AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE - EAIC

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE POLISSACARÍDEO E FRAÇÕES
OBTIDAS DE Agaricus brasiliensis NA REPLICAÇÃO DO HERPESVÍRUS
BOVINO
Ana Letícia Scaldelai Bernardi (PIBIC/CNPq – UEL), Kristie Aimi Yamamoto
(PIBIC/CNPq – UEL), Rosa Elisa Carvalho Linhares (Orientador), e-mail:
[email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas
Palavras-chave: Agaricus brasiliensis, atividade antiviral, herpesvírus bovino
Resumo:
O Agaricus brasiliensis, popularmente conhecido como Cogumelo do Sol, é um
basidiomiceto natural do sudeste do Brasil, amplamente consumido na forma de chá,
devido às suas propriedades nutricionais e farmacológicas. Neste estudo, nós
avaliamos a citotoxicidade do polissacarídeo (PLS) e frações 1 e 2 (F1 e F2)
extraídos do corpo de frutificação de A. brasiliensis, em células HEp-2, bem como
suas atividades antivirais para o herpesvírus bovino tipo 1 (HBoV-1). O PLS, F1 e F2
apresentaram concentrações citotóxicas 50% acima de 1000 µg/ml, pelo método do
dimetilthiazol difenil brometo de tetrazólio (MTT). A atividade antiviral foi monitorada
pelo ensaio de redução de plaque e os compostos foram adicionados nas várias
concentrações, antes (-2 e -1h), durante (0h) e após (1 e 2h) a infecção viral. Os
resultados mostraram que, quando o PLS, F1 e F2 foram adicionados às células no
momento (tempo 0h) e após (1 e 2h) a infecção, ocorreu uma redução no número de
plaques, dependente de concentração, de até 100% para as três substâncias e com
índices de seletividade superiores a 4.
Introdução
O Agaricus brasiliensis (A. brasiliensis), conhecido popularmente como Cogumelo do
Sol, é um basideomiceto originado do Brasil, natural do interior de São Paulo, mais
precisamente do município de Piedade (BRAGA; EIRA; CELSO, 1998). O
basidiocarpo de A. brasiliensis apresenta 40-45% de proteínas, 38-45% de
carboidratos, 6-8% de fibras, 5-7% de minerais, 3-4% de gorduras (ácidos graxos)
valores baseados em relação à matéria seca. Contém ainda as vitaminas B1, B2 e
niacina e teores elevados de potássio e cálcio (MIZUNO et al., 1990).Os efeitos
terapêuticos têm sido atribuídos aos polissacarídeos com ligação β-1,3 glucana ou a
um complexo β-1,3 glucana-proteína, entretanto a sua composição química e
propriedades medicinais não estão completamente elucidadas (MACHADO et al.,
2005).
O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) é um importante patógeno, responsável
por infecções no trato respiratório superior e no trato genital, causando graves
perdas econômicas para a bovinocultura (TIKOO et al., 1995). Pertence à família
Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ARMSTRONG
et al., 1961). Apresenta simetria icosaédrica, envelope lipídico, genoma constituído
de DNA de fita dupla, a partícula íntegra mede de 150-200 nm de diâmetro. A sua
replicação ocorre no núcleo da célula infectada (ROIZMAN; KNIPE, 2001).
Dessa forma, o presente estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a
citotoxicidade do polissacarídeo (PLS) isolado do corpo de frutificação do A.
brasiliensis e das frações (F1 e F2) obtidas a partir desse polissacarídeo, em células
HEp-2, bem como avaliar a atividade antiviral, monitorado pelo ensaio de plaque.
Materiais e Métodos
Substâncias
O polissacarídeo e as frações F1 e F2, obtidas a partir do complexo polissacarídeoproteína, isolado do corpo de frutificação do A. brasiliensis, foram fornecidas pelo
Laboratório de Polímeros do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da
Universidade Federal do Ceará/Fortaleza-Ce, Brasil.
Células
As culturas de células HEp-2 (carcinoma de laringe humana-ATCC-CCI-23) foram
cultivadas em Meio Mínimo Essencial modificado por Dulbecco (DMEM), acrescido
de 10% de soro fetal bovino (SFB) (Gibco BRL), 100 µg/mL de estreptomicina
(Sigma, Chem. Co.), 100 UI/mL de penicilina (Sigma, Chem. Co.) e 2,5 µg/mL de
fungizona (Bristol Meyers-Squibb).
Vírus
O HBoV-1, cedido pelo Departamento de Medicina Veterinária e Preventiva-UEL, foi
cultivado em células HEp-2, titulado por ensaio de plaque e estocado a -20°C até o
momento de uso.
Teste de Citotoxicidade
As células HEp-2, cultivadas em microplacas de 96 escavações foram submetidas
ao tratamento com concentrações variadas das substâncias testes: 62,5 a 1000
µg/mL (6 poços por concentração da droga), a 37°C em ambiente com tensão de 5%
de CO2. As células foram observadas diariamente, por cinco dias, para a detecção
de alterações morfológicas. Além disso, foi feita a avaliação da viabilidade celular
pelo método do dimetilthiazol difenil brometo de tetrazólio (in vitro toxicology assay
kit MTT based, Stock No. TOX-1, Sigma Chem. Co.). A leitura da absorbância foi
feita em 490 e 630 nm.
