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BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 ASSESSORIA DE COOPERAÇÃO INTERNACIONAL - ASCIN/CNPq COORDENAÇÃO DE COOPERAÇÃO BILATERAL Plano de Ação Brasil-Suíça DETALHAMENTO DA PROPOSTA Título: Vigilância de vetores de dengue dirigida à avaliação de risco de transmissão de DENV. Coordenador : Leda Narcisa Regis Instituição : Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ 1.Sumário Dengue é a mais importante virose transmitida por mosquitos no mundo, principalmente no Brasil. Espécies invasivas de mosquitos desempenham um papel chave no seu aumento exponencial, incluindo a Europa, onde os primeiros casos autóctones de dengue foram registrados em 2010. Neste projeto pretendemos avaliar o potencial para a transmissão de dengue através de estudos sobre a competência vetorial, abundância sazonal, a preferência por hospedeiros e a susceptibilidade ao Bti em Aedes aegypti e Aedes albopictus para tentar aperfeiçoar o sistema de vigilância e controle destes vetores no Brasil e na Suíça. O projeto será executado por instituições dos dois países conforme descrito abaixo: Brasil Os trabalhos de campo serão realizados em Fernando de Noronha e Recife, ambos localizados no estado de Pernambuco, nordeste do Brasil. Todo o trabalho experimental será feito no Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz, Ministério da Saúde (Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, CPqAM/FIOCRUZ/MS) Suíça Os trabalhos de campo serão realizados em Ticino, localizado no Sul da Suíça, em colaboração com o Instituto Cantonale di Microbiologia. Os trabalhos de biologia molecular serão conduzidos no Swiss TPH, enquanto os estudos de proteômica (MALDI-TOF) serão feitos na Mabritec AG e no Instituto Cantonale di Microbiologia, Ticino. 1 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 2. Antecedentes Estado da arte Nas últimas décadas, a dengue aumentou exponencialmente e tornou-se a mais importante doença viral em humanos, transmitida por mosquitos. A transmissão nas populações humanas ocorre através da picada do mosquito Aedes infectado com qualquer um dos sorotipos do vírus da dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4). A doença está disseminada na maior parte do sudeste da Ásia, no Pacífico, no subcontinente Indiano, África sub Saariana, América Central e do Sul e Caribe [1]. Oitenta por cento dos casos de dengue da América do Sul ocorrem no Brasil [2]. Devido ao aumento de viagens internacionais e dispersão pelo globo de espécies de Aedes competentes para o vírus dengue, a doença também está se tornando uma séria ameaça na Europa. Relatos de casos de dengue importados para a Europa têm aumentado [3], e no ano passado, os primeiros casos autóctones foram relatados na França [4] e na Croácia [5]. No Brasil, o principal vetor é o A. aegypti [6], alvo do Programa Nacional de Controle de Dengue (PNCD) [7]. Como os ovos de A. aegypti não são tolerantes a baixa temperatura, este mosquito é ausente da Europa, com poucas exceções de recentes registros em Madeira e Sudeste da Rússia. Na Europa, os casos de dengue têm sido associados ao A. albopictus, e também com surtos de chikungunya na província de Ravenna (Itália) em 2007 [8]. Na Suíça, A. albopictus foi detectado pela primeira vez em 2003 e está bem estabelecido em áreas ao sul deste país (i.e. Canton Ticinio) [9]. Embora apresente um papel muito menos importante, A. albopictus está presente em pelo menos 20 dos 27 estados brasileiros [10]. Registros da detecção de larvas de A. albopictus positivas para DENV sugerem que esta espécie pode ter um papel na transmissão do vírus ([11,12]). Além disso, A. albopictus foi também relacionada a surtos de dengue febril em Seicheles em 1977-78, La Reunion e Havaí em 2001-2002 [13]. Em resumo, enquanto A. aegypti é o vetor primário da dengue, existem também evidências que sugerem um papel para o A. albopictus, particularmente na Europa, onde A. aegypti é ausente. Lógica Um aumento exponencial no número de casos de dengue no Brasil, aliado à recente introdução do sorotipo 4, traz à tona um grave problema de saúde pública [14]. Simultaneamente, a Europa está enfrentando os primeiros casos de infecção autóctone de dengue [4]. Como não existem vacinas, ou tratamentos específicos, estes fatos revelam a necessidade de desenvolver melhores sistemas de vigilância e controle do vetor para reduzir a disseminação do DENV e os riscos de epidemias. Vários fatores determinam o limiar para transmissão de dengue e a probabilidade de epidemias [15,16]. Do ponto de vista do vetor, a competência vetorial, a freqüência do contato hospedeiro-vetor e a susceptibilidade às medidas de controle vetorial são elementos chave na avaliação de potenciais riscos de transmissão e do papel individual das espécies vetoras. A competência vetorial de populações de Aedes para o DENV varia consideravelmente [17,18,19] e estas espécies freqüentemente mostram distribuição descontínua, com sítios de reprodução localizados, devido às baixas taxas de dispersão e reintroduções [20,21], por exemplo. Com o objetivo de compreender melhor estes fatores, nós propomos avaliar a competência vetorial, abundância sazonal, preferência de hospedeiro de A. aegypti e A. albopictus sob condições específicas no Brasil e na Suíça. Os dados a serem obtidos neste projeto poderão, no futuro, fornecer conhecimentos e métodos para subsidiar o aperfeiçoamento dos atuais sistemas de vigilância em ambos os países e fornecer a base para acessar os riscos de epidemias de dengue. 3. Objetivos 2 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 O objetivo geral desta proposta conjunta é avaliar o potencial de transmissão de dengue pelas espécies invasivas de mosquitos, Aedes aegypti e A. albopictus, no Brasil e na Suíça. Embora no Brasil A. aegypti seja o principal vetor de dengue, A. albopictus pode também estar implicado na transmissão. Na Suíça, bem como na Europa, A. aegypti não ocorre e, a transmissão do DENV está associada ao A. albopictus. Nós propomos avaliar a competência vetorial, abundância sazonal, susceptibilidade ao larvicida Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) e preferência de hospedeiros nos dois vetores no Brasil e na Suíça focalizando nos seguintes objetivos específicos: -Mapear a distribuição espacial e temporal de A. aegypti e A. albopictus em diferentes áreas de Pernambuco (Brasil) e de Ticino (Suíça); -Identificar a preferência por hospedeiros em A. albopictus de Pernambuco e Ticino, usando novas ferramentas de análise da alimentação sanguínea; -Estimar e comparar a competência vetorial de populações locais de A. aegypti e A. albopictus para os quatro sorotipos virais em laboratório sob diferentes condições de temperatura; -Determinar e comparar o status de susceptibilidade de populações locais de A. aegypti e A. albopictus ao larvicida Bti, o qual é usado no controle do vetor nos dois países. 