Comportamento in vitro e patogenicidade de

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE
Fusarium gutiforme EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA
PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE
OZIMAR DE LIMA COUTINHO
AREIA – PB
2010
ii
OZIMAR DE LIMA COUTINHO
COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE
Fusarium gutiforme EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA
PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE
Tese apresentada à Universidade Federal da
Paraíba, pelo Doutorando Ozimar de Lima
Coutinho, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Agronomia
do Centro de Ciências Agrárias, para a
obtenção do título de Doutor em
Agronomia.
Orientadora: Profª Drª Luciana Cordeiro do Nascimento
AREIA-PB
2010
Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da
Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, Campus II, Areia – PB.
C871c Coutinho, Ozimar de Lima.
Comportamento in vitro de isolados de Fusarium gutiforme em
abacaxizeiro, oriundos dos estados da Paraíba, Pernambuco e Rio
Grande do Norte. / Ozimar de Lima Coutinho. - Areia: UFPB/CCA, 2010.
51f. : il.
Tese (Doutorado em Agronomia) - Centro de Ciências Agrárias. Universidade
Federal da Paraíba, Areia, 2010.
Bibliografia.
Orientadora: Luciana Cordeiro de Nascimento.
1. Fungos – Doenças de plantas 2.Fungos – crescimento
micelial 3. Fungos – esporulação 5. Fungos – patogenicidade 5.
Ananas comosus L. I. Nascimento, Luciana Cordeiro
(Orientadora) II.Título.
iv
À DEUS,
Minha única fonte inesgotável de sabedoria e amor, sempre fiel aos meus anseios,
apesar das minhas negligências.
Aos meus pais,
Odílio Coutinho da Silva e Maria Clese de Lima Coutinho “in memoriam” pela
incansável luta que travaram para me educar, abrindo mão em muitas ocasiões de seus
sonhos para a realização do meu sonho. A vocês, mesmo ausentes da vida terrena,
minha eterna gratidão.
À minha esposa,
Sônia Maria Venâncio Coutinho, companheira fiel em todos os momentos e
incentivadora de minha jornada de estudo.
As minhas filhas,
Rebeca Venâncio Coutinho e Raíssa Clese Venâncio Coutinho, presentes de DEUS e
motivos do meu orgulho.
DEDICO
v
AGRADECIMENTOS
À DEUS, Presença viva em todos os momentos de minha vida. Sempre fiel.
Às PIBs-RR/PB (Primeira Igreja Batista de Roraima/Paraíba) Pelas orações destinadas
ao sucesso deste trabalho e ao meu crescimento espiritual. Minhas casas e refúgios de
orações.
À minha Orientadora, Profª Drª Luciana Cordeiro do Nascimento, pelo papel
fundamental no desenvolvimento do meu trabalho de Tese.
À UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA E AO CENTRO DE CIÊNCIAS
AGRÁRIAS, minha instituição e ambiente de trabalho, por tudo que conquistei
profissionalmente.
AO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DA
PARAÍBA, por me proporcionar e possibilitar cursar o Doutorado em Agronomia com
área de concentração em Agricultura Tropical.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia: Dr. Ademar
Pereira de Oliveira; Dr. Alberício Pereira de Andrade; Dr. Egberto Araújo; Dr.
Ítalo Moreira Aquino; Dr. Jacinto de Luna Batista; Dr. Jacob Silva Souto; Drª
Luciana Cordeiro do Nascimento; Dr. Napoleão Esberard Beltrão; Dr. Ricardo
Elesbão Alves; Dr. Levi Moura Barros; Dr. Francisco Xavier de Souza; Drª
Silvanda de Melo Silva; Drª Rizelane de Alcantara Bruno; Dr. Walter Esfrain
Pereira, pelos ensinamentos, experiências e acima de tudo responsabilidade na
transferência de conhecimentos.
Ao senhor José Pedro Alves da Silva, proprietário do Sítio Jacoca em ItapororocaPB, pela doação de mudas, folhas e frutos de abacaxi utilizadas neste trabalho.
Aos amigos João Belo Soares e Fernando Antonio Tomaz de Oliveira,
proprietários da Fabrica de Bebidas Avaí em Alagoinha-PB, que além da amizade
de muitos anos, forneceram os tubetes para armazenamento dos fungos deste trabalho
de Tese.
Aos funcionários, José Tomáz de Aquino (Tomáz), Cosmo Ribeiro Dantas
(Cosminho), Severino João Numeriano de Souza (Nino), Francisco Soares de Brito
(Chico Flor), Cícera Eliane de Araújo (Eliane), Jacob Soares Dias (Jacozão),
Inaldo Gomes de Oliveira (Naum) e José Ribeiro Dantas Filho (Zezinho), amigos
sem limites para ajudar o próximo.
Aos meus colegas de turma do Doutorado em Agronomia, pelos bons momentos
juntos (Os maus momentos já ficaram no esquecimento).
vi
Aos meus amigos particulares, Leandro Silva do Vale, Luciano Façanha Marques,
Catarina de Medeiros Bandeira, Ivanildo Cavalcante de Albuquerque, Maria
Izabel Costa da Silva, Maria do Socorro Evangelista Coelho, Anne Evelyne Franco
de Souza, Hemmannuella dos Santos Costa, Pedro Aguiar Neto, Antonia Barbosa
de Lima, pela amizade sincera no transcorrer de toda jornada de estudo.
À Pedro Luciano Ferreira da Silva (Mais que cunhado, amigo) e Terezinha de
Lisieux Coutinho Ferreira (Mais que irmã, amiga).
À CAPES/PRODOUTORAL. Pela bolsa de estudo durante o curso de doutorado,
primordial para o bom andamento dos trabalhos.
Agradecimentos especiais. (Anjos existem).
Alexandra Estrela, por tudo que representou nesta jornada de trabalho, mesclando
competência, seriedade, eficiência e acima de tudo amizade sincera.
Pr. José Venâncio Filho e Maria Isaura Venâncio (Sogros), pelos joelhos dobrados
em orações por nossa família.
Aos amigos Eginaldes de Andrade Filho e Amarildo de Paula Coutinho.
À minha cidade Alagoinha. Berço e inicio de tudo que conseguí em minha vida.
À todos, (Amigos para sempre) que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização deste trabalho.
vii
MENSAGEM
Há cinco requisitos indispensáveis para o crescimento do homem:
1- ALIMENTO. O alimento espiritual é a Palavra de DEUS (Bíblia). Você deve
ler, estudar, memorizar, pôr em prática e ouvir o ensino e a pregação da Palavra.
2- RESPIRAÇÃO. A respiração espiritual é a oração. Dedique tempo cada dia
falando com DEUS sobre tudo que você faz; fale sobre suas necessidades e seus
problemas, sobre sua família e seus amigos, e diga-LHE o quanto O ama e quão
agradecido está.
3- EXERCÍCIO. O exercício espiritual é ajudar a outros, testificar, dar tempo e
energia à obra de DEUS e ser um testemunho vivo ao mundo.
4- DESCANSO. O descanso espiritual é a adoração, tanto pública como privada.
Descansar é esperar em DEUS e ter renovação física e espiritual.
5- HUMILDADE. Sejais sempre humilde e manso de coração, porque tão
glorioso quanta a espada, é o arado humilde que rasga a terra.
“DEUS, FONTE INESGOTÁVEL DE SABEDORIA E AMOR”
viii
SUMÁRIO
Resumo Geral................................................................................................................... x
General Abstract............................................................................................................ .xii
Lista de Tabelas............................................................................................................. xiii
Capitulo I - COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE
ISOLADOS DE Fusarium gutiforme, EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS
ESTADOS DA PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE.......... 1
1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................. 2
2. Revisão de Literatura.................................................................................................... 5
2.1 Aspectos Gerais e Importância da Cultura................................................................ 5
2.1.1 O abacaxizeiro (Ananas comosus (L. Merril))........................................................ 5
2.1.2 Fusariose do abacaxizeiro, causada por Fusarium gutiforme ................................. 6
3. Referencias................................................................................................................... 8
Capítulo II- COMPORTAMENTO IN VITRO DE Fusarium gutiforme EM
DIFERENTES CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO..................................................... 14
Resumo........................................................................................................................... 15
Abstract .......................................................................................................................... 16
1. Introdução................................................................................................................... 17
2. Material e Métodos..................................................................................................... 19
2.1. Localização dos experimentos.................................................................................19
2.2. Crescimento micelial de Fusarium gutiforme in vitro............................................. 20
2.3. Esporulação de Fusarium gutiforme in vitro....................................................... 21 3.
Resultados e Discussão................................................................................................... 22
ix
3.1. Crescimento micelial dos isolados de Fusarium gutiforme..................................... 22
3.2. Esporulação dos isolados de Fusarium gutiforme................................................... 25
4. Conclusões.................................................................................................................. 28
5. Referências................................................................................................................. 29
Capítulo III- AVALIAÇÃO DE SINTOMAS CAUSADOS POR Fusarium gutiforme
EM
FOLHAS
“D”
E
RAÍZES
DE
ABACAXIZEIROS
PÉROLA............................33
Resumo........................................................................................................................... 34
Abstract....................................................................................................................... 35 1.
Introdução................................................................................................................... 36 2.
Material e Métodos.................................................................................................. 38 2.1.
Inoculação de F. gutiforme em folhas “D” de abacaxizeiro aderidas a planta mãe..38
2.2. Inoculação de Fusarium gutiforme em folhas “D” destacadas de plantas de
abacaxizeiro cv. Pérola................................................................................................. 39
2.3. Inoculação de Fusarium gutiforme em raízes de mudas de abacaxizeiro ’Pérola’ em
casa
de
vegetação.........................................................................................................................40
3. Resultados e Discussão............................................................................................. 42
4. Conclusões................................................................................................................. 48
5. Referências................................................................................................................ 49
x
COUTINHO, O. L. Comportamento in vitro e patogenicidade de isolados de Fusarium
gutiforme em abacaxizeiro, oriundos dos Estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do
Norte. Areia 2010. 51 f. Tese (Doutorado em Agronomia) Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal da Paraíba.
