Capítulo 2 2

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Capítulo 22
Vacina recombinante com vetor da bouba de canário com os genes prM/E do vírus do
Oeste do Nilo protege eqüinos contra desafio com mosquito transmissor desse vírus
J. M. Minke1 , L. Siger 2 , K. Karaca2 , L. Austgen 3, P. Gordy 3, R. Bowen3 , R. W. Renshaw 4,
S. Loosmore 5, J. C. Audonnet 1, e B. Nordgren 6
Resumo
1
2
Merial SAS, Lyon, França
Merial Inc., Atenas, Geórgia, EUA
College of Veterinary Medicine and
Biomedical Sciences, Colorado State University,
Fort Collins, Colorado, EUA
3
4
College of Veterinary Medicine, Cornell
University, Ithaca, New York, EUA
5
Aventis Pasteur, Toronto, Canadá
6
Merial, Duluth, Geórgia, EUA
Foi desenvolvida uma vacina recombinante à base do vetor ALVAC (bouba de
canário) (vCP2017) que expressa os genes prM e E derivados de um isolado
do vírus do Oeste do Nilo (WNV) observado em Nova York em 1999, a qual foi
submetida a testes de eficácia na proteção de eqüinos em dois experimentos
diferentes. No primeiro, foi realizado um estudo da titulação da dose para
avaliar tanto as respostas dos anticorpos séricos neutralizantes ao WNV
como a duração da imunidade. No segundo experimento, foi verificado
quando se iniciava a proteção. Vinte e oito eqüinos adultos receberam duas
doses de vCP2017 administradas pela via intramuscular em intervalos de 5
semanas, e dezesseis eqüinos compunham o grupo-controle não vacinado,
pareado por idade. Amostras individuais de soro foram periodicamente
colhidas e testadas para verificar a presença de anticorpos neutralizantes
contra o WNV. Os eqüinos foram desafiados, permitindo-se que mosquitos
Aedes albopictus, infectados com o vírus WNV, neles se alimentassem por
um período de duas semanas (segundo experimento) ou um ano (primeiro
experimento) após a segunda vacinação. Após o desafio, os eqüinos foram
monitorados para verificar a ocorrência de sintomas da doença e amostras
de sangue foram colhidas para detecção de anticorpos e viremia do WNV.
Em ambos os experimentos, todos os eqüinos vacinados desenvolveram
anticorpos neutralizantes contra o vírus WNV. Nenhum dos animais vacinados
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Dados Importantes
• O Vírus do Oeste do Nilo (WNV), antes desconhecido no
Hemisfério Ocidental, foi identificado pela primeira vez na
América do Norte em 1999, tendo contaminado pessoas, pássaros
e eqüinos na cidade de Nova York e áreas circunvizinhas.
• Desde então, o vírus espalhou-se para praticamente todos os
estados nos EUA, afetando mais de 14 mil eqüinos somente em
2002, com uma taxa de mortalidade de aproximadamente 30%.
• A vacina com WNV inativado atualmente utilizada em eqüinos
apresenta as seguintes desvantagens:
• Necessidade de produção do patógeno infeccioso em
larga escala
• Risco de inativação incompleta
• Aparecimento lento de imunidade
• Necessidade de várias aplicações
• O objeto deste estudo é uma vacina recombinante contra o
WNV recém-desenvolvida para uso em eqüinos. Em dois testes
clínicos, foi demonstrado que essa vacina estimula tanto a
resposta com anticorpos como confere imunidade precoce em
eqüinos contra a viremia por WNV.
ou do grupo-controle desenvolveu sinais clínicos da doença
em praticamente todos os estados nos EUA até 2002. A
pelo WNV após o desafio. Nenhum dos nove eqüinos desafiados
persistência do WNV em mosquitos durante o inverno dificulta
2 semanas após a primeira vacinação, e apenas um dos dez
ou impossibilita a erradicação, não sendo mais, portanto,
vacinados desafiados 1 ano pós-vacinação, desenvolveram
considerado exótico para os Estados Unidos [3].
