- Mestrado em Horticultura Irrigada

UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA – UNEB
PRO-REITORIA DE PESQUISA E ENSINO DA PÓR-GRADUAÇÃO – PPG
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS SOCIAIS - DTCS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HORTICULTURA IRRIGADA - PPHI
DESEMPENHO SIMBIÓTICO DE RIZÓBIOS NATIVOS DO
SEMIÁRIDO PERNAMBUCANO EM DUAS CULTIVARES
DE FEIJÃO-CAUPI
JUAZEIRO-BA
2011
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
Pró-reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-graduação (PPG)
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)
Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada – Mestrado (PPHI)
MARCIONILA GONÇALVES MALHEIRO
Desempenho simbiótico de rizóbios nativos do semiárido
pernambucano em duas cultivares de feijão-caupi
JUAZEIRO - BA
2011
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
M249d
Malheiro, Marcionila Gonçalves
Desempenho sim biótico de rizóbios nativos do semiárido brasileiro em duas
cultivares de feijão-caupi / Marcionila Gonçalves Malheiro – Juazeiro, 2011.
ix, 109 f.: Il.; 30 cm
Dissertação (Mestrado em Horticultura Irrigada) – Universidade do Estado da
Bahia-UNEB, Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais-DTCS.
Orientador: Profa . Dra. Lindete Míria Vieira Martins
Bibliográfica.
1. Feijão-caupi (Vigna unguiculata (L) Walp. 2. Fixação Biológica de
Nitrogênio. 3. Biodiversidade. 4. Eficiência Simbiótica
CDD: 635.652
iii
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
Pró-reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-graduação (PPG)
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)
Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada - Mestrado (PPHI)
MARCIONILA GONÇALVES MALHEIRO
Desempenho simbiótico de rizóbios nativos do semiárido
pernambucano em duas cultivares de feijão-caupi
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Horticultura Irrigada da Universidade
do Estado da Bahia (PPHI/UNEB/DTCS), como parte
do requisito para a obtenção do título de Mestre em
Agronomia. Área de Concentração: Horticultura
Irrigada
Orientadora: Prof. Dra. Lindete Míria Vieira Martins
JUAZEIRO – BA
2011
iv
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
MARCIONILA GONÇALVES MALHEIRO
Desempenho simbiótico de rizóbios nativos do semiárido
pernambucano em duas cultivares de feijão-caupi
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Horticultura Irrigada da Universidade
do Estado da Bahia (PPHI/UNEB/DTCS), como parte
do requisito para a obtenção do título de Mestre em
Agronomia. Área de Concentração: Horticultura
Irrigada.
Aprovada em: ___/ ___/______
Comissão Examinadora
__________________________________________
Profa. Dra. Lindete Míria Vieira Martins
Universidade do Estado da Bahia (DTCS / UNEB)
___________________________________________
Dr. Luiz Balbino Morgado
Embrapa Semiárido (CPATSA)
__________________________________________
Profa. Dra. Carolina Etienne Rosália e Silva Santos
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRP)
v
DEDICATÓRIA
Dedico a Deus, a minha mãe Maria das
Dores, minha irmã Morgana, meu sobrinho
Arthur por terem sempre acreditado nos
meus objetivos.
Ao amor da minha vida, eterno companheiro
e marido Daniel por incentivar e acreditar no
meu potencial.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior
para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e me
suprir em todas as minhas necessidades.
A Universidade do Estado da Bahia, a Pró-reitoria de Pesquisa de Pósgraduação, ao Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais e ao Programa
de
Pós-Graduação
em
Horticultura
Irrigada,
pela
oportunidade
de
aprimoramento.
Ao Edital RENORBIO pelo auxilio e desenvolvimento dos trabalhos no
âmbito de conhecimentos em microbiologia.
A Capes, pelo financiamento e concessão de bolsa para conclusão dos
trabalhos.
A minha orientadora por acreditar em mim e me mostrar o caminho da
pesquisa, cuja qualidade profissional e humana será eternamente fonte de
inspiração.
Aos meus colegas de trabalho, do Lamisa que participaram diretamente
e indiretamente desse trabalho e foram meu auxilio fundamental em vários
momentos.
A todos os funcionários, professores e alunos que fazem parte dos
laboratórios, administração e mestrado, que acreditam no desenvolvimento
pelo conhecimento e aprendizagem.
A Embrapa Semiárido / CPATSA pelo espaço físico, auxiliares técnicos e
apoio no desenvolvimento dos experimentos em casa de vegetação e
laboratórios (Microbiologia do solo e Nutrição animal).
vii
SUMÁRIO
RESUMO GERAL.................................................................................................
1
GENERAL ABSTRAT..........................................................................................
2
1. INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................
3
2. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................
2.1 Feijão-caupi: Origem e Classificação............................................................
2.2 Cultivares de Feijão-caupi: Variedades.........................................................
2.3 O microssimbionte Rizóbio e sua Diversidade no Semiárido........................
2.4 Simbiose Rizobio e Feijão-caupi...................................................................
2.5 Influência de Fatores Abióticos na FBN........................................................
2.6 Eficiência Simbiótica em feijão-caupi...........................................................
2.7 Novo foco de Importância Comercial............................................................
5
5
7
10
11
13
16
17
3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................................................
19
4. OBJETIVO GERAL..........................................................................................
26
Capitulo I
CARACTERIZAÇÃO
MORFO-FISIOLOGICA
DE
BACTERIAS
INOCULADAS DE NODULOS DE FEIJÃO-CAUPI.......................................
RESUMO................................................................................................................
ABSTRAT...............................................................................................................
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................
2. MATERIAL E METODOS.................................................................................
3. RESULTADO E DISCUSSÃO...........................................................................
4. CONCLUSÕES...................................................................................................
5. REFERENCIAS...................................................................................................
27
28
29
30
31
39
54
55
Capitulo II
EFICIENCIA SIMBIOTICA DE ISOLADOS DE RIZOBIO EM DUAS
CULTIVARES DE FEIJÃO-CAUPI...................................................................
RESUMO................................................................................................................
ABSTRAT...............................................................................................................
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................
2. MATERIAL E METODOS.................................................................................
3. RESULTADO E DISCUSSÃO...........................................................................
4. CONCLUSÕES...................................................................................................
5. REFERENCIAS...................................................................................................
60
61
62
63
66
75
88
89
ANEXOS.................................................................................................................. 94
viii
LISTA DE TABELAS
Capitulo I
Tabela 1: Descrição das áreas de coleta dos solos, com histórico de
manejo distinto.......................................................................................... 32
Tabela 2: Características físicas e químicas das amostras de solo das
áreas coletadas para estudo de diversidade............................................ 32
Tabela 3: Número de nódulos, nitrogênio total acumulado na parte
aérea e raízes das plantas de feijão-caupi............................................... 40
Tabela 4: Caracterização dos grupos formados com similaridade
superior a 80%.......................................................................................... 43
Tabela 5: Índices de diversidade dos solos e das cultivares....................
46
Tabela 6:Relação de características de tempo de crescimento em
relação a índices de tolerância a temperatura, salinidade e
solubilização de fosfatos........................................................................... 52
Capitulo II
Tabela 1: Solução nutritiva para crescimento de plantas.........................
68
Tabela 2: Características morfológicas e fisiológicas das 50 bactérias
classificadas para teste de eficiência simbiótica....................................... 79
Tabela 3: Relação do numero (NN) e massa seca de nódulos (MSN),
massa seca da parte aérea (MSPA), nitrogênio acumulado na parte
aérea (NAPA) e eficiência nodular (EN) na fixação de nitrogênio
atmosférico por isolados de crescimento rápido e intermediário,
bactérias recomendadas (BRS 3262, 3301, 3302), testemunha
nitrogenada (TN) e testemunha absoluta (TA) em duas cultivares de
feijão-caupi................................................................................................ 82
Tabela 4: Relação do numero (NN) e massa seca de nódulos (MSN),
massa seca da parte aérea (MSPA), nitrogênio acumulado na parte
aérea (NAPA) e eficiência nodular (EN) na fixação de nitrogênio
atmosférico por isolados de crescimento lento, bactérias
recomendadas (BRS 3262, 3301, 3302), testemunha nitrogenada (TN)
e testemunha absoluta (TA) em duas cultivares de feijãocaupi................................................................................................
84
ix
LISTA DE FIGURAS
Capitulo I
Figura 1: Número de nódulos por planta de feijão-caupi, relação
numero de nódulos por tratamento........................................................... 41
Figura 2: Dendograma dos 32 grupos morfológicos de isolados nativos
42
Figura 3: Freqüência de isolados bacterianos em relação ao tempo de
crescimento, produção de muco e alteração de pH em meio de
cultura....................................................................................................... 45
Figura 4: Formação dos halos de solubilização de fosfato de
cálcio......................................................................................................... 50
Figura 5: Freqüência dos isolados in vitro a solubilização de fosfato de
cálcio, tolerância a diferentes faixas de temperatura e níveis crescentes
de NaCl..................................................................................................... 51
Capitulo II
Figura 1: Experimento para autenticação de isolados bacterianos em
feijão-caupi................................................................................................ 66
Figura 2: Vasos de Leonard modificados.................................................
70
Figura 3: (A) Vasos com germinação das sementes; (B) inoculação dos
isolados bacterianos e (C) adição de substrato estéril ao local de
inoculação................................................................................................. 71
Figura 4: Aspecto geral de desenvolvimento de plantas de feijão-caupi.
72
Figura 5: Confirmação de renodulação de isolados em feijão-caupi........
76
Figura 6: Demonstrativo de coloração da parte aérea de plantas de
feijão-caupi................................................................................................ 77
Figura 7: Desenvolvimento das plantas de feijão-caupi em experimento
de eficiência.............................................................................................. 78
Figura 8: Freqüência de isolados de rizóbio em relação à eficiência
nodular em dois cultivares de feijão-caupi................................................ 85
Figura 9: Dispersão dos isolados bacterianos em relação à eficiência
relativa nas duas cultivares de feijão-caupi.............................................. 86
Figura 10: Dispersão dos isolados bacterianos em relação à eficácia
nas duas cultivares de feijão-caupi........................................................... 87
x
RESUMO GERAL
As regiões Áridas e Semiáridas do Brasil são caracterizadas por fatores
edafoclimáticos limitantes ao desenvolvimento de diversas espécies vegetais,
afetando a produtividade da maioria das espécies cultivadas, por outro lado os
grupos de microrganismos simbiontes se manifestam nessas condições
apresentando tolerância e desenvolvendo mecanismos de defesa. O feijãocaupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma leguminosa que possui capacidade
de se desenvolver satisfatoriamente nessas condições quando em associação
com bactérias do grupo rizóbio, beneficiando o desenvolvimento vegetal pela
Fixação Biológica de Nitrogênio. O presente trabalho teve como objetivo
conhecer a diversidade e avaliar o desempenho simbiótico de rizóbios nativos
de solos do semiárido Brasileiro em duas cultivares de feijão-caupi. 370
bactérias foram isoladas e suas características morfo-fisiológicas conhecidas.
Deste total, somente 238 renodularam a cultura. Um novo experimento foi
realizado com duas cultivares do feijão-caupi (BRS Pujante e Canapu) e 50
isolados, agora confirmados como rizóbios pelo teste de autenticação. Os
resultados indicam a BRS Pujante como mais promissora para estudos de
fixação biológica de nitrogênio mostrando eficiência de treze isolados superior
aos apresentados pelas três estirpes de rizóbio padrões, recomendadas
atualmente para inoculação do feijão-caupi.
Palavras chave: Fixação Biológica de Nitrogênio, Biodiversidade, Eficiência
simbiótica
1
GENERAL ABSTRACT
The arid and semiarid regions of Brazil are characterized by edaphoclimatic
factors limiting the development of different plant species, affecting the
productivity of most crop species, on the other groups of microbial symbionts in
these conditions manifest showing tolerance and developing defense
mechanisms. The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume that has
the capacity to develop satisfactorily in these conditions when associated with
Rhizobium bacteria in the group, benefiting crop development for Biological
Nitrogen Fixation. This study aimed to assess the diversity and evaluate the
symbiotic performance of rhizobia in Brazilian semiarid soils of two cultivars of
cowpea. 370 bacteria were isolated and their morphological and physiological
traits known. Of this total, only 238 renodularam culture. A new experiment was
conducted with two cultivars of cowpea (BRS Pujante and Canapu) and 50
isolates, as now confirmed by rhizobia authentication test. The results indicate
the BRS Pujante as most promising for studies of biological nitrogen fixation
efficiency of thirteen isolates showing more than those presented by the three
strains of Rhizobium standards currently recommended for inoculation of
cowpea.
Index terms: Biological Nitrogen Fixation, Biodiversity, Symbiotic efficiency
2
1. INTRODUÇÃO
No século XIX onde se iniciou os estudos de fixação biológica de
nitrogênio (FBN) ate os dias atuais à simbiose entre leguminosas e bactérias
fixadoras de Nitrogênio atmosférico é amplamente aceita como alternativa à
fertilização química.
Bactérias do grupo Rizóbios têm sido especialmente exploradas por ter
capacidade de formar nódulos em raízes e caule de leguminosas, possuindo
um importante papel na agricultura sustentável, devido à carência de nitrogênio
em algumas áreas produtoras em todo o mundo, especialmente em regiões de
clima tropical (LIU et al., 2005).
Apesar da inoculação com rizóbios representar uma alternativa viável, o
potencial econômico ainda não foi totalmente estabelecido devido a problemas
de sensibilidade das estirpes, das sementes e aos fatores de estresse biótico e
abiótico.
No caso da FBN em caupi, embora não se tenha uma real contribuição
para a economia nacional, sabe-se que é muito importante para a produção do
feijão-caupi em áreas se subsistência no Nordeste e Norte do país, onde o grau
de tecnificação para a produção por parte dos agricultores de subsistência é
bastante baixo, não explorando todo o potencial produtivo e agrícola dessa
cultura, que se destaca como cultura bem adaptada e de importância sócioeconômica para os pequenos e médios produtores das regiões semiáridas do
Brasil (RUMJANEK, et al., 2005).
Assim a adoção de tecnologias sustentáveis que permitam a
conservação dos recursos naturais e promovam uma melhoria na qualidade de
vida da população de baixa renda constitui um importante componente na
reversão desse quadro.
No Brasil, o melhor exemplo de utilização deste processo de
beneficiamento e incremento agrícola em culturas de grãos é com a soja, onde
a adubação química nitrogenada foi totalmente substituída pela utilização de
inoculantes contendo bactérias do gênero Bradyrhizobium (SILVA et al, 2006).
Atualmente a utilização dessa tecnologia representa uma economia para
o país que pode chegar a cerca de U$$ 10 bilhões de dólares em fertilizantes
nitrogenados (REIS JUNIOR et al, 2005) e a simbiose feijão-caupi e bactérias
3
do grupo rizobio é capaz de fornecer de 35 a 70% do nitrogênio que a planta
precisa, fato que se destaca como economicamente bastante significativo,
principalmente para pequenos produtores (FARELEIRA et al., 2007).
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 FEIJÃO-CAUPI: ORIGEM E CLASSIFICAÇÃO
O feijão-caupi é uma leguminosa herbácea, autógama e anual com
inflorescências
simples
e flores
zigomorfas,
tem ciclo
curto,
grande
plasticidade, baixa exigência hídrica e rusticidade para desenvolvimento em
solos marginais (GRANGEIRO et al.,2005).
É uma planta dicotiledônea, pertencente à família fabaceae, gênero
Vigna, espécie Vigna unguiculata (L) Walp. Conhecido por diversas
denominações regionais como feijão-macassar, feijão de catador e feijão de
corda, no Nordeste, feijão de praia, feijão de rama e feijão de estrada na região
Norte, feijão miúdo na região Sul e feijão fradinho no estado do Rio de Janeiro
(CARDOSO & RIBEIRO, 2006). Tendo assim uma ampla distribuição nacional
e mundial, estando presente principalmente nas regiões tropicais do globo, pois
estas regiões têm características edafoclimáticas semelhantes às do seu
provável berço de origem, a África (MOUSINHO, 2005).
Sua produção se estende pela Ásia, Estados Unidos, Oriente Médio e
Américas Central e do Sul, sendo seus principais produtores mundiais a Nigéria
e o Brasil, onde foi introduzido no século 16, por colonizadores portugueses
(SINGH et al, 2002).
Segundo a FAO (2009) sobre a produção mundial de feijão-caupi, no
ano de 2007, a cultura atingiu 3,6 milhões de toneladas em 12,5 milhões de
hectares, produção essa alcançada em 36 países.
No Brasil é produzida principalmente no sertão semiárido abrangendo as
regiões Norte e Nordeste e pequenas áreas na Amazônia (SANTOS et al.,
2000). Estima-se uma área plantada de 150 mil hectares só na região
Amazônica (ZILLI et al 2009).
Tendo uma área de aproximadamente 1,2
milhões de hectares, concentrados apenas no Nordeste e 55,8 mil hectares na
região Norte do país. (FAO, 2009).
Nas regiões semiáridas do nordeste, a produção e a produtividade são
de 482 mil toneladas e 366 kg/ha-1, respectivamente, sendo os maiores
produtores os estados do Ceará, Piauí, Bahia, Maranhão e Rio Grande do
Norte (MAIA, 2006).
5
Só no estado do Ceará o ano agrícola de 2002/2003, a área plantada foi
de 618.000 hectares, resultando em uma produção de 211.800 toneladas,
enquanto no Piauí foram cultivados 218.000 hectares correspondendo a 68.500
toneladas (FNP, 2004).
Com relação aos aspectos socioeconômicos, a cultura do feijão-caupi é
responsável pela geração de 1.451.578 empregos/ano no Brasil, com o valor
de produção estimado em US$ 249.142.582,00/ano, estimando-se que
contribua com 26% da produção mundial e 82% da produção do continente
americano (FAO, 2005).
O feijão-caupi possui propriedades nutricionais superiores às do feijão
comum (Phaseolus vulgaris), sendo uma excelente fonte de proteínas (23 a
25% na composição média da semente), 56,8% de carboidratos, vitaminas e
minerais, tendo importante valor energético, além de possuir grande
quantidade de fibras dietéticas (3,9%), baixa quantidade de gordura (1,3%) e
apresenta todos os aminoácidos essenciais, principalmente lisina, o qual não é
encontrado facilmente em outros cereais (MENEZES, 2001).
Estudos recentes ressaltam que seu consumo tem sido correlacionado
ao decréscimo da incidência de doenças relacionadas a distúrbios do cólon e
doenças coronarianas, devido ao seu baixo valor calórico e teor de gordura
(ÁREAS, 2008).
Representando um alimento básico para populações de baixa renda em
contornos regionais de cultivo de subsistência e com dieta pobre de nutrientes
indispensáveis, sendo rica em taninos que são polifenois de maior importância
nutricional, pois além de possíveis efeitos sobre a disponibilidade de minerais,
está associada a sua influencia sobre a digestibilidade das proteínas
(DOURADO NETO & FANCELLI., 2000).
Seu cultivo é predominante para a produção de grãos secos ou verdes,
visando o consumo In natura, na forma de conserva ou desidratados. Além
disso, o feijão-caupi também é utilizado como forragem verde, feno, ensilagem,
farinha para alimentação animal e, ainda, como adubação verde e proteção do
solo, por demonstrar rápido crescimento, capaz de assegurar eficiente
cobertura do solo, principalmente pelas cultivares ramadoras (CARSKY et al.,
2001) características estas que conferem à essa cultura grande valor atual e
agronomicamente estratégico (FREIRE FILHO et al., 2006).
6
Atualmente é possível observar grandes áreas de cultivo de feijão-caupi
em municípios de todo o Brasil, traduzindo o caráter comercial que a cultura
tem assumindo, passando de cultura de subsistência a cultura de grande
potencial comercial e produtivo (CRAVO et al, 2009).
O feijão-caupi apresenta alta variabilidade genética, que o torna versátil
e com aptidão para varias finalidades e diversificados sistemas de produção. É
uma cultivar bem adaptada com milho, sorgo, algodão, cana-de-açúcar, além
de diversas olerícolas como berinjela e o quiabo (FATOKUM et al.,2000).
2.2 CULTIVARES DE FEIJÃO-CAUPI
Em algumas regiões do Brasil os baixos níveis de produtividade têm sido
constatados, estando associado ao plantio de cultivares tradicionais ou ao
emprego de sementes de baixa qualidade agronômica, portanto, com pouca
capacidade produtiva, esse fator vem mudando com a implantação de planos e
programas de pesquisa sobre o desenvolvimento de grãos mais tolerantes a
pragas e mais produtivos (OLIVEIRA, et al., 2007).
O feijão-caupi além de importante fonte de alimento, também é gerador
de emprego e renda. Recentemente, vem sendo incorporada a sistemas de
produção altamente tecnificados e isso fez surgir uma demanda por novas
cultivares, buscando diversas características desejáveis em uma cultivar ideal,
que não existe fenotipicamente havendo, portanto, a necessidade de serem
reunidas em uma mesma cultivar ou serem obtidas por meio da manipulação
genética (FROTA SOARES E ÁREAS, 2008).
Outro aspecto relacionado a essa questão é que os fatores bióticos e
abióticos que formam o ambiente como também as exigências dos produtores,
comerciantes e consumidores são dinâmicas. Além disso, as buscas do
aperfeiçoamento, da exploração e da melhoria da produtividade e da qualidade
exigem um trabalho permanente da criação e seleção de novas cultivares.
Primeiramente o melhoramento de variedades de feijão-caupi foi voltado
apenas para o aumento da produtividade, posteriormente, para a resistência a
doenças, principalmente a viroses, e atualmente, além dessas duas
características está sendo dada uma grande ênfase à qualidade de grãos e a
arquitetura da planta (XAVIER, et al, 2006).
7
Nisso, como resultado de trabalhos de melhoramento realizados por
empresas públicas em parcerias com o setor privado, vem sendo lançado
cultivares geneticamente melhorados Como o exemplo a BRS Marataoã para
os estados do Piauí, Maranhão, Paraíba e Bahia. Ela foi obtida do cruzamento
da cultivar Seridó com a linhagem TVx 1836-013J, em 1990 em parceria da
Embrapa Meio-Norte com a Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola –
EBDA e a Empresa estadual de Pesquisa da Paraíba -EMEPA, é uma cultivar
semiprostrada não formadora de grande volume de ramas, com ramos
consistentes com resistência ao acamamento, possui inserção das vagens
acima da folhagem com uma arquitetura adequada para a colheita mecânica.
Os grãos são de cor esverdeada, porém de baixa persistência, devendo
ser colhidos logo após a secagem. Sua característica importante é a tolerância
a altas infestações de mosca branca (Bemisia spp), resistência a mancha-café
(Colletotrichum trucatum (Schw) Andrus & Moore) e imunidade ao vírus-domosaico-severo-do-caupi (Cowpea severe mosaic vírus –CSMV0), seu ciclo é
de 42 dias até o florescimento (FREIRE FILHO. et al, 2009).
Outra alternativa de cultivar com grãos de cor tipo sempre verde tem em
destaque a BR17 Gurgueia, desenvolvida no setor de Plantas Autógamas do
Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
(ESALQ) em Piracicaba, SP em 1986, correspondente a linhagem TE867537E.1. Muito bem aceita no mercado piauiense, conferindo bons preços ao
produto nessa região.
Obtida do cruzamento entre as cultivares BR10-Piaui, que se mostra
imune ao vírus do mosaico severo do caupi-CpSMV, do mosaico dourado do
caupi-CpGMV e a algumas estirpes de Potyvirus, transmitidos por pulgão e CE315 (TVu 2331) que é altamente resistente aos Potyvirus, em particular ao
CpAMV (Cowpea Aphid-Born e Mosaic Vírus) e tambem ao CpGMV. Tem ciclo
médio com 75 dias sempre com bom padrão fitossanitário (NECHET & VIEIRA,
2006a).
Foi desenvolvida pela Embrapa semiárido uma nova cultivar para áreas
irrigadas e de sequeiro, pelo método de melhoramento entre linhagens dos
genótipos TE 90-180-26F, procedente da Embrapa Meio Norte e Epace 10,
desenvolvida na instituição de pesquisa do Ceará, chamada de BRS Pujante
que surpreende pela produtividade sem adubação, com características
8
marcantes de porte robusto, apresentando resistência às principais viroses que
atacam a cultura. Tem ciclo curto de produção, indo do plantio ate a primeira
safra de grãos secos em apenas 70 dias.
Para a agricultura dependente de chuva, a rapidez com que a planta
chega ao ponto de colheita é uma grande vantagem tecnológica para os
sistemas agrícolas de pequenos produtores. Sendo conhecida por ter ampla
adaptação e previsibilidade, altamente indicado para o consórcio com fruteiras
irrigadas na fase inicial de estabelecimento do pomar (SANTOS et al, 2005) .
Já a linhagem da IPA 206, estabelecida principalmente no estado de
Pernambuco, com ciclo de 65 a 75 dias, com sementes de cor marrom clara e
produtividade em sequeiro de 1.240 kg/ha, dado pela transferência de genes
das cultivares Bettergreem e Freezergreem, responsáveis pela cor verde do
cotilédone e do tegumento, apresentando aspecto mais atrativo para os
consumidores (LOPES. et al, 2006).
O Canapu, canapuzinho ou canapu ligeiro são alguns dos nomes usados
em algumas das regiões onde ele é preferido pelos produtores das regiões
semiáridas do Nordeste, predominantemente em áreas de influência JuazeiroBA e Petrolina-PE, esse genótipo apresenta como principais características o
peso do grão superior a 17g/100sementes, cor do grão de clara a amarelada,
persistente durante o armazenamento, formato arredondado e sabor agradável.
Contudo é altamente susceptível as principais viroses, como o mosaico
dourado e severo do grupo do Potyvirus.(SANTOS et al, 2007).