RESUMO GERAL
O presente trabalho objetivou testar a patogenicidade de Fusarium gutiforme utilizando
diferentes isolados e métodos de inoculação em plantas de abacaxizeiro ‘Pérola’
(Ananas comosus L.). Foram utilizados 20 isolados coletados de plantas de abacaxizeiro
com sintomas típicos da fusariose em áreas produtoras nos estados da Paraíba, Rio
Grande do Norte e Pernambuco. O material foi isolado em meio de cultura batatadextrose-ágar (BDA) e incubado a temperatura de 25±2°C e fotoperíodo de 12 horas
durante sete dias. Para as avaliações in vitro do crescimento micelial e esporulação de
F. gutiforme, os isolados foram plaqueados em meios: BDA, ADA (Aveia-dextroseágar), CDA (Cenoura-dextrose-ágar) e AbDA (Abacaxi-dextrose-ágar) em três regimes
de luminosidade (Claro contínuo, Escuro contínuo, Alternância luminosa). O
crescimento micelial foi avaliado durante sete dias através da medição das colônias em
dois sentidos diametralmente opostos com auxílio de uma régua milimetrada. A
contagem dos esporos foi feita através da adição de 20 mL de água destilada esterilizada
(ADE) na placa contendo o fungo, seguida de raspagem com escova de cerdas macias e
filtragem em dupla camada de gaze estéril. A contagem de esporos foi realizada em
hemacitômetro. O delineamento experimental utilizado foi o DIC com arranjo fatorial
de 4X3, sendo quatro meios de cultura e três regimes de luminosidade, aplicados a 20
tratamentos, com quatro repetições. Os testes de patogenicidade, em plantas de
abacaxizeiro ‘Pérola’ foram realizados em casa de vegetação através de inoculação em
folhas D, aderidas e destacadas da planta mãe e em raízes. Para inoculação em folhas D
aderida a planta mãe, com auxílio de agulha estéril, foi realizada duas perfurações nas
partes medianas e basais aclorofiladas com posterior pincelamento da suspensão de
conídios (107 conídios/mL) dos isolados de F. gutiforme. No método de inoculação pelo
sistema radicular, foram realizados ferimentos com bisturi seguida da imersão das raízes
na suspensão de esporos. Esse procedimento foi realizado após retirada das plantas de
seus respectivos vasos, sendo replantadas após a inoculação. Para controle, utilizaramse plantas não inoculadas. No método de inoculação em folhas D destacadas, as folhas
foram retiradas das plantas, sendo desinfestadas e o procedimento de inoculação
xi
semelhante ao de folhas aderidas à planta mãe. As folhas foram acondicionadas em
bandejas, em condições de câmara úmida, fechadas com filme plástico, mantidas a
temperatura de 25 ± 2 oC
e fotoperiodo de 12 horas. Os dados médios foram
submetidos a análise estatística pelo Programa Computacional SISVAR e adequados a
escala de notas que variou de zero a cinco. Os resultados demonstraram que,
independente do meio de cultura, regime de luminosidade e método de inoculação, os
isolados de F. gutiforme testados demonstraram patogenicidade às plantas de
abacaxizeiro cv. Pérola, podendo ser utilizados em testes experimentais de avaliação de
severidade.
Palavras
chave:
patogenicidade.
Ananas
comosus.
L.,
crescimento
micelial,
esporulação,
xii
COUTINHO, O. L. Behavior in vitro and isolated Pathogenicity of Fusarium gutiforme in
pineapple plants, originating from Paraíba, Pernambuco and Rio Grande do Norte, Brazil.
Areia, 2010. 51 f. Thesis (Doctorate in Agronomy) Centro de Ciências Agrárias, Universidade
Federal da Paraíba.
GENERAL ABSTRACT
The present work had as objective to test Fusarium gutiforme pathogenicity using
different isolates and inoculation methods in pineapple plants cultivar Pérola (Ananas
comosus L.). It was used 20 isolates collected from pineapple plants with disease typical
symptoms from production fields in Paraíba, Rio Grande do Norte and Pernambuco,
Brazil. The material was incubating in PDA medium at 25±2°C and photoperiod of 12
hours during seven days. For in vitro evaluations of mycelia growth and sporulation of
F. guttiforme, isolates were incubated on media PDA, ODA (Oat-dextrose-agar), CDA
(Carrot-dextrose-agar) e AbDA (Pineapple-dextrose-agar) in three light regimes
(continuous light, continuous dark and alternance light). The mycelia growth was
evaluated during seven days by colony growth measured with millimeter rule. The
spores counting was done by addition of 20 mL of sterilized distilled water on Petri dish
with fungus, and rasped with soft brush plus filtrate in double gauze layer. The spores
counting were done with hemacytometer. The experimental design was completely
randomized with factorial arrangement 4x3, with four culture media ant three light
regimes, on 20 treatments with four replications. Pathogenicity tests were realized in
greenroom by inoculation in D leafs, attached and separated to mother plant and in
roots. For inoculation in leafs attached to mother plant was used needle sterilized, and
was done two perfurations on media and basal clorofiled parts with posterior painting of
conidia suspension (107 conidia/mL) of F. gutiforme isolates. In inoculation method on
roots were realized wounds with needle and immersion in conidia suspension. This
procedure was done after remove plants from vases, being replanted after inoculation.
For control treatment it was used non inoculated plants. In inoculation of leafs detached
of mother plant, leafs were disinfested and inoculation method was similar leafs
attached mother plant. Leafs were incubated in trays, in humid chamber conditions,
closed with plastic film, and maintained at 25 ± 2 oC and photoperiod of 12 hours. The
data were analysed by Compute Program SISVAR and measured by severity índex
disease, varying in 0 to 5. The results demonstrated that, independent of culture media,
light regime and inoculation method, all isolates of F. gutiforme showed mycelia
growth, sporulation and pathogenicity on tested conditions in pineapple plants cultivar
Pérola, being recommended for experimental tests for severity evaluations.
xiii
Key words: Ananas comosus L., mycelia growth, sporulation, pathogenicity.
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO II
TABELA 1. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme obtidos de plantas de
abacaxizeiro, cv. Pérola com seus respectivos pontos de coletas....................................19
TABELA 2. Médias referentes a interação Isolados, Meios de culturas, Regimes de
luminosidade para crescimento micelial de Fusarium gutiforme....................................23
TABELA 3. Médias, referentes a interação Isolados, Meios de cultura, Regimes de
luminosidade para esporulação de Fusarium gutiforme..................................................26
CAPÍTULO III
TABELA 01. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme com suas respectivas
localidades e pontos de coletas........................................................................................38
TABELA 02. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculadas em folhas D de
abacaxizeiro cv. Pérola, aderidas a planta mãe...............................................................43
TABELA 03. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculadas em folhas D
destacadas de abacaxizeiro cv. Pérola.............................................................................44
TABELA 04. Patogenicidade de Fusarium. gutiforme inoculadas por imersão via
radicular de mudas de abacaxizeiro cv. Pérola................................................................46
1
COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE
Fusarium gutiforme EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA
PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE
CAPÍTULO 1
2
1. INTRODUÇÃO GERAL
Originário da América Latina, mais precisamente Brasil e Paraguai, o
abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merril) pertencente à família das Bromeliáceas,
destaca-se economicamente por ser o mais importante representante do gênero Ananas.
É classificado botanicamente como uma infrutescência, da classe das monocotiledôneas
(MARIN et al., 2008). Estudos de distribuição do gênero indicam que o seu centro de
origem é a região Amazônica compreendida entre 10ºN e 10ºS de latitude e entre 55ºL e
75ºW de longitude, por se encontrar o maior número de espécies reconhecidas até o
momento. Assim, a região Norte do Brasil pode ser considerada um segundo centro de
diversificação desse gênero (SOUZA, et al., 2002).
No Brasil, a cultura do abacaxizeiro tem desempenhado importante papel
econômico e social como geradora de emprego e renda, além de contribuir para a
manutenção do homem no campo, evitando assim, o êxodo rural para os grandes centros
urbanos (MATOS e REINHARDT, 2007).
Esta frutífera encontra condições ecológicas favoráveis à sua exploração na
maior parte do território nacional, desde a região Norte, Nordeste até a porção
setentrional da região Sul, incluindo áreas de Santa Catarina, Paraná e Rio Grande do
Sul não sujeitas a geadas (LIMA et al, 2001).
A FAO (2005) apontava o Brasil como terceiro maior produtor mundial de
frutas, com uma produção estimada de 43 milhões de toneladas, correspondendo a uma
participação de 7,9% do total produzido no cenário mundial. Cunha et al., (2007)
relataram o Brasil como maior produtor mundial de abacaxi, com 61.790 ha plantados,
uma produção de mais de dois milhões de toneladas de frutos e produtividade de 27.329
kg/ha. O Brasil participa timidamente do comércio internacional, apesar de ser o
terceiro produtor mundial de frutas frescas (EMBRAPA , 2007).
Em 2007 a abacaxicultura paraibana destacava-se no cenário nacional não só por
tratar de um fruto com grandes qualidades nutricionais e organolépticas, mas também
por sua rentabilidade e produtividade. Apresentava uma área plantada de 11.466
hectares com produção de 514.936 toneladas de frutos, sendo o segundo maior produtor
de abacaxi no Brasil, perdendo apenas para o estado do Pará (CUNHA et al., 2007).
Oficialmente o município maior produtor de abacaxizeiro da Paraíba é Santa Rita com
3
mais de três mil hectares de plantio, e uma produção esperada de cerca de 90 milhões de
frutos. (GOVERNO DA PARAÍBA, 2008).
Segundo o IBGE (2008) o Brasil produziu 1.712.365 frutos de abacaxi em 2008.
Deste total, 787.966 foram produzidos no Nordeste, participando o estado da Paraíba
com 45% desta produção, em seguida os estados da Bahia e do Ceará, com 22,3% e
13,2%, respectivamente. O Brasil, com uma produção superior a 1.700.000 toneladas
destacou-se como o maior produtor de abacaxi da América do Sul. A produção está
distribuída principalmente nas regiões Nordeste (40,2%) e Sudeste (28,92%).
A cultivar Pérola é a mais plantada comercialmente no Brasil. Sendo este um
fruto largamente produzido no estado da Paraíba e considerado de alta qualidade pelos
mercados do Sul e Sudeste do Brasil, mostrando-se também, com potencial de
exportação para países da América Latina. Por encontrar excelentes condições para seu
desenvolvimento e produção, vem sendo cultivada em quase todos os estados brasileiros
(MARTINS et al., 2007).
Para a Embrapa/Centro Nacional de Pesquisa de Mandioca e Fruticultura (1991)
na Paraíba o clima é fator favorável a produção de abacaxi de ótima qualidade, devido a
fatores como temperatura (22 a 32ºC) durante todo o ano, insolação (2.500 a 3.000
horas/ano), e umidade relativa do ar, com média anual, acima de 70%, com reduzidas
oscilações.
A colheita do abacaxi paraibano concentra-se ao longo de todo o ano, entretanto
de Janeiro a Junho, a Paraíba colhe apenas 24,66% da sua produção, ficando os 75,34%
restantes de sua colheita para os meses subseqüentes (CARVALHO et al., 2007).
Dentre os principais problemas fitossanitários que acometem a cultura do
abacaxizeiro, a fusariose é a doença que causa maiores prejuízos econômicos aos
produtores, uma vez que as perdas podem atingir até 100% da produção. Os sintomas
mais característicos da doença são alterações morfológicas, bem como exsudação de
goma ou resina, daí a doença ser conhecida, inicialmente, por gomose (PISSARRA et
al., 1979). O agente etiológico é o fungo Fusarium gutiforme Nirenberg & O'Donnell
que apresenta especificidade para o abacaxizeiro (VENTURA et al., 1993a,b;
VENTURA et al., 1994; VENTURA, 1996; LIMA et al, 2001; MATOS e
REINHARDT, 2007; OLIVEIRA e NASCIMENTO, 2009).
