Salvia officinalis - Universidade de Franca

Monique Rodrigues Moreira
UNIVERSIDADE DE FRANCA
Salvia officinalis: fracionamento
biomonitorado de extrato em
diclorometano frente a bactérias
causadoras de cárie e estudos analíticos
em CLAE-DAD
Rodrigo Cassio Sola Veneziani
Franca
2013
Monique Rodrigues Moreira
Salvia officinalis: fracionamento bioguiado de
extrato em diclorometano frente a bactérias
causadoras de cárie e estudos analíticos em
CLAE-DAD
Dissertação apresentada à Universidade de
Franca como exigência parcial para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Química Biológica.
Rodrigo Cassio Sola Veneziani
(Orientador)
Monique Rodrigues Moreira
(Mestranda)
Franca
2013
Monique Rodrigues Moreira
Salvia officinalis: fracionamento bioguiado de
extrato em diclorometano frente a bactérias
causadoras de cárie e estudos analíticos em
CLAE-DAD
Presidente:___________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Cassio Sola Veneziani
Instituição: Universidade de Franca
Titular 1:_____________________________________________
Prof. Dr. Sérgio Ricardo Ambrósio
Instituição: Universidade de Franca
Titular 2:_____________________________________________
Prof. Dr. Carlos Eduardo Saraiva Miranda
Instituição: Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP)
Dedico este trabalho a minha família e amigos,
As pessoas que estiverem ao meu lado, compreendendo minha
ausência e me incentivando sempre.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu grande exemplo professor orientador Rodrigo Cassio Sola
Veneziani, pelos preciosos conselhos, seus ensinamentos e sua inestimável confiança.
Aos amigos do laboratório que estiveram presente durante todo esse tempo, Lucas
Cintra, Ariana Borges, Lucas Zampar, Maísa Moreira, Marília Rodrigues, Thiago Porto,
Moara Garcia, Gabriela de Paula Aguiar, Ana Luísa Mosbacher, Karen Rezende, Thaís
Lima, Ana Carolina Soares, Gustavo Pregnolato, Gustavo Morais.
Meus respeitosos agradecimentos pela contribuição da banca do exame de
qualificação e banca do exame de defesa. E a todos os professores da pós-graduação
que contribuíram cada qual da sua forma para o meu aprimoramento profissional e
pessoal durante esse período.
Agradeço à FAPESP por conceder a bolsa de Iniciação Científica (Nº do processo
2009/17700-0), e também a CAPES pela bolsa de Mestrado, a CNPQ pelo apoio
financeiro.
“A imaginação é mais importante que a ciência,
porque a ciência é limitada,
Ao passo que a imaginação abrange o mundo inteiro.”
(Albert Einstein)
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS, CÓDIGOS E ABREVIATURAS...................................... VII
LISTA DE FIGURAS............................................................................................ IX
LISTA DE TABELAS............................................................................................ X
RESUMO............................................................................................................. XI
ABSTRACT.......................................................................................................... XII
1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 01
1.1.Considerações gerais............................................................................... 02
1.2.Importância da descoberta de novos quimioterápicos no combate a
patógenos bucais...................................................................................... 03
1.3.Potencial antimicrobiano de Salvia officinalis............................................ 05
1.4.Desenvolvimento e validação de métodos analíticos por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE)............................................................... 07
2. OBJETIVOS.................................................................................................... 10
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 12
3.1.Preparo e partição líquido-líquido do extrato bruto em diclorometano de
Salvia officinalis (SOD).................................................................................... 13
3.2.Fracionamento biomonitorado de SODH.................................................
15
3.3.Avaliação da atividade antimicrobiana...................................................... 17
3.3.1.Determinação da Concentração Inibitória Mínima
18
3.3.2.Determinação da Concentração Bactericida Mínima
19
3.3.3.Avaliação da Cinética Antimicrobiana
20
3.4.Desenvolvimento e validação do método analítico por CLAE................... 21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................
28
4.1. Isolamento e identificação estrutural do manool...................................... 29
4.2. Avaliação da atividade antimicrobiana..................................................... 35
4.3. Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE.................. 37
5. CONCLUSÃO.................................................................................................. 43
6. REFERÊNCIAS .............................................................................................. 45
7. ANEXO............................................................................................................ 57
VI
LISTA DE SÍMBOLOS, CÓDIGOS E ABREVIATURAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AcN - Acetonitrila
ATCC – American Type Culture Collection
BHI – Brain Heart Infusion
CBM – Concentração Bactericida Mínima
CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLAE-DAD – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo
de Diodos
CLE – Clorexidina
DMSO – Dimetilsulfóxido
DPR% - Desvio Padrão Relativo
DD – Duplo dubleto
D - Dubleto
HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Liquida de
Alta Eficiência)
LOD – Limite de Detecção
LOQ – Limite de Quantificação
MO – Manool
PI – Padrão Interno (ent-caurenoato de metila)
RMN-13C – Ressonância Magnética Nuclear de 13C
RMN-1H – Ressonância Magnética Nuclear de 1H
S - Singleto
VII
SOD – Extrato Bruto de S. officinalis em Diclorometano
SODD – Extrato em Diclorometano Obtido por Partição em Diclorometano
SODI – Extrato em Diclorometano Insolúvel em metanol/água
SODH – Extrato em Diclorometano Obtido por Partição em hexano
SODM/A – Extrato em Diclorometano Ressuspendido em metanol /água 7:3
SODH1 – SODH7 – Frações da Coluna Líquida a Vácuo Obtidas a Partir de
SODH
SODH2.1 – SODH2.6 – Frações Reunidas a Partir do Fracionamento de
SODH2
UFC/mL – Unidades Formadoras de Colônia por Mililitro
σ – Desvio Padrão Relativo
S – Inclinação da Curva de Calibração
trr – Tempo de Retenção Relativo
δ - ppm
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Salvia officinalis.
05
Figura 2: Labda-8(20),14-dien-13-ol (Manool), um dos principais
07
diterpenos de Salvia officinalis.
Figura 3: Preparo do extrato bruto bruto diclorometânico de Salvia
14
officinalis (SOD).
Figura 4: Fracionamento do extrato bruto diclorometânico de Salvia
15
officinalis (SoD)..
Figura 5: Fluxograma do fracionamento e isolamento do manool
17
partindo da fração SODH2
Figura 6: Gradiente exploratório proposto por Snyder & Dolan
22
Figura 7: Estrutura do Padrão interno ent-caur-16(17)-en-19-oato de
22
metila
Figura 8: Esquema de diluições de maool para elaboração da curva
23
de calibração
Figura 9: Esquema de preparo das amostras para determinação da
25
precisão e exatidão do método analítico.
Figura 10: Espectro de RMN-1H do manool (400 MHz; CDCl3)
30
Figura 11: Ampliação da região entre δ 6 - δ 4 mostrando os sistemas
31
de duplas ligações manool.
Figura 12: Espectro de RMN-13C do manool (100MHz, CDCl3)..
33
Figura 13: Curvas de morte obtidas para o manool (A) e SODH2 (B)
frente a Streptococcus mutans usando dicloridrato de
clorexidna (CLE) e DMSO 5% como controles positivo e 37
negativo, respectivamente..
Figura 14: Cromatograma obtido por CLAE referente a SODH2, obtido
nas condições estabelecidas (sistema isocrático de eluição
composto de 90% acetonitrila em água contendo 0.1% de
ácido acético numa velocidade de 1.0 mL/min, temperatura da 38
coluna de 40 ºC e detecção a 201 nm. No detalhe, o espectro
de UV do MO.
Figura 15: Curva de calibração do manool, constando a equação de
regressão linear e o coeficiente de correlação linear r2.
39
.
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Fracionamento por CLV de SODH
16
Tabela 2: Fatores e níveis investigados no teste de robustez.
26
Tabela 3: Design experimental de Plackett–Burman para 7 fatores e 8
experimentos.
