Apresentação

Cinética das reacções
enzimáticas
ciné
ética enzim
enzimá
ática:
Pioneiros da cin
1913 - L. Michaelis e M.L. Menten
1925 - Briggs e Haldane
Maud L. Menten
Leonor Michaelis
vo =
Vmax [S]
Km + [S]
Equação de Michaelis-Menten
invertase
sacarose
glucose + frutose
[E] - conc. enzima
([S], T, P, pH constantes)
[E]
Fosfatase
ácida
Como determinar Vmax e Km?
1. Experiências para determinar
velocidades iniciais a diferentes [S]:
Glicerol-P + H2O
Glicerol + Pi
2. Construir gráfico:
determinação da assímptota
Problema: método pouco rigoroso...
Solução: transformar a equação de
Michaelis-Menten na equação duma recta
- por exemplo, passagem de:
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
V = Vmax [S]
Km + [S]
(1)
Michaelis- Menten
(2)
1
(3)
(4)
=
V
Km + [S]
Vmax[S]
1 = Km
+ [S]
V Vmax[S]
Vmax[S]
1
V
=
Km
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
Lineweaver-Burk
vo =
Vmax [S]
Km + [S]
Equação de Michaelis-Menten
Km . 1
1
Vmax [S] + Vmax Equação de Lineweaver-Burk
1
vo =
y
m
x
b
3. Transformar os pares de valores [S], vo
em pares de valores 1/[S], 1/vo
4. Construir o gráfico:
1/0=?
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,12
0,10
0,08
1/vo
vo ( m oles/m in)
[S]=0, vo=0
0,06
0,04
0,02
0,00
0
2
4
6
[S] (µmol/l)
8
10
-2,0
-1,0
0,0
1,0
1/[S]
2,0
3,0
4,0
1/[S]=3.33, 1/vo=0.096
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,12
0,10
0,08
1/vo
vo ( m oles/m in)
[S]=0.3, vo=10.4
0,06
0,04
0,02
0,00
0
2
4
6
8
-2,0
10
-1,0
0,0
[S] (µmol/l)
[S]=0.5, vo=14.5
2,0
3,0
4,0
1/[S]=2.0, 1/vo=0.069
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,12
0,10
0,08
1/vo
vo ( m oles/m in)
1,0
1/[S]
0,06
0,04
0,02
0,00
0
2
4
6
[S] (µmol/l)
8
10
-2,0
-1,0
0,0
1,0
1/[S]
2,0
3,0
4,0
1/[S]=1.0, 1/vo=0.044
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,12
0,10
0,08
1/vo
vo ( m oles/m in)
[S]=1.0, vo=22.5
0,06
0,04
0,02
0,00
0
2
4
6
8
-2,0
10
-1,0
0,0
[S] (µmol/l)
[S]=3.0, vo=33.8
2,0
3,0
4,0
1/[S]=0.33, 1/vo=0.030
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,12
0,10
0,08
1/vo
vo ( m oles/m in)
1,0
1/[S]
0,06
0,04
0,02
0,00
0
2
4
6
[S] (µmol/l)
8
10
-2,0
-1,0
0,0
1,0
1/[S]
2,0
3,0
4,0
1/[S]=0.11, 1/vo=0.025
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,12
0,10
1/vo
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0
2
4
6
8
-2,0
10
-1,0
0,0
1,0
2,0
1/[S]
[S] (µmol/l)
0,12
0,10
0,08
1 /vo
vo ( m oles/m in)
[S]=9.0, vo=40.5
0,06
0,04
1/V
Vmax
0,02
0,00
-2,0
-1/K
KM
-1,0
0,0
1,0
1/[S]
2,0
3,0
4,0
3,0
4,0
Inibição da actividade
enzimática
Competitiva
Inibição
reversível
Inibição da
actividade
enzimática
Não competitiva
Incompetitiva
Inibição
irreversível
Inibição reversível:
1. Inibiç
Inibição competitiva
inibidor competitivo I
substrato S
- molécula inibidora tem semelhanças estruturais com o substrato
- liga-se no centro activo
E+S
ES E + P
- inibição diminui com o aumento de [S]
+
I
EI
E+S
+
I
ES
E+P
EI
s/inibidor
c/ inibidor competitivo
para todos os casos
Kmi > Km
Vmaxi = Vmax
2. Inibiç
Inibição não competitiva
substrato S
substrato S
inibidor não
competitivo I
- inibidor liga-se num sítio diferente do centro activo
- ligação do inibidor não impede a ligação do substrato, mas o complexo
formado é inactivo
E+S
ES E + P
- inibição não é superada aumentando [S]
+
I
EI + S
E+S
+
I
ES
+
I
EI + S
EIS
E+P
vo
s/inibidor
c/ inibidor não competitivo
[S]
Kmi = Km
Vmaxi < Vmax
para todos os casos
+
I
EIS
3. Inibiç
Inibição incompetitiva
-I
+I
- inibidor liga-se num sítio diferente do sítio activo
- inibidor só se liga ao complexo ES, formando um complexo ESI inactivo
- inibição aumenta com [S]
E+S
ES
+
I
EIS
Vmax
I
Vmax’
E+S
ES
I
EIS
Km’ Km
Kmi < Km
Vmaxi < Vmax
[S], mM
E+P
E+P
Inibição irreversível:
- O inibidor reage irreversivelmente com o enzima
- A cinética de Michaelis-Menten não é aplicável
Ex.:
-Insecticidas Organofosforados, inibem enzimas com Ser no local activo
da enzima, como a Acetilcolinesterase;
Inibidores da
Acetilcolinesterase
•
A acetilcolinesterase:
• Proteína tetramérica
• Presente nas junções
neurosinápticas
• Catalisa a hidrólise da
acetilcolina
• Nos seus fragmentos acetil e
colina.