A fusariose foi relatada pela primeira vez por Kimati e Tokeshi (1964) no estado
de São Paulo em frutos da cultivar ‘Smooth Cayenne’, disseminando-se por todo o país
e em alguns países da América Latina. No Brasil, as duas cultivares mais plantadas,
4
Pérola e Smooth Cayenne são suscetíveis à doença, constituindo-se de uma base
genética bastante estreita, dificultando os programas de melhoramento (SANTOS,
2000). Para efetivo controle deve-se eliminar os restos culturais da safra anterior
(incorporação no solo ou queima); utilizar mudas sadias; durante o cultivo, identificar
plantas doentes, eliminá-las e pulverizar as inflorescências desde o seu aparecimento no
olho da planta até o fechamento das últimas flores com fungicida à base de
benzimidazol (VENTURA e COSTA, 2006).
Na fusariose, a identificação e determinação das respostas de defesa contra o F.
gutiforme, é uma prática comum para entender a relação existente entre planta e o
patógeno, viabilizando o estabelecimento de estratégias de controle, prevenindo assim
perdas econômicas posteriores (ZORZAL, 2008).
As mudas são infectadas, geralmente na fase inicial de desenvolvimento, quando
ainda estão aderidas à planta-mãe que apresenta frutos doentes. É pouco perceptível nos
estádios iniciais da doença, porém, como o fungo sobrevive em mudas e plantas, o
conhecimento dos sintomas nas mesmas possibilita a eliminação de importantes fontes
de inóculo (VENTURA e ZAMBOLIM, 2002; VENTURA e COSTA, 2006).
Face ao exposto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o comportamento in
vitro e a patogenicidade de 20 isolados de F. gutiforme em abacaxizeiro cv. Pérola,
obtidos de materiais coletados em municípios dos estados da Paraíba, Pernambuco e Rio
Grande do Norte.
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Aspectos gerais e importância da cultura
2.1.1. O abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merril)
O gênero Ananas é amplamente distribuído em regiões tropicais principalmente
a espécie Ananas comosus (L.) Merril, que abrange todas as cultivares plantadas de
abacaxizeiro, constituindo-se em uma das fruteiras tropicais mais cultivadas no país. É
uma planta terrestre, perene, monocotiledônea onde o processo de florescimento é
desuniforme, comprometendo a regularidade da produção e podendo resultar em frutos
não enquadrados no padrão comercial (VAILLANT et al., 2001).
O abacaxizeiro é uma planta que apresenta folhas dispostas em espiral em torno
de uma haste central, internamente apresentam a forma de calha, que propiciam a
condução de água para a base, com ângulos que definem o tipo da folha, como por
exemplo, 45 graus, que determina as folhas “D”. As folhas são revestidas por uma
camada de cutícula e tricomas, os estômatos encontram-se na parte inferior, esses tem a
função de absolver água e nutrientes, refletir luz e proteger as folhas contra a
desidratação causada pelas altas temperaturas. Na disposição foliar do abacaxizeiro
destaca-se a folha D, por ser a principal folha desta planta, com disposição em um
ângulo de 45º do eixo central da planta (PY et al., 1984).
O caule é matéria prima para a indústria de alimentos e para a obtenção de álcool
etílico e gomas, além de propagarem vegetativamente mudas. O restante do
abacaxizeiro pode ser usado na alimentação animal, como material fresco ou ensilado.
(MEDINA et al., 1987). Sua haste quando de uma planta adulta pesa de 400 a 500
gramas. O caule armazena os produtos elaborados pelas folhas, que podem ser utilizadas
a qualquer tempo, esta é dividida em internódios, com gemas localizadas nas cicatrizes
deixadas pelas folhas no seu ponto de inserção. Das gemas nascem os rebentos que
garantem a perpetuação da espécie. As raízes são profundas, porém de pequena
dimensão e pouco resistentes, encontrando-se a maioria na faixa de 15cm de
profundidade (SIMÃO, 1998).
O fruto é normalmente cilíndrico ou ligeiramente cônico, constituído por 100 a
200 pequenas bagas ou frutilhos fundidos entre si sobre o eixo central ou coração que é
6
a continuação do pedúnculo fibroso (VILAR, 2000). A polpa do fruto apresenta as cores
branca, amarela ou laranja-avermelhada, sendo o peso médio dos frutos de um quilo,
dos quais 25% são representados pela coroa. Este é consumido ao natural, ou na forma
de sorvetes, doces, picolés, refrescos e sucos caseiros (GRANADA et al., 2004).
As variedades de abacaxi mais conhecidas foram classificadas em cinco grupos
distintos: Cayenne, Spanish, Queen, Pérola e Perolera, de acordo com um conjunto de
caracteres comuns, relativos ao porte da planta, forma do fruto e características
morfológicas das folhas (EPSTEIN, 1999). Estima-se que cerca de 70% da produção
mundial de abacaxi provém de Smooth Cayenne. No Brasil e em outros países da
América Latina, ocorrem diversas variedades locais e populações silvestres de abacaxi
pertencentes ao gênero Ananas e alguns desses materiais podem ser recomendados
diretamente como variedades ou utilizados em programas de melhoramento genético,
uma vez caracterizados e avaliados adequadamente (CABRAL et al., 2008).
.
2.1.2. Fusariose do Abacaxizeiro, causada por Fusarium gutiforme
O abacaxizeiro tem sido infectado por vários patógenos que apresentam
influência negativa na produtividade e na qualidade dos frutos (SOUZA et al., 2002). A
fusariose é o principal problema da cultura, infectando mudas, durante o crescimento,
período de florescência, e até mesmo, durante o ciclo produtivo. As perdas são
estimadas em 30 a 40% nos frutos e em até 20% nas mudas (CUNHA, 2007), podendo
atingir até 100% da produção (VENTURA e ZAMBOLIM, 2002; VENTURA et al.,
2007).
O gênero Fusarium é bem heterogêneo, e apresenta uma ampla distribuição
geográfica incluindo, assim, muitas espécies identificadas pelas características
morfológicas. F. gutiforme, antes denominado de F. moniliforme Sheldon var.
subglutinans, foi estabelecido como uma espécie independente por apresentar
características morfológicas estáveis e suficientes para tanto (MORAIS et al., 2003).
Em meio batata-dextrose-ágar, F. gutiforme apresenta inicialmente um micélio
branco, que passa a róseo alaranjado, alcançando, algumas vezes, a coloração violeta.
Dois tipos de esporos são produzidos: os microconídios e os macroconídios, entretanto
as características principais deste patógeno são a produção de microconídios em
polifiálides, sempre em falsas cabeças e ausência de clamidósporos (MELLO, 2001).
7
O patógeno incita lesões nos tecidos afetados, com exsudação de uma substância
gomosa (FISHER et al., 2006). Alves (2006) esclarece que F. gutiforme por não
produzir clamidósporos, apresenta baixa capacidade competitiva, não sobrevivendo no
solo por longos períodos. Mudas infectadas e enterradas perdem a capacidade de servir
como fonte de inóculo, após quatro a seis semanas, contudo, o patógeno pode
sobreviver, como epífita, em folhas de plantas invasoras. Para Weber et al, (2003) as
mudas constituem a principal fonte de disseminação dessa doença.
Segundo Geiser et al., (2004) inúmeros fatores, incluindo a perda da distinção das
espécies através de características morfológicas, levam a conceitos que são amplos e
justamente com a variação e mutação dentro da cultura, tem conspirado para criar um
sistema taxonômico que não reflete a diversidade das espécies. Isto tem gerado resultados
contraditórios na aplicação de nomes de espécies para isolados patogênicos e toxogênicos.
Devido a plasticidade e variações de características fenotípicas encontradas nestes fungos,
a taxonomia baseada somente em conceitos morfológicos não é confiável (SUMMERELL
e LESLIE, 2003).
Oliveira e Costa, (2004) destacam que o gênero ainda apresenta uma série de
variações de características morfológicas e patogênicas, resultando em uma classificação
complexa dividida em seções, forma specialis e raças. O conceito forma specialis (f. sp.),
foi aplicado por Snyder e Hansen, (1953) para reconhecer isolados patogênicos que foram
morfologicamente semelhantes à isolados saprofíticos da mesma espécie, mas que
diferenciam em sua habilidade para parasitar hospedeiros específicos.
8
3. REFERÊNCIAS
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2008, resumos... Vitória, ES, 2008.
14
COMPORTAMENTO IN VITRO
CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO
CAPÍTULO 2
DE
F.
gutiforme
EM
DIFERENTES
15
COUTINHO, O. L. Comportamento in vitro de Fusarium gutiforme em diferentes
condições de incubação. 2 º capítulo, Areia 2010. 51 f. Tese (Doutorado em
Agronomia) Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba.
COMPORTAMENTO IN VITRO DE Fusarium gutiforme EM DIFERENTES
CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO
RESUMO
Para a abacaxicultura, algumas doenças fúngicas podem causar prejuízos de quase
100% da produção e a fusariose causada por Fusarium gutiforme destaca-se por sua
agressividade e susceptibilidade nas variedades comerciais. Este trabalho objetivou
avaliar in vitro o comportamento de 20 isolados de F. gutiforme mediante avaliação do
crescimento micelial e esporulação em placas de Petri, usando quatro diferentes meios
de cultura: BDA (Batata-Dextrose-Ágar), CDA (Cenoura-dextrose-ágar), AbDA
(Abacaxi-dextrose-ágar)
e ADA
(Aveia-dextrose-ágar),
sob
três
regimes
de
luminosidade (Claro contínuo, Escuro contínuo e Alternância luminosa). Em meio
BDA, foi realizado o isolamento do fungo a partir de partes de plantas de abacaxizeiro
com sintomatologia típica da fusariose. As placas foram mantidas durante sete dias a
25±2°C e luminosidade natural. A avaliação do crescimento micelial foi realizada com
régua milimetrada em dois sentidos diametralmente opostos. O delineamento
experimental utilizado foi o DIC com arranjo fatorial de 4X3, sendo quatro meios de
cultura e três regimes de luminosidade, aplicados a 20 tratamentos, composto pelos
isolados, com quatro repetições. Para avaliação de esporulação, após o sétimo dia de
crescimento, as colônias fúngicas foram removidas com escova de cerdas macias, após
o acréscimo de 20mL de ADE e filtradas em dupla camada de gaze esterilizada
obtendo-se uma suspensão de conídios mensurada em hemacitômetro para 107
conídios/mL. Dos 20 isolados testados, pode-se afirmar que ocorreram diferenças
significativas, em relação ao crescimento micelial, bem como, quanto à esporulação de
F. gutiforme. Os isolados 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18 e 1SO20
apresentaram maior crescimento micelial na interação regime de luz e meio. Os 1SO12,
1SO14 e 1SO19 apresentaram menores crescimentos para a referida interação. Os
isolados 1SO07 e 1SO15 obtiveram maior esporulação na interação regime de luz e
meio, enquanto 1SO19 e 1SO20 apresentaram menores crescimentos para a referida
interação.
Palavras chave: Fusariose, crescimento micelial, esporulação
16
COUTINHO, O. L. In vitro Behavior of Fusarium gutiforme in different incubation
conditions. Second chapter, Areia 2010. 51 f. Thesis (Doctorate in Agronomy) Centro
de Ciências Agrárias. Universidade Federal da Paraíba.
