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Transcrição

ELOIZA HELENA CAMPANA
RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS
CEFALOSPORINAS DE AMPLO ESPECTRO EM ISOLADOS
CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa: ESTUDO DOS
MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ENVOLVIDOS
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
São Paulo
2013
RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS CEFALOSPORINAS DE AMPLO
ESPECTRO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa: ESTUDO DOS
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Disciplina de Infectologia - Universidade Federal
de São Paulo - UNIFESP.
Coorientador: Dr. Danilo Elias Xavier
Disciplina de Infectologia - Universidade Federal
de São Paulo - UNIFESP.
São Paulo
2013
ii
CAMPANA, Eloiza Helena
Resistência aos Carbapenens e Sensibilidade às Cefalosporinas de Amplo
Espectro em Isolados Clínicos de Pseudomonas aeruginosa: Estudo dos
Mecanismos de Resistência Envolvidos. Eloiza Helena Campana - São Paulo,
2013. vi. 150f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Ciências Básicas em Infectologia.
Título em inglês: Carbapenen resistance and susceptible to broad spectrum
cephalosporins in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates: Evaluation of
mechanisms of resistance involved.
1. Pseudomonas aeruginosa; 2. Carbapenens; 3. Cefalosporinas de amplo
espectro; 4. Sistemas de Bombas de Efluxo; 5. Proteína de membrana externa OprD.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Professor Dr. Álvaro Nagib Atallah
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Professora Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Celso Francisco Hernandes Granato
São Paulo
2013
iv
RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS CEFALOSPORINAS DE AMPLO
ESPECTRO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa: ESTUDO DOS
Presidente da Banca
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Banca Examinadora
Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari
Profa. Dra. Floristher Elaine Carrara Marroni
Dr. Guilherme Henrique Furtado
Profa. Dra. Maria Helena Matté
Suplentes
Profa. Dra. Elizabeth de Andrade Marques
Prof. Dr. Nilton Lincopan
São Paulo
2013
v
Dedico este trabalho ao meu grande amor, meu
sobrinho João Guilherme. Que me fez aprender a
amar novamente e me ensina a cada dia a ser
uma pessoa melhor.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Dra. Ana Cristina Gales, por ter me recebido há sete anos atrás
e sempre me dado a oportunidade de crescer. Obrigada pelo exemplo de dedicação, inteligência e
esforço que levarei comigo para o resto de minha vida.
Agradeço a minha família, José Argemiro Campana (in memorian), Gilda Campana e Mayla
Christina Campana pela paciência em esperar eu terminar minha pós-graduação. Obrigada por estarem
sempre ao meu lado, pela dedicação, auxílio e força na minha formação pessoal e profissional. E
principalmente, por sempre acreditarem no meu sucesso.
Ao meu padrinho Issac Ortega e a Márcia Eckert por todos os momentos de apoio e carinho.
Agradeço ao Professor Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari pelo grande exemplo de vida.
Obrigada pelo grandioso convívio e pelo apoio sempre. Levarei para sempre os seus ensinamentos.
A Dra. Maria Rita Elmor de Araujo por, gentilmente, ter cedido às amostras de Pseudomonas
aeruginosa do Hospital do Coração e Hospital Beneficência Portuguesa para esse estudo.
Agradeço ao meu coorientador e verdadeiro amigo Danilo Elias Xavier, por todos os momentos
de ensinamento, amizade e companheirismo. Obrigada por me ensinar a muito do que sou hoje.
Agradeço a minha eterna veterana Renata Cristina Picão, minha colega de sonhos,
companheira de apartamento e acima de tudo amiga. Obrigada pelas broncas, pelas palavras de carinho,
pelos ensinamentos. São mais de 12 anos de uma amizade para a vida toda.
vii
Agradeço especialmente a minha amiga e colega Fernanda Petrolini, pela dedicação, auxílio
nos experimentos e principalmente por ter me acolhido como uma irmã em sua família e na sua cidade
que eu tanto adoro.
Agradeço a Adriana G. Nicolleti, Lorena C. C. Fehlberg e Paula P. Barbosa amigas e colegas
de laboratório há tantos anos. Obrigada por toda o auxilio, por toda a paciência e por cada palavra amiga
quando eu mais precisei. Vocês estarão sempre presentes em minha vida.
Agradeço imensamente ao aluno de estagio probatório, colega e amigo Jhonatha Moura, pelo
auxílio nos experimentos, conversas e incentivo em todos os momentos.
Agradeço de todo o coração às palavras carinhosas que recebi diariamente da colega Ana
Carolina Ramos. Obrigada por me fazer ver que ser doce faz bem.
Agradeço as minhas queridas amigas Karen Bauab, Milene Quiles, Flavia Palomo e Juliana
Garcia por todo convívio, carinho, conversas, choros e amizade sincera. Vocês foram muito importantes
nessa etapa da minha vida e serão para sempre minhas verdadeiras companheiras.
Agradeço a Cecília Carvalhaes, amiga e colega. Por toda a paciência, conversas, auxilio e
amizade.
Agradeço aos meus colegas de Muay Thai, Jiu Jitsu e Treino, Mestre Reinaldo Dutra, Mestre
Edinaldo Dias, Carla Borges, Fernanda Tavares, Raul Alexandre Hanashiro, Joaquim Vicente
Alberico, Wallace Josef, Valéria Avila, Rodrigo Celebrone, Alexandre Nunes e Will Bonifacio por
me ensinarem que é preciso exercitar o corpo e não só a mente. Obrigada por fazerem meus fins de dia
mais felizes e alegres e também por deixarem minha vida mais leve.
viii
Agradeço meus eternos amigos de faculdade André Goto, Beatriz Balducci, Camila Justino,
Francielli Vasconcellos, Rafael Ferreira e Sarita Rossato pela presença em minha vida há tantos
anos. Pela amizade, conselhos, conversas e torcida sempre.
As minhas amigas de colégio, minhas eternas lulus Amanda Andrade, Christiane Braghin,
Katiane Soares, Mayla Fietta, Nancy Guetti, Natalia Albuquerque e Thais Simone por todo apoio,
amizade, carinho, conversas. Nossa amizade é eterna.
Agradeço aos meus amigos Marcos Antonio Silva, Rafael Ferreira, Rafael Nascimento,
Rafael Azevedo e Thiago Rodrigues pela amizade, conversas, viagens.
Agradeço as minhas amigas do Laboratório de Microbiologia Básica da UNIFESP Cecília
Magalhães, Bruna Gil, Paola Rossi, Tavane Cambiaghi, e o amigo Fabiano Romão por todos os
cafés, conversas, conselhos, “Brain Storm” e acima de tudo pela amizade que vale uma vida com vocês.
Agradeço os pós-graduandos e colegas do Laboratório ALERTA Adriana Pereira, Anderson
Fernandes, Bruna Nonato, Dandara Corsi, Eliete Frigatto, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun,
Juliana Provasi, Jéssica Werneck, Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Raquel
Girardello, Rafael Affini, Rodrigo Cayô, Talita Barone e Vitor Marguti pela agradável e divertida
convivência, pelos conhecimentos divididos e as experiências compartilhadas. Obrigado por todos os
momentos vividos nestes últimos sete anos.
Agradeço os pós-graduandos e colegas do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica LEMC, pelo companheirismo em todos os momentos. Agradeço também a Rosana Capecce pela
amizade e auxílio em diversos momentos.
Aos docentes e funcionários da Disciplina de Infectologia (DIPA/UNIFESP/EPM).
ix
"A ciência não pode prever o que vai
acontecer. Só pode prever a probabilidade
de algo acontecer."
(César Lattes)
x
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................................
01
2 OBJETIVOS ..........................................................................................................................................
03
2.1 Objetivo Principal ...............................................................................................................................
03
2.2 Objetivos Secundários .......................................................................................................................
03
3 REVISÂO BIBLIOGRÀFICA ...................................................................................................................
04
3.1 Pseudomonas aeruginosa ...................................................................................................................
04
3.2 Epidemiologia das Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa ..............................................
05
3.3 Mecanismos de resistência em Pseudomonas aeruginosa .................................................................
07
3.3.1 Produção de -Lactamases ..............................................................................................................
07
3.3.1.1 Serino--Lactamases – Classe A ..................................................................................................
08
3.3.1.2 Metallo-β-lactamases (MβL) – Classe B ........................................................................................
10
3.3.1.3 -Lactamase cromossomal AmpC – Classe C ..............................................................................
11
3.3.1.4 Oxacilinases (OXA) – Classe D .....................................................................................................
13
3.3.2 Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ............................................................................................
15
3.3.3 Impermeabilidade de Membrana Externa .........................................................................................
19
3.3.4 Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) ..............................................................
22
3.3.5 Resistência aos Aminoglicosídeos....................................................................................................
22
3.3.6 Resistência às Fluoroquinolonas.......................................................................................................
24
3.4 Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Pseudomonas aeruginosa.....................
25
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................................
27
4.1 Amostras Bacterianas ..........................................................................................................................
27
4.1.1 Identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) ...........................................................................................
28
4.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos .......................................................
29
4.3 Análise da similaridade genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) .................................
31
4.3.1 Preparação dos blocos de gel de agarose .......................................................................................
32
4.3.2 Digestão do DNA bacteriano ............................................................................................................
33
4.3.3 Eletroforese em campo pulsátil .........................................................................................................
33
xi
4.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI) ...................................................................................................
34
4.5 Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens .......................................................................................
35
4.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria .....................................................................
35
4.5.2 Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
(MALDI-TOF MS) .......................................................................................................................................
36
4.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases ...........................................................................
36
4.6.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................................
36
4.6.2 Sequenciamento .....................................................................................................................................
43
4.7 Avaliação fenotípica com inibidores de sistemas de efluxo e da β-lactamase cromossomal AmpC ...
43
4.7.1 Inibição da -lactamase cromossomal AmpC ..................................................................................
44
4.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo ..........................................................................................................
44
4.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo Real - qRT-PCR ............
44
4.8.1 Extração de RNA Total .....................................................................................................................
45
4.8.2 Síntese de cDNA ..............................................................................................................................
46
4.8.3 Quantificação relativa da transcrição gênica ....................................................................................
46
4.8.4 Análise da quantificação relativa da transcrição gênica ...................................................................
47
4.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo .............................................................
48
4.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE .............................................
49
4.9.1 Extração de proteínas de membrana externa ...................................................................................
49
4.9.2 SDS-PAGE .......................................................................................................................................
49
4.10 Pesquisa do Gene Codificador da Proteína de Membrana Externa – OprD .....................................
50
4.10.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................................
50
4.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e aso aminoglicosídeos ...........
51
51
4.11.2 Sequenciamento ...........................................................................................................................
54
5 RESULTADOS .......................................................................................................................................
55
5.1 Amostras Bacterianas ..........................................................................................................................
55
5.1.1 Identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) ...........................................................................................
55
5.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos .......................................................
56
5.3 Análise da similaridade genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) .................................
59
xii
5.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI) ...................................................................................................
62
5.5 Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens .......................................................................................
63
5.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria .....................................................................
63
5.5.2 Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
(MALDI-TOF MS) .......................................................................................................................................
63
5.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases ...........................................................................
64
5.6.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................................
64
5.6.2 Sequenciamento ......................................................................................................................................
65
5.7 Avaliação Fenotípica com inibidores ...................................................................................................
66
5.7.1 Inibição da -lactamase cromossomal AmpC ..................................................................................
66
5.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo ..........................................................................................................
67
5.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo Real - qRT-PCR ............
68
5.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo .............................................................
74
5.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE .............................................
74
5.10 Avaliação da presença do Gene Codificador da Proteína de Membrana Externa – OprD ...............
75
75
5.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e aos Aminoglicosídeos ...........
75
76
5.11.2 Sequenciamento .............................................................................................................................
76
6 DISCUSSÂO ...........................................................................................................................................
77
7 CONCLUSÂO .........................................................................................................................................
92
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÀFICAS ........................................................................................................
94
ABSTRACT ................................................................................................................................................
127
ANEXOS ....................................................................................................................................................
