Ação do Metabólito 5-Hidroxi-2-Hidroximetil - PPGBAIP

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
AÇÃO DO METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA
SOBRE O FUNGO FILAMENTOSO Curvularia pallescens.
JORGE AUGUSTO LEÃO PEREIRA
Belém-Pará
2013
JORGE AUGUSTO LEÃO PEREIRA
AÇÃO DO METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA
SOBRE O FUNGO FILAMENTOSO Curvularia pallescens.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profª. Dra. Edilene Oliveira da Silva
Belém-Pará
2013
1
JORGE AUGUSTO LEÃO PEREIRA
AÇÃO DO METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA
SOBRE O FUNGO FILAMENTOSO Curvularia pallescens.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do
Pará, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador:
Profa. Dra. Edilene Oliveira da Silva
Laboratório de Protozoologia, ICB-UFPA
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Silvia Helena Marques da Silva
Laboratório de Bacteriologia e Micologia, SABMI-IEC
Prof. Dr. Jorge Pereira da Silva
Laboratório de Imunologia Clínica, ICS-UFPA
Prof. Dr. Moysés dos Santos Miranda
Laboratório de Fertilização Animal, ICB-UFPA
Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos (Suplente)
Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia, ICB-UFPA
Belém, 22 de Abril de 2013
2
A Deus pela força e inspiração.
À minha filha Adrielly pelo privilégio de tê-la como filha.
À minha família pelo apoio e dedicação.
3
“Quanto mais aumenta nosso conhecimento,
mais evidente fica nossa ignorância”.
(John F. Kennedy)
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelo dom da vida.
À minha mãe, Lucília Rosa Leão Pereira, pelo amor silencioso e paciente. Ao meu pai,
Boanerges Viana Pereira, referência em sabedoria e perpiscácia. Aos meus irmãos, que de
forma velada, estão sempre na torcida pela realização dos meus sonhos.
À minha filha Adrielly pela compreensão nas minhas ausências necessárias.
À Profª. Drª. Edilene O. Silva, pela oportunidade, orientação, acolhimento, incentivo a
pesquisa, dedicação no desenvolvimento deste trabalho e aos ensinamentos proporcionados.
Ao Profº. Dr. Alberdan Silva Santos do Laboratório de Planejamento e
Desenvolvimento de Novos Fármacos, por ceder o HMP biotecnológico e a infra estrutura do
laboratório de microbiologia onde grande parte deste trabalho foi realizado. Agradeço
também a Márcia e Marcela pelo apoio dispensado durante os experimentos.
À Fernanda pela ajuda no processamento das amostras, pelo ensinamento das técnicas
e por aturar minhas chatices.
À Ana Paula, pela ajuda providencial, auxílio na obtenção das imagens, dicas,
ensinamentos e conselhos que direcionaram este trabalho nos momentos mais difíceis.
Ao Luis Henrique pela ajuda na obtenção e processamento das imagens no
microscópio confocal e citometria.
Ao Davi Oliveira pela ajuda nos resumos em inglês e dicas de quem já tem
experiência de caminhada.
Ao Bruno Martins pela ajuda no espectrofotômetro, gráficos e pelas risadas no
decorrer desses anos.
Amandinhaaa, valeu pelos protocolos quase sempre corretos e pelos artigos sobre
“Lipid droplets”.
Alô Raquel! Ainda bem que você jogou minhas lâminas com poli-L-lisina, elas não
iam funcionar mesmo. “Hoje vou me fazer um agrado”.
Ao Rodrigo Furtado obrigado por guiar-nos na viagem do Rio de Janeiro.
À Paula Frade exemplo de sensibilidade a flor da pele e a maior bandida que eu já
conheci principalmente após passar no mestrado.
À Josineide Pantoja tenho uma inveja branca de estares no Doutorado.
À Caroline Martins pela companhia nos momentos descontraídos no laboratório.
5
À Lienne Silveira pela dedicação integral nos últimos meses. Por ter suportado meu
estresse exacerbado nos momentos difíceis. Sua companhia e ajuda foram fundamentais para
conclusão deste trabalho. Foi bom te conhecer e conviver com você.
Ao Aprígio Nunes pelo exemplo de perseverança. Vamos sair mais vezes pra você
pagar a conta.
Ao Heider pela obtenção análise de microscopia eletrônica de transmissão.
Aos novos alunos do laboratório de protozoologia, Evelen, Ingrid e Sandro pelo
convívio e momentos descontraídos.
À CAPES e INBEB pelo suporte financeiro.
Ao Laboratório de Biologia Estrutural da Universidade Federal Pará.
Ao Instituto Evandro Chagas e Museu Emílio Goeldi pelo uso dos equipamentos para
obtenção das imagens.
Enfim, Agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste
trabalho.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .........
8
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS .........
10
RESUMO .
11
ABSTRACT ........................................................................................................................... 12
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13
1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS ............................................................. 14
1.2 ESPÉCIECurvulariapallescens .......................................................................................... 16
1.3 MELANINA FÚNGICA .................................................................................................... 17
1.4CORPÚSCULOS LIPÍDICOS ............................................................................................ 19
1.4.1 Biogênese dos Corpúsculos Lipídicos ......................................................................... 20
1.4.2 Função dos Corpúsculos Lipídicos.............................................................................. 21
1.5DROGAS ANTIFÚNGICAS .............................................................................................. 22
1.6 METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA (HMP) ................ 23
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 25
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 26
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 26
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 26
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 27
4.1 OBTENÇÃO DO METABÓLITO HMP ......................................................................... 27
4.2 OBTENÇÃO,CULTIVO E MANUTENÇÃO DE Curvulariapallescens ......................... 27
4.3 DILUIÇÃO DO METABÓLITO HMP ............................................................................ 28
4.4ANÁLISE MICROSCÓPICA ............................................................................................. 28
4.4.1 Microscopia Óptica de campo claro (MOCC) ........................................................... 28
4.4.2 Microscopia Eletrônica Varredura (MEV) ................................................................ 28
4.4.3 Microscopia Eletrônica Transmissão (MET) ............................................................. 29
4.5 TESTE DE VIABILIDADE CELULAR EM HIFAS TRATADAS COM HMP USANDO
O FUN-1 .................................................................................................................................. 29
4.5.1 Análise por microscopia óptica de fluorescência ...................................................... 29
4.6 ANÁLISE CITOQUÍMICA PARA DETECÇÃO DE LIPÍDIOS .................................... 30
7
4.6.1Marcação de corpúsculos lipídicos pela coloraçãosudanblack B .............................. 30
4.6.2Detecção de corpúsculos lipídicos pelo marcador fluorescente BODIPY® ............... 30
4.6.3 Detecção de corpúsculos lipídicos pelo método ósmio-imidazol ............................... 31
5.RESULTADOS ................................................................................................................... 32
5.1ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS ........................................... 32
5.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DE CAMPO CLARO .... 33
5.3
ANÁLISE
MORFOLÓGICA
POR
MICROSCOPIA
ELETRÔNICAVARREDURA(MEV) .................................................................................... 36
5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) ...................................... 41
5.5 ANÁLISE CITOQUÍMICA DAS VESÍCULAS DE Curvulariapallescens .................... 46
5.5.1 Sudanblack B ................................................................................................................ 46
5.5.2 Bodipy ............................................................................................................................ 49
5.5.3Ósmio-imidazol ............................................................................................................... 54
6. VIABILIDADE DAS CÉLULAS FÚNGICAS ................................................................ 59
7. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 62
8. CONCLUSÃO..................................................................................................................... 66
9. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 67
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Morfologia básica dos fungos ............................................................................... 14
Figura 2 – Representação esquemática da membrana e parede celular fúngica..................... 15
Figura 3 –Características morfológicas de Curvularia. pallescens ........................................ 16
Figura 4 – Representação esquemática das vias de síntese da melanina fúngica ................... 18
Figura 5 – Representação esquemática da biogênese dos corpúsculos lipídicos ................... 21
Figura 6 –Representação esquemáticados alvos de ação das drogas antifúngicas .................. 22
Figura 7 – Estrutura química do HMP .................................................................................... 23
Figura 8 – Características morfológicas da cultura de Curvularia. pallescens, cultivadas com
diversas concentrações de HMP comercial .............................................................................. 32
Figura 9 – Características morfológicas da cultura de Curvularia. pallescens, cultivadas com
diversas concentrações de HMP biotecnológico ..................................................................... 33
