EFEITOS DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO

UNIVERSIDADE NILTON LINS
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
EFEITOS DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO RECOMBINANTE
BOVINO (rbGH LACTOTROPIN®) NA EXPRESSÃO DO GENE IGF-I E
PARÂMETROS FISIOLÓGICOS EM JUVENIS DE TAMBAQUI
(Colossoma macropomum)
RÚBIA MAIELLI LIMA BRANDÃO
MANAUS, AMAZONAS
2015
RÚBIA MAIELLI LIMA BRANDÃO
EFEITOS DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO RECOMBINANTE
BOVINO (rbGH LACTOTROPIN®) NA EXPRESSÃO DO GENE IGF-I E
PARÂMETROS FISIOLÓGICOS EM JUVENIS DE TAMBAQUI
(Colossoma macropomum)
Orientadora: Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e Val
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Aquicultura da Universidade
Nilton Lins em ampla associação com o
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Aquicultura.
MANAUS, AMAZONAS
2015
A Deus pelo dom da vida. Aos meus pais,
familiares e amigos por todo amor e
carinho, por sempre me apoiarem nas
oportunidades do estudo e me permitirem
liberdade ao trilhar meus caminhos.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, inteligência suprema, causa primária de todas as coisas.
À Dra. Vera Val minha querida orientadora por confiar na minha pessoa e me permitir ser sua
orientanda. Sem palavras para descrever o quanto sua confiança foi importante para a realização de
um sonho.
Ao Dr. Adalberto pelo apoio na construção deste trabalho, pela paciência e pelo imenso carinho
que teve para comigo em seu ambiente de trabalho...
À querida Nazaré que me abraçou junto à família LEEM, pelos conselhos, pelo reconhecimento,
pelo carinho, pelos abraços mais aconchegantes que já recebi...
Ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura, especialmente à Coordenadora Dra.
Elizabeth Gusmão e à secretária Ione Castro pelo apoio e amizade desde o início do curso.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas e ao projeto ADAPTA pela
oportunidade e apoio financeiro.
À Agência de Pesca do Amapá (PESCAP), minha família profissional, pela confiança durante
este desafio.
Ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) por toda infraestrutura, apoio
e segurança oferecida no decorrer deste trabalho. Em especial, as queridas Ana Claudia Silva, Raquel
Abecassis e Raimunda Brandão.
Ao meu querido Arlan de Lima Paz, seu apoio foi imprescindível para a construção,
desenvolvimento e análise deste trabalho.
À Nayara Castro, irmã e amiga, minha professora e minha companheira, suas lições foram
muito além da bancada. Obrigada.
A ele, o meu maior incentivador, que em vários momentos me ergueu, me apoiou e foi meu
esteio nesta jornada; meu grande amigo, irmão dos bons e maus momentos... Renan.
À Lu Fé, uma florzinha que me apresentou um mundo antes desconhecido, e com toda sua
paciência e dedicação me ensinou os primeiros passos da Biologia Molecular.
Às minhas queridas que me apoiavam a cada satisfação ou decepção com meus primers...
Daiane Kochhann, Luciana Bastos, Viviane Araújo, Zizi, Helen Sadauskas, Grazyelle Sebrenski,
Roberta Prestes e novamente Nayara Castro.
Aos queridos do LEEM: Claudinha, Gizele Cortes, Luly, Jéssica, Washington, Reginaldo,
Suzana, Marcos Prado, Daniel, Tiago Gabriel, Dona Val, Dona Sonia, Wanderlan, Carolzinha,
Karolina Leitão, Katia, Dulci, Andreza, Carlos Henrique e a todos os demais pela cordialidade e
amizade.
A minha família! A família que Deus me permitiu ter nesta existência à vocês dedico todas as
minhas conquistas, pois de todas as lições que pude aprender amá-los, aceitá-los e respeitá-los foi sem
dúvida a mais importante que a distância e o mestrado poderiam me proporcionar.
v
“Agradeço a todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do
lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam”
Chico Xavier
vi
RESUMO
O hormônio do crescimento (GH, Growth hormone) e o fator de crescimento semelhante
à insulina do tipo I (IGF-I, Insulin-like Growth Factor-I) são fundamentais na regulação do
crescimento em teleósteos. Nesse estudo, mudanças no padrão da expressão do IGF-I e nos
parâmetros fisiológicos em juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos a
diferentes concentrações de hormônio do crescimento recombinante bovino (rbGH,
Lactotropin®) (1 µg.g-1, 10 µg.g-1, 100 µg.g-1, SHAM e GSI) em diferentes tempos (1, 4, 8, 12,
24, 48, 168 horas) foram avaliadas. Os resultados da PCR em tempo real foram normalizados
por meio da média geométrica dos genes endógenos 28s e EF1-α. A maior expressão relativa
do gene IGF-I foi observada no tempo de 24 horas (p<0.05). Entre os tratamentos, no tempo de
24 horas puderam ser verificadas diferenças significativas, nos animais que receberam a dose
de 100 µg.g-1 (p<0,05). Não foram observadas diferenças para as variáveis hematológicas e os
níveis plasmáticos de glicose (p>0,05). Esses resultados demonstram os efeitos funcionais do
rbGH na estimulação da expressão do gene IGF-I. Sabe-se que a concentração relativa de
transcritos de um determinado gene em uma célula é um indicativo do quanto esse gene está
sendo expresso. Nesse sentido, espera-se que as informações levantadas possam servir de base
para futuras pesquisas que relacionem diversos aspectos moleculares do crescimento do C.
macropomum.
Palavras-chave: Hormônio do crescimento, tambaqui, fator de crescimento semelhante a
insulina do tipo I, IGF-I, expressão gênica.
vii
ABSTRACT
Growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) are essential in the
growth regulation in teleost. In this study, changes in the pattern of expression of IGF-I and
physiological parameters in juvenile tambaqui (Colossoma macropomum) subjected to different
concentrations of recombinant bovine growth hormone (rbGH, Lactotropin®) (1 µg.g-1, 10
µg.g-1, 100 µg.g-1, SHAM e GSI) at different times (1, 4, 8, 12, 24, 48, 168 hours) were
evaluated. The results of real time PCR were normalized by the geometric mean of endogenous
genes 28S and EF1-α. The highest relative expression of the IGF-I gene was observed in time
of 24 hours (p <0.05). Among the treatments at 24-hour time, presential increased expression
of IGF-I the animals that received a dose of 100 μg.g-1 (p <0.05). No differences were observed
for hematological parameters and plasma glucose levels (p> 0.05). These results demonstrate
the functional effects of rbGH in stimulating IGF-I gene expression. The relative concentration
of transcripts of a particular gene in a cell is indicative of how this gene is being expressed.
Future research linking the various aspects of growth of C. macropomum allows us to
understand how growth regulation proceses take place.