128
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Isolados de P. aeruginosa selecionados para este estudo de acordo com o sítio de
Infecção e os Hospitais de isolamento ..............................................................................................
27
Tabela 2. Concentrações testadas na microdiluição em caldo dos antimicrobianos utilizados no
estudo ................................................................................................................................................
30
Tabela 3. Pontos de cortes utilizados para a interpretação das CIMs de P. aeruginosa segundo o
CLSI 2013 ..........................................................................................................................................
31
Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores
de β-lactamases pela técnica de PCR convencional e/ou multiplex neste estudo ............................
38
Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores
de β-lactamases tipo carbapenemase neste estudo pela técnica de PCR convencional e/ou
multiplex ............................................................................................................................................
40
Tabela 6. Cepas controles utilizadas neste estudo para a detecção de genes codificadores das
-lactamases e carbapenemases, por meio da técnica de PCR convencional e/ou multiplex .......
42
Tabela 7. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de qRT-PCR para os genes alvos
mexB, mexD, mexF, mexY, oprD e ampC e para o gene de referência rpsL ...................................
47
Tabela 8. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de PCR para a avaliação do gene
da oprD ..............................................................................................................................................
51
Tabela 9. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a caracterização dos mecanismos de
resistência às fluoroquinolonas e aminoglicosídeos pela técnica de PCR convencional e multiplex
nos isolados resistentes a estes antimicrobianos .............................................................................
52
Tabela 10. Distribuição da potência e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados
clínicos de P. aeruginosa estudados .................................................................................................
56
Tabela 11. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P.
aeruginosa, realizado pela técnica de microdiluição em caldo, segundo as recomendações do
CLSI (2013) .......................................................................................................................................
58
Tabela 12. Teste de inibição da β-lactamase cromossomal AmpC, na presença de cloxacilina
(200 μg/mL), aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa .................................
67
Tabela 13. Teste de inibição de bomba de efluxo, na presença de PAβN (50 μg/mL), aos
antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa .............................................................
68
Tabela 14. Média da expressão relativa dos genes estudados nos isolados clínicos de P.
aeruginosa em relação a cepa PAO1 ................................................................................................
69
Tabela 15. Mutações no QRDR dos isolados de P. aeruginosa estudados .....................................
76
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição dos isolados clínicos estudados por sítio de isolamento ...............................
55
Figura 2. Porcentagem de sensibilidade aos diversos antimicrobianos dos isolados de P.
aeruginosa estudados .......................................................................................................................
57
Figura 3. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de P. aeruginosa do H1 e H2 pela
técnica de PFGE ...............................................................................................................................
59
Figura 4. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de P. aeruginosa do H3 pela
técnica de PFGE ...............................................................................................................................
60
Figura 5. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de PFGE dos isolados de
P. aeruginosa avaliados neste estudo ...............................................................................................
61
Figura 6. Curva de regressão linear da focalização das β-lactamases presentes nos isolados de
P. aeruginosa ....................................................................................................................................
62
Figura 7. Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria ......................................................
63
Figura 8. Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF MS) .........................................................................................................
64
Figura 9. PCR convencional de todos os isolados de P. aeruginosa para a β-lactamase
cromossomal AmpC e OXA-50 .........................................................................................................
65
Figura 10. Representação esquemática do integron In163 ..............................................................
65
Figura 11. Quantificação da transcrição relativa do gene mexB para os isolados de P. aeruginosa
e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em relação a cepa PAO1 ........................................................
70
Figura 12. Quantificação da transcrição relativa do gene mexD para os isolados de P. aeruginosa
70
Figura 13. Quantificação da transcrição relativa do gene mexF para os isolados de P. aeruginosa
71
Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene mexY para os isolados de P. aeruginosa
71
Figura 15. Quantificação da transcrição relativa do gene ampC para os isolados de P.
aeruginosa e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em relação a cepa PAO1 ......................................
73
Figura 16. Quantificação da transcrição relativa do gene oprD para os isolados de P. aeruginosa
73
Figura 17. Perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE dos isolados de P.
aeruginosa .........................................................................................................................................
74
Figura 18. PCR convencional do gene codificador da proteína de membrana externa oprD dos
isolados de P. aeruginosa .................................................................................................................
xv
75
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABC - ATP-Binding Cassette
AIM - Australian Imipenemase
ATCC - American Type Culture Collection
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
CTX-M - Cefotaximase
DBL - DBL numbering system
DMT - Drug-Metabolite Transporter
DNA - Ácido desoxirribonucleico
EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético
ESAC - Extended-Spectrum AmpC
ESL - Extended Spectrum -Lactamase
EUA - Estados Unidos da América
GES - Guiana Extended Spectrum
GIM - German Imipenemase
IMP - Imipenemase
IS - Insertion Sequence
KHM - Kyorin Hospital metalo-beta-lactamase
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass
Spectrometry
MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion
ML - Metalo--Lactamase
xvi
MDR - Multi-Drug Resistance
MFS - Major Facilitator Superfamily
OMP - Outer Membrane Protein
OXA - Oxacilinase
PAN - Phenyl-Arginine--Naphthylamide
PBP - Penicillin-Binding Protein
PCR - Polymerase Chain Reaction
PER - Pseudomonas Extended Resistant
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
PI - Ponto Isoelétrico
qRT-PCR - Quantitative Real Time Polimerase Chain Reaction
RND - Resistance-Nodulation-Division
rRNA - RNA Ribossomal
SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SHV - Sulfhydryl-Variable -Lactamase
SIM - Seul Imipenemase
SME - Serratia marcescens enzyme
SMR - Small Multidrug Resistance
SPM - São Paulo Metallo--Lactamase
TEM - Temoniera -Lactamase
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
VEB - Vietnamese Extended-Spectrum -lactamase
VIM - Verona Imipenemase
xvii
RESUMO
Objetivo: Esse estudo teve como objetivo avaliar os mecanismos de resistência em
isolados clínicos de P. aeruginosa que apresentavam fenótipo de resistência aos
carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro. Material e
Métodos: Foram estudados 25 isolados de P. aeruginosa recuperadas de diferentes
sítios infecciosos em três distintos hospitais da cidade de São Paulo. Os isolados
foram submetidos ao teste de sensibilidade antimicrobiana por microdiluição em caldo
(CLSI-2013). A similaridade genética foi avaliada pela técnica de PFGE, e a atividade
enzimática das carbapenemases foi avaliada pelo método de hidrólise enzimática e
MALDI-TOF. A pesquisa de genes que codificam as β-Lactamases foi realizada pela
técnica da PCR, seguido por sequenciamento. A desrrepressão de ampC e a
hiperexpressão dos sistemas de efluxo foram avaliados fenotipicamente pela adição
de seus inibidores (cloxacilina e PAβN, respectivamente). A transcrição dos genes
mexB, mexD, mexF e mexY, da β-lactamase cromossomal ampC e da porina oprD foi
avaliada pela técnica de qRT-PCR. As proteínas de membrana externa foram
avaliadas pela técnica de SDS-PAGE e em seguida foi realizada a técnica da PCR. A
resistência aos aminoglicosídeos e ao ciprofloxacino foi avaliada pela a técnica da
PCR, seguida por sequenciamento dos respectivos genes responsáveis por conferirem
resistência a estes antimicrobianos. Resultados: O fenótipo de resistência a pelo
menos um dos carbapenens (imipenem e meropenem) e sensibilidade às
cefalosporinas de amplo espectro (cefepima e ceftazidima) foi confirmado em todos
isolados clínicos estudados. A resistência à ciprofloxacina e aos aminoglicosídeos foi
observada em cinco (20%) e dois (8%) desses isolados, respectivamente. A análise do
perfil eletroforético por PFGE permitiu o agrupamento dos isolados estudados em 17
padrões distintos sem a predominância de um perfil clonal. Nenhum isolado
apresentou atividade carbapenemase no teste de hidrólise, no entanto, no MALDI-TOF
quatro isolados apresentaram resultados duvidosos. Porém, a pesquisa de genes
codificadores de carbapenemases conhecidas foi negativa. Os genes cromossomais,
blaampC e blaOXA-50 foram amplificados entre as amostras estudadas e seu
sequenciamento revelou diversas mutações no gene blaOXA-50. O gene blaOXA-56 estava
presente em um isolado. A inibição in vitro da AmpC cromossomal e da expressão dos
sistemas de efluxo produziu uma variação de ≥ 2 diluições na CIMs dos
antimicrobianos testados para a maioria dos isolados testados. A média da expressão
relativa dos genes mexB, mexD, mexF e mexY nas 25 amostras de P. aeruginosa
foram 1,92; 2,69; 6,04 e 1,56, respectivamente, em relação à cepa referência PAO1. A
xviii
β-lactamase AmpC estava hiperexpressa em 40% dos isolados de P. aeruginosa,
enquanto todos os isolados tiveram redução da expressão de OprD. Uma alteração
na banda de 46 kDa foi identificada pelo SDS-PAGE em todos isolados clínicos
estudados. Os cinco isolados resistentes à ciprofloxacina apresentaram mutação na
QRDR dos genes gyrA e parC e apenas um dos isolados resistentes aos
aminoglicosídeos carregava o gene de resistência rmtD. Conclusão: Nossos
resultados sugerem o envolvimento de múltiplos mecanismos cromossomais, como a
hiperexpressão da β-lactamase cromossomal AmpC e a redução da expressão de
OprD no fenótipo de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de
amplo espectro entre isolados clínicos de P. aeruginosa.
xix
Introdução
1. INTRODUÇÃO
Pseudomonas aeruginosa é um dos principais agentes de infecção relacionada
à assistência a saúde em todo o mundo e no Brasil, estando principalmente associada
a infecções em pacientes imunocomprometidos (Stover et al., 2000). Com base nos
dados publicados pelo programa SENTRY de vigilância de resistência aos
antimicrobianos, na América Latina, P. aeruginosa é o patógeno mais frequente
isolado em casos de pneumonia; o terceiro patógeno mais frequente em infecções de
pele e tecidos moles e o quinto em infecções de corrente sanguínea (Gales et al.,
2012). P. aeruginosa é o quinto patógeno isolado em infecções de corrente sanguínea
segundo dados do programa SCOPE no Brasil (Marra et al., 2011).
A alta prevalência de infecções causadas por esses patógenos e sua grande
importância clínica são atribuídas a sua versatilidade, a sua capacidade de adaptação
à condições ambientais adversas, a sua resistência inata a múltiplos antimicrobianos,
e a sua capacidade de adquirir múltiplos genes de resistência (Poole, 2001).
A resistência intrínseca a diversas classes de antimicrobianos utilizados na
clínica se dá pela produção induzível da β-lactamase cromossomal AmpC, pela perda
ou diminuição da expressão de porinas e pela hiperexpressão de sistemas de efluxos
(Livermore & Woodford, 2006; Lister et al., 2009). No entanto, além da resistência
intrínseca apresentada por P. aeruginosa, essa espécie apresenta uma capacidade
importante de aquisição de outros genes de resistência, principalmente aqueles que
codificam distintas β-lactamases. A produção de β-lactamases é o principal
mecanismo de resistência aos β-lactâmicos em bactérias Gram-negativas (Livermore,
1995). Frequentemente, esses mecanismos coexistem em uma mesma cepa
bacteriana, o que confere resistência combinada a vários antimicrobianos (McGowan,
2006).
Os β-lactâmicos constituem a principal opção terapêutica para o tratamento das
infecções causadas por P. aeruginosa (Poole, 2004). No entanto, há aumento
gradativo da resistência aos β-lactâmicos, incluindo os carbapenens durante a última
1
Introdução
década nos países da América Latina, com maior proeminência no Brasil (Gales et al.,
2001; Andrade et al., 2003; Andrade et al., 2008; Gales et al., 2012). Os carbapenens
constituem uma importante opção terapêutica para o tratamento de infecções
causadas por P. aeruginosa, devido a sua estabilidade frente a uma ampla variedade
de β-lactamases em comparação aos outros antimicrobianos da classe dos βlactâmicos. Por essa razão, os carbapenens apresentam um particular valor no
tratamento
de
infecções
causadas
por
bactérias
resistentes
a
múltiplos
antimicrobianos e produtoras de β-lactamases (Hawkey et al., 2001).
