Enzimas na Nutrição de Ruminantes Enzymes on Ruminant

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Enzimas na Nutrição de Ruminantes
Enzymes on Ruminant Nutrition
Ricardo Andrade Reis 1,2*, Erika Christina Lara1, Carlos Henrique Silveira Rabelo1
RESUMO: O objetivo deste texto é discutir sobre as possibilidades de utilização de enzimas
exógenas, seja no processo de ensilagem ou como suplemento alimentar, e seus efeitos sobre a
nutrição e desempenho de ruminantes. Normalmente, enzimas fibrolíticas são mais pesquisadas pela
comunidade científica com o intuito de reduzir a fração fibrosa do alimento e/ou aumentar a
digestibilidade desta fração no ambiente ruminal, sendo particularmente interessante na ensilagem de
capins tropicais. Porém, enzimas amilolíticas e proteolíticas também têm sido investigadas como
estratégia para aumentar a degradabilidade do amido no rúmen. Adicionalmente, o uso de inoculantes
bacteriano-enzimáticos tem se tornado importante por promover melhoras no processo de conservação
dos alimentos e desempenho animal. No entanto, os resultados são amplamente variáveis, seja pelos
fatores intrínsecos aos produtos enzimáticos, ou também em relação ao uso exclusivo de enzimas
exógenas ou associadas aos inoculantes bacterianos, em que na maioria dos casos, não há efeito
positivo destes aditivos sobre o valor nutritivo das silagens produzidas, bem como sobre o
desempenho animal.
Palavras-chave: amilase, consumo, enzimas fibrolíticas, inoculante bacteriano-enzimático, proteases
ABSTRACT: Our objective is highlighting the possibility in using exogenous enzymes, either in the
ensiling process or as supplement and their effects on the nutrition and ruminant performance.
Fibrolytic enzymes are widely investigated by scientific community by reducing of fiber and
increasing the ruminal fiber digestibility, or both, being particularly interesting for ensiling of tropical
grasses. However amylolytic and proteolytic enzymes also have been used as a strategy to enhance the
starch rumen degradability. Moreover, use of bacterial-enzymes inoculants has become important to
promote improvements at the fermentation process and animal performance. However, the results
show a great variation on the nutritive value of silages due to use of exogenous enzymes as an
exclusive additive or combined with silage inoculants. As a consequence, the majority of studies no
display positive effect of these additives on animal performance.
Key words: amylase, bacteria-enzymatic inoculant, fibrolytic enzymes, intake, proteases
1
Departamento de Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, São Paulo, Brasil.
INCT/CA, UFV, Departamento de Zootecnia, Av. Peter Henry Rolfs, s/n Campus Universitário,
Viçosa, Minas Gerais 36570-000, Brasil.
*
Autor correspondente. E-mail: [email protected]
2
Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras.
1. Introdução
Ao longo dos anos, a ação conjunta de vários programas de melhoramento genético de plantas
forrageiras, estratégias de manejo e avanços agronômicos tem contribuído para melhorar a
digestibilidade da fibra dos alimentos fornecidos aos animais. No entanto, mesmo diante do avanço
nestas áreas, a digestibilidade da fibra ainda limita o consumo de energia disponível nas forragens
pelos ruminantes, contribuindo para a excessiva excreção de nutrientes no ambiente (Beauchemin et
al., 2003). Neste sentido, o uso de enzimas fibrolíticas exógenas tem por intuito aumentar a
digestibilidade da fração fibrosa melhorando sua utilização e a eficiência na produção de ruminantes
(Beauchemin et al., 1995). No Brasil, a utilização de enzimas fibrolíticas foi avaliada no processo de
ensilagem de gramíneas tropicais (Coan et al., 2005), uma vez que estas apresentam menor valor
nutritivo em relação àquelas cultivadas em áreas de clima temperado (Bernardes e Adesogan, 2012), e
silagens de capins constituem uma das principais fontes de fibra e energia na alimentação de animais
destinados a produção de leite e de carne em confinamento (Bernardes e Rêgo, 2014; Millen et al.,
2009). Como se sabe, o uso das enzimas fibrolíticas tem por intuito disponibilizar carboidratos
solúveis provenientes da hidrolise da parede celular os quais podem ser utilizados no processo de
fermentação, melhorando a conservação da forragem (Lynch et al., 2015).
Embora as enzimas fibrolíticas sejam as mais pesquisadas pela comunidade científica, enzimas
amilolíticas e proteolíticas têm sido estudadas com particular interesse em melhorar a degradabilidade
do amido no rúmen, uma vez que a primeira atua quebrando a estrutura do amido em partículas
menores (Rojo et al., 2005; Van Soest et al., 1991) e a segunda reduz a proteção da matriz proteica
presente nos grânulos de amido sobre a ação dos microrganismos ruminais (DePeters et al., 2007;
Wang et al., 2009). Ambas as enzimas, amilases e proteases, devem ser utilizadas para melhorar o
valor nutritivo de silagens de cereais (Young et al., 2012), uma vez que estas estão entre os principais
alimentos utilizados na nutrição de ruminantes no Brasil (Bernardes e Rêgo, 2014; Millen et al., 2009).
Adicionalmente, complexos enzimáticos (enzimas fibrolíticas, amilolíticas e proteolíticas) têm
sido utilizados em conjunto com inoculantes bacterianos no processo de ensilagem, os quais são
conhecidos como inoculantes bacteriano-enzimáticos. No Brasil, a utilização de inoculantes contendo
complexos-enzimáticos varia de 2,5 a 62,5% dependendo da cultura a ser ensilada (Reis et al., 2015).