Keywords: Fish growth hormone, tambaqui, insulin-like growth factor-I, IGF-I, gene
expression.
viii
SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO................................................................................................................... 10
OBJETIVOS ............................................................................................................................. 13
Capítulo 1 ................................................................................................................................. 17
RESUMO ................................................................................................................................. 18
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 19
METODOLOGIA..................................................................................................................... 22
Protocolo experimental ............................................................................................................. 22
Extração de RNA total e transcrição reversa ............................................................................ 23
Desenho dos primers do IGF-I e dos genes de referência (28s e EF1a)................................... 24
Real-time PCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real ....................................... 25
Análises Estatísticas ................................................................................................................. 26
RESULTADOS ........................................................................................................................ 27
DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 30
CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 35
APRESENTAÇÃO
O crescimento envolve vários processos que se desenvolvem ao longo do tempo e
podem depender de fatores endógenos e exógenos, associados ou não a condições ambientais
(Canosa et al., 1997). Na aquicultura, estratégias de crescimento adicionais podem auxiliar na
diminuição do tempo de produção e melhorar a eficiência e a conversão alimentar (Raven et
al., 2012). Investimentos em ferramentas biotecnológicas são algumas das estratégias que visam
essas melhorias para a produção piscícola. Nesse sentido, o hormônio do crescimento desperta
grande interesse, pois seus benefícios podem contribuir para a produção aquícola, podendo
garantir melhores taxas de crescimento com diminuição do ciclo de produção e redução do
tempo de maturação gonadal (Donaldson et al., 1979).
O hormônio do crescimento (GH do inglês Growth Hormone) é um dos principais
hormônios proteicos responsáveis pelo desenvolvimento fisiológico e endocrinológico dos
vertebrados em geral. O GH é um hormônio polipeptídico de cadeia única (monômero),
secretado por células somatotrópicas localizadas na hipófise anterior e, assim como nos demais
vertebrados, desempenha funções essenciais nos teleósteos, influenciando diversas atividades
metabólicas. Suas ações nos órgãos e tecidos são exercidas direta ou indiretamente, dependendo
da intermediação de seus receptores (GHR do inglês Growth Hormone Receptor) (CalduchGiner et al., 2001).
A expressão desses receptores (GHR) ocorre em vários tecidos e tal distribuição
evidencia variadas funções fisiológicas do GH, embora a maior quantidade de GHR seja
encontrada no fígado, alvo principal do GH. Os GHRs também são encontrados no tecido
adiposo e muscular refletindo o importante papel do GH para a síntese de proteínas e o
metabolismo lipídico (Zhou et al., 2015); do mesmo modo são expressos nas brânquias, no rim
e no intestino, além de estar presente nas gônadas e no cérebro, mais especificamente no
hipotálamo, corroborando a participação do GH na reprodução e no controle da sua própria
secreção (Canosa et al., 2007).
Os GHRs pertencem à família de receptores de citocinas tipo I, estão presentes na
membrana celular e apresentam três domínios: um extracelular de ligação direta com o GH, um
transmembrana e um intracelular relacionado com as sinalizações subsequentes (Lanning e
Carter Su, 2006). Este complexo GH-GHR ativa proteínas JAK2 (Janus Kinase) (Fox et al.,
2006) induzindo sua autofosforilação e a fosforilação de outras vias e moléculas de sinalização,
incluindo os transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STATs). Além dos STATs, outras
10
moléculas de sinalização iniciam os processos de dimerização e translocação dos sinais de GH
para o núcleo da célula, iniciando as atividades enzimáticas, transporte e transcrição dos genes
que finalmente levam a alterações no metabolismo; como a transcrição dos fatores de
crescimento do tipo insulina, ou IGFs (do inglês, Insulin-like Growth Factor) (Pierce et al.,
2007).
Como o próprio nome sugere os IGFs possuem semelhanças com as ações da insulina;
no entanto, diferente da insulina (secretada pelo pâncreas), podem ser expressos principalmente
no fígado além de outros tecidos extra-hepáticos. Outra diferença consiste na circulação dos
IGFs pelo plasma com proteínas de ligação, denominadas de IGFBPs (do inglês, Insulin-like
Growth Factor Binding Protein) (Peterson et al., 2004), as quais relacionam-se estruturalmente
com os receptores de IGFs e com os receptores de insulina. Muitos tecidos e células secretam
tais proteínas de ligação (IGFBPs) incluindo as células hematopoiéticas ou células tronco,
responsáveis pelo processo de formação, desenvolvimento e maturação das células do sangue
como os eritrócitos, leucócitos e plaquetas (Clark, 1997; Maestro et al., 1998).
Tanto quanto o GH, os IGFs (IGF-I e IGF-II) são peptídeos controlados pelo sistema
endócrino, responsáveis por inúmeras funções necessárias ao desenvolvimento somático dos
teleósteos. No músculo esquelético age diretamente como um fator de crescimento envolvido
na sinalização dos mecanismos de proliferação e diferenciação de celular (Otto e Patel, 2010).
Pode-se dizer que os efeitos diretos do IGF-I representam os efeitos indiretos do GH,
promovendo o crescimento e diferenciação celular (Duan et al., 1998; Zhou et al., 2015). Como
exemplo da ação do GH e IGF-I podemos citar o controle do tamanho dos ossos no animal;
esses hormônios controlam indiretamente o volume de medula óssea e, assim, a produção de
células hematopoiéticas (Clark, 1997; Li et al., 2003).
A utilização de hormônios nos sistemas de produção de peixes, embora não seja uma
prática comum no Brasil, é um tema de grande interesse para a aquicultura, principalmente
quando envolve espécies com crescente demanda comercial de produção (Gómez-Requeni et
al., 2012). Em peixes, os efeitos provocados pela utilização do GH podem variar em função das
doses aplicadas, da idade, do tamanho dos indivíduos, da forma de administração e,
principalmente, da origem dos hormônios; os quais podem ser de origem bovina, suína, ovina
e até mesmo recombinante de outros peixes (Revisado por Baldisserotto, 2013). Vários estudos
têm demonstrado que a administração do GH em peixes aumenta o crescimento, o peso e a
conversão alimentar (Leung et al., 1991; Moriyama et al., 1993; Leedom et al., 2002; Acosta et
al., 2007).
11
Nesse sentido, a necessidade de melhorar a produção e a produtividade de espécies
aquícolas despertou interesse quanto ao uso do hormônio do crescimento recombinante bovino
(rbGH do inglês Recombinant Bovine Growth Hormone). Estudos com o rbGH foram relatados
em várias espécies, incluindo salmonídeos (Oncorhynchus sp.), bagres de canal (Ictalurus
punctatus), trutas (Oncorhynchus mykiss), tilápias (Oreochromis sp.), além do tambaqui (C.
macropomum). Os resultados indicam que a aplicação de rbGH causa inúmeras alterações
fisiológica, incluindo principalmente a aceleração do crescimento, mudanças no ganho de peso
e na conversão alimentar (Leung et al., 1991; Silverstein et al., 2000; Leedom et al.,2002;
Peterson et al., 2004; Biga et al., 2005; Raven et al., 2012; Paz, 2015).