Embora não se tenha um estudo que indique as principais preferências
dos produtores, todos visam mais tolerância a pagas e doenças, mas também
constata-se que a arquitetura e a qualidade do grão vêm crescendo de
importância. Gerando uma busca por grãos valorizados por sua sobrevida de
pós-colheita, uniformidade de cor, tamanho e forma, tempo de cocção menor e
sabor agradável (KOLAWALE et al., 2000).
2.3 O MICROSSIMBIONTE RIZÓBIO E SUA DIVERSIDADE NO SEMIÁRIDO
O Rizobio é um termo genérico determinado a bactérias diazotróficas
originalmente pertencentes à família Rhizobiaceae nativamente presentes nos
9
solos, as quais são atraídas para as raízes das plantas leguminosas, ou seja
produtoras de vagens.
Por associação em simbiose
o rizóbio
utiliza
os
carboidratos
provenientes da fotossíntese da planta hospedeira para gerar energia
necessária para promover a fixação biológica de nitrogênio, por outro lado a
planta se beneficia do nitrogênio fixado pela bactéria na síntese de proteínas
(NASCIMENTO, 2008).
O termo Rizobio aqui será utilizado, referindo-se a um grupo bastante
heterogêneo de bactérias. Vários fatores interferem na eficiência simbiótica das
estirpes de rizóbio em condições de campo. Alguns são intrínsecos da bactéria,
outros são extrínsecos, envolvendo outros microrganismos do solo, fatores de
clima e solo ou determinados pela planta hospedeira.
De acordo com Ribeiro et al (2000) nesse propósito o estudo de seleção
de estirpes de rizobio nesse ecossistema é importante para a manutenção da
diversidade desses microrganismos no desenvolvimento de uma habitat auto
sustentável biologicamente. Para tanto o conhecimento da biodiversidade de
rizóbios é importante, pois o Brasil é um país que detém entre 15 a 20% de
toda a diversidade biológica do planeta, onde os microrganismos são os
indivíduos mais abundantes em qualquer ambiente (SALATI et al, 2006).
Estima-se que em um grama de solo superficial da área de caatinga
existam entre 104 e 106 diferentes nichos bacterianos, o que reflete uma
biodiversidade enorme, ate hoje pouco explorada em estudos de diversidade
biológica. Dentre essas bactérias estão os rizóbios, desempenhando a
manutenção e nutrição vegetal (FIERER e JACKSON 2006).
Estudos da relação existente entre a especificidade e a promiscuidade
entre bactérias e hospedeiro podem auxiliar na respostas a tais adaptabilidades
ocorridas em grande escala atualmente.
O isolamento, caracterização e avaliação da eficiência agronômica de
isolados de rizobio, candidatos a recomendação para produção de inoculantes,
é importante na exploração da diversidade do germoplasma rizobiano.
Podendo se encontrar bactérias mais eficientes e competitivas que as
atualmente recomendadas, tais como a estirpe BRS 3267, isolada da região
semiárida do nordeste brasileiro (MARTINS et al, 2003), já que nos dias atuais
as condições edafoclimaticas em constante mudanças vêm acarretando a
10
esses microrganismos rápidas adaptações bioquímicas em resposta a
condições de estresse impostas como aumento das temperaturas do solo, no
aparecimento crescente de áreas salinizadas e com mudanças de pH.
Nas regiões semiáridas do Brasil, a degradação vem ocorrendo desde a
ocupação dos portugueses em 1500, inicialmente com a divisão das áreas e
estados por capitanias hereditárias, onde a exploração de recursos naturais era
crescente e puramente extrativista.
De uma área que abrangia um total de 11% do território nacional com
969.589 quilômetros quadrados abrangendo 1.132 municípios que apresentam
isoladamente ou simultaneamente precipitação pluvial menor que 800
milímetros (mm), índices de aridez e relação pluviosidade e evapotranspiração
de ate 0,5 e risco de seca maior que 60%. Hoje sofre devastação de 0,4% de
sua área total, sendo descrita como uma das 25 “hotspots” áreas de elevada
biodiversidade com alto grau de endemismo, fortemente impactada pelas
atividades antropicas (MYERS et al., 2000).
Grande parte das áreas onde originalmente havia a cobertura vegetal de
caatinga nativa, hoje são áreas mal manejadas e degradadas. Essa
degradação pode resultar em um ecossistema frágil e com baixa diversidade
microbiana, resultando em baixa fertilidade do solo. A recuperação dessas
áreas é possível desde que processos de reintrodução de espécies vegetais
nativas em especial leguminosas (FREIRE FILHO et al, 2005).
2.4 A SIMBIOSE RIZOBIO E FEIJÃO-CAUPI
Inúmeros microrganismos que se multiplicam e habitam o solo são
responsáveis, direta ou indiretamente, por processos bioquímicos diversos que
controlam as transformações dos elementos químicos e as transferências de
energia e nutrientes no sistema solo-planta-atmosfera, constituindo a base de
sustentação e produtividade dos ecossistemas terrestres (MOREIRA &
SIQUEIRA, 2006), Nesse contexto o Feijão-caupi por ser uma leguminosa
inespecífica tem a facilidade de estabelecer associação por simbiose com
bactérias diazotróficas de diversas espécies do grupo rizóbio, incluindo os
gêneros Azorhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium e
Rhizobium em uma ampla faixa (ZILLI et al., 2006).
11
A classificação taxonômica das estirpes de rizóbio tem sofrido
numerosas modificações a partir de 2001, quando avaliações de diversas
coleções foi iniciada, revelando que uma grande parte das bactérias antes
descritas como do gênero Rhizobium pertenciam a outro gênero e outra subordem, sendo reclassificadas como gênero Burkholderia (MOULIN et al, 2001).
A partir de então diversas outras bactérias pertencentes a essa subordem foram classificadas como capazes de formar nódulos em leguminosas e
de suprir de nitrogênio pelo processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN)
(WILLEMS, 2006).
A FBN é um processo biológico importante onde o ATP é obtido a partir
de fotossimilados fornecidos pela planta hospedeira, que será utilizado também
como fonte de carbono para a assimilação e o transporte de amônia produzida,
desempenhando um processo ecológico importante e economicamente
vantajoso, podendo substituir os onerosos adubos químicos nitrogenados
(HUNGRIA & CAMPO, 2005).
Essa relação ocorre pelo processo realizado pelos microrganismos que
captam o nitrogênio atmosférico e disponibiliza em forma de amônia, com a
conversão do nitrogênio molecular (N2) em amônia (N2 => 2NH3), forma
disponível para as plantas, através de uma comunicação mediada por trocas
de sinais moleculares específicos, como a produção de flavonóides pelas
raízes, resultando em relações estreitas entre a bactéria e a planta,
promovendo a formação de estruturas especializadas, chamadas de nódulos.
Estrutura a qual desencadeia o principal meio de incorporação do nitrogênio
atmosférico ao solo sendo responsável por cerca de 65% do nitrogênio
anualmente fixado na terra (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).
Quando realizada uma comparação ao uso de fertilizantes nitrogenados
por fixação industrial, a FBN apresenta vantagens como baixo custo, ausência
de problemas ambientais devido a abundancia de nitrogênio na atmosfera
(SANTOS et al, 2008).
A fixação industrial, processo pelo qual é fabricado os fertilizantes
nitrogenados é responsável por uma quantidade similar à fixação biológica
realizada pelas bactérias diazotroficas, porém vale ressaltar que essa produção
dispende grande quantidade de energia para quebrar a ligação tripla entre os
átomos de Nitrogênio, atingindo temperaturas superiores a 450°C e pressão de
12
100 ATM´s, que é suprida por combustíveis fósseis, tornando essa produção
bastante impactante ao meio ambiente além de ser de alto custo (CAPOTE et
al, 2005).
Assim, a utilização de insumos biológicos em substituição aos insumos
químicos industrializados tem sido cada vez mais freqüentes na agricultura e a
Fixação Biológica de Nitrogênio tem se mostrado indispensável para a
sustentabilidade da agricultura brasileira e aumento da produtividade de grãos
em microrregiões, já que o nitrogênio faz parte da molécula de clorofila e,
portanto é necessário para a realização da fotossíntese. Como componente
das moléculas de aminoácidos essenciais formadores de proteína, sendo
assim o nitrogênio o responsável direto pelo aumento do teor de proteínas nos
grãos e conseqüentemente maior produção (MOREIRA, 2008).
Com isso o uso de técnicas e práticas que priorizem a utilização de
insumos biológicos em detrimento ao uso de fertilizantes e/ou defensivos é
uma pratica que vem sendo difundida por priorizar o baixo impacto biológico.
2.5 INFLUÊNCIA DOS FATORES ABIÓTICOS NA FBN
A nodulação das leguminosas é dependente dos aspectos relacionados
à associação entre planta e bactéria e influenciada também por fatores
edafoclimáticos, tais como temperatura, umidade, salinidade, pH do solo e
deficiência de elementos essenciais como o fósforo (P) e o Cálcio (Ca),
afetando negativamente as diferentes etapas do processo de nodulação
(ARAUJO et al, 2007).
Na região semi-árida brasileira, o regime de chuvas, concentrado num
período de 3 a 4 meses por ano, é marcado por forte irregularidade interanual.
As temperaturas médias variam de 23°C a 27°C e a in solação anual chega a
2.800 horas. Isto determina altas taxas de evapotranspiração, configurando
estresse hídrico em quase toda a região (MATALLO JÚNIOR, 2000).
As diferenciações de características do solo e clima e as atividades
enzimáticas dessas bactérias resultam, principalmente, na ação de enzimas
extracelulares produzidas pelos microrganismos dispondo a essas bactérias
características adaptativas às condições adversas (MERCADANTE et al,
2004).
13
O fato do cultivo do feijão caupi ser realizado predominantemente em
condições de agricultura de sequeiro em determinadas regiões do Brasil,
principalmente no Nordeste, essa associação é benéfica e eficiente, pois pode
atingir altos níveis de produtividade, o que diminui significativamente os custos
de produção.
Nos trópicos, não é raro a temperatura da superfície do solo (0 a 20cm)
alcançar 40°C. Nessas condições, o crescimento, a s obrevivência e a função
simbiótica do rizóbio costumam ser drasticamente afetadas (BURITY et al,
2000).
A falta ou excesso de água além de prejudicar diretamente o
desenvolvimento da cultura, afeta o processo de FBN, influenciando a atividade
fisiológica dos microrganismos, bem como sua sobrevivência.
Em ambientes tropicais a importância da FBN está relacionada com a
baixa disponibilidade desse nutriente nos solos, agravada por situações
diversas, como temperaturas extremas, baixa umidade, alta radiação luminosa
e deficiência de outros nutrientes (YORDANOV et al., 2000).
As bactérias do solo são capazes de desenvolver estratégias de
sobrevivência diante das condições de estresse, propriedade específica da
parede celular que é determinada pelo tipo e o estado fisiológico do rizóbio.
Outro fator que interage com a umidade, diminuindo o potencial da água
do solo, é a salinidade, pois interage fortemente com outras condições
adversas, determinando respostas complexas na planta (GUALTER, 2007).
O problema da salinidade nas regiões semiáridas tem se agravado e
tende a se tornar um problema de difícil solução em virtude de fatores inerentes
ao clima, a geologia, a qualidade da água e ao manejo da irrigação. Sendo a
salinidade um problema que atinge cerca de 45 milhões (19,5%) dos 230
milhões de hectares da área irrigada do globo terrestre (FAO, 2000).
O excesso de sais no solo limita severamente a produção agrícola
principalmente nas áreas nas regiões áridas e semiáridas, onde cerca de 25%
da área irrigada encontra-se salinizada (FAO, 2000).
Preliminarmente, o
Feijão-caupi tem sido classificado como uma espécie moderadamente
resistente à salinidade com base na condutividade elétrica do extrato de
saturação. Entretanto, a literatura tem mostrado que essa espécie vegetal
tolera a água salina com condutividade elétrica de ate 3,3 dS m-1 e salinidade
14
de 4,9 dS m-1 (COSTA et al., 2003) Portanto, de acordo com esses últimos
autores, o feijão-caupi pode indicar uma alternativa para cultivos que usem
recursos de água e solo salinos.
Um dos pré-requisitos para o estabelecimento de uma simbiose bem
sucedida em ambientes de estresse, incluem as etapas que envolvem a troca
de sinais moleculares até a formação de nódulos por estirpes eficientes e
tolerantes.
Outro fator que pode interferir na dinâmica populacional do rizóbio é o
pH do solo, onde as alterações de pH são capazes de alterar a taxa de
colonização das raízes, influenciando a competição entre os indivíduos e uma
grande variabilidade em relação a eficiência e tolerância, acidificação ou
alcalinização (FIGUEIREDO et al, 2008).
Os fatores bióticos que podem influenciar o bom desenvolvimento do
Feijão-caupi, são as características genotípicas do macro e microssimbionte,
onde podem influenciar as trocas de sinais moleculares, refletindo nas
diferentes respostas em relação ao aspecto de hospedeiro, diretamente na
especificidade e eficiência simbiótica (MELO & ZILLI, 2009).
A nodulação é um processo modulado por uma intensa troca de sinais
químicos entre as células da raiz da leguminosa e o rizobio, o que pode ser
explicado pela produção de vários compostos indutores e inibidores envolvidos
no processo de reconhecimento entre os simbiontes (REIS et al, 2009).
Embora a cultura apresente ampla capacidade na FBN, nem sempre são
observadas respostas positivas ao uso de inoculantes em campo, em razão
das características edafoclimáticas e as de que o feijão-caupi apresenta baixa
especificidade em relação ao microssimbionte na nodulação, mostrando-se
limitante à exploração tecnológica da FBN, uma vez que as bactérias
nodulantes nativas, já estabelecidas no solo, alem de serem mais competitivas
e estarem em números elevados, apresentam eficiência variável na fixação
efetiva de nitrogênio na planta hospedeira, por adaptabilidade a fatores bióticos
e abióticos adversos (HANA & OLIVEIRA, 2007).
Alem de todos os fatores influenciáveis tem também as características
fisiológicas de cada microrganismo sendo que o fósforo(P) juntamente com o
nitrogênio, são os elementos mais requeridos pelas plantas, no entanto a
eficiência da adubação de fósforo é baixa (5%) ficando grande parte deste
15
elemento fixado no solo (FARIAS et al., 2009), podendo o solo atuar como
fonte de dreno quando seu grau de intemperismo é acentuado, como em
latossolos do cerrado (NOVAIS et al., 2007).
Sendo o fósforo elementar um composto bastante reativo no solo e
grande parte aplicada via adubação, sendo fixado em complexos com cálcio
formando compostos de baixa solubilidade (SOARES, 2006).
Dessa forma o grupo de bactérias do gênero Rhizobium que apresentem
a capacidade ativa de fixação biológica de nitrogênio (FBN) quanto à eficiência
de solubilizar fosfatos, mostram potencial biotecnológico promissor para
aplicação como inoculante na atividade agrícola.
2.6 EFICIÊNCIA DA SIMBIOSE NO FEIJÃO-CAUPI
O fato do feijão-caupi ser capaz de nodular com diversas espécies de
bactérias do grupo rizóbio, alem de ser uma vantagem ecológica para a
adaptação deste vegetal é um fator limitante ao uso de inoculantes em
sistemas agrícolas, isso porque a cultura apresenta baixa especificidade de
nodulação (SILVA et al 2008).
Dessa forma, apesar de ser uma das leguminosas com maior
capacidade em fixar nitrogênio atmosférico nos sistemas agrícolas, a
ocorrência de nodulação espontânea e principalmente, a falta de resultados
positivos em condições de campo, faz com que a pratica de inoculação ainda
não seja amplamente usada para essa cultura no Brasil a qual apresenta uma
interessante variabilidade entre as cultivares (BERTINE et al., 2009).
Esse fato demonstra a alta capacidade de nodulação e sua possível
eficiência agronômica em relação ao caupi com bactérias nativas do solo,
apresentando grande eficiência na fixação de nitrogênio e de ganho em
biomassa.
Contudo os microrganismos do solo que apresentam relação simbiôntica
apresentam papel fundamental com diversas funções chave para o perfeito
funcionamento dessa relação e sua possível eficiência (LIMA et al, 2005).
Porém, a capacidade de nodulação e a de fixar Nitrogênio atmosférico
nessas leguminosas são eventos distintos e complexos vistos que a eficiência
não é determinada exclusivamente pela variedade do cultivar nem apenas pela
16
estirpe de rizobio a qual foi infectada (nodulada), mas pela interação entre os
simbiontes (NASCIMENTO, 2010).
Embora os solos apresentem uma população abundante de bactérias
noduliferas e fixadoras de N2 de leguminosas, contudo sua diversidade e real
eficiência ainda foram pouco estudadas.
Nesse contexto o atributo importante de associação simbiótica, são as
informações sobre as estruturas das populações de rizobio, bem como sobre a
co-evolução dos microssimbiontes com as plantas hospedeiras sendo
importante porque podem contribuir não só para delinear estratégias visando a
maximizar o processo de fixação biológica do nitrogênio atmosférico, como
também para obter informações sobre a evolução da simbiose em solos
brasileiros (GRANGE et al., 2007).
2.7 NOVO FOCO DE IMPORTÂNCIA COMERCIAL
O gênero Rhizobium foi o primeiro gênero descrito para designar as
bactérias que formam nódulos radiculares em leguminosas. Daí diversas
espécies de crescimento rápido e produtoras de muco eram classificadas neste
gênero, posteriormente classificadas como outro gênero (BERGE et al, 2009).
Além da importância para fins de seleção de bactérias para a
recomendação de inoculantes, outras aplicações industriais e biotecnológicas
podem
ser
oriundas
de
estudos
aplicados
a
essa
diversidade
de
microrganismos rizosféricos, na produção de muco e rápido crescimento.
Devido a versatilidade metabólica das bactérias do solo, muitas destas
podem ser utilizadas como produtores de compostos para a industria química
(OLIVEIRA et al, 2003).
As bactérias do gênero Rhizobium são microrganismos produtores de
uma gama de amilases, capazes de degradar amidos de diferentes origens
como fécula de batata e tapioca, amido de milho dentre outras fontes
(OLIVEIRA et al, 2007).
Além de apresentar capacidade de produzir enzimas lipolíticas e
proteolíticas, que servem de inúmeras fontes de matéria prima na produção
industrial de alimentos e produtos farmacêuticos, alem de poder ser aplicados
como polihidroxialcanoatos e polissacarideos para produção de plásticos
17
biodegradáveis (TRAINER e CHARLES, 2006). Tudo a partir da eficiente
produção, por algumas bactérias, de compostos de exopolissacarídeos (muco).
Diversos estudos têm focado a utilização de materiais alternativos aos
derivados de petróleo na indústria de plástico, e dentre esses materiais se
destaca o polímero bacteriano, por ter baixo impacto ambiental e efetiva
diminuição do acúmulo de resíduos, não degradando o ambiente.
Dessa forma os processos biológicos gerados por microrganismos além
de beneficiar práticas agrícolas como a FNB e solubilização de micronutrientes,
podem também colaborar com a diminuição de impactos ambientais da
produção de lixo em grandes centros urbanos (COMLURB, 2009).
18
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARAÚJO, J. P. P. de; SANTOS, A. A. dos; CARDOSO, M. J.; WATT, E. E. Nota
sobre a ocorrência de uma inflorescência ramificada em caupi Vigna
unguiculata (L.) Walp. Subsp, unguiculata no Brasil. Revista Ciência
Agronômica, Fortaleza, v. 12, n. 1/2, p. 187-193, 2007.
ARÊAS, J. A. G. Interações moleculares do amido durante o processo de
extrusão. Boletim da SBCTA, Campinas, v. 30, n. 1, p. 28-30, 2008
BERGE, O.; LODHI, A.; BRANDELET, G.; SANTAELLA, C.; RONCATO, M, A.;
CHRISTEN, R.; HEULIN, T.; ACHOUAK, W. Rhizobium alamii sp. Nov., an
exopolysaccharide-producing species isolated from legume and non-legume
rhizospheres. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, v.59: 367-372. 2009.
BERTINI, C. H. C. M.; TEÓFILO, E. M.; DIAS, F. T. C. Divergência genética
entre acessos de feijão caupi do banco de germoplasma da UFC. Revista
Ciência Agronômica, v. 40, n. 01, p. 99-105, 2009.
BURITY, H. A.; VASCONCELOS, L.; FREIRE, V. F. Efeitos de níveis de
fosfatos de rocha e da inoculação de Rhizobiumm SP. E Glomus macrocarpum
Tul. Sobre o desenvolvimento de jurema preta, mimosa acustistipula Benth.
Pesq. Agropec. Brás., Brasília, v.35, n.4, p.801-807, 2000.
CAPOTE, D. G.; BURNS, J. A.; MICHAELS, A. F.; MONTOYA, J. P.;
SUBRAMANIAM, A.; CARPENTER. E. J. Nitrogen fixation by Trichodesmium
spp.: Na important source of nem nitrogen to the tropical and sub-tropical North
Atlantic Ocean. Global Biogeochemical Cycles, v. 19: 1-17. 2005.
CARDOSO, M. J., RIBEIRO, V. Q. Desempenho agronômico do feijão-caupi,
cv. Rouxinol, em função de espaçamento entre linhas e densidade de plantas
sob regime de sequeiro. Revista Ciência Agronômica, v.v37, p. 102-105,
2006.
CARSKY, R. J., SINGH, B. B., OYEWOLE, B. Contribution of early season
cowpea to late season maize in the savanna zone of West Africa. Biol. Agric.
Hort. 18, 303-316. 2001
COMLURB. Guia de Serviços e Informações. 2009. Disponível em: <http://
www.rio.rj.gov.br/web/comlurb/listaconteudo#resultado>. Acessado em 27
deze. 2010.
COSTA, P. H. A.; SILVA.; BEZERRA, M. A.; ENÉAS FILHO, J.; PRISCO , J. T.;
GOMES FILHO, E. Crescimento e níveis de solutos orgânicos e inorgânicos em
cultivares de Vigna unguiculata submetidos a salinidade. Revista Brasileira de
Botânica, v. 26, p. 289-297, 2003.
19
CRAVO, M. S.; SOUZA, B. D. L.; CUNHA, F. D. R.; CAVALCANTE, E. S.;
ALVES, J. M. A.; MARINHO, J. T. S.; VIEIRA JUNIOR, J. R.; GONÇALVES, J.
R. P.; FREITAS, A. C. R.; TOMAZETTI, M. A. Sistemas de cultivo. In: Zilli, j. e.;
Vilarinho, a. a.; Alves, j. m. a. ORG. A cultura do feijão-caupi na Amazônia
Brasileira. 1. Ed. Boa Vista: Embrapa Roraima, 2009. v. 1, p. 59-104.
DANTAS, J.P. et al. Avaliação de genótipos de caupi sob salinidade. Revista
Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, Campina Grande, v.6, n.3,
p.425-430, 2002.
DOURADO NETO, D., FANCELLI, A. L. Produção milho e feijão. Guaíba:
Agropecuária, 2000. 360p. EMBRAPA MEIO-NORTE. Cultivo de feijão caupi.
Teresina,
Julho
2003.
Disponível
em:
<http://www.cpamn.embrapa.br/pesquisa/graos/FeijaoCaupi/referencias.htm>.
Acesso em: Outubro 2010.
FAO. Global Network on Integrated Soil Management for Sustainable Use
of
Salt-affected
Soils.
2000.
<
Disponivel
em:
www.fao.org/ag/AGL/agll/spush/intro.htm>. Acesso em agosto de 2010.
FAO/Faostat/. Roma: FAO, 2005. Disponível em: http:// faostat.fao.org. Acesso
em: 3 agost. 2010.
FAO/INCRA/. Novo retrato da agricultura familiar: o Brasil redescoberto.
Brasília, Ministério do Desenvolvimento Agrário, 2009. 74p.
FARELEIRA, P.; METOS, N.; FERREIRA, E.; MARQUES, J. F. Tolerância ao
sal e as altas temperaturas de estirpes de Sinorhizobium provenientes de
zonas secas do Alentejo. Revista de Ciências Agrárias, v.30. n.p.2007.
FARIAS, D. R.; OLIVEIRA, F. H. T.; SANTOS, D.; ARRUDA, J. A.;
HOFFMANN, R. B.; NOVAIS, R. F. Fósforo em solos representativos do estado
da paraíba: I- isotermas de adsorção e medidas do fator capacidade de fósforo.
Rev. Bras. Ciênc. Solo, 33: 623-632, 2009.
FATOKUM, C.; TARAWALI, C.; SINGH, B.; KORMATA, P.; TAMO, M., editors.
(2000): Challenges and opportunities for enhancing sustainable cowpea
production. Proceedings of the World Cowpea Conference III held in
International Institute of Tropical Agriculture (IITA). Ibadan, Nigeria, 2000.
FIERER, N.; JACKSON, R. B. The diversity and biogeography of soil bacterial
communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, v. 103: 626-631. 2006.
FIGUEIREDO, M. V. B.; VILAR, J. J.; BURITY, H. A.; FRANCA, F. P. Alleviation
of water stress effects in cowpea by Bradyrhizobium spp. inoculation. Plant
and Soil, v.207, p.67–75, 2008.
20
FNP. Consultoria & Agroinformativos. Anuário da Agricultura Brasileira –
Agrianual. São Paulo: FNP, 2003, 496p. 2004.
FREIRE FILHO, F. R.; LIMA, J. A; RIBEIRA, A. Feijão caupi: avanços
tecnológicos. Brasília: Embrapa Informações Tecnológicas, 2005. 519 p.
FREIRE FILHO, F. R.; RIBEIRO, V. Q.; BARRETO, P. D.; SANTOS, C. A. F.
Melhoramento genético de caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] na região
do Nordeste. Disponível em: <http://www.cpatsa.embrapa.br>. Acesso em: 10
jan. 2006.
FREIRE FILHO, F. R.; RIBEIRO V. Q.; BARRETO P. D.; SANTOS, C. A. F.