Nos últimos anos tem-se observado uma disseminação de P. aeruginosa
produtoras de MβL, GES-5 e ESβL no Brasil. Para estas últimas, muitas vezes os
carbapenens ainda podem ser utilizados para o tratamento das infecções (Martins et
al., 2007; Picão et al., 2009; Polotto et al., 2012). Entretanto, o fenótipo de resistência
aos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de amplo espectro, assim como
sensibilidade a outras classes de antimicrobianos, tem se tornado cada vez mais
comum. Juntamente a este fenótipo, questionamentos e dúvidas a respeito do
tratamento mais eficaz a ser adotado contra as infecções por microrganismos que
exibem esse fenótipo têm sido feitos.
Embora existam muitos estudos sobre resistência aos antimicrobianos em
isolados clínicos de P. aeruginosa, não há até o momento a descrição deste fenótipo
de resistência entre isolados clínicos de P. aeruginosa. Dada a importância dos
carbapenens no tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa, é essencial que
se conheça os mecanismos envolvidos neste fenótipo incomum, assim como a
prevalência dos mesmos. O conhecimento destes mecanismos é de suma
importância, pois altas taxas de resistência aos carbapenens têm sido observadas em
P. aeruginosa e o tratamento das infecções causadas por estes patógenos restringemse às polimixinas.
2
Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Principal

Determinar os mecanismos de resistência que pudessem justificar o
fenótipo incomum, resistência aos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de
amplo espectro, em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa.
2.2 Objetivos Secundários

Confirmar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos nos isolados de
P. aeruginosa;

Determinar a relação genética entre os isolados de P. aeruginosa pela
técnica de PFGE;

Detectar o ponto isoelétrico (pI) dos isolados de P. aeruginosa;

Detectar a atividade enzimática contra os carbapenens nos isolados de
P. aeruginosa;

Pesquisar os genes codificadores de β-lactamases nos isolados de P.
aeruginosa;

Avaliar fenotipicamente a expressão das bombas de efluxo e da β-
lactamase cromossomal AmpC nos isolados de P. aeruginosa;

Avaliar a transcrição gênica dos sistemas de efluxo MexAB-OprM,
MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM, da β-lactamase cromossomal AmpC e da
proteína de membrana externa OprD nos isolados clínicos de P. aeruginosa;

Determinar o perfil de proteínas de membrana externa e a presença do
gene codificador da proteína de membrana externa OprD;

Pesquisar
os
mecanismos
de
envolvidos
na
resistência
às
fluoroquinolonas e aminoglicosídeos.
3
Revisão Bibliográfica
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Pseudomonas aeruginosa
O gênero Pseudomonas pertence à família Pseudomonadaceae e no ano de
1992, foi subdividida em outros gêneros, como Burkholderia, Stenotrophomonas,
Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas, Acidovorax e
Brevundimonas. O gênero Pseudomonas compreende cerca de duas mil espécies já
descritas, dentre elas P. aeruginosa, a espécie mais importante e estudada, P.
fluorescens, P. putida, P. stutzeri, P. alcaligenes (Moore et al., 2006; Murray et al.,
2010).
P. aeruginosa são bacilos Gram-negativos não fermentadores da glicose, não
esporulados e ligeiramente curvados. Medem aproximadamente 0,5 a 1 μm de largura
por 1,5 a 5 μm de comprimento e usualmente são móveis, possuindo um ou vários
flagelos polares. Podem ser isolado do solo, da água, de plantas e de animais. São
capazes de utilizar uma grande variedade de substratos orgânicos como fontes de
carbono e são oxidase positiva. Isolados de P. aeruginosa são estritamente aeróbios e
são facilmente reconhecidos pela sua morfologia característica, brilho metálico,
pigmentação e pelo forte odor de uva da sua colônia bacteriana (Gillardi, 1980;
Pollack, 2000; Koneman et al., 2001; Blondel-Hill et al., 2007).
Esta espécie produz quatro pigmentos importantes, são eles: piocianina (azul),
piomelanina (marrom-escuro/preto), piorrubina (vermelho) e pioverdina (amareloesverdiado/fluorescente). Dentre estes pigmentos, a piocianina é encontrada em
aproximadamente 80% dos isolados de P. aeruginosa, já a piomelanina e piorrubina
são produzidos por menos de 2% dos isolados clínicos de P. aeruginosa. A pioverdina
pode ser encontrada em outras espécies fluorescentes de Pseudomonas spp. (Visca
et al., 1992; Pollack, 1995).
Raramente, P. aeruginosa causa infecções em indivíduos saudáveis, no
entanto, sua baixa necessidade de nutrientes para o crescimento, sua tolerância a
uma série de condições físicas adversas e sua resistência intrínseca e adquirida a
4
diversas classes de agentes antimicrobianos fez desta espécie um importante
patógeno relacionado à etiologia de infecções relacionadas à assistência à saúde
(Blondel-Hill et al., 2007; Pappas et al., 2009; Strateva & Yordanov, 2009).
3.2 Epidemiologia das Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa é um patógeno oportunista humano ubíquo de grande valor
clínico e representa uma das principais causas de infecções relacionadas à
assistência a saúde. Apresenta uma grande capacidade de adaptação ao ambiente
hospitalar, sendo isolado de diversas fontes, incluindo equipamentos de ventilação
mecânica e de diálise (Mandell et al., 2010; Murray et al., 2010).
Isolados de P. aeruginosa podem colonizar transitoriamente o trato respiratório,
gastrointestinal e áreas úmidas de pacientes hospitalizados e a grande maioria dos
casos de infecção estão relacionados ao uso de dispositivos invasivos, como
pneumonia associada à ventilação mecânica, bacteremia associada ao uso de cateter
vascular e infecção urinária relacionada ao uso de sonda vesical (Almirante et al.,
2012; Medell et al., 2013; Ortega et al., 2013). Também esta relacionada à meningite
pós-neurocirurgica, endocardite e infecção de sítio cirúrgico (Chang et al., 2010; Sousa
et al., 2012; Mackenzie et al., 2013). Também é um importante patógeno relacionado à
fibrose cística (Hoban et al., 2003; Gibson et al., 2003; Psoter et al., 2013).
Dados do National Nosocomial Infections Surveillance System – NNIS (agora
denominado como National Healthcare Safety Network - NHSN) mostram que esse
patógeno é o terceiro agente mais frequentemente associado à pneumonia ou sítio
cirúrgico, o quarto patógeno mais frequente em infecção do trato urinário e o quinto
mais comum em hemoculturas de pacientes com sepse (Richards et al., 2000).
Um estudo publicado por Gales e colaboradores, em 2001, na qual foram
avaliadas amostras de P. aeruginosa isoladas de cinco regiões geográficas (ÁsiaPacífico, Canadá, Europa, América Latina e Estados Unidos da América) mostrou que
as taxas de resistências aos β-lactâmicos entre os isolados de P. aeruginosa,
5
provenientes da América Latina, eram mais elevadas em comparação àquelas
apresentadas por isolados provenientes de outras regiões geográficas. Neste mesmo
estudo, a distribuição dos isolados de P. aeruginosa por sítio corpóreo de infecção foi
o mesmo para todas as regiões: trato respiratório, seguido por pele e tecidos moles,
urina e corrente sanguínea.
Ainda na América Latina, segundo dados do Programa de Vigilância de
Resistência a Antimicrobianos - SENTRY, P. aeruginosa foi o terceiro patógeno mais
frequentemente isolado, precedido apenas por Staphylococcus aureus e Escherichia
coli. Ainda de acordo com este estudo, este patógeno foi a causa mais frequente de
infecções do trato respiratório inferior, a terceira causa mais frequente de infecções
urinárias e de pele e tecidos moles e o quinto patógeno mais comum em infecções de
corrente sanguínea, no período entre 1997 e 2001 (Sader et al., 2004).
Além disso, dados do Programa SENTRY no Brasil, revelaram que 30,2% das
amostras de P. aeruginosa coletadas em centros brasileiros, entre 1997 e 2001, eram
resistentes aos carbapenens, e quando foram analisados isolados de pacientes
internados em unidades de terapia intensiva, esta taxa aumentava para 40% (Sader et
al., 2001).
Mais recentemente, outro estudo de Gales e colaboradores (2012), demonstrou
que P. aeruginosa foi o patógeno mais frequentemente isolado em pacientes com
pneumonia hospitalar, o terceiro patógeno mais frequente em pele e tecidos moles e o
quinto patógeno mais comum em infecções da corrente sanguínea. A taxa de
resistência a imipenem no Brasil aumentou do período de 1997-1999 (34,1%) em
relação ao período de 2003-2005 (42,0%), no entanto se manteve estável em relação
ao período de 2008-2010 (42,1%).
P. aeruginosa é considerado o patógeno mais frequentemente associado a
infecções por pacientes hospitalizados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs).
Segundo estudo do MYSTIC no Brasil, P. aeruginosa foi o patógeno mais
frequentemente recuperado (30,3%) e estava relacionada a infecções da corrente
6
sanguínea, trato respiratório, trato urinário e pele e tecidos moles. Sendo a taxa de
resistência a imipenem de 36,6% nestes isolados (Kiffer et al., 2005).
Segundo dados do programa SCOPE Brasil (The Brazilian Surveillance and
Control of Pathogens of Epidemiologic Importance), P. aeruginosa foi recuperado em
3,9% dos casos das infecções de corrente sanguínea em pacientes pediátricos, sendo
a resistência aos carbapenens superior a 20%. A taxa de mortalidade foi de 14,3% nas
infecções por P. aeruginosa (Pereira et al., 2013). Um estudo anterior do programa
SCOPE em 16 hospitais brasileiros demonstrou que P. aeruginosa foi o quinto (8,9%)
patógeno mais frequentemente recuperado de infecção de corrente sanguínea. Sendo
que 33,9%, 36,6%, 42,9%, 36,8% e 35,8% dos isolados eram resistentes à
piperacilina-tazobactam,
ceftazidima,
cefepime,
imipenem
e
meropenem,
respectivamente (Marra et al., 2011).
Na maioria das vezes, as infecções causadas por esse patógeno são difíceis
de serem tratadas devido à resistência natural dessa espécie, bem como a sua notável
capacidade em adquirir novos genes de resistência a diversos grupos de
antimicrobianos.
3.3 Mecanismos de resistência em Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa pode apresentar resistência a uma grande variedade de
antimicrobianos, entre eles os β-lactâmicos, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas,
tetraciclinas e cloranfenicol. Dentre os mecanismos envolvidos, os principais são:
alteração na permeabilidade da membrana externa, hiperexpressão dos sistemas de
efluxo, produção de β-lactamases, enzimas modificadoras de aminoglicosídeos e
alteração do alvo das fluoroquinolonas (Livermore & Woodford, 2006; Lister et al.,
2009).
3.3.1 Produção de -Lactamases
Em bactérias Gram negativas, a produção de β-lactamases é o principal
mecanismo de resistência aos β-lactâmicos (Bush, 2001). Essas enzimas agem
7
inativando, pela catalisação do anel β-lactâmico, os β-lactâmicos antes que eles se
liguem as proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs), que se localizam na membrana
celular interna (Bush et al., 1995; Livermore & Woodford, 2006). Em bactérias Gram
negativas, as β-lactamases se concentram no espaço periplasmático, diferentemente
das bactérias Gram positivas. O gene para a codificação das β-lactamases pode estar
localizado no DNA cromossômico, ou em plasmídeos e transposons, sendo estes
genes inatos ou adquiridos (Livermore, 1995).
As β-lactamases apresentam uma grande diversidade estrutural e de espectro
de atividade, fazendo que com isso, seja difícil estabelecer um sistema de
classificação. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de maior
importância, as classificações de Ambler e a de Bush, Jacoby e Medeiros (Ambler,
1980; Bush et al., 1995), sendo que a última classificação foi revista em 2010 (Bush &
Jacoby, 2010).