IN VITRO BEHAVIOR OF Fusarium. gutiforme UNDER DIFFERENT
INCUBATION CONDITIONS
ABSTRACT
Some fungal diseases can cause near 100% loss on pineapple crop. Fusarium wilt
caused by Fusarium gutiforme stands out for its aggressiveness and the susceptibility to
this pathogen among commercial varieties. This study aimed to evaluate the in vitro
behavior of 20 F. gutiforme isolates by measuring mycelial growth and sporulation in
four different culture media: PDA (Potato Dextrose Agar), CDA (carrot-dextrose agar),
ABDA (Pineapple-dextrose agar ), and ADA (Oats dextrose agar), under three light
conditions (continuous light, continuous dark, and alternating light), using Petri dishes.
Fungal isolation was carried out on PDA from pineapple plant parts with symptoms
typical of the disease. The plates were kept for seven days at 25 ± 2 ° C under natural
light. Evaluation of mycelial growth was performed with a ruler on two diametrically
opposite directions. The experimental design was a completely randomized with
factorial arrangement of 4X3, with four media and three light regimes, applied to 20
treatments, which consisted of fungal isolates and four replications. Fungal sporulation
was accessed after the seventh day by removing the colonies with a soft brush. Twenty
milliliters of ADE was added to the preparation and filtered through a double layer of
sterile gauze. The obtained conidia suspension was adjusted to a concentration of 107
conidia/mL using a hemacytometer. Evaluation of the 20 isolates showed that there were
significant differences in relation to mycelial growth, as well as on the sporulation of F.
gutiforme. The isolates 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18, and 1SO20
exhibited higher mycelial growth associated to the interaction between light and
medium. Isolates 1SO12, 1SO14, and 1SO19 exhibited lower mycelial growth for the
same interaction. Isolates 1SO07 and 1SO15 exhibited higher sporulation under the
interaction light and medium, while isolates 1SO19 and 1SO20 showed lower rates for
the same interaction.
Key words: Fusariosis, mycelia growth, sporulation
17
1. INTRODUÇÃO
O fungo causador da fusariose ou gomose do abacaxizeiro, Fusarium gutiforme,
é a principal limitação fitossanitária na produção de abacaxi no Brasil, pois causa
perdas, antes da fase de frutificação, além de ser constatada em todos os Estados
produtores de abacaxi do Brasil (RUGGIERO et al., 1994).
A doença, relatada pela primeira vez por Kimati e Tokeshi (1964) no estado de
São Paulo, em frutos da cultivar Smooth Cayenne, encontra-se disseminada por todo o
país e em alguns países da América Latina (PISSARRA et al., 1979). Este fungo
pertence à família Tuberculariaceae, capaz de sobreviver por longos períodos de tempo
no solo, em restos culturais e se disseminar através de propágulos (macro e
microconídios), de vetores físicos (vento e água de irrigação) e de vetores biológicos
(homem, insetos e mudas contaminadas) (BERGAMIN FILHO et al., 1995).
Essa doença causa prejuízos devido à infecção das mudas, morte do abacaxizeiro
no campo, infecção das inflorescências e frutos, que perdem seu valor comercial,
resultando perdas elevadas na produção. O principal sintoma da fusariose em plantas ou
em mudas é a exsudação de goma a partir da região infectada, cuja lesão se localiza no
caule, progredindo para a base da folha, ficando restrita à região aclorofilada da mesma
(LIMA et al., 2001; SANTOS et al., 2002; FISHER et al., 2006).
É importante enfatizar a importância de se verificar diferentes isolados e
determinar suas diferenças de comportamento quando cultivados in vitro, visto que a
atividade destes pode mostrar-se diferenciada devido à localização e influência
ambiental, as quais as plantas coletadas estão submetidas, além de outros fatores como
variação genética, utilização de diferentes métodos de inoculação e meios utilizados, pH
e a temperatura, obviamente, o uso de diferentes concentrações pode interferir na
variação de resultados obtidos em diferentes experimentos (RANGANATHAN e
BALAJEE, 2000).
O aumento ou diminuição no crescimento micelial in vitro de determinados
fungos fitopatogênicos pode ser resultado de mecanismos diretos ou indiretos da ação
destes, tais como produção e liberação de metabólitos secundários, agindo na
disponibilidade e absorção ou na supressão de nutrientes (GOES e KIMATI, 1990;
RUGIERO et al., 1994; JAGADEESH et al., 2006; EGAMBERDIEVA et al., 2008).
Dessa forma, o objetivo geral do presente trabalho foi avaliar o comportamento
in vitro para crescimento micelial e esporulação em diferentes condições de incubação,
18
de 20 isolados de F. gutiforme obtidos de abacaxizeiro, coletados em municípios dos
estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte.
19
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Localização dos experimentos
Os isolados de F. gutiforme foram obtidos de materiais coletados em diferentes
campos de produção comercial nos Estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do
Norte (Tabela 01) a partir de plantas de abacaxizeiro com sintomas típicos da fusariose,
caracterizados pela presença de áreas necrosadas e de resina em folhas, mudas e frutos.
TABELA 01. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme obtidos de plantas de
abacaxizeiro, cv. Pérola, com seus respectivos pontos de coleta
ISOLADOS
1SO01
1SO02
1SO03
1SO04
1SO05
ISO06
1SO07
1SO08
1SO09
1SO10
1SO11
1SO12
1SO13
1SO14
1SO15
1SO16
1SO17
1SO18
1SO19
1SO20
LOCAL
Guarabira-PB I
Guarabira-PB II
Itapororoca-PB I
Itapororoca-PB II
Rio Tinto-PB I
Rio Tinto-PB II
Pedras Fogo-PB I
Pedras Fogo-PB II
Araçagí-PB
Conde-PB
Alhandra-PB
Espirito Santo-PB
Santa Rita-PB
Mamanguape-PB
Juripiranga-PB
Itambé-PE
Pombos-PE
Touros-RN
Sapé-PB
Marí-PB
PONTO DE COLETA
Sitio Canafistula
Sitio São Gonçalo
Sitio Jacoca
Sitio Refúgio
Sitio Camparte
Sitio Cacimbão
Sitio Açude Novo
Sitio Taquari
Faz. Redenção
Sitio Boa Água
Sitio Oh! Glória
Sitio Jurema
Faz. Zé Queiroga
Sitio Pitombeira
Sitio Salgado
Faz. Maringá
Sitio Pombos
Faz. Potiguara
Sitio Meu Destino
Faz. Unção
O material coletado foi encaminhado ao Laboratório de Fitopatologia, do Centro
de Ciências Agrárias, da Universidade Federal da Paraíba, Campus II, Areia-PB. Para
realizar procedimentos de pré-lavagem e desinfestação, obedecendo aos padrões de
assepsia.
A identificação do fungo realizou-se com auxilio de microscópio óptico e
estereoscópico, através das observações de estruturas macro e micromorfológicas como
micélio, conídios e esporos, confrontando-as com as descrições da literatura micológica
20
e fitopatológica especializada (BISBY et al., 2006; LESLIE et al., 2006; LIMA et al.,
2001).
2.2. Crescimento micelial de Fusarium gutiforme in vitro
Em câmara de fluxo laminar, a partir de placas puras dos 20 isolados de
F.gutiforme, foram retirados individualmente, discos com 5mm de diâmetro, para
inoculação nos meios BDA (batata-dextrose-ágar); CDA (cenoura-dextrose-ágar),
AbDA (folhas de abacaxi-dextrose-ágar), ADA (aveia-dextrose-ágar). Cada meio foi
composto por 200g de cada espécie vegetal, 17g de ágar, 20g de dextrose e o volume
completado para 1000 mL de água destilada esterilizada (ADE), com pH ajustado para
6,2 vertidos para placas de Petri, com diâmetro de 9cm, e incubados em três diferentes
regimes de luminosidade: Claro contínuo, Escuro contínuo e Alternância luminosa.
As placas contendo os discos permaneceram por oito dias em sala de incubação
a 25±2°C e fotoperíodo de 12 horas, para avaliação do crescimento micelial. A
avaliação foi realizada no oitavo dia, mediante o uso de uma régua milimetrada, com
mensurações diametralmente opostas, sendo aferida a média, para determinação do
crescimento.
O delineamento estatístico utilizado foi DIC (Delineamento Inteiramente
Casualisado) com 20 tratamentos e quatro repetições (placas contendo o fungo) em
arranjo fatorial 20 X 4 X 3 (vinte isolados, quatro meios de cultura BDA, CDA, AbDA,
ADA e três regimes de luminosidade: Luz continua, Escuro continuo, Alternância
luminosa) totalizando 240 tratamentos.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade (FERREIRA, 2000;
SISVAR 5.1 2007).
2.3. Esporulação de Fusarium gutiforme in vitro
Para a quantificação do número de esporos produzidos pelos 20 isolados de F.
gutiforme, foram utilizadas colônias puras do fungo em quatro diferentes meios de
culturas e três regimes de luminosidade, à 25+ 2ºC.
Aos oito dias da incubação foi avaliada a produção de conídios. A suspensão foi
obtida pela adição de 20 mL de ADE às placas de petri e raspagem da colônia com
21
escova de cerdas macias. A filtragem da suspensão deu-se por intermédio de uma
camada dupla de gaze estéril, sendo determinada a quantidade de esporos em
hemacitômetro, executando-se uma média de cinco leituras para cada repetição dos
tratamentos.
O delineamento experimental utilizado foi o DIC em arranjo fatorial de 20 X 4
X 3, com 20 isolados, quatro meios de culturas e três regimes de luminosidade, com 4
repetições para cada isolado do patógeno, totalizando 240 tratamentos.
As médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade
(FERREIRA, 2000; SISVAR 5.1 2007).
22
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Crescimento micelial dos isolados
Diante dos resultados obtidos neste trabalho e expressados na Tabela 02 pode-se
afirmar que ocorreram variações significativas quanto a interação Isolados, Meios de
cultura e Regimes de luminosidade para crescimento micelial de Fusarium gutiforme.
Os isolados 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18 e 1SO20 obtiveram
maior crescimento micelial na interação regime de luz e meio; Os 1SO12, 1SO14 e
1SO19 apresentaram menores crescimentos para a referida interação (Tabela 02).
Observou-se o crescimento micelial semelhante nos meios de cultura de acordo
com o regime de luz, sendo o regime claro contínuo e alternado no meio BDA que
favoreceu maior diferenciação nos isolados. No meio CDA, maior variação ocorreu no
regime de luz alternada, assim como no meio AbDA nos regimes de luz claro e
alternado. Para meio ADA, a exceção do 1SO019, não houve diferença de crescimento
micelial no regime de luz alternada (Tabela 02).
No regime de luz claro contínuo não ocorreu interferência dos meios no
crescimento dos isolados (1SO05, ISO6, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18 e
1SO20). Para escuro contínuo não observou-se interferência dos meios nos isolados
ISO02, 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO10, 1SO15, 1SO16, 1SO17, 1SO18, 1SO19 e
1SO20 e sob regime de luz alternada nos isolados 1SO01, 1SO05, ISO6, 1SO07,
1SO08, 1SO11, 1SO15, 1SO16, 1SO17, 1SO18 e 1SO20 (Tabela 02).