viremia detectável após o desafio, enquanto que mais de 80%
O principal ciclo de transmissão do WNV envolve pássaros
dos controles se infectaram. Os resultados desses estudos
e mosquitos, embora a transmissão direta de pássaros para
demonstraram que um esquema básico com duas doses de
pássaros [12] e a infecção oral tenham sido sugeridas [4] e
vCP2017 estimula uma resposta de anticorpos e confere
demonstradas de modo experimental [9]. Os eqüinos são
imunidade precoce em eqüinos contra a viremia pelo WNV.
infectados pela picada de mosquitos contaminados e
desenvolvem viremia de baixa intensidade e curta duração.
Introdução
Portanto, é provável que os eqüinos infectados não atuem
O vírus do Oeste do Nilo (WNV) é um RNA-vírus de fita simples
como hospedeiros amplificadores do WNV, sendo
e senso positivo que pertence ao complexo do vírus da
considerados hospedeiros finais e incidentais [1]. Em 2002,
encefalite japonesa (JEV) do gênero Flavivirus, da família
mais de 14 mil casos confirmados em eqüinos de infecção pelo
Flaviviridae [6]. A infecção pelo vírus do Oeste do Nilo é bem
WNV foram registrados na América do Norte [22], com uma
conhecida na África, Ásia e na bacia do Mediterrâneo, onde
taxa de mortalidade de aproximadamente 30%.
foram relatados casos esporádicos e epidemias [14]. Esse
A vacinação com vacinas contendo vírus vivo-modificado ou
vírus foi identificado pela primeira vez na América do Norte em
inativado tem sido um mecanismo eficaz na prevenção da
1999 durante um surto que acometeu pássaros, eqüinos e
infecção pelo flavivírus no homem [7, 23] e em animais
pessoas em Nova York e seus arredores. Desde então, o vírus
domésticos [19]. Recentemente, uma vacina inativada contra o
se espalhou rapidamente pelo sul e pelo oeste, aparecendo
WNV foi registrada nos Estados Unidos para uso em eqüinos.
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Inúmeras desvantagens são em geral associadas às vacinas
O vetor da bouba de canário ALVAC [21] foi empregado como
inativadas, tais como a exigência de produção do patógeno
cepa parental para desenvolver um recombinante que
infeccioso em larga escala, o risco de inativação incompleta, o
contenha as seqüências de codificação apropriadas do WNV.
lento aparecimento da imunidade e a necessidade de várias
O vírus foi cultivado e titulado em monocamadas de células
inoculações. Devido a esses aspectos preocupantes, as
primárias de fibroblastos de embrião de galinhas (CEF) livres
vacinas de segunda geração foram desenvolvidas com
de patógenos específicos.
tecnologia recombinante. Recentemente, Davis et al. [2]
O WNV que atuou como RNA doador para a síntese do
relataram a avaliação de uma vacina de DNA contra o WNV
cDNA e posterior construção do vCP2017 foi isolado em 1999
que protegeu camundongos e eqüinos contra a infecção
na Cornell University de um pool de amostras de tecido de
experimental. O uso de poxvírus recombinantes é outro meio
fígado e rim de um pato Mallard de Queens, Nova York, EUA.
potencialmente eficaz de induzir imunidade protetora contra a
infecção pelo flavivírus [8, 10, 11]. Foi demonstrado que os
Clonagem do cDNA dos genes estruturais do WNV
recombinantes de bouba de canário realmente expressam os
Foram utilizadas técnicas-padrão de biologia molecular para a
genes recombinados inseridos sem que haja replicação viral
obtenção das seqüências do cDNA do WNV e sua clonagem.
efetiva [18, 21]. Isso fornece um recurso intrínseco de
A clonagem foi realizada no vetor do plasmídeo pTriEx-1
segurança para a vacinação, pois elimina a possibilidade de
(Novagen, Madison, WI 53719, EUA). Foram empregadas
transmissão do vetor vacinal ou do vírus imunogênico-alvo.