4. Aspectos da parceria As instituições envolvidas, bem como as equipes, são altamente complementares. A coordenadora da equipe do CPqAM-FIOCRUZ, Dra. Lêda Regis e sua equipe, tem atuado em controle de vetores desde 1992, estudando vários aspectos de biologia e controle de vetores, os quais incluem comportamento, métodos e estratégias de controle, larvicidas microbianos, resistência a inseticidas, interação vetor-patógeno. A infra-estrutura do Departamento de Entomologia (CPqAM-FIOCRUZ) é adequada, o laboratório e insetários estão bem equipados e apresentam todas as condições para o desenvolvimento dos estudos de biologia de vetores propostos. Esta equipe também faz parte do Serviço de Referência para Controle de Culicideos, o qual presta consultoria para órgãos públicos responsáveis pelos programas de controle de vetores. Dr. Pie Müller é entomologista médico e ingressou recentemente no Swiss TPH como chefe do centro de controle de vetores. Ele é expert em resistência de insetos e fisiologia de mosquito, através de abordagens genômicas e proteômicas. Adicionalmente o Swiss TPH mantém uma estreita associação com a Mabritec AG, através de vários projetos em andamento e está representada neste projeto através do Dr. Guido Vogel. O Dr PD Mauro Tonolla lidera a equipe de controle de vetores (Gruppo cantonale per la Lotta alle Zanzare, GLZ) que executa o programa de controle de Aedes no distrito de Ticino, na Suíça. Além desta função ele é microbiologista e possui uma ampla experiência no uso de Bti e supervisiona as análises de diagnóstico de rotina através de MALDI-TOF MS. Este projeto irá subsidiar o treinamento de pelo menos dois jovens pesquisadores no Brasil e na Suíça, respectivamente Duschinka Guedes e Tobias Suter, os quais irão interagir intensivamente durante o projeto durante as visitas institucionais e trabalhos nas áreas de estudo em cada país. Tobias Suter terá a oportunidade de trabalhar em área altamente endêmica para DENV e a Dr. Duschinka Guedes será treinada em técnicas de proteômica que ela irá transferir para o grupo no Brasil. 3 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 5. Plano de pesquisa detalhado e Metodologia Objetivo 1: Mapear a abundância sazonal e distribuição espacial de A. aegypti e A. albopictus em Pernambuco (Brasil) e em Ticino (Suíça). Lógica Um método eficiente e sensível de coleta para a amostragem em larga escala de espécies de mosquitos do gênero Aedes é a base para avaliar a abundância e o impacto das estratégias de controle vetorial. No Brasil, o Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD) usa diversos índices para monitorar as populações de Aedes que estão relacionados ao percentual de imóveis infestados com larvas e/ou pupas (Índice Predial) e ao número de recipientes/reservatórios positivos para estas formas pré-imaginais por 100 imóveis inspecionados (Índice de Breteau). Estes índices, contudo, têm mostrado níveis baixos de infestação pelo mosquito, ou mesmo resultados negativos em áreas onde A. aegypti está presente em 60% a 90% dos imóveis [22,23]. De fato, a complexidade da atual realidade urbana aponta para a necessidade de desenvolver novas ferramentas para a prática de vigilância epidemiológica e para complementar ou mesmo substituir os métodos atuais, os quais foram concebidos há 80 anos [24]. Por outro lado, a abundância populacional de A. albopictus na Suíça é indiretamente estimada a partir do número de ovitrampas letais (tratadas com Bti) positivas e negativas. A princípio, ovitrampas representam um método barato e sensível para coletar ovos de mosquitos, o que faz delas uma ferramenta valiosa para a vigilância [25]. No entanto, a densidade de A. albopictus na Suíça ainda precisa ser mapeada, independente do tipo de intervenção usada para seu controle, caso contrário, as estimativas baseadas apenas na positividade de ovitrampas podem levar a erros sistemáticos de monitoramento. Assim, sugerimos utilizar dois métodos independentes, mas complementares, de captura do Aedes para vigilância em nossas áreas de estudo; ovitrampas para coletar estágios imaturos e armadilhas adesivas para adultos. Abordagem Nós sugerimos, como um primeiro passo no projeto, mapear a abundância sazonal e a distribuição espacial de A. aegypti e A. albopictus em três áreas, duas no Brasil onde A. albopictus está presente ou ausente, e uma em Ticino, na Suíça, onde ocorre apenas A. albopictus. Os mosquitos serão obtidos utilizando duas técnicas de coleta, uma armadilha adesiva desenvolvida recentemente [26] e um modelo modificado de ovitrampa [27], a fim de avaliar e comparar métodos de captura para diferentes ambientes e espécies de mosquitos. Áreas de estudo. O grupo de pesquisa brasileiro já desenvolveu um Sistema de Monitoramento e Controle Populacional de A. aegypti, chamado SMCP-Aedes [28], implantado na ilha principal de Fernando de Noronha, um arquipélago distante 545 km da costa de Recife, Brasil. Nesta área, A. albopictus está ausente, portanto, selecionaremos um outro local, em Recife, Pernambuco, Brasil, onde o A. albopictus é encontrado juntamente com A. aegypti. A terceira área de estudo será Ticino na Suíça, uma região de fronteira com o norte da Itália, onde A. albopictus está atualmente presente. Coleta de Aedes. Em Recife e Ticino, usaremos tanto a ovitrampa adaptada do modelo de Fay e Eliason [27] descrita em Regis et al. (2008), quanto a armadilha adesiva recentemente desenvolvida [26], para registrar a dinâmica sazonal e abundância espacial nas áreas de estudo acima. As armadilhas serão instaladas e distribuídas nos mesmo sítios sentinela, a distâncias 4 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 seguras, de cerca de 80 m [25], para evitar a potencial competição. Os exemplares capturados pelas armadilhas adesivas serão acondicionados adequadamente para posterior análise da origem do repasto sanguíneo, conforme descrito no objetivo 2. Processamento de dados e análises. Mapas quinzenais de distribuição espaço-temporal do Aedes spp. serão gerados com base na coleta permanente de ovos por armadilhas-sentinela, geograficamente referenciadas, instaladas em estações distribuídas na área urbana, de acordo com o SMCP-Aedes [25,28]. O conceito fundamental deste sistema é integrar aspectos da biologia do vetor com a população humana e os dados ambientais através da criação de um sistema de vigilância entomológica com base em informações geográficas, para dar suporte à vigilância epidemiológica e controle da dengue. O número de ovos e adultos fornecido será inserido em um banco de dados, gerando automaticamente mapas que indicam os focos de reprodução de Aedes nas áreas que poderiam ser considerados de altíssima prioridade para as atividades de controle. Os dados também permitirão comparar e avaliar os dois métodos de captura em três cenários sócio-ecológico completamente diferentes. Objetivo 2: Identificar a preferência de hospedeiros de A. albopictus de Recife (Brasil) e Ticino (Suíça) usando novas ferramentas para análise de alimentação sanguínea em mosquitos. Lógica A identificação de hospedeiros de mosquitos e uma melhor compreensão dos padrões de alimentação dos mesmos são essenciais para entender o papel das espécies como vetores. Os padrões de alimentação sanguínea ajudam a avaliar a ameaça que espécies de mosquitos específicas representam para a saúde humana e a determinar o seu papel na transmissão da doença. Até o momento, existe pouca informação disponível sobre o padrão de comportamento alimentar dos mosquitos Aedes, e não há informações sobre os hábitos