23
Tabela 02. Médias referentes a regimes de luz/isolados/meios de culturas para o oitavo dia de crescimento micelial de Fusarium gutiforme in
vitro
Luz
Iso\Meio*
ISO01
ISO02
ISO03
ISO04
ISO05
ISO06
ISO07
ISO08
ISO09
ISO10
ISO11
ISO12
ISO13
ISO14
ISO15
ISO16
ISO17
ISO18
ISO19
ISO20
BDA
8,05Bbα
7,98Bbα
5,43Dcβ
8,18Bbβ
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
5,08Dcγ
8,28Bbβ
8,98Aaα
3,98Ecβ
7,80Bbα
6,20Ccα
9,00Aaα
9,00Aaα
7,73Bbβ
9,00Aaα
4,33Ebα
9,00Aaα
Claro
CDA
8,45Baα
9,00Aaα
7,29Cbβ
9,00Aaα
8,95Aaα
8,18Bbα
9,00Aaα
9,00Aaα
7,63Cbβ
8,88Aaα
9,00Aaα
6,60Dbα
9,00Aaα
8,20Bbα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
5,40Daα
8,88Aaα
Escuro
AbDA
ADA
BDA
CDA
6,83Bcγ 8,63Aaα 8,14Bbα 8,88Aaα
5,68Ccγ 8,53Aaα 8,34Bbα 9,00Aaα
8,89Aaα 3,89Edβ 7,29Cbα 8,95Aaα
9,00Aaα 6,83Bcβ 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 7,95Bbβ 8,35Bbα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 4,98Ccβ 8,08Bbβ 8,95Aaα
9,00Aaα 8,90Aaα 8,95Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 6,68Bbβ 9,00Aaα 9,00Aaα
8,60Aaα 3,00Fdγ 4,85Fbα 6,98Caα
9,00Aaα 6,45Bcβ 5,68Ebβ 8,13Baβ
5,23Cdβ 8,80Aaα 6,65Dbα 7,13Cbγ
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
5,68Caα 4,38Dbβ 4,53Fbα 5,15Daα
8,95Aaα 9,00Aaα 8,75Aaα 8,75Aaα
AbDA
ADA
BDA
8,05Bbβ 9,00Aaα 8,13Bbα
7,85Bcα 8,60Baα 8,48Bbα
6,53Dcγ 3,85Ddβ 4,28Dcγ
7,25Cbβ 8,88Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
8,65Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
8,78Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
5,90Ecγ 9,00Aaα 9,00Aaα
8,70Aaα 9,00Aaα 8,30Bbβ
8,13Bbβ 9,00Aaα 9,00Aaα
4,10Gcβ 4,00Dcβ 4,40Dcβ
5,15Fcβ 4,08Ddγ 3,68Ebγ
5,93Ecα 8,23Baβ 6,68Ccα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα
4,03Gcα 4,95Caα 4,38Dbα
8,98Aaα 8,98Aaα 9,00Aaα
Alternada
CDA
8,36Bbα
8,41Bbβ
4,69Ecγ
7,25Cbβ
9,00Aaα
8,65Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
8,85Aaα
9,00Aaα
4,40Ecβ
8,88Aaα
7,65Cbβ
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
5,45Daα
8,90Aaα
AbDA
8,95Aaα
7,03Dcβ
8,01Bbβ
8,55Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aa α
8,90Aaα
8,20Bbβ
9,00Aa α
9,00Aaα
7,60Cbβ
9,00Aaα
5,95Edα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
4,80Fbβ
8,58Aaα
CV (%) = 4,2
Médias seguidas de mesma letra minúsculas na coluna em cada isolado, assim como seguidas de mesma letra maiúscula na linha em cada meio de cultura e gregas em cada regime de luz na linha não
diferem a 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott. *BDA= batata-dextrose-ágar; ADA= aveia-dextrose-ágar; CDA= cenoura-dextrose-ágar; AbDA= abacaxi-dextrose-ágar.
ADA
8,95Aaα
8,93Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
8,95Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
8,93Aaα
9,00Aaα
8,91Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
9,00Aaα
5,26Baα
9,00Aaα
24
Silva et al., (2009) avaliando crescimento micelial e esporulação de Myrothecium
roridum testados em dez meios de cultura: BTDA (beterraba-dextrose-ágar); RDA
(rama de melão-dextrose-ágar); PA10 (polpa de melão com °Brix=10 ágar); ETDA
(extrato de tomate-dextrose-ágar); CMDA (casca de melão-dextrose-ágar); CA
(cenoura-ágar); PA04 (polpa de melão com °Brix= 04 ágar); IDA (inhame-dextroseágar); FMDA (folha de melão-dextrose-ágar); e BDA (batata-dextrose-ágar) como
testemunha, não observou diferenças significativas em nenhum dos meios testados
quanto ao crescimento micelial, diferentemente dos resultados obtidos no presente
trabalho onde os meios de culturas e regimes de luminosidade exerceram influência
entre os isolados quanto a crescimento micelial e esporulação.
Costa et al., (2009) estudando o crescimento micelial de F. gutiforme em
diferentes temperaturas e fotoperiodo de 12 horas, constatou que à medida em que se
aumentava a temperatura, diminuía o índice médio de crescimento deste fungo, sendo a
temperatura de 25°C a ideal para seu desenvolvimento, a mesma temperatura estudada
no presente trabalho.
Paludo et al., (2009) constataram que Cercospora beticola e Mycosphaerella
fragariae sob claro contínuo e escuro, em meio de cultura BDA, o crescimento micelial
não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos. Os resultados do presente
trabalho mostraram-se diferentes uma vez que ocorreu formação de crescimento
micelial semelhante nos meios de cultura de acordo com o regime de luz, sendo o
regime claro contínuo e alternado no meio BDA que favoreceu maior diferenciação nos
isolados.
Moraes et al., (2003) verificando o efeito da luz sobre o crescimento micelial de
F. moniliforme em meio de cultura contendo fungicidas, pode constatar que dos regimes
de luminosidade avaliados: escuro contínuo, luz branca e luz próxima da ultra violeta
(12h de luz/12 de escuro), o crescimento do fungo ficou em torno de 63% mostrando
uma média eficiência deste fungo em relação aos regimes de luminosidade, quando
trabalhado em regime de luz branca.
Todos os substratos utilizados neste trabalho favoreceram o crescimento micelial
de F. gutiforme constatando-se variações de coloração nas colônias (variando do
branco, alaranjado, violeta e marrom) de acordo com o meio de cultura e regime de
luminosidade.
25
Uma cultura de Fusarium pode mudar sua morfologia gradualmente ou ainda
produzir repentinamente setores de crescimento radicalmente na aparência do parental.
Essa variabilidade morfológica tem gerado controvérsias na taxonomia e classificação
das espécies de Fusarium. (PUHALLA, 1981; OLIVEIRA e COSTA, 2002; GEISER,
et al., 2004)
Segundo Sanabria, et al., (2002); Geiser et al., (2004); Leslie, et al., (2006),
inúmeros fatores incluindo a perda da clara distinção das espécies através de
características morfológicas, levando a conceitos que são amplos e juntamente com a
variação e mutação dentro de uma cultura não reflete a diversidade das espécies.
Muitos isolados de Fusarium estudados por taxonomistas e fitopatologistas foram
identificados incorretamente usando simplificados sistemas morfológicos. Espécies que
a pouco tempo foram identificadas usando métodos filogenéticos, certamente não
seriam se fossem utilizados os métodos convencionais de características morfológicas.
(AOKI, et al., 2003)
3.2. Esporulação dos isolados de Fusarium gutiforme
A influência dos meios de cultura e regimes de luminosidade, quanto à
esporulação são observados na Tabela 03, onde é demonstrada a variabilidade do
comportamento dos isolados de F. gutiforme nessa interação.
26
Tabela 03. Médias referentes a regimes de luz/Isolados/Meios de culturas para esporulação de F. gutiforme in vitro.
Luz
Claro
Escuro
Alternada
Iso\Meio* BDA
CDA
AbDA
ADA
BDA
CDA
AbDA
ADA
BDA
CDA
222Aaα 135Acβ 135Abβ 135Abβ 20Baαβ 14Bhβ
17Chβ
28Bfα
16Bfγ
19Beβγ
ISO01
30Bkγ
40Aiβ
36Bfβγ 110Adα 20Baαβ 29Bfδ
71Acβ
51Bdγ
36Bdα
37ABcα
ISO02
14Clγ
87Afα
37Afβ
84Afα
20Baβ
21Bgγ
33Afβ
89Aaα
28Beα
30Bdα
ISO03
15Blβ
25Ajα
22Ahαβ 24Bjαβ 20Baαβ 21Agβ
25Agβ
17Bgβ
23Beβγ 19Aeγ
ISO04
190Abβ 283Aaα 43Afγ
32Aiδ
20Baαβ 31Bfβ
20Chγ
27Afβγ 61Bcα
20Ceγ
ISO05
24Ckδ
40Biγ
144Aaα 79Afβ
20Baβ
121Aaα 71Bcγ
79Abβγ 72Bbα
23Ceγ
ISO06
3Amα
5Akα
7Aiα
4Alα
20Baα
5Ahα
5Aiα
6Ahα
6Agα
6Afα
ISO07
4Amα
4Akα
6Biα
6Blα
20Baα
6Ahα
6Biα
7Bhα
6Agγ
6Afγ
ISO08
42Ajα
10Akβ
12Biβ
20Ajβ
20Baαβ 7Ahβ
19AhBα 9Bhαβ
7Bgβ
9Afβ
ISO09
22Bkα
20Ajα
11Biα
13kBα
20Baα
23Agβ
35Afα
23Afβ
12Cfαβ 16Aeα
ISO10
4Amα
11Akα
5Biα
7Blα
20Baα
6Ahα
6Biα
6Bhα
5Agγ
5Afγ
ISO11
152Adα 53Ahγ
29Cgδ
102Beβ 20Baα
57Adγ
89Bbβ
14Cgδ
12Cfδ
22Beγ
ISO12
169Acγ 210Abα 115Acδ 197Aaβ 20Baα
36Cfβ
44Ceαβ 50Cdα
105Baβ 83Bbγ
ISO13
134Aeα 113Adβ 62Aeγ
40Ahδ
20Baα
29Bfβγ 20Bhδ
34Afβ
19Ceα
14Ceαβ
ISO14
4Amα
4Akα
4Aiα
3Alα
20Baα
7Ahα
5Aiα
6Ahα
6Agα
6Afα
ISO15
5AmBα 9Bkα
5Biα
4Blα
20Baα
4Bhα
4Biα
6Bhα
13Afβ
15Aeβ
ISO16
55Biβ
88Beα
58Ceβ
49Agβ
20Baβ
91Bbα
67Bcβ
67Bcβ
110Aaβ 115Aaβ
ISO17
68Bhβ
74Bgβ
114Bcα 49Agγ
20Baγ
66Acβ
168Baα 40Beγ
39Adδ
123Caα
ISO18
78Agα
49Ahβ
80Adα
53Gaβ
20Baβ
50Beα
45Beα
12Bgγ
21Beα
14Ceαβ
ISO19
88Cfβ
23Bjγ
25Bhγ
118Aα
20Baβ
94Abα
58Adβ
51Bdβ
21Bcα
40Bcβ
ISO20
AbDA
38Beα
23Ceβ
20Beαβ
30Aeβ
31Beβ
36Ceβ
6Afα
50Adα
27Aeα
5Bfβ
328Aaα
241Abα
100Bcβ
18Beα
7Afα
18Aeβ
105Acβ
95Acγ
5Bfβ
21Beγ
ADA
28Beαβ
9Cfγ
11Bfβ
194Aaα
30Aeβ
5Bfδ
6Afα
35Aeβ
15AfBβ
3Cfβ
140Abβ
136Abβ
188Baα
5Bfβ
8Afα
56Adα
136Bbα
105Ccβ
7Bfβ
29Ceγ
CV (%) = 11,9
* Médias seguidas de mesma letra minúsculas na coluna em cada isolado, assim como seguidas de mesma letra maiúscula na linha em cada meio de cultura e gregas em cada regime de luz não diferem a 5% de
probabilidade pelo teste de Scott-Knott. *BDA= batata-dextrose-ágar; ADA= aveia-dextrose-ágar; CDA= cenoura-dextrose-ágar; AbDA= abacaxi-dextrose-ágar.