As Classes A, C e D agem por meio de um mecanismo serino-dependente,
enquanto a classe B ou metalo--lactamases (ML) utiliza o zinco como co-fator para
sua ação hidrolítica (Ambler, 1980; Livermore, 1995). Um número significativo de lactamases de todas as classes moleculares são encontrados em P. aeruginosa,
incluindo as ESLs das classes A, B e D (Zhao and Hu, 2010).
3.3.1.1 Serino--Lactamases – Classe A
As enzimas classificadas nos grupos 2b e 2c incluem as β-lactamases de
espectro limitado e que são inibidas pelos inibidores de serino-β-lactamases. Essas
enzimas apresentam potente atividade contra as penicilinas e as cefalosporinas de
primeira e segunda geração. Entre as enzimas pertencentes ao subgrupo 2b, TEM-1,
TEM-2, TEM-90, TEM-110 e SHV-1 já foram identificadas em isolados clínicos de P.
aeruginosa, enquanto que, entre as β-lactamases pertencentes ao grupo 2c, as
variantes PSE-1, PSE-4, CARB-3, CARB-4 e AER-1 também já foram descritas nessa
espécie (Strateva & Yordanov 2009; Zavascki et al., 2010).
8
As β-lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs) estão incluídas no grupo de
enzimas da classe A (subclasse 2be), que apresentam atividade hidrolítica contra as
penicilinas, às cefalosporinas e o aztreonam. A maioria dessas enzimas é sensível à
ação dos inibidores de serino-β-lactamase (Paterson & Bonomo, 2005). ESβLs foram
descritas inicialmente em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli e, posteriormente,
se disseminaram para as demais espécies de enterobactérias. No entanto, no início da
década de 90, a produção de enzimas do tipo ESβL passou a ser observada também
entre isolados clínicos de P. aeruginosa (Weldhagen et al., 2003) e, atualmente, já
foram descritas os seguintes grupos de ESβL de classe A em P. aeruginosa: TEM,
SHV, PER, VEB, GES, BEL e CTX-M (Strateva & Yordanov, 2009). No Brasil já houve
relatos de GES-1 e CTX-M-2 em isolados de P. aeruginosa (Castanheira et al., 2004a;
Pellegrino et al., 2006a; da Fonseca et al., 2007; Picão et al., 2009a; Picão et al.,
2009b).
As β-lactamases do tipo GES foram inicialmente classificadas como ESβL, no
entanto, variantes com atividade carbapenemase já foram descritas. São elas: GES-2
em P. aeruginosa na África do Sul, GES-5 no Brasil, GES-13 na Grécia e a GES-18 na
Alemanha (Picão et al., 2009b; Poirel et al., 2001; Kotsakis et al., 2010; Bebrone et al.,
2013).
As serino-carbapenemases ou carbapenemases de classe A pertencem ao
grupo 2f de Bush (Bush & Jacoby, 2010) e a classe molecular A de Ambler (Ambler,
1980). Dentre todas as carbapenemases de classe A descritas, as mais importantes e
disseminadas são as enzimas do tipo KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase).
Essas β-lactamases têm sido descritas com maior frequência tanto em isolados
clínicos de enterobactérias, como em P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (Queenan &
Bush, 2007; Robledo et al., 2010). São normalmente codificadas por genes localizados
em plasmídeos e hidrolisam todos os agentes β-lactâmicos, incluindo penicilinas,
cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens (Queenan & Bush, 2007). Estas
enzimas são inibidas pelos inbidores das serino-β-lactamase, como o ácido
9
clavulânico, o tazobactam e o sulbactam. Elas também são inibidas pelo ácido
borônico e seus derivados. KPC-2 foi reportada pela primeira vez em P. aeruginosa na
Colômbia em 2007, seguido por relatos em Porto Rico, Trindade e Tobago e nos
Estados Unidos (Akpaka et al., 2009; Poirel et al., 2010c; Robledo et al., 2011). No
Brasil, o primeiro relato de KPC-2 em isolados clínicos de P. aeruginosa ocorreu em
Recife (Jácome et al., 2012).
3.3.1.2 Metallo-β-lactamases (MβL) – Classe B
As MβLs classificadas no grupo funcional 3 e classe molecular B e são notáveis
por seu amplo espectro de atividade, podendo degradar todas as classes de βlactâmicos. Diferem-se das outras β-lactamases por: (i) requerem íons Zn+2 ou outros
cátions divalentes como cofator no sítio ativo; (ii) são resistentes à ação dos inibidores
das serino-β-lactamases, embora sofram inibição por agentes quelantes como o
EDTA, derivados do tiol e ácido dipicolínico; e (iii) não hidrolisam o monobactâmico
aztreonam (Payne et al., 1997; Walsh et al., 2005). As MβLs se dividem em dois
grupos, as MβLs intrínsecas, e as adquiridas ou móveis (Laraki et al., 1999; Chen et
al., 2003; Bebrone, 2007).
O grupo das MβLs é representado por enzimas, como: IMP (imipenemase
metallo-β-lactamase), VIM (Verona imipenemase metallo-β-lactamase), SPM (São
Paulo metalo-β-lactamase), GIM (German imipenemase metallo-β-lactamase), SIM
(Seul imipenemase metallo-β-lactamase), NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase),
AIM (Australian imipenemase metallo-β-lactamase), KHM-1 (Kyorin Health Science
metallo-β-lactamase), DIM-1 (Dutch Imipenemase metallo-β-lactamase), SMB-1
(Serratia
metallo-β-lactamase),
TMB-1
(Tripoli
metallo-β-lactamase)
e,
mais
recentemente a FIM-1 (Florence imipenemase metallo-β-lactamase) (Osano et al.,
1994; Lauretti et al., 1999; Toleman et al., 2002; Castanheira et al., 2004b; Lee et al.,
2005a; Yong et al., 2009; Yong et al., 2012; Sekiguchi et al., 2008; Poirel et al., 2010b;
Wachino et al., 2011; El Salabi et al., 2012; Pollini et al., 2013).
10
As MβLs têm sido descritas em diversas espécies bacterianas, tais como:
Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae
(Poirel et al., 2000; Riccio et al., 2000; Yan et al., 2001). Estes genes estão inseridos,
quase sempre, em elementos genéticos móveis. Em isolados de Pseudomonas spp. já
foram descritas as MβLs IMP, VIM, SPM-1, GIM-1, AIM-1, TMB-1 e FIM-1, sendo que
no Brasil
já foram descritas as variantes IMP-1, IMP-16, IMP-18, VIM-2 porém
isolados produtores de SPM-1 são os mais frequentes devido à disseminação de um
único clone no território brasileiro (Mendes et al., 2004; Mendes et al., 2007; Xavier et
al., 2006; Gales et al., 2003; Zavascki et al., 2005; Carvalho et al., 2006; Pellegrino et
al., 2006b; Cipriano et al., 2007).
3.3.1.3 -Lactamase cromossomal AmpC – Classe C
Assim como algumas espécies da família Enterobacteriaceae (Citrobacter
freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Providencia stuartii, e Morganella
morganii), P. aeruginosa, produz uma β-lactamase cromossomal AmpC induzida que
pertence ao grupo funcional 1 ou classe molecular C (Bush et al., 1995; Jacoby, 2009;
Philippon et al., 2002). A atividade da β-lactamase cromossomal AmpC não é inibida
por inibidores de β-lactamase utilizados na prática clínica.
A
β-lactamase
cromossomal
AmpC
ou
cefalosporinase
cromossomal
normalmente é produzida em pequenas quantidades e determina resistência apenas
às penicilinas, à maioria das cefalosporinas de primeiras gerações e às cefamicinas
(Langaee et al., 2000). Entretanto, na presença de um β-lactâmico indutor
(especialmente imipenem) a produção desta enzima pode aumentar de 100 a 1000
vezes (Bagge et al., 2002; Ni et al., 2005). Esse fenótipo é conhecido como
desreprimido e pode levar à resistência às cefalosporinas de quarta geração (Jacobs
et al., 1997; Schmidtke & Hanson, 2006; Jacoby, 2009).
Esta β-lactamase é codificada pelo gene ampC (Lodge et al., 1993) e três
genes, principalmente, estão envolvidos no mecanismo de indução: ampG, ampD e
ampR (Lodgee & Piddock, 1991; Jacobs et al., 1997). Os mecanismos de regulação da
11
β-lactamase cromossomal AmpC em P. aeruginosa é semelhante aquele descrito em
E. cloacae e está intimamente ligado a reciclagem do peptideoglicano (Jacobs et al.,
1994; Höltje et al., 1994; Normark, 1995).
O gene, ampG, codifica uma proteína transmembrana envolvida na
permeabilidade do tripeptídeo N-acetilglucosamina(GluNac)-1,6-anhMurNac, que é
convertido em uma molécula sinalizadora citoplasmática para indução da β-lactamase
cromossomal AmpC (Dietz, et al., 1996). Sem o gene ampG, nem a indução e nem os
altos níveis de expressão seriam possíveis (Korfmann & Sanders, 1989; Dietz, et al.,
1997). O segundo gene, ampD, codifica uma proteína citosólica, N-acetilmuramil-Lalanina amidase, que hidrolisa o tripeptídeo 1,6-anhidro-N-acetilmuramico, atuando
como um repressor da expressão ampC (Höltje et al., 1994; Jacobs et al., 1994;
Jacobs et al., 1995). A inativação da proteína AmpD leva a uma hiperprodução semiconstitutiva ou hiperinduzida de AmpC em P. aeruginosa PAO1 (Langaee et al., 2000).
A mutação no gene ampD que resulta na expressão de β-lactamases, mesmo na
ausência de um indutor, coincide com o acumulo do tripeptídeo 1,6-anhMurNac
(Jacobs et al., 1995). O terceiro gene envolvido, ampR, é adjacente à ampC,
entretanto é transcrito de forma oposta, e codifica um ativador transcricional, membro
da família LysR (AmpR). Este regulador é necessário para a indução da β-lactamase
(Lodge et al., 1993). Na ausência de um β-lactâmico indutor, AmpR reprime a síntese
de β-lactamase em 2,5 vezes, enquanto que a expressão e induzida de 10 a 200
vezes na presença do β-lactâmico indutor (Lindberg & Normark, 1987; Jacobs et al.,
1997). Recentemente foi demonstrado que P. aeruginosa tem três homólogos de
AmpD, a proteína AmpD, AmpDh2 e AmpDh3, que são responsáveis por um
mecanismo de regulação positiva levando a hiperexpressão constitutiva desta
cefalosporinase (Juan et al., 2006).
Um quarto gene, ampE, forma um operon ampDE e codifica uma proteína de
membrana citoplasmática, que atua como um molécula sensorial necessária para a
indução (Honore et al., 1989).
12
Estudos recentes mostram que outros genes podem estar envolvidos na
expressão da -lactamase cromossomal AmpC. O gene dacB codifica a proteína de
ligação à penicilina 4 (PBP-4) e a inactivação do gene dacB resulta em um alto nível
de resistência aos β-lactâmicos e a hiperprodução de AmpC (Moyá et al., 2009). O
gene nagZ codifica uma β-N-acetil-D-glucosaminidase, e inativação deste gene em P.
aeruginosa parece diminuir a resistência aos β-lactâmicos (Asgarali et al., 2009). A
inativação de nagZ em dacB ou ampD mutantes impede a hiperexpressão de ampC,
no entanto, a inativação deste gene não parece prejudicar a indução da AmpC
(Zamorano et al., 2010). Vários sistemas parecem estar envolvidos na expressão e
indução do gene ampC, e ainda não é totalmente compreendido o sistema de
regulação deste gene.
A resistência ou sensibilidade intermediária ao imipenem em isolados clínicos
de P. aeruginosa pode estar relacionado com a desrepressão da β-lactamase
cromossomal AmpC associada a modificação estrutural ou perda da OprD (Gutiérrez
et al., 2007). Em 2009, foram descritas as AmpCs de espectro ampliado (ESAC Extended-Spectrum AmpC). Neste estudo as CIMs para ceftazidima e imipenem
tiveram redução na presença de cloxacilina. O gene, ampC, apresentava uma
mutação ocasionando a substituição de um aminoácido específico (T105A) no sítio ativo
da enzima, resultando na ampliação do espectro hidrolítico da enzima, sendo,
portanto, capazes de hidrolisar cefepima e o imipenem (Rodriguez-Martinez et al.,
2009a).