•
Inibidores mais conhecidos da
AChE:
• Organofosforados e os Carbamatos
•
•
Largamente utilizados como insecticidas
agrícolas, podendo produzir respostas
tóxicas nos seres vivos.
Mais interessante aplicação dos
inibidores desta enzima:
• Ultilização na terapêutica
doença de Alzheimer.
da
“A doença de Alzheimer
(AD) é uma afecção
neurodegenerativa
progressiva e irreversível
de aparecimento insidioso,
que acarreta perda da
memória
e
diversos
distúrbios
cognitivos”
(Smith, 1999).
Animação
Aloysius Alzheimer
(1864 -1915)
•
Como os portadores da doença
de Alzheimer possuem níveis
reduzidos de acetilcolina:
• Controlar o problema é evitar
que a pequena quantidade de
acetilcolina
produzida
seja
degradada
pela
enzima
responsável pela sua destruição;
• Impedindo a acção do enzima
através dos seus inibidores.
•
Deste modo, a descoberta de
novas moléculas capazes de
inibir
selectivamente
a
acetilcolinesterase
tem
interesse do ponto de vista
farmacológico.
Acetil-CoA
Colina
Colina-O-acetil-transferase
Acetilcolina
Acetilcolinesterase
Inibidor de
Acetilcolinesterase
Acetato
+
Colina
•
Mais de 50% dos medicamentos
introduzidos no mercado nos
últimos 20 anos:
• Derivados,
directa
ou
indirectamente, a partir de
moléculas de origem natural,
geralmente compostos de defesa
dos organismos.
•
A síntese de produtos secundários
com actividade de inibição da
acetilcolinesterase confere a uma
planta, alga ou invertebrado séssil,
a
capacidade
de
resistir
à
predação, ao interferir com a
transmissão
dos
impulsos
nervosos
nos
seus
possíveis
predadores.
Galantus nivalis
O
N
MeO
Donepezil
(Aricept)
MeO
Galantamine
(Razadyne, Razadyne ER,
Reminyl, Nivalin)
O
N
O
Rivastigmine
(Exelon)
N
• Inibidor reversivel da acetilcolinesterase;
•Tem uma biodisponibilidade oral de 100% e
facilmente atravessa a barreira hematoencefálica
• Estudos mostram benefícios modestos na
cognição e comportamento.
•Efeitos adversos:
•Perda de apetite;
• Cãibras musculares;
• Náuseas;
•Insónias;
• Cansaço ou fraqueza.
Efeitos adversos:
Náuseas;
Vómitos;
Cefaleia,
Cólicas abdominais;
Tonturas.
inibidor pseudo-reversível da
acetilconesterase.
Após a reacção com o sítio
activo de serina, um carbamato
(uretano) é formado que é
quimicamente mais resistente
para a hidrólise de uma ligação
ester.
• Galantamina
é
um
inibidor
reversível da acetilcolinesterase;
•Tem uma biodisponibilidade oral de
8-10% e facilmente atravessa a
barreira hematoencefálica
•Efeitos adversos:
• Náuseas;
• Vómitos.
Outros inibidores da acetilcolinesterase:
Metrifonato; Huperzina A; Tacrina.
A esperanças e interesse suscitado por estas
drogas é demonstrado pelas 41.370 referências
listadas pelo PubMed com “inibidores da
acetilcolinesterase”.
Em particular, a comunidade científica está em
busca de novos inibidores da acetilcolinesterase
exibindo menos efeitos secundários.