técnicas-padrão de reação em cadeia da polimerase
Foram desenvolvidos vários recombinantes de bouba de
acoplada à transcriptase reversa (RT-PCR) para amplificar as
canário para uso veterinário [13, 15, 20, 21], sendo atualmente
seqüências da codificação para prM, M e E do RNA do WNV,
comercializados na América do Norte e na Europa.
utilizando-se primers ME no.2 (sentido 5’-3’ ou forward)
Desenvolvemos um vírus recombinante da bouba de canário
(5’ -AGCTGATATCAACCGGAATTGCAGTCATG- 3’) e
(vCP2017) que expressa as proteínas pré-membrana (prM) e
prM/E (sentido 3’-5’ ou reverse)
envelope (E) de um isolado do WNV observado em Nova York
(5’-CACAGTCTCGAGAGCGTGCACGTTCACGGAG-3’).
em 1999. Após os estudos de segurança em eqüinos,
O fragmento de DNA amplificado por PCR foi digerido com
camundongos, frangos e corvos, esse vírus recombinante foi
EcoRV e XhoI, e clonado no vetor pTriEx. O plasmídeo
submetido a testes para avaliar sua capacidade de induzir
resultante foi denominado pTriEX-WNVME.
imunidade em eqüinos e também verificar seu potencial como
candidato a vacina para prevenção da infecção pelo WNV.
Construção do plasmídeo doador de ALVAC no cassete de
expressão do WNV
Materiais e Métodos
O final 0,7 kb EcoRV–ClaI 5’ do cassete do gene do WNV no
Linhagens de células e cepas do vírus
pTriEx foi amplificado pela técnica de PCR, empregando-se os
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primers 7600.SL (5’-ATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAA
final pDS-2946-1-1 era composto pelo promotor H6 do vírus
TGACCGGAATTGCA-GTCATGATTGGCCTG-3’) e 7616.SL (5’-
vaccínia ligado ao códon de iniciação do ATG adicionado
CATCTTCACATCGAT-GGTAGGCTT-3’) e o fragmento inserido
exatamente à extremidade 5’ da seqüência de codificação do
no pCR2.1 para gerar o plasmídeo pDS-2905-2-1. A seqüência
prM e inserido entre os braços laterais da bouba de canário
da inserção foi confirmada. O primer 7600.SL contém o final 3’
no locos do ALVAC C5.
do promotor H6 da vaccínia. O fragmento 1.4 kb ClaI –XhoI 3’
do pTriEx-WNV foi inserido em pUC-4K, gerando o clone pDS-
Desenvolvimento do vírus recombinante ALVAC (vCP2017)
2889-1. Para retirar um sítio interno TTTTTNT na seqüência E,
Os experimentos de recombinação foram realizados conforme
foi realizada mutagênese sitio-dirigida (ou superexpressão),
descrito anteriormente [16], empregando-se o pDS-2946-1-1
utilizando-se o kit Stratagene QuickChange (La Jolla, CA
como plasmídeo doador e o ALVAC como vírus de resgate. O
92037, EUA) e os primers 7598.SL (5’-GAAGTGGCCATTTTTGT
plasmídeo de inserção pDS-2946-1-1 foi misturado ao DNA
CCATG-GACCAACT-3’) e 7599.SL (5’-AGTTGGTCCGTGCACGAA
genômico da bouba de canário (ALVAC) e co-precipitado em
GATG-GCCACTTC-3’). O clone pDS 2897-5-1 que contém a
células CEF infectadas com ALVAC para permitir que a
seqüência mutada de E foi confirmado como correto pela
recombinação in vitro entre as regiões laterais de C5 ORF do
análise da seqüência. Para retirar a cauda poli-His e introduzir
cDNA viral e as regiões laterais homólogas do ALVAC no
uma terminação de tradução e o terminal TTTTTNT, o
plasmídeo de inserção. A progênie contendo os genes do
fragmento 1.4 kb 3’ de pDS-2897-5-1 foi amplificado por PCR
WNV foi identificada por meio de hibridização in situ da placa,
usando-se os primers 7617.SL (5’- AAGCCTACCATCGAT
empregando-se uma sonda do gene do WNV marcado com
GTGAAGATG-3’) e 7601.SL (5’-GGGCCCTCTAGATAAA
rádio. Diversas placas virais positivas à sonda do WNV foram
AATTAAGCGTGCACGTTCA-CGGAGAGGAAGAGCAG-3’). O
submetidas a seis ciclos sucessivos de purificação. Uma
fragmento resultante foi inserido no pCR2.1 para gerar o
placa representativa, denominada vCP2017, foi então
plasmídeo pDS-2918-1. O plasmídeo pDS-2918-1 também foi
amplificada por meio de cinco passagens nas células
confirmado como correto pela análise da seqüência. O
primárias CEF, identificadas como passagem 10 e utilizadas
fragmento EcoRV –ClaI 5’ de pDS-2905- 2-1 e o fragmento ClaI
na preparação dos stocks do vCP2017.