3.3.1.4 Oxacilinases (OXA) – Classe D
As oxacilinases estão incluídas na classe D de Ambler e seu grupo funcional
apresentado pelas classificações 2d (oxacilinases de espctro restrito), 2de (βlactamases de espectro ampliado - ESβL) e 2df (Carbapenem- Hydrolyzing Class D βLactamase - CHDLs). As OXAs receberam essa designação por apresentarem
atividade hidrolítica potente contra as penicilinas resistentes à ação das penicilinases
(oxacilinases, cloxacilina e meticilina). Uma característica importante deste grupo é de
13
ser fracamente inibida pelo ácido clavulânico e fortemente inibida pelo cloreto de sódio
(Poirel et al., 2010a).
As oxacilinases podem ser divididas em quatro subgrupos: OXA-1, OXA-2,
OXA-10 e outros (Poirel et al., 2010a). Sendo que o grupo da OXA-10 constitui as βlactamases do tipo OXA mais prevalentes entre isolados clínicos de P. aeruginosa. No
entanto, recentemente foi observado pela análise da similaridade das sequências de
nucleotídeos que as oxacilinases poderiam ser divididas em 10 grupos, sendo eles:
OXA-1, OXA-2, OXA-5, OXA-10, OXA-18, OXA-20, OXA-45, OXA-46, OXA-50 e OXA198 (Petrolini et al., 2013). A OXA-56, uma oxacilinase do grupo da OXA-10, foi
descrita em um isolado de P. aeruginosa produtor de SPM-1 no Brasil. Esta enzima
apresenta espectro hidrolítico restrito. Este gene esta relacionado com a disseminação
de SPM-1 e rmtD em P. aeruginosa no nosso país (Poirel et al., 2004a). As ESβLs do
tipo OXA hidrolisam muito bem a oxacilina e a cloxacilina e não apresentam
similaridade genética com as demais ESβLs e são mais frequentemente descritas em
P. aeruginosa (Poirel et al., 2010a).
Em P. aeruginosa, ocorre uma oxacilinase cromossômica e intrínseca,
denominada OXA-50, pertencente ao subgrupo 2df. Esta oxacilinase apresenta uma
diminuição na sensibilidade à ampicilina e ticarcilina e, curiosamente, a moxalactam e
meropenem. É uma oxacilinase de espectro restrito (Girlich et al., 2004). Já foram
descritas 10 variantes desta OXA, denominadas, OXA-50a a OXA-50j (Empel et al.,
2007; Seok et al., 2011).
Até o momento somente a variante de CHDLs, OXA-24/40, foi descrita em dois
isolados clínicos de P. aeruginosa na Espanha (Sevillano et al., 2009), sendo estas
CHDLs, mais frequentes em isolados de A. baumannii. No entanto, a OXA-198
descrita em um isolado de P. aeruginosa, é uma carbapenemase também pertencente
ao subgrupo 2df e que apresenta resistência à maioria dos β-lactâmicos, incluindo o
imipenem, mas apresentou uma sensibilidade intermediária ao meropenem. Contudo,
o isolado manteve-se sensível à ceftazidima e ao aztreonam (El Garch et al., 2011).
14
3.3.2 Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo
A resistência inata em isolados de P. aeruginosa é em grande parte
determinada pela interação entre a baixa permeabilidade da membrana externa e o
efluxo ativo de antimicrobianos (Livermore, 2002). Sistemas de bombas de efluxo são
um importante mecanismo não enzimático de resistência aos β-lactâmicos em P.
aeruginosa. Esses sistemas contribuem também para o desenvolvimento da
resistência múltipla a todos antimicrobianos com ação frente à Pseudomonas spp..
Os sistemas de efluxo são classificados levando em consideração três critérios
básicos: (i) a fonte de energia utilizada pelo sistema, (ii) a relação filogenética com
outros sistemas de efluxo e (iii) a especificidade de substratos. São agrupados em
cinco famílias: ABC ("ATP binding cassette"), MFS ("major facilitator superfamily"),
SMR ("small multidrug resistance"), MATE ("multidrug and toxic compound extrusion")
e RND ("resistance-nodulation division"), distribuídos tanto em bactérias Gram
negativas, como também em Gram positivas (Piddock, 2006; Lister et al., 2009).
A família RND de sistemas de efluxo é a que possui especificidade a um maior
número de substratos e engloba antimicrobianos de relevância clínica. Desempenha
um importante papel na resistência intrínseca e adquirida em diversas bactérias Gram
negativas. Geralmente, os genes que codificam os sistemas de efluxo pertencentes a
essa família estão localizados no cromossomo bacteriano (Piddock, 2006).
A habilidade do sistema de efluxo em reconhecer um grande número de
compostos é, provavelmente, devido à hidrofobicidade, à aromaticidade e ao caráter
ionizável (Saier et al., 1998). A grande maioria dos antimicrobianos são anfifílicos
(possuem características hidrofílicas e hidrofóbicas), sendo assim, facilmente
reconhecidos por varias bombas de efluxo (Kaatz, 2002). No entanto, cada sistema de
bomba de efluxo tem afinidade preferencial por determinados antimicrobianos. As
fluoroquinolonas são substratos universais de todas as bombas do tipo Mex (Piddock,
2006).
15
Enquanto as outras famílias de efluxo são constituídas por um componente
simples, a família RND é baseada na abertura de um canal que atravessa as
membranas interna e externa bacteriana. Esse canal é um sistema de três
componentes. O primeiro componente é uma proteína, que é a bomba propriamente
dita, localizada na membrana citoplasmática, dependente de energia, e funciona como
elemento transportador (MexB, MexD, MexF, MexY); o segundo componente é uma
proteína de membrana externa, denominada porina (OprM, OprJ, OprN, OpmB,
OmpG, OmpI). A terceira proteína localiza-se no espaço periplasmático e liga os
outros dois componentes (MexA, MexC, MexE, MexY) (Livermore, 2002). Os genes
que codificam esses sistemas estão organizados em operons, nos quais o primeiro
codifica a proteína periplasmática, o segundo a proteína transportadora e o terceiro
gene codifica a proteína de membrana externa (Lister et al., 2009).
Dez desses sistemas foram caracterizados até o momento: MexAB-OprM
(ABM), MexCD-OprJ (CDJ), MexEF-OprN (EFN), MexXYOprM (XY), MexJK-OprM,
MexGHI-OpmD, MexVW-OprM, MexPQ-OpmE, MexMN-OprM e TriABC-OpmH (Lister
et al., 2009; Strateva & Yordanov 2009). Apenas os sistemas de efluxo ABM, CDJ,
EFN e XY têm sido relacionados à resistência intrínseca e adquirida a uma ampla
variedade de agentes antimicrobianos de importância clínica em P. aeruginosa.
MexAB-OprM
MexAB-OprM é o sistema de efluxo mais importante em P. aeruginosa. É
expresso constitutivamente e desempenha um importante papel na resistência
intrínseca e adquirida a múltiplos antimicrobianos (Masuda et al., 2000). Os substratos
preferenciais de ABM são variados e esta bomba ejeta: β-lactâmicos, os inibidores de
β-lactamases, fluoroquinolonas, macrolídeos, tetraciclinas, cloranfenicol entre outros
(Narita et al., 2003). Entre os β-lactâmicos ejetados estão os carbapenens, exceto o
imipenem, devido à diferença na sua estrutura química (Yoneyama et al., 2000;
Livermore, 2002; Strateva & Yordanov, 2009).
16
A hiperexpressão desse sistema pode ser observada em três tipos mutantes:
nalB, nalC e nalD. Os mutantes nalB apresentam alterações no gene mexR localizado
à montante do operon mexAB-oprM, que codifica uma proteína repressora da sua
transcrição (Saito et al., 1999; Saito et al., 2001). Os mutantes nalC apresentam o
gene mexR intacto, mas no entanto apresentam uma uma mutação no gene PA3721,
também chamado de nalC. A proteína codificada por este gene atua como um
repressor que aparentemente, possui a capacidade de inibir a atividade de MexR
(Srikumar et al., 2000; Cao et al., 2004). Mais recentemente, mutantes nalD foram
encontrados. Eles apresentam uma mutação no gene PA3574, qua atua ligando-se a
região promotora, aumentando a expressão do sistema ABM (Sobel et al., 2005).
MexCD-OprJ
O sistema CDJ não é expresso constitutivamente em P. aeruginosa, e assim
não contribui para a resistência intrínseca. Porém, a hiperexpressão do sistema
MexCD-OprJ pode ser observada entre isolados clínicos de P. aeruginosa com
mutações no gene nfxB, repressor da transcrição desse sistema de efluxo, localizado
na região à montante do operon MexCD-OprJ (Poole et al., 1996). Este sistema de
efluxo
exportam
predominantemente
quinolonas,
tetraciclinas,
cloranfenicol,
acriflavina, entre outros (Masuda et al., 1996; Poole et al., 1996; Li et al., 2000).
Mesmo esse sistema não possuindo como substrato preferencial os agentes βlactâmicos, ele é capaz de extruir cefalosporinas, especialmente, as de quarta geração
(Strateva & Yordanov, 2009).
Mutantes nfxB podem apresentar sensibilidade à carbenicilina, à ceftazidima,
ao aztreonam e aos aminoglicosídeos, provavelmente pela diminuição da expressão
de ABM, decorrente do mecanismo de corregulação da expressão desses sistemas
(Poole et al., 1996; Lister et al., 2009, Masuda et al., 2000).
MexEF-OprN
A expressão de MexEF-OprN ocorre em cepas selvagens de P. aeruginosa em
baixos níveis. A transcrição deste sistema é dependente da presença de MexT, uma
17
proteína ativadora da sua transcrição, codificada por um gene localizado à montante
do operon MexEF-OprJ. A transcrição de mexT é suficiente para ativar a expressão
desse operon (Maseda et al., 2004). Este sistema é expresso em cepas denominadas
nfxC, que apresentam resistência a múltiplas drogas como às fluoroquinolonas, ao
cloranfenicol e ao trimetoprim, como consequência da ejeção direta, e indiretamente
ao imipenem (Hooper et al., 1992; Fukuda et al., 1995). Os mutantes nfxC,
apresentam aumento da sensibilidade aos β-lactâmicos e aos aminoglicosídeos, por
meio da diminuição da expressão de outros sistemas como ABM e XY (Okamoto et
al., 2002; Wolter et al., 2004a).
A resistência ao imipenem exibida pelos mutantes nfxC pode ser explicada pela
redução da expressão de OprD, já que acredita-se que MexT possui uma função
regulatória repressora, implicando na inibição pós-transcricional da expressão da
porina OprD (Kolayli et al., 2004; Wolter et al., 2004a; El AN et al., 2005). Em mutantes
nfxC, que hiperexpressam EFN foi observado o aumento da expressão de fatores de
virulência em P. aeruginosa (Maseda et al., 2004).
MexXY-OprM
O operon mexXY, diferentemente dos outros sistemas de efluxo em P.
aeruginosa, não possui o gene codificador de proteína de membrana externa. Para
esta função utiliza a OprM, que exerce o mesmo papel de canal ejetor como nos
outros sistemas de efluxo (Poole 2001). A deleção de mexXY aumenta a sensibilidade
aos aminoglicosídeos, à tetraciclina e à eritromicina, indicando que esse sistema é
responsável pela resistência intrínseca de P. aeruginosa a esses antimicrobianos
(Aires et al., 1999). Quando o sistema XY está hiperexpresso foi notada uma
diminuição na sensibilidade às fluoroquinolonas e, portanto, esra classe de
antimicrobianos constitui substrato para este sistema (Mine et al. 1999).
Mutações inativadoras no gene mexZ, localizado à montante do operon, levam
a hiperexpressão de XY, em decorrência da perda de sua atividade repressora. A
resistência aos β-lactâmicos, como a cefepima e a cefpiroma, está associada à
18
hiperexpressão desse sistema de efluxo, sendo o principal mecanismo responsável
pelo fenótipo de resistência à cefepima e sensibilidade à ceftazidima em isolados
clínicos de P. aeruginosa (Masuda et al., 2000; Hocquet et al., 2006).