Melhoramento genético de caupi (Vigna unguiculata (L) Walp) na região do
Nordeste. In: Queiroz, M. A.; Goedet, C. O.; Ramos, S. R. R. (ed.) Recursos
genéticos e melhoramento de plantas para o Nordeste brasileiro. Petrolina:
Embrapa Semiárido/ Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, 2009. http//www.cpatsa.embrapa.br. 25 jan. 2011.
FROTA, K. M. G.; SOARES, R. A. M.; ARÊAS, J. A. G. Composição química do
feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp), cultivar BRS-Milênio. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v. 28, n. 2, p. 470-476, 2008.
GRANGE, L.; HUNGRIA, M.; GRAHAM, P.H. & MARTÍNEZROMERO, E. New
insights into the origins and evolution of rhizobia that nodulate common bean
(Phaseolus vulgaris) in Brazil. Soil Biol. Biochem., 39:867-876, 2007.
GRANGEIRO, T. B.; CASTELLÓN, R. E. R.; ARAÚJO, F. M. M. C. de; SILVA,
S. M. de S. e; FREIRE, E. de A.; CAJAZEIRAS, J. B.; AMARAL NETO, M.;
GRANGEIRO, M. B.; CAVADA, B. S. Composição bioquímica da semente. In:
FREIRE FILHO, F. R.; LIMA, J. A. de A.; RIBEIRO, V. Q. (Eds.). Feijão-caupi:
avanços tecnológicos. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2005. p.
338-365.
GUALTER, R.M.R. et al. Avaliação dos efeitos da inoculação de feijão-caupi
(Vigna unguiculata [L.] Walp.) com Bradyrhizobium elkanii. Revista Brasileira
de Agroecologia, v. 02, n. 02, p. 637-640, 2007.
HANA, F. A. S.; OLIVEIRA, L. A. Características fisiológicas e ecológicas de
isolados de rizobio oriundos de solos ácidos e álicos de presidente Figueiredo,
Amazonas. Acta Amazônica, 34: 343-357. 2007
HUNGRIA, M.; CAMPOS, R. J. (2005). Fixação biológica do nitrogênio em
sistemas agrícolas. In: Congresso Brasileiro de Ciência do Solo, 30., 2005,
Recife. Anais... Recife. 1 Cd-Rom.
KOLAWALE, G. O., TIAN, G., SINGH, B. B. Differential response of cowpea
varieties to aluminum and phosphorus application. J. Plant Nutr. 23, 731-740.
2000.
21
LIMA, A. S.; PEREIRA, J. P. A. R.; MOREIRA, F. M. S. Diversidade fenotípica e
eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium spp. de solos da Amazônia.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 40, p. 1095-1104, 2005.
LIU, K.; MCWATTERS, K.H.; PHILLIPS, R.D. Protein insolubilization during
storage as related to hard to cook defect in cowpeas. J. Agric. Food Chem., v.
10, p. 2183- 187, 2005
LOPES, E. M. L; FREIRE FILHO, F. R.; GOMES, R. L. F.; MATOS FILHO, C.
H. A. Caracterização morfo-agronômica de cultivares locais de feijão-caupi do
grupo Canapu. In: CONGRESSO NACIONAL DE FEIJÃO-CAUPI, 1.;
REUNIÃO NACIONAL DE FEIJÃO-CAUPI, 6., 2006, Teresina. Tecnologias
para o agroneg6cio: Anais... Teresina: Embrapa Meio-Norte, 2006. 1 CDROM. (Embrapa Meio-Norte. Documentos, 121).
MAIA, F. M. M. Composição e caracterização nutricional de três cultivares de
Vigna unguiculata (L.) Walp: EPACE-10, Olho de ovelha e IPA-206. Fortaleza,
2006. 87 p. Universidade Federal do Ceará - UFC.
MARTINS, L. M. et al. Contribution of biological nitrogen fixation to cowpea: a
strategy fot improving grain yield in the semi-arid region of Brazil. Biology and
Fertility of Soil, v. 38, p. 333-339, 2003.
MATALLO JÚNIOR, H. A desertifi cação no Brasil. In: OLIVEIRA, T. S. et al.
(Eds). Agricultura, sustentabilidade e o Semi-Árido. Fortaleza: UFC/SBCS,
2000. p.89-113
MELO, S. R.; ZILLI, J. E. Fixação biológica de nitrogênio em cultivares de
feijão-caupi recomendadas para o Estado de Roraima. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, v. 44, n. 09, p. 1177-1183, 2009.
MENEZES, E. W.; CARUSO, L.; LAJOLO, F. M. Avaliação da qualidade dos
dados de fibra alimentar. Estudo em alimentos Brasileiros. In: LAJOLO, F. M.;
SAURA-CALIXTO, F.; PENNA, E. W.; MENEZES, E. W. (Eds.). Fibra dietética
en Iberoamerica: tecnología y salud. 2 ed. São Paulo: Varela, 2001. p. 165178. (cap. 11).
MERCANTE, F.M.; OTSUBO, A.A.; SILVA JÚNIOR, A. & VERALDO, F.
Isolamento e seleção inicial de rizóbios obtidos de solos de Mato Grosso do Sul
para inoculação em feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Dourados, Embrapa
Agropecuária Oeste, 2004. 24p. (Documentos, 67)
MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O. Microbiologia e bioquímica do solo.
Lavras,MG: UFLA, 2004. 729p.
MOREIRA, F. M. S,; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e Bioquímica do solo 2.
Ed. Lavras: UFLA, 2006. 781p.
22
MOREIRA, F. M. S. Bactérias fixadoras de nitrogênio. In MOREIRA, F. M. M,;
SIQUEIRA, J. O.; BRUSAARD, L Eds. Biodiversidade do solo em
ecossistemas brasileiros. UFLA, Lavras. 2008. p. 768.
MOULIN, L.; MUNIVE, A.; DREYFUS, B.; BOIVIN-MASSON, C. Nodulation of
legumes by members of the B-subclass of proteobacteria. Nature, v.411: 948950. 2001.
MOUSINHO, F.E.P. Viabilidade econômica da irrigação do feijão-caupi no
Estado do Piauí. Piracicaba, Escola Superior de Agricultura Luiz Queiroz, 2005.
97p. (Tese de Doutorado)
MYERS, N.; MITTERMEIER, R. A.; MITTERMEIER, C. G.; FONSECA, G. A. B.;
KENT, J. Biodiversity hotspots for conservation priorities . Nature. 403: 853358. 2000.
NASCIMENTO, L. R. S. et al. Nodulação e produção do caupi (Vigna
unguiculata L.) sob efeito de plantas de cobertura e inoculação. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v. 32, p. 579-587, 2008.
NASCIMENTO, L. R. S. Eficiência de isolados de rizóbios nativos do agreste
paraibano em caupi. Revista Brasileira de Ciências Agrárias, v. 05, n. 01, p.
36-42, 2010.
NECHET, K. L.; HALFELD-VIEIRA, B.A. Caracterização de isolados de
Rhizoctonia spp., Associados à mela do feijão-caupi (Vigna unguiculata),
coletados em Roraima. Fitopatologia Brasileira, v.31, n.5, p. 505- 508, setout. 2006a.
NOVAIS, R. F.; ALVAREZ V., V. H.; BARROS, N. F. de; FONTES, R. L. F.;
CANTARUTTI, R. B.; NEVES, J. C. L. Editores. Fertilidade do Solo. Viçosa,
MG;Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 2007. 1017p.
OLIVEIRA, A. P.; SILVA, V. R. F.; ARRUDA, F. P.; NASCIMENTO, I. S.;
ALVES, A. U. Rendimento de feijão-caupi em função de doses e formas de
aplicação de nitrogênio. Horticultura Brasileira, v.21, n.1, p.77-80, 2003.
OLIVEIRA, A. N.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S.; CHAGAS JUNIOR, A. F.
Atividade enzimática de isolados de rizobio nativos da Amazônia central
crescendo em diferentes níveis de acidez. Ciências e Tecnologia de
Alimentos, v. 26: 204-210, 2007.
REIS, V.M.; BALDANI, J.I.; BALDANI, V.L.; DÖBEREINER, J. Biological
dinitrogen fixation in gramineae and palm trees. Critical Reviews in Plant
Sciences,v.19, p.227-247, 2009.
REIS JUNIOR, F.B.; SILVA, L.G.; REIS, V.M.; DÖBEREINER, J. Ocorrência de
bactérias diazotroficas em diferentes genótipos de cana-de-açúcar. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v.35, p.985-994, 2005.
23
RIBEIRO, J. R. A.; OLIVEIRA, R. R.; RUMJANEK, N. G. Estudo populacional
de rizobio na Mata Atlântica. XXXIV Reunião Brasileira de Fertilizantes do Solo
e Nutrição de Plantas – FERTBIO, 2000, Santa Maria, RS. ANAIS... 2000 CD
ROM.
RUMJANEK, N. G. et al. Fixação biológica de nitrogênio. In: FREIRE FILHO, F.
R. et al. Feijão Caupi: avanços tecnológicos. Brasília: Embrapa Informações
Tecnológicas, 2005. p. 281-335.
SALATI, E.; SANTOS, A. A.; KLABIN, I.Relevant environmental issues. Estudos
Avançados. V.20: 170-127. 2006.
SANTOS, C. E. R. S.; STAMFORD, N. P.; FREITAS, A. D. S.; VIEIRA, I. M. M.
B.; SOUTO, S. M.; NEVES, M. C. P.; RUMJANECK, N. G. Efetividade de
rizóbios isolados de solos da região nordeste do Brasil na fixação do N2 em
amendoim (Arachis hypogaea L.). Acta Scientiarum, v.27, p.301-307, 2005.
SANTOS, C. A. F.; SANTOS, I. C. N. dos; RODRIGUES, M. A. Melhoramento
genético do feijãocaupi na Embrapa Sem I-Árido. Petrolina: Embrapa Sem iÁrido, 2007. 24 p. (Embrapa Semi-Árido. Documentos, 204).
SANTOS, C. A. F.; BARROS, G. A. de A.; SANTOS, I. C. N.; FERRAZ, M. G.
de S. Comportamento agronômico e qualidade tecnol6giCS de grãos de
linhagens de feijão-caupi avaliadas no Vale do São Francisco. Hortilcultura
Brasileira, v. 26, p. 404-408, 2008.
SANTOS, C. E. R. S. Diversidade, faixa hospedeira e eficiência de fixação de
N2 de rizobio nativo da região nordeste do Brasil em amendoim (Arachis
hypogaea). Seropedica. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. 178 f.
2000 (Tese de Doutorado)
SILVA, V. N.; SILVA, L. E. S. F.; FIGUEIREDO, V. B. Atuação de rizóbio com
rizobactéria promotora de crescimento em plantas na cultura do caupi (Vigna
unguiculata [L.] Walp.). Acta Scientiarum Agronomy, v. 28, n. 03, p. 407-412,
2006.
SILVA, R. P.; SANTOS, C. E. R. S.; LIRA JÚNIOR, M. A.; STAMFORD, N. P.
Efetividade de estirpes selecionadas para feijão caupi em solo da região semiárida do sertão da Paraíba. Revista Brasileira de Ciências Agrárias, v.3, n.2,
p.105-110, 2008.
SINGH, B. B.; EHLERS, J. D.; SHARMA, B.; FREIRE FILHO, F. R. Recent
progress in cowpea breeding. In: FATOKUN, C. A.; TARAWALI, S. A.; SINGH,
B. B.; KORMAWA, P. M.; TAM?Ò, M. (Eds.). Challenges and opportunities
for enhancing sustainable cowpea production. Ibadan: IITA, 2002. p. 22-40.
SOARES, A. L. L. Eficiência agronômica de rizóbios selecionados e diversidade
de populações nativas nodulíferas em Perdões (MG): II - feijoeiro. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v. 30, p. 803-811, 2006.
24
TRAINER, M. A.; CHARLES, T. C. The role of PHB metabolism in the
symbiosis of rhizobia with legumes. Applied Microbiology and
Biotechnology, v. 71: 377-386. 2006
WILLEMS, A. The taxonomy of rhizobia: an overview. Plant and Soil,
Dordrecht, v. 287, p.3-14, 2006.
YORDANOV, I.; VELIKOVA, V.; TSONEV, T. Plant response to drought,
acclimation, and stress tolerance. Photosynthetica, v. 38, n. 2, p. 171-186,
2000.
XAVIER, G. R. et al. Especificidade simbiótica entre rizóbio e acessos de feijãocaupi de diferentes nacionalidades. Revista Caatinga, v. 19, n. 01, p. 25-33,
2006.
ZILLI, J. E. et al. Caracterização e avaliação da eficiência simbiótica de estirpes
de Bradyrhizobium em caupi nos solos de cerrados. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v. 41, p. 811-818, 2006.
ZILLI, J. E. et al. Contribuição de estirpes de rizóbio para o desenvolvimento e
produtividade de grãos de feijão-caupi em Roraima. Acta Amazonica, v. 39, n.
04, p. 749-758, 2009.
25
4. OBJETIVO GERAL
Avaliar a diversidade da população de rizóbios nativos ou naturalizadas
formadoras de nódulos em feijão-caupi em áreas de semiárido do estado de
Pernambuco e testar a eficiência destes isolados, com finalidade de obter
inóculo eficiente na fixação biológica de nitrogênio em cultivares de uso
agronômico na região.
26
CARACTERÍSTICAS MORFO-FISIOLÓGICAS DE BACTÉRIAS
ISOLADAS DE NÓDULOS DE FEIJÃO-CAUPI
27
RESUMO
A manutenção da biodiversidade microbiana em diferentes ecossistemas é o
foco principal em se tratando de desenvolvimento agronômico em diferentes
regiões produtoras e o uso de microrganismos capazes de promover a Fixação
Biológica de Nitrogênio em associação simbiótica planta e bactéria, com
finalidade de melhorar a disponibilidade de nutrientes as plantas é uma
alternativa ao cultivo com adubos químicos visando à preservação dos
recursos ambientais bem como uma considerável economia na aplicação de
suplementos nitrogenados. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a
diversidade de bactérias presentes em nódulos de feijão-caupi por suas
características morfológicas e fisiológicas in vitro. O experimento foi
desenvolvido em casa de vegetação e laboratório de microbiologia do solo da
Embrapa Semiárido / CPATSA, Petrolina-PE. Foram isoladas 370 bactérias
provenientes de cinco diferentes amostras de solos e cinco cultivares de feijão
caupi (IPA206; BRS Marataoã; BRS Pujante; Canapu Tardio e BR17
Gurgueia). A coleta do experimento se deu aos 40 dias após a germinação, os
nódulos
foram
destacados
e
contados
para
posterior
caracterização
morfológica e fisiológica em meio de cultura YMA. Os isolados foram
agrupados em 32 representantes com similaridade superior a 80%, destes, 165
são de crescimento rápido, 96 de crescimento lento e o restante de
crescimento intermediário. Na avaliação de tolerância a diferentes fatores
abióticos, tais como diferentes faixas de temperatura, 43 isolados cresceram a
45°C e para tolerância a diferentes concentrações d e NaCl apenas 11 isolados
apresentaram crescimento na concentração máxima de 35g. Em relação aos
índices de diversidade, os solos estudados apresentaram uma diversidade
populacional, onde o solo 3 (com histórico de plantio de leguminosas), se
destacou juntamente com o cultivar 3 (BRS Pujante), tanto para número de
nódulos como para diversidade de indivíduos. Os resultados indicam que a
população estabelecida nos solos do Nordeste foi caracterizada pela
diversidade elevada quanto às propriedades morfológicas e fisiológicas.
Palavras chaves Fixação Biológica de Nitrogênio, Características Fenotípicas,
Bactérias Nodulíferas
28
ABSTRACT
The maintenance of microbial biodiversity in different ecosystems is the main
focus when dealing with agricultural development in different producing areas
and the use of microorganisms capable of promoting biological fixation of
nitrogen in symbiotic association plant and bacteria, aiming to improve the
availability of nutrients to cropped plants is an alternative to chemical fertilizers
in order to conserve environmental resources and a considerable saving in the
application of nitrogen supplements. The aim of this study was to characterize
the diversity of bacteria present in nodules of cowpea by their morphological
and physiological characteristics in vitro. The experiment was conducted in a
greenhouse and soil microbiology laboratory of Embrapa Semiarid / CPATSA,
Petrolina-PE. Three hundred-seventy bacteria were isolated from five different
soil samples and five cowpea cultivars (IPA206; Marataoã BRS, BRS Mighty;
Canapu tardio and BR17 Gurgueia). The collection of the experiment took place
40 days after germination and the nodules were detached and counted for
subsequent morphological and physiological characterizatiors in YMA medium.
The isolates were grouped into 32 with representatives similarity of more than
80% from these, 165 are of rapid growth, 96 slow growth and the remainder of
intermediate growth. In the assessment of tolerance to different abiotic factors,
such as different temperature ranges, 43 isolates grew at 45°C and for
tolerance to different concentrations of NaCl only 11 isolates showed growth at
the maximum concentration of 35g. With respect to diversity indices, the soils
showed a population diversity, where the soil 3 (with a history of planting
legumes), stood together with the cultivar 3 (BRS Pujante), both for number of
nodules and for diversity of individuals. The results indicate that the established
population in the soil of the Northeast was characterized by high diversity with
regard to morphological and physiological properties.
Keywords: biological N2 fixation, phenotypic characteristics, leguminosae
nodulating bacteria
29
1. INTRODUÇÃO
Depois da água, o nitrogênio (N2) é o principal elemento nutricional
limitante para a produção vegetal nos diferentes ecossistemas existentes,
principalmente para o desenvolvimento das plantas em solos pouco férteis das
regiões tropicais (JEMO et al., 2006).
Paradoxalmente é o elemento mais abundante na atmosfera e o quarto
elemento mais abundante nos vegetais, sendo constituinte essencial de
aminoácidos, proteínas, bases nitrogenadas, ácidos nucléicos, hormônios,
outras moléculas e da clorofila. Na natureza é apenas superado pelo Carbono,
Oxigênio e Hidrogênio, porém a maior parte do Nitrogênio da natureza está na
atmosfera, sob a forma de gás (N2) bem estável, impossibilitando sua absorção
e assimilação por organismos eucariontes, plantas e animais (CARVALHO,
2003).
Somente
algumas
bactérias
conhecidas
como
diazotróficas
desenvolveram um complexo enzimático necessário para transformar o N2 em
amônia, assimilada em aminoácidos e proteínas. A falta de conhecimento
sobre esses microrganismos e sua aplicação fez com que os fertilizantes
nitrogenados se tornassem em um produto essencial para o manejo de culturas
comerciais, disponibilizando o nitrogênio necessário às plantações, porém com
alto custo, dificultando o acesso por parte de pequenos produtores, como é o
caso dos pequenos produtores da região Nordeste do Brasil, em especial as
zonas semiáridas, onde a produção é de subsistência, com o cultivo do feijãocaupi (Vigna unguiculata (L) Walp).
O feijão-caupi é uma leguminosa bem adaptada às condições brasileiras
de solo e clima, além de sua associação simbiótica com bactérias fixadoras de
nitrogênio atmosférico, favorecendo sua produção. (LACERDA et al, 2004).
Neste contexto, a fixação biológica do nitrogênio (FBN) representa uma
alternativa para satisfazer a demanda deste importante nutriente, tanto para
ecossistemas agrícolas como para naturais. Conhecer todos os fatores
implicados na manutenção desta prática de fixação biológica de nitrogênio
(FBN) se torna de suma importância, pois, além de colaborar para uma
agricultura sustentável, auxilia nas investigações acerca da diversidade de
30
espécies que podem representar a veracidade das características da
microbiota dos solos brasileiros (LACERDA & SILVA., 2006).
A comunicação entre a bactéria e a planta para a efetivação da FBN
inicia-se
pela
troca
de
sinais
moleculares
específicos.
Antes
do
estabelecimento da simbiose, o rizóbio é quimiotaticamente atraído para a
rizosfera por compostos, sejam aminoácidos, açúcares ou exudados, pelas
plantas. A partir daí ocorre uma interação química específica entre o rizóbio e a
planta hospedeira, mediada pela produção de flavonóides pelas raízes.
Por especializações ao longo do processo evolutivo, as relações foram
se estreitando e promovendo a formação de estruturas especializadas, os
nódulos, que garantem proteção contra fatores adversos do solo.
A avaliação das características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas
através da diversidade de comunidades microbianas do solo e a riqueza de
espécies que são indicadores determinantes do estado de conservação do
ecossistema e de sua biomassa sendo o primeiro passo para a identificação de
grupos taxonômicos de microrganismos, (TAYLOR et al., 2002).
Neste contexto, fatores como temperatura, disponibilidade de água,
salinidade do solo e técnicas de manejo inadequadas são fatores positivos para
o desencadeamento de degradação de solos determinando a diminuição da
atividade microbiana (BATRA & MANNA, 1997)
Este estudo teve como objetivo estimar a diversidade de bactérias
isoladas de nódulos de feijão-caupi através de caracterização morfo-fiológicas
desses microrganismos.
2. MATERIAL E METODOS
2.1- Coleta, montagem e condução do experimento para obtenção dos isolados
bacterianos
As amostras de solo foram coletadas para o levantamento da população
nativa de rizóbios capazes de nodular feijão-caupi. As áreas de coleta foram
representadas
por
cinco
diferentes
formas
de
manejo
(Tabela1),
geoprocessadas como regiões fisiográficas do Semiárido de Pernambuco no
31
município de Petrolina (09º09’S e 40º22’W), cidade localizada à margem
esquerda do rio São Francisco (EMBRAPA, 2008).
Tabela 1: Descrição das áreas de coleta dos solos, com histórico de manejo distinto.
Solo
Áreas/Município
Parcelas
S1
Volta do Riacho
Chapada com plantio de feijão-caupi
S2
Volta do Riacho
Caatinga nativa de chapada
S3
Volta do Riacho
Baixio com plantio de feijão-caupi
S4
Petrolina CPATSA
Estação experimental com plantio de feijão-caupi
S5
Petrolina CPATSA
Estação experimental com caatinga nativa
As coletas foram realizadas na camada arável de 0-20cm de
profundidade e cada amostra composta foi constituída de quatro sub-amostras,
secas ao ar, destorroadas e passados em peneira de 2mm de malha e
enviadas para o laboratório de solos do CPATSA onde foram pesadas e
posteriormente analisados quanto as suas características químicas e físicas
(Tabela2) seguindo a metodologia recomendada pela Embrapa (1997).
Tabela 2: Características físicas e químicas das amostras de solos das áreas coletadas para
estudo de diversidade
Granulometria
Amostras
(g/kg)
pHa
Solo
Areia
Total Silte Argila H2O - 1:2,5
S1
879,6 62,1 58,3
6,8
S2
868,0 75,3 56,7
6,0
S3
826,5 118,7 54,9
6,6
S4
880,0 64,3 55,7
5,6
6,0
S5
837,4 86,3 76,3
CE
+3
Al
(dS m-1)
0,21
0,47
0,32
0,13
0,13
+2
Ca
+2
Mg
Cmolc. dm-3
0,05
0,05
0,05
0,20
0,05
2,1
2,0
2,4
0,8
2,6
0,8
0,7
1,1
0,5
0,7
+2
Na
Mat.
Org.
P
g/kg-1
(mg/ dm3)
0,02 6,52
0,04 10,76
0,03 2,59
0,02 2,79
0,01 10,96
7
4
5
3
4
Para isolar os rizóbios presente nas amostras dos solos foi realizado um
experimento em casa de vegetação da Embrapa Semiárido, com cinco
cultivares de feijão-caupi como planta isca (IPA206; BRS Marataoã; BRS
Pujante; BRS17 Gurgueia e Canapu Tardio), com delineamento experimental
em blocos casualizados (DBC) em vasos com 3kg de solo.
Para o plantio, as sementes passaram por uma assepsia por imersão em
álcool etílico à 70% por 30 segundos e com hipoclorito de sódio a 1% por 1
minuto. Em seguida, foi realizada uma lavagem seriada com água destilada e
estéril, para posterior semeadura de quatro sementes por vaso, sendo
32
procedido o desbaste aos três dias após a emergência (DAE), deixando-se
duas plantas por vaso. A irrigação foi realizada com água esterilizada sempre
que necessário.
As plantas foram colhidas 40 dias após a semeadura, sendo separada a
parte aérea para determinação dos pesos de massa verde e seca e nitrogênio
total acumulado na parte aérea, por amostra composta. A parte radicular foi
lavada, os nódulos foram retirados, contados e estocados em potes de vidro
contendo sílica gel, para desidratação e preservação.
2.2- Isolamento, purificação e caracterização cultural dos isolados bacterianos
Os nódulos foram reidratados por 30 minutos, sendo em seguida
realizada uma lavagem em álcool etílico a 95% por 30 segundos para quebrar
a tensão superficial e remover bolhas de ar do tecido, seguida de uma
desinfestação em solução a 5% de hipoclorito de sódio por 30 segundos e
posteriormente por 8 lavagens consecutivas em água destilada e esterilizada
(ADE), seguindo descrição de Vincent (1970).
Em seguida, os nódulos foram levemente pressionados com o auxílio de
uma pinça flambada sobre placas de Petri, contendo o meio YMA sólido (FRED
& WAKSMAN, 1928), com manitol, ágar e extrato de levedura, contendo azul
de bromotimol (0,5%) como indicador em um pH de 6,8 a 7,0.
Após o isolamento, as placas foram levadas à câmara incubadora BOD,
com demanda bioquímica de oxigênio controlada e à temperatura de 28ºC para
o crescimento dos isolados, onde foi observado o aparecimento das colônias
nas placas do primeiro ao décimo dia após a repicagem.
Ao mesmo tempo, os isolados bacterianos eram repicados e isolados em
placas com meio contendo vermelho congo como corante com propriedade
fungicida, sendo utilizado para facilitar a diferenciação entre rizóbio e possíveis
contaminantes. O rizóbio crescente no meio é incapaz de absorver o corante, já
o microrganismo considerado contaminante se destaca por absorver a
coloração rosada difusa, sendo facilmente diferenciado.
O inóculo passou por uma purificação serial até obtenção por repicagem
de uma cultura de colônias puras para estocagem e formação da coleção e
posterior caracterização.
