VERIFLOW® BRETT – Perguntas Frequentes

VERIFLOW® BRETT – Perguntas Frequentes
Breve resumo da tecnologia Veriflow® BRETT
A tecnologia Veriflow® BRETT envolve a amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) de um marcador
genético específico do genoma de Brettanomyces bruxellensis. Primers comerciais para PCR são utilizados
para marcar moléculas de DNA (ácido desoxirribonucleico), as quais servem como a “impressão digital” da
Brettanomyces em vinho e outras bebidas. Os genes amplificados são então transferidos para um cartucho
de fluxo vertical (ou cassette) para ler um resultado visual em 3 minutos. O aparecimento de uma linha
indica um teste negativo para Brett e duas linhas indicam uma amostra positiva para células viáveis de
Brett.
Nesta tecnologia patenteada de fluxo vertical, a amostra contendo o DNA de Brett amplificado flui
verticalmente e é capturado na zona de teste de uma membrana de nitrocelulose. Nanopartículas de ouro
coloidal de cor vermelha, permitem visualizar as partículas agregadas. Um material absorvente, absorve o
excesso de fluido, mantém o líquido dentro da cassette. A gravidade e a pressão formada nos cartuchos
ajudam a acelerar o processo, gerando resultados dentro de 3 minutos.
Em que difere a tecnologia de fluxo vertical da tecnologia de fluxo lateral (exemplo: teste de gravidez)?
A tecnologia de fluxo lateral envolve uma interação antigénio-anticorpo, que é menos sensível quando
comparada com tecnologias de deteção molecular. Adicionalmente, o fluido migra horizontalmente ao
longo da membrana de teste com probabilidade de refluxo, que pode originar um falso positivo ou
resultado inconclusivo.
Quais são as vantagens da deteção genética de Brett utilizando Veriflow®?
Identificam-se várias vantagens únicas na tecnologia Veriflow® BRETT, comparando com outros métodos
moleculares:
1. Quantificação específica e exata de Brettanomyces bruxellensis: A tecnologia Veriflow® requer
sequências de “primers” para se ligarem especificamente às moléculas de DNA, de forma a detetar
a Brett. Foram desenvolvidas análises rigorosas inclusivas e exclusivas, para assegurar a
identificação precisa e exata de células de Brettanomyces bruxellensis.
2. Deteção de Células Viáveis mas Não-Cultiváveis (CVNC): Sabe-se que a Brett resiste no vinho num
estádio de latência devido aos fatores de stress externos tais como o SO2, pH baixo e teor alcoólico.
Neste caso, as CVNC de Brett não podem ser identificadas pelos métodos de cultura tradicionais e
continuam a metabolizar nutrientes para produzir 4-etil-fenol e 4-etil-guaiacol. A tecnologia
Veriflow®deteta o DNA presente nas CVNC de Brett.
3. Sensibilidade aumentada: O protocolo utiliza um volume de amostra 25 vezes superior ao que é
utilizado por outros métodos moleculares, para concentrar níveis baixos de Brett que podem não
ser detetados num pequeno volume de amostra. Esta abordagem assegura a consistência e a
repetibilidade dos resultados.
4. Resultados em 4 horas: Com 3,5 horas de processamento automatizado da amostra, o Veriflow®
BRETT oferece o resultado mais rápido de teste PCR na indústria de vinhos, fornecendo ao enólogo
a informação crucial que permite a tomada de decisão. Em termos práticos, são necessários menos
de 30 minutos de trabalho direto.
5. Eliminação da preparação laboriosa da amostra: A nossa robusta formulação de reagentes PCR e
buffers tem a capacidade de ultrapassar o efeito inibitório dos compostos fenólicos presentes em
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vinhos tintos. Como resultado, eliminamos a necessidade de extração do DNA ou “purificação da
amostra” antes do PCR, etapa que é necessária nos demais métodos moleculares.
6. Flexibilidade do trabalho: Após a finalização dos programas BRETDIGEST e BRETPCR no
termociclador, as amostras são mantidas à temperatura de refrigeração (4oC) até que o operador
esteja pronto a processá-las. Isto permite tratar as amostras apenas quando for conveniente. As
amostras podem ser mantidas até 24 horas no termociclador no final dos programas mencionados.
O Veriflow® BRETT deteta todas as espécies de Brettanomyces?
Veriflow® BRETT é específico para Brettanomyces bruxellensis. Das 5 espécies pertencentes ao género
Brettanomyces, a principal responsável pela produção de fenóis voláteis é a B. bruxellensis.
O Veriflow® BRETT deteta células mortas de Brett?
Não. Este método apenas deteta as células vivas de Brett. Tratamento de vinhos tintos com SO2 e/ou
DMDC, vinhos com pH baixo e elevado teor alcoólico, resultam num meio desfavorável para o DNA
exposto de células mortas. O DNA deteriora-se rapidamente, ficando indisponível para que ocorram
reações por PCR.
Como quantificar a concentração Brett?
Estão disponíveis 2 opções:
1. Quantificação através de escala com indicações padrão: Fornecemos um cartão com 5 indicações
de concentrações celulares baseadas nas várias intensidades de cor da linha do teste. A
comparação visual do teste com as imagens do cartão permite a correlação com a concentração de
células de Brett por mL, no vinho em análise. A interpretação da linha do teste tem demonstrado
resultados muito precisos em laboratórios de enologia nos EUA.
2. Leitor Veriflow®: Este dispositivo é a mais recente ferramenta para fornecer resultados
quantitativos específicos de contaminação microbiana. Consiste num scanner de códigos QR de
utilização simples, que permite o registo de dados e a sua transferência para o software da adega.
Qual o limiar de deteção deste teste?