alimentares de A. albopictus de Recife (Brasil) e nem da Suíça. Identificar a fonte de alimentação sanguínea é, contudo, particularmente importante para A. albopictus, por que esta espécie tem a habilidade de colonizar tanto áreas silvestres como áreas urbanas e, portanto ela poderia ser eficiente e ecologicamente adequada para servir de ponte, conectando os dois ambientes, para veicular outros arbovírus, como por exemplo, o vírus da febre amarela [29]. A razão para a escassez destes dados são particularmente devidas à dificuldade em se coletar fêmeas alimentadas desta espécie diurna de mosquito exofílico, além dos protocolos laboriosos e dispendiosos que envolvem seqüenciamento genômico para analisar o conteúdo da alimentação sanguínea de mosquitos, por exemplo [30]. Por outro lado, métodos mais simples usando pares de primers específicos, como por exemplo [31] ou teste direto de ELISA (enzyme-linked immunobsorbent assay) [32] não detectam espécies que não foram incluídas no ensaio. Abordagem Nesta etapa serão coletados adultos de A. albopictus alimentados para identificar a preferência por hospedeiros desta espécie em nossas áreas de estudo durante a vigilância a ser feita no objetivo 1. Nós iremos avaliar o conteúdo da alimentação sanguínea (a) por análise de seqüência (b), e em paralelo, nós iremos desenvolver e testar novas abordagens que medem o perfil proteômico por espectrometria de massa (MS) visando fornecer uma nova ferramenta para análise de conteúdo de alimentação sanguínea de mosquito que irá reduzir dramaticamente o trabalho, custo e tempo e que poderia permitir a análise em larga escala (high-throughput) em programas futuros de vigilância. 5 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Coleta de mosquitos. Nós iremos coletar espécimes usando armadilhas adesivas [26], que recentemente mostraram-se eficientes para esta finalidade [33]. Coleta da alimentação sanguínea e sequenciamento de COI. A alimentação sanguínea será coletada de abdomens de mosquitos alimentados e dividida em duas amostras. O DNA será extraído de uma amostra para realizar a amplificação por PCR do gene Citocromo oxidase I (COI). Os produtos de PCR do COI serão seqüenciados e as seqüências usadas para identificação do hospedeiro (www.barcodeoflife.org) [34]. MALDI-TOF MS. O seqüenciamento de produtos de PCR, de amostras de mosquitos provenientes de programas de vigilância, as quais são comumente numerosas, pode se tornar muito laborioso e lento com o aumento do número de amostras. Como alternativa, um método mais rápido e menos laborioso nós iremos avaliar o sistema MALDI-TOF MS usando nosso próprio material (segunda amostra), seqüenciado e já identificado como referência, assim como amostras de banco de dados quando disponíveis (por exemplo, http://globin.cse.psu.edu). MALDI-TOF MS é um método altamente sensível que permite a análise de hemoglobinas de uma única hemácia [35] e é aplicado para detectar variantes de hemoglobinas em avaliações clínicas [36]. Como as seqüência de aminoácidos das proteínas globinas nas hemoglobinas usualmente diferem entre espécies, esta técnica mostra um grande potencial para identificar a alimentação sanguínea dos mosquitos. Objetivo 3: Estimar e comparar a competência vetorial de populações locais de A. aegypti e A. albopictus aos quatros sorotipos virais sob condições climáticas reais. Lógica Um determinante chave para a transmissão do vírus dengue, além da abundância de vetores (objetivo 1) e da preferência pelo hospedeiro (objetivo 2), é a competência vetorial. Esta pode variar não somente entre espécies, mas também entre populações da mesma espécie. Quando comparado ao A. aegypti, o A. albopictus desempenha um papel relativamente menos relevante em relação à transmissão do DENV, o qual está provavelmente relacionado às diferenças em relação à preferência alimentar bem como à reduzida competência vetorial [37]. Entretanto, o A. albopictus pode ter um papel relevante nas infecções pelo DENV, particularmente em locais onde o A. aegypti está ausente [13,38,39,40]. Uma importante limitação relativa aos estudos de infecção experimental é que a suscetibilidade e taxas de replicação viral podem ser dependentes da temperatura. De fato, Westbrook et al. [41] demonstraram que fatores climáticos, tal como a baixa temperatura durante a fase larvária, podem aumentar a competência de fêmeas adultas para arbovírus. Como conseqüência, o conhecimento da competência vetorial das populações de Aedes, específicas para as condições climáticas próprias de cada local, permitiria estimar o nível de risco de transmissão do vírus dengue de forma mais precisa. Abordagem Nós pretendemos analisar as populações naturais de A. aegypti (Brasil) e A. albopictus (Brazil e Suíça) em relação ao nível de suscetibilidade para os quatro sorotipos do DENV e determinar a expressão de moléculas que foram previamente descritas como estando associadas à suscetibilidade ao DENV [42,43]. Nosso objetivo é mensurar a resposta destas populações aos diferentes sorotipos e confirmar o papel de determinadas moléculas associadas à suscetibilidade para cada um deles. 6 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Colônias de mosquitos. Ovos de populações naturais analisadas nos objetivos 2 e 3 serão coletados nas áreas de estudo do Brasil e da Suíça, e serão transferidos para o laboratório do CPqAM/FIOCRUZ a fim de estabelecer colônias para os estudos de infecção experimental. Infecções experimentais. Os experimentos serão realizados em um laboratório de biosegurança nível 3 disponível no CPqAM/FIOCRUZ. Os mosquitos serão infectados oralmente com o DENV (os quatro sorotipos) através de alimentadores artificiais. As infecções positivas serão visualizadas através de imunofluorescência (IFA) e a carga viral será quantificada através de ensaios de transcrição reversa quantitativa (qRT) PCR, de acordo com protocolos previamente estabelecidos pelo grupo do CPqAM-FIOCRUZ [44,45]. As linhagens de DENV a serem utilizadas nas infecções orais, foram previamente isoladas de pacientes do Recife, Brasil. As colônias de mosquito serão caracterizadas em relação à competência vetorial através da taxa de infecção disseminada (DIR), da taxa de barreira de infecção do intestino (MIB) e da taxa de escape da barreira do intestino (MEB) os quais serão determinadas através de imunofluorescência e ensaios de qRT PCR, segundo Sylla et al. [46]. Os experimentos de infecção serão realizados em diferentes temperaturas simulando as condições de campo encontradas no Brasil e na Suíça. Objetivo 4: Determinar e comparar a susceptibilidade de populações de A. aegypti e A. albopictus ao biolarvicida Bacillus thuringiensis var. israeliensis (Bti) aplicado em ambos os países. Lógica A resistência de insetos tem sido registrada para vários compostos inseticidas e representa um dos maiores desafios para o sucesso do controle de vetores [47]. A avaliação da suscetibilidade de populações de insetos expostas é essencial para garantir a eficácia dos tratamentos. Tanto na Suíça, como no Brasil, os programas de controle de Aedes são baseados na aplicação do biolarvicida Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) que possui ação especifica para mosquitos. O Bti tem desempenhado um