33
A caracterização morfológica dos isolados foi realizada inicialmente
utilizando parâmetros do fenótipo segundo Vincent (1970), sendo observado
em cada um dos isolados características das colônias através de testes para
avaliação da velocidade de crescimento, tempo de aparecimento das colônias
(rápidas de 1 a três dias, intermediária de quatro a cinco dias e lentas acima de
seis dias), reação do pH em meio de cultura após o crescimento celular,
(determinado pela alteração da coloração do meio de cultura contendo azul de
bromotimol (os isolados acidificantes tornam o meio amarelo, os alcalinizantes
tornam o meio azulado e os neutros não modificam a coloração do meio de
cultura, permanecendo verde).
O tamanho das colônias foi analisado pelo diâmetro representado em
milímetros; forma da colônia classificada em circular e irregular; presença ou
não de elevação; coloração da colônia em branca e amarela; aparência em
homogênea e heterogênea, forma e transparência da colônia, produção e
quantidade de polissacarídeos (muco), sua elasticidade (observada a partir da
formação ou não de fio, no momento da remoção do muco do meio de cultura
com o auxílio de alça de platina) e aparência referente ao tipo como butírica,
floculosa e viscosa.
Após a purificação e caracterização, as estirpes foram estocadas em
microtubos do tipo eppendorfs contendo um mililitro de meio YMA sem o
corante e com emulsificante (SOMASEGARAN & HOBEN, 1994), contendo
solução
de
glicerina/glicerol
esterilizada
na
composição
de
15%
e
armazenadas em temperaturas inferiores a 10º C, visando à formação de uma
barreira impedindo o fluxo de oxigênio para a manutenção das culturas
estocadas. Os isolados foram identificados por quatro números, referentes ao
solo, cultivar, repetição e nódulo (scr-n). Exemplo: (123-4), o número 1 se
refere ao solo; o número 2 à cultivar; o 3 à repetição e o número 4 referente ao
quarto nódulo dessa repetição.
2.3- Agrupamento morfo-fisiológico dos isolados e cálculos de índices
ecológicos
As características dos isolados foram observadas através de análise
multivariada, disposta em um Dendograma por agrupamento dos genótipos em
34
função de descritores fitotécnicos qualitativos UPGMA – Unweighted PairGroup Method Aritmetic Average (ROHLF., 1992).
O agrupamento dos dados foram obtidos para geração de um coeficiente
de
coincidência
simples
e
matriz binária
(presença
e
ausência
de
características), estabelecendo uma faixa de similaridade por uma matriz
superior a 80% entre as famílias e codificado utilizando o agrupamento com
informações, da distância taxonômica entre as espécies, analisadas por um
algarítmo, pelo coeficiente de Jaccard (JACCARD., 1908), configurando grupos
formados com base nas identificações das características mais relevantes,
sendo elas tempo de crescimento, pH, tamanho da colônia, cor e produção de
muco.
Os
resultados
do
agrupamento
morfológico,
gerados
em
um
Dendograma serviram como base para os cálculos da diversidade dos rizóbios
nos diferentes solos e cultivares utilizados segundo Odum (1988). Para isso,
cada grupo morfológico foi considerado como um táxon, sendo analisados em
gráficos tabulados utilizando os índices de diversidade de Shannon-Weaver
(1949), riqueza de Margalef (1959), dominância de Simpson (1949),
uniformidade de Pielou (1959) e Menhinich (1964), sendo construída uma
árvore filogenética com a finalidade de separar os grupos de isolados com
maior similaridade, através do Software para estimativa da diversidade e
riqueza de espécies, Div ES v2.0 (Rodrigues, 2007).
2.4- Incubação em diferentes faixas de temperatura
Para o teste de tolerância à diferentes faixas de temperatura, as
bactérias isoladas foram repicadas no mesmo meio original YMA e submetidas
à incubação em câmara de incubação BOD às temperaturas de 39, 41, 43 e
45ºC até o aparecimento das colônias ou até o décimo quinto dia após as
repicagens quando se fazia necessário.
A temperatura da câmara de incubação em BOD foi verificada por
termômetro digital externo e interno. Para cada isolado foram utilizadas três
placas referentes a cada repetição. Os isolados que obtiveram crescimento
uniforme nas diferentes temperaturas receberam o sinal positivo (+) e as que
não se mostraram tolerantes receberam um sinal negativo (-).
35
2.5- Resistência a níveis crescentes de NaCl
Três repetições de cada isolado foram testadas quanto à tolerância a
níveis crescentes de NaCl, nas dosagens de 1g; 2,5g; 5g; 10g; 20g; 30g; 35g e
40g em meio YMA sólido a uma temperatura de incubação em BOD de 28ºC
por aproximadamente 15 dias após repicagem quando necessário.
Os isolados que obtiveram crescimento uniforme nas diferentes
concentrações receberam o sinal positivo (+) e as que não se mostraram
tolerantes receberam um sinal negativo (-).
2.6- Solubilização de fosfatos
A avaliação de solubilização de fosfato de cálcio foi realizada através do
isolamento das bactérias em meio salino básico (MSB) desenvolvido por
Sylvestre-Bradley et al (1982), com 10g de dextrose, 2g de extrato de levedura
(colocado após autoclavagem) e 20g de ágar e 5g de CaHPO4 por litro de
meio. Nesse meio foi acrescentada uma solução A de Hoagland (1950) em
volume por litro, contendo 6ml de CaCl2 para formação do cálcio precipitado;
1,6ml de MgSO4.7H2O, 16ml de K2SO4.
Outra solução foi adicionada com 4ml do volume por litro de meio
contendo CuSO4.5H2O; H3BO3; Na2MoO4.2H2O; MnCl2.4H2O; ZnSO4.7H2O e
por fim 4ml do volume por litro de meio de Fe EDTA, sendo o pH ajustado para
6,5.
Os isolados de rizóbio, crescidos em meio YMA, com azul de bromotimol
(pH 6.8-7.0) foram repicados para o meio de solubilização com o auxílio de
uma alça de platina onde retirou-se uma porção do isolado estocado em
glicerina e realizou-se um leve toque no meio de cultura para cada colônia,
onde foram estabelecidas cinco colônias por placa, em três repetições por
isolado.
O diâmetro do halo de solubilização foi medido a cada dois dias, sendo
percebido como uma área translúcida em torno da colônia correspondente à
dissolução do fósforo em meio de cultura sólido contendo fosfato de cálcio,
havendo uma acidificação do meio de dissolução do fósforo (KANG, 2005).
36
Para a avaliação dos isolados utilizou-se um paquímetro digital, por um
período de 15 dias para medição dos halos bem como o diâmetro das colônias.
A partir dessas medidas, foram obtidos os índices de solubilização (IS) de
acordo com Berraquero et al (1976), para cada isolado, através da formula:
IS = mm do halo/ mm da colônia
Onde o IS representa a medida do halo em milímetro dividido pelo valor
em milímetro da colônia. Com base nos índices, os isolados foram classificados
por capacidade de solubilização como baixa (IS < 4), media (4,≤ IS ≥ 9) e alta
(IS > 9). Foram também classificados como precoces, quando o início da
solubilização se deu ate o quarto dia; tardio, com inicio da solubilização a partir
do quarto dia; e não solubilizadores, aqueles que não apresentaram
solubilização visível ate o 15º dia de avaliação.
A avaliação da solubilização de fosfato de alumínio (P-Al), foi realizada
através do isolamento das bactérias em meio YMA sem o corante e com pH 4,5
em sequida transferidas para o meio GL modificado (SYLVESTER-BRADLEY
et al., 1982), contendo 10 g de manitol, 2 g de extrato de levedura, 6 g de
K2HPO4 e 18 g de ágar por litro de meio, acrescido de 5,34 g de AlCl3, para
formar
o
precipitado
de
fosfato
de
alumínio,
que
foi
autoclavado
separadamente antes da sua adição ao meio.
Os isolados de rizóbio, crescidos em meio YMA (pH 6,8) foram
repicados para o meio de solubilização com o auxílio de uma alça de platina,
retirando-se uma porção do isolado armazenado em tubos modelo eppendorfs,
realizando-se um leve toque no meio de cultura para cada colônia.
Foram estabelecidas duas placas por isolado com cinco colônias por
placa. O diâmetro do halo de solubilização foi percebido pela formação de uma
área translúcida em torno da colônia sendo medida a cada três dias, utilizandose um paquímetro digital por um período de 18 dias, cujas medidas dos
diâmetros do halo de solubilização e da colônia foram mensuradas, utilizando
paquímetro digital.
A partir dessas medidas, foram obtidos os Índices de Solubilização (IS),
em mm e para cada isolado através da fórmula: IS = diâmetro do Halo (mm)/
diâmetro da Colônia (mm) (BERRAQUEIRO et al., 1976).
37
Com base nos índices de solubilização, os isolados foram classificados
como isolados com baixa (IS<2), média (2 ≤ IS < 4) e alta (IS>4) capacidade de
solubilização (HARA; OLIVEIRA., 2005).
De acordo com o início da solubilização, os isolados foram classificados
como precoces, quando o início da solubilização se deu até o terceiro dia,
tardios, com início da solubilização a partir do terceiro dia e não solubilizadores,
aqueles que não apresentaram solubilização visível até o décimo oitavo dia de
avaliação.
2.7- Teste de tolerância a diferentes níveis de pH in vitro.
O estudo foi realizado sob condições estéreis, sendo utilizados todos os
370 isolados estocados do trabalho de caracterização morfológica.
Os isolados com características típicas de rizóbio, crescidos em meio
YMA (Fred & Waksman, 1928), com azul de bromotimol e pH 6.8-7.0, foram
repicados para o meio YMA com pH ajustado para meio alcalino (m.al) de 8.89.0 e o meio YMA com pH ajustado para 4.8-5.0 meio ácido (m.ác). Com o
auxilio de uma alça de platina, retirou-se uma porção do isolado estocado em
glicerina e realizou-se um leve toque no meio de cultura para cada colônia.
Foram estabelecidas cinco colônias por placa, em três repetições por
isolado. As observações de crescimento das colônias foram realizadas durante
18 dias.
38
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Analises de número de nódulos e Nitrogênio total acumulado na parte
aérea e radicular.
Os resultados obtidos mostram que houve diferença significativa entre
as cultivares quanto ao número de nódulos (p<0,05) (Tabela 3). O solo S3
apresentou os maiores valores para todas as cultivares estudadas. Este solo foi
coletado em área de pequeno produtor com cultivo de feijão-caupi indicando
que o histórico de solos com cultivo de leguminosas pode determinar a
existência de populações estabelecidas. A cultivar BRS Pujante (C3), plantada
neste mesmo solo (S3), apresentou a maior média de nódulos por planta,
acompanhando o padrão deste solo, com os melhores resultados. Já para o
solo S5 de área de caatinga degradada, o baixo número de nódulos por planta
pode ser explicado pelo histórico de queimadas naturais o que pode influenciar
na presença de microrganismos na área.
O tratamento S4C4 (solo 4, com a cultivar 4 - Canapu tardio) se
diferenciou dos demais tratamentos pelo baixo teor de nitrogênio fixado. Porém
os demais tratamentos não apresentaram diferenças estatísticas nem dentre
nem entre os solos e cultivares tanto para nitrogênio da parte aérea como da
parte radicular. Isto pode ser explicado pela capacidade que o feijão-caupi tem
de se adaptar a diferentes solos.
Observa-se, também, na Tabela 3 que os solos que apresentam baixa
concentração de nódulos tiveram teores de nitrogênio na parte aérea e nas
raízes semelhantes aos solos com altas concentrações de nódulos, sugerindo
que os rizóbios dos solos com baixa nodulação foram tão eficientes quanto
aqueles dos solos com alta nodulação.
39
Tabela 3 – Número de nódulos, nitrogênio total acumulado na parte aérea e raízes das plantas
de feijão-caupi
.
Solo
S1
S1
S1
S1
S1
S2
S2
S2
S2
S2
S3
S3
S3
S3
S3
S4
S4
S4
S4
S4
S5
S5
S5
S5
S5
Cultivar
C1
C2
C3
C4
C5
C1
C2
C3
C4
C5
C1
C2
C3
C4
C5
C1
C2
C3
C4
C5
C1
C2
C3
C4
C5
N° de nódulos
41,0 b
48,0 b
79,0 a
37,3 b
36,0 b
17,3 c
51,6 b
33,0 b
22,3 b
13,6 c
67,6 a
62,3 a
109,0 a
43,3 b
43,0 b
20,3 b
34,3 b
46,3 b
27,6 b
25,3 b
10,6 c
17,0 c
19,6 c
10,3 c
7,0 d
N. parte aérea (g)
1,6 a
1,5 a
1,5 a
1,2 a
1,7 a
1,2 a
1,0 a
1,1 a
1,0 a
1,4 a
1,4 a
1,3 a
1,4 a
1,1 a
1,6 a
1,1 a
1,1 a
1,3 a
0,8 b
1,1 a
1,2 a
1,2 a
1,4 a
1,1 a
1,3 a
N. r aiz (g)
1,6 a
1,3 a
1,3 a
1,1 a
1,0 a
1,5 a
1,2 a
1,4 a
1,3 a
1,3 a
1,2 a
1,3 a
1,2 a
1,1 a
1,2 a
1,3 a
1,1 a
1,3 a
1,3 a
1,0 a
1,4 a
1,5 a
1,4 a
1,4 a
1,4 a
S1 = solo 1; S2 = solo 2; S3 = solo 3; S4 = solo 4 e S5 = solo 5 para C1 = cultivar IPA 206; C2
= cultivar BRS Marataoã; C3 = BRS Pujante; C4 = Canapu tardio e C5 = BRS17 Gurgueia.
Teste de tukey a 5%.
3.2- Isolamento dos nódulos, caracterização e agrupamento morfo-fisiológico
dos isolados
O experimento de captura dos isolados bacterianos utilizando feijãocaupi como planta isca, obteve um total de 2.830 nódulos (Figura 1), onde
apenas cerca de 13% dos nódulos de cada tratamento foram isolados,
totalizando, 370 isolados caracterizados (Anexo 1).
Foi observado que os tratamentos correspondentes ao solo 3, em todas
as cultivares, obtiveram números maiores de nódulos em relação aos demais
solos. Entretanto, ocorreu que o interior dos nódulos possuírem coloração
branca ou róseo claro indicando deficiência de leghemoglobina, fato que pode
ser um indicativo de baixa incidência de rizóbios eficientes. Resultados estes,
40
que contrastam com o sistema de cultivo predominante, pois o solo 3 é de
cultivo ativo de feijão-caupi e, mesmo assim, apresentou um reduzido
crescimento de colônias de bactérias. Isso não foi observado nos outros solos,
que mesmo com um número menor de nódulos, todos apresentaram coloração
avermelhada em seu interior, indicativo de presença de bactérias do grupo
rizóbio, alem de apresentar uma boa produção de colônias.
Nodulação
327
350
nº de N odulos
300
237
250
203
187
200
144 155
150 123
100
139
103
62
61
50
129
108
83
67
59
51
42
130
112
99
51
76
51
31
c5s5
c5s4
c5s3
c5s2
c5s1
c4s5
c4s4
c4s3
c4s2
c4s1
c3s5
c3s4
c3s3
c3s2
c3s1
c2s5
c2s4
c2s3
c2s2
c2s1
c1s5
c1s4
c1s3
c1s2
c1s1
0
Cultivar x Solo
Figura 1: Número de nódulos por planta de feijão-caupi. Relação: n° de nódulos por tratamento,
sendo: c1 a cultivar IPA 206; c2 a cultivar BRS Marataoã; c3 a cultivar BRS Pujante; c4 a cultivar Canapu
Tardio e c5 a cultivar BRS Gurgueia e as siglas s1 Solo 1; s2 solo 2; s3 solo 3; s4 solo 4 e s5 solo 5.
Dos 370 isolados caracterizados da zona Semiárida de Pernambuco, foi
gerada uma árvore com dados fenotípicos das colônias onde foram
identificados 32 grupos morfológicos com similaridade (distância entre os
isolados) superior a 80%, referentes às características morfológicas de tempo
de crescimento, alteração do pH do meio de cultura, tamanho e coloração das
colônias e quantidade de muco produzido (Tabela 4).
Entre os 32 agrupamentos formados no Dendograma (Figura 2), nove
grupos, com um total de 165 isolados bacterianos, foram formados por
bactérias com característica de crescimento rápido (1 a 3 dias) representadas
em 44,6% dos isolados obtidos, todas produtoras de expolissacarídeo (muco
viscoso)
Esta predominância de isolados de crescimento rápido contrasta com o
conhecimento corrente de que as bactérias que nodulam feijão-caupi são
41
pertencentes ao gênero Bradyrhizobium spp que por sua vez compreende,
geralmente, estirpes de crescimento lento (MOREIRA., 2008)
Entretanto, não foi o comportamento predominante nos isolados obtidos,
visto que os dados sugerem que, dentre os grupos de rizóbio que nodulam o
feijão-caupi, exista grupos significativos de isolados diferentes do que tem sido
definido como Bradyrhizobium spp segundo Zhang et al ( 2007).
Grupos
G1, G2, G3,
G4, G5, G6
G7 e G8
G9, G10,
G11, G12
e G13
G14, G15,
G16, G17
G18, G19,
G20 e G21
G22, G23,
G24, G25
e G26
G27, G28,
G29, G30
e G31
G32
0,25
0,45
0,65
0,85
100
Figura 2: Dendograma dos 32 grupos morfológicos de isolados nativos do semiárido
pernambucano
Destes 32 grupos com características morfológicas diferentes, 73%
apresentaram crescimento satisfatório em meio de cultivo, provocando
acidificação do meio, 16% com bom desenvolvimento em pH neutro e 11%
42
promoveram alcalinização do meio de cultura. Quatorze grupos, com um total
de 109 isolados, apresentaram crescimento intermediário (4 a 5 dias) formando
um total de 29,5% dos isolados. Os nove grupos restantes, totalizam 96
isolados de crescimento lento (acima de 6 dias) correspondendo a 26% do total
de bactérias crescidas. Para Norris (1965) em trabalho com feijão-caupi em
solos da África, para Thies et al (1991) em estudo de eficiência simbiótica de
Feijão-caupi em solos salinos e para Hara & Oliveira (2007) caracterizando a
ecologia de rizóbios em solos ácido e álicos, essa característica de tempo de
crescimento lento representa uma forma ancestral dos atuais rizóbios que
estão associados á leguminosas tropicais que apresentam baixa eficiência
simbiótica e habitam solos ácidos de baixa fertilidade.
Tabela 4: Caracterização dos grupos formados com similaridade superior a 80%
Grupos
Número
de
Indivíduos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
4
6
5
20
5
9
2
79
11
1
49
5
3
5
2
8
13
25
7
4
3
2
2
26
13
1
9
1
3
20
21
Tempo de
Crescimento
Intermediário
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Lento
Intermediário
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Características Culturais
Tamanho da
pH
Colônia
Coloração
Ácido
>2
Branca
Ácido
>2
Branca
Ácido
Puntiforme
Branca
Ácido
2
Amarela
Neutro
2
Branca
Ácido
Puntiforme
Amarela
Ácido
>2
Amarela
Ácido
2
Amarela
Ácido
2
Branca
Neutro
2
Amarela
Ácido
>2
Amarela
Ácido
>2
Amarela
Neutro
2
Branca
Neutro
2
Branca
Alcalino
2
Branca
Ácido
Puntiforme
Amarela
Ácido
Puntiforme
Branca
Neutro
Puntiforme
Branca
Alcalino
Puntiforme
Branca
Alcalino
2
Branca
Neutro
2
Branca
Neutro
2
Branca
Ácido
2
Branca
Alcalino
Puntiforme
Branca
Neutro
Puntiforme
Branca
Alcalino
Puntiforme
Amarela
Ácido
Puntiforme
Branca
Neutro
Puntiforme
Amarela
Neutro
Puntiforme
Branca
Ácido
Puntiforme
Amarela
Ácido
Puntiforme
Branca
Quantidade
de muco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
43
32
6
Rápido
Ácido
Puntiforme
Amarela
Pouco
Representação de famílias com número de indivíduos; características de tempo de crescimento
(RAP = rápido, INT = intermediário e LEN = lento), alteração de pH do meio de cultura (AC =
ácido, NE = neutro e AL = alcalino), tamanho das colônias (PUNT = colônias puntiformes, 2 =
dois milímetros e > 2 = maiores de dois milímetros)
A caracterização dos isolados que nodularam feijão-caupi, de acordo
com a morfologia das colônias, permitiu também, encontrar diferenças
significativas que foram utilizadas para o agrupamento dos mesmos.
No grupo de crescimento rápido foram evidenciados alguns isolados que
se destacaram dos demais por apresentar crescimento evidente em meio de
cultivo em período menor que 24 horas. Entretanto, dentre os isolados obtidos
dos solos estudados o maior número de isolados apresentou crescimento
rápido, acidificando o meio de cultura.
Estes resultados diferem daqueles encontrados por Martins et al. (1997)
em solos da mesma região em que este estudo foi realizado, nos quais os
isolados de rizóbio obtidos apresentaram crescimento lento com alcalinização
do meio, sugerindo que a diversidade morfológica das colônias é uma
indicação das diferenças fundamentais entre isolados e pode ser um indicio da
diversidade genética dessas bactérias nos solos do semi-árido.
As características dos resultados do agrupamento apresentam respostas
fenotípicas distribuídas em diferentes grupos conforme Moreira e Pereira
(2001). Este resultado confirma a especificidade do feijão-caupi e concorda
com os valores encontrados por Lima et al (2005), Soares et al (2006) e
Medeiros et al (2009), avaliando a diversidade fenotípica de rizóbios em
diversos ecossistemas, utilizando o feijão caupi como planta isca.
Observa-se no presente trabalho, que as bactérias com hábito de
crescimento rápido são as que mais produzem muco e acidificam o meio de
cultura (Figura 3). Resultados semelhantes aos encontrados por Sprent (1994)
e Stamford et al (1996) em isolamento de rizóbio em feijão-caupi, soja e
jacatupé em solos da zona da mata pernambucana, onde foi encontrado em
maior freqüência rizobios de crescimento rápido e que acidificam o meio, alem
de apresentarem maior especificidade hospedeira.
As bactérias consideradas como lentas nesta caracterização apresentam
baixa produção de muco. Uma característica que ocorreu nesta coleção pouco
44
comum nos estudos de isolados bacterianos presentes em nódulos de
leguminosas, foi a de isolados lentos acidificarem o meio YMA.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Pouco
Muito
Rapidas
Acidas
Pouco
Muito
Intermediaria
Neutras
Pouco
Muito
Lentas
Alcalinas
Figura 3: Freqüência de isolados bacterianos em relação ao tempo de crescimento, produção
de muco e alteração de pH do meio de cultura.
Os resultados obtidos estão de acordo com Santos et al (2007) em
estudos com solos do sertão que obtiveram um total de 433 isolados de rizóbio,
formados por colônias de crescimento com dois dias, caracterizando estirpes
de crescimento rápido, confirmando que os rizóbios de crescimento rápido são
mais comuns em regiões áridas e semiáridas, constituindo esta característica
uma estratégia de sobrevivência, já que são mais tolerantes à seca que os de
crescimento lento e se multiplicam mais rápido, em um curto espaço de tempo
úmido, o que se explica sua maior freqüência.
Para os dados do agrupamento morfológico foram utilizados os índices
de similaridade SM (Tabela 5), que atribui pesos iguais tanto à presença
quanto a ausência de determinada característica, analisados pela diversidade
de Shannon-weaver, abundância de Simpsom e riqueza de Margalef e
Menhinik.
Estes índices foram utilizados em função de serem relativamente
simples e permitirem comparações de amostras com diferentes tamanhos de
populações (ODUM, 1988). Sendo que o de Simpson considera a abundância
45
das espécies mais comuns, enquanto o de Shannon é influenciado mais pela
riqueza de espécies (MAGURRAN, 1988).
Tabela 5: índices de diversidade dos solos e das cultivares.
SOLO
I. Shannon
S-1
Margalef
Menhinich
Riqueza
Simpson
S1
S2
S3
S4
S5
CULTIVAR
3.68
2.17
2.17
2.70
3.28
I. Shannon
18
5
6
9
11
S-1
4.17
1.16
1.39
2.08
2.59
Margalef
2.19
0.69
0.81
1.15
1.43
Menhinich
9.6
2.6
3.2
4.8
5.9
Riqueza
0.11
0.25
0.32
0.21
0.13
Simpson
3,43
2.82
3.06
3.48
3.33
12
10
12
13
12
2,78
2.32
2.78
3.01
2.82
1,5
1.27
1.5
1.62
1.55
6,4
5.3
6.4
6.9
6.5
0,11
0.21
0.15
0.11
0.11
IPA 206
Marataoã
Pujante
Canapu Tardio
BR17 Gurgueia
Os índices de Shannon e de Riqueza para os solos S1 e S5 foram os de
maiores valores, indicando uma maior diversidade de população e de
indivíduos por população. Já para os solos S2 e S3 todos os índices foram os
de menores valores encontrados, podendo ser um indício devido à ausência de
vegetação, que pode diminuir a diversidade de rizóbio capazes de nodular o
feijão-caupi, verificado principalmente pelo índice de Margalef. Isso mostra uma
tendência de que a espécie vegetal tem de selecionar o rizóbio e no caso de
monoculturas existe limitação e restrição à diversidade dessas bactérias, sendo
observado também em trabalho de Hameed et al (2004) com estudos das
características morfo-fisiológicas em nível de DNA e similaridade.
Segundo Berger & Parker (1970) e Simpson (1949) a dominância reflete
a probabilidade de dois indivíduos escolhidos ao acaso na comunidade
pertencerem à mesma espécie. Para esses autores, quanto mais alto for o
resultado, maior a probabilidade de os indivíduos serem da mesma espécie, ou
seja maior a dominância e menor a diversidade.