27
Tabela 4: Dados de RMN-1H (em δ) do manool.
34
Tabela 5: Dados de RMN-13C (em δ) do Manool.
35
Tabela 6: Valores obtidos para CIM do manool (MO) e de SODH2
frente a patógenos bucais.
36
Tabela 7: Valores obtidos para CBM do manool (MO) e de SODH2
frente a patógenos bucais
Tabela 8: Parâmetros analíticos de LD, LQ, precisão, exatidão e
robustez obtidos para o método desenvolvido.
36
40
X
RESUMO
Pertencente à família Lamiaceae, Salvia officinalis (Salvia) é uma erva muito
cultivada em várias partes do mundo devido ao seu uso culinário como
tempero. Seu nome botânico, porém, é baseado em sua importância medicinal.
Em latim, “Salvia” significa “curar” e “officinalis” significa “medicinal”. Dentre as
várias atividades biológicas descritas, o potencial antimicrobiano desta espécie
se destaca devido ao fato de ter sido amplamente investigado e confirmado
frente a um grande número de microrganismos. Visando explorar este
potencial, neste trabalho, (foram propostos) a obtenção e fracionamento
bioguiado do extrato em diclorometano de Salvia officinalis (SOD) frente a um
painel de bactérias causadoras de cárie (Streptococcus mutans, ATCC 25275;
Streptococcus sanguinis, ATCC 10556; Enterococcus faecalis, ATCC 4082;
Streptococcus sobrinus, ATCC 33478; Streptococus. mitis ATCC 49456;
Lactobacillus casei ATCC 11578; Streptococcus. Salivarius, ATCC 25975). A
fração mais ativa (SODH2) apresentou valores de CIM entre 15,68 e 31,36
µg/mL e seu metabólito secundário majoritário (manool) apresentou valores de
CIM entre 6,24 e 24,96 µg/mL. SODH2 e o manool necessitaram de 12 e 6
horas, respectivamente, para exercer seu efeito bactericida. Estes resultados
denotam o potencial de Salvia officinalis na busca de novos princípios ativos
anticariogênicos. Descreve-se ainda o desenvolvimento e validação de método
analítico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD) para
determinação do teor de manool em SODH2. Os estudos analíticos permitiram
estabelecer um método confiável para determinar o teor de manool em
SODH2, atendendo às crescentes demandas por qualidade e segurança em
produtos fitofarmacêuticos.
Palavras-chave: Salvia officinalis, manool, cárie, método analítico, CLAE-DAD
XI
ABSTRACT
Belonging to the family Lamiaceae, Salvia (Salvia officinalis) is an herb
cultivated worldwide due to its culinary seasoning use. Its botanical name is
based on its medicinal importance. In latin, “Salvia” means “to cure” and
“officinalis” means “medicinal”. Among the several biological activities described
for this specie, its antimicrobial potential can be highlighted due at the fact have
been broadly investigated and confirmed against a large number of
microoganisms. Aiming to explore such potential, this works describes: the
obtaining and the bioguided fractioning of a dichloromethane crude extract of
Salvia officinalis (SOD) through a panel of carigenic bacteria (Streptococcus
mutans, ATCC 25275; Streptococcus sanguinis, ATCC 10556; Enterococcus
faecalis, ATCC 4082; Streptococcus sobrinus, ATCC 33478; Streptococus.
mitis ATCC 49456; Lactobacillus casei ATCC 11578; Streptococcus. Salivarius,
ATCC 25975).Fraction more active (SODH2) presented values of the MIC
between 15.68 – 31.36 µg/mL and your secondary metabolite majoritarian
(manool) presented values of the MIC of the 6.24 – 24.96 µg/mL. SODH2 and
manool required 12 and 6 hours respectively, to compounds exert effects
bactericide. It’s theses values denote the potential of Salvia officinalis in the
search for new active principles anticariogenic. It is also described the
development and validation of an HPLC-DAD analytical method to determine
the manool content in SODH2. Moreover, the establishment of a validated
method to quantify manool in SODH2 attended to the increasing demands in
quality and safety of phytopharmaceuticals.
Key-words: Salvia officinalis, manool, caries, analytical method, HPLC-DAD
XII
1.Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações gerais
Devido à inigualável diversidade química, os produtos naturais
proporcionam oportunidades ilimitadas para obtenção de novos princípios
ativos, sejam eles na forma de metabólitos isolados ou de extratos
padronizados. Para atingir este objetivo, a melhor estratégia consiste na
associação entre estudo fitoquímico e ensaios biológicos [1].
Mesmo com o advento da biotecnologia e dos modernos métodos da
química combinatória e do design racional de fármacos, os produtos naturais
ainda se mostram como uma importante para o desenvolvimento de produtos
farmacêuticos [2-5]. Assim, ainda que a importância relativa dos princípios
ativos naturais oscile ao longo do tempo de acordo com as estratégias
mercadológicas das grandes companhias farmacêuticas, a tendência atual é
largamente favorável ao Brasil devido à sua grande biodiversidade e fronteira
agrícola em expansão. [2,3,5].
Geralmente acredita-se que o risco associado ao uso deste tipo de
medicamento é pequeno, mas uma série de registros envolvendo graves
reações adversas ou ineficácia destes produtos mostra que esta percepção é
errônea. Problemas envolvendo contaminação, adulteração e identificação
incorreta das espécies vegetais envolvidas no preparo dos produtos
fitofarmacêuticos tornam essencial o desenvolvimento de padrões técnicos na
manufatura, de avaliações toxicológicas e de métodos analíticos que garantam
a qualidade e segurança no uso destes produtos [6-8].
2
1.2. Importância da descoberta de novos quimioterápicos no combate a
patógenos bucais.
A saúde bucal é dependente das medidas de caráter curativo e
preventivo. Na última década observou-se o crescimento da Odontologia
Preventiva, visando à adoção de medidas profiláticas combinadas para manter
a cavidade bucal saudável, prevenindo-a de doenças e diminuindo a
necessidade de tratamentos curativos [9,10].
Segundo dados da Pesquisa Nacional de Saúde Bucal, realizada pelo
Ministério da Saúde em 2010, a cárie continua sendo a principal patologia que
acomete a cavidade bucal, sendo encontrada em 56% da população brasileira
[11]. Ela tem início quando ocorre um desequilíbrio da microbiota residente na
cavidade bucal, com o consequentemente acúmulo de certos microrganismos
potencialmente cariogênicos que, somados a uma dieta rica em carboidratos
(principalmente açucares) podem levar à instalação da cárie dental [12,13]. Em
outros termos, trata-se de uma doença de origem bacteriana, que resulta na
dissolução do esmalte dentário devido à ação de ácidos produzidos pelo
processo de metabolismo bacteriano sobre os carboidratos fermentáveis da
dieta.
Quando não eliminada, a cárie pode levar à desmineralização dos
tecidos dentais e consequentemente à perda do dente [14,15]. Além disso, as
bactérias responsáveis pela cárie podem desencadear processos inflamatórios,
culminando em doenças como estomatites, gengivites, aftas e ainda outras de
maior gravidade, como o câncer bucal [16,17].
3
O biofilme é composto por microorganismos sobre uma camada
liopoprotêica denominada película, constituída por glicoproteínas salivares,
fosfoproteínas, lipídeos e componentes do fluído gengival. Sua formação iniciase pela adsorção de bactérias na superfície do dente, seguida da síntese de
exopolissacarídeos (EPS) insolúveis que garantem a aderência sua em uma
matriz que se torna madura após a reprodução bacteriana associada à
aderência de outras espécies de bactérias comensais [21,22]. Diversos ácidos
orgânicos são produzidos através da intensa atividade metabólica dessas
bactérias aderidas, ocasionando a desmineralização do esmalte dentário
[21,22].