papel muito relevante no programa de controle do A. aegypti desde 2000 (e.g. único larvicida permitido para uso em F. de Noronha) além de também ser um componente estrutural dos programas de controle de Aedes na Europa [48]. O modo complexo de ação do Bti, baseado na ação combinada de quatro toxinas, reduz o risco potencial de seleção de resistência [49]. Embora muitos estudos tenham demonstrado a eficiência do Bti [50] sugerindo a ausência de resistência em campo, já foi demonstrado que a resistência às toxinas individuais pode ser selecionada em condições de laboratório [49,51], e alguns estudos mostraram alterações na suscetibilidade ao Bti da ordem de 3 vezes [52]. Embora a resistência ao Bti tenha um baixo potencial, comparado ao cenário de resistência já descrito para diversos inseticidas químicos, uma avaliação contínua deve ser mantida a fim de evitar falhas que possam comprometer a eficácia das atuais estratégias de controle de Aedes. Abordagem O presente estudo visa avaliar a suscetibilidade das larvas aos produtos a base de Bti, bem como a suscetibilidade às toxinas individuais e em combinações, a fim detectar níveis iniciais de resistência. Nós esperamos abranger aspectos relevantes para a sustentabilidade do uso do Bti em programas de controle, além de produzir conhecimento para desenvolver ferramentas mais robustas para avaliar o risco de resistência. A linha de base da suscetibilidade das populações de Aedes das áreas estudadas ao Bti será determinada a partir de bioensaios. Amostras de populações de Ticino e Recife serão 7 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 estabelecidas em laboratório (CPqAM e a Estação de Campo do Instituto Cantonale di Microbiologia, TI) e a susceptibilidade ao Bti e às toxinas individuais serão estabelecidas através de bioensaios adaptados para este finalidade [53]. A susceptibilidade das populações tratadas serão comparadas com as colônias suscetíveis de referência mantidas no CPqAMFIOCRUZ. Em paralelo será estabelecida uma colônia de A. aegypti selecionada com o Bti em condições de laboratório, por sucessivas gerações com a finalidade de obter uma linhagem resistente às toxinas individuais. De acordo com os resultados obtidos esta colônia será submetida a uma analise molecular, através de colaboração entre o CPqAM/FIOCRUZ e o Swiss TPH, antecipando assim um desdobramento do atual projeto. Divisão de atividades As atividades propostas para os dois anos de projeto serão divididas entre os grupos envolvidos e cada pesquisador conforme mostra a tabela abaixo: Pessoa responsável Instituição Atividades CPqAM/FIOCRUZ Dr Lêda Regis Coordenação do projeto no Brasil Dr Constância Ayres Dr Maria A. Varjal de Melo Dra Claudia F. de Oliveira Dr Maria Helena N. Lobo Silva-Filha Dr Miguel Monteiro Ms Duschinka Guedes CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ INPE CPqAM/FIOCRUZ Supervisão dos trabalhos de laboratório no Brasil Supervisão dos trabalhos de campo no Brasil Supervisão das infecções com DENV Supervisão dos bioensaios no Brasil Análise dos dados de distribuição de Aedes Pós-doc- Infecções com DENV Dr Pie Müller Swiss TPH Supervisão dos trabalhos de laboratório na Suíça Mr Tobias Suter Swiss TPH Estudante de doutorado- Trabalhos de campo e laboratório na Suíça PD Dr Mauro Tonolla Instituto Cantonale di Microbiologia, TI Supervisão dos trabalhos de campo na Suíça Dr Guido Vogel Mabritec AG, Switzerland Supervisão das análises de MALDITOF 6. Resultados esperados e Plano de difusão A presente proposta irá gerar dados de alta qualidade a serem utilizados para avaliar o risco de transmissão do DENV e de epidemias no Brasil e na Suíça. Além disso, o projeto de pesquisa irá comparar atuais e novos métodos de controle, aperfeiçoar a qualidade dos dados e o processo de tomada de decisões para a vigilância da dengue e do controle de vetores, de uma forma integrada. Os resultados deste projeto terão um impacto relevante para os gestores de programas de controle da dengue e nós iremos usar a nossa ampla rede de colaboradores em países endêmicos a fim de assegurar a rápida disseminação das informações para os gestores 8 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 de programas. Nós também temos o objetivo de desenvolver uma nova abordagem para o estudo do comportamento da hematofagia de mosquitos, o qual pode ser transferido para outros vetores, tais como carrapatos e flebotomíneos, e ser usado em monitoramento de rotina dos programas. Finalmente, as equipes irão estabelecer colônias de mosquito e dados de referência que servirão de base para futuros trabalhos de colaboração que incluem estudos de mecanismos moleculares de resistência, interação mosquito-vírus e genética de populações. Os resultados deste projeto serão publicados em congressos internacionais e em periódicos indexados de alto nível. Perspectivas Esta proposta está parcialmente situada no âmbito do projeto Aedes-SMCP que já está em desenvolvimento e tem o apoio da FIOCRUZ e CNPq, no Brasil. Parte do estudo a ser desenvolvido na Suíça terá o apoio do distrito de Ticino e fará parte de uma nova iniciativa de coordenação e controle de Aedes neste país. Novas oportunidades de financiamento no Brasil e na Suíça, bem como em outras fontes, serão identificadas para dar continuidade a esta colaboração. Do ponto de vista cientifico, o estabelecimento de colônias de mosquito resistentes e a geração de dados de referência poderão ser futuramente explorados através da análise de mecanismos moleculares de resistência a inseticidas, interação vírus-mosquito e genética de populações. Esta pesquisa em colaboração também permitirá o desenvolvimento de marcadores genéticos/proteômicos úteis para monitorar populações de mosquito. O Swiss TPH também possui forte experiência em modelagem matemática e estatística espacial que pode ser explorada para integrar dados deste, e de futuros projetos, com o objetivo de gerar modelos de avaliação de risco da dengue e estratégias de intervenção adequadas. Dr. Constância Ayres, a qual irá diretamente auxiliar Dr Lêda Regis, e Dr. Pie Müller já tiveram um experiência prévia como pesquisadores assistentes durante o pós-doutorado de ambos no Vector Group, da Liverpool School of Tropical Medicine no Reino Unido. Nesta ocasião eles já deram início, a um projeto de genômica comparativa de mosquitos (manuscrito em revisão). O programa BSJRP terá, portanto, uma excelente oportunidade de fomentar a colaboração entre os grupos de pesquisa no Brasil e Suíça. Um importante aspecto na Suíça é a limitação em termos de entomologistas de vetores e este projeto poderá subsidiar, através do apoio de Tobias Suter, o desenvolvimento de capacidade nesta área do conhecimento na equipe. É importante ressaltar que, dois produtos principais podem resultar deste estudo: a tecnologia do SMCP-Aedes a qual poderá ser transferida para os órgãos de saúde da Suíça e para o PNCD no Brasil, e um novo método para a identificação da fonte alimentar usado pelos vetores o qual será extremamente útil para melhor caracterizar o ciclo de transmissão da doença. 7. Questões éticas, de segurança e regulatórias Este projeto será desenvolvido de acordo com as normas da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP (resolução 196/96) e será executado apenas após a sua aprovação pelo referido Comitê. As atividades propostas na Suíça não envolvem o uso de animais ou seres humanos. 