Verificou-se
também,
que
essa
dominância
foi
inversamente
proporcional à equitabilidade. Santos (2001) relata que quanto menor a
dominância, maior a equitabilidade de espécies de uma comunidade, mais
estável e com maior resistência aos impactos ambientais que possa vir a
sofrer. A equitabilidade representa a situação hipotética em que todas as
46
espécies
encontram-se
com
a
mesma
proporção
na
comunidade
(MAGURRAN., 1988).
Em ambientes com limitações, como o clima da região semiárida, é
preferível o uso de leguminosas como o feijão-caupi, com capacidade de
formar simbiose com uma quantidade maior de grupos de rizóbios, pela
promiscuidade ou baixa especificidade e assim ampliar a possibilidade dos
benefícios da possível fixação simbiótica do nitrogênio.
Em relação ao índice geral de riqueza total para os índices ecológicos, o
qual não considera solo ou cultivar separadamente, foi visto que para Shannon
o valor encontrado foi de 4.26 e Pielou 0.860 com riqueza total de 3, nesse
índice geral o cálculo foi feito considerando a coleção total 370 isolados com
32 grupos morfológicos, indicando valores para a incidência de populações de
rizobio na região em estudo.
Com base nestes índices gerais foi possível fazer uma comparação
entre os solos e as cultivares que apresentaram índices próximos do regional
(área estudada). A riqueza total é o índice que diz respeito ao número de
espécies (morfotipo) presentes numa determinada região. Nesse caso, cada
grupo representa e corresponde a uma espécie, Shannon é o índice de
diversidade e Pielou é o índice de uniformidade. Quanto mais perto de 1 mais
uniforme são as espécies ou populações de uma determinada região, se o
índice for baixo, próximo de zero, diz-se que uma espécie está predominando
na região.
A caracterização morfológica possibilitou um maior conhecimento da
população de rizóbio dos solos coletados neste trabalho, e o agrupamento
facilitou o desenvolvimento das confirmações para seleção em eficiência na
fixação de Nitrogênio em variedades de feijão-caupi. Segundo Hameed et al
(2004), o estudo das características fisiológicas e morfofisiológicas revela uma
diversidade bastante ampla dos isolados de rizóbio e costuma estar
relacionado com estudos em nível de DNA, sendo estes dados importantes,
uma vez que os conhecimentos das comunidades nativas por meio destas
técnicas revelam-se fundamentais para se conhecer a diversidade das
espécies.
47
3.4- Caracterização fisiológica dos isolados
Neste estudo, avaliando a tolerância das estirpes às diferentes
temperaturas, foi observado que a relação de crescimento das colônias à
temperatura máxima (TM) de 45ºC se deu predominantemente nos solos de
Caatinga nativa, sendo facilmente interpretado por se referir aos solos onde
temperaturas acima de 40ºC são freqüentemente observadas em sua
superfície.
Dentre os 370 isolados, 343 (93 %) cresceram a 39ºC, 249 (67%) a
41ºC, 125 (34%) a 43ºC e 43 isolados, representando 11,6%, toleraram a
temperatura de 45ºC. Das 43 bactérias tolerantes a 45ºC, 18 são de
crescimento lento, 14 de crescimento rápido e 11 de crescimento intermediário
(Tabela 6). Esse perfil de comportamento em meio de cultivo YMA é típico de
bactérias dos gêneros Rhizobium, Sinorhizobium e Bradyrhizobium em solos
com características de clima quente e seco e com tolerância às temperaturas
elevadas, fato que ocorre nas regiões estudadas, onde temperaturas acima de
40°C são freqüentemente observadas na superfície do solo (Lal, 1993). Essas
temperaturas elevadas têm sido responsáveis por limitar a nodulação e a
possível fixação de nitrogênio (HUNGRIA & VARGAS, 2000).
Apesar de não existir forte correlação da seleção in vitro de rizóbios
tolerantes a temperaturas elevadas e seus resultados em testes de campo, tal
característica pode ser muito útil para o melhoramento de inoculantes que em
geral contem isolados de rizóbio eficientes, mas sensíveis a temperatura
elevada (HUNG et al., 2005).
Dentre os isolados tolerantes a temperatura máxima (TM), 25 (58%) são
de bactérias secas ou produtoras de pouco muco e 18 (42%) são de bactérias
produtoras de grande quantidade de muco.
Dentre os 370 isolados bacterianos, dos 43 isolados tolerantes a TM de
45ºC, foi visto um maior número de bactérias lentas tolerantes, já para
tolerância a níveis crescentes de NaCl foi visto na concentração máxima (CM)
de 3,5% (35g NaCl) apenas uma bactéria lenta tolerante e para solubilização
de fosfato um número elevado de bactérias rápidas seguido de bactérias
lentas.
48
Em relação aos estudos dos efeitos da salinidade (alta concentração de
NaCl) em meio de cultivo, todas as 370 estirpes foram inicialmente cultivadas a
0,02% de NaCl a 28ºC, onde 100% apresentou crescimento satisfatório em
meio YMA. Nas concentrações de 1; 2,5 e 5 gramas de NaCl o índice de
crescimento foi maior que 90%. Observou-se ainda que à medida que a
concentração de NaCl aumentou ocorreu uma redução na porcentagem de
isolados tolerantes: sendo a 10g de NaCl a porcentagem de crescimento de
83%, com 307 bactérias crescidas; a 20g o percentual teve uma acentuada
queda para 35,4% com 131 bactérias; com 25g caiu para 21%, sendo 77
bactérias; com 30g apenas 38 bactérias cresceram, representando 10%, e na
concentração com 35g, caracterizada como a concentração máxima tolerada
(CMT) de NaCl, apresentou apenas 3% de crescimento, correspondendo a 10
isolados tolerantes à CMT. Destes dez isolados, dois apresentaram
crescimento rápido, cinco com crescimento lento e três com crescimento
intermediário (Tabela 6), sendo cinco destas, colônias de característica seca e
cinco com colônias produtoras de grande quantidade de muco.
Eaglesham et al (1987) estudando aspectos fisiológicos e bioquímicos
da diversidade de Bradyhizobium spp isolados de feijão-caupi em solos do
oeste africano encontraram somente uma estirpe capaz de resistir a 1% de
NaCl, dentre 79 estirpes estudadas. Para Graham (2000), muitas espécies de
rizóbio podem tolerar acima de 2% de NaCl no meio de cultura. O que
corrobora com os resultados obtidos onde foi observado tolerância superior a
essa concentração, no caso 35g de NaCl (3,5%).
As faixas de tolerâncias observadas variaram de 0 a 35g L-1 de NaCl,
sendo as mais tolerantes as de característica morfológica de crescimento
rápido e produção de muco o que corrobora com os dados obtidos por
Nóbrega, et al (2004) e Frioni, et al (2001) de que espécies de rizóbio de
crescimento rápido são mais tolerantes a altas concentrações salinas em meio
de cultura, quando comparadas a espécies de crescimento lento, pois
produzem mais polissacarídeos extracelulares, que envolvem as células
bacterianas, diminuindo o contato da superfície celular com o meio salino,
proporcionando maior resistência da célula ao efeito osmótico.
49
No entanto, neste estudo foi visto também estirpes de crescimento
rápido e lento entre as mais tolerantes e entre as mais sensíveis, como
também observado por Matsuda et al. (2002b).
A relação de tolerância à salinidade vem sendo estudada por diversos
autores que afirmam que o nível de tolerância de tais bactérias fixadoras de
nitrogênio testadas em solos áridos e semiáridos encontra-se numa escala
entre 0,02 gramas que se caracteriza por ser o nível ideal de crescimento em
meio de cultura e 60 g L-1 de NaCl o mais alto nível de tolerância encontrado
(FARELEIRA et al., 2007), corroborando com o presente trabalho onde foi visto
o crescimento regular dentro desta escala.
3.6- Teste de solubilização de fosfato de cálcio
Entre os 370 isolados avaliados, 238 correspondentes a 64%,
apresentaram capacidade de solubilizar o fosfato de cálcio, formando em torno
das colônias um halo facilmente visível por contraste com o meio opaco (Figura
4). 8 % dos isolados bacterianos se apresentaram com índices de solubilização
(IS < 4) considerados como de baixa solubilização, 25% com (4 ≤ IS ≤ 9)
considerados de média capacidade de solubilização e 20% dos isolados com
característica de solubilização (IS > 9), considerados como isolados de alta
capacidade solubilizadora. Estudos evidenciam que a capacidade dos isolados
em solubilizar o P-Ca está correlacionado com a diminuição do pH do meio
decorrente da formação de ácidos orgânicos, o que pode favorecer o
desenvolvimento de rizóbios nessa condição (MIKANOVÁ e NOVÁKOVÁ.,
2002).
Figura 4: Formação dos halos de solubilização de fosfato de cálcio
50
O índice de solubilização variou de 1,0 a 14,3. Houve pouca variação
quanto ao potencial de solubilização desses isolados, não apresentando
diferenças significativas no crescimento do halo durante os dias observados,
resultados compatíveis com os observados por Kumar et al (2001); Kang et al
(2002) e Souchie et al (2005) em trabalhos com isolados bacterianos
provenientes de solos da Amazônia testando a solubilização de fosfato de
cálcio e alumínio tóxico in vitro.
Referente à classificação do aparecimento das colônias, foram
observadas bactérias solubilizadoras após 24 h de incubação. Estas bactérias
foram isoladas dos solos S2 e S5 e classificadas como precoces; as bactérias
dos demais solos (S1, S3 e S4) não apresentaram solubilização e sim um halo
de solubilização tardio, iniciando a solubilização após o quarto dia de
repicagem.
25
Número de isolados
bacterianos
20
15
10
5
0
39°C
41°C
43°C
45°C
39°C
41°C
Solubilizadora
43°C
45°C
Tolerante
Caracteristicas morfo-fisiologicas
1g
10g
20g
25g
30g
35g
Figura 5: Freqüência dos isolados in vitro, a solubilização de fosfato de cálcio, tolerância a
diferentes faixas de temperatura e a níveis crescentes de NaCl.
Os valores obtidos contrastam com os de Silva Filho & Vidor (2000) que
observaram índices variando de 1,06 a 1,24 com isolados de feijão guandu em
solos ácidos de Iranduba, Amazonas.
Os isolados oriundos dos solos de Caatinga nativa apresentaram uma
maior eficiência na solubilização de fosfato, com índices expressivos que são
diferentes daqueles encontrados na literatura, sugerindo uma diversificação
desses microrganismos, ou sua adaptação às condições edafoclimáticas do
51
semi-árido, detectando-se assim bactérias capazes de metabolizar fontes de
fosfato inorgânico adicionado ao meio de cultura.
Observa-se que as bactérias solubilizadoras de fosfato de cálcio
apresentaram uma melhor resposta tanto para tolerância a concentrações de
NaCl e diferentes faixas de temperatura (Figura 5), destacando-se um número
baixo de isolados bacterianos tolerantes a maior concentração de NaCl com
35g e, ao mesmo tempo, tolerante à máxima faixa de temperatura de 45°C e
solubilizadoras de fosfato, totalizando apenas cinco isolados com essas
características.
Para os testes de solubilização de fosfato de alumínio, entre os 370
isolados avaliados, 300 foram tolerantes a presença de fosfato de alumínio no
meio (Figura 4), porém nenhum isolado foi capaz de solubilizá-lo, indicando
que as bactérias são apenas tolerantes a presença do Al tóxico e sua acidez, já
que, segundo HARA e OLIVEIRA (2005) a produção de ácidos orgânicos por
microrganismos e a liberação de íons de H+ são importantes mecanismos para
solubilizar o AlPO4, que, após a solubilização, o alumínio é liberado para o
meio na forma monomérica (AL+3), que poderia causar toxicidade aos isolados
bacterianos.
Tabela 6: Relação de características de tempo de crescimento em relação a índices de
tolerância a temperaturas, salinidade e solubilização de fosfatos
Características morfo-fisiológicas
Temperaturas
NaCl
Solubilização
28°C 43°C 45°C 0,02% 1% 2,5% 3,5% P-Ca P-Al
Rápidas
165 82
14
165 69 42
2
104
171
Intermediarias 109 23
11
109 48 25
3
46
79
Lentas
96
20
18
96
31 10
5
88
50
Tempo de
crescimento
Silva Filho & Vidor (2000) também detectaram baixa incidência de
solubilizadores de fosfato de alumínio. Esses autores sugerem que tal fato
pode ser atribuído a seleção dos isolados durante o isolamento, além das
características intrínsecas de solubilidade dos fosfatos. Mostrando que a não
solubilização desse fosfato se deve ao estado físico do meio de cultivo sólido
em relação ao líquido do que à real incapacidade dos isolados de solubilizarem
esse fosfato. Estes resultados contrastam com os obtidos por Raij (1991) onde
a solubilização foi efetivada com índices elevados e corroboram com os de
52
Toro et al (1996) e HARA e OLIVEIRA (2005), onde variações foram
encontradas na tolerância à acidez do meio de solubilização de fosfato de
alumínio pelos isolados de rizóbio.
Todos os isolados que toleraram P-Al (fosfato de alumínio) solubilizaram
P-Ca (fosfato de cálcio) corroborando com os resultados reportados por Hara e
Oliveira (2007) e Silva Filho & Vidor (2000) que registraram baixa ocorrência de
isolados que solubilizaram ambos os fosfatos.
3.5- Teste de mudanças do pH in vitro
Das 370 bactérias estudadas, 269 apresentaram características
morfológicas de pH ácido obtidas pela modificação da cor do meio de verde
para amarelo, 61 apresentavam características de neutralidade, permanecendo
com meio verde e 40 bactérias com alteração da cor do meio de verde para
azul.
Nesse contexto, após a repicagem das bactérias no meio com ajuste de
pH para 4.8-5 foi observado que 94,1% das bactérias cresceram no meio de
forma regular, sendo 348 bactérias tolerantes a alteração de pH ácido in vitro e,
para o meio ajustado em 8.8-9, foi observado um crescimento regular de 93,0%
representadas por 344 bactérias tolerantes a ajuste de pH para alcalino.
O presente estudo mostrou que as bactérias que apresentavam
crescimento regular em meio neutro com características morfológicas ácidas
cresceram também em meio alcalino e as crescidas em meio neutro com
características morfológicas alcalinas obtiveram crescimento regular em meio
ácido, mostrando assim a adaptabilidade em diferentes faixas de pH.
53
4. CONCLUSÕES
A coleção de isolados representada por 32 grupos de isolados
bacterianos mostra diversidade de características morfo-fisiológicas.
Cinco isolados bacterianos mostraram concomitantemente capacidade
para crescer em 35g de NaCl, 45°C e solubilizar fo sfato de cálcio, indicando
potencial para estudos de eficiência simbiótica para a cultura do feijão-caupi
em ambientes tropicais com temperaturas elevadas, problemas de salinização
e pobres em fosforo.
54
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BATRA, L.; MANNA, M. C. Dehydrogenase activity and microbial biomass
carbon in salt-affected soils of semiarid and arid regions. Arid Soil and
Rehabilitation, v.11, p.295-303, 1997.
BERGER, W.H. & PARKER, F.L. (1970). Diversity of planktonic foraminifera in
deep-Sea sediments. Science, 168. 1345-1347.
BERRAQUEIRO,F.R.; BAYA,A.M.; CORMENZANA,A.R. Estabelecimento de
índices para el estúdio de la solubilizacion de fosfatos por bactérias del suelo.
Ars Pharmaceutica, v.17, p.399-406, 1976
CARVALHO, F.G. 2003. Variabilidade de Isolados de Estirpes de
Bradyrhizobium spp. recomendadas para cultura da soja. Tese de Doutorado.
Universidade Federal do Rio.
EAGLESHAM, A. R. J.; STOWERS, M. D.; MAINA, M. L.; GOLDMAN, B. J.;
SINCLAIR, M. J.; AYANABA, A. Physiological and Biochemical Aspects of
Diversity of Bradyhizobium sp. (Vigna) from three West African Soils. Soil
Biology and Biochemistry, Oxford, v.19, p.575-581, 1987
EMBRAPA-Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria. Manual
métodos de análise de solo. 2. ed. Brasilia: Embrapa/ CNPS,212p. 1997.
de
EMBRAPA-Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária/ CPATSA Semiárido.
Boletim técnico. Áreas geoprocessadas e monitoramento climático. PetrolinaPE. 2008. www.cpatsa.embrapa.br. Acesso: 22.01.2011
FARELEIRA, P.; MATOSI, N.; FERREIRA, E.; MARQUES, J.F. Tolerância ao
sal e às altas temperaturas de estirpes de Sinorhizobium meliloti provenientes
de
zonas
secas
do
Alentejo.
2007
Dispornível
em:
http://www.iniap.minagricultura.pt/ficheiros_pu blic/Microsoft Word public
208.pdf. Acesso em: 02 jul 2010.
FRED, E.B. & WAKSMAN, S.A. Laboratory manual of general microbiology.
New York, McGraw-Hill Book Company, 1928. 143p.
FRIONI, L.; RODRIGUEZ, M.; MEERHOFF, M. Differentiation of rhizobia
isolated from native legume trees in Uruguay. Applied Soil Ecology,
Amsterdam, v. 16, n. 3, p. 275-282, Mar. 2001.
GRAHAM, P. H.; VANCE, C. P. Nitrogen fixation in perpective: na overview of
research and extension needs. Field Crops Research, v.65, p. 93-106, 2000.
Grande do Sul. Porto Alegre, Rio Grande do Sul. 104 p.
HAMEED, S.; YASMIN, S.; MALIK, K. A.; ZAFAR, Y.; HAFEEZ, F. Y.
Rhizobium, Bradyrhizobium and Agrobacterium strain isolated from cultivated
legumes. Biology and Fertility of Soils, v. 39, n. 3, p. 179-185, 2004.
55
HARA, F. A. S.; OLIVEIRA, L. A. Características Fisiologicas de isolados
oriundos de solos ácidos e alicos de Presidente Figueiredo, Amazonas. Acta
Amazônica, v. 34, n. 3, p. 231-298, 2005.
HARA, F. A. dos S.; OLIVEIRA, L. A. de. Características ecológicas de isolados
de rizóbios oriundos de solos ácidos e álicos de Presidente Figueiredo,
Amazonas. Acta Amazônica, v.34, p.343 357, 2007.
HOAGLAND, D.R. & ARNON, D.I. The water culture method of growing plants
without soil. Berkeley, University. of California, 1950. 32p.
HUNG, M. H.; BHAGWATH, A. A.; SHEN, F. T.; DEVASYA, R. P.; YOUNG, C.
C. Indigenous rhizobia associated with native shrubby legumes in Taiwan.
Pedobiologia, v. 49, p. 577- 584, 2005.
HUNGRIA, M.; VARGAS, M.A.T. Environmental factors affecting N2 fixation in
grain legumes in tropics, with an emphasis on Brazil, Field Crop Res v. 65, p.
151–164, 2000.
JACCARD, P. 1908. Nouvelles recherches sur la distribution florale. Bul. Soc.
Vaudoise Sci. Nat. 44:223–270.
JEMO, M.; ABAIDOO, R. C.; NOLTE, C.; HORST, W. J. Genotypic avariation
for phosphorus uptake and dinitrogen fixation in cowpea on low-phosphorus
soils of southern Cameroon. Journal of Plant Nutrition and Soil Science,
v.169, n.6, p.816-825, 2006.
KANG, S. C.; HÁ, C. G.; LEE, T. G.; MAHESHWARI, D. K. Solubilization of
insoluble inorganic phosplantes by a soil-inhabiting fungos Fomitopsis sp. PS
102. Current Science. Bangalore, v.82, n.4, p.439-442, fev. 2002.
KUMAR, V.; BEHL, R. K.; NARULA, N. Establishment of phosphate-solubilizing
strains of Azotobacter chroococcum in the rhizosphere and their effect on wheat
cultivars sunder greenhouse conditions. Microbiological Research, Jena,
v.156, n.1, p.87-93, 2001.
LACERDA, A. M.; MOREIRA, F. M. S.; ANDRADE, M. J. B.; SOARES, A. L. L.
Efeitos de estirpes de rizobio sobre a nodulação e produtividade do feijãocaupi. Revista Ceres, v. 51, n.293, p.67-82, 2004
LACERDA, N. B.; SILVA, J. R. C. Efeitos da erosão e de técnica de manejo
sobre a produção do algodoeiro. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e
Ambiental, v.10, n.4, p.820-827, 2006.
LAL, R. The role of no-till farming in sustainable agriculture in tropics. Anais do
I Encontro Latinoamericano sobre Plantio Direto na Pequena Propriedade,
IAPAR, Ponta Grossa/Brazil, 22– 26 Novembro, pp. 29–62, 1993.
56
LIMA, A. S.; PEREIRA, J. P. A. R.; MOREIRA, F. M. D. Phenotypic diversity
and symbiotic efficiency of Bradyrhizobium spp. strains from Amazonian soils.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.40, n.11, p.1095-1104, 2005.
MAGURRAN, A. E. Ecological diversity and its measurement. Magurran, A. E.,
eds. 177p. 1988.
MARGALEF, R. (1958). Information theory in ecology. Gen. Systems. 3: 36-71.
MARTINS, L. M. V.; NEVES, M. C. P.; RUMJANEK, N. G. Growth
characteristics and symbiotic efficiency of rhizobia isolated from cupi nodules of
the north-east region of Brasil. Soil Biology and Biochemistry, v.29, n.5/6,
1997, p.1005-1010.
MATSUDA, A.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Sobrevivência de
Bradyrhizobium e Azorhizobium em mistura de solo contaminadas com metais
pesados. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v. 26, n. 1, p. 249256, jan./mar. 2002b.
MEDEIROS, E. V.; MARTINS, C. M.; LIMA, J. A. M.; FERNANDES, Y. T. D.;
OLIVEIRA, V. R.; BORGES, W. L. Diversidade morfologica de rizobios isolados
de caupi cultivado em solos do Estado do Rio Grande do Norte. Acta
Scientiarum. Agronomy, v. 31, n. 3, p. 529-535, 2009.
MENHINICK, E. F. (1964). A comparison of some species individuals diversity
indices applied to samples of field insects. Ecology, 45: 859-861.
MIKANOVÁ, O.; NOVAKOVÁ, J. Evaluation of the P-solubilizing activity of soil
microorganisms and its sensitivity to soluble phosphate. Rostlinná Výroba, v.
48, n. p, p. 397-400, 2002.
MOREIRA, F.M.S.; PEREIRA, E.G. Microsymbionts: Rhizobia. In: SWIFT, M.;
BIGNELL, D. (Ed.). Standard methods for assessment of soil biodiversity
and land use practice. Bogor, Indonesia, 2001. 34p.
MOREIRA, F. M. S. Bactérias fixadoras de nitrogênio que nodulam
Leguminosae. In: MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O.; BRUSSAARD, L. (Ed.).
Biodiversidade do solo em ecossistemas brasileiros. Lavras: UFLA, 2008.
p.621 680.
NÓBREGA, R. S. A.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O.; LIMA, A. S.
Caracterização fenotípica e diversidade de bactérias diazotróficas associativas
isoladas de solos em reabilitação após a mineração de bauxita. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, n. 28, n. 2, p. 269-279, mar./abr. 2004.
NORRIS, D. O. T.; Mannetje, L. The symbiotic specialization of African Trifolium
spp. in relation to their taxonomy and their agronomic use. East African
Agricultural and Forest Journal, Nairobi, v.29, p214-235. 1965.
57
ODUM, Eugene P. (1988). Ecologia. Rio de Janeiro, Guanabara
ÖHLINGER, R. Bestimmung der Bodenatmung im Laborversuch. In:
SCHINNER, F.; ÖHLINGER, R.;
KANDELER, E.; MARGESIN, R. (Ed.).
Bodenbiologische Arbeitsmethoden. Berlin: Springer-Verlag, 1993.
PIELOU, E. C., 1959. J. Ecol., An Introduction to Mathematical Ecology. Wiley,
New York. 47, 607-613.
RAIJ, B. van. Fertilidade do solo e adubação. São Paulo: Ceres, 1991. 347p.
ROHLF. The analysis of shape variation using ordinations of fitted functions.
Pp. 95-112, in Sorensen, J. T. and Foottit, R. (eds.) Ordinations in the study of
morphology, evolution and syste¬matics of insects: applications and
quantitative genetic rationals. Elsevier: Amsterdam, 418 pp 1992.
RODRIGUES, W. C. 2007. DivEs - Diversidade de Espécies - Guia do
Usuário. Seropédica: Entomologistas do Brasil. 9p. Disponível em:
<http://www.ebras.bio.br/dives/>. Acesso em 22.05.210
SANTOS, C. E. R. S. (2001). Diversidade de rizóbio nativo da região Nordeste
do Brasil capaz de nodular amendoim (Arachis hypogaea), Stylosanthes e
Aeschynomene. 2001. 178f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro, Seropédica.
SANTOS, C. A. F.; SANTOS, I. C. N. dos; RODRIGUES, M. A. Melhoramento
genético do feijãocaupi na Embrapa Sem I-Árido. Petrolina: Embrapa Sem iÁrido, 2007. 24 p. (Embrapa Semi-Árido. Documentos, 204).
SHANNON, C. E. (1949). A mathematical theory of communication. Bell Syst.
Techn. J. 27: 379-423, 623-656.
SILVA FILHO, G. N.; VIDOR, C. Solubilização de fosfatos por microrganismos
na presença de fontes de carbono. Revista brasileira de Ciência do Solo,
Viscosa, MG, v.24, n.2, p.311-329, mar/abr. 2000.
SIMPSON, E. H. (1949). Measurement of diversity. Nature 163: 688.
SOARES, A. L. de L.; FERREIRA, P. A. A.; PEREIRA, J. P. A. R.; VALE, H. M.
M. do; LIMA, A. S.; ANDRADE, M. J. B. de; MOREIRA, F. M. de S. Eficiência
agronômica de rizóbios selecionados e diversidade de populações nativas
nodulíferas em Perdões (MG): II feijoeiro. Revista Brasileira de Ciência do
Solo, v.30, p.803 811, 2006.