Dentre as principais bactérias envolvidas no processo cariogênico,
destaca-se a Streptococcus mutans, pois foi demonstrado experimentalmente
que ela é a iniciadora de cáries em sulcos e fissuras, superfícies vestibulares e
linguais das faces lisas, áreas proximais e mesmas superfícies radiculares,
para posterior colonização de outros microrganismos, tais como Streptococcus
salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Enterococcus e
Lactobacillus sp entre outros [14,18-20].
Como coadjuvantes à remoção mecânica e química dos microrganismos
cariogênicos através da escovação e do uso do fio dental, os enxaguatórios
bucais têm sido empregados adjuvantes no combate à cárie. Entretanto, alguns
problemas relacionados à eficácia e segurança destes produtos têm sido
observados, dentre os quais pode-se destacar a resistência microbiana
[14,15,23] e os efeitos adversos de seus princípios ativos [24,25]. Neste
sentido, há uma crescente necessidade de obtenção de novos princípios ativos
anticariogênicos.
4
1.3. Potencial antimicrobiano de Salvia officinalis.
Pertencente à família Lamiaceae, Salvia officinalis (sálvia) é uma erva
muito cultivada em várias partes do mundo devido ao seu uso culinário como
condimento (Figura 1). Seu nome botânico, porém, é baseado em sua
importância medicinal. Em latim, “Salvia” significa “curar” e “officinalis” significa
“medicinal” [26]. Vários extratos de diferentes espécies de Salvia têm sido
investigados para uma série de atividades biológicas, tais como antiinflamatória, antioxidante, espasmolítica, colinérgica e até mesmo para o
controle do mal de Alzheimer [27-31].
Figura 1: Salvia officinalis. Fonte: http://www.floridata.com/ref/s/salv_off.cfm
Dentre
as
várias
atividades
biológicas
descritas,
o
potencial
antimicrobiano de Salvia officinalis (extratos e óleos essenciais) se destaca
devido ao fato de ter sido amplamente investigado e confirmado frente a um
grande número de bactérias, tais como Pseudomonas sp, Staphylococcus sp,
Salmonella sp, Bacillus sp, Klebsiella sp, Shigella sp, Enterobacter sp,
5
Escherichia sp, Streptococcus sp e também em algums fungos Verticillium sp,
Trichoderma sp, conforme pode se verificar pela quantidade de artigos
encontrados na literatura científica [32-41]. Bozin et al [42] e Horiuchi et al
[43,44]
relatam
significativa
atividade
do
óleo
essencial
(obtido
por
hidrodestilação) e de vários monoterpenos e sesquiterpenos detectados nesta
espécie, e do ácido oleanólico isolado de Salvia officinalis contra bactérias
relacionadas às patologias do trato gastrointestinal, algumas delas resistentes
ao antibiótico vancomicina. Em outro trabalho produzido no mesmo ano,
Horiuchi [43] descreve como o carnosol, um diterpeno do tipo abitetano
também isolado de Salvia officinalis, foi capaz de potencializar a ação de
antibióticos
aminoglicosídicos
contra
várias
espécies
de
Streptococci.
Avaliando extratos preparados de diversas maneiras a partir de sálvia frente a
bactérias causadoras de afecções cutâneas, Leelapornipsid et al [45] sugerem
que aqueles são promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos
para o controle da acne.
Em termos de metabolismo secundário, é possível afirmar que os
diterpenos são uma das classes de micrometabólitos mais característicos de
Salvia officinalis [26,46,47]. Dentre tais metabólitos, o manool (MO, Figura 2)
se destaca na literatura científica como um dos mais abundantes componentes
de óleos essenciais e extratos de Salvia officinalis [48-51], tendo sido reportado
que, em alguns destes extratos, seu teor pode chegar a até 11% [51].
6
OH
H
Figura 2: Labda-8(20),14-dien-13-ol (Manool), um dos principais
diterpenos de Salvia officinalis
Em recente revisão da literatura Oliveira et al. [52] acerca da utilização
popular de espécies vegetais para tratamento de afecções odontológicas no
Brasil, a Salvia officinalis é apontada como uma das mais indicadas, contando
com oito citações. Este fato, associado ao seu potencial antimicrobiano,
credencia S. officinalis como possível fonte de novos princípios ativos
anticariogênicos.
1.4.
Desenvolvimento
e
validação
de
métodos
analíticos
por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
A validação é um processo que fornece uma evidência documentada de
que um método é confiável ao que se aplica. Consiste em uma série de
procedimentos que visam assegurar credibilidade às medidas obtidas. Deste
modo, a validação é uma etapa muito importante e necessária para que um
método analítico possa ser utilizado na rotina analítica. Porém, antes de iniciar
o processo de validação, é necessário desenvolver o método a ser validado
[53-56].
O desenvolvimento de um método analítico envolve o estabelecimento
do procedimento de extração, as condições cromatográficas e a realização de
7
alguns estudos preliminares quanto à seletividade, sensibilidade, linearidade,
parâmetros a serem avaliados, procedimentos utilizados para avaliar
parâmetros, critérios de aceitação, resposta do detector e forma de
padronização. Segundo Oliveira [57], o desenvolvimento de um método
analítico envolve, na verdade, cinco etapas: levantamento bibliográfico, seleção
do método, desenvolvimento, otimização e validação.
Além da necessidade de garantir a autenticidade e a qualidade de
matérias primas vegetais ou de fitofarmacêuticos, existem razões legais que
justificam a validação de métodos analíticos. No Brasil, a principal agência
governamental que verifica a competência de laboratórios de ensaios é a
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Para isso, ela disponibiliza
um verdadeiro guia para o procedimento de validação de métodos analíticos
[58,59].
Segundo a RE n° 899/2003 “Guia para validação de métodos analíticos
e bioanalíticos” da ANVISA [60], a metodologia analítica para testes
quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos
ou matérias-primas não descritas em farmacopéias ou formulários oficiais, será
validada, desde que sejam avaliados os seguintes parâmetros:
Seletividade: habilidade do método de detectar, a substância de interesse, dos
componentes da amostra que possam também ser visíveis no detector,
assegurando-se que o sinal medido não é influenciado por substâncias
interferentes [53-56,60].
Linearidade: é a capacidade de um método analítico de gerar resultados
proporcionais à concentração do composto em questão, dentro de uma faixa
8
analítica especificada (Intervalo Dinâmico), sendo possível relacionar a
resposta do detector à concentração [53-56,60,61].
Exatidão: é a relação entre o valor encontrado pelo método e o valor aceito
como verdadeiro ou de referência. A exatidão é normalmente determinada por
intermédio de, no mínimo, análises em três pontos: mais diluído da curva
analítica, outra em média 40 a 60% do ponto mais concentrado e uma alta 75 a
95% do ponto mais concentrado [53-56]. Outra forma de investigação consiste
em comparar a média dos resultados obtidos com a média obtida do programa
interlaboratorial, ou ainda por meio de estudos de recuperação de quantidades
conhecidas do analito adicionado na matriz limpa da amostra ou ainda na
matriz da amostra [61,62].
Precisão: consiste na habilidade do método de repetir o mesmo resultado,
embora não necessariamente o correto, sempre que o procedimento é
executado [53-56].
Robustez: é a habilidade do método em fornecer resultados inalterados quando
sujeitos a pequenas mudanças como diferentes analistas, variações no pH e/ou
concentração da fase móvel, alterações na performance da coluna,
temperatura do ambiente etc [53-56].
9
2.Objetivos
10
2. OBJETIVOS
Geral
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o potencial antimicrobiano de
Salvia officinalis frente a patógenos bucais, além de isolar e identificar o(s)
princípio(s) ativo(s) e determinar qual a fração mais ativa. Objetivou-se também
desenvolver uma metodologia analítica para identificar e quantificar o(s)
princípio(os) ativos(s) da referida fração.