–XbaI 3’ de pDS-2918-1 foram isolados e ligados junto com o
plasmídeo pNVQH6C5LSP 18 (plasmídeo que contém os
Expressão dos genes prM e E
braços laterais para o locos do ALVAC C5), previamente
A expressão apropriada dos genes prM e E do WNV foi
digeridos com EcoRV and XbaI, para gerar pDS-2946-1-1. O
confirmada pela análise do vCP2017 com uso das técnicas de
clone pDS-2946-1-1 foi confirmado pela análise da enzima de
fluorescência indireta e Western blot. Para o teste de Western
restrição e a inserção foi seqüenciada. O plasmídeo doador
blot, as células CEF foram infectadas com ALVAC (vírus
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parental) ou vCP2017. Após incubação a 37°C em CO2 a 5%
quantidades necessárias para mantê-los em boas condições
durante 24–30 horas, os sobrenadantes foram colhidos e
físicas, além de água ad libitum.
submetidos à eletroforese em um gel de SDS PAGE 12%, que
Durante a fase de vacinação, os eqüinos foram mantidos a pasto
foi então transferido para uma membrana de náilon Millipore P.
ou em estábulos, tendo sido regularmente tratados com repelente
A membrana foi sondada com soro de galinha anti-WNV como
de moscas (Tri-Tec®, Farnan Companies Inc., Osborne, Phoenix,
anticorpos primários (APHIS, NVSL, Ames, Iowa), e com soro
Arizona, EUA) de uso tópico, conforme as indicações de bula.
de asno anti-galinha conjugado com peroxidase de rábano
(Jackson Immunoresearch, West Grove, Pensilvânia, EUA)
Desafio e Vacinação dos Animais
como anticorpos secundários. Para visualização foi utilizado o
A proteção conferida pelo vCP2017 foi avaliada tanto às 2
kit de detecção Amersham Enhanced Luminol (Amersham-
semanas como 1 ano após a segunda dose do esquema básico de
Pharmacia, Piscataway, Nova Jersey, EUA) .
vacinação. As vacinas foram reconstituídas com o adjuvante
Os testes de imunofluorescência indireta (IF) foram conduzidos
Carbopol (BF Goodrich Chemicals Europe NV, Bruxelas, Bélgica)
em células CEF infectadas, fixadas em acetona. Como anticorpos
numa concentração de 4 mg por dose (1 mL) antes da imunização.
primários, foram utilizados o anticorpo monoclonal 538 que reage
No primeiro experimento, foi realizado um estudo de titulação
com prM do WNV [5] e o monoclonal F7/101 que reage com E do
da dose em eqüinos para avaliar tanto os títulos séricos de
WNV [16] , e como anticorpo secundário, um soro de cabra anti-
anticorpos neutralizantes contra WNV como a duração da
camundongo acoplado com fluorocromo Cy3 (Jackson
imunidade. Três grupos de seis eqüinos foram vacinados duas
Immunoresearch, West Grove, Pensilvânia).
vezes com 5 semanas de intervalo pela via intramuscular com
doses graduadas (baixa-média-alta) da vacina vCP2017. Um
Eqüinos
Neste estudo foram utilizados 44 eqüinos adultos (machos
grupo de seis eqüinos não foi vacinado, atuando como controles.
