrutura, particularmente na caracterização de grupos funcionais importantes e na determinação de
parâmetros estruturais como o grau de cristalinidade (vide abaixo). Porém, como
o FTIR não se presta à análise quantitativa tanto quanto à qualitativa, resultados
conclusivos são muitas vezes decorrentes da análise comparativa de espectros gerados sob as mesmas condições experimentais. Para facilitar esta análise comparativa,
recomenda-se que os espectros sejam normalizados pela absorbância característica
Resposta do detector (FID)
FIGURA 11.
(GC) dos carboidratos
presentes em
hidrolizados de polpas
kraft de eucalipto,
após derivatização dos
mesmos a acetatos
de alditol (o inositol
corresponde ao padrão
interno da análise).
glucitol
14000
12000
10000
8000
6000
inositol (PI)
xylitol
4000
galactitol
manitol
arabinitol
2000
0
6
7
8
9
10
11
12
13
14
294
|
do carbono anomérico C1 (900 cm-1) através de cálculos matemáticos, tornandoos equivalentes a todos os materiais celulósicos em análise. Dentre as principais
bandas atribuídas à celulose em espectros de FTIR, constam: 3200-3400 cm-1, que
correspondem à deformação axial de O-H em grupamentos hidroxila associados;
2800-2950 cm-1, que representa os estiramentos simétricos das ligações C-H em
grupos metílicos e metilênicos; 800-1500 cm-1, que congrega as absorções correspondentes à impressão digital dos carboidratos; 1100-1200 cm-1, que representa as
deformações axiais de éteres; 900 cm-1, que representa vibração característica da
ligação glicosídica do tipo β; e a banda em 1640 cm-1, que se deve à água adsorvida
ou à presença de carbonilas conjugadas e/ou insaturações provavelmente resultantes da oxidação de carboidratos e/ou de fragmentos contaminantes de lignina (vide
Figura 12).
A análise por FTIR é geralmente realizada a partir de pastilhas de KBr, preparadas em prensa apropriada na presença de concentração conhecida do material celulósico previamente moído (1 a 2% em massa seca). Os espectros no infravermelho
próximo são geralmente gravados de 4000 a 400 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e
coleta de 32 interferogramas por espectro antes da aplicação da transformada de
Fourier. Alternativamente, os espectros de FTIR podem ser gerados a partir de materiais celulósicos utilizando-se da técnica de reflectância difusa (ou “DRIFT”), cuja
excecução dispensa a confecção de pastilhas de KBr e, por conseguinte, a moagem
das fibras celulósicas. Embora menos comuns, outras regiões do espectro do infravermelho, como o infravermelho próximo (NIR) e a espectroscopia Raman, também têm sido aplicadas com sucesso na caracterização de materiais celulósicos.
3. Métodos Analíticos Não Convencionais
3.1. DETERMINAÇÃO DO GRAU DE CRISTALINIDADE DA CELULOSE
A estrutura supramolecular da celulose pode ser caracterizada através de métodos que permitam a determinação de sua cristalinidade e grau de polimerização.
100
Transmitância (%)
FIGURA 12.
Espectrometria no
infravermelho com
transformada de
Fourier de polpa kraft
branqueada em pastilha
de KBr a 1% (m/m).
80
60
40
20
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
Número de onda (cm-1)
3.500
4.000
4.500
|
295
Segundo Sarko (1986), citado por Ramos (1992), a natureza cristalina da celulose
foi primeiro estabelecida usando microscopia de luz polarizada, mas a confirmação
desta hipótese somente foi possível com o desenvolvimento da difratometria de
raios-X. Cada plano cristalográfico da unidade espacial da celulose é representado
no difratograma de raios-X por um pico a um ângulo de difração característico.
Embora, vários planos cristalográficos (hkl) contribuam para o padrão de difração
da celulose, as reflexões obtidas nos planos (101), (101) e (002) são, em geral, dominantes. Esses planos correspondem a picos centrados nos ângulos de difração
(2θ ou ângulo de Bragg) de 14,6, 16,2 e 22,6 graus, respectivamente, quando utilizada como fonte de radiação a linha alfa do cobre (CuKα = 0,154 nm). Porém,
quando a linha alfa do cobalto (CoKα = 0,179 nm com filtro de Ni) é utilizada, há
um deslocamento homogêneo do difratograma em relação à linha alfa do cobre
de aproximadamente + 3,5 graus (Ramos, 1992). Este deslocamento não causa
qualquer alteração analítica na determinação do índice de cristalinidade, havendo
perfeita equivalência entre os perfis obtidos por difração de raios-X em qualquer
um destes casos.
A cristalinidade é geralmente avaliada por difração de raios-X (Sarko, 1986;
Ramos et al., 1993b), empregando o método empírico de Segal et al. (1959) (Figura
13). Neste método, (a) a região cristalina é estimada pela intensidade de difração
no plano (hkl) = (002), correspondente a um ângulo de Bragg (2θ) de 22,5o, (b) a
região amorfa é caracterizada pela intensidade mínima na região de 2θ = 18,5o e (c)
o índice de cristalinidade é calculado através da seguinte expressão:
Intensidade relativa (%)
100
FIGURA 13.
Difração de raios-X de
polpa kraft branqueada,
com a identificação das
intensidades utilizadas
na relação empírica
de Segal et al. (1959).
Valores em parêntesis
indicam diferentes
planos cristalográficos
e seus respectivos (hkl).
(002)
80
60
(101) (101)
40
(021)
20
(040)
IAM
ICR
0
8
12
16
20
24
28
Angulo de Bragg (2 Θ)
32
36
296
|
No entanto, a interpretação dos dados de difração de raios-X deve sempre
ser muito cuidadosa, principalmente quando este método é utilizado para avaliar
o efeito de um processo hidrolítico e/ou degradativo da celulose. Conforme dito
anteriormente, à medida que a superfície das fibrilas (ou mesmo os cristalitos,
em uma menor dimensão) de celulose são atacadas por agentes químicos (ácidos
minerais) ou biológicos (enzimas), moléculas de menor grau de polimerização são
geradas. Estas moléculas, durante o preparo da amostra para difração de raios-X,
são suscetíveis à recristalização devido à remoção de água por processos como a liofilização, muitas vezes mascarando o real efeito causado pelo processo degradativo
em estudo (Atalla, 1984; Ramos et al., 1993).