Geralmente, os resultados apontam que não há melhora no valor nutritivo destas silagens (Reis et al.,
2015), embora o potencial de ação dos inoculantes bacteriano-enzimáticos seja intimamente
dependente da forragem ensilada, taxa de aplicação e tempo de ensilagem, assim como observado no
uso exclusivo de enzimas exógenas.
Diante deste contexto, o objetivo desta revisão é elucidar o potencial e as limitações da
utilização de enzimas exógenas associadas ou não à inoculantes bacterianos sobre o valor nutritivo das
silagens e seu efeito na nutrição e desempenho de ruminantes.
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2. Enzimas
Uma vez que há inúmeras enzimas com grande potencial de utilização na nutrição de
ruminantes, serão abordados aspectos inerentes à produção destas, bem como descrever o sítio de ação
das principais enzimas pesquisadas nesta área e, posteriormente, discorrer sobre seus efeitos na
conservação de forragens e na nutrição e desempenho de ruminantes.
2.1 Produção de enzimas
Enzimas utilizadas na alimentação de ruminantes são produzidas por microrganismos
específicos através da metabolização de nutrientes presentes no meio de cultivo, seguida pela síntese e
secreção enzimática. Uma vez que o processo se completa, o extrato enzimático é separado do resíduo
e dos organismos que lhe deram origem. Ainda que a fonte de organismo entre os produtos
enzimáticos seja geralmente semelhante, o tipo e a atividade de enzimas produzidas podem variar
amplamente, a depender da linhagem selecionada, do substrato de crescimento e do meio de cultura
utilizado (Considine e Coughlan, 1989; Gashe, 1992; Lee et al., 1998).
Os aditivos enzimáticos são normalmente classificados com base nos compostos que degradam,
como as celulases, xilanases e ligninases, que atuam sobre celulose, xilana e lignina, respectivamente
(McAllister et al., 2001). Além disso, os produtos enzimáticos destinados à alimentação animal,
geralmente são compostos por diferentes combinações enzimáticas e, mesmo produtos compostos
somente por celulases e hemicelulases, podem apresentar atividades secundárias como amilases,
proteases e/ou pectinases, as quais podem se associar às celulases e hemicelulases, consideradas
primárias ou essenciais às dietas de bovinos (McAllister et al., 2001).
As enzimas de origem microbiana são preferencialmente utilizadas pela indústria e são
provenientes, principalmente, de quatro espécies de bactérias (Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophilus, L. plantarum e Streptococcus faecium, spp.) e três espécies de fungos (Aspergillus
oryzae, Trichoderma reesei e Saccharomyces cerevisiae) (Muirhead, 1996). O interesse em produzir e
utilizar estas enzimas é relativamente maior no setor de nutrição animal comparado a outros setores
(Polizeli, 2008). Dentre as vantagens da utilização de microrganismos na produção de enzimas estão o
rápido crescimento celular, curto tempo de produção de metabólitos, cepas com alto potencial de
produção, meio de crescimento barato e fácil extração do produto.
57
2.1 Principais enzimas e sítios de ação
2.1.1 Celulases
O sistema enzimático das celulases é constituído de um conjunto de hidrolases glicosídicas, que
envolvem três tipos de enzimas: endo-β-1,4-glucanases ou endoglucanases, exo-β-1,4-glucanases ou
celobiohidrolases, ou apenas exoglucanases e β-1,4-glucosidases. Esses três componentes atuam de
forma sinérgica na hidrólise de celulose (Dillon, 2004; Zhang et al., 2007), porém, em locais
diferentes. As endoglucanases agem nas regiões de menor organização das microfibrilas da celulose
reduzindo a polimerização das microfibrilas e disponibilizando mais substratos para ação das
exoglucanases (McAllister et al., 2001). Em outras palavras, endoglucanases hidrolisam
aleatoriamente as cadeias de celulose produzindo oligômeros de celulose de vários graus de
polimerização. Por sua vez, exoglucanases hidrolisam a cadeia de celulose a partir da extremidade não
redutora para produzir celobiose, enquanto β-glucosidases liberam glicose a partir da celobiose e
hidrolisam cadeias curtas de celoligossacarídeos a partir de extremidades redutoras ou não (Bhat e
Hazlewood, 2000). Por outro lado, as celulases são inibidas pela presença de altas concentrações de
seus produtos de hidrólise (Bhat e Hazlewood, 2000), enquanto endo e exoglucanases são geralmente
inibidas pela celobiose e β-glucosidases são inibidas pela alta concentração de glicose.
2.1.2 Hemicelulases
A utilização de hemicelulases para promover modificação na composição química da fibra está
essencialmente associada à aplicação de xilanases, que catalisam a hidrólise das xilanas. As xilanases
participam da desagregação da parede celular de plantas e, em conjunto com outras enzimas,
hidrolisam polissacarídeos (Polizeli et al., 2005).
A heterogeneidade das hemiceluloses, notadamente das xilanas, exige tal como a celulose, um
sistema enzimático (cooperativo) complexo para que a sua solubilização completa ocorra (Sunna e
Antranikian, 1997). As endo-β-1,4-xilanases são as principais enzimas no processo de
despolimerização da xilana, as quais hidrolisam a cadeia principal mais fácil e rapidamente em regiões
sem substituições gerando oligossacarídeos não substituídos e ramificados ou esterificados (Biely,
1985; 2003). Estas enzimas diferem na sua especificidade por substratos, em que algumas delas
quebram aleatoriamente resíduos de xilose não substituídos, enquanto outras dependem fortemente dos
substituintes próximos aos resíduos de xilose hidrolisados (De Vries e Visser, 2001).