No segundo experimento foi definido o início da proteção. Dez
castrados e éguas), com peso entre 337 e 600 kg, sob um
eqüinos foram vacinados com vCP2017 a uma dose baixa, de
protocolo aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e
acordo com o mesmo esquema de vacinação (veja acima).
Cuidados dos Animais (Institutional Animal Care and Use
Outros 10 eqüinos não foram vacinados, atuando como controles.
Committees) da Merial e da Colorado State University.
Todos os estudos de desafio foram realizados em instalações
Nenhum dos eqüinos apresentou anticorpos detectáveis para
de confinamento com nível 3 de biossegurança na Colorado
WNV ou vírus da encefalite de St. Louis no teste de
State University, empregando-se um método de desafio com
neutralização com redução em placa (PRNT) (1) no início do
mosquito descrito anteriormente (1). Todos os eqüinos foram
estudo. Os animais foram alimentados com mistura de cereais
desafiados pela picada de 12–15 mosquitos Aedes albopictus
e feno ou receberam ração completa estrusada nas
infectados com o isolado do WNV NY99-4321. Os mosquitos
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puderam se alimentar nos eqüinos durante 5–8 minutos. Depois
de se alimentarem, 3–5 mosquitos ingurgitados de cada um dos
eqüinos foram macerados e submetidos a testes em placa para
verificar a presença do vírus. Os eqüinos vacinados com doses
baixas e médias de vCP2017 e os não vacinados do grupocontrole do experimento número 1 e todos os eqüinos do
experimento número 2 foram desafiados 1 ano (teste no. 1) e 2
semanas (teste no. 2) após a segunda vacinação.
Após o desafio, os eqüinos foram examinados duas vezes ao
dia a partir do dia 0 (dia da infecção) até o dia 13 e uma vez no
dia 14 para verificar a ocorrência de sinais da doença clínica;
também foi mensurada uma vez ao dia a temperatura corporal
Fig. 1:
Análise
184.5
do teste de Western
121.3
immunoblot dos
85.9
sobrenadantes do vírus
68.8
ALVAC (vírus parental) e
52.5
E
vCP2017 (ALVAC
40.0
recombinante que
expressa as proteínas do
WNV). Os sobrenadantes
das células CEFs
28.4
M
infectadas pelo ALVAC (1)
21.7
ou CP2017 (2) foram
submetidas a eletroforese
num gel PAGE SDS a 12%,
sendo transferidos para a
16.8
membrana de náilon. A
membrana foi sondada
com soro de galinha anti-WNV (1:1000) como anticorpo primário e com antisoro de asno anti-galinha marcado com HRPO como anticorpo secundário.
Para visualização, foi utilizado o kit de detecção de luminol (Amersham). As
células infectadas pelo vCP2017 (2), mas não as infectadas pelo ALVAC (1),
expressaram as proteínas WNV-E e WNV-M no sobrenadante (setas). Os
tamanhos (esquerda) são mostrados em quilodaltons.