As investigações a respeito do uso de GH em espécies com potencial piscícola parecem
ser um caminho promissor (Paz, 2015). Nesse sentido, este trabalho buscou avaliar as ações do
rbGH em Colossoma macropomum, uma das principais espécies nativas da produção aquícola
brasileira (Ministério da Pesca e Aquicultura-MPA, 2013). Conhecida popularmente como
tambaqui, nos últimos anos vem apresentando expressiva importância econômica, contribuindo
para o crescimento da produção aquícola nacional. Como a espécie responde positivamente à
estimulação de hormônios gonadotróficos exógenos (Paz, 2015), espera-se que com o
desenvolvimento de novas biotecnologias esta prática ganhe destaque, não apenas para
reprodução, mas também para a otimização do crescimento e da rentabilidade econômica
(Foresti, 2008).
O rbGH é de amplo interesse biotecnológico e seu uso como um promotor do
crescimento em escala comercial ainda é demasiadamente limitado devido à falta de
padronização de um método eficaz. No entanto, a sua utilização em experimentos científicos
pode auxiliar na identificação de genes e hormônios envolvidos na regulação do crescimento
(Fenn e Small, 20015). Este trabalho poderá abrir um caminho promissor para a investigação
dos fatores envolvidos no sistema endócrino relacionado ao crescimento da espécie C.
macropomum. Assim, por meio das ações diretas do GH na liberação do IGF-I, buscou-se
elucidar principalmente os efeitos da aplicação do rbGH sobre a expressão do gene IGF-I.
12
OBJETIVOS
GERAL:
Avaliar os efeitos da aplicação intraperitoneal do hormônio do crescimento recombinante
bovino (rbGH, Lactotropin®) na expressão do gene IGF-I (Insulin-like Growth Factor-I) e
sobre os parâmetros fisiológicos em juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum).
ESPECÍFICOS:

Analisar, em diferentes tempos, a atuação do hormônio do crescimento recombinante
bovino (rbGH, Lactotropin®) sobre a expressão do gene IGF-I de juvenis de tambaqui
(Colossoma macropomum).

Analisar a expressão gênica do IGF-I em fígado de juvenis de tambaqui (Colossoma
macropomum) submetidos a diferentes dosagens do hormônio do crescimento
recombinante bovino (rbGH, Lactotropin®);

Avaliar as condições hematológicas dos juvenis de tambaqui (Colossoma
macropomum) submetidos à aplicação intraperitoneal do hormônio do crescimento
recombinante bovino (rbGH, Lactotropin®).

Verificar se o uso do hormônio do crescimento recombinante bovino (rbGH,
Lactotropin®) causa alterações nos níveis de glicose no plasma de juvenis de tambaqui
(Colossoma macropomum).
13
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16
Capítulo 1
Brandão, R. M. L.; Almeida-Val, V. M. F. Efeitos do hormônio do crescimento recombinante bovino
(rbGH) na expressão do gene IGF-I e parâmetros fisiológicos em juvenis de tambaqui (Colossoma
macropomum). Manuscrito formatado para Acta Amazonica.
17
Efeito do Hormônio do Crescimento Recombinante Bovino (rbGH
Lactotropin ®) na Expressão do Gene IGF-I e Parâmetros Fisiológicos em
Juvenis de Tambaqui (Colossoma macropomum)
BRANDÃO, R. M. L.a*; ALMEIDA-VAL, V. M. F. a
a
Instituto Nacional de Pesquisas na Amazônia (INPA), Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular,
Alameda Cosme Ferreira, 1756, 69.083-000, Manaus-AM, Brasil.
*[email protected]
RESUMO
O hormônio do crescimento (GH, Growth hormone) e o fator de crescimento semelhante
à insulina do tipo I (IGF-I, Insulin-like Growth Factor-I) são fundamentais na regulação do
crescimento em teleósteos. Nesse estudo, foram avaliadas mudanças no padrão da expressão do
IGF-I e nos parâmetros fisiológicos em juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum)
submetidos a diferentes concentrações de hormônio do crescimento recombinante bovino
(rbGH, Lactotropin®) (1 µg.g-1, 10 µg.g-1, 100 µg.g-1, SHAM e GSI) em diferentes tempos (1,
4, 8, 12, 24, 48, 168 horas). Os resultados da PCR em tempo real foram normalizados por meio
da média geométrica dos genes endógenos 28s e EF1-α. A maior expressão relativa do gene
IGF-I foi observada no tempo de 24 horas (p<0.05). Entre os tratamentos, no tempo de 24 horas
puderam ser verificadas diferenças significativas, nos animais que receberam a dose de 100
µg.g-1 (p<0,05). Não foram observadas diferenças para as variáveis hematológicas e os níveis
plasmáticos de glicose (p>0,05). Esses resultados demonstram os efeitos funcionais do rbGH
na estimulação da expressão do gene IGF-I. Sabe-se que a concentração relativa de transcritos
de um determinado gene em uma célula é um indicativo do quanto esse gene está sendo
expresso. Nesse sentido, espera-se que as informações levantadas possam servir de base para
futuras pesquisas que relacionem os diversos aspectos do crescimento do C. macropomum, bem
como para serem aplicadas a outras espécies neotropicais com potencial aquícola.
Palavras-chave: Hormônio do crescimento, tambaqui, IGF-I, expressão gênica.
18
INTRODUÇÃO
O GH (Growth hormone) e o IGF-I (Insulin-like Growth Factor-I) são fundamentais na
regulação do crescimento em teleósteos (Clark, 1997). Como nos vertebrados superiores, GH e
IGF-I participam da maioria dos processos fisiológicos, a exemplo da regulação iônica e
osmótica (McCormick, 2001; Reinecke et al., 2005), da atividade reprodutiva (Reinecke, 2010),
do sistema imunológico (Havis e Bird, 2000;), do catabolismo e anabolismo de proteínas,
lipídeos, carboidratos, aminoácidos e ácidos nucleicos, auxiliando no crescimento de diversos
tecidos (Leung et al., 1991; Li et al., 2003). Suas ações nos órgãos e tecidos são exercidas
diretas e indiretamente, intermediada pelos seus receptores (GHR - Growth Hormone Receptor)
(Calduch-Giner et al., 2001).
O complexo GH-GHR ativa proteínas JAK2 (Janus Kinase) (Fox et al., 2006), induzindo
a sua autofosforilação e a fosforilação de outras moléculas de sinalização, incluindo os
transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STATs). Além dos STATs outras moléculas
de sinalização iniciam os processos de dimerização e translocação dos sinais de GH para o
núcleo da célula, iniciando as atividades enzimáticas, de transporte e de expressão dos genes
que finalmente tem ações que influenciam o crescimento e outras respostas metabólicas (Pierce
et al., 2007). Os GHRs estão presentes em diversos tecidos, além de afetar vários aspectos do
metabolismo em diferentes locais, promovem principalmente no fígado a expressão do IGF-I,
principal gene induzido pelo GH envolvido com o crescimento (Biga, et al., 2004).