Figura 10 – Microscopia óptica de campo claro deCurvularia. Pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial e coradas com lactofenol azul de algodão......... 34
Figura 11 – Microscopia óptica de campo claro deCurvularia. Pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico e coradas com lactofenol azul de algodão. 35
Figura 12 – Microscopia eletrônica de varredura de Curvulariapallescenscultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial........................................................................... 38
Figura 13 – Microscopia eletrônica de varredura de Curvulariapallescens cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico.................................................................... 40
Figura 14 – Microscopia eletrônica de transmissão de Curvulariapallescens cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial........................................................................... 43
Figura 15 – Microscopia eletrônica de transmissão de Curvulariapallescens cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico................................................................... 45
Figura 16 – Microscopia óptica de campo claro de Curvulariapallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial e marcado com sudanblack B ......................... 47
Figura 17– Microscopia óptica de campo claro de Curvulariapallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico e marcado com sudanblack B ................. 48
Figura 18– Microscopia confocal de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP comercial e incubados com BODIPY® .............................................. 51
Figura 19– Microscopia confocal de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP biotecnológico e incubados com BODIPY® ...................................... 53
9
Figura 20– Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de
Curvulariapallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP comercial ............... 56
Figura 21– Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de
Curvulariapallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP biotecnológico 58
Figura 22– Microscopia de fluorescência de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP comercial e incubados com FUN-1® .................................................. 60
Figura 23 – Microscopia de fluorescência de Curvulariapallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP biotecnológico e incubados com FUN-1® .......................................... 61
10
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
°C – Graus Celsius
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
µg/mL – Microgramas por mililitros
g – Grama
µL – Microlitros
µm – Micrometros
HMP – 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona
M – Molar
mL – Mililitros
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MOCC – Microscopia Óptica de Campo Claro
mg/ mL – Miligramas por mililitros
nm- Nanômetro
RPM – Rotação por minuto
UV – Ultravioleta
DHN – 1,8-di-hidroxinaftaleno
L- DOPA – L-3,4-dihidroxifenilalanina
DMP30 – Dimethylaminomethyl phenol
PHEM – Pipes, Hepes, EGTA e Magnésio
pH – Potencial hidrogeniônico
GPY – Sigla inglesa para glicose peptona e estrato de levedura
11
RESUMO
Os fungos são organismos eucarióticos que desempenham um importante papel na
manutenção da vida no planeta. Existem cerca de noventa mil espécies fúngicas descritas,
sendo que apenas algumas destas são patógenos de plantas e animais. A espécie Curvularia
pallescens é um fungo endofítico produtor de melanina que ocasionalmente pode causar
algumas infecções humanas. Atualmente, há alguns estudos acerca dos efeitos antifúngicos de
bioprodutos que possuem baixa toxicidade. O 5-hidroxi-2-hidroximetil-γ-pirona (HMP) é um
metabolito secundário sintetizado por algumas espécies de fungos do gênero Aspergillus. O
HMP possui várias aplicações, principalmente como inibidor da tirosinase, enzima que ajuda
na via biossintética para formação da melanina em células de mamíferos e fungo. Este estudo
avaliou a ação deste metabólito sobre o fungo filamentoso C. pallescens cultivado e tratado
com 25, 50, 100 e 200 µg/ml de HMP comercial e obtido por processos biotecnológicos. A
análise morfológica por microscopia óptica de campo claro, microscopia eletrônica de
varredura e microscopia eletrônica de transmissão, mostrou um acúmulo de estruturas
intracitoplasmáticas semelhantes a corpúsculos lipídicos, externalização de vesículas e
desestruturação da parede celular. Análises citoquímica específicas, sudan black B, bodipy e
ósmio-imidazol, para detecção de lipídio definiram que estas vesículas continham lipídio e
que estavam sendo externalizadas provavelmente por causa da desestruturação da parede
celular provocadas pelo tratamento com HMP. Apesar desses danos celulares apresentados, o
teste de viabilidade celular utilizando FUN-1, mostrou que a viabilidade foi alterada somente
em algumas concentrações de HMP. Esses resultados sugerem que o HMP pode apresentar
ação fungistática e promover alterações importantes na morfologia das células de Curvularia
pallescens as quais podem estar relacionadas à diminuição da viabilidade de algumas células.
Assim, novos estudos são necessários para identificar o mecanismo que induzem estas
alterações.
Palavras-chave: HMP; Fungo; Alterações morfológicas; Curvularia pallescens.
12
ABSTRACT
Fungi are eukaryotic organism that have an important role in maintenance of the life
on the planet. There are approximately ninety thousand fungal species described, with only
some of these are pathogens of plant and animals. The species Curvularia pallescens is
a entophytic fungi and producer of melanin that occasionally causes a variety of human
infections. Nowadays, there are some studies about antifungi effects of bioproducts which
have low toxicity. The 5-hydroxy-2-hydroxymethyl-γ-pyrone (HMP) is a secondary
metabolite synthesized by some species of fungi from Aspergillus genera. The HMP has
several applications mainly as tyrosinase inhibitor, enzyme that helps in biosynthetic pathway
for melanin formation in various mammalian and fungi cells. This study evaluated the HMP
effect on the filamentous fungus C. pallescens cultivated and treated with 25, 50, 100 e 200
µg/ml of HMP. The morphological analysis by bright field optical microscopy, scanning
electron microscopy and transmission electron microscopy of treated cells showed
accumulation of many structures intracytoplasmatic like lipid droplets, vesicles
externalization and disruption of the cell wall. Cytochemical analyses specific, sudan black B,
bodipy and osmium-imidazole, to detect lipid defined that vesicles had lipid e was be
externalised probably by disruption of the cell wall caused by treatment with HMP. Despite
the present cellular damage, the viability test using FUN-1, showed that the viability was
altered only in some concentrations of HMP. These results suggested that HMP may have
fungistatic action and promote significant changes in cell morphology of Curvularia
pallescens, that may be related to decreased of viability of few cells. Thus, further studies are
needed to identify the mechanisms that induce these alterations.
Keywords: HMP; Fungal; Morphological alterations; Curvularia pallescens.
13
1. INTRODUÇÃO
Os fungos são seres eucarióticos, heterótrofos que desempenham um papel essencial
para a manutenção da vida no planeta. Constituem um grupo grande e heterogêneo encontrado
virtualmente em todos os ambientes e são importantes recicladores da matéria orgânica.
Podem viver em simbiose com plantas e animais, além de servirem como alimentos para
produção de drogas (Lacaz et al., 2002). Estão envolvidos também em processos
biotecnológicos produzindo enzimas, fármacos, ácidos orgânicos, proteínas heterólogas e
metabólitos como o 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona (Wang et al., 2005; Ferreira et al,
2010).
Apresentam organizações celulares básicas do tipo leveduriforme e hifal (uni ou
multinucleada). São revestidos por uma parede celular que confere resistência aos desafios
ambientais, sendo constituída basicamente de quitina e outros polissacarídeos como glicanas e
mananas, possuindo uma porção fibrilar e outra amorfa, composição que pode variar entre os
filos do reino fungi (Tortora et al., 2005).
Sua nutrição ocorre através da secreção para o ambiente externo de uma grande
variedade de enzimas como hidrolases e peroxidases, além de outros metabólitos secundários.
São capazes de decompor os substratos em moléculas menores para que possam atravessar a
parede e a membrana celular. A reserva energética baseia-se no armazenamento de glicogênio
(Papagianni, 2004).
Estima-se que existam cerca de um milhão e meio de espécies fúngicas, com
aproximadamente noventa mil descritas, sendo algumas destas patógenos de plantas e animais
(Margulis & Schwartz, 2001; Putzke & Putzke, 2004). Em alguns fungos, a patogênese
baseia-se principalmente na produção de glicoproteínas, enzimas e pigmentos (Eisenman et
al., 2009). Uma grande variedade de fungos produz pigmentos com diversas funções com
grande destaque para a melanina, um pigmento escuro, que protege contra dissecação,
temperaturas extremas, osmose, radicais de oxigênio, radiação ionizante e radiação
ultravioleta (Wang & Casadevall, 1994; Bryan et al., 2011; Khajo et al., 2011). Dentre as
espécies produtoras de melanina, destaca-se o fungo Curvularia pallescens, alvo de estudo
neste trabalho.
14
1.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS FUNGOS
Os fungos são seres eucarióticos pluricelulares e unicelulares que possuem, na grande
maioria, genoma haplóide. São multinucleados e possuem reprodução sexuada e assexuada.
Não possuem pigmentos fotossintéticos, utilizando fontes energéticas do ambiente onde
vivem para obter compostos orgânicos necessários para seu crescimento e armazenamento de
energia. Os principais compostos armazenados compreendem açucares, alcoóis e lipídios.