As β-xilosidases são exoglucosidases que hidrolisam xilooligossacarídeos pequenos e xilobiose,
liberando xilose. A especificidade dessas enzimas por pequenos oligossacarídeos de xilose é alta
(Reilly, 1981; Sunna e Antranikian, 1997), e elas são capazes de liberar xilose de terminais não
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redutores de oligossacarídeos ramificados somente quando dois resíduos de xilose contínuos estão
adjacentes à resíduos de xilose simples ou duplamente substituídos (De Vries e Visser, 2001).
Outras enzimas responsáveis por eliminar resíduos substituintes específicos são conhecidas
como enzimas auxiliares ou desramificadoras e atuam em sinergia com as xilanases e β-xilosidases no
processo de despolimerização da xilana. Dentro desse grupo são conhecidas as acetil xilana esterases,
α-glucuronidases, α-L-aferanosidase, feroluil esterase e coumaroil esterase (Aro et al., 2005; Kulkarni
et al., 1999; Prade, 1995). Algumas atuam nas ligações entre um resíduo da cadeia principal e o grupo
substituinte, enquanto outras quebram ligações internas ou terminais das cadeias laterais (De Vries e
Visser, 2001).
2.1.3 Amilases
Amilases são capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas α-1,4 da molécula de amido e, de
acordo com seu modo de ação, podem ser divididas em duas categorias: endoamilases e exoamilases.
A α-amilase trata-se de uma endoamilase que promove a hidrólise de ligações α-1,4 no interior da
cadeia de amilose e de amilopectina, liberando várias cadeias de oligossacarídeos de diversos
tamanhos que apresentam conformação α no carbono 1 (Reddy et al., 2003). A glucoamilase ou
amiloglicosidase trata-se de uma exoamilase capaz de hidrolisar ligações glicosídicas do tipo α-1,4 por
meio da remoção de sucessivas unidades de glicose a partir da extremidade não redutora da cadeia,
liberando moléculas de D-glicose na conformação β. Essas enzimas também hidrolisam as ligações α1,6 e algumas ligações do tipo α-1,3, porém, em uma velocidade menor (Kumar e Satyanarayana,
2009; Michelin et al., 2008).
2.1.4 Proteases
As proteases podem ser classificadas de acordo com o tipo de reação catalisada, a natureza
química da porção catalítica de sua cadeia química, entre outras, sendo divididas em exopeptidases e
endopeptidases. As exopeptidases atuam na quebra das ligações peptídicas próximas aos grupos amino
ou carboxílico terminal da proteína, enquanto as endopeptidases promovem a lise de ligações distantes
dos grupos amino ou carboxílicos terminais (Rao et al., 1998).
Estas enzimas proteolíticas têm sido associadas na melhora da digestibilidade do amido
(DePeters et al., 2007; Young et al., 2012), uma vez que agem sobre a matriz proteica dos grânulos de
amido hidrolisando cadeias complexas de polipeptídeos e liberando compostos de menor peso
molecular, o que resulta em mais sítios de ação para atuação dos microrganismos do rúmen (Simpson,
2001). Desta maneira, o impedimento físico-químico na digestão do amido em ruminantes promovido
pela matriz proteica (Owens et al., 1986) pode ser reduzido.
59
2.1.5 Feruloil esterase (FAE)
O uso da FAE na nutrição de ruminantes tem se tornado importante por quebrar ligações
cruzadas entre lignina e os polissacarídeos da parede celular. Essa enzima é uma hidrolase que atua em
ésteres carboxílicos liberando ácido ferúlico e outros ácidos cinâmicos presentes nos polissacarídeos
da parede celular vegetal, envolvidos na interligação entre a hemicelulose e a lignina (Faulds et al.,
2002). Por isso, as FAEs são conhecidas como enzimas acessórias, pois ajudam a ação das xilanases e
celulases na hidrólise da biomassa lignocelulósica (Gottschalk et al., 2010).
3. Aplicação de enzimas na nutrição de ruminantes
A forragem é a maior fonte de energia para os ruminantes, sendo constituída, principalmente,
por celulose e hemicelulose (Van Soest, 1994). Esses dois compostos são formados por moléculas
simples interligadas por ligações rígidas e altamente resistentes. Com isso, a degradação do alimento
pelos microrganismos do rúmen pode ser comprometida diminuindo a liberação de energia e proteína
para os ruminantes, além do desempenho animal (Church et al., 1993). Portanto, o maior volume de
pesquisas envolvendo enzimas fibrolíticas no intuito de melhorar a nutrição e maximizar o
desempenho animal é justificado.
Enzimas fibrolíticas foram inicialmente testadas como aditivos na ensilagem de forrageiras, pois
se acreditava que estas poderiam melhorar o processo fermentativo pela disponibilização de maiores
quantidades de carboidratos solúveis para as bactérias ácido-láticas (BAL), as quais rapidamente
produzem ácido lático e reduzem o pH da forragem ensilada (Colombatto et al., 2004; McDonald et
al., 1991). Além disso, essas enzimas podem atuar na degradação da parede celular da forragem,
diminuindo o conteúdo de fibra e/ou aumentando a digestibilidade desta fração, o que potencialmente
pode melhorar o desempenho animal (Beauchemin et al., 2003).