O IGF-I, por sua vez, regula os processos de hipertrofia e hiperplasia celular (Fuentes
et al., 2015), atuando como sinalizador mitogênico, sendo um dos principais fatores de
progressão necessários para a proliferação e diferenciação de células mitogênicas (Butler e
Roith, 2001; Duan et al., 2010). Este hormônio influencia na quantidade de proteínas
distribuídas pelo corpo, pois interfere nas taxas de transcrição nuclear e tradução de proteínas
pelos ribossomos (Biga et al., 2004; Otto e Patel, 2010), regulando os vários processos de
crescimento do músculo esquelético. Embora o IGF-I seja encontrado em maiores quantidades
no fígado, além de controlar o crescimento e diferenciação celular, atua também em vários
outros sistemas, pois pode ser encontrado em diferentes tecidos extra-hepáticos tais como
brânquias, intestino, gônadas, cérebro e músculo, evidenciando sua participação em diferentes
ações, envolvidas não apenas com o crescimento mas também com a reprodução, a
19
osmorregulação e o sistema imunológico (Clark, 1997; Biga et al., 2004). A circulação do IGFI pelo plasma ocorre por meio das suas proteínas de ligação IGFBPs (Insulin-like Growth
Factor Binding Protein) (Peterson et al., 2004). Muitos tecidos e células secretam tais proteínas
de ligação incluindo as células hematopoiéticas ou células tronco, responsáveis pelo processo
de formação, desenvolvimento e maturação das células do sangue como os eritrócitos,
leucócitos e plaquetas (Clark, 1997; Maestro et al., 1998).
As funcionalidades do sistema GH/IGF-I são demonstradas nos teleósteos por meio de
ensaios que mensuram seus níveis moleculares em respostas a diversas condições
experimentais, inclusive por meio da administração de hormônios do crescimento exógenos,
tais como o hormônio do crescimento recombinante bovino, o rbGH (Recombinant Bovine
Growth Hormone) (Leedom et al., 2002; Reinecke et al., 2005; Acosta et al., 2007). Estudos
com o rbGH foram relatados em várias espécies, incluindo principalmente salmonídeos
(Oncorhynchus sp.), bagres de canal (Ictalurus punctatus), trutas (Oncorhynchus mykiss) e
tilápias (Oreochromis sp.). Os resultados indicam que a aplicação de rbGH proporciona
alterações fisiológicas nos indivíduos tratados, incluindo principalmente mudanças no ganho
de peso (Leung et al., 1991; Leedom et al.,2002; Biga et al., 2005; Raven et al., 2012).
As investigações a respeito do uso de rbGH em espécies com potencial piscícola
parecem ser um caminho promissor. Ainda que o uso do rbGH como um promotor do
crescimento em escala comercial seja limitado, não apenas pela falta de padronização nos
métodos de administração, mas também por resultados que evidenciem seus efeitos a curto e
longo prazo, pesquisas que façam seu uso em espécies com potencial piscícola permitem-nos
compreender não apenas suas ações na promoção do crescimento e no desempenho zootécnico
mas também auxiliam na identificação de outros genes e hormônios envolvidos nos processos
fisiológicos do crescimento (Souza, 2009; Fenn e Small., 2015).
Nesse sentido, este trabalho buscou avaliar as ações do rbGH em C. macropomum,
conhecido popularmente como tambaqui, uma das espécies nativas de maior produção aquícola
brasileira (Ministério da Pesca e Aquicultura-MPA, 2013). Nos últimos anos, seu estoque
natural sofreu grande pressão pela pesca extrativa; no entanto, sua importância econômica
continua expressiva por meio da produção aquícola (Andrade e Yasui, 2003; Dairiki e Silva,
2011). Sabe-se que estudos sobre os mecanismos reguladores do crescimento podem fornecer
informações úteis (Peterson et al., 2004). No entanto, poucos estudos foram realizados a fim de
investigar os processos metabólicos envolvidos com a capacidade de promoção do crescimento
do rbGH em teleósteos neotropicais.
20
Portanto, o presente estudo avaliou a expressão gênica relativa do IGF-I e os parâmetros
fisiológicos de juvenis de tambaqui submetidos à aplicação de diferentes concentrações de
rbGH (Lactotropin®) em distintos tempos, a fim de obter uma maior compreensão da influência
do GH na expressão do IGF-I.
21
METODOLOGIA
Protocolo experimental
Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular
(LEEM) localizado no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), cidade de
Manaus-Amazonas (Brasil). Os juvenis de C. macropomum foram adquiridos em uma fazenda
aquícola, situada próxima à cidade de Manaus. O protocolo experimental desenvolvido neste
trabalho foi submetido ao comitê de ética em pesquisa da Universidade Nilton Lins, também
situado em Manaus. Antes do início do experimento os peixes passaram por um período de
aclimatação em tanques de polietileno de 500 L com sistema de aeração e recirculação de água,
constantes, em condições naturais de fotoperíodo e temperatura. Foram alimentados com ração
comercial extrusada de 1-3 mm contendo 45% de proteína bruta, duas vezes ao dia até a
saciedade aparente.
Foram utilizados 140 juvenis de tambaqui com peso médio de 20,07 ± 0,70 g e
comprimento total 10,82 ± 0,18 cm (média ± erro padrão). A distribuição dos indivíduos seguiu
um delineamento inteiramente casualizado e os tratamentos foram dispostos em um esquema
fatorial 7 x 5, correspondendo aos tempos (1, 4, 8, 12, 24, 48, 168 horas) e às concentrações
com e sem rbGH, Lactotropin® (1 µg.g-1, 10 µg.g-1, 100 µg.g-1, SHAM e GSI). O grupo
controle SHAM recebeu aplicação apenas da solução veículo (soro fisiológico 0,9% NaCl),
enquanto que o grupo GSI (Grupo Sem Injeção) não recebeu nenhuma aplicação. Os peixes
foram distribuídos aleatoriamente em 14 aquários de 70 L (dois aquários por tempo e 10 peixes
por aquário). Dentro dos aquários haviam cinco subdivisões correspondentes aos tratamentos
nomeados como: T1: 1µg.g-1, T2: 10µg.g-1, T3: 100µg.g-1, C+: SHAM e C-: GSI. Tal
nomeação foi definida aleatoriamente como caráter de organização. Devido às subdivisões,
dentro de cada aquário havia um sistema de aeração e recirculação de água. O número total de
indivíduos por tratamento e controles foi de quatro, e cada indivíduo foi considerado uma
unidade experimental, pois posteriormente suas amostras foram analisadas em triplicata nas
placas de PCR em tempo real. Os tratamentos foram definidos com base nos trabalhos de Fenn
e Small (2015), Peterson et al. (2004), Li et al. (2003) e Leedom et al. (2002).