9 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Visitas planejadas Equipe visitante Dr Pie Müller (Swiss IPH) Mr Tobias Suter (doutorando, Swiss IPH) Dr Alice varjal, Mr Miguel Monteiro (CPqAM-FIOCRUZ) Ms Duschinka Guedes (pós-doc, CPqAMFIOCRUZ) Dr Pie Müller (Swiss IPH) Equipe visitada Dr Lêda Regis, Dr Constância Ayres (CPqAM-FIOCRUZ) Dr Lêda Regis, Dr Constância Ayres (CPqAM-FIOCRUZ) Objetivo 1ª Reunião: início do projeto, visita da área de estudo (Recife) Treinamento (estudos de transmissão, atividades de controle de Aedes em Recife) Visita atividades de controle de Aedes em Ticino Treinamento (análise proteômica por MALDI-TOF) Período e duração Mês 1, 10 dias Mês 12, 6 meses Dr Pie Müller, Dr Mês 2-4, 10 dias Mauro Tonolla (Swiss IPH) Drs Pie Müller, Mês13, 6 meses Guido Vogel (Swiss IPH, Mabritec) Dr Lêda Regis, Dr 2ª Reunião: avaliação Mês 13, 10 dias Constância Ayres do andamento projeto (CPqAM-FIOCRUZ) Referências 1. 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Summary Project title Surveillance of dengue vectors directed to assessing the risk of DENV transmission Name and address of the Swiss university Swiss Tropical & Public Health Institute, Socinstrasse 57, PO Box, CH-4002 Basel Name of person in charge Dr Pie Müller Name of contact person (if different from person in charge) Telephone number +41 (0)61 284 8241 Email address [email protected] Telephone number Postal address Socinstrasse 57, PO Box, CH-4002 Basel Postal address Email address Name and address of the Brazilian University Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/ FIOCRUZ Av. Moraes Rego, s/n campus da UFPE, Cidade Universitária. Recife-PE Brasil Name of person in charge Dr Lêda Narcisa Regis Name of person in charge (if different from person in charge) Telephone number +55 81 21012552 Telephone number Email address Lê[email protected] Email address Postal address CEP 50670-420 Postal address Short research summary (max. 5 lines) Dengue fever is the most important viral disease transmitted by mosquitoes worldwide, and particularly in Brazil. Invasive mosquito species play a key role in its exponential increase including Europe where first autochthonous cases have been reported in 2010. We will assess the potential for dengue virus transmission by studying vector competence, seasonal abundance, host preference, and Bti susceptibility in Aedes mosquitoes to improve vector surveillance and control. Start date / Duration (months) 1 January 2012, 24 months Total budget (in CHF) : 344,00 Swiss part (in CHF) 200,000 Brazilian part (in CHF) 144,000 16 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 2. Research part 2.1.Project objectives The overall objective of our joint research is to assess the potential of dengue virus (DENV) transmission by the invasive mosquito species, Aedes aegypti and A. albopictus, in Brazil and Switzerland. Though in Brazil A. aegypti is the major dengue vector A. albopictus may also transmit dengue. In Switzerland A. aegypti is not present; and hence here, and Europe, the focus is on A. albopictus with regards to dengue transmission. We propose to evaluate the vector competence, seasonal abundance, susceptibility to the larvicide Bti and host preference of the two species in Brazil and Switzerland by addressing the following four specific objectives: 1. Map seasonal and spatial abundance of A. aegypti and A. albopictus in Pernambuco (Brazil) and Canton Ticino (Switzerland); 2. Identify host preference of A. albopictus from Pernambuco (Brazil) and Canton Ticino (Switzerland) using new tools for blood-meal analysis; 3. Measure and compare vector competence of local A. aegypti and A. albopictus populations to all four dengue serotypes under realistic climatic conditions; 4. Determine and compare the susceptibility status of the local A. aegypti and A. albopictus populations to the biolarvicide Bacillus thuringiensis var. israeliensis (Bti) which is applied for vector control in both countries. 2.2. Project location Brazil Field work will be performed in Fernando de Noronha and Recife, both located in Pernambuco state, northeast Brazil. All work will be carried out at the Aggeu Magalhães Research Centre from the Oswaldo Cruz Foundation, Ministry of Health (Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, CPqAM/FIOCRUZ/MS) Switzerland Field work will be carried out in the Canton of Ticino in collaboration with the Instituto Cantonale di Microbiologia. Molecular work will be conducted at Swiss TPH, while proteomics (MALDI-TOF) will be performed at Mabritec AG and the Instituto Cantonale di Microbiologia, Ticino. 2.3. Academic discipline(s) Epidemiology, parasitology, vector biology, comparative genomics, molecular biology, proteomics, physiology, ecology, biostatistics. 2.4. Activities and approach 17 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Background Over the last decades, dengue increased exponentially and has become the most important viral disease in humans transmitted by mosquitoes. Transmission among the human population occurs through the bite of an Aedes mosquito infected with any one of the four dengue virus serotypes (i.e. DENV-1, -2, -3 and -4). The disease is widespread throughout most of South-east Asia, the Pacific, the Indian subcontinent, sub-Saharan Africa, Central and South America and the Caribbean [1]. Eighty percent of dengue cases in South America occur in Brazil [2]. Due to increased international travel and spread of dengue-competent Aedes species across the globe, dengue is, however, also becoming a serious threat in Europe. Reports on dengue cases imported to Europe are increasing [3] and last year even the first autochthonous cases have been reported from France [4] and Croatia [5]. In Brazil, the major vector for DENV is A. aegypti [6], which is the target of the National Program for Dengue Control (PNCD) [7]. As the eggs of A. aegypti are not cold tolerant this mosquito is - with few exception of recent appearances in Madeira and Southern Russia absent from Europe. In Europe, dengue cases have been associated with A. albopictus together with outbreaks of chikungunya in the province of Ravenna (Italy) in 2007 [8]. From Switzerland, A. albopictus was first reported in 2003 and has now firmly established in the southern parts of the country (i.e. canton of Ticino) [9]. Though playing a much less important role, A. albopictus is still present in at least 20 of the 27 Brazilian states [10]. Reports of DENV positive larvae of A. albopictus suggest that in Brazil, too, species may still play a role in DENV transmission [11-12]. Moreover, A. albopictus has also been linked to dengue fever outbreaks in the Seychelles in 1977-78, La Reunion and Hawaii in 2001-2002 [13]. In summary, while A. aegypti is the prime dengue vector, there is also evidence that suggests a role for A. albopictus, particularly in Europe where A. aegypti is absent. Overall rational An exponentially increasing number of dengue cases in Brazil, together with a recent introduction of the fourth dengue serotype raise huge public health