Específicos
 Preparar o extrato em diclorometano de partes aéreas de Salvia
officinalis e obter frações em hexano, diclorometano e metanol / água
através de partição.
 Avaliar o potencial antimicrobiano do extrato bruto e frações frente ao
microrganismo iniciador do processo cariogênico (S. mutans) [10].
 Investigar fitoquimicamente a fração mais ativa e também avaliar o
potencial antimicrobiano de seu(s) princípio(s) ativo(s) frente a um painel
de microrganismos formado por Streptococcus. mutans, Streptococcus
sobrinus, Streptococcus mitis, Lactobacillus casei, Streptococcus
salivarius, Streptococcus sanguinis, Enterococcus faecalis.
 Desenvolver e validar uma metodologia analítica, utilizando CLAE, para
quantificar o metabólito majoritário (princípio ativo) na fração mais ativa.
11
3.Materiais e métodos
12
3. MATERIAIS E MÉTODOS.
3.1. Preparo e partição do extrato bruto em diclorometano de Salvia
officinalis (SOD).
Foram adquiridos 1 kg das partes aéreas secas e rasuradas de “Salvia”
(Salvia officinalis – lote san01-08, validade até 05/01/2011, colhido dia
01/08/2009) junto ao fornecedor (Nutriervas) localizado em São Paulo, na Rua
Bucolismo nº 144 – Brás, CEP: 03008-040. A autenticidade do material foi
conferida pelo farmacêutico responsável Dr. Carlos A. K Neves (CRF/SP
8.805). Visando melhorar a eficiência do processo extrativo, o material foi
pulverizado em moinho de facas e tamisado em telas de malha nº10.
Para a preparação do extrato bruto, 1000 g de Salvia officinalis
(processado conforme o parágrafo anterior) foi extraído com 5000 mL de
diclorometano por maceração exaustiva durante um período de 24 horas. O
procedimento extrativo foi repetido outras duas vezes e, após isso, o material
filtrado foi concentrado em rotaevaporador. Após completa evaporação do
solvente, foi obtido o extrato bruto em diclorometano (SOD; 45,5 g). A seguir, a
Figura 3 apresenta um fluxograma que resume o procedimento extrativo
adotado.
13
Salvia officinalis
(1000 g)
Temperatura ambiente
- Maceração por 24h com 5000 mL de diclorometano (3x)
- Filtração
Salvia officinalis
Partes aéreas extraída com
diclorometano
Extrato diclorometano
Concentrado em rotaevaporador
Desprezar resíduo
Extrato diclorometano concentrado
(SOD) m = 45,5 g
Figura 3: Preparo do extrato bruto bruto diclorometânico de Salvia officinalis
(SOD).
Para a partição do extrato bruto, tomou-se 45,5 g de SOD e solubilizouse em 300 mL de Metanol/ H2O (9:1v/v). Em seguida, o material obtido foi
filtrado em papel de filtro e o resíduo foi desprezado. O filtrado consistiu numa
fração hidroalcóolica que foi então colocada em um funil de separação e
extraída com 400 mL de hexano, sendo o procedimento repetido por três
vezes. Originou-se assim uma fração em hexano (SODH m= 10,58 g) que,
após ter sido concentrada em rotaevaporador, foi reservada em outro frasco. A
porção hidroalcoólica solúvel foi concentrada em rotaevaporador e extraída
com 400 mL de diclorometano por duas vezes, originando uma fração em
Diclorometano
(SODD
m=6,68
g)
que,
após
ser
concentrada
em
rotaevaporador, foi reservada em outro frasco. A parte hidroalcoólica solúvel
restante foi recolhida e nomeada como SoDM/A (m=0,09 g). A Figura 4 a
seguir apresenta um fluxograma que descreve os procedimentos adotados
durante o fracionamento de SOD.
14
Extrato bruto em diclorometano de
Salvia officinalis (SOD) (m= 45,5 g)
- Solubilizado em 300 mL Metanol / H2O (9:1 v/v)
- Filtração em papel de Filtro
Hexano (4X 400 mL cada)
Parte insolúvel
(SODI, m= 21,6 g)
Parte
hidroalcoólica
solúvel
Obs.: Concentrada a parte hidroalcoólica solúvel em
rotaevaporador antes de ter sido extraida com diclorometano.
Diclorometano (2X 400 mL)
Parte
hidroalcoólica
solúvel
Parte
hidroalcoólica
solúvel
Fração em Hexano
Concentrada em Rotaevaporador
(SODH, m= 10,58 g)
Fração em Diclorometano
Concentrada em Rotaevaporador
(SODD, m= 6,68 g)
Fração Hidroalcoólica
Concentrada em Rotaevaporador
(SODM/A, m= 0,09 g)
Figura 4: Fracionamento do extrato bruto diclorometânico de Salvia officinalis
(SOD).
3.2. Fracionamento biomonitorado de SODH.
Após o parcionamento, SOD e as frações obtidas (SODI, SODH e
SODD) foram submetidas a ensaio antimicrobiano para determinação da
Concentração inibitória mínima (CIM) frente à Streptococcus mutans (ATCC
25275; que é considerado o microrganismo iniciador do processo cariogênico
15
[10]. SODH foi a fração considerada mais ativa, e portanto foi submetida a
fracionamento cromatográfico utilizando sílica gel 60H (500 g) [63] como fase
estacionária e n-hexano com percentuais crescentes de acetato de etila como
fase móvel (1500 mL cada fração) como mostra a Tabela 1. Após a
evaporação do solvente, este procedimento originou sete frações (SODH1SODH7), que também foram investigadas frente a Streptococcus. mutans.
Tabela 1: Fracionamento por CLV de SODH
Código da Fração
Fase móvel
Volume (mL) Massa (g)
SoDH1
Hex
1500
0,08
SoDH2
Hex/AcOEt 8:2
1500
2,89
SoDH3
Hex/AcOEt 6:4
1500
4,29
SoDH4
Hex/AcOEt 4:6
1500
1,83
SoDH5
Hex/AcOEt 2:8
1500
0,35
SoDH6
AcOEt
1500
0,08
SoDH7
MeOH
1500
0,57
SODH2 (2,89 g) apresentou valores de CIM considerados promissores
frente a S. mutans (menores que 100 µg/mL) [64,65], então, 2,00 g desta
fração foi fracionada em coluna clássica utilizando sílica gel 60 (100 g) como
fase estacionária e n-hexano/acetato de etila 9:1 como fase móvel. Cinquenta
novas frações foram coletadas e reunidas em outras seis (SODH2.1 a
SODH2.6) após análise via cromatografia em camada delgada comparativa
(CCDC) usando sílica gel GF254 (Merck, Darmstadt, Alemanha) como fase
estacionária e n-hexano/acetato de etila 9:1 como fase móvel. SODH2.3 (152
mg) foi a fração mais ativa frente Streptococcus. mutans e apresentou apenas
uma mancha na análise por CCDC, sendo então submetida à análises por
16
RMN 1H e
13
C, que se tratava do diterpeno do tipo labdano manool (MO). A
seguir, a Figura 5 apresenta todo o procedimento.
SODH
CLV
BIOMONITORAMENTO
SODH2
SODH1
SODH4
SODH3
SODH5
SODH6
SODH7
-CC (50 frações)
-CCDC (reunião)
BIOMONITORAMENTO
SODH2.1
SODH2.2
SODH2.3
SODH2.4
SODH2.5
SODH2.6
-CCDC
-RMN1H e 13C
Manool
Figura 5: Fluxograma do fracionamento e isolamento do manool partindo da
fração SODH2
3.3. Avaliação da atividade antimicrobiana
Inicialmente e, conforme a estratégia de biomonitoramento, o extrato
bruto SOD, as frações SODH; SODD; SODH1-SODH7 e SODH2.1-SODH2.7
foram submetidas à determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
apenas frente a S. mutans (American Type Culture Collection, ATCC 25275).