A temperatura e o oxigênio da água foram registrados diariamente e mantidos entre
25,88 ± 0,06 °C e 5,84 ± 0,14 mg/L (média ± erro padrão), respectivamente (Oxímetro YSI
modelo 85). A composição dos íons Na+, K+, Ca2+ e Cl- da água também foram medidos nos
22
aquários a cada tempo de coleta e diariamente para os tempos de 48 e 168 horas (Na+ 81,80 ±
5,2 μM/L; K+ 54,56 ± 4,8 μM/L; Ca2+ 3,64 ± 0,2 μM/L; Cl- ± 40,80 μM/L;) (Média e EP). O
pH e a condutividade apresentaram valores médios de 6,30±0,02 e 51,33±5,4 µS.cm-1,
respectivamente (pHmetro modelo YSI 55).
A alimentação dos juvenis foi suspensa 24h antes das respectivas aplicações. Os peixes
foram brevemente imersos em água contendo gelo. Imediatamente após o banho de gelo, os
animais foram pesados e medidos e, em seguida, receberam as aplicações intraperitoneais de
hormônio com a utilização de agulhas e seringas (3mL) descartáveis. Em seguida, os peixes
foram devolvidos aos seus aquários de origem e ali permaneceram até findar o tempo de
exposição previamente determinado para cada aquário. Após concluído o tempo estabelecido,
os peixes foram coletados e imersos novamente em um banho de gelo. Para a avaliação da
condição hematológica dos animais, amostras de sangue foram obtidas por meio de punção do
vaso caudal utilizando seringas contendo heparina como anticoagulante. No sangue total, foram
determinados os seguintes parâmetros: hematócrito (Ht), hemoglobina (Hb), contagem de
eritrócitos (RBC), e, a partir destes, foram calculadas as constantes corpusculares: volume
corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM), de acordo com as fórmulas estabelecidas por Brow
(1976). Parte do sangue foi centrifugada para separação do plasma, onde foram determinados
os níveis de glicose por meio de kit comercial (InVitro®) por espectrofotometria em um
comprimento de onda de 500 nm.
Após a coleta de sangue os peixes foram sacrificados por secção medular e foram
retiradas amostras de fígado, as quais foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido e
posteriormente armazenados em freezer -80ºC até o momento da extração de RNA total.
Extração de RNA total e transcrição reversa
O RNA total do fígado dos juvenis de tambaqui submetidos ao experimento, foi isolado
de acordo com as instruções do fabricante para TRIzol® Reagent (Invitrogen). A integridade
do material genético foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1% (m/v). A concentração
e a pureza das amostras foram determinadas em espectrofotômetro NanoDrop®
Spectrophotometer 2000 (Thermo Scientific) por meio da razão dos valores de absorbância nos
comprimentos de onda 260/280 nm e 260/230 nm. Antes da transcrição reversa, o RNA total
23
foi tratado com DNase I® (Life Technologies) a fim de evitar qualquer contaminação com DNA
genômico. A fita de cDNA foi sintetizada por transcrição reversa utilizando 1 g de RNA total
em 20 μL de volume final da reação, seguindo o protocolo do fabricante do kit Revertaid H
Minus First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific).
Desenho dos primers do IGF-I e dos genes de referência (28s e EF1a)
Foi realizada uma busca de sequências do gene IGF-I e dos genes de referência 28s e do
EF1α, dentre as espécies de peixes da ordem Characiformes depositadas no banco de dados online do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), por meio da ferramenta Nucleotide. Após o
alinhamento das sequências os primers (sequências iniciadoras) de oligonucleotídeos
(degenerados) foram desenhados utilizando o Software Oligo Explorer 1.2.
Os primers selecionados com base na qualidade do produto de PCR e na visualização
da amplificação por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, os produtos de PCR foram
purificados através do sistema de eletroforese E-Gel® (Life Technologies) e sequenciados para
a verificação da especificidade da sequência amplificada com a espécie C. macropomum. Na
reação de sequenciamento foi utilizado o reagente Big Dye V3.1 (Applied Biosystems)
seguindo o protocolo padrão do fabricante. Os produtos da reação de sequenciamento foram
limpos através de precipitação com isopropanol 65% (v/v), à temperatura ambiente e 15 min ao
abrigo da luz. A solução foi centrifugada durante 35 min a 3000 x g em temperatura ambiente
e o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 200 μL de etanol 70% (v/v) em temperatura
ambiente, seguido de 10 min de centrifugação a 3000 x g. O sobrenadante foi descartado e as
amostras secas por 120 minutos, protegidas da luz. As amostras foram, então, re-suspensas em
10 μL de formamida HiDi (Applied Biosystems) e aquecidas a 95°C por 5 minutos. Após todo
o protocolo da reação de sequenciamento as amostras foram sequenciadas com auxílio do
sequenciador automático de dezesseis capilares ABI 3130XL Sequence Analizer (Applied
Biosystems).
Após obtenção das sequências, os primers específicos foram desenhados utilizando
novamente o Software Oligo Explorer 1.2. Para determinar a eficiência de cada primer, curvas
padrão foram geradas utilizando 6 pontos de diluição seriada, com fator de diluição 1:2, a partir
de uma única amostra de cDNA de C. macropomum. Diferentes concentrações dos primers
foram testadas até a obtenção do melhor valor de eficiência da PCR (E), calculada pela obtenção
24
dos valores de “slope” (declividade) da curva padrão de acordo com a equação E = 10(-1/slope) 1 (Tabela 1).
Tabela 1: Sequências dos oligonucleotídeos específicos-primers (Forward e Reverse) dos genes IGF-I, 28s e EF1α para a
espécie Colossoma macropomum. Valores de concentração (Conc.) dos primers validados e os valores de Slope e R2 da curva
padrão de acordo com a eficiência (Eff%).
Genes
Forward
IGF-I
5’CAAGTTGCTTTTCGTCGTG3’
28s
5’CGGGTTCGTTTGCGTTAC3’
EF1α
5’GTTGGTGAGTTTGAGGCTGG3’
Conc.
Slop
R2
Eff%
5’CGCATGGTACACTTTAAGAC3’
2,8pMol
3,34
0,997
99,26
5’AAAGGGTGTCGGGTTCAGAT3’
2,5pMol
3,33
0,998
99,39
5’CACTCCCAGGGTGAAAGC3’
1,8pMol
3,35
0,998
98,70
Reverse
Real-time PCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Para verificar os padrões de expressão do gene Insulin Growth Factor-I (IGF-I) em
indivíduos de Colossoma macropomum submetidos à aplicação intraperitoneal de
Lactotropin®, um experimento de PCR em Tempo Real foi realizado. Nesse experimento
quatro indivíduos de cada tratamento e controles foram analisados em triplicata.
A quantificação de RT-PCR foi realizada no equipamento ViiA 7 Real Time PCR System
(Applied Biosystems), cada reação foi feita em triplicata para um volume final de 10 µL
contendo 5 µL de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 µL de cDNA, 1 µL
de primer forward, 1 µL de primer reverse e 2 µL de água nuclease free. As condições do
experimento foram: uma desnaturação inicial de dois minutos a 50°C e 95°C por 10 minutos,
seguida de 40 ciclos a 95°C por 15s e 60°C por 60s e um estágio para curva de hibridização
(Melt Curve) a 95°C por 15s, 60°C por 60s e 95°C por 15s para confirmação da especificidade
dos amplicons. A eficiência da PCR (E) foi calculada pela obtenção dos valores de slope da
curva padrão de acordo com a equação E = 10(-1/slope) -1.