Contudo, devido à variedade de produtos enzimáticos e condições experimentais, as respostas
observadas na utilização de enzimas para ruminantes são muitas vezes inconsistentes, e variam desde a
maior liberação de carboidratos solúveis e melhora na digestibilidade do alimento, até respostas nulas
ou negativas da aplicação desses aditivos (Tabela 1). Tais respostas podem ser atribuídas às condições
nas quais a energia não é limitante, pela diferença de atividade enzimática e características das
enzimas suplementadas, assim como, por uma super ou sub-dosagem da atividade enzimática e pelo
método inapropriado de fornecimento da enzima para o animal (Beauchemin et al., 2003).
Além do efeito sobre a concentração da FDN e FDA ser variável, o uso de enzimas fibrolíticas
como estratégia para melhorar o processo de conservação de forragens não apresenta grandes impactos
sobre o valor nutritivo das silagens. Como exemplo, Lynch et al. (2014a; 2015a) não encontraram
efeitos positivos no uso das de enzimas fibrolíticas exógenas sobre o valor nutritivo e digestibilidade
da FDN de silagem e feno de alfafa. Além disso, os autores observaram que o uso das enzimas
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favoreceram a fermentação heterolática da silagem de alfafa e proporcionou maiores perdas de matéria
seca (MS) da forragem. Adicionalmente, em alguns casos, o uso das enzimas fibrolíticas tem
promovido resultados negativos. Por exemplo, Colombatto et al. (2004) avaliaram silagens tratadas
com enzimas comerciais e observaram menor produção de gases e degradação mais lenta nas tratadas
quando comparadas com a controle, o que implicou em substrato menos fermentável e disponível para
os microrganismos do rúmen.
Tabela 1. Efeito da aplicação de enzimas na ensilagem de diferentes forrageiras sobre as
concentrações de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA)
(valores expressos em g/kg de MS)
Fonte
FDN
FDA
Beuvink e Spoelstra (1994)
-35,6
-
Jacobs e McAllan (1991)
-4,9
-10,2
Choung e Chamberlain (1992)
-12,3
-11,7
Rodrigues et al. (1993)
-29,6
-19,2
Selmer-Olsen et al. (1993)
-26,9
-30,7
Stokes et al. (1996)
-5,3
-8,2
0
-8,8
+1,1
+2,6
-1,3; -7,8
-1,4; -6,5
Hoffman et al. (1995)
-6,7
-2,0
Sheperd et al. (1995)
-9,5; -7,8
-9,2; -4,2
-3,7
0
Kung et al. (1990)
-4,2
-2,8
Weinberg et al. (1993)
-7,3
-7,2
Adogla-Bessa et al. (1999)
-8,5
-12,8
Adogla-Bessa et al. (1999) (+ ureia)
+0,3
-1,1
Nia e Wittenberg (1999)
-0,4
-0,6
Silagem de capim
Weinberg et al. (1993)
Silagem de leguminosas e capim-leguminosas
Kung et al. (1991)
Fredeen e Mc Queen (1993)
Nadeau e Buxton (1997)
Silagem de planta inteira de milho
Fonte: Adesogan (2005).
Embora a fração fibrosa possa ser reduzida em alguns casos devido ao uso de enzimas
fibrolíticas (Tabela 1), os resultados negativos de várias pesquisas conduzidas em condições tropicais
parecem estar mais vinculados a um provável aumento proporcional na fração fibra em detergente
neutro indigestível (FDNi) das silagens tratadas em detrimento da redução na fração potencialmente
61
digestível da FDN (FDNpd), uma vez que a ação das enzimas fibrolíticas deve resultar em maior
quantidade de substratos fermentáveis pelas BAL, as quais produzem ácido lático e ácidos de cadeia
curta (McDonald et al., 1991; Nadeau et al., 2000). Como exemplo, Cysneiros et al. (2006)
observaram redução no teor de FDN em silagens de milho tratadas com enzimas fibrolíticas, porém,
sem qualquer efeito sobre a degradação ruminal da FDN.
Portanto, estudos passaram a avaliar enzimas fibrolíticas como aditivos em ração para
ruminantes, ou seja, fornecida imediatamente antes da alimentação, no intuito de aumentar a
digestibilidade, melhorar a eficiência de utilização dos alimentos e, consequentemente, melhorar o
desempenho animal. Quando fornecidas dessa maneira, as enzimas formam ligações com os
substratos, que as protegem da degradação ruminal e podem aumentar a digestibilidade através de
diferentes mecanismos, como: hidrólise direta, melhoria da aceitabilidade, alterações na viscosidade
intestinal e mudanças do local de digestão (Beauchemin et al., 2003; Loures, 2004; Martins, 2003).
O fato de aplicar as enzimas diretamente no cocho parece conferir maior estabilidade enzimática
graças à formação do complexo enzima-substrato, dificultando a ação de proteases microbianas e
aumentando seu tempo de permanência no rúmen por não estar dissolvida no fluído ruminal (Morgavi
et al., 2000). Entretanto, na falta do complexo enzima-substrato estável, as enzimas se solubilizam no
líquido ruminal e fluem rapidamente para o intestino (Beauchemin et al., 2003).
Frente ao contexto de que enzimas fibrolíticas devem ser mais efetivas na degradação ruminal
da FDN quando aplicadas sobre o alimento, imediatamente antes do fornecimento aos animais, Lara et
al. (2012) verificaram maior degradação da parede celular primária de silagens de milho tratadas com
xilanases e celulases após 6 horas de contato entre enzimas e substrato (Figura 1). Neste mesmo
estudo, os autores verificaram ainda maior colonização e exposição dos grânulos de amido da matriz
proteica das silagens de milho quando tratadas com as enzimas fibrolíticas e a bactéria Lactobacillus
buchneri. Tal fato comprovou que aumentos na taxa de degradação do alimento no rúmen estão
relacionados com a melhora na colonização dos alimentos pelos microrganismos ruminais em função
do tratamento enzimático (Colombatto et al., 2003).