Fungos apresentam vida livre, mas podem estabelecer relação mutualística ou parasitária com
outros
organismos.
Os
fungos
estão
distribuídos
em
quatro
grandes
divisões:
Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota. Essa divisão baseia-se nas
estruturas esporuladoras originadas sexuadamente (zoósporo, ascósporo e basidiósporos). Os
fungos que não produzem essas estruturas são denominados fungos mitospóricos
(anamórficos) e são colocados em categorias artificiais como a divisão Deuteromycota ou
subdivisão Deuteromycotina constituindo os fungos imperfeitos (Esposito & Azevedo, 2010).
Quanto à morfologia, os fungos apresentam-se sob duas formas principais,
filamentosa ou hifal e leveduriforme. A primeira possui forma tubular, contendo normalmente
um ou mais núcleos. Podem apresentar paredes transversais denominadas septos que em
algumas espécies possuem poros centrais que permitem o fluxo de material citoplasmático
entre os compartimentos. As hifas que não possuem septos são chamadas de cenocíticas. As
leveduras são células arredondadas que se reproduzem por brotamento (Figura 01).
Figura 1: Morfologia básica dos fungos. (A) hifa cenocítica; (B) hifa Septada; (C) levedura.
Fonte: Winn jr et al., 2008 modificado.
15
As duas formas possuem uma membrana celular constituída por uma bicamada fosfolipídica
intimamente associada a uma parede rígida constituída basicamente por quitina e glucanas,
formando um envoltório que confere resistência as condições adversas do ambiente (Figura
02) (Esposito, 2010). Assim como os demais eucariontes, os fungos apresentam, organelas
que de modo geral desempenham papel similar a de animais e plantas. Possuem núcleo,
mitocôndria e ribossomos que desempenham importante papel no metabolismo oxidativo de
energia e síntese de proteínas. O retículo endoplasmático está associado a secreção de
proteínas (Griffin, 1994). A maioria das espécies fúngicas apresentam complexo de golgi
atípico, constituído de cisternas únicas ou tubulares localizado no ápice das hifas e estão
relacionados a seu cescimento (Bracker et al., 1996). Outras organelas como os vacúlos são
compartimentos intracelulares que podem estar relacionados ao armazenamento de nitrogênio,
empacotamento de enzimas hidrolíticas e síntese e secreção de polissacarídeos extracelulares
(Griffin, 1994; Esposito, 2010). O microcorpo é uma organela que recebe denominação
dependo das enzimas que produzem, quando contêm oxidases produtoras de peróxido de
hidrogênio e catalase são denominados peroxissomos, quando produzem enzimas de beta
oxidação são denominados glioxissomos e ao armazenarem hidrogenases e enzimas
associadas denominam-se hidrogenossomos (Griffin, 1994). Uma organela fúngica que vem
ganhando destaque nos últimos tempos são os corpúsculos lipídicos, que possuem membrana
simples, podem ser observados em esporos e hifas e parecem derivar do retículo
endoplasmático (Esposito, 2010).
Figura 2: Representação esquemática da membrana e parede celular fúngica. Fonte: Kartsonis
et al., 2003 modificado.
16
1.2. ESPÉCIE Curvularia pallescens
O gênero Curvularia pertence ao grupo dos fungos demáceos e está inserido no filo
Ascomycota, classe Euascomycetes, ordem pleosporales e família Pleosporaceae. Habitam
regiões tropicais e subtropicais, e estão presentes no solo e vegetais. Possui cerca de trinta e
cinco espécies, sendo que a maioria é patógeno de plantas (Assunção et al., 2006). Algumas
espécies como C. lunata, C. pallescens e C. geniculata, são patógenos oportunistas podendo
causar infecções em humanos e animais. Estas espécies já foram recuperadas de infecções
humanas como: ceratite micótica, sinusite, endocardite, peritonite, micetoma e infecções do
sistema nervoso central (Ellis et al., 2007; Carter & Boudreaux, 2004; Berbel et al., 2011). As
principais formas de infecção ocorrem através da inalação ou inoculação por soluções de
continuidade da pele (Vachharajani et al., 2005).
A espécie C.pallescens é um patógeno de plantas e animais que apresenta colônias
com bordas irregulares, anverso cotonoso acinzentado e verso variando do castanho ao preto
(Figura 3 A e B). A conidiação é do tipo simpodial, ou seja, brotamento a partir de gemas
laterais (Figura 3 C). Os conídios são retos ou geniculados com três septos e quatro células,
sendo que a segunda é mais volumosa (Freire, 1998).
Figura 3: Características morfológicas de Curvularia pallescens. A) Anverso da cultura; B)
Verso da cultura C) Microcultivo. Fonte: próprio autor.
17
1.3. MELANINA FÚNGICA
A melanina é um pigmento, ubíquo no reino biológico, formado pela polimerização de
compostos fenólicos ou indólicos e apresenta inúmeras funções biológicas (Plonka &
Grabacka, 2006). Em mamíferos a síntese de melanina ocorre em células especializadas
denominadas melanócitos sendo mediada pela enzima tirosinase.
Nos fungos ela ocorre através de duas vias principais, a via DHN (1,8-dihidroxinaftaleno) (Figura 4 A) e a via L-dopa (L-3,4-dihidroxifenilalanina) (Figura 4 B). A
melanina da via DHN é catalisada pela enzima policetídeo síntase que tem como substrato
moléculas endógenas provenientes do metabolismo celular como a acetil-CoA e malonil-CoA.
Através de reações de redução e desidratação produz intermediário como o 1,3,8trihidroxinaftaleno levando a formação do 1,8-dihidroxinaftaleno o qual sofre polimerização
levando à formação de melanina. A segunda é a via L-dopa, semelhante a dos mamíferos,
mediada pelas enzimas tirosinase e lacase. As precursoras nesta via são moléculas exógenas
como tirosina e L-dopa. Quando L-dopa é a molécula precursora a oxidação para
dopaquinona é feita pela lacase. Quando tirosina é o precursor, esta é convertida em L-dopa e
a seguir em dopaquinona. Estas duas etapas são mediadas pela tirosinase (Eisenman &
Casadevall, 2012).
18
Figura 4: Representação esquemática das vias de síntese da melanina fúngica. (A) Via DHN
(1,8-dihidroxinaftaleno); (B) Via L-DOPA (L-3, 4-dihidroxifenilalanina). Fonte: Eisenman &
Casadevall, 2012 modificado.
O local de síntese de melanina fúngica é bem caracterizado em algumas espécies como
Fonsecaea pedrosoi que ocorre em vesículas semelhantes à melanossomos dos mamíferos
(Franzen et al., 2006). Em Cryptococcus neoformans a melanização ocorre em vesículas
presentes na parede celular (Eisenman et al., 2009; Eisenman & Casadevall, 2012).
A melanina fúngica desempenha um papel essencial na biologia e patogênese dos
fungos (Revankar & Sutton, 2010). A sua característica multifuncional baseia-se em suas
características moleculares, que a torna estável e capaz de resistir a processos físico-químicos.
Em fungos patogênicos humanos a função da melanina é bem descrita atuando através de
vários mecanismos. A melanina protege contra radicais livres, “burst oxidativo” (Schnitzler et
al., 1999) e tem ação antioxidante (Jacobson et al., 1995; Gonçalves & Sponchiado, 2005).
19
Fungos melanizados são menos suscetíveis a fagocitose de neutrófilos e macrófagos
(Hayakawa et al., 2006). Nos fungos endofiticos, produtores de melanina, a presença de
apressórios melanizados são essenciais para penetração destas estruturas nos tecidos do
hospedeiro (Gachomo et al., 2010).
Além disso, fungos melanizados são mais resistentes a terapia antifúngica (Van Duin
et al., 2002; Paolo et al., 2006). Essa resistência pode ser devido à ligação das drogas com a
melanina causando bloqueio do fármaco. A melanina pode ligar-se a anfotericina B, uma
droga antifúngica, provocando uma redução na concentração da droga em solução (Ikeda et
al., 2003). Essa função variada da melanina pode explicar o potencial patogênico dos fungos
melanizados (Revankar & Sutton, 2010).
1.4. CORPÚSCULOS LIPÍDICOS
Corpúsculos
lipídicos
(CL)
são
estruturas
esféricas
intracitoplasmáticas,
funcionalmente ativas, encontradas em vários tipos celulares (mamíferos, bactérias, fungos e
plantas) (Murphy, 2001, Reue, 2011, Zhang et al. 2010). Classicamente eram vistos apenas
como reservatório do excesso de gordura, contudo novos estudos acerca da biologia dos CL
têm mostrado que proteínas estão associadas a sua monocamada fosfolipídica, conferindo
função semelhante à de organelas (Murphy et al. 2009, Thiele & Spandl 2008; Tauchi-Sato et
al. 2002). Essas organelas compartimentalizam enzimas envolvidas na biossíntese, transporte
e catabolismo de lipídios (Waltermann et al., 2005).