Os resultados de expressão gênica relativa aqui apresentados foram calculados por meio
do modelo matemático 2-(ΔΔCt) descrito por Pfaall (2001), onde o ΔΔCt equivale ao ΔCt da
amostra - ΔCt do gene de referência. Sendo que, para a utilização de dois genes de referência
(28s e EF1α), seguiu-se o descrito por Vandesompele et al. (2002) os quais sugerem que o
experimento seja normalizado com os valores das médias geométricas dos Cts de ambos os
genes de referência.
25
Análise Estatística
Os dados foram analisados observando-se diferenças significativas da interação entre os
fatores tempo e tratamento por Análise de Variância de dois fatores (Two Way ANOVA),
considerando o intervalo de confiança de 5%. As premissas exigidas pelo teste paramétrico
foram verificadas por meio do teste de Shapiro-Wilk. Quando houve diferenças significativas
entre as médias, estas foram comparadas pelo teste de Tukey, considerando p<0,05. Para
aplicação dos testes estatísticos foi utilizado o programa SigmaStat 11.0.
26
RESULTADOS
O efeito das aplicações de rbGH sobre a expressão gênica relativa do gene IGF-I em
fígado de C. macropomum está representado na figura 1. As aplicações resultaram em uma
interação estatisticamente diferente entre os fatores tempo e tratamento (p ≤ 0.001).
Aumento e pico na expressão relativa do gene IGF-I foi observada no tempo de 24 horas
em comparação aos demais tempos, que apresentaram menores níveis de expressão relativa
(p<0.05). Entre os tratamentos, somente no tempo de 24 horas puderam ser verificadas
diferenças significativas. Maior expressão relativa foi apresentada pelos animais que receberam
a dose de 100 µg.g-1 em comparação aos demais tratamentos (p<0,05). Expressão gênica
superior aos animais do GSI e dos que receberam a dose de 1 µg.g-1 foi observada para o SHAM
e os animais que receberam 10 µg.g-1 (p<0,05) (Figura 1).
Não foram observadas diferenças para as variáveis hematológicas e os níveis
plasmáticos de glicose dos juvenis de tambaqui entre os tempos e os tratamentos ao longo do
período experimental (p>0,05) (Tabela 2).
27
Expressão Gênica Relativa IGF-I
40
30
A
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
a
b b
20
B
B
10
c
c
0
1h
4h
8h
12h
24h
48h
168h
Figura 1: Efeito da aplicação intraperitoneal ao longo de tempos amostrais de hormônio do
crescimento bovino (Lactotropin®) e sua influência na expressão do gene IGF-I em juvenis de
tambaqui (C. macropomum). Resultados de expressão relativa normalizada por meio da média
geométrica dos genes endógenos 28s e EF1-α, expressos como média ± erro padrão. Letras
distintas em maiúsculo indicam diferenças significativas entre os tempos e letras distintas em
minúsculo indicam diferenças entre os tratamentos no mesmo tempo (p<0,05). GSI (Grupo Sem
Injeção); SHAM (Soro fisiológico 0,9% NaCl); 1 μg.g-1; 10 μg.g-1; 100 μg.g-1.
28
Tabela 2: Glicose plasmática (mg/dL) e variáveis hematológicas de juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum) sob efeito de diferentes
concentrações do hormônio do crescimento recombinante bovino (Lactotropin®).
Tempo (Horas)
1
4
8
12
24
48
168
Tratamentos
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
GSI
SHAM
1 µg.g-1
10 µg.g-1
100 µg.g-1
Glicose (g/dL)
42,00 ± 6,27
46,25 ± 5,43
60,00 ± 5,43
50,00 ± 5,43
39,00 ± 5,43
38,67 ± 6,27
40,80 ± 4,86
42,75 ± 5,43
33,75 ± 5,43
31,75 ± 5,43
26,00 ± 5,43
37,50 ± 5,43
45,25 ± 5,43
41,25 ± 5,43
38,00 ± 6,27
31,00 ± 5,43
43,00 ± 5,43
42,00 ± 5,43
36,00 ± 5,43
40,50 ± 5,43
41,75 ± 5,43
35,50 ± 5,43
38,50 ± 5,43
32,75 ± 5,43
37,75 ± 5,43
32,50 ± 5,43
39,25 ± 5,43
32,00 ± 5,43
35,00 ± 6,27
41,00 ± 5,43
48,25 ± 5,43
37,50 ± 7,68
41,50 ± 7,68
42,75 ± 5,43
39,25 ± 5,43
Hematócrito (%)
13,83 ± 1,71
16,63 ± 1,48
18,13 ± 1,48
17,63 ± 1,48
17,25 ± 1,48
17,75 ± 1,48
16,25 ± 1,48
16,38 ± 1,48
18,88 ± 1,48
14,88 ± 1,48
15,13 ± 1,48
15,88 ± 1,48
17,88 ± 1,48
17,38 ± 1,48
15,50 ± 1,71
14,13 ± 1,48
16,13 ± 1,48
14,88 ± 1,48
16,38 ± 1,48
15,50 ± 1,48
16,88 ± 1,48
14,88 ± 1,48
16,88 ± 1,48
15,75 ± 1,48
18,75 ± 1,48
21,13 ± 1,48
17,63 ± 1,48
20,25 ± 1,48
24,50 ± 1,48
21,75 ± 1,48
18,25 ± 1,48
21,50 ± 2,09
24,25 ± 2,09
18,50 ± 1,48
16,25 ± 1,48
Hemoblobina (g/dL)
4,52 ± 0,86
4,53 ± 0,74
6,97 ± 0,86
5,41 ± 0,74
5,70 ± 0,74
5,71 ± 0,74
5,04 ± 0,74
4,75 ± 0,74
6,46 ± 0,74
5,34 ± 0,74
4,71 ± 0,74
5,13 ± 0,74
5,06 ± 0,74
5,36 ± 0,74
5,44 ± 0,86
7,20 ± 0,74
4,80 ± 0,74
4,62 ± 0,74
4,95 ± 0,74
4,12 ± 0,74
4,95 ± 0,74
4,28 ± 0,74
5,52 ± 0,74
4,15 ± 0,74
5,69 ± 0,74
6,49 ± 0,74
5,27 ± 0,74
5,77 ± 0,74
5,53 ± 0,74
6,49 ± 0,74
6,13 ± 0,74
7,40 ± 1,05
6,96 ± 1,05
6,32 ± 0,74
5,88 ± 0,74
RBC (nºerit.*106/mm3)
1,26 ± 0,14
1,40 ± 0,13
1,70 ± 0,14
1,59 ± 0,13
1,37 ± 0,13
1,58 ± 0,18
1,11 ± 0,18
1,25 ± 0,18
1,56 ± 0,18
1,16 ± 0,18
