QUANTA LiteTM dsDNA
Transcrição
QUANTA LiteTM dsDNA
TM NOVA Gel Jo-1 “T” 708495 Para Diagnóstico In Vitro Aplicação Diagnóstica NOVA GelTM Jo-1 é um sistema de teste de difusão dupla para a titulagem e a determinação semiquantitativa de auto-anticorpos para Jo-1, um antigénio nuclear extraível (ENA), em soro humano. A presença de anticorpos para Jo-1 pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de polimiosite e de outras doenças do tecido conjuntivo. Resumo e Explicação do teste O termo "Anticorpos antinucleares" (ANA) descreve uma diversidade de auto-anticorpos que reagem com constituintes do núcleo de células, incluindo DNA, RNA e várias proteínas e ribonucleoproteínas.1 Estes auto-anticorpos ocorrem com elevada frequência em doentes com doenças do tecido conjuntivo ou reumáticas, especialmente SLE. Virtualmente todos os doentes de SLE são ANA positivos. Esta sensibilidade do diagnóstico conduziu à incorporação dos testes de ANA nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação do Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão da Associação de Artrite e Reumatismo.2 Enquanto o teste ANA é um teste de rastreio excelente para SLE (um resultado negativo exclui virtualmente o SLE activo3) não é de modo algum um teste específico. A tendência actual para diagnosticar e gerir doenças do tecido conjuntivo é combinar um teste de rastreio sensível de ANA com testes de seguimento mais específicos tais como dsDNA e/ou ENA. Os testes de ENA são especialmente importantes visto que eles fornecem tanto informações de diagnóstico como de prognóstico. Os anticorpos para o autoantigénio Jo-1 (sintetase histidil-tRNA) são encontrados num subgrupo do doente com doença do tecido conjuntivo com polimiosite pura, dermatomiosite pura ou miosite associada com outra doença reumática.4 Os anticorpos para Jo-1 são encontrados em 18-36% de todos os doentes que satisfazem os critérios para miosite.4-7 O anticorpo é mais comum em polimiosite do que em dermatomiosite e é raramente encontrado noutros estados de doença.5-7 Os anticorpos para Jo-1 estão fortemente associados com a doença do pulmão intersticial8,9 com aproximadamente todos os doentes positivos de Jo-1 mostrando evidência de envolvimento pulmonar. Uma relação de título de anticorpo Jo-1 e a actividade da doença foi relatado10 mas até à data não foi confirmado. Princípio do Procedimento O teste de dupla difusão, descrito por Ouchterlony,11 permite que uma solução de antigénio se difunda passivamente através de uma matriz de suporte de gel em direcção a uma amostra e/ou controlo contendo anticorpo. Os poços, com forma especial, fixados na matriz de gel, funcionam como reservatórios a partir dos quais as soluções de antigénio e de anticorpo difundem em direcção uma da outra. No ponto de equivalência antigénio-anticorpo, forma-se no gel uma linha visível de precipitação. O estado imunológico de um doente pode então ser determinado através da observação de padrões de linhas de precipitação adjacentes formadas no gel por uma amostra controlo, de especificidade conhecida, e por um soro desconhecido de um doente. A técnica de dupla difusão pode ser usada com uma preparação purificada de Jo-1, uma amostra controlo de auto-anticorpos Jo-1 conhecida e um soro de um doente suspeito de conter auto-anticorpos Jo-1, para mostrar identidade imunológica ou não identidade. A confirmação de actividade de auto-anticorpos Jo-1 no soro do doente pode ser feita se a sua linha de precipitação combinar caracteristicamente com a linha formada por uma amostra controlo conhecida. Em certos casos, uma determinação semi-quantitativa da quantidade de auto-anticorpos de Jo-1 num soro do doente é desejada. Nestes casos, a placa NOVA Gel “T” pode ser utilizada para ensaiar uma amostra do doente diluída em série. O recíproco da diluição mais elevada que forma uma linha de precipitação pode então ser relatada como o título do auto-anticorpo de Jo-1 para o doente. O procedimento de teste de dupla difusão correcta requer o ensaio de razões de concentração de antigénios -anticorpos múltiplos de forma a impedir o excesso de antigéniso ou de anticorpos. A formação de linha de precipitação incorrecta ou ilusória pode ocorrer devido ao excesso de antigénio ou de anticorpo. Para impedir isto, as diluições do soro do doente deverão ser ensaiadas em comparação com a mesma preparação de antigénio. Isto é conseguido simultaneamente enquanto faz a titulagem da amostra do doente na placa de NOVA Gel “T”. Reagentes 1. 2. 