No rúmen, as enzimas podem agir diretamente nos alimentos ou estimular indiretamente a
digestão por potencializar as atividades das enzimas microbianas (McAllister et al., 2001),
demonstrando a possibilidade de haver sinergismo entre enzimas exógenas e microbianas (Morgavi et
al., 2000). Neste sentido, produtos enzimáticos contendo xilanases, esterases e proteases mostraram-se
efetivos em estimular a degradação in vitro do feno de alfafa (Colombatto et al., 2003; Nsereko et al.,
2000). Melhorias na digestibilidade in vitro da FDN e fibra em detergente ácido (FDA) da palha de
arroz também foram observadas com a aplicação de xilanase e celulase (Eun et al., 2006).
Os resultados positivos reportados em condições in vitro devido à aplicação das enzimas
poderiam sugerir que as mesmas respostas fossem obtidas em condições in vivo. Entretanto, a
aplicação de enzimas em dietas contendo tortas de azeitona e gramíneas no momento da alimentação
de cordeiros não surtiu qualquer efeito sobre o consumo e digestibilidade (Awawdeh e Obeidat, 2011;
62
Miller et al., 2008). Além disso, outros estudos envolvendo carneiros (McAllister et al., 1999; Rojo et
al., 2005) e bovinos (Krueger et al., 2008; ZoBell et al., 2000) não reportaram efeitos positivos no
ganho de peso dos animais tratados com enzimas aplicadas no momento da alimentação.
Figura 1. Elétron-micrografia de varredura de silagem de milho não tratada (A), silagem de milho
tratada com L. buchneri (B), silagem de milho tratada com enzimas fibrolíticas (C) e
silagem de milho tratada com L. buchneri e enzimas fibrolíticas (D) por 0,5; 1,0; 3,0; 6,0 e
12 horas, de cima para baixo, respectivamente.
Fonte: Lara et al. (2012).
Em condições brasileiras, a adição de enzimas como suplemento para bovinos não proporcionou
mudanças no consumo de matéria seca e de fibra em detergente neutro, como também na
digestibilidade da matéria seca, conforme apresentado na Figura 2 (Martins et al., 2006; Loures et al.,
2005). Porém, foi verificado melhora na digestibilidade da fibra em detergente neutro dos alimentos
suplementados com enzimas (Figura 3). Respostas negativas ou nulas podem estar relacionadas ao
63
tempo no qual o produto enzimático ficou em contato com o alimento antes de ser consumido, e
também ao nível de atividade enzimática presente e ativa no substrato.
12
Sem enzimas
Com enzimas
Ingestão, kg/dia
10
8
6
4
2
0
Silagem de
milho
Silagem de
capim
Feno de
Tifton 85
Silagem de
milho
MS
Silagem de
capim
Feno de
Tifton 85
FDN
Figura 2. Ingestão de matéria seca (MS) e fibra em detergente neutro (FDN) em bovinos
suplementados ou não com enzimas fibrolíticas exógenas em condições brasileiras.
Fonte: Adaptado de Martins et al. (2006) e Loures et al. (2005).
70
Sem enzimas
Com enzimas
Digestibilidade, %
60
50
40
30
20
10
0
Silagem de Silagem de
milho
capim
Feno de
Tifton 85
MS
Silagem de Silagem de
milho
capim
Feno de
Tifton 85
FDN
Figura 3. Coeficientes de digestibilidade aparente total (%) da matéria seca (MS) e fibra em
detergente neutro (FDN) de bovinos suplementados ou não com enzimas fibrolíticas
exógenas em condições brasileiras.
Fonte: Adaptado de Martins et al. (2006) e Loures et al. (2005).
Como mencionado acima, para que as enzimas sejam eficazes como modificadoras da
fermentação ruminal, elas devem resistir à proteólise decorrente da ação de microrganismos do rúmen
e à flutuação do pH e temperatura do rúmen durante um período de tempo suficientemente longo. Em
pesquisa para verificar a estabilidade de enzimas no líquido ruminal, Morgavi et al. (2000) concluíram
64
que, na maioria das enzimas, isso não constitui um fator limitante para sua utilização em dietas para
ruminantes. Todavia, existem evidências de que a aplicação de enzimas sobre os alimentos,
principalmente na forma líquida, aumenta sua adsorção, com consequente aumento da resistência das
enzimas à proteólise prolongando sua viabilidade no ambiente ruminal (Beauchemin et al., 1999).
Além disso, o modo de ação das enzimas exógenas é extremamente complexo, acarretando respostas
variáveis quando da sua utilização em dietas de ruminantes (McAllister et al., 2001).
Outra provável explicação para a falta de resultados positivos em muitos estudos está
relacionada às condições de atuação das enzimas. Em geral, as enzimas usadas na alimentação animal
são misturas de diferentes polissacaridases, glucosidases, ligninases e proteases, que geralmente
necessitam de condições diferentes para mostrarem máximo efeito (Vahjen e Simon, 1999). Por
exemplo, temperatura de 50ºC e pH entre 4,8 a 5,3 são recomendados para celulases provenientes do
Trichoderma spp. (Ghose, 1987; Wood e Bhat, 1988). No entanto, essas condições não refletem a
situação in vivo (Sabatier e Fish, 1996), como temperatura do rúmen de 39ºC e pH entre 5,8 e 6,8. Para
aplicações em ração animal, parece lógico que o pH e a temperatura utilizada nos ensaios de avaliação
devem assemelhar-se às condições encontradas no alimento ou no animal, dependendo do local onde
as enzimas irão atuar.