e retal. Amostras de sangue completas foram colhidas duas
Quadro 1:
vezes ao dia durante 7 dias (experimento no.1) e 13 dias
(experimento no. 2) e depois uma vez ao dia até o 14º pósdesafio, tendo sido testadas em placa para verificar a
Respostas sorológicas após a imunização
com vCP2017
Dose
GMT no teste de PRNT80%
Experimento Vacinal Soroconversão
(Log10)
2 semanas
após a 1ª
vacinação
presença do WNV. Quando foram sacrificados, foi colhida uma
No. 1
amostra de líquido cefalorraquidiano (CSF) da região atlantooccipital dos eqüinos do experimento nº 1 para teste da
presença de WNV. Os eqüinos foram sacrificados com uma
overdose de pentobarbital entre o 14º e o 24º dia após o
No. 2
baixa
média
alta
baixa
6/6
5/6
4/5
14,3 (1/7)
0
0
0
0,47
2 semanas
após a 2ª
vacinação
1,1
0,9
0,8
a
Comparando-se cada grupo vacinal aos controles NYVAC-RG e ALVACRG (NY/AL-RG). NP, não pertinente.
desafio, necropsiados para exame patológico e
histopatológico macroscópico (experimento no. 2) e as
carcaças incineradas nas instalações de confinamento.
Isolamento do vírus em ensaios de placa
Q u a d r o 2 : Resposta de anticorpos e proteção contra
o desafio com o WNV
Experimento
No. 1
Os vírus nas amostras de soro, nos homogeneizados de
No. 2
mosquitos e no líquido cefalorraquidiano, foram quantificados por
meio da titulação num ensaio de placa, como descrito
anteriormente [1]. Em resumo, 0,1 mL da amostra foi
Groupo
No
% Proteção
contra a
viremia
dose baixa
dose média
controles
dose baixa
controles
5
5
6
9
10
100
80
16
100
20
Soroconversão*
(no. positivos/
no. testados)
5/5
5/5**
6/6
8/9
10/10
* Títulos neutralizantes ≥ 5
** O eqüino não protegido apresentou resposta lenta dos anticorpos após
o desafio com o WNV.
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acrescentado a uma monocamada de células Vero numa placa
(Fig. 1). Bandas de proteínas do tamanho esperado para as
de cultura com seis cavidades e incubado a 37°C numa atmosfera
proteínas E e prM do WNV estavam presentes nas amostras
com CO2 a 5%. As células foram cobertas com 3 mL de agarose a
de vCP2017, mas ausentes nas de controle do ALVAC. A
0,5% em meio de cultivo M-199 sem fenol vermelho suplementado
expressão das proteínas foi considerada fenotipicamente
com antibiótico e soro fetal bovino a 5%. Após 48 h, foi adicionada
estável após 10 passagens in vitro nas células CEF.
uma segunda sobrecamada de 3 mL contendo vermelho neutro a
0,004%. As placas foram marcadas no dia 3, 4 e 5 da incubação e
Respostas dos anticorpos à vacinação
expressas como unidades formadoras de placas por mL.
Não foram detectados anticorpos anti-WNV em nenhum soro de
Amostras séricas selecionadas foram submetidas a testes de
animais pré-imunizados. Nenhum dos eqüinos não vacinados
PRNT para verificar a presença de anticorpos para WNV.
apresentou soroconversão ao WNV até o momento do desafio.
Um animal pertencente ao grupo de dose elevada (experimento
Sorologia
no.1) demonstrou uma resposta de anticorpos anamnéstica
Foram colhidas amostras de sangue da veia jugular periodicamente
(título: 80) aos 7 dias após a primeira vacinação. Como não
após a vacinação e o desafio, sendo a resposta de anticorpos ao
podíamos desconsiderar a possibilidade de prévia exposição ao
WNV avaliada pelo teste de PRNT. A titulação dos soros foi feita de
WNV ou a outro flavivírus geneticamente relacionado, esse
modo cego na Colorado State University. Resumidamente, os soros
animal foi excluído dos demais testes. Um eqüino vacinado do
foram termo-inativados a 56°C por 30 minutos e suas diluições
experimento no. 2 morreu 28 dias após a primeira vacinação por
seriadas na potência 2 foram misturadas a um igual volume (0,1 mL)
um problema entérico pré-existente não relacionado à
contendo 200 – 300 pfu da cepa NY99-4132 do WNV. Após
vacinação, sendo eliminado do estudo.