3. Placas de gel de rastreio Nova Gel “T” com 7 poços cada, contendo estabilizadores e 0,09% de azida de sódio 0,4 ml de antigénio Jo-1 (de timo de vitelo), liofilizado em tampão, contendo estabilizadores e 0,09% de azida de sódio 1,4 ml de controlo Jo-1, soro humano contendo auto-anticorpos para Jo-1 em tampão contendo 0,09% de azida de sódio Advertências 1. Todo o material de origem humana usado na preparação de controlos para este produto foi testado e considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA. No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV 1 2. 3. 4. ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo Jo-1 deverão ser manuseados como material potencialmente infeccioso.12 A Azida de Sódio é usada como um conservante. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a formação de azida. Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos. Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos. Precauções 1. 2. 3. 4. 5. Este produto é para Uso de Diagnóstico In Vitro. A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste sistema pode conduzir a resultados inconsistentes. É recomendado que água estéril destilada ou desionizada seja usada para re-hidratar o antigénio. Uma variedade de factores influencia o desempenho do ensaio. Estes incluem a temperatura de início dos reagentes, prevenir o enchimento excessivo dos poços com reagentes ou amostras dos doentes e a qualidade da água usada para re-hidratar o antigénio. Deverá ser prestada uma atenção cuidadosa à consistência para obter resultados precisos e reprodutíveis. É recomendado um cumprimento rigoroso do protocolo. Condições de Armazenamento Armazene todos os reagentes a 2-8°C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à data de validade quando armazenados e manuseados conforme indicado. Após re-hidratado, o antigénio é estável durante 2 semanas a 2-8°C. Se for desejado, alíquotas de 100 μL de antigénio podem ser preparadas e armazenadas a < -70oC. O antigénio armazenado nesta forma é estável durante pelo menos 1 ano. Colheita de Amostras Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas. Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A2 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8 horas, guarde a amostra a 2-8°C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da amostra , congele a -20°C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas após descongelação e antes do teste. Procedimento Material fornecido 8 2 1 placas de rastreio NOVA Gel "T" 0,4 ml de antigénio Jo-1, liofilizado 1,4 ml de controlo Jo-1 Material Necessário Não Fornecido Micropipetas de 15-100 μL de volume Pontas descartáveis para micropipetas Solução salina 0,85% Água destilada ou desionizada (preferencialmente estéril) Fonte de luz ou caixa de visualização de gel Método Antes de começar 1. Re-hidratar o Antigénio Jo-1 Abra cuidadosamente um frasco de antigénio e adicione 0,4 ml de água destilada ou desionizada para o antigénio liofilizado. A água estéril destilada ou desionizada é recomendada para um desempenho óptimo do produto. Deixe que o antigénio re-hidratado descanse durante 5 minutos, depois agite para misturar completamente antes de usar. 2 2. Encher a Placa de Gel Prepare uma dupla diluição em série da amostra do doente em 0,85% de salina. Carregue os poços da placa de gel com antigénio (aproximadamente 80μL), com controlo (aproximadamente 80μL), e com diluições de amostra do doente (aproximadamente 80μL) conforme mostrado abaixo. As quantidades exactas de enchimento não são críticas; no entanto, NÃO ENCHA EXCESSIVAMENTE OS POÇOS. O controlo pode ser enchido directamente a partir dos frascos de pressão de plástico ou das micropipetas. Se usar os frascos de pressão, coloque uma ponta distribuidora no poço e aperte suavemente até o nível de controlo se aproximar do cimo do poço. Cubra a placa imediatamente após encher. 3. Incubação Deixe que a(s) placa(s) coberta(s) faça(m) incubação à temperatura ambiente numa superfície estável, plana durante 24 horas. Inspeccione a(s) placa(s) e anote quaisquer linhas de precipitação que se formem entre a amostra do doente e o antigénio. Examine a relação desta linha com qualquer linha de precipitação do controlo. Reinspeccione a(s) placa(s) novamente às 48 horas para verificar a existência de quaisquer linhas desenvolvidas recentemente antes da interpretação final dos resultados. Controlo de Qualidade Os Controlo Jo-1 deverão ser corridos em todas as placas para assegurar que todos os reagentes e procedimentos foram efectuados correctamente. Outros soros de controlo adequados adicionais podem ser preparados aliquotando amostras de soro humano combinado e armazenando a < -70oC. De forma a que os resultados do teste sejam considerados válidos, uma linha de precipitação deve estar visível entre os Controlo Jo-1 e os poços de antigénio de Jo-1. Interpretação de Resultados Para uma observação óptima das linhas de precipitação são recomendados os seguintes procedimentos: 1. Remova a tampa da placa. 