Outros métodos analíticos, tais como a ressonância magnética nuclear de
13
C no estado sólido (Newman and Hemmingson, 1994; Evans et al., 1995) e a
espectrometria no infravermelho (FTIR) do material compactado em pastilhas
de KBr (Evans et al., 1995), também têm sido sugeridos para a determinação da
cristalinidade. O trabalho publicado por Evans et al. (1995) traz uma excelente
discussão sobre cada um destes métodos, cuja abordagem vai além dos objetivos
deste ensaio.
Em decorrência destes estudos, foi proposto que a celulose nativa é composta
por duas formas cristalinas alomórficas, chamadas de Iα e Iβ. Assim, a celulose
nativa foi classificada em duas famílias: a família das celuloses bacterianas (Valonia
e Acetobacter), onde a celulose é rica na forma Iα, e a família das fibras vegetais (ramie e algodão), onde a forma Iβ é predominante. Um aspecto do dimorfismo Iα/Iβ
da celulose é que a forma Iα é metaestável e pode ser rapidamente convertida em
Iβ por tratamento térmico na presença de NaOH (Sugiyama et al., 1991; Newman,
1994).
O tamanho da molécula de celulose nativa é inferior a 5 μm, o que corresponde
a um tamanho de cadeia de aproximadamente 10000 unidades de anidroglucose
(AnGlc). O menor elemento de construção do esqueleto celulósico é considerado
por muitos como a fibrila elementar, formada por um agregado de moléculas de
celulose nas quais regiões altamente ordenadas (cristalinas) alternam-se com regiões menos ordenadas (amorfas). As fibrilas elementares formam as microfibrilas
(Figura 2) que, por sua vez, formam as fibras de celulose. Dada a esta estrutura
macromolecular, a celulose possui alta resistência à tensão e é insolúvel em muitos
solventes (Nevell e Zeronian, 1985; Fengel e Wegener, 1989). Por outro lado, a
proporção entre regiões ordenadas e desordenadas varia consideravelmente em
decorrência da origem da amostra. Assim, a celulose do algodão é mais cristalina
do que a celulose da madeira, que possui índice de cristalinidade entre 50 a 70%
(Sjöström, 1993).
3.2. DETERMINAÇÃO DO GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA CELULOSE
Juntamente com o grau de organização molecular ou cristalinidade, o grau de
polimerização é também um dos principais parâmetros para avaliação da estrutu-
|
ra molecular da celulose. Classicamente, esta propriedade tem sido determinada
em solução mediante o uso de solventes reativos como complexos nitrogenados
contendo íons metálicos, geralmente cobre ou cádmio (por exemplo, cuoxam,
cuproetilenodiamina ou cadoxen). Com base nas propriedades viscosimétricas da
solução obtida, avaliadas por viscosimetria capilar, conclusões sobre massa molecular média, polidispersidade e conformação do polímero podem ser obtidas com
relativa facilidade (Fengel e Wegener, 1989).
Outros métodos podem também ser utilizados para avaliação das propriedades poliméricas da celulose. Por exemplo, o número molecular médio (ou média
aritmética das massas moleculares, MMN) pode ser medido por osmometria ou pela
determinação do número relativo de grupos redutores terminais, enquanto que a
massa molecular média (ou média ponderada das massas moleculares, MMM) pode
ser deduzida a partir de dados obtidos por espalhamento de luz. Para a celulose, a
relação entre massa molecular (MM) e grau de polimerização (GP) é de GP=MM/
162, onde 162 é a massa molecular de uma unidade de anidroglucose. A razão
MMM/ MMN é a medida de polidispersidade, que corresponde à largura da distribuição em massas moleculares (Nevell e Zeronian, 1985; Fengel e Wegener, 1989).
Cada unidade D-glucopiranosídica dentro da cadeia de celulose contém três
grupos OH reativos, dois secundários (OH-2 e OH-3) e um primário (OH-6). Os
álcoois primários e secundários na celulose reagem do mesmo modo que substâncias simples de constituição química similar. Estes grupamentos podem ser, portanto, rapidamente oxidados, esterificados e/ou convertidos em éteres.
Utilizando-se de métodos controlados de derivatização à ésteres de celulose,
vários protocolos de síntese têm sido propostos para adequar a investigação do
grau de polimerização da celulose a métodos cromatográficos como a cromatografia de permeação em gel (GPC), de cujos perfis se pode obter dados estruturais
mais refinados como a distribuição em massas moleculares de amostras nativas e
parcialmente hidrolisadas. Um destes métodos preconiza a utilização da reação de
carbamilação, cujo produto (celulose per-carbamilada) é suscetível à CPG por ser
perfeitamente solúvel em tetrahidrofurano (Valtasaari and Saarela, 1975; Schroeder
e Haigh, 1979; Kossler et al., 1981; Miller et al., 1991). A análise de outros derivados
da celulose, tais como o seu produto de nitração, permitem igualmente com que
se determine o grau de polimerização da celulose, desde que sempre assistidos por
métodos de calibração universal. Porém, nestes casos, os derivados obtidos são menos estáveis do que aquele obtido pela reação de carbamilação (Wood et al., 1986;
Ramos et al., 1993, 1999).
O derivado per-carbamilado pode ser obtido por reação com isocianato de
fenila em meio contendo piridina ou sulfóxido de dimetila (DMSO) (Ramos, 1992;
Ramos et al., 1993b, 1999b). A Figura 14 apresenta o perfil cromatográfico obtido
a partir dos derivados tricarbamilados da celulose presente no algodão e em polpas
celulósicas branqueadas do tipo kraft. Obviamente, a celulose do algodão apresenta
297
298
|
massas moleculares superiores aos da polpa kraft, pois esta última é decorrente de
um processo quimicamente degenerativo e hidrolítico (polpação kraft).
A massa molecular da celulose varia significativamente, dependendo da origem da amostra. Por exemplo, a celulose encontrada nas fibras de rami possui uma
massa molecular da ordem de 50.000 u.m.a., o que corresponde a um grau de polimerização (GP) de aproximadamente 300 unidades de anidroglucose, enquanto
que a celulose de origem bacteriana possui um GP da ordem de 7.000 unidades de
anidroglucose ou mais. Celulose oriunda de plantas superiores pode atingir GP superiores a 10.000, ou seja, na faixa de 2 a 3 milhões de u.m.a. (Fengel and Wegener,
1989). Todos os processos que envolvem o isolamento e utilização da celulose para
fins industriais geram uma diminuição radical de seu GP. Processos de polpação do
tipo kraft fazem com que o GP da celulose encontrada na madeira caia para a faixa
de 1.000 a 1.300, enquanto que outros processos como a hidrólise ácida podem
gerar decréscimos ainda mais contundentes em GP, chegando a valores limites da
ordem de 250 a 300 unidades de anidroglucose (Fan et al., 1987). Este produto
celulósico de alta cristalinidade, a que chamamos de celulose microcristalina, tem
grande aceitação no mercado e serve a uma série de aplicações nas indústrias farmacêutica (como excipiente para fármacos), de cosméticos, de alimentos e de aditivos
para os mais variados fins.