1,26 ± 0,13
1,23 ± 0,13
1,23 ± 0,13
1,25 ± 0,13
1,13 ± 0,14
0,94 ± 0,13
1,19 ± 0,13
1,05 ± 0,13
1,26 ± 0,13
1,20 ± 0,13
1,36 ± 0,13
1,08 ± 0,13
1,19 ± 0,13
1,26 ± 0,13
1,43 ± 0,13
1,58 ± 0,13
1,36 ± 0,13
1,49 ± 0,13
1,62 ± 0,13
1,68 ± 0,13
2,09 ± 0,13
2,52 ± 0,18
2,37 ± 0,18
1,74 ± 0,13
1,69 ± 0,13
VCM (µm³)
112,81 ± 17,20
118,82 ± 14,90
150,21 ± 14,90
112,68 ± 14,90
126,27 ± 14,90
112,53 ± 21,07
170,12 ± 21,07
149,81 ± 21,07
107,14 ± 21,07
138,57 ± 21,07
122,11 ± 14,90
130,43 ± 14,90
150,90 ± 14,90
138,48 ± 14,90
137,89 ± 17,20
152,18 ± 14,90
141,19 ± 14,90
141,76 ± 14,90
129,24 ± 14,90
129,33 ± 14,90
124,80 ± 14,90
139,20 ± 14,90
143,08 ± 14,90
126,73 ± 14,90
131,89 ± 14,90
142,46 ± 14,90
127,29 ± 17,20
134,96 ± 14,90
151,56 ± 14,90
131,34 ± 14,90
87,19 ± 14,90
85,50 ± 21,07
115,77 ± 17,20
110,61 ± 14,90
110,48 ± 14,90
HCM (pg)
36,14 ± 4,39
32,64 ± 3,80
41,12 ± 4,39
34,33 ± 3,80
42,43 ± 3,80
35,08 ± 5,37
46,58 ± 5,37
42,27 ± 5,37
33,96 ± 5,37
51,74 ± 5,37
37,27 ± 3,80
41,78 ± 3,80
41,76 ± 3,80
43,22 ± 3,80
48,23 ± 4,39
37,97 ± 4,39
42,46 ± 3,80
44,70 ± 3,80
39,09 ± 3,80
34,34 ± 3,80
36,29 ± 3,80
39,48 ± 3,80
46,84 ± 3,80
32,97 ± 3,80
39,78 ± 3,80
41,64 ± 3,80
39,15 ± 3,80
39,29 ± 3,80
34,12 ± 3,80
39,96 ± 3,80
29,35 ± 3,80
29,35 ± 5,37
29,35 ± 5,37
37,78 ± 3,80
39,53 ± 3,80
CHCM (%)
32,89 ± 3,16
27,27 ± 2,74
39,44 ± 3,16
31,13 ± 2,74
33,82 ± 2,74
32,45 ± 2,74
31,68 ± 2,74
29,03 ± 2,74
33,94 ± 2,74
35,74 ± 2,74
30,92 ± 2,74
33,18 ± 2,74
28,42 ± 2,74
31,60 ± 2,74
35,12 ± 3,16
25,66 ± 3,16
29,65 ± 2,74
31,24 ± 2,74
30,26 ± 2,74
26,57 ± 2,74
29,20 ± 2,74
28,55 ± 2,74
32,75 ± 2,74
26,26 ± 2,74
30,41 ± 2,74
33,27 ± 2,74
32,61 ± 3,16
29,79 ± 2,74
22,45 ± 2,74
30,35 ± 2,74
33,73 ± 2,74
34,44 ± 3,87
29,21 ± 3,87
34,16 ± 2,74
36,07 ± 2,74
29
DISCUSSÃO
No presente estudo as aplicações do hormônio do crescimento recombinante bovino
(Lactotropin®) causaram um aumento nos níveis de expressão relativa do gene IGF-I em fígado
de Colossoma macropomum após 24 horas da injeção peritoneal, sendo que o mesmo retornou
aos valores iniciais de expressão após este período (figura 1). Diversos trabalhos já
demonstraram que o rbGH pode induzir o aumento nos níveis de IGF-I em diferentes espécies
de teleósteos, como nos estudos utilizando Ictalurus punctatus (Peterson et al., 2005),
Oreochromis mossambicus (Kajimura et al., 2001), Oncorhynchus mykiss (Biga et al., 2005),
Oncorhynchus kisutch (Raven et al., 2012), Perca fluviatilis (Jentoft et al., 2004) e
Scaphirhynchus platorhynchus (Fenn e Small, 2015). Estes estudos, embora diferenciem-se em
vários aspectos como doses, condições ambientais, dietas, análises fisiológicas e idade dos
animais, obtiveram respostas positivas tanto a longo quanto a curto prazo, não apenas no
aumento da expressão do IGF-I, mas também no crescimento das diferentes espécies avaliadas.
Estudos como os de Peterson et al. (2005) sugerem que o rbGH auxilia no crescimento
muscular e no apetite, melhorando a conversão alimentar e aumentando os níveis plasmáticos
de IGF-I. Fenn e Small (2015) estudaram as ações do rbGH em Scaphirhynchus platorhynchus
e observaram aumento no comprimento e no peso dos animais, aumento este diretamente
relacionado aos níveis de expressão hepática do IGF-I, demonstrando que o rbGH atuou nos
mecanismos de promoção do crescimento muscular e síntese de proteínas por meio dos
mecanismos do IGF-I. O IGF-I participa dos processos de hipertrofia e hiperplasia envolvidos
principalmente com a sinalização mitogênica e atua, juntamente com outras moléculas, como
um fator de progressão da divisão celular (Butler e Roith, 2001).
Além disso, Biga et al. (2004), buscando avaliar ações importantes do IGF-I em tecidos
envolvidos com a reprodução e a osmorregulação, bem como sua importância para o
crescimento, estudaram as ações do rbGH em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e
verificaram aumento na expressão de IGF-I não apenas no fígado, mas também no plasma e em
vários tecidos extra-hepáticos como brânquias, intestino, gônadas, cérebro e músculo. O rbGH
inicia suas ações biológicas, bem como a produção e liberação do IGF-I no fígado e em outros
tecidos, intermediado pelos GHR’s. Para Silverstein et al. (2000) o rbGH também promove o
crescimento estimulando aumento nos níveis de IGF-I plasmático, expressos tanto pelo fígado
quanto por outros tecidos. Ambos os estudos sugerem que o IGF-I é responsável por completar
30
as ações do GH, atuando como regulador de respostas metabólicas em diferentes tecidos. É
possível que esses mesmos efeitos tenham sido estimulados em C. macropomum, considerando
o papel do eixo GH-IGF na regulação de grande parte dos processos autócrinos e parácrinos
envolvidos no crescimento dos teleósteos.