Já SODH2 e Manool (MO) foram avaliadas frente a um painel de bactérias
cariogênicas que incluiu também: Streptococcus sobrinus ATCC 33478,
Streptococcus
mitis
ATCC
49456,
Lactobacillus
casei
ATCC
11578,
Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC 10556,
Enterococcus faecalis ATCC 4082. Para SODH2 e o manool (MO) foram
17
também determinados os valores de concentração bactericida mínima (CBM)
frente aos microrganismos citados.
3.3.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima
A Concentração Inibitória Mínima - (CIM) é definida como a menor
concentração capaz de inibir o crescimento dos microrganismos, considerado
bacteriostático quando o valor de CBM (Concentração Bactericida Mínima) for
superior ao valor de CIM.
Os valores foram determinados para cada microrganismo foi realizada
em triplicata utilizando-se o método de microdiluição em microplacas [66]. Para
isso, foi dissolvidos 1 mg de cada fração ou substância pura em 100 μL de
dimetilsulfóxido (DMSO) e 1900 μL de Caldo Triptona Soja (TSB), ou seja em
2000 µL, originando soluções de 500 µg/mL. A concentração final de DMSO
não foi superior a 5% e a solução nesta porcentagem foi utilizada como
controle negativo.
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, culturas de 24 horas
dos microrganismos foram transferidas para tubos contendo 10 mL de solução
salina esterilizada. A suspensão foi padronizada por comparação com um tubo
0,5 da escala de McFarland (0,1 mL de uma solução 1% de Cloreto de Bário
(BaCl2) em 9,9 mL de uma solução 1% de H2SO4). Em seguida, foram
realizadas diluições sucessivas em solução salina e por fim em caldo Triptona
Soja, de modo a fornecer um inóculo com uma concentração aproximada de 5
x 105 UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia/mL).
18
Em microplacas esterilizadas de 96 poços foi adicionado um total de 100
μL contendo caldo Triptona Soja, as suspensões dos microrganismos e as
soluções dos extratos e frações a serem avaliadas, de forma a se obter a
concentração final dos agentes antimicrobianos de 2000 µg/mL – 0,98 µg/mL,
enquanto o manool, por sua vez, foi avaliado na concentração de 400 µg/mL –
0,195 µg/mL permitindo determinar a concentração necessária para inibir o
crescimento dos microrganismos avaliados.
Em um dos poços de cada placa fez-se o controle da cultura, a qual
apresentou
crescimento
bacteriano
devido
à
ausência
de
agentes
antimicrobianos. Em outro poço fez-se o controle de esterilidade do caldo
Triptona Soja, e em outro, o controle do solvente (DMSO) utilizado para a
solubilização dos compostos testados. Como controle positivo, utilizou-se
clorexidina em uma faixa de concentração compreendida entre 59,0 µg/mL e
0,115 µg/mL, uma vez que esse é um agente antimicrobiano comumente
utilizado em produtos bucais (enxaguatórios e cremes dentais) para controle
das cáries.
As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Posteriormente,
adicionou-se a cada poço, 30 μL de uma solução aquosa 0,02% de resazurina,
sendo as placas reincubadas por 3 horas. Logo após, foram retiradas para a
leitura, observando - se visualmente a presença da coloração azul (coloração
da solução de resazurina) representou ausência de crescimento bacteriano
enquanto a coloração rosa o crescimento dos microrganismos.
3.3.2. Determinação da Concentração Bactericida Mínima
19
A Concentração Bactericida Mínima (CBM); é definida como a menor
concentração do composto capaz de matar 99,99% ou mais dos inóculos, ou
seja, demonstra o efeito bactericida do extrato ou composto puro avaliado.
Os valores de Concentração Bactericida Mínima foram determinados em
sequência a partir da metodologia descrita no item anterior (item 3.3.1),
lembrando que, antes de adicionar a resazurina para determinar CBM, uma
alíquota de cada poço das soluções teste foram assepticamente removida de
todos os poços e em seguida transferida para um novo meio de cultura
esterilizado. O meio foi novamente incubado a 37ºC por 24 horas. A menor
concentração que evitou o crescimento dos microrganismos foi caracterizada
como sendo a CBM.
3.3.3. Avaliação da cinética antimicrobiana (Curva de morte)
Por fim, a cinética da atividade bactericida (tempo de morte) foi avaliada
somente para Streptococcus. mutans frente a SODH2 e o manool. Esse
experimento foi realizado no sentido de avaliar o tempo necessário para as
amostras em questão provocarem a morte dos microrganismos. Para isso,
culturas jovens de Streptococcus mutans foram diluídas até uma concentração
de 5 X 105 UFC/mL e ressuspendidas em soluções salina com tampão fosfato.
Após a adição da amostra a ser testada na sua CBM, foram retiradas alíquotas
em três tempos (6, 12 e 24 horas) e colocadas em placas contendo meio BHI
para contagem de colônias. Todo o procedimento foi realizado em triplicata e
submetido à análise estatística de acordo como previamente estabelecido por
D'Arrigo et al. [67].
20
3.4. Desenvolvimento e validação do método analítico por CLAE.
Para esta etapa do trabalho, foi utilizado um sistema de cromatografia
líquida de alta eficiência (Shimadzu, Tóquio, Japão) com duas bombas modelo
LC-20A Prominence composto de um injetor automático SIL-20A, forno para
coluna CTO-20A, módulo de controle CBM-20A, degaseificador DGU-20A3 e
detector de fotoarranjo de diodos SPD-M20A. O processamento dos dados foi
realizado com o software LC solution® versão 1.25 e as análises foram
realizadas numa coluna Shim-pack CLC-ODS (25 cm X 4.6 mm de d.i.; 5 µm;
Shimadzu).
Visando o desenvolvimento do método analítico, foram realizados
experimentos preliminares baseados no gradiente exploratório descrito por
Snyder & Dolan [68] para estimar as melhores condições. Para isto, 0,00482 g
de SODH2 e 0,00075 g de ent-caur-16(17)-en-19-oato de metila (Padrão
interno -PI); Figura 7); respectivamente 964,0 µg/mL e 150,0 µg/mL) foram
solubilizados em 5 mL de acetonitrila num balão volumétrico. Em seguida, 20
µL desta solução foi injetada no cromatógrafo utilizando um sistema gradiente
de eluição conforme o gráfico da Figura 6 , vazão a 1,0 mL/min, temperatura
da coluna de 40 oC e detecção em 201 nm.
21
100
90
80
% AcN
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
t (min)
Figura 6: Gradiente exploratório proposto por Snyder & Dolan [68]
Após a avaliação dos parâmetros cromatografados, foi estabelecido um
sistema isocrático de eluição com 90% de acetonitrila em água contendo 0,1%
de ácido acético a uma vazão 1,0 mL/min. Utilizou-se uma temperatura de
40oC para a coluna e a detecção foi realizada em 201 nm. As amostras foram
preparadas dissolvendo-se 964,0 µg/mL de SODH2 e 150,0 µg/mL do padrão
interno (PI; ent-caur-16(17)-en-19-oato de metila) em acetonitrila e filtrados em
um filtro do tipo seringa UNIFLO 25/02 PTFE (Whatman/Schleicher & Schuell,
Maidstone, UK).
H
COOCH3
Figura 7: Estrutura do Padrão interno (ent-caur-16(17)-en-19-oato de metila)
A seletividade do método foi atestada através da pureza espectral dos
picos de manool em todas as amostras. Os espectros combinaram-se
22
exatamente, demonstrando que não foram encontradas outras substâncias coeluindo com manool.
Para obtenção da curva de calibração, foram preparadas soluções de
manool em acetonitrila (500,00; 400,00; 300,00; 200,0; 100,00; 80,00; 40,00 e
20,00 µg/mL) conforme o esquema de diluições demonstrado na Figura 8.