Outro fator que também exerce grande influência sobre os resultados é o nível de aplicação
enzimática, ou seja, quantas unidades de atividade enzimática devem ser adicionadas por quilo de MS
a ser ingerida. O uso de níveis moderados de enzimas na alimentação de ruminantes pode causar
rupturas benéficas na estrutura da superfície dos alimentos, antes ou após a ingestão (Nsereko et al.,
2002). No entanto, níveis elevados de enzimas podem ser menos eficazes do que níveis mais baixos
por diminuir a adesão microbiana e limitar a digestão do alimento, enquanto o nível ótimo é
dependente da dieta (Beauchemin et al., 2003). Neste sentido, as quantidades de enzimas normalmente
utilizados como aditivos na alimentação de ruminantes variam de 0,5 a 2,0 mg/g (ou g/kg) da dieta
total, com base na MS (Beauchemin et al., 2003). Porém, estas quantidades são dependentes das
características específicas de cada produto, como tipo de atividade das enzimas presentes.
4. Inoculantes bacteriano-enzimáticos
4.1 Efeito sobre o valor nutritivo das silagens
A ensilagem de culturas que apresentam baixo teor de MS, baixa concentração de carboidratos
solúveis e alta capacidade tampão, ou a escolha errada do ponto de colheita, invariavelmente resultam
em silagens inadequadamente fermentadas e de baixa qualidade nutricional (McDonald et al., 1991).
Este quadro é mais grave particularmente em regiões de clima tropical, onde geralmente plantas
forrageiras apresentam menor valor nutritivo comparado àquelas de clima temperado (Bernardes e
Adesogan, 2012). Portanto, a obtenção de silagens com boa qualidade requer adequado manejo da
65
cultura e do processo de ensilagem e, a população epífita de BAL deve estar presente em quantidade
suficiente (105 - 106 unidades formadoras de colônia/g de forragem) para dominar o processo de
fermentação e garantir a fermentação lática (McDonald et al., 1991). No entanto, os produtos
utilizados pelas BAL no processo fermentativo estão restritos basicamente aos carboidratos solúveis
(mono e dissacarídeos), uma vez que a maioria destas bactérias não possui complexo enzimático para
metabolizar carboidratos complexos (Rooke e Hatfield, 2003).
Estratégias como a utilização de inoculantes bacteriano-enzimáticos têm sido avaliadas para
melhorar o padrão de fermentação e valor nutritivo das silagens. Geralmente podem-se considerar dois
tipos distintos de inoculantes bacteriano-enzimáticos: o primeiro e mais comum refere-se à utilização
de BAL homo e/ou heterofermentativas associadas a um complexo enzimático exógeno (enzimas
fibrolíticas, amilolíticas e proteolíticas); o segundo trata-se de cepas específicas de BAL ou outros
microrganismos que são capazes de produzir enzimas. Por exemplo, algumas cepas de Lactobacillus
buchneri, L. plantarum e Bacillus subtilis demonstraram ser hábeis em produzir algum tipo de enzima,
normalmente fibrolíticas (Cavin et al., 1997; Donaghy et al., 1998; Kang et al., 2009). A aplicação de
enzimas fibrolíticas seja isoladamente ou associada à BAL antes da ensilagem de qualquer forragem
deve facilitar a ação das mesmas, uma vez que o tempo de contato entre forragem e enzimas aumenta,
permitindo obter um grande impacto sobre o valor nutritivo da silagem (Lynch et al., 2015b). Neste
sentido, a utilização de inoculantes bacteriano-enzimáticos é benéfica, uma vez que as BAL presentes
no inoculante agem promovendo maior e mais rápida produção de ácido lático, enquanto o complexo
enzimático contido no inoculante age na parede celular e na matriz proteica dos grânulos de amido
liberando açúcares solúveis prontamente disponíveis para fermentação (Fugita et al., 2012).
Especificamente no caso de enzimas fibrolíticas, estas agem na parede celular das plantas removendo
ácido-ferúlico, o que teoricamente implicaria no aumento da digestibilidade das silagens, pois a fração
fibrosa torna-se mais susceptível à ação de bactérias fibrolíticas presentes no rúmen dos animais (Kang
et al., 2009). Como se sabe, o ácido ferúlico é o mais abundante e mais inibitório ácido fenólico que
limita a digestão ruminal da fibra (Yu et al., 2005). Portanto, reduções no teor de FDN em silagens de
milho tratadas com inoculantes bacteriano-enzimáticos têm sido reportadas em silos laboratoriais nos
países de clima temperado (Stokes e Chen, 1994).