SOMASEGARAN, P.; HOBEN, H. J. (1994). Handbook for Rhizobia - methods
in legume - Rhizobium technology. New York. Springer-Verlag, p.336-337.
SOUCHIE, E. L. et al. Solubilização de fosfatos em meios sólido e líquido por
bactérias e fungos do solo. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasilia, v.40,
n.11, p.1149-1152, 2005.
58
SPRENT, J. I. Evolution and diversity in the legume-rhizobium symbiosis:
chaos theory Plant and Soil, Dordrecht, v.161, p.1-10, 1994.
STAMFORD, N. P.; SANTOS C. E. R. S.; MEDEIROS, R.; FIGUEIREDO, M. V.
B. Efeito de diferentes relações potássio magnésio no jacatupé com inoculação
com rizóbio. Revista Brasileira de Ciência do Solo. Viçosa- MG:, v.20,-54,
1996.
SYLVESTER-BRADLEY, R.; ASAKAWA, N.; LA TORRACA, S.; MAGALHÃES,
F. M. M.; OLIVEIRA, L. A.; PEREIRA, R. M. Levantamento quantitativo de
microrganismos solubilizadores de fosfatos na rizosfera de gramíneas e
leguminosas forrageiras na Amazônia. Acta Amazonica, Manaus, v. 12, n. 1,
p. 15-22, 1982
TAYLOR, J. P.; WILSON, B.; MILLS, M.; BURNS, R. G. Comparason of
microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using
various techniques. Soil Biology and Biochemistry, v.34, p.387-401, 2002.
THIES, J. E.; BOHLOOL, B. B.; SINGLETON, P. W. Subgroups of cowpea
miscellany: symbiotic specificity within Bradyrhizobium spp. for Vigna
unguiculata, Phaseolus lunatus, Arachis hypogaea, and Macroptilium
atropurpureum.
Applied
and Environmental
Microbiology,
v.57,
p.1540 1545, 1991.
TORO, M.; AZCÓN, R.; HERRERA, R. Effects on yield and nutrition of
mycorrhizal and nodulated Pueraria phaseoloides exerted by P-solubilizing
rhizobacteria. Biology and Fertility Soils, v.21, p.23-29, 1996.
VINCENT, J. M. A manual for the practical study of root-nodule bacteria.
International Biological Program (IPB) handbook, nº.15. 1970. Blackwell
Scientific, Oxford.167p.
ZHANG, W. T.; YANG, J. K.; YUAN, T. Y.; ZHOU, J. C. Genetic diversity and
phylogeny of indigenous rhizobia from cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.].
Biology and Fertility of Soils, v.44, p.201 210, 2007.
59
AUTENTICAÇÃO DE ISOLADOS E EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA DE
RIZÓBIOS EM DUAS CULTIVARES DE FEIJÃO-CAUPI (Vigna
unguiculata (L.) Walp)
60
RESUMO
O uso de microrganismos com a finalidade de melhorar a disponibilidade de
nutrientes às plantas, através da relação simbiótica entre plantas e bactérias
capazes de promover a Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), é uma
alternativa ao cultivo com adubos químicos visando à preservação dos
recursos naturais e diminuição dos custos agrícolas. Para a cultura do feijãocaupi, a FBN realizada por bactérias do gênero Rhizobium é um fator primordial
no seu crescimento, desenvolvimento e produção, permitindo a manutenção da
agricultura familiar, por ser uma cultura de subsistência, principalmente nas
regiões Norte e Nordeste do Brasil. A seleção de novas estirpes, capazes de
fixar N atmosférico com o feijão-caupi, é uma ferramenta importante na busca
de uma simbiose mais eficiente em níveis próximos ou similares aos obtidos
com a cultura da soja, capaz de competir com as populações nativas do solo. O
objetivo deste trabalho foi testar a autenticidade de 370 isolados bacterianos e,
a eficiência simbiótica de 50 isolados de rizóbio com nodulação comprovada,
em promover a fixação biológica de nitrogênio em feijão-caupi, cultivares BRS
Pujante e Canapu. O experimento foi conduzido em casa de vegetação do
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS) da Universidade do
Estado da Bahia (UNEB), Campus III de Juazeiro-BA. Dos 370 isolados, 238
(64% do total) nodularam o feijão-caupi, confirmando características do grupo
rizóbio. O segundo experimento, para avaliar a eficiência simbiótica em duas
cultivares de feijão-caupi (BRS Pujante e Canapu), 50 isolados de rizóbio foram
selecionados a partir do conjunto de características apresentadas no capítulo 1
e desempenho no ensaio de autenticação para testes com substrato estéril . A
análise de variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste
de Scott-Knott a 5% de probabilidade no programa SISVAR. A cultivar BRS
Pujante mostrou maior potencial para estudos de eficiência simbiótica para a
maioria dos parâmetros avaliados, destacando-se treze isolados de rizóbio que
apresentaram valores de eficiência nodular superiores aos apresentados pelas
três estirpes recomendadas e utilizadas como padrões no presente trabalho.
Palavras chaves: Semiárido, Nodulação, BRS Pujante.
61
ABSTRACT
The use of microorganisms aiming of improving the availability of nutrients to
plants through the symbiotic relationship between plants and bacteria capable
of promoting the Biological Nitrogen Fixation (FBN) is an alternative to cropping
with chemical fertilizers in order to preserve natural resources and reducing
agricultural costs. For the cowpea crop, FBN performed by bacteria of the
genus Rhizobium is a primary factor in its growth, development and production,
allowing the maintenance of family farming, being a subsistence crop, mainly in
the North and Northeast Brazil. The selection of new strains, capable of fixing
atmospheric N with cowpea, is an important tool in the search for an efficient
symbiosis at levels near or similar to those obtained with soybean, able to
compete with native populations of soil. This study waimed of testing
authenticity of 370 bacterial isolates, and the symbiotic effectiveness of 50
rhizobial isolates with proved nodulation, to promote biological nitrogen fixation
in cowpea, BRS Pujante and Canapu cultivars. The first experiment was carried
in the greenhouse of the Department of Technology and Social Sciences
(DTCS) State University of Bahia (UNEB), Campus III Juazeiro-BA. From the
370 isolates, 238 (64%) nodulated cowpea, confirming the characteristics of the
Rhizobium group. The second experiment aimed of evaluating the symbiotic
efficiency in two cultivars of cowpea (BRS Pujante e Canapu), 50 isolates of
rhizobia were selected from the set of characteristics presented in Chapter 1
and performance testing of authentication for testing sterile substrate. The
analysis of variance and treatment means were compared by Scott-Knott test at
5% probability in SISVAR program. The BRS Pujante showed greater potential
for studies of symbiotic efficiency for most parameters, pointing out thirteen
isolates of rhizobia that averaged nodule efficiency higher than those presented
by the three strains recommended and used as standards in this work.
Keywords: Semiarid, Nodulation, BRS Pujante
62
1. INTRODUÇÃO
O feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma leguminosa herbácea
de pequeno porte, cujos grãos são de alto valor nutricional, devido ao seu
elevado teor protéico, sendo cultivado principalmente em agricultura familiar,
como cultura de subsistência, comercializado principalmente nas regiões Norte
e Nordeste do Brasil (DANTAS et al, 2002). Possui tolerância a situações de
estresse ambiental, com capacidade de se desenvolver satisfatoriamente em
solos de baixa fertilidade e em condições desfavoráveis de água e solo que
permitem seu cultivo em áreas agronomicamente marginais (MARTINS et al.,
2003).
Embora o feijão-caupi seja uma cultivar tipicamente nordestina, vem
apresentando altas produtividades em pesquisas realizadas pela Embrapa de
Dourados na região centro-oeste, destacando-se e ganhando espaço agrícola,
especialmente no estado do Mato Grosso e algumas áreas do Mato Grosso do
Sul, onde o feijão-caupi é cultivado em grandes áreas, em inter safras de
outono-inverno, em substituição ao milho safrinha, onde a produtividades de
seu cultivo pode ultrapassar 1.000 kg por hectare, sendo um grão de grandes
possibilidades e modelo ideal na manutenção de rotação de culturas
(NASCIMENTO et al., 2009)
Em regiões onde a agricultura tradicional é praticada em cultivos de
subsistência, a baixa disponibilidade de nitrogênio é um dos fatores mais
limitantes para a produção de hortaliças leguminosas (FILGUEIRA., 2000) e é,
sem dúvida, o fator primordial ao cultivo de leguminosas, como o feijão-caupi,
que respondem com crescimento, desenvolvimento e boa produção de grão,
permitindo a manutenção da agricultura familiar (CRAVO et al., 2009).
Todo o nitrogênio necessário para um bom desenvolvimento do feijãocaupi é absorvido através da Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) em
simbiose com bactérias do gênero Rhizobium (BATRA., 1997), diminuindo os
problemas ambientais da produção agrícola e as exigências da demanda
crescente por alimento e, dessa forma, contribuindo para reduzir o custo da
atividade produtiva e mantendo importantes processos biológicos do solo
(FILGUEIRAS et al., 2009)
63
Para a cultura do feijão-caupi (Vigna unguiculata (L) Walp.), os resultados
de várias pesquisas no âmbito da FBN tem se mostrado positivo para o
aumento da produtividade de grãos com a inoculação de bactérias do gênero
Bradyhizobium nas sementes (MARTINS et al., 2003; SOARES et al., 2006).
Sendo demonstrado que a inoculação de estirpes bacterianas eficientes é
capaz de substituir a adubação nitrogenada comercial em até 80 kg ha-1 na
forma de uréia, aumentando dessa forma o rendimento de grãos desta
leguminosa em mais de 30% (ZILLI et al., 2008).
O uso de inoculantes com bactérias eficientes na FBN em condições de
campo tem se mostrado uma importante estratégia para o aumento da
produtividade dessa leguminosa de apelo agronômico e nutricional nas regiões
Norte e Nordeste do Brasil (LACERDA et al., 2004). Existem quatro estirpes de
Bradyrhizobium atualmente recomendadas para a cultura do feijão-caupi,
segundo Zilli et al (2008): a UFLA3-84 (SEMIA 6461), BR 3267 (SEMIA 6462),
INPA3-11B (SEMIA 6463) e BR3262 (SEMIA6464). Contudo, embora essa
cultura apresente ampla capacidade na fixação biológica de nitrogênio, nem
sempre é observada resposta positiva ao uso de inoculantes em campo, em
razão do feijão-caupi ser uma leguminosa de cultivo em condições de
subsistência com baixo aporte tecnológico e, na maioria das vezes, apresentar
baixa especificidade na nodulação (MOREIRA, 2008).
O feijão-caupi é capaz de nodular e estabelecer simbiose com diversas
espécies de bactérias do grupo rizóbio, incluindo vários gêneros. Essa baixa
especificidade da cultura em relação ao microssimbionte mostra-se limitante à
exploração tecnológica da FBN, uma vez que as bactérias nodulantes
estabelecidas no solo além de ser altamente competitivas e estar em número
elevado apresentam eficiência variável na FBN (ZHANG et al., 2007).
Além das peculiaridades inerentes ao microssimbionte, existem relatos de
que determinados genótipos de cultivares de feijão-caupi apresentem maior
capacidade de nodulação e eficiência na fixação, que indica a possibilidade de
otimização das respostas quanto a FBN com o uso concomitante de cultivares
nativas diagnosticadas como mais eficientes, como exemplo a variedade
Canapu, ou mesmo com a implementação de programas de melhoramento
vegetal, como ocorreu com a cultivar BRS Pujante (XAVIER et al., 2006).
64
A seleção de novas estirpes, capazes de fixar N atmosférico com o feijãocaupi, é uma importante ferramenta na busca de uma simbiose mais eficiente e
capaz de competir com as populações nativas e estabelecidas no solo, com
baixa adaptação às condições ambientais locais, competindo com a
diversidade do solo (SOARES et al., 2006).
Desta forma justifica-se a importância de se produzir um inoculante capaz
de fornecer nitrogênio ao feijão-caupi com menor custo ambiental e econômico
que os fertilizantes nitrogenados minerais, através da seleção de bactérias do
solo capazes de estabelecer uma associação com as plantas e possibilitar o
fornecimento de nitrogênio.
A utilização de insumos biológicos em substituição aos insumos químicos
industrializados tem sido cada vez mais freqüente na agricultura de grãos e o
fato da fixação biológica de nitrogênio ter se mostrado indispensável para a
sustentabilidade da agricultura brasileira, pelo fornecimento de nitrogênio às
culturas com baixo custo econômico e reduzido impacto ambiental, vem
implementando a disseminação dessa técnica tanto para grandes produtores
como para pequenas propriedades (HUNGRIA et al., 2007).
Tendo a premissa de que há uma grande incidência de estirpes nativas de
rizóbio de feijão-caupi, mas a predominância de uma sobre as outras varia com
as diferentes condições edafoclimáticas e de que o estabelecimento de estirpes
eficientes proporcionará aumento de produtividade desta cultura de grande
importância social para a região Nordeste (SOARES et al., 2006).
Este trabalho faz parte de uma estratégia visando uma melhor
caracterização deste importante grupo de bactérias, tendo em vista a seleção
de estirpes eficientes que possibilitem aumentar a contribuição de FBN para
esta leguminosa.
Portanto, o objetivo deste trabalho foi autenticar a capacidade de
nodulação de isolados bacterianos, além de avaliar, sob condições estéreis, a
eficiência de representantes de rizóbios em fixar nitrogênio em duas cultivares
de feijão-caupi.
65
2. MATERIAL E MÈTODOS
2.1 Origem dos isolados bacterianos
Para a realização do experimento de autenticação, foram testados 370
isolados bacterianos pertencentes à coleção RENORBIO provenientes de
experimentos prévios conduzidos no Laboratório de Microbiologia do Solo da
Embrapa Semiárido, Petrolina-PE.
2.2 Experimento para autenticação de isolados bacterianos
Em casa de vegetação do Departamento de Tecnologia e Ciências
Sociais na Universidade do Estado da Bahia, foi testada a capacidade de
nodulação de 370 isolados bacterianos, utilizando feijão-caupi, cultivar BRS
Pujante, como planta isca.
O plantio foi feito em copos de polietileno com capacidade de 500ml
(Figura 1), com areia lavada e vermiculita estéreis na proporção de (1:1 v/v),
utilizando uma base de polietileno para drenagem de água e solução nutritiva
quando o caso.
Figura 1: Experimento para autenticação de isolados bacterianos em feijão-caupi.
66
O substrato foi colocado em sacos de poliestireno e no, seu interior, em
sacos de algodão para serem autoclavados à pressão de 1,0 atm e
temperatura de 120ºC por 1 hora durante dois dias consecutivos para fins de
esterilização.
Os copos passaram por uma assepsia em solução de hipoclorito de sódio
a 5 % por 10 minutos e uma lavagem seriada em água destilada estéril para
posterior retirada de possível resido.
O experimento de autenticação foi conduzido em Delineamento
Inteiramente Casualizados (DIC) com duas repetições, utilizando, além da
coleção de isolados, uma testemunha absoluta (sem nenhuma fonte de
nitrogênio) e uma testemunha inoculada com isolado de nodulação
comprovada, oriunda de trabalho de validação de isolados de rizóbio obtidos de
solos da região do submédio São Francisco associados a três cultivares de
feijão-caupi,
identificado
como
isolado
331-6,
com
características
de
FOTO: SEIDO, S.L
crescimento lento, neutra, produção de pouco muco, tolerante a temperatura de
41ºC e a 50 gramas de NaCl em meio de cultura (LEITE., et al 2009).
FOTO: SEIDO, S.L
2.3 Preparo das sementes para plantio
As sementes foram lavadas com álcool 92,%, durante 30 segundos,
passaram por assepsia em imersão de hipoclorito de sódio (solução com 5%
de cloro, de princípio ativo), durante cinco minutos e enxaguadas por quatro
vezes em água destilada esterilizada. Posteriormente, foram colocadas nos
copos na profundidade de 2 cm para proceder à germinação. A semeadura foi
realizada diretamente nos copos (3 sementes por vaso); 5 dias após o plantio,
(DAP) foi realizado o desbaste, deixando-se apenas uma planta por vaso.
2.4 Inoculação dos isolados bacterianos
Os 370 isolados foram repicados em placas de Petri em meio YMA
(extrato de levedura, manitol e ágar) (VINCENT., 1970). Após crescimento das
colônias, uma pequena quantidade dos isolados foi retirada com o auxilio de
uma alça de platina e incubadas em tubos de ensaio com 10ml de meio 79
(YM) líquido à base de extrato de levedura e manitol. Posteriormente os
FOTO: SEIDO, S.L
FOTO: SEIDO, S.L
67
isolados foram colocados em agitador rotativo, a 180 rpm, por três dias para
cultura de crescimento rápido e seis dias para culturas de crescimento lento à
temperatura de 28°C, a fim de promover o cresciment o log (concentração
mínima de 108 células viáveis por ml) das bactérias.
A inoculação foi realizada sete dias após a emergência das plântulas.
Para proceder à inoculação, fez-se uma pequena retirada do substrato do colo
da plântula para facilitar o contato dos isolados com as raízes. Com o uso de
uma pipeta automática, 1mL do caldo bacteriano (Fred & Waskman, 1928), na
fase log de seu crescimento o caldo bacteriano foi colocado no colo da
plântula, em seguida cobriu-se a região inoculada com areia estéril.
2.5 Solução nutritiva
O fornecimento de nutrientes às plantas ocorreu a cada três dias, na
forma de solução nutritiva de Norris e Date (1976): KCl (2mM); K2HPO4
(0,3mM); KH2PO4 (0,7mM); CaSO4.5H2O (0,3µM); ZnSO4.7H2O (0,7µM);
MnSO4 (1µM); (NH4)6 Mo7O24.4H2O (0,002µM); H3BO3 (11,5µM); FeSO4.7H2O
(17,9µM); ácido cítrico (26µM), e
a irrigação realizada com água destilada
estéril sempre que necessário (Tabela 1).
Tabela 1: Solução nutritiva para crescimento de plantas (Norris & Date, 1976)
Solução
Estoque
1
2
3
4
5
6
Química
Concentração
(g.L-1)
29,8
4,35
98,6
ml da Sol.Estoque L-1
KCL
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Micronutrientes
CuSO4.5H2O
0.078
ZnSO4.7H2O
0,22
MnSO4.4H2O
2,03
(NH4)6Mo7O2.4H2O
0,01
H3BO3
1,43
Citrato Férrico
1,795
CaSO4. 2H2O
68,0
Ajuste para pH 6,5 com solução de KOH, 1N.
2,5
2,5
2,5
0,5
1,0
1,0
A fonte de nitrogênio disponibilizada para as plantas que serviram como
testemunha nitrogenada (T.N) foi nitrato de amônio NH4NO2 na dose de
68
0.750mg por planta parceladas em 6 doses de 0.125mg, durante o
desenvolvimento do experimento.
2.6 Coleta do experimento
A coleta foi realizada 30 dias após o plantio (DAP), a parte aérea das
plantas foi cortada a 2,5 cm de altura do solo e acondicionada em sacos de
papel, para posterior pesagem de peso verde (fresco).
As raízes foram lavadas para melhor observação dos nódulos e
possibilidades de classificação de local de nodulação (colo, meio ou ponta) e
determinação do tamanho dos nódulos (pequeno, médio e grande).
2.7- Seleção dos isolados para experimento de eficiência simbiótica
Após o ensaio para autenticação de nodulação, foi realizado um novo
experimento em condições controladas em casa de vegetação do DTCS na
UNEB, campus III-A de Juazeiro-BA. Para avaliar, em vasos de “Leonard”
(Vincent, 1970), adaptados por Santos et al., (2010),
isolados bacterianos
quanto à sua eficiência simbiótica em duas cultivares de feijão-caupi. A escolha
destes isolados levou em conta, além da confirmação de renodular a espécie
leguminosa, as características morfológicas e fisiológicas apresentadas no
Capítulo 1 deste trabalho.
2.8- Preparação dos vasos e plantio
Os vasos de “Leonard” foram produzidos a partir de garrafas pet de 2
litros de capacidade, cortadas de modo que um vaso fosse produzido a partir
de uma garrafa na parte inferior servindo de suporte e a parte superior fosse
outra garrafa, onde foi colocado o substrato e a planta. As tampas foram
perfuradas e serviram de impedimento a perda de substrato (Figura 2).
69
Figura 2: Vasos de Leonard modificados
A esterilização foi feita com imersão dos vasos em solução de hipoclorito
de sódio na concentração de 5%, por 1 hora, após esse período, retirou-se o
excesso de possível resido de hipoclorito com lavagens seriadas com água
estéril.
O substrato foi composto por areia lavada e vermiculita na proporção de
2:1; v:v colocados em sacos plásticos com capacidade para 10kg e
esterilizados em autoclave a 120°C por 60 minutos e 1 ATM por duas vezes em
dias consecutivos. Cada vaso foi preenchido com aproximadamente 1,5kg
vaso-1 de substrato.
As sementes de feijão-caupi utilizadas foram das cultivares BRS Pujante
e a Canapu, que foram desinfestadas com álcool 70% para quebra de tensão
superficial, e hipoclorito de sódio (1:100), para limpeza, seguidas por nove
lavagens com água destilada estéril com a finalidade de retirar o excesso de
hipoclorito.
Os isolados foram incubados isoladamente em Erlenmeyer de 50 ml de
meio YMA líquido (Vincent, 1970) com pH ajustado para 6,8 sem a adição do
indicador azul de bromotimol. Foram colocados sob agitação orbital, a 105
RPM, por seis dias à temperatura de 28°C para que a cultura atingisse a fase
logarítima de crescimento (Matsuda et al., 2002).
70
Cada vaso recebeu cinco sementes (Figura 3A). Após 72 horas do
plantio, foi procedido o desbaste deixando-se apenas uma plantas por vaso e
feita a inoculação das bactérias nas plântulas, colocando-se 1ml por vaso da
suspensão das estirpes em teste no colo da planta (Figura 3B), contendo
aproximadamente 600 mil unidades formadoras de colônia (UFC). Após a
inoculação, o local foi coberto com areia estéril no intúito de proteger a área
inoculada de possíveis contaminantes microbianos e/ou insetos (Figura 3 C).
A
B
C
Figura 3: (A) Vasos com germinação das sementes; (B) Inoculação dos isolados bacterianos;
(C) Adição de substrato estéril ao local de inoculação.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados em
um esquema fatorial 55x2x3, sendo 55 tratamentos, 2 cultivares e 3 repetições.
Além dos 50 tratamentos com isolados de rizóbio, foram utilizados tratamentos
controles sem inoculação, sendo um sem disponibilidade de nitrogênio como
testemunha absoluta (T.A) e um com adição de uma fonte nitrogenada de
750mg vaso-1 de NH4NO3 em doses parceladas semanalmente a partir de
quinze dias após o plantio (DAP) como disposto em recomendação da rede de
laboratórios para recomendação, padronização e difusão de tecnologia de
inoculantes microbianos de interesse agrícola (RELARE, 2007), denominada
testemunha nitrogenada (TN). Foram utilizadas como padrões três estirpes de
rizóbio recomendadas para a cultura do feijão-caupi: BRs 3301, 3302 e 3262
(SEMIA 6464)
A solução nutritiva isenta de nitrogênio foi preparada de acordo com
Norris & Date (1976) e colocada em doses intercaladas com água estéril em
um volume que variava de 50 a 100ml a depender da temperatura, radiação e
umidade relativa do dia.
71
Nos primeiros quinze DAP a solução foi fornecida em doses diluídas à
50%; posteriormente a solução foi fornecida com a concentração indicada
pelos descritores em volumes que variavam de 150 a 250ml até o dia da coleta
das plantas, que ocorreu aos 40 dias após a emergência e início do
aparecimento dos primeiros botões florais (Figura 4).
Figura 4: Aspecto geral de desenvolvimento de plantas de feijão-caupi mostrando detalhe de
aparecimento de botões florais.
Na coleta, as plantas foram separadas em raiz e parte aérea, na altura
do nó cotiledonar. Na parte radicular, os nódulos foram destacados das raízes,
lavados, contados, pesados e secos em estufa de circulação a temperatura de
65°C por aproximadamente 72 horas, ou até atingirem peso constante, para
determinação de número de nódulos (NN) e massa seca de nódulos (MSN).
A parte aérea das plantas foi pesada para determinação do peso fresco,
e postas para secagem em estufa de circulação forçada de ar à temperatura de
60 e 65°C ate atingirem peso seco, aproximadamente 72 horas (pré secagem),
para eliminação da umidade.
Posteriormente as amostras da parte aérea, foram moídas para
determinação da massa da matéria seca, cinzas e do N-total pelo método semimicro Kjeldahl (LIAO., 1981), segundo Tedesco et al. (1995). A média das três
repetições da biomassa seca da parte aérea (BSPA) foi utilizada para calcular
a eficácia das estirpes em teste, em relação à testemunha nitrogenada,
72
segundo Gibson (1980). Outras variáveis analisadas foram número e massa de
nódulos secos, eficiência nodular (N total da parte aérea por massa de nódulos
secos de cada planta) e eficiência relativa.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância com teste de
F a 5% de probabilidade, de acordo com o delineamento de cada experimento,
e ao teste de Tukey, 5% de probabilidade. Os dados de número de massa de
nódulos foram transformados para raiz quadrada.
2.9 Determinação do Nitrogênio Total acumulado na parte aérea
As análises foram realizadas no laboratório de Nutrição Animal da
Embrapa Semiárido Petrolina-PE.
A determinação da matéria seca da parte aérea (MSPA) da amostra foi
realizada para eliminação da umidade pela secagem em estufa com circulação
forçada de ar à temperatura de 55°C a 60°C por 72 h oras (pré secagem), para
evitar perda por volatilização de outros nutrientes, principalmente compostos
nitrogenados ou causar danos a proteínas. Após esse passo, as amostras que
passaram pela pré secagem foram levadas a estufa à 105°C por 12 horas para
secagem definitiva, que é medida gravimetricamente com o resíduo
remanescente após secagem.