Esses corpúsculos apresentam em sua superfície, algumas proteínas específicas, como
as pertencentes ao grupo PAT (Perilipinas, ADRP e TIP 47), que estão envolvidas no
armazenamento de lipídio, montagem e biogênese dos CL. Algumas proteínas são
encontradas dentro do ambiente hidrofóbico do corpúsculo, contudo suas funções ainda
permanecem sem entendimento (Robenek et al. 2005, Robenek et al. 2009).
Os CL são bem heterogêneos, possuindo tamanhos que variam de 0.1 a 200 μm de
diâmetro e tal característica pode estar relacionada ao estágio de maturação dessas organelas
(Saka & Valdivia, 2012). A constituição lipídica desses corpúsculos consiste principalmente
de triacilgliceróis (TAG), diacilgliceróis (DAG) e ésteres-esteróis, podendo variar
dependendo do tipo celular (Rinia et al. 2008). Adipócitos apresentam em sua constituição o
predomínio de TAG, enquanto que em leveduras, TAG e ésteres-esteróis estão distribuídos
igualitariamente na célula (Bartz et al. 2007, Leber et al. 1994, Tauchi-Sato et al. 2002).
20
1.4.1. Biogênese dos Corpúsculos Lipídicos
O retículo endoplasmático (RE) é a organela que está diretamente envolvida na
formação dos CL devido possuir a maioria das enzimas necessárias para a biossíntese dos
triacilgliceróis, fosfolipídios e esterificação de esteróis (Murphy, 2001). Atualmente existem
vários modelos que explicam a formação dos corpúsculos lipídicos. Segundo Ohsaki et al.,
2009, três modelos principais são descritos na literatura para demonstrar essa formação.
A hipótese mais aceita para a formação dos CL, sugere que lipídios neutros (LN) em
células de mamíferos acumulam-se entre os espaços da membrana do RE, causando uma
curvatura no folheto citosólico da membrana do retículo com posterior liberação do CL
totalmente formado (Figura 5) (Murphy & Vance, 1999, Ohsaki et al., 2009). O segundo
modelo sugere que a gênese ocorra de forma semelhante ao primeiro modelo, exceto pelo
fato, de os CL ficarem fisicamente conectados ao RE gerando um domínio rico em LN (Saka
& Valdivia, 2012). Um terceiro modelo, chamado de escotilha, postula que após os LN
acumularem-se no espaço intermembranar do RE essa região seria clivada e liberada para o
citosol.
Os CL são encontrados próximos a organelas como mitocôndrias, e peroxisomos as
quais acessam esses lipídios para β-oxidação de ácidos graxos e fornecimento de precursores
para lipidação de proteínas, biossíntese fosfolipídica e biogênese de membrana (Murphy,
2001, Binns et al. 2006, Van Meer et al. 2008).
21
Figura 5: Representação esquemática da biogênese dos corpúsculos lipídicos. Fonte: Martin &
Parton, 2006 modificado.
1.4.2. Função dos Corpúsculos Lipídicos
Os CL podem ser considerados como uma organela multifuncional que está envolvida
em vários processos celulares como sinalização celular e autofagia (Murphy et al., 2009;
Shibata et al., 2009). Uma característica que merece destaque é a relação dos CL com a
patogênese. Agentes patogênicos como vírus, bactérias intracelulares e protozoários induzem
o acúmulo de lipídios na célula hospedeira para posterior utilização nas suas necessidades
metabólicas. Vírus da família flaviviridae como da hepatite C e da dengue possuem proteínas
que se ligam aos corpúsculos lipídicos obtendo precursores para a montagem de novos vírus
(Moradpour et al., 1996; Samsa et al., 2009). Os processos inflamatórios desencadeados por
muitos agentes infecciosos induzem o acúmulo de corpúsculos lipídicos em células do sistema
imune inato como macrófagos, neutrófilos e eosinófilos (Melo et al., 2011). Bactérias
intracelulares como M. tuberculosis e M. leprae associam-se aos CL utilizando-os como fonte
de nutrientes (Daniel et al., 2011; Mattos et al., 2010, Mattos et al., 2011). O protozoário
Trypanosoma cruzi induz acúmulo de CL em macrófagos, que são recrutados para o vacúolo
22
parasitóforo (Melo et al., 2006). Evidências sugerem que os CL também possam participar
como mediadores da resposta imune (Saka & Valdivia, 2012).
Além desses microorganismos, que podem acumular corpúsculos lipídicos em seu
citosol, os fungos de um modo geral merecem destaque, pois ultimamente pouco se sabe
sobre os mecanismos de biogênese dos corpúsculos lipídicos nesses organismos. Alguns
fungos patogênicos, como Plasmodiophora brassicae utilizam os CL durante a formação de
suas estruturas reprodutivas (Losel & Sancholle, 1996).
1.5. DROGAS ANTIFÚNGICAS
Segundo Allen (2010) as principais drogas antifúngicas disponíveis atualmente no
mercado são classificadas como azóis, polienos, equinocandinase e inibidores mitóticos
(Figura 6). Os dois primeiros compostos baseiam-se na inibição de ergosterol e as
equinocandinas inibem a síntese de β-1,3-D-glicano da parede celular. Apesar de sua ação de
amplo espectro, esses antifúngicos, apresentam elevada nefrotoxicidade e hepatotoxicidade.
Além de inúmeros efeitos colaterais como: febre, calafrios, vômitos, diarréia, erupções
cutâneas (Allen, 2010; Lewis, 2011).
Figura 6: Representação esquemática dos alvos de ação das drogas antifúngicas. Fonte:
Lewis, 2011 modificado.
23
1.6. METABÓLITO 5-HIDROXI-2-HIDROXIMETIL-GAMA-PIRONA (HMP)
O HMP ou ácido kójico (Figura 7) é um metabólito secundário produzido por fungos
do gênero Aspergillus e Penicillium a partir de várias fontes de carbono (Rukachaisirikul et
al., 2007; Mohamad et al., 2010). É uma substância cristalina solúvel em água etanol e
acetona (Gomes et al., 2001).
Figura 7: Estrutura química do HMP. Fonte: Chang et al., 2009.
O HMP possui aplicabilidade variada, sendo utilizado principalmente como inibidor
da tirosinase (Papagianni, 2004; Chang et al., 2009), agente antioxidante, aditivo alimentar
(Bentley, 2006; Chusiri et al., 2011), no tratamento de melasma como agente despigmentante
(Lin et al., 2007), ação antitumoral (Tamura et al., 2006), atividade radioprotetora (Bryan et
al., 2011) e atividade fungistática (Chee & Lee, 2003). Além disso, apresentam ação ativadora
e proliferativa sobre células do sistema imune, como macrófagos (Rodrigues et al., 2011).
A ação antioxidante do HMP foi observada em cultura de neutrófilos onde houve uma
diminuição significativa das espécies reativas de oxigênio no sobrenadante. Além disso, os
neutrófilos tratados com HMP apresentaram aumento na quantidade de cálcio intracelular, íon
envolvido na produção de mediadores inflamatórios e na ativação celular (Niwa & Akamatsu,
1991). Devido à ação antioxidante o HMP é usado como aditivo alimentar possibilitando que
frutas, verduras e legumes sejam preservados por mais tempo (Burdok et al., 2001).
A ação clareadora do HMP também foi observada em peixes escuros que eram
alimentados com comidas suplementada com HMP e tornaram-se marrons após 49 dias de
tratamento (Bentley et al., 2006). Esta ação deve-se ao fato deste metabólito ser um potente
inibidor da tirosinase, enzima fundamental para síntese de melanina (Bentley et al., 2006; Mi
24
ha et al, 2007). O HMP é utilizado eficientemente como despigmentante, demonstrando ser
tão eficaz quanto à hidroquinona no tratamento de melasma (Lim et al., 1999).
O HMP tem atividade proliferativa em hepatócitos de camundongos que sofreram
hepatotomia e foram tratados por quatro semanas com alimentos contendo 3% HMP (Moto et
al., 2006; Kono et al., 2007). Em camundongos com lesão na tireóide, tratados por oito
semanas com alimentos suplementados com 2% HMP não foi observada proliferação celular
anormal (Tamura et al., 2006).