Este método é capaz de detetar Brett em concentrações entre 10-50 células/mL.
Como abordar a questão da contaminação cruzada dos produtos amplificados?
Incorporamos uma enzima, Uracil-DNA-Glicosilase (UDG), na formulação do reagente PCR para evitar a
contaminação cruzada. A enzima UDG destrói seletivamente produtos contaminantes do processo de
amplificação de reações prévias que possam causar resultados falsos positivos.
Recomenda-se um método específico para a amostragem?
É fundamental utilizar uma amostra de vinho homogénea. As células de Brett tendem a depositar no fundo
das barricas ou dos depósitos. Para se obter uma amostra representativa, sugerimos homogeneizar o
conteúdo da barrica antes de retirar a amostra. Se não for exequível a homogeneização, recomendamos
utilizar um tubo apropriado que consiga chegar ao fundo da barrica. Nota: é importante usar material
descartável ou desinfetar com etanol (conc. 70%), entre barricas.
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O meu vinho deu negativo com Veriflow® BRETT, mas positivo para 4-Etil-P e 4-Etil-G. Porquê?
Duas razões principais contribuem para esta observação:
1. Tratamentos químicos ou físicos: O tratamento de vinhos com SO2 , DMDC, Enartis Stab Micro, ou
a filtração prévia à análise com Veriflow®, vai remover as células de Brett do vinho, mas não os
fenóis voláteis.
2. Amostra não representativa: a Brett tende naturalmente a depositar-se no fundo da barrica ou
depósito, enquanto que os compostos 4-Etil-P e 4-Etil-G permanecem no vinho em suspensão. Se
uma amostra é retirada sem homogeneização do conteúdo da barrica, podem verificar-se
resultados inconsistentes.
Quais sãos as várias aplicações de Veriflow® BRETT?
O controlo sanitário e de qualidade é importante para manter os níveis de Brett controlados. Veriflow®
BRETT permite ao Enólogo adotar uma estratégia proativa na monitorização da Brett. A integração de um
programa de teste ambiental, promove a deteção precoce e a implementação de ações corretivas,
prevenindo contaminações e mantendo a qualidade geral do vinho.
De realçar algumas aplicações:
1.
2.
3.
4.
5.
Triagem do mosto antes da fermentação alcoólica;
Avaliação durante as fermentações alcoólica e a malolática;
Avaliação de vinhos trasfegados;
Triagem de vinhos para definição de lotes;
Avaliação de vinhos antes e após tratamentos físicos (colagens, filtrações de desbaste, de
clarificação ou esterilizante);
6. Avaliação de vinhos antes e após tratamentos químicos (SO2, Enartis Stab Micro, DMDC);
7. Avaliação de vinhos de barricas individuais ou grupadas;
8. Garantia da eficácia da higienização e desinfeção das barricas.
Quantos testes existem num kit?
Em cada kit, existem 24 testes, onde estão incluídos:
1.
2.
3.
4.
5.
24 Cassettes de teste Veriflow® BRETT
24 Reagentes DIGEST
24 Reagentes PCR
Buffer A
Buffer B
Quantas amostras podem ser avaliadas no Veriflow® Termocycler ao mesmo tempo?
O termociclador ou equipamento PCR pode processar até 24 amostras em simultâneo.
Quais os equipamentos e materiais necessários, que não são fornecidos no kit?
Os materiais necessários mas não incluídos no kit são:
i.
ii.
iii.
iv.
v.
Centrífuga capaz de centrifugar cones de 50 mL a 1800 RPM;
Tubos cónicos esterilizados de 50 mL;
Micropipetas capazes de transferir volumes de 5 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL;
Pontas de micropipetas compatíveis;
Congelador.
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Posso reutilizar os tubos cónicos?
Não. Para prevenir a ocorrência de falsos positivos, recomendamos descartar os tubos cónicos usados.
Posso utilizar pontas de micropipetas não esterilizadas?
Não. A utilização de pontas de micropipetas esterilizadas é altamente recomendada para prevenir
contaminações cruzadas nos buffers e a ocorrência de falsos positivos.
É necessário algum contrato de serviço ou de manutenção associado ao termociclador?
Não.
E se o equipamento avariar?
Se o equipamento avariar, contacte o seu suporte técnico da Enartis para o envio rápido de um
equipamento de substituição.
O que fazer se houver mau funcionamento da cassette de teste do Veriflow®? Tem que se repetir todo o
processo desde o início?
Se a cassette estiver danificada, pode ser reutilizada a amostra DIGEST a partir da análise no mesmo dia,
para se repetir a etapa de PCR, utilizando um novo tubo de PCR.
É fornecido um controlo positivo em cada kit? O que é o controlo positivo?
Controlos positivos são fornecidos sob pedido. É utilizado DNA purificado de Brettanomyces bruxellensis no
kit Veriflow® BRETT, como um amplificador positivo, para demonstrar o funcionamento adequado dos
componentes das reações e do equipamento PCR da Invisible Sentinel. Quando o controlo amplificador
positivo é analisado no teste Veriflow® BRETT, o aparecimento de 2 linhas vermelhas indica a amplificação
do PCR e permite verificar que quaisquer resultados negativos que ocorram em paralelo ao controlo
positivo, são negativos.
Quais são as condições de armazenamento para o kit?
As cassettes e os buffers podem ser armazenados à temperatura ambiente até 1 ano a partir da data de
fabrico. Os reagentes DIGEST e PCR devem ser armazenados no congelador até 1 ano a partir da data de
fabrico.
Para mais informações consulte o S/distribuidor autorizado:
ENARTIS PORTUGAL UNIP., LDA.
Tel. 00 351 220 992 192 | Fax. 00 351 220 932 076
Email. [email protected]
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