MexJK-OprM
O sistema MexJK foi identificado como resultado da exposição ao triclosan,
uma droga com atividade antibacteriana, selecionando assim, a mutação do gene
mexL, cujo produto de sua expressão exerce a função regulatória do operon mexJKopmD (Chuanchuen et al., 2001; Chuanchuen et al., 2005b). Esse sistema,
diferentemente dos outros, utiliza diferentes proteínas de membrana externa,
dependendo do composto a ser ejetado. Para a ejeção de eritromicina e tetraciclina é
utilizada a OprM, enquanto que OmpH é utilizada para a extrusão de triclosan
(Chuanchuen et al., 2005a).
MexGHI-OpmD
O sistema MexGHI-OpmD contém além dos três componentes uma pequena
proteína, MexG, cuja função é desconhecida. Esse sistema confere resistência à
norfloxacina, brometo de etídio, acriflavina e rodamina 6G (Aendekerk et al., 2002).
MexVW-OprM
O MexVW foi o sistema de efluxo da família RND mais recentemente
caracterizado e confere resistência às fluoroquinolonas, à tetraciclina, ao cloranfenicol,
à eritromicina, ao brometo de etídio e à acriflavina (Li et al., 2003).
3.3.3 Impermeabilidade de Membrana Externa
As bactérias Gram negativas possuem em sua composição uma membrana
externa que fisiologicamente, caracteriza-se por ser a primeira linha de defesa contra
compostos tóxicos. Esta membrana é composta por fosfolipídeos, lipopolissacarídeos
e por proteínas de membrana externa (OMP, outer membrane protein) (Hancock &
Brinkman, 2002).
As OMPs, conhecidas como porinas, são responsáveis por controlar a
passagem, seletiva, de compostos, incluindo os antimicrobianos. Essas proteínas
19
formam canais constituídos de água no seu interior, permitindo a difusão passiva de
solutos hidrofílicos e a extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana
(Nikaido, 1994). A perda das porinas ou até mesmo a diminuição da expressão dos
genes codificadores destas, acarretam a redução da entrada do antimicrobiano na
célula, diminuindo assim, a sua concentração interna e contribuindo para o mecanismo
de resistência aos β-lactâmicos (Quinn et al., 1988; Hancock & Brinkman, 2002).
As porinas das bactérias Gram negativas vem sendo classificadas segundo sua
atividade, estrutura funcional, regulação e expressão (Pagès et al., 2008). Em isolados
de P. aeruginosa diferentes porinas podem ser encontradas, como, OprC, OprD, OprE
e OprF (Fung-Tomc et al., 1995, Huang & Hancock, 1996, Livermore, 2001).
OprF é a porina mais abundante na membrana externa de P. aeruginosa,
sendo provavelmente a mais utilizada na difusão dos β-lactâmicos para o interior da
célula. Muitos estudos sugerem que a OprF se assemelha a OmpA de E. coli na
estrutura e também na função (Hancock & Brinkman, 2002). OprC e OprE são canais
inespecíficos (Vila & Marco, 2002).
A OprD (conhecida também por D2) é uma porina, de aproximadamente 46
kDa, substrato-específica que facilita a difusão de aminoácidos e antimicrobianos para
dentro da célula. A principal função fisiológica da OprD é permitir a passagem passiva
dos aminoácidos básicos através da membrana externa. Esta porina é capaz de
permitir a entrada de carbapenens, mas não de outros β-lactâmicos (Yoshihara et al.,
1996). A perda da OprD ou a expressão reduzida do gene oprD, tem contribuído para
a resistência ao imipenem (Livermore, 2001). Estudos revelaram que os loops 2 e 3 da
proteína OprD são a entrada e/ou sítio de ligação para o imipenem. Assim, qualquer
mutação ou deleção nesses loops, poderia resultar na resistência ao imipenem (Ochs
et al., 2000; Pirnay et al., 2002; Chevalier et al., 2007). Sua associação com à
hiperexpressão de sistemas de efluxo, acarreta na diminuição significativa da
sensibilidade de P. aeruginosa a essa classe de antimicrobianos, afetando mais o
imipenem que o meropenem (Lister et al., 2009; Köhler et al., 1999). Vários estudos
20
demonstraram a seleção de isolados com mutações na OprD durante o tratamento
com imipenem das infecções causadas por P. aeruginosa (Cometta et al., 1994;
Jaccard et al., 1998; Zanetti et al., 2003).
A afinidade e a capacidade de difusão do imipenem através desta porina são
quase setenta vezes mais elevadas que para o meropenem (Nikaido et al., 1991).
Enquanto a concentração inibitória mínima (CIM) de imipenem dos isolados oprD
mutantes variam na faixa de 8 - 32 μg/mL as CIMs para meropenem são 2 - 4 μg/mL
(Köhler et al., 1999,. Pai et at., 2001).
Um estudo, demonstrou a presença de 19 proteínas com similaridade à porina
OprD. Pela análise filogenética foi possível identificar dois grupos distintos, sendo um
grupo menor que possuía alta similaridade com a porina OprD e um outro grupo que
possuia maior semelhança com a porina Phak de P. putida. Seis proteínas descritas
em P. aeruginosa (OpdJ, OpdI, OpdR, OpdO, OpdD e OpdQ) parecem ter surgido a
partir de eventos de duplicação, apresentando funções exclusivas para P. aeruginosa.
Além disso, nenhuma dessas seis proteínas homólogas a porina OprD foram
relacionadas à resistência aos antimicrobianos até o momento (Tamber et al., 2006).
A resistência antimicrobiana mediada por OprD pode envolver mecanismos que
diminuem a transcrição do gene oprD e/ou mutações que podem interromper o
funcionamento da porina na membrana externa (Lister et al., 2009). Alguns desses
mecanismos já foram caracterizados, sendo: (i) interrupção da transcrição da porina,
por meio de inserções e deleções na região à montante do gene promotor oprD; (ii)
transcrição imatura do gene oprD; (iii) deficiência na função da porina causada por
mutações, inserções e/ou deleções do gene e a presença de “stop codons”; (iv) e
disrruptura estrutural do gene oprD pela adição de elementos de inserção. Assim
como, a diminuição da transcrição por corregulação com mecanismos que conferem
resistência a metais ou com o sistema de efluxo MexEF-OprN (Evans & Segal, 2007;
Wolter et al., 2004b; Perron et al., 2004; Caille et al., 2007; Lister et al., 2009).
21
A perda de porinas menos específicas, pode afetar o transporte de pequenos
agentes hidrofílicos, tais como os aminoglicosídeos, as tetraciclinas e o cloranfenicol
(Zavascki et al.,2010).
3.3.4 Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs)
As proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) constituem o sítio de ação para a
classe de antimicrobianos dos β-lactâmicos. Essas enzimas estão envolvidas nas
etapas finais da síntese do peptideoglicano, sítio onde se ligam covalentemente aos βlactâmicos impedindo a formação da parede celular e levando à lise osmótica da
célula (Strateva & Yordanov, 2009).
O número de PBPs pode variar de acordo com cada espécie e são
denominadas numericamente de acordo com o peso molecular; quanto maior o peso
molecular, menor a numeração que recebem (Poole 2004; Zapun et al., 2008). Sete
PBPs diferentes já foram descritas em P. aeruginosa, são elas: 1a, 1b, 2, 3, 4, 6 e 7.
As PBP-1a, -1b, -2 e -3 desempenham funções essenciais e não essenciais para a
viabilidade da célula. Os carbapenens possuem afinididade pela PBP-2, enquanto as
cefalosporinas se ligam à PBP-3 (Poole, 2004; Strateva & Yordanov 2009; Zavascki et
al., 2010).
Apesar de relatos pouco frequentes, alterações nas PBPs já foram descritas
em isolados clínicos de P. aeruginosa. Alteração na PBP-4 em isolados de P.
aeruginosa após tratamento com imipenem e com piperacilina/tazobactam. E a
associação da produção da PBP-3 aumentada com a resistência aos β-lactâmicos
(Farra et al., 2008). Em 2012, Moyá e colaboradores notaram uma tendência para o
aumento da expressão da PBP-2 (imipenem) e da PBP-3 (ceftazidima e imipenem) em
isolados de P. aeruginosa apresentando resistência aos β-lactâmicos.
3.3.5 Resistência aos Aminoglicosídeos
A resistência aos aminoglicosídeos em P. aeruginosa está frequentemente
relacionada com a produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, seja pela
acetilação, fosforilação e/ou adenilação. Mas pode estar relacionada também a
22
alteração da permeabilidade de membrana, bombas de efluxo e, mais dificilmente, a
modificação do seu sítio de ação (Vakulenko & Mobashery, 2003; Poole, 2005; Magnet
& Blanchard, 2005).
Existem três classes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs):
acetiltransferases (AAC), adeniltransferases (ANT), fosfostransferases (APH). Essas
enzimas são codificadas por genes localizados em plasmídeos, transposons ou
integrons (Poole, 2005). AMEs são comuns em isolados de P. aeruginosa,
especialmente AAC (6’)-I (resistência à tobramicina, netilmicina e amicacina); AAC
(6’)-II (resistência à gentamicina, netilmicina e tobramicina); AAC (3)-I (resistência à
gentamicina); AAC (3)-II (resistência à gentamicina, netilmicina e tobramicina); ANT
(2’)-I (resistência à gentamicina e tobramicina) e APH(3’)-II (resistência à canamicina e
neomicina (Vanhoof et al., 1993; Miller et al., 1997; Torres et al., 2000; Llano-Sotelo et
al., 2002).
A metilação do gene 16S rRNA surgiu recentemente como um novo
mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos em bactérias Gram negativas (Doi &
Arakawa, 2007). Os genes das 16S rRNA metilases são geralmente localizados em
integrons, transposons e plasmídeos. Desde sua primeira descrição em 2003, 8 genes
de 16S rRNA metilase foram descritos: armA, rmtA, rmtB, rmtC, rmtD, rmtE, rmtF e
npmA, de varias regiões geográficas (Yokoyama et al., 2003; Wachino & Arakawa,
2012). As 16S rRNA metilases conferem elevado nível de resistência a todos os
aminoglicosídeos. Já sendo descritos em isolados de P. aeruginosa, RmtA (Yamane et
al., 2004; Jin et al., 2009), RmtB (Zhou et al., 2010), RmtD (Doi et al., 2007a; Doi et al.,
2007b; Lincopan et al., 2010), e ArmA (Gurung et al., 2010; Zhou et al., 2010). Sendo
que a RmtD está frequentemente relacionada com a coprodução de SPM-1 e ArmA
com a coprodução de IMP-1 (Doi et al., 2007a; Gurung et al., 2010).
Em 2007 El' Garch e colaboradores (2007) mostraram que o acúmulo de
mutações nos genes galU, nuoG, mexZ e rplY leva a um aumento progressivo na
resistência aos aminoglicosídeos. Mutações no gene galU levam a alterações no LPS
23
e, com isso, prejudicam a ligação dos aminoglicosídeos à superfície celular. A
ausência da expressão de nuoG inativa um complexo enzimático que contribui
significativamente para o gradiente eletroquímico da célula e, assim, prejudica a
absorção dos aminoglicosídeos. Os genes mexZ e rplY estão envolvidos na
hiperexpressão do sistema de efluxo MexXY-OprM ( El' Garch et al., 2007).
3.3.6 Resistência às Fluoroquinolonas
O alvo das fluoroquinolonas nas bactérias Gram negativas são as
topoisomerases tipo II (DNA-girase) e a topoisomerase IV. O principal mecanismo de
resistência de P. aeruginosa as fluoroquinolonas são as mutações nos genes que
codificam a DNA-girase. Essas mutações ocorrem nas regiões determinantes de
resistência às quinolonas (QRDRs) dos genes gyrA e parC. O alvo principal é a gyrA,
sendo as mutações no gene parC secundárias, mas geralmente associadas a níveis
mais altos de resistência. Ocorrem de maneira acumulativa através de mutações
simples no alvo primário da droga (Yonezawa et al., 1995; Zhao et al., 1997; Hawkey,
2003). Existem alguns relatos de sensibilidade reduzida devido a mutações no gene
gyrB (Le Thomas et al., 2001).