0,025 g de manool
Soluçãomãe
(SM)
50 mL AcN
500 g/mL
4 mL
5 mL AcN
400 g/mL
1 mL
3 mL
2 mL
5 mL AcN
300 g/mL
5 mL AcN
5 mL AcN
200 g/mL
100 g/mL
1 mL
1 mL
5 mL AcN
80 g/mL
1 mL
5 mL AcN
40 g/mL
5 mL AcN
20 g/mL
Figura 8: Esquema de diluições de manool para elaboração da curva de
calibração.
Posteriormente, alíquotas de 20 µL destas soluções foram injetadas em
triplicata no equipamento. Os dados obtidos foram utilizados para construir a
curva de calibração em relação à concentração de manool. O coeficiente de
determinação (r2) e a equação da reta foram calculados utilizando-se o
programa Microsoft Excel®, logo após, o coeficiente de correlação linear (r) foi
23
calculado extraindo a raiz do r2, gerando um bom coeficiente de correlação
linear sendo igual a r = 0,9985.
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram determinados
com base no desvio padrão relativo da resposta (σ) e na inclinação da curva de
calibração (S) através das seguintes fórmulas: LD = 3,3 σ/S e LQ = 10 σ/S.
A precisão intra-dia foi determinada através da análise de seis amostras
e a precisão inter-dias foi analisada em dois dias consecutivos. A partir dessas
análises foram calculadas a concentração de manool em SODH2 e o
respectivo desvio padrão relativo (DPR%). Para verificação da precisão interdias, as médias das concentrações de manool entre os dois dias foram
comparadas através de teste t (p<0,05) utilizando-se o programa GraphPad
Prism®.
Para determinar a exatidão foi empregado o método da adição de
padrão, desta forma a exatidão é determinada através da concordância das
concentrações medidas e nominais do analito na amostra adicionada. Neste
sentido, amostras foram preparadas a partir da adição de manool em SODH2
em três níveis (baixo, médio e alto) de concentrações conhecidas,
respectivamente 25, 50 e 100% da concentração determinada para manool em
SODH2 no ensaio de precisão intra-dia e então analisadas. E a partir dos
dados gerados a exatidão foi então calculada utilizando a seguinte fórmula:
E (%) 
(X1  X )
X 100
X
Sendo dada em porcentagem, onde X1 é a concentração de manool nas
amostras preparadas com os teores conhecidos adicionados do mesmo, e X é
a concentração de manool de referência (concentração obtida na precisão). A
faixa de aplicação que demonstra o valor superior e inferior do manool é
24
especificada pela ANVISA compreendendo um intervalo de 80 – 120% para
medicamentos e determinação de impurezas. A Figura 9, a seguir, apresenta o
esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e exatidão
do método analítico.
0,00482 g de SODH2
+
0,00075 g de Caurenoato de metila
Amostra
Precisão
Intra-dia: Injetou 20L da amostra 18 vezes
Inter-dias: Injetou 20L da amostra 18 vezes
após finalização exatidão
5 mL AcN
964 g/mL
500 L amostra
Alta Concentração
(100% de manool)
1000 L padrão
500 L amostra
+
300 L AcN
Média Concentração
(50% de manool)
500 L amostra
+
450 L AcN
Baixa Concentração
(25% de manool)
700 L padrão
Exatidão
Injetou cada concentração
(alta, média e baixa) em triplicata
550 L padrão
0,0025 g de manool
Padrão
5 mL AcN
500 g/mL
Figura 9: Esquema de preparo das amostras para determinação da precisão e
exatidão do método analítico
A robustez do método cromatográfico foi determinada segundo o design
experimental de Plackett-Burman descrito por Heyden et al.[69]. Para isso,
foram selecionados aleatoriamente fatores operacionais relacionados ao
método cromatográfico tais como: vazão da fase móvel, temperatura da coluna,
porcentagem do solvente orgânico na fase móvel (%B), comprimento de onda
do detector e volume da amostra injetada (Tabela 2).
25
Tabela 2: Fatores e níveis investigados no teste de robustez
Fatores
Vazão da fase
móvel
Temperatura da
coluna
Porcentagem de
solvente orgânico
na fase móvel
(%B)
Comprimento de
onda do detector
Volume de
amostra injetado
Abreviação Unidades Limites
Vaz.
± 0.1
0.9
1.1
1.0
o
C
±5
35
45
40
%B
%
±1
89
91
90
λ
nm
±5
196
206
201
Inj.
µL
±1
19
21
20
Temp.
mL/min
Nível Nível
Nominal
(-1)
(+1)
Foram estabelecidos então, níveis de variação para cada um desses
fatores a partir do método desenvolvido. Esses níveis foram representados
como (-1) e (+1), quando relativos respectivamente a variações abaixo e acima
dos valores nominais (Tabela 3) e foram divididos em oito experimentos,
conforme estipulado pelo design experimental de Plackett-Burman [69]. Deve
ser mencionado que dois fatores fictícios foram adicionados de modo a atingir a
saturação do design experimental. Cada experimento foi conduzido conforme
as variações pré-definidas para os limites de variação −1 e +1 de cada fator e
uma das respostas y foram obtidas ao fim de cada um destes experimentos
(Tabela 3).
26
Tabela 3: Design experimental de Plackett–Burman para 7 fatores e 8
experimentos [69]
Experimento
no.
1
2
3
4
5
6
7
8
A
B
Vel.
Temp.
+1
-1
-1
+1
-1
+1
+1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
-1
+1
-1
Fatores
C
D
Fictício
%B
1
+1
-1
+1
+1
+1
+1
-1
+1
-1
-1
+1
-1
-1
+1
-1
-1
E
F
λ
Inj.
+1
-1
+1
+1
+1
-1
-1
-1
-1
+1
-1
+1
+1
+1
-1
-1
G
Fictício
2
-1
-1
+1
-1
+1
+1
+1
-1
Resposta
y1
y2
y3
y4
y5
y6
y7
y8
As respostas selecionadas para o estudo de robustez foram a área do
pico e o tempo de retenção relativo (trr) do manool. Entre as oito respostas
obtidas, o efeito estimado foi calculado para cada fator levando-se em conta as
respostas selecionadas conforme a seguinte equação:
Ex 
 y (  )   y ( ) ,
N /2
N /2
Para qual E é o efeito estimado para a resposta selecionada x; x é a
área do pico ou o trr para manool; ∑y(+) é a somatória das respostas em nível
positivo; ∑y(−) é a soma das respostas em nível negativo e N é o número de
experimentos. Para melhorar a interpretação dos resultados para os estudos de
robustez, o efeito estimado Ex foi convertido utilizando-se a equação DPR% =
(S/X) 100 onde DPR% é o desvio padrão relativo, S é o valor de Ex e X
representa as médias das respostas y, considerando-se diferentes respostas e
fatores.
27
4.Resultados e discussão
28
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.
4.1. Isolamento e identificação estrutural do manool.
O espectro de RMN-1H do manool obtido pelo fracionamento (fração
SODH2.3) (Figura 10) exibiu quatro sinais bastante característicos de
hidrogênios metílicos na região compreendida entre δ 1,50 e 0,50 , onde o sinal
da metila em δ 1,27 (s) foi atribuído aos hidrogênios do carbono 16, o sinal em
δ 0,86 (s) aos hidrogênios do carbono 18, o sinal em δ 0,79 (s) aos hidrogênios
do carbono 19. Por fim, o sinal em δ 0,67 (s) foi atribuído aos hidrogênios
metílicos ligados ao carbono 20. Observa-se ainda vários sinais relativos a
hidrogênios vinílicos na região entre δ 6,00 e 4,50 e um padrão complexo de
sinais equivalentes a carbonos saturados na região entre δ 2,40 e 0,80.
Associando-se tais dados ao fato de que plantas do gênero Salvia produzem
diterpenos [26,46,47], inferiu-se que a substância da fração SODH2.3 possuía
esse tipo de estrutura.