100
algodão
Resposta Normalizada do Detector
FIGURA 14.
Análise de celulose
per-carbamilada por
cromatografia de
permeação em gel,
indicando a distribuição
em massas moleculares
do polímero oriundo
de fibras de algodão
hidrófilo e polpa kraft
branqueada de Pinus
spp.
80
polpa de Pinus
60
40
20
0
10
100
1.000
Grau de Polimerizacão
10.000
|
O termo celulose microcristalina se originou da observação que, durante o tratamento ácido de celulose das mais diversas origens, o produto parcialmente hidrolisado adquiria uma cristalinidade cada vez maior, simultaneamente ao decréscimo
gradativo em seu GP médio. Teoricamente, o processo de hidrólise age sobre o material celulósico eliminando as regiões amorfas que interligam as regiões cristalinas
de maior organização molecular, gerando um produto altamente homogêneo e estruturalmente definido (Fan et al., 1987). Mesmo aqueles oligômeros parcialmente
hidrolisados, que prevaleceram ainda desorganizados em sua orientação espacial,
sofrem uma reorientação “catalisada” pela retirada da água durante o processo de
secagem para comercialização. Isto resulta em um processo de recristalização ou
redeposição de forma organizada na superfície do agregado, reforçando o caráter
cristalino do produto (Atalla, 1984).
A redução do GP da celulose não ocorre de uma forma homogênea e uniforme.
Mesmo a partir de uma distribuição de moléculas bastante uniformes, métodos de
degradação parcial da molécula levam a um aumento da polidispersidade (ou polidispersividade) do produto, caracterizando assim a geração de sub-populações de
moléculas ou oligômeros que se distribuem ao longo de uma grande faixa de massas moleculares. Tal efeito é devido a vários fatores, dos quais o mais importante é o
ataque inicialmente superficial ao agregado molecular cristalino, gerando gradativamente uma maior variedade de fragmentos e o eventual acúmulo de oligômeros
à medida que a degradação progride para as regiões mais internas do compósito
(Ramos et al., 1993b, 1999b).
3.3. CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATIVOS DE POLPA E MADEIRA
Esta seção enfoca fundamentalmente os principais métodos analíticos para
caracterização dos extrativos lipofílicos de madeira e polpa. Embora geralmente
classificados de acordo com a sua localização e função no tecido vegetal, os extrativos também são agrupados de acordo com a sua polaridade e solubilidade em
diferentes solventes, como demonstra a Tabela 1.
Na maioria dos casos, é necessário isolar os extrativos das amostras antes de
proceder as suas respectivas análises. A extração de amostras sólidas usualmente se
realiza com extratores Soxhlet ou Soxtec. Este último requer menos da metade do
tempo de extração e permite o tratamento simultâneo de até seis amostras (Sitholé
et. al. 1991).
Vários tipos de solventes podem ser utilizados para a extração de amostras de
madeira, polpa e papel. Atualmente, se utilizam os seguintes solventes, expressos
em relação ao volume: etanol, etanol:benzeno (1:2), etanol:tolueno (1:2), acetona,
acetona:água (9:1) e diclorometano, assim como outros alcanos como o hexano.
Um novo método padrão SCAN (SCAN – CM 49:93) substituiu o diclorometano por acetona para a extração de polpas celulósicas porque, apesar de um bom
solvente, o diclorometano apresenta certos riscos ambientais e para a saúde. Na
verdade, a acetona tem sido amplamente utilizada para extração desde os anos 70 e
299
300
|
Tabela 1. Classificação dos extrativos de madeira e polpa (Holmbom, 1999a.)
Localização
Componentes,
solubilidade e
Zona de
crescimento
Canais
resiníferos
Células
Parenquimáticas
Cerne
Principais
componentes
Ácidos resínicos,
monoterpenos e
outros terpenos
Graxas, ácidos
graxos e esteróis
Substâncias
fenólicas
Alcanos
+++
+++
Éter dietílico,
DCM
+++
+++
++
0
0
Acetona
+++
+++
+++
++
+
Etanol
++
++
+++
+
+
Água
0
0
+
+++
++
Ocorrência
Coníferas
Todas as espécies
de madeira
Geralmente
coníferas
ocorrência
e câmbio
Agua ascendente,
seiva
Glicosídeos,
açúcares, amido
e proteínas
Solubilidade em:
0
0
0
Todas as espécies Todas as espécies
de madeira
de madeira
+++: facilmente solúvel; ++: solúvel; +: ligeramente solúvel; 0: insolúvel.
foi há muito selecionada como solvente de referência no Canadá (CPPA Standard
G13 e G20).
A acetona, ou ainda melhor, a acetona:água (9:1), é um solvente efetivo para os
componentes resínicos da madeira. Trata-se de um sistema inerte, estável e seguro.
No entanto, quando comparada ao diclorometano, a acetona apresenta a desvantagem de também extrair alguns componentes hidrofílicos importantes, tais como
açúcares simples e fenil glicosídeos.
A análise de extrativos pode ser realizada em três níveis:
a) Quantificação de extrativos totais (por gravimetria ou outra determinação);
b) Determinação de diferentes grupos de componentes;
c) Análise de componentes individuais (algumas vezes precedida por uma etapa
de separação de diferentes componentes ou grupos de componentes)
Para a análise de rotina e controle de qualidade, a quantificação gravimétrica
de extrativos totais pode ser considerada suficiente. No entanto, não são raras as
situações em que informações detalhadas sobre componentes individuais, como
triglicerídeos, esteróis, ácidos graxos e ácidos resínicos, se fazem necessárias para
estudos de otimização de processos.
Os diferentes tipos de componentes presentes nos extrativos podem ser determinados por várias técnicas cromatográficas, como as de fase gasosa (GC) e fase
líquida de alta eficiência (HPLC), de fluido supercrítico (SFC) e de camada delgada
(TLC).
