Yersinia enterocolitica IgA ELISA

Instruções de Utilização
Yersinia enterocolitica
IgA ELISA
Ensaios imunoenzimáticos (tiras da microplaca) para a determinação
qualitativa e quantitativa de anticorpos IgA contra
Yersinia enterocolitica em soro e plasma humanos.
RE56971
12x8
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
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Yersinia enterocolitica IgA ELISA (RE56971)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
Ensaios imunoenzimáticos (tiras da microplaca) para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos
IgA contra Yersinia enterocolitica em soro e plasma humanos.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
Os germes patogénicos Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica e Y. ruckeri pertencem ao
género Yersinia como um membro da família dos enterobacteriaceae. Todas as espécies de importância
médica ocorrem facultativamente no interior das células, o que leva à inflamação característica do tecido
linfático no curso de uma doença. O Yersinia enterocolitica é absorvido por via oral e os sintomas do
paciente são ileíte terminal, bem como a diarreia. É difícil fazer uma separação da apendicite por
diagnóstico diferencial. No decurso de uma reacção imunológica retardada, podem surgir manifestações
extra-intestinais como eritema nodoso, uveíte e artrite. Foi alegado que os antecedentes de uma artrite
reactiva provocada por Yersinia consistem na síntese local de anticorpos nas articulações (líquido sinovial).
O Yersinia pode ser caracterizado sem problemas por testes bacterianos, após isolamento em cultura pura.
Na sequência de uma doença humana, acima de todos, foram encontrados os sorotipos O3, S8 e S9. As
reactividades cruzadas à Brucella são descritas e têm de ser tomadas em consideração no diagnóstico
diferencial. O método de detecção sorológica clássico sempre foi o teste de Widal. Métodos cada vez mais
populares são os HAT, o teste KBR, bem como o ELISA. O ensaio imunoenzimático caracteriza-se, por um
lado, por uma elevada sensibilidade, mas também pela possibilidade de diferenciar entre anticorpos IgG e
IgA / IgM. As categorias de imunoglobulinas IgM e IgA devem ser referidas como um critério de
interpretação de um processo activo, quando se suspeita de uma doença artrítica. Como também existe
uma semelhança imunológica com o receptor do TSH, o teste também pode ser empregado para a
confirmação da doença auto-imune de Graves. Como teste de confirmação com a possibilidade de
identificação de proteínas de bactérias separadas, bem como a exclusão de reactividade cruzada, o
método Western Blot foi bem sucedido.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) em fase sólida baseado no princípio de sandwich. Os
poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços revestidos com
antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) específico para IgA
humanos. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de
IgA-anticorpos específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente
usando a curva padrão.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto
informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana
após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para
reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não
utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis
e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja
MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para
este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo
com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN3) como conservante. Em caso de contacto com os olhos
ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN3 pode reagir com o chumbo e o cobre da
canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com
grande volume de água para evitar a formação dos compostos.
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PORTUGUÊS
10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram
considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto
a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com
potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 °C. Mantenha-o longe do calor ou
da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos
nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente
fechada, quando armazenada a 2-8 °C.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Soro, Plasma (EDTA, Heparina)
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade
química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize
amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser
centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento:
Estabilidade:
7.
2-8 °C
2 dias
-20 °C
> 2 dias
Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente.
MATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 15 mL
ENZCONJ IgA
1 x 4 x 2 mL
CAL A-D
1 x 60 mL
DILBUF
1 x 60 mL
WASHBUF CONC
1 x 15 mL
TMB SUBS
Solução de Substrato TMB
1 x 15 mL
TMB STOP
Solução de Paragem TMB
2x
FOIL
Película Aderente
BAG
Saco Plástico
1x
8.
Componente
Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos.
Conjugado Enzimático IgA
Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: anti-humano IgA, conjugado com
peroxidase, tampão contendo proteína, estabilizantes.
Padrão A-D
1; 10; 50; 200 U/mL. Pronto a usar.
Padrão A = Controlo Negativo
Padrão B = Controlo „Cut-off“
Padrão C = Controlo positivo fraco.
Padrão D = Controlo Positivo
Contêm: IgA anticorpos contra Yersinia, PBS, estabilizantes.
Tampão de Diluição
Pronto a usar. Contêm: PBS Tampão, BSA, < 0.1 % NaN3.
Tampão de Lavagem, Concentrado (10x)
Contêm: PBS Tampão, Tween 20.
Pronto a usar. Contêm: TMB.
Pronto a usar. 0.5 M H2SO4.
Para tapar a Microplaca durante a incubação.
Resselável. Para armazenamento a seco de tiras não usadas.
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 50; 100; 500 µL
Proveta
Tubos (1 mL) para diluição de amostras
Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático
Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de
referência 600-650 nm)
7. Água bidestilada ou desionizada
8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
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PORTUGUÊS
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os
resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os
passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize
apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os
reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo
apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar
(18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar.
Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para
cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não
reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
5. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma
ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a
pipetagem das soluções nos poços.
6. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É
recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não
permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e
aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são
cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
7. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os
tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
10.1. Preparação de Componentes
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas.
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).
Diluir /
dissolver
Componente
20 mL
WASHBUF
CONC
Diluente Relação
200 mL
agua
bidest.
1:11
Observações
Aquecer até 37 °C para
dissolver cristais.
Misturar energicamente.
Armazenamento Estabilidade
2-8 °C
8 sem
10.2. Diluição de Amostras
Amostra
Soro / Plasma
diluir
com
Relação
Observações
geralmente
DILBUF
1:101
p.ex. 5 µL + 500 µL DILBUF
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente
diluídas.
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PORTUGUÊS
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
1. Pipetar 100 µL de cada Padrão e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. No
teste qualitativo apenas é utilizado o Padrão B.
2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a 18-25 °C.
3. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µL de Solução de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
4. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.
5. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min a 18-25 °C.
6. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µL de Tampão de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem.
Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
8. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço.
9. Incubar 20 min a 18-25 °C no escuro (sem película aderente).
10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB a cada poço.
Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para
amarelo.
11. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência:
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.
12.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste são válidos apenas se o teste tiver sido executado seguindo as instruções. Além
disso, o operador deve seguir estritamente as regras de GLP (Good Laboratory Practice) ou outros
padrões/leis aplicáveis. Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis
como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não
é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É
recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos
reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e
métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
A avaliação do teste pode ser feita quer quantitativamente quer qualitativamente.
13.1. Avaliação Qualitativa
O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a
partir das densidades ópticas médias da amostra e do Valor do Cut-off. Se a densidade óptica da amostra
estiver num intervalo de 20% á volta do Valor de Cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada
como equívoca. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas.
O Índice de Cut-off (COI) das amostras pode ser calculado da
seguinte forma:
COI =
DO Amostra
DO Padrão B
13.2. Avaliação Quantitativa
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo
dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Ao
utilizar um programa de computador, são recomendados os métodos "Cubic-Spline" ou "Ponto a Ponto",
uma vez que fornecem a máxima precisão na avaliação dos dados de medição comparando com outros
modelos de avaliação.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar
um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado).
A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
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Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras
com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como
descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
(OD)
2.000
Curva de Calibração Típica
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão
A
B
C
D
14.
U/mL
1
10
50
200
1.500
DOMédia
0.043
0.444
0.816
1.679
1.000
0.500
0.000
1
10
100
1000
(U/mL)
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Método
Intervalo
< 8 U/mL
8 – 12 U/mL
> 12 U/mL
< 0.8
0.8 – 1.2
> 1.2
Quantitativa
(Curva Padrão)
Qualitativa
(Índice de Cut-off, COI)
15.
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Interpretação
negativo
indeterminado
positivo
negativo
indeterminado
positivo
Os resultados por si só não devem
ser a única razão para qualquer
acção terapêutica e deverão ser
correlacionados
com
outras
observações clínicas e testes de
diagnóstico.
VALORES ESPERADOS
Num estudo interno, indivíduos aparentemente saudáveis evidenciaram os seguintes resultados:
Ig Isotípico
n
IgA
88
16.
positivo
14.8 %
Interpretação
indeterminado
5.7 %
negativo
79.6 %
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E
ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito Hemoglobina
8.0 mg/mL
significativo (+/- 20 % do esperado nos resultados do teste Bilirrubina
0.3 mg/mL
até às concentrações descritas em baixo:
Triglicéridos
5.0 mg/mL
17.
DESEMPENHO
Especificidade Analítica Não foram detectadas reactividade
cruzadas com:
(Reactividade Cruzada)
Média (U/mL)
CV (%)
Precisão
36
10.3
Intra-Ensaio
27
10.3
Inter-Ensaio
Linearidade
Recuperação
Comparação Método
Usado versus ELISA
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Intervalo (U/mL)
2.5 – 147
88 – 107 %
Sensibilidade rel.
Especificidade rel.
Helicobacter
Diluição em Série até
Intervalo (%)
1/8
65 - 116
% Recuperação após adição de “reforço” (n = 3)
> 95 %
> 95 %
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
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Rheumatic Diseases 45: 561-565 (1986)
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comparison of lipopolysaccharide and whole bacterium as antigen, J. Clin. Microbiol. 14(1): 6–14 (1981)
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enterocolitica Lipopolysaccharide in Human Sera by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, J. Clin.
Microbiol. 10(3): 279-284 (1979)
7. Heesemann, J. et al.: Experimental Yersinia enterocolitica infections; a model for human yersiniosis,
APMIS 101: 417 (1993)
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10. Luo, G. et al.: Purification and characterization of Yersinia enterocolitica proteins, J. Immunol. 152: 2555
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-Gesundheitsschutz 46: 949–955 (2003)
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enterocolitica Serotype 09 and Brucella Species by Immunoblot or Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay Using Whole Bacteria and Yersinia Outer Membrane Proteins, J. Clin. Microbiol. 28(7): 15701574 (1990)
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6/6
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
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IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
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+ 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11
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+1 (416) 645 -1703 Fax: -1704
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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
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