concerns [14]. Simultaneously, Europe is experiencing the first autochthonous DENV infections [4]. As no vaccine or specific treatment is available these developments call for increased surveillance and vector control measures to reduce the spread of DENV and the risk of epidemics. Many factors determine DENV transmission thresholds and the likelihood of an outbreak ([15-16]). From a vector point of view, vector competence, frequency of host-vector contact and susceptibility to vector control measures are key factors in assessing the risks for potential transmission and the role of individual vector species. Vector competence of Aedes populations for DENVs varies widely ([17-19]) and these species often show a discontinuous distribution, with localized breeding units, due to low dispersal rates and reintroductions (e.g. [20-21]). In order to better understand these factors, we suggest evaluating the vector competence, seasonal abundance and host preference of A. aegypti and A. albopictus under the specific, local settings in Brazil and Switzerland. Our data on mosquito biology shall help to improve current surveillance systems in both countries and give the basis for assessing the risk of dengue outbreaks. Objective 1: Map seasonal and spatial abundance of A. aegypti and A. albopictus in Pernambuco (Brazil) and Canton Ticino (Switzerland) 18 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Rational An efficient and sensitive collection method for large-scale sampling of Aedes mosquitoes is the basis for assessing vector abundance and evaluating the impact of control strategies. In Brazil, the National Program for Dengue Control (PNCD) uses several indices to monitor Aedes populations that are all related to immature stages that is the percentage of houses infested with larvae or pupae (“house index”) and the number of positive containers per 100 households inspected (“Bretau index”). These indices, however, showed very low level of mosquito density, or even negative results for places where A. aegypti was actually present in 60% to 90% of houses [22-23]. Indeed, the complexities of the new urban realities point out that new tools are needed for epidemiological practice and surveillance to complement or even replace the current methods, designed 80 years ago [24]. A. albopictus population abundance in Switzerland, on the other hand, is currently estimated indirectly from positive over negative Bti-baited, lethal ovitraps [9]. In principal, ovitraps are a cheap and sensitive method for collecting mosquito eggs making it a valuable tool for surveillance [25]. A. albopictus densities in Switzerland have, however, yet to be mapped independently of the intervention as otherwise these estimates lend themselves to systematic biases. We suggest to use two independent but complementary trapping methods for Aedes surveillance in our study areas; ovitraps to collect immature stages and sticky traps for adults. Approach We suggest, as a first step in the project, to map the seasonal and spatial abundance of A. aegypti and A. albopictus in three areas; two in Brazil where A. albopictus is either present or absent, and in the Canton of Ticino, Switzerland where only A. albopictus occurs. Mosquitoes will be sampled using two trapping techniques, a recently developed sticky trap [26] and a modified model of the classic ovitrap [27] in order to evaluate and compare trapping methods in different settings and mosquito species. Study areas. The Brazilian research group has already developed a system for monitoring and population control of A. aegypti, called SMCP-Aedes [28], implemented on the main island of Fernando de Noronha, an archipelago 545 km off the coast of Recife, Brazil. In this area, A. albopictus is, however, absent and we will, therefore, select another site in Recife, Pernambuco, Brazil, where A. albopictus is found together with A. aegypti.. The third study area will be the canton of Ticino, a region bordering northern Italy, where A. albopictus is currently present in Switzerland. Mosquito collections. In Recife and Ticino, we will use both the ovitrap adapted from Fay and Eliason [27] and the recently developed sticky trap [26] to record the seasonal dynamics and spatial abundance in the study sites above. The traps will be set-up in the same sentinel sites in safe distances to avoid potential competition for breeding sites 80 m apart [25]. The specimens from the sticky traps will be preserved for further blood meal analysis as described under objective 2. Data processing and analysis. Bi-weekly maps of spatial-temporal distribution of Aedes spp. will be yielded based on permanent egg-collection by the sentinel traps, geographically referenced, installed in stations spread at the urban area by or according to the SMCP-Aedes [29-30]. The main underlying concept within the SMCP-Aedes is to integrate biological aspects of the vector with human population and environmental data through building an entomological surveillance system based on geographical information, as a support for dengue epidemiological surveillance and control. The number of eggs and adults provided will be uploaded in a database generating maps automatically which will indicate the hotspots of Aedes breeding areas that could be considered high priority for control activities. The data 19 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 will also allow for comparing and evaluating the two trapping methods in three completely different socio-ecological settings. Objective 2: Identify host preference of A. albopictus from Recife (Brazil) and Canton Ticino (Switzerland) using new tools for blood-meal analysis in mosquitoes Rational Identification of the mosquito hosts and a better understanding of the feeding patterns is the key in understanding the role of vector species. Blood-feeding patterns help assessing the threat that specific mosquito species pose to human health and determine their role in disease transmission. To date, there is very little data available on host feeding patterns of Aedes mosquitoes and we have no information on the feeding habits of A. albopictus neither from Recife (Brazil) nor from Switzerland. Identifying the source of blood meal is, however, particularly important for A. albopictus, because it has the ability to colonize silvatic areas as well as urban areas and hence it could be competent and ecologically suited to serve as a bridge vector for other arboviruses such as the yellow fever by connecting the sylvatic and urban environments [31]. Reasons for missing data on A. albopictus are partially due to hurdles in collecting blood-fed females of this diurnal and exophilic mosquito species together with labour, cost and time intensive laboratory protocols that involve genome sequencing to analyse blood meals from mosquitoes (e.g. [32]. In contrast, simpler methods using specifically designed primer pairs (e.g. [33]) or a direct enzyme-linked immunobsorbent assay (ELISA) (e.g. [34]) may miss out on host species for which the assays were not designed for. Approach We plan to collect blood-fed mosquitoes to identify A. albopictus host preference in our study areas during the surveys carried out under objective 1. We will analyse the