A grande resolução alcançada com GC, utilizando colunas capilares curtas,
torna este método uma excelente técnica para análise de misturas multicomponentes complexas, como são os extrativos da madeira. A combinação de GC com a
|
301
espectrometria de massa (GC/MS) permite a obtenção de informações qualitativas
complementares e é adequada à identificação dos componentes individuais presentes nas amostras. A Figura 15 mostra cromatogramas de GC dos extratos de acetona
de diferentes amostras de madeiras.
Métodos de HPLC têm sido igualmente utilizados para a análise de grupos de
extrativos nos modos de exclusão por tamanho (HPSEC) e fase reversa (RP). Uma
boa separação dos principais componentes da resina pode ser obtida no modo SEC
usando colunas de poliestireno entrecruzado e tetrahidrofurano como fase móvel.
A principal limitação desta análise é a superposição comumente observada entre
esteróis e ácidos graxos.
FIGURA 15.
GC de extratos em
acetona de madeira
de spruce e birch
(Holmbom,1999b)
Spruce heartwood (1 g wood, 2 mg std)
std
0,2 %
std
std
Fatty Resin
acids acids
2
4
Steryl
esters
Lignans Sterols
6
8
10
12
14
16
18
Triglycerides
20
22
Birch wood (1 g wood, 2 mg std)
std=cholesterol
0,2 %
std
Fatty
acids
2
4
std
Steryl
esters
Sterols
6
8
10
12
14
16
18
Triglycerides
20
22
302
|
A cromatografía de camada delgada (TLC) é uma técnica conveniente e
econômica para a análise de resinas. A TLC geralmente proporciona uma boa
visualização da composição da amostra, mas não oferece qualquer precisão como
método quantitativo. Portanto, a TLC é apropiada para a separação preparativa dos
componentes da resina para posterior análise por métodos mais detalhistas como a
cromatografia de fase gasosa (GC).
A necessidade de derivatização tem sido considerada uma desvantagem do GC,
quando comparado às técnicas de fase líquida (HPLC). No entanto, esta etapa não
é muito demorada para a análise de extrativos se comparada com o tempo necessário para a secagem, moagem e extração da amostra, seguida da evaporação total
do solvente.
A HPSEC pode ser realizada sem derivatização, apesar de que a metilação
geralmente melhora a separação de ácidos resínicos e ácidos graxos. Ademais, esta
técnica permite o isolamento de frações ou grupos de componentes que poderão
ser separados para posterior análise dos componentes individuais.
21:0 std
Neo
18.9 min
20:0
Ab
Pal + Le
DeAb
Neo
20:3
P
18:0
IP
Sa
16.5 min
Sa
5.8 min
8.3 min
17:0 ai
Le
P
IP
16:0
18:0
18:3
DeAb
Pal
AB + 20:3
18:1
17:0 std
18:2
TMS esters
16:0
FIGURA 16.
Análise por GC de
ácidos graxos e ácidos
resínicos derivados
do processo kraft,
na forma de metil e
trimetilsilil ésteres.
Ácidos graxos
identificados:
16:0-20:0, saturados;
18:3, pinolénico;
18:2, linoleico;
18:1, oléico;
20:3, 5,11,14eicosatrienóico.
Ácidos resínicos:
P, pimárico;
IP, isopimárico;
Pal, palústrico;
Lê, levopimárico;
Ab, abiético;
Neo, neoabiético.
Methyl esters
|
A cromatografía de fluido supercrítico (SFC) é uma técnica que apresenta
semelhanças ao GC e ao HPLC. Como no GC, pode-se fazer uso do detector de
ionização de chama (FID) e, como no HPLC, permite a análise direta e rápida dos
extratos de madeira e polpa sem hidrólise ou qualquer tipo de derivatização. A
separação é similar à obtida por GC, embora não tenha sido possível obter boas
separações entre esteróis e triglicerídeos.
Devido a sua alta resolução e eficiência, o GC com colunas capilares proporciona
a separação dos componentes individuais da resina, ainda que sem nenhum préfracionamento dos extratos. Como exemplo, a Figura 16 apresenta a separação, em
coluna capilar de dimetilpolisiloxano de 30 m de comprimento, dos ésteres metílicos
e trimetilsilil derivados de ácidos graxos, ácidos resínicos, álcoois graxos e esteróis.
3.4. DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS URÔNICOS EM POLPAS
O método para a determinação dos ácidos urónicos utilizado por Simão e colaboradores (2005a,b) é uma modificação do método proposto por Blumenkrantz
e Asboe-Hansen (1973), que foi desenvolvido originalmente para a determinação
de mucopolissacarídeos ácidos em materiais biológicos. O método baseia-se na
formação de um grupo cromóforo de cor rosa resultante da reação dos ácidos
urônicos, previamente tratados com o reagente 2-hidroxibifenila (ou 2-fenilfenol).
Segundo Blumenkrantz e Asboe-Hansen (1973), a cor obtida é estável e o método
apresenta melhores sensibilidade e especificidade que outros métodos colorimétricos propostos até a data, usando os reagentes carbazol e orcinol. No entanto, não é
conhecido o mecanismo desta reação.
No trabalho de Simão (2007), cuja descrição se segue, foram introduzidas
algumas modificações no procedimento original, de modo a utilizar uma maior
quantidade de polpa por amostra. As amostras de polpa ou de madeira moída são
previamente hidrolisadas através de um método baseado na hidrólise de Saeman: a
0,02 g de madeira ou polpa juntam-se 400 μL de ácido sulfúrico a 72%. A mistura
é colocada num banho térmico a 25ºC durante 3 horas, após as quais se adicionam
4,4 mL de água ultra-pura, diminuindo assim a concentração do ácido sulfúrico
para 1 M. Em seguida, coloca-se a amostra em um banho térmico a 100 ºC durante
1 hora.
As amostras assim hidrolisadas são centrifugadas e o líquido sobrenadante é
recolhido. Este é então diluído de modo a que a concentração de ácidos urônicos
produza uma absorvância dentro dos limites da validade da Lei de Beer-Lambert
(entre 0,2 e 0,6). Para cada amostra são utilizados cinco tubos de ensaio, em cada
um dos quais se introduz 1 mL da solução. Adicionam-se 6 mL de uma solução de
tetraborato de sódio 0,0125 M em ácido sulfúrico concentrado. A mistura é agitada
em agitador Vortex e colocada em banho térmico a 100ºC durante 10 minutos, ao
fim dos quais é colocada em banho de gelo durante 5 minutos. Posteriormente, 200
μL de uma solução de 2-hidroxibifenila 0,15% em NaOH 0,5% são adicionados a
quatro dos cinco tubos envolvidos no ensaio. Depois de agitada a mistura, a absor-
303
304
|
vância é lida a um comprimento de onda de 520 nm. Como alguns açúcares neutros
geram cor na reação com a solução de tetraborato de sódio e ácido sulfúrico, um
branco deve sempre ser efetuado em cada ensaio (5º tubo de ensaio), no qual o reagente 2-hidroxibifenila deve ser substituído por uma solução de NaOH 0,5%.