Por outro lado, em uma ampla revisão da literatura brasileira, Reis et al. (2015) observaram que
inoculantes bacteriano-enzimáticos são mais utilizados em silagens de sorgo (62,5% dos tratamentos
avaliados), seguido por silagem de capim e milho (30 e 24%, respectivamente). De acordo com os
dados compilados pelos autores citados anteriormente, ao contrário do que se esperava, a aplicação de
inoculantes bacteriano-enzimáticos não reduziu os teores de FDN ou alterou os coeficientes de
digestibilidade comparado às silagens não tratadas (Figura 4). Uma das premissas em utilizar
inoculantes bacteriano-enzimáticos deve-se a preservação de maior quantidade de compostos solúveis
durante a fermentação (Ribeiro et al., 2008). Se esta premissa é atingida, poderia esperar-se uma
redução indireta na participação percentual da parede celular na silagem tratada. No entanto, a maioria
66
dos resultados obtidos experimentalmente no Brasil sugere que inoculantes bacteriano-enzimáticos
não são eficientes em preservar carboidratos solúveis e aumentar a produção de ácido lático nas
silagens (Reis et al., 2015). Além disso, a obtenção de resultados similares quanto aos coeficientes de
digestibilidade possivelmente está associada ao aumento da FDNi na silagem, uma vez que as enzimas
contidas nos inoculantes são capazes de agir somente na fração FDNpd (Rooke e Hatfield, 2003).
800
Controle
Inoculante bacteriano-enzimático
DIVMS
PB
g/kg de MS
600
400
200
0
PB
FDN
Milho
FDN
Capim
DIVMS
PB
FDN
DIVMS
Sorgo
Figura 4. Efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre o teor de proteína bruta (PB), fibra em
detergente neutro (FDN) e coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS)
de silagens de milho, capim e sorgo.
Fonte: Adaptado de Reis et al. (2015).
Outros fatores como estádio de maturidade da forragem, tempo de fermentação, exposição ao
oxigênio e perdas de constituintes não fibrosos durante a fermentação também contribuem para as
discrepâncias sobre os efeitos de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre o teor de FDN das silagens
(Addah et al., 2014). De fato, o estádio de maturidade da forragem interfere marcadamente sobre a
ação de inoculantes bacteriano-enzimáticos. Como exemplo, a aplicação de um inoculante bacterianoenzimático foi mais eficiente em aumentar os coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria
orgânica (DIVMO) em silagens de milho produzidas a partir de plantas colhidas mais tardiamente
(Figura 5), como reportado por Rabelo et al. (2014). De acordo com os próprios autores, os maiores
coeficientes de DIVMO encontrados em silagens produzidas nos estádios 2/3 de linha de leite e
camada negra se devem à presença de enzimas amilolíticas, assim como celulolíticas no inoculante,
que atuam sobre o amido e celulose, respectivamente, e auxiliam na degradação destas frações durante
o processo digestivo. Contudo, de maneira geral, os inoculantes bacteriano-enzimáticos não têm
contribuído de forma positiva em melhorar o valor nutritivo das silagens produzidas em condições
brasileiras, especialmente sobre a redução da FDN e aumento da digestibilidade (Reis et al., 2015), o
que está de acordo com dados reportados em países de clima temperado (Van Soest, 1994).
67
90
Controle
80
DIVMO, %
70
60
50
40
30
20
10
0
SLL
1/3 LL
1/2 LL
2/3 LL
CN
Figura 5. Efeito de um inoculante bacteriano-enzimático sobre os coeficientes de digestibilidade in
vitro da matéria orgânica (DIVMO) em silagens de milho produzidas em diferentes
estádios de maturidade (SLL = sem linha de leite (25,9% de MS); 1/3 de linha de leite
(29,5% de MS); 1/2 de linha de leite (31,6% de MS); 2/3 de linha de leite (33,9% de MS);
CN = camada negra (38,4% de MS)).
Fonte: Adaptado de Rabelo et al. (2014).
Mesmo que não haja reduções na fração fibrosa, os inoculantes bacteriano-enzimáticos são
aplicados no intuito de promover benefícios sobre a degradação da FDN em condições ruminais (Kang
et al., 2009). Estudos de degradabilidade in situ têm demonstrado que a hidrólise completa ou parcial
das ligações entre ácido ferúlico e carboidratos da parede celular da forragem deve diretamente
melhorar a digestão ruminal ou aumentar a susceptibilidade da parede celular para digestão ruminal
(Nsereko et al., 2008; Kang et al., 2009). Todavia, dados sumarizados de estudos conduzidos nos
Estados Unidos e Canadá mostram que o efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre a
degradabilidade da MS e FDN é muito pequeno (<2,5%) em silagens de milho, enquanto observa-se
um negativo efeito em silagens de alfafa pré-secada (Figura 6). O ligeiro aumento na degradabilidade
da MS e da FDN em silagem de milho pode indicar que carboidratos presentes na parede celular das
silagens tratadas são mais facilmente digestíveis devido à ação da enzima ferulato-esterase (Lynch et
al., 2015). Porém, de maneira geral, os efeitos observados sobre a digestibilidade de silagens tratadas
com inoculantes bacteriano-enzimáticos são inconsistentes e controversos (Chen et al., 1994; Sheperd
e Kung, 1996; Kung et al., 2000). Adicionalmente, silagens de milho apresentam maior digestibilidade
da fibra em condições in vitro quando tratadas imediatamente antes do ensaio de digestão somente
com enzimas fibrolíticas (Colombatto et al., 2004; Phakachoed et al., 2013).
68
Controle
80
70
60
%
50
40
30
20
10
0
24 h
48 h
24 h
DMS
48 h
DFDN
Milho
24 h
48 h
DMS
24 h
48 h
DFDN
Alfafa pré-secada
Figura 6. Efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre a degradabilidade da matéria seca
(DMS) e fibra em detergente neutro (DFDN) de silagens de milho e alfafa pré-secada após
24 e 48 horas de incubação in vitro.
Fonte: Adaptado de Kang et al. (2009) e Lynch (2014a,b, 2015).