blood meals (a) by sequence analysis and (b), in parallel, we will develop and test a novel approach that measures proteomic profiles by mass spectrometry (MS) aiming providing a new tool for mosquito blood meal analysis that should dramatically reduce labour, cost and time and which would also allow for high-throughput analysis in future surveillance programmes. Mosquito collections. We will collect adult, blood-fed A. albopictus specimens using stickytraps [26] which have recently been proven to be a very useful application for this purpose [35]. Blood meal collections and COI sequencing. Mosquito blood meals will be collected from abdomens of engorged mosquitoes and split into two aliquots. DNA will be prepared from one aliquot and Cytochrome c oxidase I (COI) gene sequences amplified by polymerase chain reaction (PCR). COI PCR products will then be sequenced and sequences matched to host species (www.barcodeoflife.org; [36]). MALDI-TOF MS. Sequencing PCR products from large numbers of mosquitoes for surveillance programmes may become very rapidly time and labour intensive with increasing sample sizes. As an alternative, less labour and time intensive approach we will evaluate whole cell matrix-assisted-laser-adsorption time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) by using our own collected, and sequenced, reference material as well as public data bases where available (e.g. http://globin.cse.psu.edu). MALDI-TOF MS is a highly sensitive method that even enables the analysis of hemoglobin from a single red blood cell [37] and is applied to detect hemoglobin variants in clinical applications [38]. As the amino acid 20 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 sequences of the globin proteins in hemoglobins usually differ between species this technique shows great promise for identifying mosquito blood meals. Objective 3: Measure and compare vector competence of local A. aegypti and A. albopictus populations to all four dengue serotypes under realistic climatic conditions Rational Another key determinant for dengue transmission in addition to vector abundance (objective 1) and host preference (objective 2) is vector competence. Vector competence for DENV may not only vary between species but also among populations of the same species. When compared to A. aegypti, A. albopictus plays a relatively minor role in DENV transmission likely due to differences in host preferences and reduced vector competence [39]. A. albopictus may, however, still play a role in DENV infections, particularly where A. aegypti is absent [40-42] and [13]. An important caveat underlying experimental infection studies is that susceptibility and viral replication rates may be temperature-dependent. Indeed, Westbrook et al. [43] showed that climate factors, such as low temperature, experienced at the larval stage, can increase the competence of adult females to vector arboviruses. As a consequence, knowing the vector competence of Aedes populations specific to each location in relation to more realistic climatic conditions would allow estimating the level of risk of dengue transmission more accurately. Approach We intend to analyze natural populations of A. aegypti (from Brazil) and A. albopictus (from Brazil and Switzerland) with regards to their susceptibility level to all four DENV serotypes and measure the expression of molecules previously associated with DENV susceptibility [44-45]. Our aim is to measure how these populations respond to the different DENV serotypes and to confirm the role of the molecules associated with susceptibility to each serotype. Mosquito strains. Eggs from natural populations studied in objective 2 and 3 will be collected from the study sites in Brazil and Switzerland and transferred to the laboratories at CPqAM/FIOCRUZ in order to established strains for experimental infection studies. Experimental infections. Experimental infection studies will be carried out in an established biosafety level 3 laboratory at CPqAM/FIOCRUZ. The mosquitoes will be infected orally with DENV (all four serotypes) using artificial feeders. Positive infections will be visualised by immunofluorescence (IFA) and virus loads quantified by quantitative reverse transcription (qRT) PCR according to previous protocols established by the group in Brazil [46-47]. DENV strains, previously isolated from patients in Recife, Brazil, will be used in the oral infections. Mosquito strains will be characterized for their vector competence by determining the disseminated infection (DIR), the midgut infection barrier (MIB) and the midgut escape barrier (MEB) rate from immunofluorescence and qRT PCR assays according to Sylla et al. [48]. Dengue infection experiments will be carried out at temperatures simulating field conditions in Brazil and Switzerland. 21 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Objective 4: Determine and compare the susceptibility status of the local A. aegypti and A. albopictus populations to the biolarvicide Bacillus thuringiensis var. israeliensis (Bti) which is applied for vector control in both countries. Rational Resistance to insecticides has been reported to several insecticides and poses one of the greatest challenges in vector control strategies [49]. For insecticide resistance management, assessment of insecticide susceptibility of mosquito field populations is essential to assure the effectiveness of treatments. Both in Brazil and Switzerland, Aedes control programs are based on the application of the highly mosquito specific biological larvicide, Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti). Bti has played a crucial role for the control of A. aegypti in Brazil since 2000 (e.g. only larvicide allowed on Fernando de Noronha island) and is also the backbone of A. albopictus control in Europe [50]. The complex mode of action of Bti, a combination of four toxins, reduces the potential risk of resistance development [51]. Although many studies have repeatedly shown its efficacy [52] suggesting no development of Bti resistance in the field, resistance to individual toxins can, however, be selected in laboratory selection experiments [51,53]. Low levels of tolerance have also been observed against Bti in laboratory experiments [54]. Though Bti resistance, as seen for many chemical insecticides, seems much less likely to happen, a continuous evaluation is needed to avoid compromising current Aedes vector control efforts. Approach The present study intends to evaluate the larvae susceptibility to Bti products used in each country as well as to the four individual toxins, alone or in combination, to detect early development of potential Bti resistance or even tolerance. We expect to cover essential aspects to assure the sustainability of these insecticides in control programs and provide knowledge for the development of robust tools to evaluate resistance risk. Larval bioassays. By conducting series of larval bioassays we will provide a baseline of Bti susceptibility of local Aedes population in the study areas. Experimentally, specimens of Aedes populations from Ticino and Recife will be established in the laboratory (CPqAM and a field station of the Instituto Cantonale di Microbiologia, TI) and