A concentração citotóxica de 50% (CC50) foi determinada como a
concentração capaz de reduzir 50% da densidade óptica em comparação ao
controle. O CC50 foi calculado por análise de regressão linear da curva doseresposta.
Ensaio de Redução de Plaque
A atividade antiviral por ensaio de redução de plaque foi efetuada de acordo com
Melo et al. (2008). Células HEp-2 foram cultivadas em placas de cultura de células
com 24 escavações a 37° C, com tensão de 5% de CO2. Após confluência completa,
as células foram infectadas e tratadas com as frações e o PLS. Paralelamente foram
feitos os controles de célula e de vírus. A porcentagem de inibição viral (%IV) foi
determinada pela fórmula: %IV = [1-(Número de plaques no teste / Número de
plaques no controle)] x 100.
A concentração inibitória 50% (IC50) foi determinada como a concentração capaz de
reduzir em 50% o número de unidades formadoras de plaques (PFU) em relação ao
controle. A IC50 foi determinada por análise de regressão linear da curva de inibição
viral para cada tratamento.
Atividade antiviral
Três protocolos de tratamento foram utilizados para avaliar a ação das frações e do
PLS na replicação viral, por meio do ensaio de redução de plaque, utilizando-se as
concentrações de 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL e 400 µg/mL.
1. Tempo de adição das substâncias
A avaliação do tempo de adição das frações e PLS na replicação viral foi executada
de acordo com o método descrito por Yang et al. (2005), com algumas modificações.
Células foram tratadas com as substâncias antes (-1h; -2h) durante (0h) e após a
infecção viral (1h; 2h).
2. Inibição da adsorção
A inibição da adsorção viral foi feita de acordo com Zhu et al. (2004).
Resumidamente, as células foram infectadas com o HBoV-1 na presença das
substâncias e incubadas a 4° C por uma hora. Em seguida, o ensaio de plaque foi
executado.
3. Atividade virucida
Para avaliar o efeito direto sobre a partícula viral, o vírus foi deixado em contato
com as substâncias, V/V, por uma hora em banho-maria a 37° C e, em seguida,
inoculado. Após uma hora de incubação a 37° C e sob tensão de 5% de CO2 para
adsorção viral, foi realizado o ensaio de plaque.
Índice de Seletividade
O índice de seletividade (IS) foi calculado como a razão da concentração citotóxica
de 50% (CC50) pela concentração inibitória de 50% da replicação viral (IC50).
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com o programa SigmaStat. Os dados foram
analisados pelo teste ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Valores para P ≤ 0,05
foram considerados significativos. A CC50 e IC50 foram calculadas por análise de
regressão linear. Todos os testes de atividade antiviral foram realizados em
quadruplicata.
Resultados e Discussão
O teste de citotoxicidade demonstrou que o PLS e a F1 não apresentaram toxicidade
para as células HEp-2 até a concentração 500 µg/mL. A F2 não demonstrou
toxicidade até a concentração de 1000 µg/mL. Desse modo, foram selecionados
para os testes de atividade antiviral as concentrações de 50, 100, 200 e 400 µg/mL.
A concentração citotóxica 50%(CC50) obtida pelo teste da viabilidade celular
baseado no MTT resultou em valores para PLS, F1 e F2 maiores que 1000 µg/mL.
As três substâncias apresentaram índices de seletividade maiores que 4.
Neste trabalho, foi testada a atividade antiviral do polissacarídeo e de suas
frações obtidas de Agaricus brasiliensis contra o herpesvírus bovino tipo 1. Essas
substâncias mostraram atividade semelhante, dependente da concentração e do
tempo de adição. Quando as substâncias foram adicionadas nos tempos -1 e -2h de
infecção a replicação do HBoV-1 não foi inibida de forma significativa, não houve
também inibição da adsorção viral (não mostrado) sugerindo uma não interferência
na ligação específica do vírus ao receptor celular. A falta da atividade virucida de
todas as substâncias (não mostrado) sugere a ausência de um efeito direto na
partícula viral.
Nos tratamentos 0, 1 e 2h pós-infecção, houve até 100% de inibição da
replicação viral para as maiores concentrações testadas das três substâncias,
sugerindo que as substâncias atuam nos processos iniciais de replicação do HBoV1, após estágio de penetração. As pesquisas de Faccin et al. (2007) demonstraram
que o polissacarídeo isolado de A. brasiliensis foi mais efetivo quando adicionado ao
tempo 0h de infecção contra o poliovírus tipo 1, corroborando com este estudo.
Conclusões
Esses resultados podem contribuir para o desenvolvimento de uma droga antiviral, a
partir de substâncias isoladas do A. brasiliensis, uma vez que as substâncias
testadas apresentaram baixa toxicidade, demonstrada pelos índices de seletividades
obtidos. Porém, estudos mais detalhados são necessários para determinar o
mecanismo de ação destas substâncias.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de
iniciação científica à Ana Letícia Scaldelai Bernardi e Kristie Aimi Yamamoto.
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