Para determinação de cinzas das amostras, estas foram pesadas em
balança de precisão em 2 gramas, utilizando-se cadinhos de porcelana e
colocadas em mufla para total secagem a 600°C por 4
horas, para
determinação do peso real da amostra sem umidade alguma e matéria mineral
total, a qual pode influenciar no resultado de nitrogênio orgânico.
Para a determinação do N-Total foi adotado o método de Kjeldahl, que é
o método padrão de determinação de nitrogênio, que consiste em 3 passos
básicos: 1- digestão da amostra em acido sulfúrico com um catalisador, que
resulta em conversão do nitrogênio em amônia pela digestão onde nitrogênio é
transformado em amônia e os compostos orgânicos são convertidos em CO2 e
H2O.
O segundo passo é a destilação da amônia em uma solução receptora, e
o terceiro passo é a determinação quantitativa da amônia por titulação contida
na solução receptora e padrão.
73
Dependendo da técnica, a separação da amônia é obtida fazendo-se
sua determinação diretamente no material após a digestão.
As proteínas e outros compostos nitrogenados são decompostos na
presença do ácido sulfúrico concentrado, a quente, com produção de sulfato de
amônio.
O sulfato de potássio é adicionado a fim de aumentar o ponto de
ebulição do acido sulfúrico, apressando a digestão da matéria orgânica por
uma reação catalítica.
O sulfato de amônio resultante, na presença da solução concentrada de
hidróxido de sódio titulada com ácido sulfúrico ou clorídrico, determinando o
teor de nitrogênio da amostra.
A maior parte do nitrogênio das plantas é encontrado na forma de
aminoácidos, formando proteínas, as quais são parte do protoplasma . O
método clássico kjeldahl, por meio de uma digestão ácida, faz com que o
nitrogênio da amostra seja transformado em amônio (NH4+), o qual é
posteriormente separado por destilação e finalmente dividido nas três etapas
citadas acima.
2.10 Eficácia e Eficiência dos isolados
A média das três repetições da matéria seca da parte aérea inoculada foi
utilizada para calcular a eficácia das estirpes em teste, em relação à
testemunha nitrogenada, segundo Gibson (1980), pela fórmula:
Ef = (MSPA inoculada / MSPA N-mineral) x100.
Os dados foram organizados em ordem crescente e agrupados em
classes de eficiência, utilizando o método de Brockwell et al (1966) modificado,
onde Ef ≥ 0,60 (altamente eficaz); 0,55 ≤ Ef < 0,60 (eficaz); Ef < 0,50 (pouco
eficaz) e sem nodulação (ineficaz)
Através dos dados de Nitrogênio total acumulado na parte aérea e a
massa seca de nódulos pode-se determinar a eficiência nodular (BERGENSEN
et al., 1971), pela fórmula:
74
EN = (N Total acumulado da parte aérea/ Massa seca de nódulos)
A eficiência relativa de cada tratamento foi calculada segundo a fórmula:
ER = (MSPA inoculada/ MSPA com N) x 100
Em que ER é a eficiência relativa; MSPA inoculada é a matéria seca da
parte aérea da planta com inoculação; e MSPA com N é a matéria seca da
parte aérea da planta que recebeu Nitrogênio mineral segundo LIMA et al
(2005).
Os dados foram analisados, estatisticamente, com o programa SISVAR
versão 4.3. Os efeitos dos tratamentos foram comparados pelo teste de ScottKnott a 5% de probabilidade.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Autenticação de isolados bacterianos
Dos 370 isolados repicados e purificados para o teste de validação e
eficiência, 132 (36%) não conseguiram nodular pelo menos uma das
repetições. Destes, 91 (69%) não apresentaram nodulação em nenhuma das
repetições e, 41 (31%), nodularam em apenas uma. Assim, estas 91 bactérias
foram desconsideradas nas análises realizadas e omitidas das tabelas. A
ausência de nodulação em espécies leguminosas pode ser atribuída à
seletividade promovida pelos exsudados das raízes, os quais contém fatores
de crescimento que estimulam os organismos capazes de penetrar nos tecidos
radiculares e induzir a nodulação (ASSIS JUNIOR et al ., 2007).
Do total testado, 238 bactérias, perfazendo um percentual de 64%,
renodularam o feijão-caupi (Figura 5), confirmando possuírem a principal
característica do grupo rizóbio. Destas, 99 apresentam crescimento rápido
(41%), 52 crescimento lento representando 22% e 87 bactérias (37%) o
crescimento ocorreu na faixa intermediária. Resultados diferentes foram
encontrados por Zilli (2001), estudando isolados do Cerrado, onde todas as
75
bactérias isoladas tiveram características de crescimento lento e nenhum de
crescimento rápido, em teste de autenticação em feijão-caupi.
Figura 5: Confirmação de renodulação de isolados em Feijão-caupi
Em relação à coloração, todas as plantas inoculadas com bactérias
classificadas como não noduladoras eram amareladas ou verde claras: já as
plantas que nodularam, estavam com uma cor verde escuro ou verde escuro
intenso (Figura 6).
Das bactérias testadas com nodulação comprovada, 183 plantas
obtiveram peso verde de 22,54 g a 10g e apenas 55 apresentaram peso verde
de 10g até o menor peso verde encontrado de 2,66g. Segundo Filgueira (2000)
e Moreira (2008) a maior produção de massa verde estimada, obtida pela
relação cultivar e bactéria, pode ser uma resposta ao bom desempenho da
simbiose, onde o ganho de peso fresco é influenciado pelo bom
desenvolvimento da própria cultivar. Porém com aporte da associação
favorável do isolado bacteriano que manteve um equilíbrio na disponibilidade
de nutrientes que proporcionaram um maior rendimento de massa verde
(fresca).
Quanto à localização e tamanho dos nódulos, das plantas com
nodulação confirmada, foi visto que as disposições dos nódulos nas raízes
estavam em maior concentração na coroa da raiz principal e apresentavam
tamanhos variados e coloração interna avermelhada, o que confirma a
76
presença de leghemoglobina, uma das principais características dos nódulos
de isolados do grupo rizóbio segundo Hungria & Bohrer (2000).
A
B
C
Figura 6: Demonstrativo de coloração da parte aérea em plantas de feijão-caupi: A – não
apresentaram nodulação e obtiveram uma coloração amarelada; B - com coloração
verde claro indicativo de baixa nodulação ou não nodulação e, planta C com
coloração verde escuro e presença de nodulação.
O fato de que apenas as plantas noduladas apresentarem parte aérea
de coloração mais intensa de verde pode ser explicado pela presença de
bactérias eficientes no fornecimento de nitrogênio, indicando que a nodulação
proporcionou para estas o crescimento satisfatório, desde que as plantas bem
supridas de nitrogênio podem ter deslocado uma maior quantidade de
fotoassimilados para a parte aérea em relação às plantas sem presença de
nódulos (Figura 7). Fato similar foi verificado por Araújo et al ( 2007), quanto à
biomassa da parte aérea e sua coloração em trabalho de Fixação biológica de
N2 no feijoeiro submetido a dosagens de inoculantes e tratamento químico na
semente comparado à adubação nitrogenada, o trabalho mostrou que, sob
carência de nitrogênio, há um comprometimento da produção de massa verde
e de sua coloração.
77
Figura 7: Desenvolvimento l das plantas de feijão-caupi em experimento de eficiência
Cabe destacar que as diferenças no ganho de massa da parte aérea
entre as cultivares não podem ser atribuídas exclusivamente ao efeito das
fontes ou disponibilidade de nitrogênio, ocasionados pela associação
simbiótica, porque a produção de biomassa tende a variar também de acordo
com o potencial genético do cultivar (ARF et al., 2004).
3.2 Experimento para avaliar a eficiência simbiótica de isolados de rizóbio
Para o teste de eficiência simbiótica em duas cultivares de feijão-caupi
(BRS Pujante e Canapu) foram selecionados 50 isolados de rizóbio,
representando 21% dos 238 que obtiveram resultado positivo para nodulação
no ensaio anteriormente descrito. Além do melhor desenvolvimento vegetal
promovido pelos isolados testados levou-se em conta para a seleção o hábito
de crescimento: sete isolados apresentando hábito de crescimento rápido, 23
intermediários
e
20
lentos
(Tabela
2).
Outras
características
foram
consideradas tais como: alteração do pH do meio de cultura e quantidade de
muco produzido, como também características fisiológicas de tolerância à
diferentes faixas de temperaturas, concentrações crescentes de sal (NaCl) e
solubilização de fosfato de cálcio.
78
Tabela 2: Características morfológicas e fisiológicas das 50 bactérias classificadas para o teste
de eficiência simbiótica
Características Morfológicas
Id
Isolado
Tempo de
Crescimento
pH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
111-1
332-3
312-2
553-5
353-5
253-3
523-1
542-3
413-2
443-5
433-4
323-5
521-4
412-3
551-3
451-2
542-1
421-1
421-5
121-1
442-1
452-2
343-5
151-5
531-1
213-5
252-4
231-3
223-5
212-5
531-4
313-4
121-3
533-3
113-3
142-1
533-5
511-3
131-1
153-1
243-5
221-5
441-2
242-5
233-3
143-5
131-3
512-4
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Lento
Lento
Lento
Lento
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Intermediário
Intermediário
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
Álcalis
Álcalis
Álcalis
Álcalis
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Álcalis
Álcalis
Características Fisiológicas
Quantidade
Tolerância
de Muco
°C
Muito
45
Muito
41
Muito
41
Muito
41
Muito
41
Pouco
39
Muito
45
Muito
41
Muito
41
Muito
41
Muito
43
Muito
41
Muito
45
Muito
41
Muito
41
Pouco
41
Muito
41
Muito
45
Muito
45
Pouco
43
Pouco
39
Muito
41
Muito
41
Pouco
45
Pouco
45
Pouco
45
Pouco
39
Pouco
45
Pouco
45
Pouco
45
Pouco
45
Pouco
41
Pouco
43
Pouco
45
Pouco
45
Pouco
39
Pouco
45
Pouco
43
Pouco
43
Pouco
45
Pouco
43
Pouco
45
Pouco
39
Pouco
43
Pouco
45
Pouco
39
Pouco
43
Muito
43
NaCl
-1
(g meio )
Solubilização
25
10
25
30
20
25
25
35
20
10
10
25
25
20
30
10
35
10
20
10
10
10
25
10
20
10
25
35
30
10
20
25
30
20
25
10
20
25
10
10
25
30
10
25
35
10
10
25
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Sim
Não
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
79
49
50
141-1
513-1
Intermediário
Intermediário
Neutro
Neutro
Pouco
Muito
39
43
10
25
Sim
Sim
Os resultados dos parâmetros avaliados nas plantas de feijão-caupi,
cultivares BRS Pujante e Canapu, estão demonstrados na tabela 3, para os
isolados rápidos e intermediários e, tabela 4 para os tratamentos inoculados
com isolados lentos, observando-se diferenças estatísticas significativas entre
isolados e entre cultivares, fato mais pronunciado para alguns dos parâmetros,
como eficiência nodular.
A cultivar BRS Pujante mostrou maior formação de nódulos nas raízes
das plantas quando comparada com a Canapu, atestando a sua capacidade
em promover bons resultados quanto à simbiose com bactérias do gênero
Rhizobium.
Uma boa capacidade de formação de nódulos e sua ocupação nas
raízes podem fornecer subsídios em relação à capacidade de sobrevivência,
estabelecimento e competitividade do isolado com outros isolados e estirpes já
introduzidas, como visto por Bertine et al (2009) em trabalhos com divergência
genética entre acessos de feijão-caupi do banco de germoplasma da UFC,
demonstrando que outro fator revelante para o sucesso da ocupação nodular
pelas bactérias é a seletividade simbiótica dos genótipos vegetais, cuja
especificidade pode ser o fator principal na infestação do micro-organismo nas
espécies vegetais melhoradas, como ocorre na cultivar BRS Pujante, que
apresenta alta capacidade de associação com bactérias noduliferas. Das três
estirpes utilizadas como padrões (BR 3262, 3301 e 3302) só a BR 3262
mostrou resultados semelhantes aos dos isolados nativos do semiárido
pernambucano, as outras duas não apresentaram valores semelhantes ou
superiores quando se estabeleceu comparações.
Os isolados 413-2, 531-1, 142-1 e 143-5 apresentaram maiores números
de nódulos na cultivar Canapu, superiores aos encontrados pelo isolado padrão
3262, atualmente recomendada para o Norte do país. Tais resultados
corroboram com trabalhos de Gualter et al (2007) em avaliação de inoculação
de feijão-caupi com Bradyrhizobium, onde os isolados testados demonstraram
capacidade de formação de nódulos maior que os padrões utilizados.
Não foi verificada a presença de nódulos nas duas testemunhas,
nitrogenada e absoluta, corroborando com estudos realizados por Zilli et al
80
(2005) na utilização de inoculantes de Bradyrhizobium no cultivo de soja nos
Cerrados de Roraima, onde as testemunhas não apresentaram nódulos,
confirmando a ausência de contaminação.
Seguindo a mesma linha de resultado, a massa seca de nódulos
também mostra diferenças entre cultivares, porém sem muito distanciamento
de médias quando se avalia o hábito de crescimento do isolado: no caso
daqueles de hábito de crescimento rápido a cultivar Canapu mostrou médias de
1,35 g e a BRS Pujante 1,44 g (Tabela 3), enquanto as lentas apresentaram
médias de 1,35 para a Canapu e 1,45 para a BRS Pujante (tabela 4).
Em relação à massa seca da parte aérea, sete isolados rápidos ou
intermediários (Tabela 3) e um lento (Tabela 4) mostraram diferenças entre as
cultivares, com melhor desempenho na BRS Pujante, com valores maiores que
os das estirpes padrões, que são recomendadas pela RELARE para a cultura
do feijão-caupi. Estes valores só não são maiores ao da testemunha
nitrogenada.
Para o nitrogênio acumulado na parte aérea (NAPA), ocorreram
diferenças estatísticas entre as cultivares, com a BRS Pujante mostrando
melhores resultados para 17 (Tabela 3) e 12 isolados (Tabela 4). Estes
isolados proporcionaram valores de N acumulado superiores ou semelhantes
aos apresentados pelas estirpes BR 3662, BR3301 e BR3302. Para as plantas
da cultivar canapu um isolado (151-5) mostrou o mesmo acúmulo de N que as
plantas da BR 3262 com valores próximos aos da testemunha nitrogenada
(Tabela 4). Este padrão de resultado de acúmulo de nitrogênio na parte aérea
pela planta corroboram com os de Pereira (2000) e Lacerda et al (2004),
indicando potencial promissor para os isolados nativos da região.
.
81
Tabela 3: Relação do Número (NN) e Massa Seca de Nódulos (MSN), Massa Seca de Parte Aérea (MSPA), Nitrogênio Acumulado na Parte Aérea (NAPA) e
Eficiência Nodular (EN) na fixação de Nitrogênio atmosférico por isolados de crescimento rápido e intermediário, bactérias recomendadas (BRS
3262, 3301 e 3302), Testemunha nitrogenada (T.N) e testemunha absoluta (T.A) em duas cultivares de feijão-caupi.
Isolados
111-1
332-3
312-2
553-5
353-5
253-3
523-1
542-3
413-2
443-5
433-4
323-5
542-1
421-1
421-5
121-1
442-1
452-2
343-5
121-3
533-3
113-3
142-1
533-5
511-3
131-1
131-3
Número de nódulos
(planta-1)
BRS Pujante
136,00 b E
133,33 b E
108,00 a F
153,00 a D
171,00 a D
161,66 a D
100,00 b F
92,33 b F
141,33 b E
104,33 a F
106,33 a F
136,33 a E
115,33 a F
200,00 a B
126,66 b E
215,33 a A
127,66 a E
161,33 a D
132,33 a E
167,33 a D
190,33 a C
206,33 a B
204,33 b B
193,66 b B
237,33 a A
221,66 a A
183,33 a C
Canapu
158,33 a
134,33 b
84,66 b
88,33 b
98,33 b
115,33 b
86,33 b
92,66 b
254,33 a
82,00 b
18,66 b
38,33 b
23,00 b
110,66 b
165,00 a
121,00 b
31,33 b
105,00 b
26,66 b
130,66 b
104,66 b
82,00 b
251,33 a
201,66 b
151,33 b
97,33 b
45,33 b
G
D
F
F
F
E
F
F
A
F
H
G
H
E
C
E
H
E
H
D
E
F
A
B
C
F
G
Massa seca de nódulos
Massa seca da parte aérea
(g planta-1)
(g planta-1)
BRS
Pujante
Canapu
BRS Pujante
Canapu
1,36 b C 1,30 b B 24,71 a A 19,36 b A
1,30 b C 1,43 a A 18,07 b A 17,34 b A
1,33 b C 1,40 b A 18,36 b A 17,25 b A
1,43 b B 1,43 b A 18,87 b A 19,52 b A
1,43 b B 1,33 b B 20,12 b A 20,00 b A
1,63 a A 1,33 b B 17,49 b A 17,50 b A
1,36 b C 1,46 b A 22,58 a A 12,11 b B
1,46 b B 1,36 b B 22,37 a A 15,39 b A
1,30 b C 1,50 a A 19,42 b A 18,06 b A
1,43 a B 1,30 b B 15,69 b A 19,33 b A
1,36 b C 1,30 b B 21,32 a A 9,65 b B
1,40 b B 1,40 b A 19,34 a A 14,41 b A
1,46 a B 1,33 b B 16,68 b A 15,16 b A
1,50 a A 1,36 b B 19,71 b A 17,72 b A
1,46 a B 1,33 b B 20,80 b A 18,65 b A
1,43 b B 1,40 b A 19,80 b A 15,79 b A
1,43 a B 1,30 b B 16,15 b A 15,13 b A
1,43 b B 1,40 b A 19,28 b A 14,95 b A
1,46 a B 1,26 b B 22,95 a A 16,68 b A
1,46 b B 1,36 b B 21,31 b A 18,55 b A
1,30 b C 1,33 b B 21,89 b A 17,82 b A
1,53 a A 1,33 b B 21,84 b A 17,58 b A
1,43 b B 1,43 b A 20,35 b A 20,14 b A
1,53 a A 1,36 b B 19,87 b A 17,55 b A
1,46 a B 1,30 b B 21,91 b A 17,62 b A
1,53 a A 1,33 b B 18,94 b A 18,79 b A
1,46 a B 1,30 b B 20,55 a A 12,61 b B
N total na parte aérea
(mg planta-1)
BRS
Pujante
Canapu
0,530 b A 0,403 b
0,473 b B 0,413 b
0,466 b B 0,386 b
0,483 b B 0,413 b
0,523 b A 0,436 b
0,463 b B 0,376 b
0,533 a A 0,333 b
0,540 a A 0,403 b
0,426 b B 0,403 b
0,400 b B 0,350 b
0,510 a B 0,203 b
0,456 b B 0,393 b
0,440 b B 0,396 b
0,510 a B 0,360 b
0,523 a A 0,430 b
0,510 a B 0,360 b
0,416 a B 0,276 b
0,473 b B 0,443 b
0,510 a B 0,346 b
0,600 a A 0,380 b
0,553 a A 0,373 b
0,553 a A 0,396 b
0,656 a A 0,436 b
0,523 b A 0,416 b
0,496 b B 0,420 b
0,493 b B 0,393 b
0,546 a A 0,316 b
Eficiência Nodular
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
BRS Pujante
0,386 b A
0,363 b A
0,350 b B
0,340 b B
0,363 b A
0,286 b B
0,386 a A
0,380 b A
0,333 b B
0,290 b B
0,383 a A
0,326 b B
0,300 b B
0,356 b B
0,366 b A
0,356 a B
0,286 b B
0,330 b B
0,346 b B
0,410 a A
0,430 a A
0,370 b A
0,466 a A
0,340 b B
0,340 b B
0,326 b B
0,380 a A
Canapu
0,313 b
0,290 b
0,290 b
0,286 b
0,316 b
0,283 b
0,226 b
0,293 b
0,273 b
0,280 b
0,140 b
0,283 b
0,303 b
0,270 b
0,330 b
0,256 b
0,206 b
0,320 b
0,273 b
0,273 b
0,283 b
0,303 b
0,303 b
0,270 b
0,326 b
0,290 b
0,246 b
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
82
512-4
141-1
513-1
BR 3262
BR 3301
BR 3302
TN
TA
Média
CV
143,66 a
106,33 a
182,66 a
208,66 a
178,33 b
122,00 b
0,00
0,00
156.61 a
E
F
C
B
C
E
94,66 b
84,00 b
93,33 b
75,66 b
160,33 b
120,33 b
0,00
0,00
103.84 b
9,65
F
F
F
F
C
E
1,43 a
1,53 a
1,50 a
1,63 a
1,53 a
1,46 a
0,00
0,00
1.44 a
B
A
A
A
A
B
1,30 b
1,30 b
1,33 b
1,33 b
1,33 b
1,33 b
0,00
0,00
1.35 b
5,65
B
B
B
B
B
B
21,71 b
20,07 b
22,51 b
18,62 b
15,42 b
17,38 b
27,63 b
0,000
20.10 a
A
A
A
A
A
A
A
18,57 b
17,70 b
21,45 b
22,58 b
13,06 b
20,26 b
27,85 b
0,000
17.5 b
14,31
A
A
A
A
B
A
A
0,613 a
0,540 a
0,616 a
0,480 b
0,410 a
0,390 b
0,560 b
0,000
0.506 a
A
A
A
B
B
B
A
0,440 b
0,410 b
0,446 b
0,510 a
0,253 b
0,396 b
0,491 b
0,000
0.388 b
18,16
A
A
A
A
A
A
A
0,430 a
0,356 b
0,403 b
0,296 b
0,266 b
0,269 b
0,000
0,000
0.351 a
A
B
A
B
B
B
0,336 b
0,306 b
0,333 b
0,376 a
0,203 b
0,293 b
0,000
0,000
0.284 b
18,21
A
A
A
A
A
A
Médias seguidas da mesma letra, nas colunas e linhas, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
(
83
Tabela 4: Relação do Número (NN), Massa Seca de Nódulos (MSN), Massa Seca de Parte Aérea (MSPA), Nitrogênio Acumulado na Parte Aérea (NAPA) e
Eficiência Nodular (EN) na fixação de Nitrogênio atmosférico por isolados de crescimento lento, bactérias recomendadas (BRS 3262, 3301 e 3302),
Testemunha nitrogenada (T.N) e testemunha absoluta em duas cultivares de feijão-caupi.
Isolados
521-4
412-3
551-3
451-2
151-5
531-1
213-5
252-4
231-3
223-5
212-5
531-4
313-4
153-1
243-5
221-5
441-2
242-5
233-3
143-5
BR 3262
BR 3301
BR 3302
CN
CA
Média
CV
Número de nódulos
(planta-1)
BRS Pujante
Canapu
108,33 b F 100,66 b
85,00 a F 45,33 b
96,33 b F 130,00 a
177,33 b C 172,33 b
132,33 b E 114,66 b
125,66 b E 249,66 a
204,00 a B 162,00 b
225,66 a F 104,66 b
148,00 a E 55,33 b
223,33 a A 61,33 b
142,66 a E 93,33 b
176,00 a C 67,00 b
119,00 b E 139,66 b
204,66 a B 168,00 b
193,33 a B 138,00 b
95,33 b F 156,66 a
186,33 a C 88,33 b
194,00 b B 185,00 b
213,33 b A 217,00 b
125,00 b E 244,33 a
208,66 a B 75,66 b
178,33 b C 160,33 b
122,00 b E 120,33 b
0,00
0,00
0,00
0,00
160.2 a
132.59 b
9,65
E
G
D
C
E
A
C
B
G
G
F
F
D
C
D
C
F
C
B
A
F
C
E
Massa seca de nódulos
Massa seca da parte aérea
(g planta-1)
(g planta-1)
BRS
Canapu
Pujante
Canapu
BRS Pujante
1,43 b B 1,40 b A 20,61 b A 17,39 b A
1,43 b B 1,46 b A 20,88 b A 17,62 b A
1,46 b B 1,50 b A 20,04 b A 17,08 b A
1,60 a A 1,30 b B 20,93 b A 17,37 b A
1,36 b C 1,33 b B 18,82 b A 18,65 b A
1,46 a B 1,33 b B 22,11 b A 18,06 b A
1,36 b C 1,36 b B 22,00 b A 19,52 b A
1,43 b B 1,33 b B 20,59 b A 17,01 b A
1,43 b B 1,36 b B 19,52 b A 19,98 b A
1,43 b B 1,33 b B 19,25 b A 17,25 b A
1,43 b B 1,40 b A 21,55 b A 18,48 b A
1,43 b B 1,36 b B 20,87 b A 16,54 b A
1,40 b B 1,33 b B 20,12 b A 17,40 b A
1,53 a A 1,36 b B 20,89 b A 18,16 b A
1,46 b B 1,50 b A 20,39 b A 18,54 b A
1,36 b C 1,33 b B 20,66 a A 15,13 b A
1,43 b B 1,36 b B 17,18 b A 16,54 b A
1,43 a B 1,23 b B 20,27 b A 17,97 b A
1,46 a B 1,30 b B 20,45 b A 17,43 b A
1,56 a A 1,30 b B 19,48 b A 17,20 b A
1,63 a A 1,33 b B 18,62 b A 22,58 b A
1,53 a A 1,33 b B 15,42 b A 13,06 b B
1,46 a B 1,33 b B 17,38 b A 20,26 b A
0,00
0,00
27,63 b A 27,85 b A
0,00
0,00
0,000
0,000
1.45 a
1.35 b
20.23 a
18.21 b
5,65
14,31
N total na parte aérea
(mg planta-1)
BRS
Pujante
Canapu
0,480 b B 0,403 b
0,543 b A 0,453 b
0,546 a A 0,353 b
0,683 a A 0,470 b
0,300 b B 0,446 a
0,556 a A 0,390 b
0,500 b B 0,436 b
0,550 a A 0,410 b
0,500 b B 0,410 b
0,526 b A 0,440 b
0,660 a A 0,380 b
0,456 b B 0,393 b
0,480 b B 0,420 b
0,543 a A 0,356 b
0,426 b B 0,383 b
0,483 a B 0,346 b
0,530 a A 0,380 b
0,610 a A 0,390 b
0,586 a A 0,356 b
0,570 a A 0,393 b
0,480 b B 0,510 a
0,410 a B 0,253 b
0,390 b B 0,396 b
0,560 b A 0,491 b
0,000
0,000
0.515 a
0.402 b
18,16
Eficiência Nodular
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
BRS Pujante
Canapu
0,336 b B 0,290 b
0,383 b A 0,316 b
0,376 a A 0,233 b
0,433 b A 0,363 b
0,330 b B 0,333 b
0,383 a A 0,290 b
0,370 b A 0,313 b
0,380 b A 0,303 b
0,346 b B 0,300 b
0,363 b A 0,326 b
0,470 a A 0,266 b
0,320 b B 0,280 b
0,336 b B 0,316 b
0,350 b B 0,260 b
0,283 b B 0,270 b
0,353 b B 0,263 b
0,370 b A 0,280 b
0,430 a A 0,313 b
0,410 a A 0,276 b
0,303 b A 0,296 b
0,296 b B 0,376 a
0,266 b B 0,203 b
0,269 b B 0,293 b
0,000
0,000
0,000
0,000
0.357 a
0.293 b
18,21
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Médias seguidas da mesma letra, nas colunas e linhas, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
(
84
A eficiência nodular, medida pelo nitrogênio acumulado na parte aérea
pela matéria seca de nódulos, mostrou resultados mais expressivos da cultivar
BRS Pujante em relação à Canapu. Os isolados 523-1; 433-4; 121-1; 121-3;
533-3; 142-1; 131-3 e 512-4 de hábito de crescimento rápido a intermediário e
551-3; 531-1; 212-5 e 242-5 de crescimento lento, mostraram valores
superiores aos das 3 estirpes padrões - BRS 3262, 3301 e 3302 (Figura 8),
quando inoculados na cultivar BRS Pujante. Observou-se para este parâmetro
diferenças estatísticas entre as cultivares BRS Pujante e Canapu e entre os 13
isolados com as 3 estirpes padrões. Entretanto, maior eficiência foi observada
quando a cultivar Canapu foi inoculada com a BRS 3262.