No trabalho de Simão (2007), foram ainda efetuados testes de repetibilidade
tendo esta sido calculada através da análise de madeiras de E. globulus em 35 ensaios. Obteve-se um valor de 0,34%, em base madeira, para uma média de 5,2%,
com um grau de confiança de 95%. A Figura 17 apresenta o histograma dos valores
obtidos.
A técnica colorimétrica utilizada para determinação dos ácidos urônicos
quantifica tanto o ácido metilglucurônico como os ácidos galacturônico e glucurônico. Uma vez que na madeira de folhosas existem apenas quantidades residuais
destes últimos (Sjöstrom, 1989), é comum considerar, neste tipo de madeiras, que
todos os ácidos urônicos determinados por esta técnica correspondem a ácidos
metilglucurônicos (GlcA). Nas polpas kraft, por sua vez, existem também ácidos
hexenurônicos (HexA) formados durante o cozimento alcalino. Contudo, estes são
degradados em grande extensão nas condições analíticas associadas à referida técnica colorimétrica, pelo que não é necessário efetuar qualquer correção dos valores
experimentais.
Para quantificar os ácidos urônicos, é necessário construir uma curva de calibração utilizando soluções de concentrações diferentes de ácido galacturônico. O
gráfico da Figura 18 apresenta uma curva de calibração deste tipo. Como se pode
observar nesta representação, verificou-se uma variação linear da absorvância (Abs)
com a quantidade de ácido galacturônico (Gal) quando esta variou entre 23 e 50
μg/ml, correspondendo a absorvâncias inferiores a cerca de 0,6 (lidas em um espec-
9
8
Número de observações
FIGURA 17.
Histograma dos teores
de ácido glucurônico
(GlcA) na madeira de E.
globulus (Simão, 2007).
7
6
5
4
3
2
1
0
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1
5.2
[GIcA] (% odw)
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
|
305
0,7
0,6
Avsorvância
0,5
0,4
0,3
FIGURA 18.
Curva de calibração
utilizada nos ensaios
para a determinação
dos ácidos urónicos
(Simão, 2007).
0,2
0,1
0
0
20
40
60
80
100
120
Ácido galacturônico (μg/mL)
FIGURA 19.
Mecanismo de
formação do ácido
2-furóico em meio
ácido, a partir do ácido
hexenurônico
(Teleman et al. 1996)
trofotômetro Beckman DU-600). O reagente colorimétrico tinha uma pureza de 90%
(Aldrich), enquanto que a do padrão era de 99% (Riedel). A correlação obtida foi:
Gal (μg/ml) = 5,0 + 181,5*Abs
R2=0,9972
3.5. DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS HEXENURÔNICOS EM POLPAS
Sabe-se que folhosas como o Eucalyptus spp. contêm um alto teor de 4-Ometil-glucuronoxilanas e que as unidades de ácido 4-O-metil-glucurônico podem
contribuir com até 5% de sua massa seca (Carvalho, 1999). Estas unidades, durante o processo de polpação, são parcialmente convertidas no ácido hexenurônico
(HexA) por desmetoxilação seguida de um rearranjo interno (Figura 19).
A ocorrência de altos teores de HexA em polpas kraft representa a extensão
com que as hemiceluloses foram degradadas durante o processo. A formação e a
306
|
estabilidade do ácido hexenurônico é muito influenciada pelas condições de cozimento, em especial pela temperatura e pela carga alcalina (Buchert, 1995). Assim,
polpas marrons obtidas sob diferentes condições de polpação (diferentes severidades) apresentam diferenças no conteúdo destes ácidos carboxílicos.
A existência de ácidos hexenurônicos (HexA) em polpas kraft era, até há pouco
tempo, desconhecida porque estes compostos degradam durante procedimentos de
hidrólise ácida (Johansson e Samuelson, 1977; Teleman et al., 1996). Os primeiros
autores a detectar a presença destes ácidos em polpas kraft (Buchert et al., 1995)
substituíram a tradicional hidrólise ácida por uma hidrólise enzimática, utilizando
depois as técnicas de RMN e HPLC para determinar a composição dos carboidratos
da polpa.
Desde então, vários métodos foram desenvolvidos para a detecção e quantificação destes ácidos hexenurônicos. Tenkanen et al. (1999) fizeram uma comparação
dos três principais métodos desenvolvidos até a data: o método VTT, que consiste
na hidrólise enzimática das polpas seguida de análise dos carboidratos por HPAEC-PAD (Tenkanen et al., 1995); o método HUT, que consiste em uma hidrólise
ácida seletiva com formato de sódio, seguida de análise por espectrofotometria no
UV (Vuorinen et al., 1999); e o método KTH, que consiste em uma hidrólise com
acetato de mercúrio e reação com ácido tiobarbitúrico, produzindo uma cor rosa
que é quantificada por espectrofotometria no visível (Gellerstedt e Li, 1996). Mais
recentemente, Jiang et al. (2001) propuseram um método de determinação dos
HexA por hidrólise com ácido sulfúrico e análise dos ácidos furóicos resultantes da
reação por cromatografia de troca iônica com detecção por condutividade suprimida. No entanto, até o momento, não existe um método considerado padrão para a
determinação destes compostos em polpas kraft.
Ácidos hexenurônicos têm sido comumente medidos pelo método descrito
por Jiang et al. (2001) nos hidrolisados ácidos de polpas kraft. A análise dos hidrolisados pode ser realizada por HPLC utilizando uma coluna com fase reversa
quimicamente ligada (octadecilsilano ou C18). A análise quantitativa é geralmente
efetuada por padronização externa utilizando concentrações crescentes de ácido 2furóico, que corresponde ao produto de hidrólise ácida dos ácidos hexenurônicos
presentes na polpa. Para este fim, o monitoramento do eluato da coluna é efetuado
por espectrofotometria no ultravioleta, no comprimento de onda máximo de absorção deste analito (254 nm).