incubação por uma noite a 4°C, foi acrescentado 0,1 mL de cada
O Quadro 1 mostra as respostas de anticorpos após a
uma das misturas em monocamadas de células Vero em placas
vacinação. Nenhum dos eqüinos vacinados desenvolveu
com 6 cavidades, processadas em ensaio de placa. Os pontos finais
anticorpos detectáveis após a primeira vacinação. Duas semanas
de neutralização foram registrados como a mais alta diluição de
depois da segunda vacinação, 15/17 eqüinos do experimento no. 1
soro com uma redução de 80% em 100 –150 placas. Os títulos > 5
e 8/9 do no. 2 apresentaram anticorpos detectáveis (variação: 5 a
foram considerados positivos.
1280), mas não foi observada nenhuma resposta clara relacionada
à dose utilizada. Os três eqüinos que não soroconverteram ao
Resultados
nível de redução de 80% no teste em placa apresentaram todos
Expressão das proteínas prM e E
baixa titulação de anticorpos ao nível de 50%. Para avaliar a
A expressão das proteínas prM e E foi detectada tanto por
persistência das respostas dos anticorpos neutralizantes nos
testes de IF (não apresentados) como de Western blotting
eqüinos do experimento no.1, foram colhidas amostras de sangue
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36 semanas após a segunda vacinação e novamente analisadas
após o desafio. Todos os outros animais vacinados
pelo teste de PRNT80. Apenas 2 eqüinos apresentaram níveis ainda
apresentaram anticorpos já no dia 7 pós-desafio. Cinco dos 6
baixos de anticorpos circulantes anti-WNV (título: 5). Ambos
controles desenvolveram títulos de anticorpos ≥ 5 no dia 14
apresentaram os níveis mais elevados de anticorpos no teste de
pós-infecção, e também um controle até o dia 7 pós-desafio.
PRNT (título: 40) duas semanas após a segunda vacinação.
Não foram observados sinais clínicos, inclusive pirexia, em
nenhum dos eqüinos infectados. Nenhum dos eqüinos
Proteção contra o desafio
A quantidade de WNV presente nos mosquitos ingurgitados
apresentou vírus detectável no líquido cefalorraquidiano.
No segundo experimento, nove eqüinos vacinados e dez
analisados após se alimentarem nos eqüinos variou de 107,0 a
controles foram desafiados duas semanas após a segunda
108,0 pfu por mosquito no primeiro experimento e de 107,0 a 109,1
vacinação. Oito dos dez controles apresentaram viremia 18 a 72
no segundo.
h após serem picados pelos mosquitos infectados. Os picos dos
Os resultados dos dois experimentos são apresentados no
títulos de viremia variaram de 100,7 pfu a 102,4 pfu, sendo que o
Quadro 2. Dois eqüinos vacinados pertencentes ao estudo
vírus não foi isolado após o 6º dia pós-desafio. Nenhum dos nove
sobre a duração da imunidade (experimento no.1) foram
eqüinos vacinados desenvolveu viremia. Todos os eqüinos do
excluídos do desafio, pois foram expostos a uma cepa de
grupo-controle e 8 dos 9 vacinados apresentaram aumento dos
campo do WNV quando mantidos a pasto durante o período
títulos de anticorpos após a exposição ao WNV. O eqüino que
pré-desafio, como comprovado pela soroconversão. Nenhum
não soroconverteu ao WNV apresentou um título de 1.280 no
outro eqüino soroconverteu antes do desafio. Portanto, 5
momento do desafio. Não foram observados sinais clínicos da
eqüinos vacinados dos grupos de dose baixa e média e 6
doença em nenhum desses animais durante o estudo, com
controles foram desafiados um ano após a segunda
exceção de um controle que apresentou uma resposta
vacinação. Cinco dos seis eqüinos do grupo-controle
temporária de temperatura (38,8°C) no 6º dia após as picadas dos
expostos ao WNV por meio de mosquitos infectados que neles
mosquitos. Na necrópsia, não foram observadas anormalidades
se alimentaram desenvolveram viremia detectável 24 a 72 h
macroscópicas, sendo que o exame histopatológico de secções
após o desafio, com os picos de títulos de vírus entre 100,7 e
representativas do córtex, tronco cerebral e cerebelo não
101,8 pfu. O vírus não foi isolado após o dia 6. Somente um
revelaram lesões compatíveis com infecção pelo WNV.