Outra aplicação recente desse metabólito é o seu uso como radioprotetor contra
irradiação gama. Essa ação pode estar relacionada com a formação de complexos com
manganês e zinco, que passam a possuir grande estabilidade hidrolítica, tornando-se altamente
lipofílicos ou ainda, devido à atividade antioxidante (Emami et al., 2007; Hosseinimehr et al.,
2009).
Sua ação sobre patógenos humanos foi demonstrada recentemente por nosso grupo,
"Rodrigues (Comunicação Pessoal)", em protozoário do gênero leishmania. Em helminto,
como Schistosoma mansoni, foi detectada diminuição da produção de ovos do parasito devido
à inibição da enzima tirosinase, presente nos vermes adultos (Fitzpatrick et al., 2007). Sua
ação fungistática foi descrita por Chee & Lee (2003), em três espécies de fungos produtores
de melanina. Em fungos filamentosos o HMP parece agir sinergicamente com drogas
antifúngicas convencionais potencializando sua ação (Kim et al., 2013). Entretanto, não existe
na literatura nenhum trabalho descrevendo alterações morfológicas em fungos provocadas
pelo HMP.
25
2. JUSTIFICATIVA
O número de infecções fúngicas tem aumentado nos últimos anos acometendo
severamente pacientes imunocomprometidos. Essas infecções, assim como os fármacos
antifúngicos, têm recebido pouca atenção das autoridades competentes e o surgimento de
novas drogas não tem acompanhado o aumento crescente de micoses em humanos (Di Santo,
2010). Os principais quimioterápicos disponíveis atualmente para o tratamento das doenças
fúngicas, apesar de apresentarem amplo espectro de ação, são altamente tóxicos e
desencadeiam inúmeros efeitos adversos (Allen, 2010; Lewis, 2011). Nos últimos trinta anos
a resistência a antifúngicos tem aumentado devido a fatores intrínsecos aos microrganismos
assim como falhas no tratamento dos pacientes (Pfaller et al., 2011; Wandeputte et al., 2012).
Atualmente há uma tendência da análise das propriedades antifúngicas de compostos naturais
bioativos isolados de diversas fontes biológicas (Mayer et al., 2011).
Portanto, torna-se necessário o desenvolvimento de novos compostos antifúngicos que
atuem em novos alvos específicos. Estudos demonstram que o HMP, um metabólito
secundário produzido pelo gênero Aspergillus, atua como um importante inibidor da síntese
de melanina, além de ativar monócitos e macrófagos. Desta forma, considerando que a
melanina fúngica desempenha um papel protetor para os fungos e a inexistência de trabalhos
na literatura que mostre a ação do HMP sobre as alterações morfológicas em fungos
produtores de melanina, o presente estudo buscou elucidar essas questões.
26
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Analisar a ação do metabólito secundário, 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona
(HMP), sobre o fungo Curvularia pallescens.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
(1) Analisar a ação do HMP sobre conídios e hifas de Curvularia pallescens;
(2) Comparar a ação do 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona HMP comercial e o
HMP biotecnológico sobre o fungo Curvularia pallescens;
(3) Analisar a viabilidade fúngica após tratamento com HMP;
(4) Observar alterações morfológicas das células fúngicas tratadas com HMP.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. OBTENÇÃO DO METABÓLITO HMP
O HMP comercial foi obtido da empresa (Sigma-Aldrich) e o HMP biotecnológico foi
obtido no laboratório de Desenvolvimento de Fármacos da Universidade Federal do Pará
(UFPA). Fungos do gênero Aspergillus foram cultivados em meio Czapek-Dox sólido. Deste
cultivo foi feita uma suspensão de esporos da qual foram inoculados 5 mL em frascos
contendo 400 mL de meio líquido Czapek-Dox e incubados por 10 dias. Posteriormente,
foram realizados repiques a fim de aumentar o crescimento dessa cultura em frascos contendo
500 mL de meio líquido Czapek-Dox (pH 5,5) suplementados com 6% de amido de mandioca
devidamente esterilizado (121 ºC / 15 minutos). Os frascos foram colocados em incubadora
com agitação e temperatura fixas (120 rpm a 28 ºC). A fase líquida obtida do meio de cultura
foi submetida à filtração e em seguida à liofilização para obtenção do material bruto
concentrado. O conteúdo foi transferido para frascos contendo solução de etanol e água na
proporção de 80:20. Extrações consecutivas foram realizadas e os produtos resultantes foram
concentrados por evaporação. O HMP foi obtido por cristalização.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear foi utilizada para caracterizar a
substância. A pureza foi avaliada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE),
sendo considerado puro o material cristalizado com pureza acima de 95%. A estrutura do
HMP foi caracterizada por ultravioleta (UV) utilizando os filtros com comprimentos de onda
de 269 nm (para detecção do HMP).
4.2. OBTENÇÃO, CULTIVO E MANUTENÇÃO DE Curvularia pallescens.
As cepas fúngicas de C. pallescens foram obtidas no Laboratório de Microbiologia do
Instituto Ciências Exatas e Naturais da Universidade Federal do Pará e cultivadas em meio
GPY sólido e líquido (20g glicose, 20g ágar, 5g peptona sódica, 5g extrato de levedura em
1000 mL de água destilada). As amostras foram preservadas em glicerol 5%.
28
4.3. DILUIÇÃO DO METABÓLITO HMP
A solução estoque foi preparada em uma concentração final de 1 mg/mL e diluída em
H2O destilada. As concentrações de 25, 50, 100, 200 µg/mL utilizadas nos experimentos
foram obtidas a partir dessa solução.
4.4. ANÁLISE MICROSCÓPICA
As células de C. pallescens, utilizadas na microscopia, foram obtidas através do
cultivo em meio de cultura GPY sólido e líquido. Em meio sólido foi feito macro e
microcultivo. Para o macrocultivo, fragmentos micelias foram inoculados na superfície do
meio e cultivados por oito dias permitindo o desenvolvimento completo do fungo, enquanto
que para o microcultivo, as células foram cultivadas de acordo com Riddell, 1950. O cultivo
em meio líquido foi feito em placas de 24 poços e mantidos por oito dias em temperatura
ambiente.
4.4.1. Microscopia Óptica de Campo Claro (MOCC)
As células fúngicas cultivadas por oito dias em meio GPY e tratadas com HMP
comercial e biotecnológico, nas concentrações de 25, 50, 100, 200 µg/mL foram coradas com
lactofenol azul de algodão e analisada em microscópio óptico Axiophot Zeiss.
4.4.2. Microscopia Eletrônica Varredura (MEV)
As amostras provenientes do microcultivo foram processadas para MEV. Estas foram
fixadas em uma solução de glutaraldeído 1%, paraformaldeído 4%, sacarose 2,5 % e tampão
PHEM (Pipes, Hepes, EGTA e Magnésio) 0,1 M pH 7,2 por uma hora em temperatura
ambiente e posteriormente colocadas em uma solução contendo glutaraldeído 2,5%,
paraformaldeído 4%, cloreto de cálcio 2,5 mM e tampão cacodilato 0,1MpH 7,4 por uma hora
em temperatura ambiente. Após essa etapa as lamínulas foram lavadas três vezes em tampão
cacodilato 0,1M pH 7.2, pós-fixadas em solução contendo tetróxido de ósmio 1% e
ferrocianeto de potássio1% por uma hora em temperatura ambiente protegidos da luz. As
células aderidas às lamínulas foram lavadas novamente por três vezes no mesmo tampão e
desidratadas em uma série gradual de etanol a 20, 30, 50, 70, 90% (15 minutos cada) com
duas passagens em etanol 100% (20 minutos cada). As amostras foram submetidas ao ponto
crítico de CO2, aderidas em suportes “stubs” com fita de carbono e metalizadas com ouro. As
células foram analisadas em microscópio eletrônico de varredura LEO 1450 VP.
29
4.4.3. Microscopia Eletrônica Transmissão (MET)
C. pallescens foram cultivadas em meio GPY e tratadas com 25, 50, 100, 200 μg/mL
de HMP diluído em H2O destilada. O tratamento foi realizado com 200 μL dessas soluções de
uso, as quais foram inoculadas na superfície do meio de cultura e espalhadas com alça de
Drigalski. Após oito dias de cultivo a superfície das culturas, região intermediária entre o
centro e a periferia, foi raspada com alça “L”, fixadas e pós-fixadas conforme descrito no item
4.4.2. A desidratação foi feita em série gradual de acetona 20, 30, 50, 70, 90% (15 minutos
cada etapa) e duas passagens em acetona 100% (20 minutos cada). Foi feita infiltração em
resina epon/acetona nas concentrações: 1:2, 1:1, 2:1 (12 horas cada). Após infiltração, o
material foi colocado em epon puro com DMP-30 (substância polimerizadora), por 12 horas
em geladeira, emblocados e incubados em estufa a 60 °C por 48 horas para polimerização. Os
cortes ultrafinos foram feitos em ultramicrótomo (Leica EM UC6), posteriormente
contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo e observados em microscópio
eletrônico de transmissão LEO 906 E.