2. Segure a placa numa posição que minimize o reflexo na superfície do gel. 3. Ilumine a placa do gel lateralmente (i.e. paralela à superfície do gel). Nota: Certifique-se de que a fonte de luz está protegida da vista directa. 4. As linhas de precipitação vêem-se melhor quando existe contraste com um fundo escuro e vistas de um ângulo. 5. Um amplificador pode ajudar na observação de linhas ténues ou para distinguir a não identidade de amostras. Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se não se formarem linhas de precipitação visíveis entre os poços do doente e o poço do antigénio após 48 horas. Interpretação de Especificidade. Na dupla difusão, a especificidade é determinada anotando a relação das linhas de precipitação da amostra com as linhas de controlo conhecidas. Podem ocorrer as seguintes possibilidades com o teste NOVA GelTM Jo-1: Fig. 1: Não Identidade Fig. 2: Identidade Jo-1 A linha de precipitacção do doente atravessa ou apresenta não identidade com ambos os controlo Jo-1. Isto indica que o doente reage com um antigénio ENA diferente do Jo-1. A linha de precipitação do doente combina ou apresenta identidade com a linha de controlo Jo-1. Neste caso o doente tem auto-anticorpos para Jo-1. 3 Limitações do Procedimento 1. 2. 3. 4. Embora não seja provável com este teste devido à geometria única do poço, o prozoneamento é uma possibilidade. O prozoneamento ocorre quando uma enorme quantidade de auto-anticorpos do doente está presente em relação ao antigénio (excesso de anticorpo), fazendo com que a linha de precipitação se forme na face do poço de antigénio. Nestes casos, são recomendados novos testes de possíveis amostras positivas numa diluição de 1:2 ou de 1:4 em solução salina para impedir uma interpretação falsa negativa do teste. Se for usada água não estéril ou contaminada para re-hidratar o antigénio, o antigénio pode sofrer degradação imediata ou progressiva. Neste caso pode resultar uma linha de precipitação muito leve ou nenhuma linha. Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros testes serológicos. As características de desempenho do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes das do soro. Valores Esperados O teste de dupla difusão NOVA GelTM Jo-1 foi usado para avaliar doentes com várias doenças do tecido conjuntivo bem como 200 dadores aleatórios de sangue. Os resultados são os seguintes: Grupo de Doente Polimiosite SLE Dermatomiosite Normais Número 24 105 14 200 Número Positivo Teste NOVA Gel™ ENA Jo-1 Positivo 10 0 1 0 Referências 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. Tan E, et al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964. Biswas T, et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection and quantitation of anti-Jo-1 antibody in human serum. J Immunol Methods 98:243, 1987. Nishikai M, Reichlin M. Heterogeneity of precipitating antibodies in polymyositis and dermatositis: characterization of the Jo-1 antibody system. Arthritis and Rheumatism 23:881, 1980. Arnett F, et al. The Jo-1 antibody system in myositis: relationships to clinical features and HLA. J Rheumatol 8:925, 1981. Reichlin M, et al. Antibodies to a nuclear/nucleolar antigen in patients with polymyositis overlap syndrome. J Clin Immunol 4:40, 1984. Bernstein R, et al. Anti-Jo-1 antibody: a marker for myositis with interstitial lung disease. Br Med J 289:151, 1984. Hochberg M, et al. Antibody to Jo-1 in polymyositis/ dermatomyositis: association with interstitial pulmonary lung disease. J Rheumatol 11:663, 1984. Yoshida S, et al. The precipitating antibody to an acidic nuclear protein antigen, the Jo-1, in connective tissue diseases: a marker for a subset of polymyositis with interstitial pulmonary fibrosis. Arthritis and Rheumatism 26:604, 1983. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, 1958. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). Fabricado por: Technical Service 628495 INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 4 888-545-9495 December 2007 Revision PRT11
Documentos relacionados
QUANTA LiteTM dsDNA
erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964....
Leia mais