eqüino vacinado pertencente ao grupo de dose média
desenvolveu viremia, que durou 2 dias, com um pico de
Discussão
viremia de 101,3 pfu. Esse animal não conseguiu desenvolver
Construímos um vírus recombinante de bouba de canário que
uma resposta de anticorpos neutralizantes após a vacinação,
expressa as proteínas prM/E de um isolado do WNV
tendo demonstrado uma resposta de anticorpos lenta (dia 14)
observado em Nova York em 1999. Os dados dos testes de
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Western immunoblot mostraram que as células infectadas com
canário contra o JEV [8]. Esse construto induziu respostas das
vCP2017 processaram adequadamente as proteínas prM e E. A
células T JEV-específicas em seres humanos, apesar dos
expressão foi confirmada pelo teste de IF com anticorpos
anticorpos neutralizantes não detectáveis [8].
monoclonais específicos para as proteínas E e prM.
As vacinas foram bem toleradas pelos eqüinos e não foi
Em nossos experimentos, o vCP2017 foi testado na presença
do adjuvante Carbopol. Estudos anteriores [13] sobre um
possível isolar o vCP2017 do sangue, fezes ou esfregaços
recombinante de bouba de canário contra influenza (vCP1533)
nasais coletados em intervalos regulares após a vacinação
para uso em eqüinos demonstraram que, embora o construto
(dados não apresentados). Isso é coerente com os resultados
conferisse proteção na ausência de adjuvante, sua eficácia
da inoculação anterior de ALVAC em mamíferos, inclusive em
melhorou quando associado ao Carbopol. Os mecanismos
seres humanos [8, 18].
imunológicos subjacentes à atividade do Carbopol são pouco
A capacidade de proteção do vCP2017 foi testada,
desafiando-se os eqüinos vacinados por meio de picadas de
entendidos, sendo atualmente objeto de pesquisas.
Em resumo, o esquema básico de vacinação com duas
mosquitos infectados pelo WNV, um método que se aproxima
injeções de vCP2017 conferiu proteção significante a eqüinos
da exposição natural. Os baixos níveis de viremia e a nítida
contra viremia pelo WNV, fornecendo uma alternativa potente
ausência de sinais clínicos nos controles desafiados aqui
e segura à vacina com WNV inativado atualmente disponível.
descritos são semelhantes aos relatados por Bunning et al.
[1]. A vacina induziu a produção de anticorpos neutralizantes
Agradecimentos
para o WNV e conferiu proteção precoce contra a viremia
Agradecemos ao Dr. E. Gould por nos fornecer os anticorpos
pelo WNV. Além disso, a imunidade protetora durou no mínimo
monoclonais anti-WNV e a H. Coupier, L. Motes-Kreimeyer, C.
um ano após a vacinação. Curiosamente, a proteção ocorreu
Leung e G. Royer e sua equipe pela assistência técnica
na ausência de anticorpos detectáveis. A necessidade de
especializada. Nossos agradecimentos a H. Hughes, M. Murray
níveis significantes de anticorpos neutralizantes no momento
e A.L. Glaser pela revisão crítica do manuscrito.
da exposição pode não ser um fator essencial, desde que a
vacinação estimule adequadamente o sistema imune e a
resposta seja rápida. Isso foi anteriormente descrito com
outros construtos de bouba de canário que contêm os genes
protetores do vírus da leucemia felina [20] e da cinomose
canina (J. Minke, comunicação pessoal). A vacina pode
também ter induzido respostas dos CTL, como demonstrado
no caso do ALVAC-JEV, um recombinante de bouba de
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