27
Os isolados 1SO07 e 1SO15 obtiveram maior esporulação na interação regime de
luz e meio, enquanto 1SO19 e 1SO20 apresentaram menores índices para a referida
interação (Tabela 03).
Observou-se a formação de esporulação semelhante nos meios de cultura de
acordo com o regime de luz, sendo o regime claro contínuo, no meio BDA, que
favoreceu maior diferenciação nos isolados. No meio CDA, maior variação ocorreu no
regime de luz clara, assim como no meio AbDA nos regimes de luz claro e escuro. Para
meio ADA, maior diferenciação ocorreu sob regime de luz claro (Tabela 03).
No regime de luz claro continuo não ocorreu interferência dos meios na
esporulação dos isolados 1SO07, 1SO08, 1SO10, 1SO11, 1SO15 e 1SO16. Para escuro
contínuo não observou-se interferência dos meios nos isolados 1SO07, 1SO08, 1SO11,
1SO15 e 1SO16 e sob regime de luz alternada nos isolados 1SO07 e 1SO15 como
descrito na Tabela 03.
Coelho et. al. (1997) apresentaram resultados demonstrando que isolados de
Phomopsis sp. e Phoma sp., quando foram cultivados em meio ADA, em regime de
claro contínuo, produziram maior quantidade de esporos. No presente trabalho obtevese resultados semelhantes quando trabalhado em meio ADA sob regime de claro
continuo, demonstrando uma maior diferenciação entre os isolados.
Rosa e Menezes (2001) observaram que em BDA e MPA (Maltose-PeptonaAgar), a esporulação de Pseudocercospora musae foi bastante incrementada, indicando
assim haver especificidade do meio com determinadas linhagens do fungo e o seu
potencial de esporulação, devido às vezes a metabólitos liberados ao meio pelo fungo.
Salvaia et al., (2009) observando o potencial de esporulação de três isolados de
Corynespora cassiicola em regimes de luz contínua, escuro contínuo e fotoperíodo de
12 horas, e variação de temperaturas determinou que na esporulação do fungo, os
mesmos diferiram entre si no requerimento de luz para esporularem.
No presente trabalho o substrato que proporcionou maior crescimento micelial
não necessariamente proporcionou maior esporulação, visto que a exceção dos isolados
1SO07 e 1SO015 que proporcionaram melhor crescimento micelial e maiores taxas de
esporulação os demais isolados não tiveram esta correlação.
28
4. CONCLUSÕES
1. Os isolados 1SO05; 1SO07; 1SO08; 1SO15; 1SO16, 1SO18 e 1SO20 apresentaram
maior crescimento micelial de F. gutiforme, na interação: Isolados X Meios de cultura
X Regimes de luminosidade e os isolados 1SO12, 1SO14 e 1SO19 apresentaram menor
crescimento micelial na interação Isolados X Meios de cultura X Regimes de
luminosidade.
2. Os isolados 1SO07 e 1SO15 apresentaram maior esporulação de F. gutiforme, dentro
da interação: Isolados X Meios de cultura X Regimes de luminosidade e os isolados
1SO19; 1SO20 apresentaram menor esporulação, dentro da interação Isolados X Meios
de cultura X Regimes de luminosidade.
29
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33
AVALIAÇÃO DE SINTOMAS CAUSADOS POR Fusarium gutiforme EM
FOLHAS “D” E RAÍZES DE ABACAXIZEIRO ‘PÉROLA’
CAPÍTULO 3
34
COUTINHO, O. L. Avaliação de sintomas causados por Fusarium gutiforme em folhas
D e raízes de Abacaxizeiro Pérola. 3. Cap., Areia 2010. 51 f. Tese (Doutorado em
Agronomia) Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba.
AVALIAÇÃO DE SINTOMAS CAUSADOS POR Fusarium gutiforme EM
FOLHAS “D” E RAÍZES DE ABACAXIZEIRO PÉROLA
RESUMO
A fusariose constitui o principal problema fitossanitário para o abacaxizeiro. Objetivouse neste trabalho, avaliar in vivo a atividade de Fusarium gutiforme, através da
inoculação de folhas e raízes de abacaxizeiro ‘Pérola’. Mudas e folhas “D” foram
inoculadas em casa de vegetação com 20 isolados de F. gutiforme, de diferentes áreas
produtoras da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte visando avaliar a
patogenicidade. De colônias puras do patógeno, foram obtidas suspensões através da
adição de 20mL de água destilada esterilizada na placa de Petri com BDA, contendo o
fungo, incubado por sete dias à 25+2ºC e fotoperíodo de 12 horas, raspagem com
escova macia, seguida de filtragem em dupla camada de gaze estéril, obtendo-se uma
suspensão na concentração de 107conidios/mL, mensurada em hemacitômetro. Foi
realizada inoculação em folhas D aderidas e destacadas da planta mãe, pelo método com
uso de agulha de seringa descartável contaminada com suspensão conidial,
incrementada pelo pincelamento da suspensão. As mudas foram inoculadas através da
imersão radicular na suspensão de conídios por 30 minutos. Foram avaliados a
patogenicidade e severidade em raízes e folhas aderidas através de análise estatística,
utilizando delineamento inteiramente casualizado e em folhas destacadas da planta mãe
através de escala de notas. Todos os isolados testados foram patogênicos ao material
inoculado de abacaxizeiro. Na inoculação por imersão radicular as plantas
desenvolveram alta severidade com notas variando de zero a cinco, 90 dias após a
inoculação. O isolado 1SO10, foi o mais agressivo, quando inoculado via radicular, o
ISO02 foi mais agressivo quando inoculado na parte basal aclorofilada das folhas
destacadas e os isolados ISO01, ISO05, 1SO12, 1SO13, 1SO18, 1SO20 expressaram
maior agressividade quando inoculados em folhas aderidas a planta mãe. Foram
observadas diferenças significativas de severidade entre os isolados de F. gutiforme
inoculados em abacaxizeiro cv. Pérola.
Palavras-chave: Ananas comosus L., fusariose, métodos de inoculação
35
COUTINHO, O. L. Evaluation of symptoms caused by Fusarium gutiforme in leaves
D and roots of Pineapple plants Pérola. 3. chapter, Areia 2010. 51 f. Thesis
(Doctorate in Agronomy) Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da
Paraíba
EVALUATION OF SYMPTOMS CAUSED BY Fusarium gutiforme IN D LEAFS
AND ROOTS OF PINEAPPLE PLANTS ‘PÉROLA’
ABSTRACT
Fusariosis is one of the most important disease problems for pineapple culture. The
objective of this work was to evaluate in vivo Fusarium gutiforme activity by
inoculation in leaf and roots of pineapple plants cultivar Pérola. Plantlets and D leafs
were inoculated in greenhouse with 20 isolates F. gutiforme, from different production
areas in Paraíba, Pernambuco and Rio Grande do Norte, Brazil, for evaluation of
pathogenicity. From pure fungus colonies it was obtained suspensions by addition of
20mL of distilled water on Petri dish with PDA and fungus incubated for seven days at
25+2ºC and photoperiod of 12 hours and rasped with soft brush plus filtrate in double
gauze layer obtained suspension of 107conida/mL measured in hemacytometer. It was
done inoculation in D leafs attached and detached from mother plant by inoculation
with sterilized needle infested with conidia suspension and painting suspension. The
plantlets were inoculated by roots immersion on conidia suspension for 30 minutes. It
was evaluated pathogenicity and severity on roots and attached leafs by statistical
analysis using experimental design completely randomized and in detached leafs it was
used disease index. All isolates tested were pathogenic to pineapple plants inoculated.
In roots immersion inoculation, plants developed higher severity after 90 days post
inoculation. The isolate 1SO10 was the most aggressive when inoculated by root
immersion, 1SO02 was most aggressive when inoculated in detached leafs and isolates
1SO01, 1SO05, 1SO12, 1SO13, 1SO18, 1SO20 showed higher aggressively when
inoculated in attached leafs in mother plant. It was observed significative differences of
severity between F. gutiforme isolates of pineapple plants cv. Pérola.
Key words: Ananas comosus, fusariosis, inoculation methods
36
1. INTRODUÇÃO
De acordo com Ventura e Zambolim (2002) dentre as 1300 espécies conhecidas
da família Bromeliaceae, o abacaxizeiro (Ananas comosus L.) destaca-se em
importância para a agricultura, pois se trata de frutífera originária do Brasil, que
apresenta grande expansão em área cultivada e tecnologia empregada, elevando o país,
ao posto de maior produtor mundial. Apesar disso, sua produção, destina-se
basicamente, ao consumo interno (Cabral et al., 2003).
Segundo a FAO (2008) e o IBGE (2008) a abacaxicultura está difundida por
quase todo o Brasil, e, dentre os principais estados produtores, destaca-se a Paraíba,
primeiro lugar, em produção e área plantada. Para Carvalho et al. (2002) a baixa
produtividade, deve-se a fatores como a não seleção de mudas, tratos culturais
inadequados e em maior ênfase, a fusariose (perdas de 20 % na Paraíba; 40 % na Bahia;
e até 80 % em Minas Gerais), causada pelo fungo Fusarium gutiforme.
No Brasil, as cultivares ‘Pérola’ e ‘Smooth Cayenne’ suscetíveis à doença,
proporcionam altos prejuízos na cultura (GIACOMELLI, 1982; PY et al., 1984). Para
Kimati e Tokeshi (1964), a doença encontra-se disseminada em todas as regiões
produtoras destas variedades no Brasil e América Latina. Os sintomas característicos da
doença são alterações morfológicas das plantas, como exsudação de goma, daí as
denominações de gomose e resinose (PISSARRA et al., 1979).
A doença é constatada em todos os Estados produtores de abacaxi do Brasil,
sendo a principal limitação da expansão da cultura (ZORZAL et al., 2008). Goes et al.