their susceptibility to Bti and its individual toxins will be analyzed through larvicide bioassays adapted for this purpose [5556]. Populations will be analyzed and compared with the susceptible laboratory colonies from CPqAM-FIOCRUZ. In parallel, colonies of A. aegypti will be established and selected against Bti for successive generations in order to obtain resistance or tolerant strains. If selection is successful these strains will then be molecularly characterized in anticipated future collaborative work between CPqAM/FIOCRUZ and Swiss TPH. Division of activities The proposed activities for the two year project will be divided between the involved groups and individuals according to the table below: Person Dr Lêda Regis Dr Constância Ayres Dr Maria A. Varjal de Melo Institution CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ Activity Coordination of project in Brazil Supervision of laboratory work in Brazil Supervision of field work in Brazil 22 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 Dr Claudia Fontes Dr Maria Helena Dr Miguel Monteiro Ms Duschinka Guedes CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ INPE CPqAM/FIOCRUZ Supervision of dengue infection experiments Supervision of bioassays in Brazil Aedes distribution data analysis Post-doc-Dengue infection Dr Pie Müller Swiss TPH Supervision of laboratory work in Switzerland Mr Tobias Suter Swiss TPH PhD student. Laboratory and field work in Switzerland PD Dr Mauro Tonolla Instituto Cantonale di Microbiologia, TI Supervision of field work in Switzerland Dr Guido Vogel Mabritec AG, Switzerland Supervision of MALDI-TOF analysis 2.5. Expected results and outputs The proposed project will generate essential baseline data for risk assessment of DENV transmission and outbreaks both in Brazil and Switzerland. In addition, the proposed research compares current with new methodologies and helps to improve the data content and quality improving decision making for dengue surveillance and vector control globally. The outcome of this research will be of relevance to managers of dengue control programmes and we will use our extensive network of collaborators in disease endemic countries to ensure that the information is rapidly disseminated to programme managers. Particularly, the evaluation of the SMCP-Aedes technology will help other local health authorities and may be adopted by the National Program for Dengue Control (PNCD). We will also develop a new proteomic approach to study blood-feeding behaviour of mosquitoes that can be transferred to other vectors such as ticks and sandflies and may then be used for routine screenings provided as a (commercial) service. Finally, we will establish mosquito colonies and reference data that will be the foundation for future collaborative work including the study of the molecular mechanisms of insecticide resistance, mosquito-virus interactions and population genetics. We plan to present our results at international scientific conferences and publish our work in international, open-source peer-reviewed journals. 2.6. Collaboration concept (partnership) The involved institutions and working groups are highly complementary. Dr Lêda Regis has been working on mosquito control research since 1992, studying many aspects of mosquito biology and vector control, including mosquito behaviour, methods and strategies for mosquito control, microbial larvicides, insecticide resistance, vector-pathogen interactions. The infrastructure of the Department of Entomology (CPqAM-FIOCRUZ) is well equipped to address all these aspects of vector biology. In addition, Dr Lêda Regis’ team is part of the national reference centre for culicid vector control and consults public health authorities. Dr Pie Müller is a medical entomologist who has recently joined Swiss TPH as head of the vector control centre. He is an expert in insecticide resistance and mosquito physiology using genomic and proteomic approaches. Moreover, Swiss TPH has strong links with Mabritec AG, represented in the project by Dr Guido Vogel, through several ongoing projects. Finally, Dr PD Mauro Tonolla leads the mosquito working group (Gruppo cantonale per la Lotta alle Zanzare, GLZ) that runs the Aedes control programme in the Canton of Ticino, Switzerland. Furthermore, he is a microbiologist and has extensive expertise on Bti and supervises 23 BSJRP Call for JRP 2011 - 2012 MALDI-TOF MS based routine diagnostics. This project will allow at least two young scientists to receive training in Brazil and Switzerland: Tobias Suter and Ms Duschinka Guedes will interact intensively during the project through respective visits at each others institutions and at the field sites in Brazil. Tobias Suter will have the opportunity to work in an area hyper-endemic for DENV and Dr Duschinka Guedes will be trained in proteomic techniques which she will transfer to Brazil. 2.7. Perspectives This project is embedded into ongoing projects funded by FIOCRUZ and CNPq for the Aedes-SMCP work in Brazil. Some of the proposed work in Switzerland is partially funded by the Canton of Ticino and will be an integral part of a new initiative to co-ordinate vector surveillance and control in Switzerland. Moreover, we will seek further funding in Brazil, in Switzerland and elsewhere to continue this collaboration. Scientifically, the establishment of mosquito colonies and generation of reference data will be further exploited and will extend studies of the molecular mechanisms of insecticide resistance, mosquito-virus interactions and population genetics. The joint research will also help in developing molecular/proteomic markers to survey mosquito field populations. Swiss TPH has also strong expertise in mathematical modelling and spatial statistics that can be exploited to integrate the data from this and future projects in order to generate models for dengue risk assessment and prediction of optimal intervention strategies. Dr Constância Ayres, who will directly assist Dr Lêda Regis, and Dr Pie Müller know each other from their time as postdoctoral research assistants at the Vector Group, Liverpool School of Tropical Medicine, UK, and already initiated a small collaborative project on comparative genomics of mosquitoes (manuscript under review). The Brazilian Swiss Joint Research Programme will, therefore, be a great opportunity to foster collaborations between the groups in Brazil and Switzerland. An important aspect is that Switzerland is short of vector entomologist; and hence this project will also help, through the support of Tobias Suter, to build the much needed capacity in Switzerland. 2.8. Ethical, safety and regulatory issues This project will be designed under the norms and rules of the National Committee on Ethics and Research (Comissão Nacional de Etica em Pesquisa – CONEP, resolution 196/96) and will be conducted only after their approval. The proposed work in Switzerland does not involve the use of animal or human subjects. References 1. Gubler DJ (1998) Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev 11: 480-496. 2. Schatzmayr HG (2000) Dengue situation in Brazil by year 2000. Mem Inst Oswaldo Cruz 95 Suppl 1: 179-181. 3. 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