Como a ligação glicosídica que ancora os HexA à hemicelulose residual é de
natureza lábil ao ataque de ácidos minerais, o procedimento cromatográfico depende de uma etapa hidrolítica com ácido sulfúrico diluído cujo rendimento em
ácido 2-furóico é de difícil determinação. Assim, não é possível garantir que 100%
dos HexA existentes nas polpas seja liberado em solução mediante este tratamento.
Apesar disso, o procedimento baseado em hidrólise ácida tem sido amplamente
utilizado para a análise destas estruturas em polpas celulósicas.
|
A determinação do teor de HexA em polpas, no âmbito dos trabalhos de Pedroso (2001), Pedroso e Carvalho (2003), Simão (2007) e Simão et al. (2005a,b), foi
feita com base no método proposto por Chai et al. (2001). Estes autores desenvolveram uma metodologia que permite a determinação do teor de HexA em polpas
através de uma hidrólise com uma solução de cloreto de mercúrio (II) em acetato
de sódio. Os produtos da hidrólise são quantificados através de espectrofotometria
no UV. A hidrólise com cloreto de mercúrio é semelhante à hidrólise com acetato
de mercúrio que está incluída no método KTH; contudo, ao contrário do acetato
de mercúrio, o cloreto de mercúrio tem uma absorvância muito baixa na região do
UV, o que permite a determinação dos HexA por espectrofotometria sem a influência deste reagente. Para corrigir a contribuição da lignina dissolvida na absorvância
medida por este método, os autores utilizaram uma técnica de medição em dois
comprimentos de onda diferentes (260 e 290 nm), tendo encontrado uma razão de
1,2 entre as intensidades de absorção atribuídas à lignina.
No trabalho de Pedroso (2001), a temperatura e o tempo desta reação foram
otimizados, sendo de 70ºC e 70 min para polpas cruas de E. globulus, respectivamente. Por sua vez, no trabalho de Simão (2007), as quantidades foram modificadas em relação à metodologia original de modo a permitir a análise de uma maior
quantidade de polpa por amostra, tendo sido realizados também testes para determinar os tempos de reação mais adequados. A solução aquosa de hidrólise é composta por cloreto de mercúrio (HgCl2) 0,6% em acetato de sódio (CH3COONa)
0,7%, o que mantém a solução neutra (pH 6 a 7). A necessidade de adicionar um
composto tampão é devida ao fato do HgCl2 ser extremamente ácido e degradar os
HexA em compostos furânicos. Por exemplo, para preparar 500 mL de solução, são
necessários 2,99 g de HgCl2 e 3,50 g de CH3COONa. É ainda importante ressaltar
que a solução deve ser guardada em um local escuro, à temperatura ambiente, e que
estará em boas condições enquanto não apresentar qualquer precipitação.
Como procedimento experimental, juntam-se 0,2 g de madeira ou polpa com
40 mL de uma solução de cloreto de mercúrio/acetato de sódio. A mistura é agitada
em agitador Vortex e colocada em banho térmico a 70 ºC com agitação durante 70
min. Após este tempo, as amostras são colocadas em gelo durante 10 min e centrifugadas durante 5 min a uma velocidade de 2700 rpm. Se necessário, procede-se
ainda à filtração do sobrenadante. O sobrenadante é colocado em uma célula de
quartzo com um percurso óptico de 10 mm e a absorvância é lida a 260 nm e a 290
nm. O teor de HexA na polpa é calculado a partir da expressão desenvolvida por
Chai et al. (2001):
CHexA =0,287
൫A260 -1,2A290 ൯·V
W
em que CHexA é o teor de HexA em mmol/kg odp, A260 e A290 são as absorvâncias a
260 e 290 nm, V é o volume da solução de hidrólise em mL, e w é a massa seca em
g da amostra de polpa.
307
308
|
No trabalho de Simão (2007), para cada amostra de polpa foram realizadas no
mínimo três réplicas. A repetibilidade do método foi calculada através de uma análise ANOVA, obtendo-se um valor de 3,08 mmol/kg com um intervalo de confiança
de 95% para uma média de valores de 19,54 mmol/kg. Os teores de HexA podem
ser posteriormente convertidos em percentagem da massa de madeira inicial,
considerada mais adequada para estudos cinéticos, multiplicando-se pela massa
molecular de 176 g/mol e pelo rendimento.
Segundo Chai et al. (2001), as amostras de polpas não necessitam de extração
prévia com solventes, tendo o mesmo sido confirmado por Pedroso (2001). De
fato, Pedroso (2001) obteve 54,8 e 54,5 mmol HexA/kg de polpa, respectivamente,
para uma polpa kraft crua de E. globulus, não extraída e extraída com diclorometano. Pedroso (2001) também estudou a influência da dimensão das partículas de
polpa, tendo obtido resultados de HexA inferiores em polpas moídas em moinho
de facas do tipo Wiley.
4. Conclusão
A caracterização de materiais lignocelulósicos é uma difícil tarefa experimental
cuja solução exige a aplicação de uma diversidade de métodos analíticos de vanguarda. Uma das principais justificativas para este comportamento está relacionada
à íntima associação que existe entre os seus componentes majoritários, celulose,
hemiceluloses e lignina. Cada um destes componentes tem características químicas
próprias e nenhum método é capaz de caracterizá-los simultaneamente sem gerar
alguma ambigüidade, perdas de processo ou erros experimentais. Por esta razão, o
grande desafio que acompanha estes procedimentos é o fechamento de um balanço de massas aceitável, isento de respostas ambíguas e de artefatos experimentais.
Este capítulo teve como objetivos revisar as bases da química de materiais lignocelulósicos e abordar alguns dos principais métodos instrumentais que vêm sendo
empregados para sua caracterização. Detalhes sobre outros métodos analíticos não
abordados neste ensaio poderão ser obtidos em artigos científicos ou revisões bibliográficas amplamente disponíveis na literatura especializada.
Bibliografia
1. Adler, E. (1977). Lignin chemistry: past, present and future, Wood Sci. Technol., 11, 169.
2. Atalla, R. V.; Ellis, J. D.; Schroeder, L. R. (1984). Some effects of elevated temperatures on the structure of cellulose and its transformation. J. Wood Chem.
Technol., 4, 465-482.
3. Baker, A. D.; Engel, R. (1992). Carbohydrates. In: Organic chemistry, West, St.
Paul, USA. pp. 932-972.
4. Barnett, C.; Loferski, K.; Wartman, C. (1982). Experimental procedures
routinely applied in the wood chemistry laboratory. Department of Forest
Products, University of Madison, Madison, USA.
|
5. Blakeneny, A. B.; Harris, P. J.; Henry, R. J.; Stone, B. A. (1993). A simple and
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr.