(1983) afirmam que o patógeno é capaz de infectar toda a planta, colonizando desde a
região das inserções foliares até os frutos e, principalmente, as mudas.
Para Ventura et al. (1993), o sintoma mais evidente é exsudação de goma,
manifestando-se em todos estádios de desenvolvimento, especialmente em frutos. Na
planta, a infecção do fungo causa lesões no caule e base das folhas, facilmente
observadas, na parte aclorofilada. Durante o ciclo da cultura, o período crítico para
infecção ocorre após a indução floral até ao final da antese, tendo como principal sitio
de infecção as flores (VENTURA e ZAMBOLIM, 2002). Os demais sintomas da
doença são curvatura do caule, alteração na filotaxia e redução do tamanho das folhas,
37
abertura da roseta central e exsudação de resina a partir de frutilhos infectados
(PISSARRA et al., 1979) .
O primeiro relato de variação no comportamento de genótipos de abacaxi referente
à incidência da fusariose baseou-se em observações em frutos, sob condições naturais de
inoculação (GIACOMELLI et al. 1982). Apesar de eficiente, a avaliação em campo, pode
ser influenciada pelas condições ambientais e pelo potencial de inóculo na área, além de
demandar tempo, uma vez que a avaliação é realizada no momento da colheita.
Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a patogenicidade e
sintomatologia causados por de 20 isolados de F. gutiforme inoculados em folhas D e
raízes de abacaxizeiro cv. Pérola.
38
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Inoculação de F. gutiforme em folhas “D” de abacaxizeiro aderidas à planta
mãe
Mudas de abacaxizeiro cv. Pérola, do tipo filhote rebentão, foram selecionadas e
padronizadas de acordo com idade (30 dias após colheita do fruto), e tamanho (40 ±
5cm),
coletadas
no
Sítio
Jacoca,
município
de
Itapororoca-PB,
(Latitude:
6:49:53.555102; Longitude: 35:15:04.154224 do meridiano de Grennwich), plantadas
em vasos com capacidade para 10kg, contendo terra vegetal, sem adubação química,
com irrigação controlada (150 mL H2O/48hs), e mantidas em casa de vegetação, do
Departamento de Fitotecnia e Ciências Ambientais, do Centro de Ciências Agrárias, da
Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB.
Os isolados de F. gutiforme, foram obtidos de plantas sintomáticas de
abacaxizeiro, coletadas em diferentes localidades de três estados produtores da
abacaxicultura nordestina (Tabela 01).
TABELA 01. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme com as respectivas
localidades e pontos de coleta.
ISOLADOS
1SO01
1SO02
1SO03
1SO04
1SO05
ISO06
1SO07
1SO08
1SO09
1SO10
1SO11
1SO12
1SO13
1SO14
1SO15
1SO16
1SO17
1SO18
1SO19
1SO20
LOCAL
Guarabira I-PB
Guarabira II-PB
Itapororoca I-PB
Itapororoca II-PB
Rio Tinto I-PB
Rio Tinto II-PB
Pedras Fogo I-PB
Pedras Fogo II-PB
Araçagí-PB
Conde-PB
Alhandra-PB
Espírito Santo-PB
Santa Rita-PB
Mamanguape-PB
Juripiranga-PB
Itambé-PE
Pombos-PE
Touros-RN
Sapé-PB
Marí-PB
PONTO DE COLETA
Sitio Canafistula
Sitio São Gonçalo
Sitio Jacoca
Sitio Refúgio
Sitio Camparte
Sitio Cacimbão
Sitio Açude Novo
Sitio Taquari
Fazenda Redenção
Sitio Boa Água
Sitio Oh! Glória
Sítio Jurema
Faz. Zé Queiroga
Sitio Pitombeira
Sitio Salgado
Fazenda Maringá
Sitio Pombos
Faz. Potiguara
Sitio Meu Destino
Faz. Unção
39
Os isolados foram testados quanto à patogenicidade em “folhas D” cv. Pérola,
aderidas à planta mãe, através de dois ferimentos, feitos com agulhas esterilizadas, dois
nas partes basais aclorofiladas e, dois nas partes medianas clorofiladas das folhas.
A inoculação foi realizada através ferimentos com agulhas de seringas
descartáveis
incrementadas
pelo
pincelamento
de
suspensão
de
conídios
7
(10 conídios/mL) da suspensão obtida pela adição de 20mL de água destilada
esterilizada (ADE) em placas de Petri contendo colônias puras cultivadas do fungo em
meio BDA e incubadas por sete dias à 25± 2ºC e fotoperíodo de 12 horas. Foi efetuada a
raspagem da colônica fúngica, com auxílio de escova de cerdas macias, sendo efetuada
a filtragem com dupla camada de gaze estéril.
Após a inoculação, as plantas
mantiveram-se em casa de vegetação, para as avaliações do aparecimento dos sintomas
da doença.
Os sintomas expressos nas folhas D foram avaliados aos 30 dias, através de
medições dos tamanhos das lesões apresentadas, sendo aplicados valores de acordo com
escala de notas proposta por Santos et al., (2002) adaptada, na qual as notas variaram de
zero (0) a cinco (5), onde: 0= Sem sintomas; 1= Lesão com tamanho de 0,1 até 1cm,
caracterizada como exsudação leve; 2= Lesão variando de 1,1 a 2cm, caracterizada
como lesão moderada; 3= Lesão variando de 2,1 a 3cm, caracterizada como exsudação
acentuada; 4= Lesão variando de 3,1 a 4cm, caracterizada como Folha D com necrose e
exsudação acentuada e inicio de murcha; 5= Lesão acima de 4cm, caracterizada como
folha D necrosada, exsudação e murcha acentuada.
Foram inoculados 20 isolados de F. gutiforme em quatro repetições constituídas
pelas folhas D de abacaxizeiro. A testemunha foi composta por folhas D de plantas não
inoculadas. O Delineamento utilizado foi o DIC e as médias comparadas pelo teste de
Scott-Knott a 1% de probabilidade, analisados pelo programa SAS (1992).
2.2. Inoculação de Fusarium gutiforme em folhas “D” destacadas de plantas de
abacaxizeiro cv. Pérola
Para inoculação de F. gutiforme em folhas D destacadas de mudas de
abacaxizeiro ‘Pérola’, foi utilizada suspensão de conídios obtida conforme metodologia
descrita no item 2.1. Das mudas de abacaxizeiro cv. Pérola previamente plantadas foram
destacadas folhas D e submetidas à desinfestação em hipoclorito de sódio a 1,5% por 3
minutos, complementada por triplo enxágue em ADE. Posteriormente as folhas foram
40
acondicionadas em bandejas plásticas, sendo realizada a inoculação dos diferentes
isolados, descritos na Tabela 01, mais a testemunha não inoculada. As folhas foram
feridas mecanicamente através de agulha esterilizada (dois ferimentos, um na parte
aclorofilada basal e outro ferimento na parte clorofilada mediana da folha), infectadas
através da imersão da extremidade pontiaguda em suspensão conidial de F. gutiforme
complementado pelo pincelamento da suspensão, sobre a superfície do ferimento.
As bandejas contendo as folhas inoculadas foram mantidas em condições
ambientais (25+ 2ºC e fotoperíodo de 12 horas), protegidas com papel filme
transparente adicionadas de chumaços de algodão estéreis embebidos em ADE,
caracterizando a formação de uma câmara úmida.
As avaliações foram realizadas aos oito dias após a inoculação, sendo a
severidade avaliada de acordo com escala de notas proposta por Santos et al., (2002)
modificada, por um período de oito (8) dias, na qual as notas variaram de zero (0) a
cinco (5), onde: 0= Sem sintomas; 1= Lesão com tamanho de 0,1 até 1cm, caracterizada
como exsudação leve; 2= Lesão variando de 1,1 a 2cm, caracterizada como exsudação
moderada; 3= Lesão variando de 2,1 a 3cm, caracterizada como exsudação acentuada;
4= Lesão variando de 3,1 a 4cm, caracterizada como Folha D com necrose e exsudação
acentuada e inicio de murcha; 5= Lesão acima de 4cm, caracterizada como folha D
necrosada, exsudação e murcha acentuada.
O delineamento utilizado foi o DIC e as médias dos dados foram comparadas
pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade. Os resultados foram analisados pelo
programa SAS (1992), com 20 tratamentos e 4 repetições.
2.3. Inoculação de Fusarium gutiforme em raízes de mudas de abacaxizeiro ’Pérola’
em casa de vegetação.
Para inoculação em raízes foram utilizadas mudas do tipo filhote rebentão de
abacaxizeiro cv. Pérola, coletadas 30 dias após colheita do fruto, sendo previamente
plantadas em baldes com capacidade para 10kg, contendo terra vegetal, sem adubação
química, com irrigação controlada em (150mL H2O) a intervalos de 48 horas, por 45
dias.
A inoculação das mudas foi realizada retirando-se cuidadosamente as mesmas
dos seus respectivos vasos e proferindo ferimentos no colo e raízes com auxílio de
instrumento pontiagudo estéril, sendo posteriormente imersas as raízes por 30 minutos
41
na suspensão conidial de F.gutiforme. A suspensão foi obtida através de colônias puras
do fungo, cultivadas em placas de Petri contendo o meio BDA e incubadas por sete dias
à 25+ 2ºC e fotoperíodo de 12 horas, pela adição de uma alíquota de 20 mL de ADE e
raspagem com auxílio de escova de cerdas macias. O material suspenso foi devidamente
filtrado em dupla camada de gaze estéril e ajustada a concentração em hemacitômetro
para 107conídios /mL da suspensão.
Para um maior contato da suspensão com as raízes na inoculação radicular,
foram utilizados sacos plásticos com capacidade para 5 Litros como invólucro,
facilitando o manuseio e distribuição da suspensão nas raízes (VENTURA et al., 1994).
Para cada um dos 20 isolados foram utilizadas quatro mudas como e a testemunha foi
composta por plantas não inoculadas.
Após tal procedimento, as mudas foram replantadas em seus respectivos vasos e
acondicionadas em casa de vegetação sendo avaliadas após 90 dias. Foram realizadas as
avaliações dos sintomas típicos da fusariose considerando escala de notas proposta por
Santos et al. (2002) adaptada, variando de 0 (zero) a 5 (cinco), onde: 0= Sem sintoma
(S/S), 1= Início de exsudação (IE), 2= Exsudação leve (EL), 3= Exsudação acentuada
(EA), 4= Folhas basais necrosadas com início de murcha (FM), 5= Murcha acentuada
com morte da planta (MP).
O Delineamento utilizado foi o DIC e as médias dos dados foram comparadas
pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade. Os resultados obtidos foram analisados
pelo programa SAS (1992). Foram utilizados 20 tratamentos com 4 repetições,
totalizando 80 plantas.
42
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os 20 isolados de F.gutiforme testados mostraram-se patogênicos ao serem
inoculados em plantas de abacaxizeiro ‘Pérola’. Os sintomas típicos da doença foram
inicialmente observados 30 dias após a inoculação destacando-se exsudações de resina
gomosa, amarelecimento, necrose e murcha de forma mais acentuada.