29
1.27
RCSV2.001.ESP
1.0
0.9
0.86
0.79
0.67
0.8
H14
OH
16
14
13
0.6
12
20
11
H15a
15
H15b
H17a
17
0.5
2
3
0.4
5.22
5.17
5.06
5.03
4.81
4
10
9
5
6
8
H17b
7
18
2.39
2.34
0.2
1
4.51
19
0.3
5.96
5.92
5.90
5.86
Normalized Intensity
0.7
0.1
0
1.00
7.0
6.5
6.0
1.00 1.03 1.02 1.02
5.5
5.0
4.5
0.96
4.0
3.5
3.0
Chemical Shift (ppm)
2.5
0.91
2.0
3.76 3.17 3.23 3.26
1.5
1.0
0.5
0
Figura 10: Espectro de RMN-1H do manool (400 MHz; CDCl3)
30
Ampliando a região entre δ 6,00 e δ 4,00 observam-se com maior nitidez
os padrões de acoplamento dos hidrogênios vinílicos (Figura 11) e nota-se que
os hidrogênios em δ 5,91 (dd), δ 5,04 (dd) e δ 5,19 (dd) encontram-se
acoplados entre si em um padrão característico de duplas exocíclicas
terminais, podendo ser atribuídos aos hidrogênios dos carbonos 14, e 15 (15a e
15b), respectivamente. Os hidrogênios em δ 4,81 (d) e δ 4,51 (d) exibem
acoplamento geminal (J= 1,56 Hz), compatível com duplas que possuem
apenas dois hidrogênios no mesmo carbono, sendo estes atribuídos aos
hidrogênios do carbono 17 (17a e 17b, respectivamente). Assim, é possível
estabelecer que a substância em questão possui dois sistemas de duplas
ligações.
RCSV2.001.ESP
1354.10
1352.85
1445.22
1443.66
1519.01
1508.25
1787.53
1776.76
1770.05
1759.44
Normalized Intensity
0.15
1569.57
1568.16
1552.09
1550.84
0.20
0.10
0.05
0
5.9
5.8
5.7
5.6
5.5
5.4
5.3
5.2
5.1
Chemical Shift (ppm)
5.0
4.9
4.8
4.7
4.6
4.5
Figura 11: Ampliação da região entre δ 6 - δ 4 mostrando os sistemas de
duplas ligações do manool.
Analisando-se o espectro de RMN-13C desse composto (Figura 12),
nota-se a presença de um sinal em δ 73,5, compatível com carbonos
carbinólicos. Além disso, nesse mesmo espectro, foi possível verificar a
presença de quatro carbonos característicos de duplas ligações na região
31
compreendida entre δ 150,0 e δ 105,0. Finalmente, percebe-se também neste
espectro a ausência de sinais relativos a carbonos carbonílicos.
32
33.49
12
H15b
H17a
17
19
4
10
9
5
6
8
H17b
33.58
2
1
7
73.50
145.21
11
18
77.42
77.00
0.5
20
3
148.52
Normalized Intensity
0.7
0.6
106.44
0.8
15
24.35
21.67
19.32
H15a
13
14.38
14
27.54
0.9
17.62
H14
OH
16
42.12
38.98
38.28
1.0
57.22
55.49
111.48
RCSV2.015.ESP
0.4
0.3
0.2
0.1
0
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
Chemical Shift (ppm)
50
40
30
20
10
0
Figura 12: Espectro de RMN-13C do manool (100MHz, CDCl3).
33
A análise inicial dos espectros de RMN de 1H e de
13
C permitiu concluir
que, muito provavelmente, a fração SODH2.3 é um álcool diterpênico, com
duas duplas ligações, sendo uma delas terminal em uma cadeia lateral. Após
busca na literatura científica por diterpenos com essas características, chegouse à estrutura do manool (Figuras 2 ou inserida nas Figuras 10 e 12), cuja
abundância em Salvia officinalis foi discutida na “Introdução”. A comparação
dos dados espectrais experimentais com os da literatura científica (Tabelas 4 e
5) [70,71] confirmam a identificação estrutural.
Tabela 4: Dados de RMN-1H (em δ) do manool
H
Literatura [72]
(200MHz; CDCl3)
14
5,91 dd; 1H; vinílico
15a
5,05 ; 1H; vinílico
15b
5,21 dd; 1H, vinílico
16
17a
17b
18
19
20
1,26 s; 3H; metílico
4,8 br s; 1H; vinílico
4,47 br s; 1H; vinílico
0,87 s; 3H; metílico
0,78 s; 3H; metílico
0,67 s; 3H, metílico
1
Experimental (400 MHz; CDCl3)
5,91 dd;1H; (J14, 15b= 17,5 Hz; J14, 15a= 10,6
Hz)
5,04 dd; 1H; (J15a,14= 10,6 Hz; J15a,15b= 1,4
Hz)
5,19 dd; 1H; (J15b,14= 17,5 Hz; J15b,15a = 1,4
Hz)
1,27 s; 3H
4,81 d; 1H; (J17a,17b= 1,5 Hz)
4,51 d; 1H; (J17b, 17a= 1,5 Hz)
0,86 s; 3H
0,79 s; 3H
0,67 s; 3H
34
Tabela 5: Dados de RMN-13C (em δ) do Manool
13
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Experimental
(100 MHz;
CDCl3)
39,0
39,7
19,0
19.3
42,1
42,1
33,5
33,5*
55,5
55,5
24,4
24,3
38,3
38,3
148,4
148,5
57,2
57,2
39,8
39,8
17,6
17,6
41,3
41,2
73,4
73,5
144,9
145,2
111,4
111,5
27,9
27,5
106,2
106,4
33,5
33,5*
21,7
21,7
14,4
14,4
*Podem ser trocados entre si.
Literature [70]
(25 MHz; CDCl3)
4.2. Avaliação da atividade antimicrobiana
Conforme esperado, a análise da Tabela 6 revela que manool apresenta
menores valores de CIM quando comparados com SODH2 para todas as
bactérias avaliadas. Alguns autores sugerem [64,65] que frações como SODH2
são promissoras na busca de novos e efetivos agentes antimicrobianos em
concentrações muito maiores (até 100 μg/mL) que as requeridas para
substâncias isoladas como o manool (até 10 μg/mL). Assim, os resultados
assinalam a importância de ambos os derivados vegetais (SODH2 e manool)
na busca por novos e efetivos agentes antimicrobianos. O controle negativo
35
(solução de DMSO 5%) não afeta o crescimento dos microrganismos, e o
Dicloridrato de clorexidina (CLE) foi utilizado como controle positivo.
Tabela 6: Valores obtidos para CIM do manool e de SODH2 frente a patógenos
bucais
Bactéria (ATCC)
S. mutans (25275)
S. salivarius
(25975)
S. sanguinis
(10556)
S. sobrinus
(33478)
S. mitis (49456)
L. casei (11578)
CLE*
0,92
CIM em µg/mL
MO
6,24
SODH2
15,68
0,92
24,96
31,36
3,69
12,48
15,68
0,92
24,96
31,36
3,69
0,92
12,48
12,48
15,68
31,36
Tabela 7: Valores obtidos para CBM do manool e de SODH2 frente a
patógenos bucais
Bactéria (ATCC)
S. mutans (25275)
S. salivarius
(25975)
S. sanguinis
(10556)
S. sobrinus
(33478)
S. mitis (49456)
L. casei (11578)
CLE*
3,69
CBM em µg/mL
MO
6,24
SODH2
15,68
0,92
49,92
31,36
3,69
12,48
15,68
0,92
24,96
31,36
3,69
0,92
12,48
12,48
15,68
62,72
Visando uma melhor compreensão da atividade antimicrobiana, foram
conduzidos experimentos para determinar o tempo necessário para que
manool e SODH2, em suas respectivas CBMs (Tabela 7) levam para matar
completamente o microrganismo considerado como o agente causador primário
da cárie [10]. A Figura 13 mostra que o controle positivo (CLE) matou S.