4.2 Efeito no desempenho animal
Nos trabalhos onde inoculantes bacteriano-enzimáticos melhoram o valor nutritivo das silagens
tratadas é compreensível que algumas expectativas em maximizar o desempenho animal sejam
geradas. Como se sabe, o consumo de MS é direta e negativamente correlacionado com a
concentração de fibra no alimento (Allen, 1997). Portanto, qualquer ação que diminua a concentração
de fibra e/ou maximize a digestibilidade da fração fibrosa no rúmen deve implicar no aumento do
consumo e, consequentemente no ganho de peso dos animais (Van Soest, 1994). Todavia, como
descrito anteriormente, na maioria dos casos os inoculantes bacteriano-enzimáticos não tem
promovido melhorias significativas no valor nutritivo das silagens. Como resultado, dados
sumarizados de estudos conduzidos em países de clima temperado e tropical indicam desempenhos
similares entre os animais que consomem silagens tratadas e não tratadas (Figura 7 e Tabela 2).
10
Consumo de matéria seca
Ganho de peso
kg/dia
8
6
4
2
0
Controle
Inoculante
Figura 7. Efeito de inoculantes contendo BAL produtoras de ferulato esterase sobre o desempenho de
bovinos de corte alimentados com silagem de cevada e terminados em confinamento.
Fonte: Adaptado de Addah et al. (2012, 2014, 2015).
69
Isto sugere que em muitos casos não há ação do complexo enzimático contido nos inoculantes
durante o processo fermentativo, nem mesmo dentro do rúmen, onde o mesmo poderia maximizar a
digestão da fibra e outros componentes. Como não há atuação das enzimas, provavelmente o potencial
de ação das BAL presentes no inoculante também não é alterado, embora estas possam interferir
marcadamente sobre o desempenho animal (Basso et al., 2014) por melhorar a qualidade da silagem
e/ou fornecer massa microbiana diretamente no rúmen, agindo como um probiótico (Weinberg et al.,
2007).
Os dados obtidos em condições brasileiras indicam que o consumo de MS (kg/dia) diminuiu
ligeiramente quando bovinos e ovinos foram alimentados com silagens de capim e milho tratadas com
inoculantes bacteriano-enzimáticos (Tabela 2). Além disso, bovinos consumindo silagem de milho
tratada apresentaram acentuada redução (14,2%) na digestibilidade da FDN em relação aos animais
alimentados com silagem não tratada. Como resultado, a digestibilidade da MS também foi
ligeiramente prejudicada pelo inoculante. Do mesmo modo, ovinos alimentados com silagem de milho
tratada com o inoculante bacteriano-enzimático apresentaram redução de 9,3% na digestibilidade da
MS. No entanto, estudos envolvendo inoculantes bacteriano-enzimáticos e seus efeitos sobre o
desempenho animal ainda são incipientes no Brasil (Reis et al., 2015) e, novos estudos são necessários
para atestar o potencial destes aditivos nas mais variadas condições.
Tabela 2. Dados sumarizados sobre consumo e digestibilidade em bovinos e ovinos alimentados com
silagens de capim, milho e sorgo tratadas ou não com inoculantes bacteriano-enzimáticos
em condições brasileiras
Bovinos
Ovinos
Controle
Inoculante
Controle
Inoculante
Consumo de matéria seca, kg/dia
Capim
4.71
4.67
1.10
1.08
Milho
8.67
8.42
1.37
1.11
Sorgo
6.53
6.63
0.51
0.53
Consumo de matéria seca, % do peso vivo
Capim
2.34
2.37
2.16
2.05
Milho
2.19
2.22
2.81
2.39
Sorgo
1.99
2.10
1.64
1.72
Digestibilidade in vivo da matéria seca, %
Capim
65.74
66.35
64.00
63.32
Milho
65.25
64.21
60.40
54.80
Sorgo
60.10
61.07
52.24
54.05
Digestibilidade in vivo da fibra em detergente neutro, %
Capim
62.78
61.39
53.55
50.97
Milho
56.92
48.85
35.17
37.21
Sorgo
50.43
52.30
46.49
48.84
Digestibilidade in vivo da proteína bruta, %
Capim
66.28
66.71
65.04
66.40
Milho
65.33
60.01
60.50
59.20
Sorgo
60.21
60.17
36.21
36.92
Fonte: Adaptado de Bergamaschine et al. (2006), Bumbieris Junior et al. (2009), Fugita et al. (2012),
Henrique e Bose (1992), Jayme et al. (2011), Rocha et al. (2006), Rodrigues et al. (2002), Silva et al.
(2006) e Zanette et al. (2011).
Item
70
5. Implicações
De maneira geral, com base no conjunto de artigos consultados na construção desta revisão
notou-se que a aplicação de enzimas antes da ensilagem na forma exclusiva ou associada à inoculantes
bacterianos não altera positivamente o valor nutritivo da silagem. Além disso, resultados de
degradação da fibra e do alimento como um todo demonstra o baixo impacto das enzimas sobre estas
variáveis, o que explica a falta de resultados positivos no desempenho animal.
A aplicação das enzimas nas dietas no momento do fornecimento aos animais parece gerar
resultados mais promissores. Por outro lado, o volume de estudos no Brasil sobre o efeito de enzimas
exógenas sobre o desempenho animal ainda é incipiente. Portanto, novas pesquisas que contribuam
para o entendimento de mecanismos de ação das várias enzimas utilizadas na nutrição de ruminantes
visando maximizar o desempenho animal devem ser estimuladas.
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Enzimas na Nutrição de Ruminantes Enzymes on Ruminant

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