Sistemas de bombas de efluxo também estão envolvidos na resistência às
fluoroquinolonas em P. aeruginosa. Enquanto cada bomba de efluxo tem um conjunto
preferencial de substratos, as fluoroquinolonas são substratos para os quatro
principais sistemas de efluxo identificados em P. aeruginosa (Masuda et al., 2000).
Mutações nos genes reguladores mexR e nfxB, das bombas de efluxo MexAB-OprM e
MexCD-OprJ, respectivamente, estão relacionados a expressão aumentada destes
sistemas e envolvidos com a resistência às fluoroquinolonas (Higgins et al., 2003).
Um novo membro das bombas de efluxo da família RND, MexVW-OprM, foi
descrita em P. aeruginosa em 2003. Esta bomba confere resistência às
fluoroquinolonas, assim como, a outras classes de drogas (Li et al., 2003). A
resistência de alto nível às fluoroquinolonas em isolados de P. aeruginosa esta
24
atribuída à interação das mutações no QRDR e os sistemas de bomba de efluxo
(Nakajima et al., 2002; Wang et al., 2007).
Recentemente, a resistência às fluoroquinolonas mediada por plasmídeos foi
reportada em membros da família Enterobacteriaceae. O gene responsável por esta
resistência é chamado qnr (quinolone resistance), sendo já descrito os genes qnrA,
qnrS, qnrB, qnrC, qnrD e qnrVC (Ruiz et al., 2012). Em adição aos genes qnr, há
também, outro gene plasmidial, chamado aac(6’)-Ib-cr, capaz de inativar por
acetilação,
antimicrobianos
de
duas
classes
diferentes,
aminoglicosídeos
e
fluoroquinolonas. Duas bombas de efluxo plasmidiais, QepA e OqxAB, que atuam por
um mecanismo seletivo, já foram descritas (Périchon et al., 2007; Hansen et al., 2004).
No entanto, até o momento não há nenhum relato desses genes plasmidiais em
isolados de P. aeruginosa (Luzzaro, 2008; Coban et al., 2011).
3.4 Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Pseudomonas
aeruginosa
As opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por P.
aeruginosa muitas vezes são limitadas devido ao fato deste patógeno ser
intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Além disso, este microrganismo
é altamente adaptável às condições adversas, podendo desenvolver resistência
durante a terapia antimicrobiana à maioria dos antibióticos (Carmeli et al., 1999;
Tenover, 2006). Juntamente com estes fatores, o desenvolvimento de novos
antimicrobianos não ocorre na mesma velocidade (World Health Organization, 2012).
Os antimicrobianos da classe dos β-lactâmicos que apresentam atividade
contra P. aeruginosa e podem ser utilizados clinicamente são: as penicilinas, ticarcilina
e piperacilina, e suas respectivas associações com inibidores de β-lactamase (ácido
clavulânico e o tazobactam); as cefalosporinas de amplo espectro como a ceftazidima,
a cefepima e a cefoperazona; o monobactam aztreonam; e os carbapenens imipenem,
meropenem e doripenem.
25
Dentre os antimicrobianos não β-lactâmicos, podem ser utilizadas as
fluoroquinolonas, entre eles, ciprofloxacina, levofloxacina e moxifloxacina e em
associação aos β-lactâmicos, os aminoglicosídeos, como, gentamicina, tobramicina e
amicacina, na tentativa de potencializar a atividade antimicrobiana e de evitar o
desenvolvimento de resistência (Giamarellou & Kanellakopoulou, 2008; Pappas et al.,
2009).
No entanto, no panorama atual de resistência em P. aeruginosa, o tratamento
se restringe muitas vezes a drogas com alta toxicidade, como as polimixinas B e E
(colistina) (Zavascki et al., 2010).
26
Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostras Bacterianas
Foram avaliadas 25 (vinte e cinco) amostras clínicas de P. aeruginosa isoladas
de diferentes sítios de infecção (Tabela 1) de três diferentes hospitais da cidade de
São Paulo. Os isolados foram previamente triados como resistentes aos carbapenens
e sensíveis as cefalosporinas de amplo espectro, e assim, foram encaminhados ao
Laboratório ALERTA para caracterização dos mecanismos envolvidos neste fenótipo.
Tabela 1. Isolados de P. aeruginosa selecionados para este estudo de acordo com o sítio de
Infecção e os Hospitais de isolamento.
Isolados
Número do
Banco
Iniciais do
Paciente
Data de
coleta
Sítio de Infecção
Hospital de
Procedência
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P12070
P12119
P12255
P12249
P12713
P12714
P12715
P12716
P12717
P12718
P12719
P12720
P12721
P12722
P12723
P12724
P12725
P12726
P12727
P12728
P12729
P12730
P12731
P12732
P12733
J.A.N.
J.A.O.
J.D.T.
A.E.
A.C.C.
A.C.C.
M.R.V.
C.S.S.
A.C.C.
I.R.
V.A.B.
V.A.B.
A.C.L.
V.A.B.
D.G.O.
B.S.
B.S.
SN_M.F.O.S.
A.R.P.G
C.S.F.
A.C.L.
D.S.L.
A.J.
M.J.S.
SN_M.F.O.S.
07.05.12
13.06.12
14.09.12
04.06.12
28.01.13
28.01.13
28.01.13
31.01.13
04.02.13
07.02.13
08.02.13
08.02.13
09.02.13
17.02.13
19.02.13
19.02.13
21.02.13
24.02.13
24.02.13
25.02.13
01.03.13
01.03.13
02.03.13
11.03.13
13.03.13
Secreção Traqueal
Secreção Traqueal
Urina
Secreção Traqueal
Ponta de Cateter
Ponta de Cateter
Urina
Hemocultura
Ponta de Cateter
Urina
Secreção Traqueal
Secreção Traqueal
Lavado Bronco-Alveolar
Secreção Traqueal
Secreção Traqueal
Secreção Traqueal
Lavado Bronco-Alveolar
Urina
Secreção Traqueal
Secreção Traqueal
Secreção Traqueal
Ponta de Cateter
Urina
Secreção Traqueal
Hemocultura
H1
H1
H1
H2
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
H3
27
Material e Métodos
As amostras clínicas de P. aeruginosa avaliadas neste estudo foram isoladas
em três hospitais terciários, que atendem casos de alta complexidade na cidade de
São Paulo. Os três hospitais situam-se na Zona Sul da cidade e estão contidos em um
raio de aproximadamente 4 Km.
As amostras foram posteriormente bancadas em Tryptic Soy Broth – TSB
(Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com 15% de glicerol a -70ºC, no banco de
microrganismos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) e
subcultivadas por duas vezes em ágar sangue antes da realização dos testes, para a
garantia da pureza e viabilidade das amostras.
4.1.1 Identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted laser
desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
A identificação dos isolados de P. aeruginosa foi confirmada pela técnica de
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS) de acordo com o estabelecido por Claydon e colaboradores (1996), que
consiste em identificar o gênero e a espécie do microrganismo estudado através da
ionização de suas proteínas por tiros de raio laser.
A extração das proteínas foi feita de acordo com as normas do fabricante
(Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha). Em um tubo de microcentrífuga, 20 colônias
foram diluídas em 300 µL de água destilada, agitada e em seguida foram adicionados
900 µL de etanol absoluto. A mistura foi submetida à agitação cuidadosa e
centrifugada a 13.000 rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento foi ressuspenso em 50 µL de ácido fórmico à 70% (v/v), com formação de
bolhas. Após, foi acrescentado a essa suspensão 50 µL de acetonitrila pura e a
mistura homegeneizada. Esta solução foi centrifugada a 13.000 rpm durante 2
minutos. Um volume de 1 µL do extrato de proteínas, em triplicata, de cada amostra foi
colocada em uma placa de aço inoxidável fornecida pelo fabricante e após a secagem
à temperatura ambiente, foi acrescentado 1 µL de matriz (ácido α-ciano-4hidroxicinâmico, HCCA - 10 mg/mL; Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) em todas
28
Material e Métodos
as amostras, incluindo o calibrante. Após secar a temperatura ambiente, a placa foi
colocada no aparelho Bruker Daltonics Microflex LT MALDI-TOF para a leitura (Bruker
Daltonics, Bremen, Alemanha).
Os espectros de massa gerados para cada amostra foram comparados com
uma série de espectros depositados no banco de dados do software Biotyper MALDI
2.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) para a determinação do gênero e da
espécie bacteriana. A interpretação dos critérios de identificação bacteriana utilizados
foram aqueles especificados pelo próprio fabricante, onde: scores ≥ 2.300 foram
considerados como identificação altamente confiável para a espécie (+++), entre 2.000
e 2.299 foram consideradas como indentificação confiavél para o gênero bacteriano e
provável para espécie bacteriana (++). Scores entre 1.700 e 1.999 foram considerados
como identificação confiável apenas para o gênero bacteriano (+), enquanto scores de
identificação abaixo de 1.699 foram considerados como não confiáveis (-), não sendo
possível realizar a identificação bacteriana.
4.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos
O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado pela técnica de
microdiluição em caldo de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI). Os agentes antimicrobianos testados foram: amicacina
(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), aztreonam (Bristol-Myers Squibb, Nova York, EUA),
ceftazidima (Strides Arcolab, Bangalore, Índia), cefepima (Bristol-Myers Squibb, Nova
York, EUA), ciprofloxacino (Fresenius Robi, Alemanha), gentamicina (Sigma-Aldrich,
St. Louis, USA), imipenem (Merck Sharp, Nova Jersey, EUA), meropenem (Astra
Zeneca, Londres, Inglaterra), piperacilina/tazobactam (Novafarma, Goiás, Brasil) e
sulfato de polimixina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). As concentrações testadas
para cada antimicrobiano podem ser vistas na Tabela 2.
29
Material e Métodos
Tabela 2. Concentrações testadas na microdiluição em caldo dos antimicrobianos utilizados no
estudo.
Classe
Aminoglicosídeos
Monobactâmico
Cefalosporinas
Fluoroquinolonas
Carbapenens
Combinação β-lactâmico/Inibidor de β-lactamase
Lipopeptídeos
Antimicrobianos
Concentrações
(μg/mL)
Amicacina
Gentamicina
Aztreonam
Ceftazidima
Cefepima
Ciprofloxacino
Imipenem
Meropenem
Piperacilina/Tazobactam
Polimixina B
0,125 -128
0,06 – 64
0,03 – 32
0,03 – 32
0,03 – 32
0,03 – 32
0,03 – 64
0,03 – 64
0,125/4 – 128/4
0,03 – 64
Para o controle de qualidade, foram incluídas nos testes de sensibilidade, as
cepas da American Type Culture Collection (ATCC) de E. coli ATCC 25922, P.
aeruginosa ATCC 27853 e Staphylococcus aureus ATCC 29213.
A solução mãe de cada antimicrobiano foi preparada em água ultrapura, numa
concentração 200 vezes superior aquela desejada na placa de microdiluição, e diluída
1:10 em caldo Mueller-Hinton – MH (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) para obtenção da
maior concentração de cada antimicrobiano a ser testado. A partir dessa diluição,
foram realizadas diluições seriadas e 100 μL de cada diluição foi dispensado na placa
de microdiluição. As placas foram armazenadas em freezer -70°C até a realização dos
testes, exceto para os carbapenens (imipenem e meropenem) e polimixina B. Após o
crescimento bacteriano em placas de ágar sangue por 18 horas, 3 a 5 colônias
isoladas foram transferidas para tubos contendo 5 mL de caldo MH a uma turbidez
correspondente à escala 0,5 de McFarland (1.5 x 108 UFC/mL).