4.5. TESTE DE VIABILIDADE CELULAR EM HIFAS
TRATADAS
COM
HMP
USANDO O FUN®1.
O FUN®1 (2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1phenylquinolinium iodide) é uma sonda fluorescente que em células mortas apresenta
fluorescência difusa variando do verde ao amarelo. Em células metabolicamente ativas é
convertida em estruturas cilíndricas intravacuolares entre o vermelho e o alaranjado, com
diminuição da fluorescência verde citoplasmática. Esta conversão ocorre através do
processamento dos compartimentos ácidos da via endocítica que está preservada em células
metabolicamente ativas.
4.5.1. Análise por microscopia óptica de fluorescência
Fragmentos fúngicos, obtidos a partir de cultura sólida foram inoculados em meio
GPY líquido e cultivados por oito dias. Após esse período 100 µL da cultura líquida foram
retirados e inoculados em placas de 24 poços contendo lamínulas e meio de cultura
suplementado com HMP comercial e biotecnológico nas concentrações de 25, 50, 100, 200
µg/mL e incubados a temperatura ambiente por oito dias. Os controles negativos (células
mortas) foram obtidos após fixação com metanol 100%. As lamínulas contendo hifas aderidas
foram incubadas por 1h com FUN®1 na concentração de 6,25 µM à temperatura ambiente,
30
protegidas da luz e lavadas três vezes com PBS por 10 minutos cada, montadas com
ProLong® Gold antifade e analisadas em microscópio óptico Axiophot Zeiss.
4.6. ANÁLISE CITOQUÍMICA PARA DETECÇÃO DE LIPÍDIOS
4.6.1. Marcação de corpúsculos lipídicos pela coloração sudan black B
O Sudan Black B é um corante que se liga a lipídios e triglicerídeos neutros. As
lamínulas provenientes do microcultivo foram fixadas em solução de etanol 70% por 20
minutos e lavadas em H2O destilada. As células aderidas nas lamínulas foram incubadas com
solução filtrada de Sudan Black B em etanol 70% por 15 minutos. Após esse período, o
excesso de corante foi retirado utilizando etanol a 70%. As lamínulas foram lavadas com água
destilada, montadas com Entellan® e analisadas em microscópio óptico Axiophot Zeiss.
4.6.2. Detecção de corpúsculos lipídicos pelo marcador fluorescente BODIPY®
O BODIPY® (4,4-difluoro-3a,4a-diasa-s-indacene) é um marcador fluorescente
altamente lipofílico, que marca principalmente lipídios neutros presentes em corpúsculos
lipídicos e membrana celular. O comprimento de onda para análise varia de 500 à 650 nm.
As lamínulas provenientes do cultivo em meio líquido foram fixadas com
paraformaldeído 4% por 20 minutos a temperatura ambiente e lavadas com PBS 3 vezes por
10 minutos cada. Em seguida as lamínulas foram incubadas com BODIPY ® , na concentração
de 1 µg/mL em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente protegido da luz, para detecção
dos lipídios neutros presentes nos corpúsculos do microorganismo. Em seguida, as lamínulas
foram lavadas 3 vezes, por dez minutos cada em PBS. Após a secagem das lamínulas, estas
foram montadas em lâminas de vidro com ProLong® Gold antifade e analisadas em
microscópio confocal a laser LSM 5 Pascal Zeiss.
31
4.6.3. Detecção de corpúsculos lipídicos pelo método ósmio-imidazol (Angermüller &
Fahini, 1982)
O complexo ósmio-imidazol penetra rapidamente nas células facilitando a interação da
molécula de tetróxido de ósmio com os lipídios insaturados contrastando fortemente as
inclusões lipídicas. A contrastação deve-se ao imidazol com forte capacidade de ligar-se a
metais.
As células provenientes do macrocultivo foram fixadas como descrito no item 4.4.2.
Após a fixação, as células foram lavadas por 10 minutos em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2
e em tampão imidazol 0,1 M, pH 7,5. Posteriormente foram pós-fixadas em uma solução de
tetróxido de ósmio a 2% e tampão imidazol 0,1 M, pH 7,5 por 30 minutos à temperatura
ambiente, protegido da luz. As células foram lavadas duas vezes em tampão imidazol 0,1M,
desidratadas em acetona e incluídas em resina como descrito no item 4.4.3. Os cortes
ultrafinos obtidos foram contrastados durante 20 minutos com acetato de uranila 5%, e
durante 5 minutos com citrato de chumbo. Ao final o material foi observado em Microscópio
Eletrônico de Transmissão, LEO 906 E. Tanto as células tratadas quanto o grupo controle,
sem tratamento, foram submetidas ao mesmo processamento.
32
5. RESULTADOS
5.1. ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS
A cultura em meio sólido do fungo C. pallescens tratado com HMP comercial e
biotecnológico, em diferentes concentrações apresentou diferenças significativas durante o
período de tratamento. Em relação à morfologia da colônia, houve aparente redução no
tamanho, bem como diminuição na pigmentação do micélio vegetativo, observada
principalmente nas culturas tratadas com HMP na concentração de 200 µg/mL (Figuras 8 E2 e
9 E2), quando comparadas ao grupo controle (Figuras 8 A2 e 9 A2).
Figura 8: Características morfológicas da cultura de Curvularia pallescens, cultivadas com
diversas concentrações de HMP comercial. (A1) controle sem tratamento; (B1-E1) tratadas
com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente; (A1-E1) anverso da
cultura; (A2-E2) verso da cultura.
33
Figura 9: Características morfológicas da cultura de Curvularia pallescens, cultivadas com
diversas concentrações de HMP biotecnológico. (A1) controle sem tratamento; (B1-E1)
tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente; (A1-E1)
anverso da cultura; (A2-E2) verso da cultura.
5.2. ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DE CAMPO CLARO
A análise por microscopia óptica de campo claro de C. pallescens, mostrou algumas
alterações morfológicas, após tratamento com HMP comercial e biotecnológico. Hifas e
conídios sem tratamento apresentaram morfologia característica, como parede íntegra da hifa
e conídio alongado (Figura 10 A e 11 A). As células tratadas com diferentes concentrações de
HMP comercial (Figura 10 B-E) e HMP biotecnológico (Figura 11 B-E) mostraram um
aumento no número de vesículas intracitoplasmáticas nas hifas e conídios. Além disso, foi
observada discreta diminuição na melanização da parede celular, principalmente nas
concentrações de 100 e 200 µg/mL (Figuras 10 e 11 D e E).
34
Figura 10: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial e coradas com lactofenol azul algodão. (A)
controle sem tratamento; (B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial,
respectivamente. Observar que os cultivos tratados apresentam grande número de vesículas
citoplasmáticas (setas) e redução na melanização da parede celular quando comparados ao
controle.
35
Figura 11: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico e coradas com lactofenol azul algodão. (A)
controle sem tratamento; (B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico,
respectivamente. Observar que os cultivos tratados apresentam grande número de vesículas
citoplasmáticas (setas) e redução na melanização da parede celular quando comparados ao
controle.
36
5.3. ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
(MEV)
As culturas de C. pallescens foram analisadas por MEV, para observar mais
detalhadamente as alterações morfológicas de hifas e conídios. Pode-se notar que as células
não tratadas (Figuras 12 A e 13 A) apresentaram morfologia característica, sem alterações. Já
as culturas tratadas com HMP comercial (Figuras 12 B-E) e HMP biotecnológico (Figuras 13
B-E), nas concentrações de 25, 50, 100 e 200 µg/mL apresentaram alterações morfológicas.
Os conídios apresentaram superfície enrugada, característico de desestruturação da parede
celular. Inúmeras vesículas sendo externalizadas foram observadas nas hifas tratadas.
37
Figura 12: Microscopia eletrônica de varredura de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial. (A) controle sem tratamento; (B-E) células
tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente. Observar a
presença de inúmeras vesículas sendo externalizadas (setas longas B, C e E) e conídios
apresentando superfície enrugada (cabeça de setas B, C e D) quando comparados ao controle
sem tratamento. Imagens coloridas no programa Adobe Photoshop®.