Butter e Roith (2001) também descreveram a presença de IGF-I em tecidos extrahepáticos e, levando tais achados em consideração, sugeriram que o IGF-I seja mais atuante em
processos que promovem o crescimento do que o próprio GH, ressaltando sua importância nos
processos metabólicos celulares. Desse modo, eles contradizem outros trabalhos que
consideram que o GH possui suas ações mediadas indiretamente pelo IGF-I (Reinecke et al.,
2005). De qualquer forma, nota-se neste estudo que o rbGH atuou de forma eficiente na
expressão do IGF-I hepático mostrando ser biologicamente ativo em C. macropomum.
É evidente que os efeitos das injeções de rbGH provocaram um pico na expressão do
IGF-I em fígado de C. macropomum após 24 horas de aplicação (Figura 1). Estes resultados
são similares aos obtidos por Peterson et al. (2005) que também descreveram uma maior
expressão nos níveis hepáticos de IGF-I após 24 horas em I. punctatus. No entanto, Biga et al.
(2004) relataram um primeiro pico de expressão do IGF-I em fígado de O. mykiss 12 horas após
a primeira aplicação de rbGH e estes níveis permaneceram elevados durante todo período
amostral subsequente. Estes resultados comprovam que o rbGH estimula a transcrição de
mRNA de IGF-I e sua liberação a partir do fígado e de tecidos extra-hepáticos. A permanência
dos níveis de IGF-I após o pico de expressão em O. mykiss pode indicar uma resposta espécieespecífica. Embora esses trabalhos citem resultados similares aos encontrados no presente
estudo, eles não evidenciam mecanismos de ações anabólicas e catabólicas do rbGH.
Por outro lado, o trabalho de Leung e Woo (1991) descrevem os efeitos metabólicos do
rbGH em O. Massambicus, relatando que após 24 horas de aplicação suas respostas foram
consideradas “anti-insulínicas”, isso porque os níveis de aminoácidos e glicose no plasma foram
significativamente maiores do que nos indivíduos do grupo controle, associados também à
redução da síntese de glicogênio em tecido hepático. Sabe-se que entre as ações do GH estão o
aumento no transporte de aminoácidos através das membranas celulares, redução do
catabolismo de proteínas e melhoramento da captação e utilização de aminoácido para síntese
de proteínas; além de aproveitar as reservas de gordura como fonte de energia e conservar os
carboidratos (Canosa, 2007; Bergan et al., 2015).
Normalmente os peixes necessitam de uma dieta com alto teor de proteínas, a qual é
metabolizada e utilizada como fonte de energia, e um dos efeitos esperados pelo GH seria a
31
utilização da glicose como fonte principal energia, ao invés das proteínas, fazendo com que o
efeito poupador e construtor de proteínas seja uma das suas principais ações na promoção do
crescimento (Leung e Woo, 1991). No entanto, nossos resultados mostram que não houve
mudança nos níveis de glicose em nenhum dos tratamentos e nos diferentes tempos após
aplicação, assim como não houve alteração nos parâmetros hematológicos (tabela 1).
Com relação às concentrações de rbGH aplicadas em C. macropomum nota-se ainda no
tempo de 24 horas, que a concentração de 100 μg.g-1 apresentou maior expressão de IGF-I,
diferindo das demais, inclusive dos grupos controles. Kajimura et al. (2001) também aplicaram
concentrações de 100 μg.g-1 de rbGH e seus resultados foram semelhantes aos nossos. No
entanto, avaliaram também o crescimento e constataram que houve correlação significativa
entre os níveis de expressão de IGF-I em fígado com as taxas de crescimento de O.
mossambicus. Embora no trabalho de Peterson et al. (2005) a concentração utilizada tenha sido
de 50 μg.g-1 de rbGH, seus resultados apresentaram concentrações de IGF-I elevadas não
apenas no fígado, mas também no plasma dos animais que apresentaram melhor desempenho
no crescimento. Já Fenn e Small (2015), utilizando uma concentração maior do que as nossas
(240 μg.g-1), constataram que a quantidade dos transcritos de IGF-I em fígado foi maior nos
peixes com melhor desempenho no ganho de peso e no comprimento e observaram, por meio
de análise centesimal do corpo, um aumento significativo nas concentrações de proteínas totais.
Silverstein et al. (2000) submeteram I. punctatus a tratamentos com 2,5 μg.g-1 de rbGH duas
vezes por semana e avaliaram sua influência no crescimento associado a baixas e altas
temperatura. Os autores concluíram que o rbGH foi eficiente no aumento dos índices
plasmáticos do IGF-I e, consequentemente, possibilitou à espécie melhor desempenho no
crescimento, tanto em baixas quanto em altas temperaturas. Os resultados desses trabalhos
demonstram os efeitos funcionais do rbGH na estimulação da expressão do gene IGF-I,
associado em muitos casos a promoção do crescimento. Sabe-se que a concentração relativa de
transcritos de um determinado gene em uma célula é um indicativo do quanto esse gene está
sendo expresso, isto é, do quanto a célula está investindo do seu maquinário bioquímico para
produzir a proteína codificada pelo gene (Alberts et al., 2010). No geral, com o uso do rbGH é
notória sua atuação no esforço celular, provocando aumento na expressão dos transcritos de
IGF-I.
Fenn e Small (2015) sugerem que estudos com GH e IGF-I sejam conduzidos em
espécies comercialmente importantes, pois a caracterização dos mecanismos subjacentes ao
crescimento, juntamente com a identificação dos hormônios e genes envolvidos são importantes
32
para o desenvolvimento de novas tecnologias, não apenas para serem aplicadas na aquicultura,
mas também para conservação de espécies com estoque natural limitado. Por fim, espera-se que
as informações levantadas neste trabalho sobre expressão do IGF-I pelo rbGH possam servir de
base para entendermos os mecanismos de regulação do crescimento do tambaqui Colossoma
macropomum, bem como de outras espécies neotropicais, possibilitando maior controle dos
processos produtivos e a agregação de valores sobre as principais espécies cultivadas no país.
33
CONCLUSÕES
O hormônio exógeno bovino (rbGH, Lactotropin®) mostrou ser um indutor biológico
do gene IGF-I de juvenis de tambaqui (Colossoma macropomum).
As aplicações do rbGH causaram aumento significativos nos níveis de expressão
relativa do gene IGF-I em fígados de juvenis de tambaqui após 24 horas, retornando aos valores
iniciais de expressão após este período.
A concentração de 100 μg.g-1 de rbGH mostrou ser mais eficiente para a expressão do
gene IGF-I em juvenis de tambaqui.
O rbGH não provocou alterações nas condições hematológicas, assim como não
interferiu nos níveis plasmáticos de glicose dos juvenis de tambaqui.
34
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto Nacional de Pesquisas na Amazônia – INPA, ao projeto Adaptações da
Biota Aquática da Amazônia (INCT ADAPTA, CNPQ/FAPEAM), à Fundação de Amparo à
Pesquisa no Estado do Amazonas – FAPEAM e ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução
Molecular – LEEM, pela infraestrutura e apoio financeiro na execução deste estudo.
35
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