36
mutans na menor concentração (3,69 µg/mL) após 24 horas. Em sua CBM, o
manool (6,24 µg/mL) necessitou de 6 horas para matar completamente a
bactéria. Já SODH2 necessitou de 12 horas, numa concentração duas vezes
maior que sua CBM (31,36 µg/mL). Considerando-se o relativamente curto
período de tempo em que os princípios ativos de produtos de higiene bucal
permanecem em seu local de ação, pode-se considerar que esses resultados
denotam o potencial de Salvia officinalis na busca de novos princípios ativos
anticariogênicos.
Manool (A)
SODH2 (B)
10
10
8
Controle Negativo
CHD (3.69 g mL -1)
Manool (6.24 g mL -1)
Manool (12.48 g mL -1)
Manool (18.72 g mL -1)
6
4
2
Log10 UFC mL-1
Log10 UFC mL -1
8
Controle Negativo
CHD (3.69 g mL -1 )
SODH2 (15.68 g mL -1 )
SODH2 (31.36 g mL -1 )
SODH2 (47.04 g mL -1 )
6
4
2
0
0
5
10
15
Tempo (horas)
20
25
0
0
5
10
15
20
25
Tempo (horas)
Figura 13: Curvas de morte obtidas para o manool (A) e SODH2 (B) frente a
Streptococcus mutans usando dicloridrato de clorexidna (CLE) e DMSO 5%
como controles positivo e negativo, respectivamente.
4.3. Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE.
As análises foram realizadas conforme descrito no item “Material e
métodos”. A Figura 14 apresenta um cromatograma típico de SODH2
juntamente com o respectivo espectro de UV relativo ao pico de manool para
assegurar sua pureza espectral e, consequentemente, a seletividade do
método.
37
Figura 14: Cromatograma obtido por CLAE referente a SODH2, obtido nas
condições estabelecidas (sistema isocrático de eluição composto de 90%
acetonitrila em água contendo 0.1% de ácido acético numa vazão de 1.0
mL/min, temperatura da coluna de 40 oC e detecção a 201 nm. No detalhe, o
espectro de UV do manool.
Foi gerado o coeficiente de determinação (r2 = 0,9971) que expressa a
proporção de variação de y em função de x, e um bom coeficiente de
correlação linear (r = 0,9985) para o gráfico da concentração versus área do
pico de manool [60], conforme pode ser observado na curva de calibração
exibida na Figura 15.
38
Figura 15: Curva de calibração do manool, constando a equação de regressão
linear e o coeficiente de correlação linear r.
A Figura 15 apresenta ainda a equação de regressão linear, para a qual
y é a resposta do detector (área) e x é a concentração de manool (em µg/mL).
Os valores de LD e LQ encontram-se listados na Tabela 7 e indicam que o
método desenvolvido é bastante sensível [60].
39
Tabela 8. Parâmetros analíticos de LD, LQ, precisão, exatidão e robustez da
SODH2 obtidos para o método desenvolvido.
Parâmetros
trra
trr
Ex em trr Concentração Concentração
DPR%
DPR%
(µg mL-1)
DPR%
LQ
0.382
LD
0.126
Precisão
Intra-dia
0.594 0.008
174.362
Inter-dias
0.594 0.010
174.028
Exatidãob
Baixa
0.593 0.009
212.737
Média
0.593 0.019
254.138
Alta
0.593 0.021
333.639
Robustez
Vel.
0.116
Temp.
-4.353
%B
-2.511
λ
-0.010
Inj.
-0.038
a
Tempo de retenção relativo calculado em relação ao PI;
Ex em
Área do
pico
DPR%
0.067
0.217
0.018
0.032
0.046
-19.621
2.134
4.306
-50.590
10.289
b
Valores obtidos em
relação à concentração intra-dia.
A precisão intra-dia foi determinada pela análise do princípio ativo
(manool) em seis amostras de SODH2, e a precisão inter-dias foi investigada
em dois dias consecutivos. As concentrações obtidas e os respectivos valores
de desvio de padrão relativo (DPR%) também encontram-se na Tabela 8.
Todos os valores de DPR% das concentrações de manool foram menores que
5% [60] e a média obtida em dias diferentes não diferiu estatisticamente
(p<0,05).
A Tabela 8 ainda mostra as concentrações obtidas pela adição de
quantidades conhecidas de manool em SODH2 nas concentrações baixa,
média e alta (respectivamente 43,590; 87,181 e 174,362 µg/mL), analisadas
em triplicata cada uma, visando a determinação da exatidão do método. Assim
40
como observado no estudo de precisão, os valores de DPR% também foram
menores que 5%, e a faixa de aplicação compreende um intervalo de 88,036 –
91,507% demonstrando a proximidade com o valor de referência, indicando
que os resultados foram adequados para os propósitos analíticos do método
desenvolvido [60].
O teste de robustez visa investigar potenciais fontes de variação através
da avaliação de um ou de um conjunto de respostas relativas ao método. Para
investigar estas fontes de variação, seleciona-se uma série de fatores que são
então submetidos a pequenas variações controladas. Geralmente estas
variações tem como objetivo emular a perspectiva de uma dada oscilação
quando o método é aplicado em outros equipamentos ou mesmo outros
laboratórios. Seguindo a metodologia descrita para o parâmetro robustez no
item “Material e métodos”, os efeitos (Ex) foram calculados e convertidos para
DPR% para cada resposta estudada relativa ao manool. Os fatores
“comprimento de onda do detector”, “vazão da fase móvel” e “volume de
amostra injetado” foram sensíveis em relação à resposta “área do pico” com
valores de DPR% de 50, 19 e 10% respectivamente. Os demais valores de
DPR% das respostas restantes foram inferiores a 10%. Levando-se em conta o
design experimental executado e o número de variáveis envolvidas, considerase que esses valores são aceitáveis até um limite de 20% [69]. É necessário
ressaltar que o alto valor de DPR% obtido para as respostas relacionadas à
área do pico (50%) se devem ao perfil agudo do espectro de UV do manool
(Figura 14). Observando-se a Figura 14, pode-se notar que pequenas
variações no comprimento de onda podem acarretar em grandes mudanças na
absorbância.
41
Em termos gerais, os resultados obtidos nos estudos de validação
permitem considerar que o método desenvolvido é adequado para utilização
em diferentes laboratórios e atende aos requisitos preconizados no “Guia para
validação de métodos analíticos e bioanalíticos” contido na Resolução
899/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) [60].
Finalmente, considerando-se que a amostra de SODH2 é preparada numa
concentração de 964 µg/mL e que a concentração de manool nesta amostra é
de 174,362 µg/mL, conforme determinada nos estudos de precisão intra-dia,
podemos concluir que a porcentagem de manool (marcador químico) é de 18%
em SODH2. Dessa forma, demonstra-se que todos os objetivos propostos no
desenvolvimento de um método analítico por CLAE para SODH2 foram
atingidos.
42
5.Conclusão
43
5. CONCLUSÃO.
A estratégia de estudo fitoquímico biomonitorado permitiu não só
identificar o diterpeno manool como principal responsável pela atividade
antibacteriana in vitro frente a bactérias causadoras de cárie, como também
permitiu propor a fração SODH2 como outro derivado vegetal com potencial
utilização no combate à cárie.
Os estudos analíticos permitiram determinar um método validado para
determinar o teor de manool nesta fração, adequando-a as crescentes
demandas por qualidade e segurança, no caso de uma futura confirmação de
seu uso potencial.
Como perspectivas futuras pretende-se preparar formulações contendo
o manool ou a fração SODH2 e realizar testes clínicos em pacientes
voluntários.
44
6. Referências
45
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