Figura 8: Freqüência de isolados de rizóbios em relação à eficiência nodular em duas
cultivares de feijão-caupi
O fato de isolados nativos terem mostrado valores de eficiência
superiores aos das padrões recomendadas, pode ser atribuído ao potencial das
cultivares estudadas serem bem adaptadas às condições de solo e clima da
região onde a simbiose pode ter ocorrido de forma mais eficiente; resultado
semelhante foi encontrado por Abd-Alla e Omar (2001), estudando rizóbio de
solos da Amazônia, em que a eficiência teve relação com o aumento
significativo de MSPA, NN e MSN, com valores superiores aos das estirpes
referência em relação às estirpes isoladas de nódulos de feijão-caupi.
85
A eficiência relativa é a massa seca da parte aérea (MSPA) das plantas
que receberam inoculação, dividido pelo valor da MSPA da testemunha
nitrogenada, onde os isolados de rizóbios provenientes da cultivar Canapu
foram mais eficientes linearmente com valores de 40 a 60%, sendo
sobrepostos pelos isolados 141-1 com 68% e o 531-1 a 69 % da cultivar BRS
Pujante (Figura 9).
Figura 9: Dispersão dos isolados bacterianos em relação a eficiência relativa nas duas
cultivares de feijão-caupi
Na avaliação da eficácia, um isolado é considerado eficaz se o seu valor
for superior a 0,60% e os resultados encontrados no presente trabalho foram
superiores a este, no caso das duas cultivares. A BRS Pujante obteve os
maiores resultados, na faixa de 2,0% a 4,0% sendo superada pela cultivar
Canapu apenas para a testemunha nitrogenada (T.N) que obteve valores
relativamente parecidos com os isolados 513-1 e 141-1 na cultivar BRS Pujante
(Figura 10). Esse resultado é bastante relevante, tendo em vista que trabalhos
desenvolvidos com leguminosas tropicais em geral mostram que rizóbio nativo
é ineficaz ou de baixa eficácia em relação a padrões recomendados
(STAMFORD et al., 1995), (Fernandes & Fernandes 2000). Por outro lado,
Martins et al (1997), Motta (2002) e Lacerda et al (2004), também encontraram
isolados de rizóbio nativos da região Nordeste do Brasil com baixa, média e
alta eficiência na fixação de nitrogênio.
86
Figura 10: Dispersão dos isolados bacterianos em relação à eficácia nas duas cultivares de
feijão-caupi
Estes dois isolados, 531-1 e 141-1, são de crescimento lento e rápido,
respectivamente. O 531-1 foi isolado de uma área de cultivo de feijão-caupi
confirmando que o histórico da cultura cria um ambiente favorável para o
estabelecimento de bactérias eficientes, como também que bactérias de
crescimento lento, os Bradyrhizobium, mostram melhores resultados em
interações com o feijão-caupi. Por outro lado, o isolado 141-1, que tem hábito
de crescimento rápido, também mostrou eficiência relativa e eficácia altas que
não é um resultado comumente encontrado em trabalhos desenvolvidos na
mesma região (Martins et al., 1997). Mostrando assim potencial promissor para
avaliações agronômicas visando futuros programas de recomendação de
bactérias para áreas agrícolas do semiárido pernambucano.
87
4. CONCLUSÕES
• Dos 370 isolados obtidos, 36% não foram considerados rizóbios, por não
terem renodulado o feijão-caupi.
• A cultivar BRS Pujante mostrou melhor desempenho para estudos com
isolados nativos de rizóbio selecionados no Semiárido pernambucano.
• Treze isolados de rizóbio, inoculados em feijão-caupi, cv BRS Pujante,
apresentaram eficiência nodular superior aos apresentados pelas
estirpes recomendadas e tidas como padrões no presente estudo.
88
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARAÚJO, F. F.; CARMONA, F. G.; TIRITAN, C. S.; CRESTE, E. Fixação
biológica de N2 no feijoeiro submetido a dosagens de inoculante e tratamento
químico na semente comparado à adubação nitrogenada. Acta Scientiarum.
Agronomy, Maringá, v.29, p.540-540. 2007
ARF, O.; RODRIGUES, R.A.F.; SÁ, M.E.; BUZETTI, S.; NASCIMENTO, V.
Manejo do solo, água e nitrogênio no cultivo de feijão. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, v.39, p.131-138, 2004.
ASSIS JÚNIOR, J.O. et al. Produtividade do feijão-de-corda e acúmulo de sais
no solo em função da fração de lixiviação e da salinidade da água de irrigação.
Engenharia Agrícola, Jaboticabal, v. 27, n. 3, p. 702-713, 2007.
BERGENSEN, F.J.; BROCKWELL, J.; GIBSON, A.H.; Schwinghamer, E.A.
Studies of natural populations and mutants of Rhizobium in the improvement of
legume inoculants. Plant and Soil, v.46, supplement 1, p.3-16, 1971.
BERTINI, C. H. C. M.; TEÓFILO, E. M.; DIAS, F. T. C. Divergência genética
entre acessos de feijão caupi do banco de germoplasma da UFC. Revista
Ciência Agronômica, v. 40, n. 01, p. 99-105, 2009.
BATRA, L.; MANNA, M. C. Dehydrogenase activity and microbial biomass
carbon in salt-affected soils of semiarid and arid regions. Arid Soil and
Rehabilitation, v.11, p.295-303, 1997.
BROCKWELL, J.; HELY, F.W.; NEAL-SMITH, C.A. Some symbiotic
characteristics of rhizobia responsible for spontaneous, effective field nodulation
of Lotus hispidus. Australian Journal of Experimental Agricultural and Animal
Husbandry, v.6, p.365-370, 1966.
CRAVO, M. S.; SOUZA, B. D. L.; CUNHA, F. D. R.; CAVALCANTE, E. E.;
ALVES, J. M. A.; MARINHO, J. T. S.; VIEIRA JUNIOR, J. R.; GONÇALVES, J.
R. P.; FREITAS, A. C. R.; TOMAZETTI, M. A. Sistemas de cultivo. A cultura do
feijão-caupi na Amazônia Brasileira. 1. Ed. Boa Vista: Embrapa Roraima, 2009.
v. 1, p. 59-104.
DANTAS, J.P. et al. Avaliação de genótipos de caupi sob salinidade. Revista
Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, Campina Grande, v.6, n.3,
p.425-430, 2002.
89
FERNANDES, M.F.; FERNANDES, R.P.M. Seleção inicial e caracterização
parcial de rizóbios de tabuleiros costeiros quando associados ao guandu.
Revista Brasileira de Ciência do Solo, v.24, p.321-327, 2000.
FILGUEIRA, F.A.R. Novo Manual de Olericultura: Agrotecnologia moderna na
produção e comercialização de hortaliças. Viçosa, 2000, 402 p.
FILGUEIRAS, G. C.; SANTOS, M. A.; HOMMA, A. K. O.; REBELLO, F. K.;
CRAVO, M. S. Aspectos socioeconômicos. A cultura do feijão caupi. Ed1.
Embrapa, 2009. p. 19-58.
FRED, E.B.; WAKSMAN, S.A. Yeast Extract – Mannitol agar for laboratory
manual of general microbiology. New York, McGraw Hill, 1928, 145p.
GIBSON, A. H., (1980). Methods for legumes in glasshouse and controlled
environment cabinets. In: Bergersen, F.T. (Ed.), Methods for Evaluation
Biological Nitrogen Fixation. Wiley. Brisbane, p.139–184.
GUALTER, R.M.R. et al. Avaliação dos efeitos da inoculação de feijão-caupi
(Vigna unguiculata [L.] Walp.) com Bradyrhizobium elkanii. Revista Brasileira
de Agroecologia, v. 02, n. 02, p. 637-640, 2007.
HUNGRIA, M.; BOHER, T.R.J. Variability of nodulation and dinitrogen fixation
capacity among soybean cultivars. Biology and Fertility of Soils, v.31, p.4552, 2000.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, I.C. A importância do processo de
fixação biológica do nitrogênio para a cultura da soja: componente
essencial para a competitividade do produto brasileiro. Londrina: Embrapa
Soja, 2007. 80p. (Embrapa Soja. Documentos, 283).
LACERDA, A.M.; MOREIRA, F.M.S.; ANDRADE, M.J.B; SOARES, A.L.L. Yield
and nodulation of cowpea inoculated with selected strains. Revista Ceres, v.51,
p.67‑82, 2004.
LEITE, J.; SEIDO, S. L.; PASSOS, S. R.; XAVIER, G. R.; RUMJANEK, N, G.;
MARTINS, L. M. V. Biodiversity of rhizobia associated with cowpea cultivars in
soils of the lower half of the São Francisco River Valley. Rev. Bras. Ciênc. Solo,
33:1215-1226, 2009.
LACERDA, A.M.; MOREIRA, F.M.S.; MAGALHÃES, F.M.M.; ANDRADE, M.J.B.
de; SOARES, A.L. de E.L. Efeito de estirpes de rizóbio sobre a nodulação e
produtividade do feijão caupi. Revista Ceres, v.51, p.67-82, 2004.
LIAO, C. F. H. Devarda's allow methods for total nitrogen determination. Soil
Science Society of America Journal, v. 45, p. 852-855, 1981.
LIMA, A. S.; PEREIRA, J. P. A. R.; MOREIRA, M. F. S. Diversidade fenotípica e
eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium spp. de solos da Amazônia.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, V. 40, N. 11, P. 1059-1104, 2005.
90
MARTINS, L.M.V.; NEVES, M.C.P.; RUMJANEK, N.G. Growth characteristics
and symbiotic efficiency of rhizobia isolated from cowpea nodules of the
Northeast region of Brazil. Soil Biology and Biochemistry, v.29, p.1005-1010,
1997.
MARTINS, L. M. V.; RANGEL, F. W.; XAVIER, G. R.; RIBEIRO, J. R. A.;
MORGADO, L. B.; NEVES, M. C. P.; RUMJANEK, N. Contribution of biological
nitrogen fixation to cowwpea : a strategy for improving granin yeld in the semiárid region of Brazil. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v. 38, p. 333-339;
2003.
MATSUDA, A.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Tolerância de rizobios de
diferentes procedências ao zinco, cobre e Cadmo. Pesquisa Agropecuária
Brasileira. 2002. v. 37, n. 3, p.343-355. 2002.
MOREIRA, F.M.S. Bactérias fixadoras de nitrogênio que nodulam
Leguminosae. In: MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O.; BRUSSAARD, L. (Ed.).
Biodiversidade do solo em ecossistemas brasileiros. Lavras: UFLA, 2008.
p.621‑680.
MOTTA, J.S. Diversidade fenotípica e eficiência simbiótica de estirpes de
Bradyrhizobium sp. isoladas de áreas de mineração de bauxita
reabilitadas. 2002. 43p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de
Lavras, Lavras.
NASCIMENTO, H. T. S. do; FREIRE FILHO, F. R.; ROCHA, M. M.; RIBEIRO,
V. Q.; DAMASCENO-SILVA, K. J. PRODUÇÃO, AVANÇOS E DASAFIOS
PARA CLTURA DO FEIJÃO-CAUPI NO BRASIL. In: CONGRESSO
NACIONAL DE FEIJÃO-CAUPI, 2; REUNIÃO NACIONAL DE FEIJÃO-CAUPI,
7., 2009, Belém, PA. Da agricultura de subsistência ao agronegócio: Anais.
Belém, PA: Embrapa Amazônia Oriental, 2009. 1 CD-ROM.
NORRIS, D.O.; DATE, R.A. Legume bacteriology. In: SHAM, N.H.; BRYAN,
W.W. (Ed.). Tropical pasture research: principles and methods. Hurley:
Commonwealth Bureau of Pastures and Field Crops, 1976. p.134‑174.
(Commonwealth Bureau of Pastures and Field Crops. Bulletin, 51).
PEREIRA E.G. Diversidade de rizóbios isolados em diferentes sistemas de
uso da terra na Amazônia. 2000. 93p. Tese (Doutorado) - Universidade
Federal de Lavras, Lavras.
RELARE. (2007). Rede de Laboratórios para Recomendação, Padronização e
Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbianos de Interesse Agrícola. Anais
da XIII Reunião da Rede de Laboratórios para Recomendação, Padronização e
Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbianos de Interesse Agrícola. In:
Fertibio 2006, Londrina-PR: Embrapa Soja, 212p.
91
SANTOS, M. A. S; REBELLO, F. K.; HOMMA, A. K. O. Fontes de crescimento
da população de feijão-caupi no estado do Pará no período 1998-2008. In:
CONGRESSO NACIONAL DE FEIJÃO-CAUPI, 2., 2010, Belém. Anais. Belém:
Embrapa, 2010. p. 603-607.
SILVA, P.S.L.; OLIVEIRA, C.N. Rendimentos de feijão verde e maduro de
cultivares de caupi. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 11, n. 2, p 133-135, 1993.
SOARES, A.L. de L.; FERREIRA, P.A.A.; PEREIRA, J.P.A.R.; VALE, H.M.M.
do; LIMA, A.S.; ANDRADE, M.J.B. de; MOREIRA, F.M. de S. Eficiência
agronômica de rizóbios selecionados e diversidade de populações nativas
nodulíferas em Perdões (MG): II ‑ feijoeiro. Revista Brasileira de Ciência do
Solo, v.30, p.803‑811, 2006.
STAMFORD, N. P.; NEPTUNE, A. M. L. Especificidade hospedeira e
competição entre estirpes de Rhizobium em inoculação cruzada com quatro
cultivares de Vigna unguiculata (L) Walp. OMEGA, Recife, v. 3, p. 25-34, 1995.
TAYLOR, J. P.; WILSON, B.; MILLS, M.; BURNS, R. G. Comparason of
microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using
various techniques. Soil Biology and Biochemistry, v.34, p.387-401, 2002.
TEDESCO, M.J.; GIANELLO, C.; BISSANI, C.A.; BOHNEN, H.; VOLKWEISS,
S.J. Análise do solo, planta e outros materiais. 2.ed. Porto Alegre: UFRGS,
Departamento de Solos, 1995. 174p. (Boletim Técnico, 5).
VINCENT, J.M. A manual for the practical study of root nodule bacteria.
Oxford: Blackwell Scientific, 1970. 164p.
XAVIER, G.R.; MARTINS, L.M.V.; RIBEIRO, J.R. de A.; RUMJANEK, N.G.
Especificidade simbiótica entre rizóbios e acessos de feijão‑caupi de diferentes
nacionalidades. Caatinga, v.19, p.25‑33, 2006.
ZHANG, W.T.; YANG, J.K.; YUAN, T.Y.; ZHOU, J.C. Genetic diversity and
phylogeny of indigenous rhizobia from cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.].
Biology and Fertility of Soils, v.44, p.201‑210, 2007.
ZILLI, J. L. E. Caracterização e seleção de estirpes de rizóbio para inoculação
de caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] em áreas do cerrado. 2001. 137 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) – Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro, Seropédica.
ZILLI, J. E. CAMPO, R. J. RIBEIRO, K. G. GIANIUPPI, V. SMIDERLER, O . J.
HUNGRIA, M. Utilização de Inoculantes de Bradyrhizobium no Cultivo de
Soja nos Cerrados de Roraima. Boa Vista: Embrapa Roraima, 2005. 9p. (
Embrapa Roraima. Circular Técnica, 02).
92
ZILLI, J.É.; XAVIER, G.R.; RUMJANEK, N.G. BR 3262: nova estirpe de
Bradyrhizobium para a inoculação de feijão‑caupi em Roraima. Boa Vista:
Embrapa Roraima, 2008. 7p. (Embrapa Roraima. Comunicado técnico, 10).
93
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS BACTÉRIAS DOS NÓDULOS DE FEIJÃO-CAUPI ATRAVÉS DO CULTIVO EM MEIO SELETIVO
CARACTERÍSTICAS
COMO CARACTERIZAR
Tempo de crescimento
1 a 3 dias – Rápida
4 a 5 dias – Intermediaria
Acima de 6 dias - Lenta
Neutro – verde
Alcalino – azulado
Acido – amarelo
Puntiforme a 1mm
2mm
Acima de 2mm
Irregular
Circular
Plana – não ou Elevada - sim
Sim ou Não
Branca
Amarela
Sim ou Não
Pouco
Muito
Homogêneo
Heterogêneo
Sim ou não
Viscoso
Floculoso
Butírico
pH do meio
Tamanho da colônia
Forma da colônia
Elevação da colônia
Transparência
Cor da colônia
Presença de muco
Quantidade de muco
Aparência do muco
Elasticidade do muco
Tipo de muco
REPETIÇÃO 1
Tratamento
S1C1
S1C1
S1C1
S1C1
S1C1
S1C2
S1C2
S1C2
S1C2
S1C2
S1C3
S1C3
S1C3
S1C3
S1C3
S1C4
S1C4
S1C4
S1C4
S1C4
S1C5
S1C5
S1C5
S1C5
S1C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
do muco
Elasticidade
Tipo de
muco
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
rápido
rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
lento
lento
rápido
rápido
Intermediário
Intermediário
lento
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Ácido
Ácido
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Branca
Branca
Branca
Amarela
Branca
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Amarela
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Branca
Branca
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Floculoso
Neutro
Neutro
Neutro
Alcalino
Alcalino
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
2mm
+ 2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
+ 2mm
+ 2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
95
REPETIÇÃO 2
Tratamento
S1C1
S1C1
S1C1
S1C1
S1C1
S1C2
S1C2
S1C2
S1C2
S1C2
S1C3
S1C3
S1C3
S1C3
S1C3
S1C4
S1C4
S1C4
S1C4
S1C4
S1C5
S1C5
S1C5
S1C5
S1C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Alcalino
Alcalino
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Homo
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Floculoso
Viscoso
Floculoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
96
REPETIÇÃO 3
Tratamento
S1C1
S1C1
S1C1
S1C1
S1C1
S1C2
S1C2
S1C2
S1C2
S1C2
S1C3
S1C3
S1C3
S1C3
S1C3
S1C4
S1C4
S1C4
S1C4
S1C4
S1C5
S1C5
S1C5
S1C5
S1C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Lento
Lento
Lento
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Lento
Lento
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Neutro
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Neutro
Neutro
Alcalino
Neutro
Neutro
Neutro
Ácido
2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Elevada
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Branca
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Floculoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
97
REPETIÇÃO 1
Tratamento
S2C1
S2C1
S2C1
S2C1
S2C1
S2C2
S2C2
S2C2
S2C2
S2C2
S2C3
S2C3
S2C3
S2C3
S2C3
S2C4
S2C4
S2C4
S2C4
S2C4
S2C5
S2C5
S2C5
S2C5
S2C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Quantidade
de muco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Aparência
Elasticidade
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Tipo de
muco
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
98
REPETIÇÃO 2
Tratamento
S2C1
S2C1
S2C1
S2C1
S2C1
S2C2
S2C2
S2C2
S2C2
S2C2
S2C3
S2C3
S2C3
S2C3
S2C3
S2C4
S2C4
S2C4
S2C4
S2C4
S2C5
S2C5
S2C5
S2C5
S2C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
99
REPETIÇÃO 3
Tratamento
S2C1
S2C1
S2C1
S2C1
S2C1
S2C2
S2C2
S2C2
S2C2
S2C2
S2C3
S2C3
S2C3
S2C3
S2C3
S2C4
S2C4
S2C4
S2C4
S2C4
S2C5
S2C5
S2C5
S2C5
S2C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Quantidade
de muco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Aparência
Elasticidade
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Tipo de
muco
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
100
REPETIÇÃO 1
Tratamento
S3C1
S3C1
S3C1
S3C1
S3C1
S3C2
S3C2
S3C2
S3C2
S3C2
S3C3
S3C3
S3C3
S3C3
S3C3
S3C4
S3C4
S3C4
S3C4
S3C4
S3C5
S3C5
S3C5
S3C5
S3C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
101
REPETIÇÃO 2
Tratamento
S3C1
S3C1
S3C1
S3C1
S3C1
S3C2
S3C2
S3C2
S3C2
S3C2
S3C3
S3C3
S3C3
S3C3
S3C3
S3C4
S3C4
S3C4
S3C4
S3C4
S3C5
S3C5
S3C5
S3C5
S3C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Floculoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
102
REPETIÇÃO 3
Tratamento
S3C1
S3C1
S3C1
S3C1
S3C1
S3C2
S3C2
S3C2
S3C2
S3C2
S3C3
S3C3
S3C3
S3C3
S3C3
S3C4
S3C4
S3C4
S3C4
S3C4
S3C5
S3C5
S3C5
S3C5
S3C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
103
REPETIÇÃO 1
Tratamento
S4C1
S4C1
S4C1
S4C1
S4C1
S4C2
S4C2
S4C2
S4C2
S4C2
S4C3
S4C3
S4C3
S4C3
S4C3
S4C4
S4C4
S4C4
S4C4
S4C4
S4C5
S4C5
S4C5
S4C5
S4C5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
n1
n2
n3
n4
n5
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Ácido
Neutro
Ácido
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Amarela
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Homo
Hetero
Homo
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Não
Não
Sim
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Floculoso
Viscoso
Floculoso
Viscoso
Floculoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
104
REPETIÇÃO 2
Tratamento
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
S4C1
S4C1
S4C1
S4C1
S4C1
S4C2
S4C2
S4C2
S4C2
S4C2
S4C3
S4C3
S4C3
S4C3
S4C3
S4C4
S4C4
S4C4
S4C4
S4C4
S4C5
S4C5
S4C5
S4C5
S4C5
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Hetero
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
105
REPETIÇÃO 3
Tratamento
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
S4C1
S4C1
S4C1
S4C1
S4C1
S4C2
S4C2
S4C2
S4C2
S4C2
S4C3
S4C3
S4C3
S4C3
S4C3
S4C4
S4C4
S4C4
S4C4
S4C4
S4C5
S4C5
S4C5
S4C5
S4C5
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
106
REPETIÇÃO 1
Tratamento
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
S5C1
S5C1
S5C1
S5C1
S5C1
S5C2
S5C2
S5C2
S5C2
S5C2
S5C3
S5C3
S5C3
S5C3
S5C3
S5C4
S5C4
S5C4
S5C4
S5C4
S5C5
S5C5
S5C5
S5C5
S5C5
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Lento
Lento
Lento
Lento
Lento
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
107
REPETIÇÃO 2
Tratamento
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
de muco
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
S5C1
S5C1
S5C1
S5C1
S5C1
S5C2
S5C2
S5C2
S5C2
S5C2
S5C3
S5C3
S5C3
S5C3
S5C3
S5C4
S5C4
S5C4
S5C4
S5C4
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Ácido
Ácido
Ácido
Alcalino
Alcalino
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
+ 2mm
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
+ 2mm
+ 2mm
2mm
2mm
2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Butírico
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
108
REPETIÇÃO 3
Tratamento
Tempo de
crescimento
pH do
meio
Tamanho
da colônia
Forma da
colônia
Elevação
Transparência
Cor da
colônia
Presença
de muco
Quantidade
Aparência
Elasticidade
Tipo de
muco
S5C1
S5C1
S5C1
S5C1
S5C1
S5C2
S5C2
S5C2
S5C2
S5C2
S5C3
S5C3
S5C3
S5C3
S5C3
S5C4
S5C4
S5C4
S5C4
S5C4
S5C5
S5C5
S5C5
S5C5
S5C5
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Intermediário
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Rápido
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Neutro
Ácido
Neutro
Neutro
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
Ácido
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
Puntiforme
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
2mm
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Circular
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Amarela
Branca
Branca
Branca
Branca
Branca
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Pouco
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Muito
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Hetero
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Loculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Floculoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
Viscoso
109
0