Nas folhas D inoculadas com F. gutiforme, maior patogenicidade foi observada
nos isolados 1SO20, 1SO18, 1SO12, 1SO01, 1SO13, 1SO05, 1SO14, 1SO19, 1SO17,
1SO08, 1SO09, 1SO02, 1SO07, ISO6 e 1SO10 respectivamente, não diferindo
estatisticamente entre si e apresentando maior agressividade do fungo. Ao contrário dos
isolados 1SO15, 1SO04, 1SO03, 1SO11 e 1SO16 que mostraram-se menos patogênicos
e não diferiram estatisticamente da testemunha (Tabela 02).
Pode-se observar na Tabela 02 os valores correspondentes a severidade da
doença 30 dias após a inoculação de F. gutiforme em folhas D aderidas a planta mãe
de abacaxizeiro cv. Pérola.
43
TABELA 02. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculados em folhas D de
abacaxizeiro cv. Pérola, aderidas à planta mãe.
ISOLADOS
1SO20
MÉDIAS *
5,68 A
1SO18
4,88 AB
1SO12
4,70 AB
1SO01
4,50 AB
1SO13
4,40 ABC
1SO05
4,30 ABCD
1SO14
3,80 ABCDE
1SO19
3,60 ABCDE
1SO17
3,50 ABCDE
1SO08
3,50 ABCDE
1SO09
3,40 ABCDE
1SO02
3,40 ABCDE
1SO07
3,30 ABCDE
ISO06
2,40 ABCDE
1SO10
2,20 ABCDE
1SO15
1,50
CDEF
1SO04
1,40
DEF
1SO03
1,40
DEF
1SO11
1,10
EF
1SO16
1,00
EF
Testemunha
0,00
F
*Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste Scott-Knott a 1% de
probabilidade. *Médias baseadas em escala de notas proposta por Santos (2002) modificada, onde:
0= sem sintomas; 1= lesão com tamanho de 0,1 a 1,0 cm (Exsudação leve); 2= lesão com tamanho de
1,1 a 2,0 cm (Lesão moderada); 3= 2,1 a 3,0 cm (Exsudação acentuada); 4= lesão com tamanho de 3,1
a 4,0 cm (Necrose acentuada com inicio de murcha); 5= Acima de 4,0 cm (Folha D necrosada
exsudação e murcha acentuada).
Para avaliação da patogenicidade dos 20 isolados de F. gutiforme os
resultados demonstraram que em folhas destacadas 15 isolados (1SO15, 1SO11,
1SO17, 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO19, ISO06, 1SO13, 1SO03, 1SO10, 1SO04,
1SO20, 1SO09 e 1SO18) apresentaram sintomatologia branda. A testemunha não
inoculada, não expressou sintomatologia típica da fusariose. Os resultados obtidos
44
evidenciaram eficiência a inoculação por ferimento com agulha esterilizada
contaminada com suspensão do patógeno.
Os isolados 1SO02, 1SO14, 1SO01, 1SO12 E 1SO16 apresentaram maior
agressividade dos sintomas em folhas destacadas. Menor sintomatologia foi
observada nos isolados 1SO03, 1SO10, 1SO04, 1SO20, 1SO09, 1SO18. Observa-se
comportamento diferenciado de patogenicidade quando se utiliza folha destacada e
folhas aderidas.
TABELA 03. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculados em folhas D
destacadas de abacaxizeiro cv. Pérola
ISOLADOS
1SO02
MÉDIAS *
4,75 A
1SO14
3,20 AB
1SO01
2,30 AB
1SO12
1,90 AB
1SO16
1,65 AB
1SO15
1,40
BC
1SO11
1,20
BC
1SO17
1,15
BC
1SO05
1,05
BC
1SO07
1,00
BC
1SO08
0,90
BC
1SO19
0,72
BC
ISO06
0,67
BC
1SO13
0,60
BC
1SO03
0,45
C
1SO10
0,40
C
1SO04
0,37
C
1SO20
0,37
C
1SO09
0,37
C
1SO18
0,30
C
0,00
C
Testemunha
*Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste Scott-Knott a 1% de
probabilidade. *Médias baseadas em escala de notas proposta por Santos (2002) modificada, onde: 0=
Sem sintomas; 1= 0,1 a 1,0 cm (Exsudação leve); 2= 1,1 a 2,0 cm (Exsudaçào moderada); 3= 2,1 a 3,0
cm (Exsudaçào acentuada); 4= 3,1 a 4,0 cm (Folha D necrosada exsudação acentuada com inicio de
murcha); 5= acima de 4,0 cm (Folha D necrosada exsudação e murcha acentuada)
45
Ventura et al., (1994) e Santos et al., (2001a), trabalhando com inoculação
de F. gutiforme em folhas destacadas de abacaxizeiro cv. Pérola, afirmam que o
método da adição de uma gota de suspensão de inóculo sobre um ferimento na parte
aclorofilada da folha foi o mais evidente na expressão dos sintomas.
Para Oliveira (2008) a introdução de um palito contaminado com F.
gutiforme a 2 e 5,0 cm da base de folhas D, destacadas de abacaxizeiro, foi um
método de inoculação eficiente, incitando o desenvolvimento de lesões e
possibilitando a avaliação dos sintomas da doença 15 dias após a inoculação. No
presente trabalho, pode-se constatar que ferimentos inoculados com pincelamento de
suspensão de conídios de F. gutiforme, mostrou-se eficiente quando realizado na
parte basal aclorofilada, apresentando sintomas característicos da fusariose. Santos
et al. (2001a) verificaram efeitos significativos da inoculação em diferentes tipos e
regiões da folha, estabelecendo áreas com maior e menor severidade do patógeno.
Para Zorzal, et al. (2008) que estudaram a variedade Vitória, resistente a
fusariose, pôde-se observar que quando inoculadas com uma suspensão de conídios
de F. gutiforme, os danos observados diferiram, indicando resistência e observandose uma maior espessura dos tecidos foliares, dificultando a penetração do inóculo.
Em relação às variedades Pérola e Smooth Cayene, susceptíveis a fusariose, essas se
mostraram vulneráveis aos danos causados pelo patógeno inoculado. Resultados
semelhantes foram observados por Ventura et al. (2006) e Vance et al. (1980).
Conforme Rugiero et al. (1994) a severidade da doença pode variar de uma
região para outra, em função do inóculo existente no campo e, segundo Giacomelli,
(1984), em virtude da grande variabilidade patogênica existente em F. gutiforme.
Na Tabela 04 pode-se observar a severidade de F. gutiforme Pérola após 60
dias inoculação em mudas de abacaxizeiro cv. Pérola, através do método da imersão
do sistema radicular em suspensão conidial.
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TABELA 04. Patogenicidade de Fusarium. gutiforme inoculados por imersão via
radicular de mudas de abacaxizeiro cv. Pérola
ISOLADOS
1SO10
MÉDIAS*
5,00A
1SO02
4,50AB
1SO07
4,50AB
1SO13
4,50AB
1SO08
4,50AB
1SO14
4,00 BC
1SO15
4,00 BC
1SO17
4,00 BC
1SO05
4,00 BC
ISO06
4,00 BC
1SO12
3,80 B C
1SO04
3,50
C
1SO01
3,50
C
1SO18
3,50
C
1SO11
3,50
C
1SO16
3,30
CD
1SO09
3,30
CD
1SO03
3,00
D
1SO20
2,30
E
1SO19
2,30
E
Testemunha
0,00
F
*Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste Scott-Knott a 1% de
probabilidade. *Médias baseadas em escala de notas proposta por Santos (2002) modificada, onde:0=
sem sintoma (S/S); 1= incio de exsudação (IE); 2= Exsudação leve (EL); 3= Exsudação acentuada
(EA); 4= Folhas basais necrosadas com inicio de murcha (FM); 5= Murcha acentuada com morte da
planta (MP)
Os isolados 1SO20 e 1SO19 apresentaram apenas exsudação leve,
demonstrando menor patogenicidade às raízes inoculadas. A testemunha não
apresentou sintomatologia típica da doença.
Para os isolados inoculados por imersão radicular pode-se constatar que
47
1SO10, 1SO02, 1SO07, 1SO13 e 1SO08 apresentaram maior agressividade,
condicionando uma maior severidade da doença, sem diferença significativa entre
eles. Quanto aos sintomas apresentados, os isolados estudados apresentaram índices
satisfatórios de infecção, variando quanto à agressividade e confirmando sua
utilização em testes de patogenicidade.
Santos et al. (2001b) estudando isolados de F. gutiforme em mudas e folhas
destacadas de abacaxizeiros obteve resultados significativos, quanto aos danos
causados.
Castro et al., (2008) observando diferentes métodos de inoculação do F.
oxysporum f.sp. cubense em helicônia, determinaram que o método de injeção
radicular sobressaiu aos demais, demandando menos tempo para surgimento de
sintomas. Diferentes de quando utilizaram “dipping” de raízes, que foi menos
eficiente para testes de patogenicidade em outras espécies fúngicas. Goes e Kimati,
(1990) afirmaram ser a variabilidade do patógeno, responsável pela variação na
intensidade dos danos e consequentemente das perdas, tendo este fato a ser
considerado, principalmente quando se visar à identificação de genótipos de
abacaxizeiro resistentes à fusariose.
Relacionando as diferentes formas de inoculação estudadas no presente
trabalho, observa-se que não houve diferença em relação á patogenicidade, face o
método de inoculação, ou seja, todos os isolados foram patogênicos às plantas de
abacaxizeiro ‘Pérola’. Quanto às formas de inoculação, tanto em testes via foliar
quanto em testes via radicular, observaram-se variações na severidade da doença com
diferença no tamanho das lesões.
Pode-se afirmar que os isolados de F.gutiforme estudados no presente
trabalho possuem potenciais de patogenicidade quando inoculados via foliar, em
folhas destacadas ou aderidas, ou através de inoculação via radicular.
48
4. CONCLUSÕES
Os isolados 1SO20, 1SO18, 1SO12, 1SO01, 1SO13, 1SO05, 1SO14, 1SO19, 1SO17,
1SO08, 1SO09, 1SO02, 1SO07, ISO6 e 1SO10 apresentaram maior patogenicidade
do fungo quando inoculados em folhas D aderidas; entretanto, os isolados 1SO015,
1SO04, 1SO03, 1SO11 e 1SO16 expressaram menor patogenicidade quando
inoculados em folhas D aderidas.
O teste de patogenicidade em folhas D destacadas da planta mãe de abacaxizeiro cv.
Pérola, através de ferimentos com agulhas de seringas contaminadas em suspensões
conidiais de F. gutiforme, mostrou-se um método eficiente de inoculação, onde,
1SO02, 1SO14, 1SO01, 1SO12 e 1SO16 apresentaram sintomatologia mais severa,
enquanto menor severidade foi observada nos isolados 1SO03, 1SO10, 1SO04,
1SO20, 1SO09, 1SO18.
As mudas de abacaxizeiro cv. Pérola inoculadas por imersão radicular em suspensões
conidiais de F. gutiforme mostraram-se susceptíveis aos 20 isolados testados.
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5. REFERÊNCIAS
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