Res., 113, 291-299.
Blumenkrantz, N.; Asboe-Hansen, G. (1973), “New Method for Quantitative
Determination of Uronic Acids”. Anal. Biochem., 54, 484.
Buchert, J.; Teleman, A.; Harjunpää, V.; Tenkanen, M.; Viikari, L.; Vuorinen,
T. (1995), “Effect of Cooking and Bleaching on the Structure of Xylan in Conventional Pine Kraft Pulp” Tappi J., 78 (11), 125.
Butterfield, B. G.; Meylan, B. A. (1980). Three-dimensional structure of wood
- na ultrastructural approach. Chapman & Hall, New York, pp. 56-90.
Carioca, J. O. B.; Arora, H. L. Biomassa, fundamentos e aplicações tecnológicas, São Paulo: Ed. UFC, 1984. 180 p.
Carvalho, M. G. V. S. (1999). Efeito das variáveis de cozimento nas características químicas de pastas kraft de Eucalyptus globulus. Tese de Doutoramento,
Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal.
Chai, X.-S.; Zhu, J. Y.; Li, J. (2001). “A Simple and Rapid Method to Determine
Hexeneuronic Acid Groups in Chemical Pulps”. J. Pulp Paper Sci., 27 (5), 165.
Cramer, A. B.; Hunter, R. D.; Hibbert, H. (1939). Contribution to characterisation of analytical and technical lignins. (2) Physical-chemical and electron
microscopical studies. J. Am. Chem. Soc., 61, 509.
D’Almeida, M. L. O. Composição química dos materiais lignocelulósicos. In: I
- Celulose e Papel: tecnologia de fabricação da pasta celulósica. 1 ed. São Paulo:
Instituto de Pesquisas do Estado de São Paulo, 1978, v.1.
Dence, C. W.; Reeve, D. W. Pulping Bleaching: Principles and Pratice. Atlanta:
Tappi. 1996.
Evans, R.; Newman, R. H.; Roick, U. C.; Suckling I. D.; Wallis, A. F. A. (1995).
Changes in cellulose crystallinity during kraft pulping, Comparison of infrared,
X-ray diffraction and solid state NMR results. Holzforschung, 49, 498-504.
Fan, L. T., Gharpuray, M. M.; Lee, Y.-H. (1987). Cellulose hydrolysis, Springer-Verlag, New York.
Fengel, D.; Wegener, G. (1989). Wood-Chemistry, Ultrastruture and Reactions, Walter de Gruyter, Berlin, New York.
Freudenberg, K.; Neish, A. C. Constitution and biosynthesis of lignin. Berlin,
Heidelberg: Springer, 1986. 298p.
Gellerstedt, G.; Li, J. (1996). “An HPLC method for the quantitative determination of hexeneuronic acid groups in chemical pulps”. Carbohydr. Res., 294,
41-51.
Gomide, J. L.; Demuner, B. J. (1986). Determinação do teor de lignina em
material lenhoso: método Klason modificado. O Papel, 47, 36-38.
Holmbom, B. (1999a) Chap. 5 Extractives. In Analytical Methods in Wood
Chemistry, Pulping and Papermaking. Eero Sjöstrom and Raimo Alén (Eds.).
p.126.
309
310
|
22. Holmbom, B. (1999b) Extractives. In: “Analytical Methods in Wood Chemis-
try, Pulping and Papermaking”, Eero Sjöstrom and Raimo Alén (Eds.). p.142.
23. Jiang, Z.-H.; Audet, A.; Sullivan, J.; Van Lierop, B.; Berry, R. (2001) A New
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
Method for Quantifying Hexenuronic Acid Groups in Chemical Pulps. J. Pulp
Paper Sci., 27 (3), 92.
Johansson, M. H.; Samuelson, O. (1977). Epimerization and Degradation of
2-O-(4-O-methyl-α-D-glucopyranosyluronic acid)-D-xylitol in Alkaline Medium Carbohyd. Res., 54, 295.
Kuhad, R. C.; Singh, A. (1993). Lignocellulose biotechnology: current and
future prospects. Critical Reviews in Biotechnology, 13, 151-172.
Mesquita, A. L. S. (1990) A indústria de celulose e papel. O Papel, 51, 65.
Morais, S. A. L. Contribuição ao estudo químico e espectroscópico da lignina
de madeira moída do Eucalyptus grandis: isolamento, quantificação e análise
estrutural. Belo Horizonte: UFMG, 1992. 260p. Tese (Doutorado em Ciências)
- Universidade Federal de Minas Gerais, 1992.
Nevell, T. P.; Zeronian, S. H. Cellulose Chemistry and its Applications, Ellis
Horwood Limited, New York, 1995.
Newman, R. H.; Hemmingson, J. A. (1994). Carbon-13 NMR distinction
between categories of molecular order and disorder in cellulose. Cellulose, 2,
95-110.
Ooshima, H.; Burns, D. S.; Converse, A. O. (1990). Adsorption of cellulase
from Trichoderma reseei on cellulose and lignacious residue in wood pretreated
by dilute sulfuric acid with explosive decompression. Biotechnol. Bioeng., 36,
446-452.
Örsa, F.; Holmbom, B. J. (1994) Pulp Paper Sci 20(12):J361.
Pedroso, A. I. (2001). “Influência das condições de cozimento no teor de ácidos
hexenurónicos em pastas kraft de Eucalyptus globulus”, trabalho de seminário,
Dep. Engª Química, Coimbra.
Pedroso, A. I.; Carvalho, M. G. (2003), “Alkaline pulping of Portuguese
Eucalyptus globulus: Effect on Hexenuronic Acid Content”, Journal of Pulp and
Paper Science, 29(5), 150-154.
Preston, R. D. (1986) Natural celluloses. In: Cellulose-Structure, Modification
and Hydrolysis, R. A. Young and R. M. Rowell (eds.), John Wiley, New York,
USA, 3-28.
Puls, J. (1993) Substrate analysis of forest and agricultural wastes. In: Bioconversion of Forest and Agricultural Plant Residues, J. N. Saddler (ed.), CAB
International, Wallingford, UK. 349 p.
Puri, V. P. (1984). Effect of crystallinity and degree of polymerization of cellulose on enzymatic saccharification. Biotechnol. Bioeng., 26, 1219-1222.
Ramos, L. P. (1992). Steam pretreatment and enzymatic hydrolysis of Eucalyptus viminalis chips. Tese apresentada e defendida junto a Coordenação de Pós-
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
|
graduação da Universidade de Ottawa para a obtenção do grau de Doutor em
Filosofia (Ph.D.).