38
39
Figura 13: Microscopia eletrônica de varredura de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico. (A) controle sem tratamento; (B-E) tratadas
com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente. Observar a presença
de inúmeras vesículas sendo externalizadas (setas longas D) e conídios apresentando
superfície enrugada (cabeça de setas B, C e E) quando comparados ao controle sem
tratamento. Imagens coloridas no programa Adobe Photoshop®.
40
41
5.4. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET)
Para detectar as mudanças ocorridas em células de C. pallescens tratados com HMP
comercial (Figura 14) e HMP biotecnológico (Figura 15), nas concentrações de 25, 50, 100 e
200 µg/mL foi feita análise por MET de rotina. Foi observada a desestruturação da parte
fibrilar da parede celular em células tratadas (Figuras 14 e 15 B-E), quando comparadas ao
grupo controle, que não recebeu tratamento com a droga, sugerindo que o HMP está atuando
nos componentes da parede celular fúngica. Além dessa desestruturação, observou-se também
a presença de algumas vesículas no interior das células com aspecto irregular e de tamanhos
variados. No entanto, não foi possível detectar a natureza destas estruturas.
42
Figura 14: Microscopia eletrônica de transmissão de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial. (A) controle sem tratamento. (B-E) tratadas com
25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente. Observar a desestruturação da
parte fibrilar da parede celular (setas longas B-E), quando comparados ao controle. Escala da
barra 2 µm.
43
44
Figura 15: Microscopia eletrônica de transmissão de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico. (A) controle sem tratamento. (B-E) tratadas
com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente. Observar a
desestruturação da parte fibrilar da parede celular (setas longas B-E), quando comparados ao
controle. Escala da barra 2 µm.
45
46
5.5. ANÁLISE CITOQUÍMICA DAS VESÍCULAS DE Curvularia pallescens.
A análise citoquímica é uma técnica que permite definir especificamente estruturas
celulares e sua composição bioquímica. Esta técnica é usada para a identificação de proteínas,
carboidratos e lipídios, permitindo sua identificação e localização (Souza, 2007). Para
detecção de lipídios nós utilizamos três técnicas específicas.
5.5.1. Sudan black B
O sudan black B é um corante
lipofílico que marca especificamente lipídios
insaturados, éster colesterol, triglicerídeos e alguns fosfolipídios, através da dissolução do
corantes nestes componentes. Dependendo do tipo de lipídio a ser marcado, a coloração pode
variar do azul ao preto.
A análise das hifas por microscopia óptica de campo claro de C. pallescens tratadas
com HMP comercial e biotecnológico e marcadas com sudan black B, apresentou marcação
específica para lipídios (Figura 16 e 17). As células tratadas com diferentes concentrações de
HMP comercial (Figura 16 B-E) e HMP biotecnológico (Figura 17 B-E) mostraram um
aumento na marcação em toda a extensão das hifas, quando comparadas ao controle sem
tratamento (Figura 16 A e 17 A).
47
Figura 16: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP comercial e marcado com sudan black B. (A) controle sem
tratamento; (B-E) células tratadas com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP comercial,
respectivamente. Observar marcação lipídica em azul em toda a extensão das hifas.
48
Figura 17: Microscopia óptica de campo claro de Curvularia pallescens, cultivados com
diferentes concentrações de HMP biotecnológico e marcado com sudan black B. (A) controle
sem tratamento; (B-E) Células tratadas com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP biotecnológico,
respectivamente. Observar marcação lipídica em azul em toda a extensão das hifas.
49
5.5.2. Bodipy
Para confirmar o acúmulo de lipídios, foi utilizado o marcador altamente lipofílico
fluorescente bodipy. Foi possível observar uma intensa marcação dos corpúsculos lipídicos
intracitoplasmáticos bem como externamente às hifas principalmente nas concentrações de
100 e 200 µg/mL de HMP comercial (Figura 18 D e E) e biotecnológico (Figura 19 D e E),
quando comparada ao grupo controle (Figuras 18 e 19 A). Indicando que possivelmente o
tratamento está promovendo uma maior produção desses corpúsculos.
50
Figura 18: Microscopia confocal de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP comercial e incubados com BODIPY®. (A) controle sem tratamento;
(B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente. Observar
corpúsculos lipídicos extra e intracitoplasmáticos marcados em verde. Escala das barras 10
µm.
51
52
Figura 19: Microscopia confocal de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP biotecnológico e incubadas com BODIPY®. (A) controle sem
tratamento; (B-E) tratadas com 25, 50, 100, 200 µg/mL de HMP biotecnológico,
respectivamente. Observar corpúsculos lipídicos extra e intracitoplasmáticos marcadas em
verde. Escala das barras 10 µm.
53
54
5.5.3. Ósmio-imidazol
Para confirmar os resultados as células foram marcadas pela técnica citoquímica
ósmio-imidazol para detectar lipídios através de MET. Os resultados obtidos mostraram que
as células tratadas como HMP comercial e biotecnológico (Figura 20 e 21) apresentaram hifas
e conídios com acúmulo de corpúsculos lipídicos intracitoplasmáticos, evidenciados por forte
marcação eletrodensa, assim como vesículas contendo lipídios sendo externalizadas (Figura
20 e 21 B-E). Essas estruturas encontravam-se retidas na porção fibrilar da parede celular das
células controle (Figura 20 e 21 A) evidenciando que o tratamento com HMP está
promovendo a desestruturação da parede com consequente liberação dessas vesículas.
55
Figura 20: Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de Curvularia
pallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP comercial. (A) controle sem
tratamento; (B-E) tratados com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP comercial, respectivamente.
Observar presença dos corpúsculos lipídicos (*) e vesículas lipídicas com forte marcação
eletrodensa (setas). Escala das barras 5µm.
56
57
Figura 21: Microscopia eletrônica de transmissão pelo método ósmio-imidazol de Curvularia
pallescens, cultivado com diferentes concentrações de HMP biotecnológico. (A) controle sem
tratamento; (B-E) tratados com 25, 50, 100 e 200 µg/mL de HMP biotecnológico,
respectivamente. Observar presença dos corpúsculos lipídicos (*) e vesículas lipídicas com
forte marcação eletrodensa (setas). Escala das barras 5µm.
58
59
6. VIABILIDADE DAS CÉLULAS FÚNGICAS
Para verificar se o tratamento com HMP estava promovendo a morte das células
fúngicas, foi realizado o ensaio fluorescente FUN®1. Este marcador é uma sonda fluorescente
que avalia a capacidade de processamento endocítico dependente da integridade da membrana
celular fúngica. No presente estudo as hifas apresentaram marcação característica de seu
estado metabólico (Figuras 22 e 23) após tratamento com HMP comercial e biotecnológico.
Para controle negativo as células foram mortas com metanol absoluto (Figuras 22A e 23A).
As células viáveis apresentaram vesículas citoplasmáticas apresentando padrão de
fluorescência vermelho-alaranjada semelhante ao controle positivo, células vivas (Figuras
22B e 23B). As culturas tratadas com 25 µg/mL de HMP comercial (Figuras 22C) e 25 e 50
µg/mL de HMP biotecnológico (Figuras 23 C e D), apresentaram fluorescência verdeamarelada característica de células mortas ou metabolicamente inativas.
60
Figura 22: Microscopia de fluorescência de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP comercial e incubados com FUN®1. (A) controle negativo, células
mortas; (B) controle positivo, células vivas; (C-F) tratados com 25, 50, 100, 200 µg/mL de
HMP comercial, respectivamente. Observar vesículas fluorescentes vermelho-alaranjadas no
interior das hifas em (D, E e F). Escala das barras 20 µm.
61
Figura 23: Microscopia de fluorescência de Curvularia pallescens, cultivados com diferentes
concentrações de HMP biotecnológico e incubados com FUN®1. (A) controle negativo,
células mortas; (B) controle positivo, células vivas; (C-F) tratados com 25, 50, 100, 200
µg/mL de HMP biotecnológico, respectivamente. Observar vesículas fluorescentes vermelhoalaranjadas no interior das hifas em (E e F). Escala das barras 20 µm.
62
7. DISCUSSÃO
A complexa relação entre fungos patogênicos e o hospedeiro envolve diversos
mecanismos que tentam modular o sistema de defesa do hospedeiro. Esses patógenos utilizam
algumas estratégias como produção de pigmentos, enzimas, glicoproteínas e polissacarídeos
que podem estar envolvidos no processo de adaptação do fungo às condições adversas do
hospedeiro, sendo considerados fatores de virulência (Casadevall et al., 2009).