Ramos, L. P.; Saddler, J. N. (1994b) Bioconversion of wood residues: Mechanisms involved in pretreating and hydrolyzing lignocellulosic materials.
In: Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E.,
Baker, J. D. and Overend, R. P., eds., American Chemical Society/ACS Symposium Series 566, Washington, pp. 325-341.
Ramos, L. P. Determination of cellulose degree of polimerization using gel permeation chromatography and universal calibration. In: 7TH Brazilian Symposium On The Chemistry Of Lignins And Other Components. Belo Horizonte,
2001. Anais... Viçosa: Universidade Federal de Viçosa. p. 17-24.
Ramos, L. P.; Breuil, C.; Saddler, J. N. (1993a) The use of enzyme recycle and
the influence of sugar accumulation on cellulose hydrolysis by Trichoderma
cellulases. Enzyme Microb. Technol., 15, 19-25.
Ramos, L. P.; Mathias, A. L.; Cotrim, A. R.; Silva, F. T.; Chen, C.-L. (1999a)
The role of alkali-insoluble lignin on the enzymatic hydrolysis of steam-exploded wood residues. J. Agric. Food Chem., 47, 2295-2302.
Ramos, L. P.; Nazhad, M. M.; Saddler, J. N. (1993b) Influence of enzymatic
hydrolysis on the morphology and fine structure of pretreated cellulosic residues. Enzyme Microb. Technol., 15, 821-831.
Ramos, L. P.; Zandoná Filho, A.; Deschamps, F. C.; Saddler, J. N. (1999b) The
effect of Trichoderma cellulases on the fine structure of a bleached softwood
kraft pulp. Enzyme Microb. Technol., 24, 371-380.
Roelofsen, P. A. (1959). The plant cell wall, Borntraeger, Berlin.
Sarko, A. (1986) Recent X-ray crystallographic studies of celluloses. In: Cellulose - Structure,Modification and Hydrolysis, R. A. Young and R. M. Rowell
(eds.), John Wiley, New York, USA, 29-50.
Segal, L.; Creely J. J.; Martin A. E.; Conrad C. M. (1959). An empirical method
for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-ray diffractometer. Text.Res. J., 29, 786-793.
Silva, F. T. (1995) Obtenção de insumos químicos a partir do aproveitamento
integral do bagaço de cana. Tese de Doutoramento, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo.
Simão, J. P. F.; Egas, A. P. V.; Baptista, C. M. S. G.; Carvalho, M. G.; Castro, J.
A. A. M. (2005a) “Evolution of Methylglucuronic and Hexenuronic Acid Contents of Eucalyptus globulus pulp during Kraft delignification” Ind Eng Chem
Res, 44(9), 2990-2996.
Simão, J. P. F.; Egas, A. P. V.; Baptista, C. M. S. G.; Carvalho, M. G. 2005b,
“Heterogeneous Kinetic Model for the Methylglucuronic and Hexenuronic
Acids Reactions During Kraft Pulping of Eucalyptus globulus” Ind Eng Chem
Res, 44(9):2997-3002.
311
50. Simão, J. P. F. (2007). “Cinética das Etapas do Cozimento Kraft” tese de douto-
ramento, em preparação, Universidade de Coimbra.
51. Singh, A.; Kumar, P. K. R.; Schugerl, K. (1991). Adsorption of cellulases during
saccharification of cellulosic residues. J. Biotechnol., 18, 205-221.
52. Sinitsyn, A. P.; Gusakov, A.V.; Vlasenko, E. Y. (1991). Effect of structural and
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
physico-chemical features of cellulosic substrates on the efficiency of enzymatic hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol., 30, 43-59.
Sitholé, B. B., Vollstaedt, P., Allen, L. H. (1991). Comparison of soxtec and
soxlet systems for determining extractives content. Tappi J. 74 (11), 187-191.
Sjöström, E. (1989) “The Origin of Charge in Cellulosic Fibers”, Nordic Pulp
Pap. Res, 2, 90-93.
Sjöström, E., Wood chemistry, fundamentals and applications. 2. ed. California: Academic Press, 1993. 215p.
Solomons, T. W. G. (1996). Carbohydrates. In: Organic chemistry, 6a. ed.,
John Wiley, New York, USA. pp. 1046-1087.
Teleman, A.; Hausalo, T.; Tenkanen, M.; Vuorinen, T. (1996). “Identification
of the acidic degradation products of hexenuronic acid and characterisation
of hexenuronic acid-substituted xylooligosaccharides by NMR spectroscopy”
Carbohydr. Res., 280, 197-208.
Tenkanen, M.; Gellerstedt, G.; Vuorinen, T.; Teleman, A.; Perttula, M.; Li, J.;
Buchert, J. (1999), “Determination of Hexenuronic Acid in Softwood Kraft
Pulps by Three Different Methods”. J. Pulp Paper Sci., 25 (9), 306.
Tenkanen, M.; Hausalo, T.; Siikaho, M.; Buchert, J.; Viikari, L. (1995). “Use
of Enzymes in Combination with Anion Exchange Chromatography in the
Analysis of Carbohydrate Composition of Kraft Pulps”. Proc. 8th Intl. Symp.
Wood Pulping Chem., Helsinki, III, 189-184.
Valtasaari, L.; Saarela, K. (1975). Determination of chain length distribution of
cellulose by gel permeation chromatography using the tricarbanilate derivative. Paperi ja Puu, 57, 5-10.
Vuorinen, T.; Fagerström, P.; Buchert, J.; Tenkanen, M.; Teleman, A. (1999).
“Selective Hydrolysis of Hexenuronic Acid Groups and its Application in ECF
and TCF Bleaching of Kraft Pulps”. J. Pulp Paper Sci., 25 (5), 155-162
Wallis, A. F. A.; Wearne, R. H. (1997). Characterization of resin in radiata pine
woods, bisulfite pulps and mill pitch samples. Appita J. 50(5), 409-414.
Wood, B. F.; Conner, A. H.; Hill, C. G. Jr. (1986) The effect of precipitation on
the molecular weight distribution of cellulose tricarbanilate. J. Appl. Polym.
Sci., 32, 3703-3712.
Young, R. A. (1986). Structure, swelling and bonding of cellulose fibers. In: Cellulose-Structure, Modification and Hydrolysis, R. A. Young and R. M. Rowell
(eds.), John Wiley, New York, USA. 91-12.

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