Dentre os pigmentos produzidos, destaca-se a melanina, um pigmento escuro que
apresenta propriedades importantes, atuando como agente antioxidante, antitumoral e inibidor
da mutagênese (Tamura et al., 2006; Chusiri et al., 2011). Apresenta também ação protetora
contra radiações ionizantes, estresse oxidativo e fagocitose, constituindo um dos principais
fatores de virulência envolvidos na interação do patógeno com a célula hospedeira (Schnitzler
et al., 1999; Langfelder et al., 2003; Nosanchuk & Casadevall, 2006; Hayakawa et al., 2006).
Existem substâncias naturais que são capazes de inibir a síntese de melanina, entre elas
destaca-se o ácido kójico ou HMP produzido por fungos do gênero Aspergillus (Ferreira et
al., 2010). O HMP apresenta ação inibidora da enzima tirosinase a qual está envolvida na
síntese de melanina em células de mamíferos e fungos (Papagianni, 2004; Chang et al., 2009;
Ferreira et al., 2010). Substâncias capazes de inibir a síntese de melanina podem promover
importantes modificações na fisiologia e morfologia de fungos patogênicos.
No presente trabalho foi observado, inicialmente, que o HMP comercial e o
biotecnológico, promoveram a inibição da melanização do micélio de culturas do fungo C.
pallescens na concentração de 200 µg/mL do bioproduto, com uma aparente diminuição do
crescimento. Resultados semelhantes foram observados por Chee & Lee (2003) que ao
analisarem a atividade do HMP sobre o fungo patogênico Cryptococcus neoformans,
demonstraram a diminuição no crescimento e pigmentação dessa espécie, atribuindo tal fato à
ação fungistática e despigmentadora da substância. Estudo utilizando o agrotóxico triciclazol,
um inibidor específico da biossíntese de melanina, demonstrou diminuição na melanização e
desestruturação da parede celular do fungo demáceo Fonsecaea pedrosoi (Franzen et al.,
2006). Além disso, outros inibidores da biossíntese de melanina, como carpropamida e
piroquilona, em estudo feito no fungo Diplocarpon rosae, apresentaram uma redução na
melanização com conseqüente diminuição na germinação de conídios e formação de
apressórios (Gachomo et al., 2010).
63
A maioria dos trabalhos descritos na literatura demonstra que a inibição da
melanização
causa
diferentes
alterações
fisiológicas
em
fungos,
entretanto poucos estudos demonstraram alterações morfológicas causadas por estas drogas.
Desta forma, para verificar se o HMP promovia alterações na morfologia de
Curvularia pallescens, primeiramente foram realizadas análises por microscopia óptica. Foi
observado acúmulo de vesículas semelhantes a corpúsculos lipídicos, que posteriormente,
foram confirmadas por técnicas de marcação específica para lipídios como sudan black B e
bodipy. Nosso grupo de pesquisa demonstrou recentemente que o HMP foi capaz de
promover o acúmulo de vacúolos semelhantes a corpúsculos lipídicos em Leishmania
amazonensis (Rodrigues, 2013) e em monócitos humanos (Costa, 2012).
Tendo em vista o acúmulo de vesículas lipídicas, foi realizada também a análise de C.
pallescens por MEV e MET para demonstrar possíveis alterações ultraestruturais relacionadas
ao tratamento com HMP.
Foi observado o acúmulo de inúmeras vesículas
intracitoplasmáticas e externalizadas bem como alterações na parede celular fúngica. Além
disso, através da técnica do ósmio-imidazol para MET, foi possível confirmar a presença de
corpúsculos lipídicos no citoplasma das células fúngicas tratadas com HMP. Os resultados
encontrados no presente trabalho são semelhantes aos descritos por Souza (2008), que
verificou aumento no número de corpos eletrodensos no interior das células do fungo
Cunninghamella elegans, quando tratados com o hidrocarboneto aromático sulforado,
dibenzotiofeno.
Além disso, também foi observada a presença de um grande número de vesículas
externalizadas em culturas tratadas com HMP enquanto que nas células sem tratamento essas
vesículas estavam retidas na porção fibrilar da parede celular. A liberação para o meio
extracelular de vesículas por microorganismos pode ocorrer naturalmente ou por ação de
estímulos externos como drogas, temperatura e defensinas de plantas (Rodrigues et al, 2007).
Em fungos, vesículas externalizadas, podem conter uma grande variedade de moléculas que
podem estar associadas a fatores de virulência, entretanto, o processo de externalização ainda
não é bem esclarecido, podendo ocorrer através de exocitose ou através de vias alternativas
como os exosomos que ocorre em células de mamíferos (Rodrigues et al., 2008; Panepinto et
al., 2009).
64
As células tratadas com HMP também apresentaram desestruturação da parede celular
promovendo liberação das vesículas retidas em sua porção fibrilar. Estudos demonstraram que
vesículas presentes na parede celular de C. neoformans podem conter lipídios e uma série de
enzimas como lacase, urease, fosfatase e polissacarídeos como o glucuronoxilomanana
(GSL), um dos maiores constituintes da parede celular do agente causador da criptococose
(Rodrigues et al., 2007; Rodrigues et al., 2008; Casadevall et al., 2009).
Walker et al., 2010 ao estudar cepas mutantes de Candida albicans para o gene que
codifica quitina sintase, observou que a quitina presente na parede parece regular a
externalização de melanossomos. Além de fungos, a liberação de vesículas também foi
descrita para o protozoário Leishmania major e Leishmania donovani (Hosseini et al., 2013).
Hassani et al., 2011 mostraram que Leishmania mexicana submetida à variação de
temperatura apresentou aumento na síntese de proteínas e exovesículas aderidas a superfície
do parasito.
De acordo com Eisenman et al. (2009), vesículas lipídicas de C. neoformans
apresentam melanina em sua composição. Desta forma, podemos inferir que, devido à
presença de vesículas lipídicas observadas por MET (ósmio-imidazol) em culturas de
Curvularia pallescens tratadas com HMP, este metabólito pode estar induzindo a liberação de
vesículas contendo lipídios possivelmente associado à melanina. Além disso, o acúmulo e
externalização destas vesículas podem estar relacionados com a tentativa do patógeno em se
proteger da ação do HMP.
Tendo em vista, as alterações morfológicas observadas no presente estudo, foi
realizado o teste de viabilidade utilizando FUN®1 para determinar se o tratamento com HMP
estava promovendo a morte celular. A viabilidade das hifas de C. pallescens foi alterada
apenas nas culturas tratadas nas concentrações de 25 µg/mL de HMP comercial e de 25 e 50
µg/mL de HMP biotecnológico. Este resultado pode estar relacionado à ação fungistática da
droga em menores concentrações. Nas concentrações de 100 e 200 µg/mL, o HMP parece não
estar alterando a viabilidade das células, tal fato pode estar relacionado ao aumento do
metabolismo celular do fungo na tentativa de se defender da ação do HMP. Resultados
semelhantes foram encontrados por Frazen et al. (2006), que após tratamento do fungo
Fonsecaea pedrosoi com Triciclazol, observaram que a viabilidade do fungo não foi alterada
significativamente com o tratamento, porém foram detectadas várias alterações morfológicas.
Estes autores sugerem que a desestruturação da parede fúngica pode potencializar o efeito do
65
tratamento com drogas antifúngicas como, por exemplo, a Anfotericina B. Recentemente, foi
demonstrado que o HMP tem ação quimiosensibilizante agindo de forma sinérgica com
drogas antifúngicas comerciais (Kim et al., 2012). O HMP parece estar atuando na
desestruturação da melanina e podendo assim ser utilizado como droga antifúngica associada
a potentes fungicidas.
Desta forma, no presente trabalho, foi possível demonstrar que o HMP promoveu
importantes alterações morfológicas na parede celular de C. pallescens, induzindo uma
intensa liberação de vesículas lipídicas que podem estar associadas à melanina, demonstrando
que o HMP pode ser um importante agente antifúngico em fungos produtores de melanina ou
até mesmo atuar de forma sinérgica com drogas antifúngicas convencionais para o tratamento
de doenças fúngicas de importância médica e drogas antifúngicas usadas na agroindústria.
66
8. CONCLUSÃO
Nossos resultados permitem concluir que:
1. O HMP foi capaz de promover diminuição na melanização em C. pallescens,
principalmente nas maiores concentrações.
2. O HMP promoveu alterações morfológicas, uma vez que se observou o acúmulo
de vesículas citoplasmáticas, desestruturações na parede celular e externalização
de vesículas.
3. O
HMP
comercial
e
biotecnológico
promoveu
importantes
alterações
morfológicas.
4. O HMP biotecnológico apresentou ação semelhante ao HMP comercial podendo
ser utilizado como um possível agente fungistático já que sua obtenção possui
menor custo.
67
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