Um volume de 32 μL da suspensão bacteriana foi diluído em 968 μL de caldo
MH fresco. Posteriormente, 500 μL desta suspensão foi transferido para um tubo
contendo 4,5 mL de caldo MH, para obtenção de uma concentração bacteriana em
torno de 5 x 105 UFC/mL. Um volume de 100 µL desse inóculo bacteriano foi utilizado
para inocular a placa de microdiluição contendo 100 µL dos antimicrobianos a uma
concentração duas vezes maior que a concentração desejada, de modo que a
30
Material e Métodos
concentração final bacteriana foi de aproximadamente 2,5 x 105 UFC/mL. As placas
foram incubadas a 37 °C, em aerobiose por 16-20 horas. Após esse período a leitura
foi realizada por inspeção visual.
A concentração inibitória mínima (CIM) foi considerada como a menor
concentração capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano. Após o
resultado final, as amostras foram classificadas como sensíveis (S), intermediárias (I)
ou resistentes (R) aos antimicrobianos testados de acordo com os critérios
estabelecidos pelo CLSI para P. aureginosa (CLSI, 2013) (Tabela 3).
Tabela 3. Pontos de cortes utilizados para a interpretação das CIMs de P.
aeruginosa segundo o CLSI 2013.
Antimicrobianos
Amicacina
Gentamicina
Aztreonam
Ceftazidima
Cefepima
Ciprofloxacino
Imipenem
Meropenem
Piperacilina/tazobactam
Polimixina B
4.3
Breakpoints (μg/mL)
Sensível
Intermediário
Resistente
≤16
≤4
≤8
≤8
≤8
≤1
≤2
≤2
≤16/4
≤2
32
8
16
16
16
2
4
4
32/4 – 64/4
4
≥64
≥16
≥32
≥32
≥32
≥4
≥8
≥8
≥128/4
≥8
Análise da relação genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis
(PFGE)
Para avaliar a relação genética entre os isolados de P. aeruginosa avaliados
neste estudo foi utilizada a técnica de análise do DNA cromossômico por eletroforese
de campo pulsado Pulsed-Field Gel Electrophoresis – PFGE (Pfaller et al. 1992), com
o objetivo de verificar se a disseminação de um clone não poderia ser responsável
pelo perfil de resistência encontrado.
31
Material e Métodos
4.3.1 Preparação dos blocos de gel de agarose
As amostras foram incubadas por 18-24 horas em 10 mL de caldo Luria-Bertani
– LB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) e, então, centrifugadas por 20 minutos a 3.000
rpm. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado, contendo as células bacterianas,
diluído em 1 mL de solução salina 0,85% (m/v) , homogeneizado e transferido para
tubo de microcentrífuga previamente pesado.
Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante
removido. O material centrifugado (sedimento bacteriano) foi diluído em solução
salina, na proporção 1:1 entre o volume do diluente e o peso do material obtido pela
centrifugação, calculado pela diferença de peso do microtubo previamente pesado e
do peso do mesmo contendo o pellet. Após minuciosa homogeneização, 40 L da
mistura foi transferido para outro tubo contendo 300 L de tampão TEN (Tris 100 mM
pH 7,5; EDTA 100 mM, NaCl 150 mM) e 340 L de agarose de baixo ponto de fusão
foi adicionado e aplicado em moldes para a formação de blocos de gel contendo as
células bacterianas.
Após solidificação a temperatura ambiente por alguns minutos, os blocos foram
incubados a 37 ºC, por no mínimo 4 horas em solução EC (Tris 6 mM pH 6,5, NaCl 1
M; EDTA 0,01 M, Brij 58 0,5%, Sarcosil 0,5% e Deoxiglicolato 0,2%). A solução EC foi
removida e substituída por 2 mL de solução ES (EDTA 0,4 M pH 9,3 e Sarcosil 10%)
contendo 1 mg/mL de proteinase K (USB Corporation, Cleveland, EUA). As amostras,
então, foram incubadas por 12 horas a 50ºC. Após o tratamento com proteinase K,
foram realizadas quatro lavagens com CHEF-TE (Tris 0,1 M pH 7,5, EDTA 0,1 M), de
30 a 60 minutos cada. Os blocos foram armazenados em CHEF-TE, a 5 oC, até o
momento da digestão do DNA bacteriano.
32
Material e Métodos
4.3.2 Digestão do DNA bacteriano
O DNA bacteriano contido nos blocos de agarose foi submetido à clivagem com
SpeI, a 37 ºC por 12-18 horas, de acordo com instruções do fabricante (New England
Biolabs, Ipswich, EUA).
4.3.3 Eletroforese em campo pulsátil
A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1%, em TBE 0,5x (Tris 0,089 M,
ácido bórico 0,089 M e EDTA 0,002 M), no sistema CHEF-DR III (BioRad Laboratories,
Califórnia, EUA) à temperatura de 13oC e utilizando corrente elétrica de 200 Volts
(6V/cm). O gel foi corado com brometo de etídio 0,08 μL/mL e fotografado sob
iluminação ultravioleta em transiluminador (BioRad Laboratories, Califórnia, EUA).
O gel foi analisado utilizando os critérios de Tenover et al. (1995) e pelo
programa BioNumerics versão 5.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) para avaliar o
grau de similaridade genética entre os isolados avaliados.
Segundo Tenover e colaboradores (1995), as amostras foram consideradas
idênticas quando apresentaram perfil eletroforético idêntico (todas as bandas). As
amostras que apresentaram diferenças do perfil de até seis bandas foram
consideradas semelhantes (subtipos) e pertencentes a um mesmo clone. As amostras
que apresentaram sete ou mais bandas discordantes foram consideradas amostras
genotipicamente distintas. No programa BioNumerics, a definição de bandas foi
realizada automaticamente pelo programa e depois conferida individualmente, por
comparação visual. O coeficiente de similaridade que foi utilizado é o coeficiente de
Dice (Dice, 1945). O dendrograma foi construído utilizando o algoritmo de análise
filogenética UPGMA - Unweighted Pair-Groups Method using arithmetic averages
(Sneath & Sokal, 1973). Os valores de otimização e tolerância utilizados para o
conjunto de isolados foram de 0,8% e 1,0%, respectivamente. Amostras com
coeficiente de similaridade acima de 80% foram consideradas relacionadas e
pertencentes ao mesmo clone “cluster”.
33
Material e Métodos
4.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI)
Para focalização do pI foram utilizados extratos proteicos dos isolados de P.
aeruginosa. As amostras bacterianas foram cultivadas em ágar sangue para
isolamento de colônias. Com o auxilio da alça de semeadura, 10 a 15 colônias foram
suspensas em 10 mL de TSB e incubadas por 18 horas a 37 °C. Apos a incubação, as
amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 3.000 rpm e o centrifugado foi
ressuspenso em 1 mL de tampão (Tris HCl 1mM e ZnSO4 1mM). O inóculo foi ultrasonicado quatro vezes por 30 segundos, com amplitude de até 40% (Sonics Vibra
CellTM; Newtown, EUA), e centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos a 4 °C. O
sobrenadante foi transferido para um novo tubo e as amostras mantidas no gelo até o
momento do ensaio.
Um volume de 10 μL do extrato proteico bruto contendo as possíveis βlactamases foi misturado em placa de microdiluição com β-lactâmico cromogênio,
nitrocefin (Nitrocefin 0,5 mg/mL, pH 7.0). Um volume de 1 μL, 3 μL, 5μL, 7 μL e 10 μL
do extrato proteico foi pipetado gradativamente nas células que continham nitrocefin,
para a determinação do volume adequado a ser utilizado de cada amostra no gel de
pI.
A focalização foi realizada em géis de poliacrilamida com intervalo de pH entre
3,5 - 9,5 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, EUA), utilizando o sistema Multiphor II
Electrophoresis System (Pharmacia Biotech), seguindo os parâmetros de corrida
eletroforética adequados ao intervalo de pH presente no gel. O gel foi revelado com
500 mM de nitrocefin (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD). O
extrato proteico de bactérias sabidamente produtoras de β-lactamases com pontos
isoelétricos conhecidos foram utilizados como controles (TEM-1, pI = 5,4; FOX-5, pI =
7,2; SHV-5, pI =7,8), e o posicionamento das bandas foi utilizado para cálculo do pI
das β-lactamases presentes nas amostras testadas utilizando o teste de regressão
linear do pacote de análises estatísticas do programa Excel (Microsoft™, Washington,
EUA).
34
Material e Métodos
4.5 Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens
A hidrólise dos carbapenens foi utilizada para a detecção da atividade
enzimática nos isolados de P. aeruginosa. Como controles positivos foram utilizadas
as cepas de K. pneumoniae produtora de KPC-2 e de A. baumannii produtora de OXA23. Foram utilizadas duas técnicas distintas: espectrofotometria e espectrometria de
massas.
4.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria
Após o isolamento da amostra em ágar MacConkey – MC (Oxoid, Basingstoke,
United Kingdom) 10 colônias foram inoculadas em 10 mL de caldo TSB contendo 0,5
µg/mL de imipenem, em estufa a 37 °C em agitação durante 12 horas. A suspensão
bacteriana foi centrifugada por 15 minutos a 6.000 rpm, e, em seguida, o sobrenadante
foi desprezado e o sedimento ressuspendido em 1 mL de tampão de amostra (TrisHCL 1mM e ZnSO4 1mM, pH 7,0). As amostras suspensas, então, foram
ultrasonicadas 30 segundos por 4 vezes, e o produto centrifugado a 13.000 rpm por 3
minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e as amostras
mantidas no gelo até o momento do ensaio.
Uma solução de imipenem e meropenem foi então preparada em tampão de
amostra de forma a se obter 1,5 a 2 unidades de absorbância a um comprimento de
onda de 299 nm. Para o teste, foi adicionado a uma cubeta de quartzo 940 μL de
tampão de amostra e 50 μL do extrato proteico. Esta mistura foi homogeneizada
através de inversão da cubeta e a leitura de absorbância foi zerada. A seguir, 10 μL da
solução do antimicrobiano foi adicionado a cubeta, e após nova homogeneização, o
monitoramento da absorbância da solução foi realizado no espectrofotômetro Biomate
5 UV Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra) por 5 minutos a 299 nm. A
diminuição gradativa da absorbância e valores negativos de variação de absorbância
(Δabs/min, calculada por meio da diferença entre o valor de absorbância final e
absorbância inicial após 5 minutos) foi considerada resultados positivos, isto é,
hidrólise do agente β-lactâmico por uma carbapenemase.
35
Material e Métodos
4.5.2 Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization
time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
Após o isolamento da amostra em ágar MH (Oxoid, Basingstoke, United
Kingdom), 25 colônias foram inoculadas em 1 mL de tampão de solução (Tris-HCl 20
mM, pH 6,8) contendo 1 mg/ml de imipenem e incubada por 2 horas, sob agitação. A
suspensão bacteriana foi centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos, e, em seguida, 1 µl
do sobrenadante, em triplicata, de cada amostra foi colocada em uma placa de aço
inoxidável fornecida pelo fabricante e após a secagem em temperatura ambiente,
acrescentado 1 µl de matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, HCCA - 10 mg/mL;
Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) sobre todas as amostras como recomendado
pelo fabricante. Após secar a temperatura ambiente, a placa foi colocada no aparelho
Bruker Daltonics Microflex LT MALDI-TOF para a leitura (Bruker Daltonics, Bremen,
Alemanha).
A hidrólise do imipenem foi considerada positiva se o pico de massa da
molécula intacta (300,4 m/z) desapareceu e nenhum pico adicional foi observado
(Sparbier et al., 2011)
4.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases
4.6.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR)
A pesquisa dos genes de resistência aos antimicrobianos codificados por βlactamases e carbapenemases foi realizada pela técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR) convencional ou multiplex, de acordo com os genes pesquisados.
O DNA das amostras bacterianas foi extraído utilizando o kit QIAamp DNA Mini
Kit (Quiagen, Courtaboeuf, France) de acordo com as recomendações do fabricante.
Para cada reação foram utilizados 50 ƞg do DNA das amostras estudadas para as
reações de PCR. As reações de PCR foram preparadas em fluxo laminar, com volume
final igual a 50 µL, contendo: 25 µL de master-mix 2x (GoTaqR Green Master Mix,
Promega, Madison, EUA), 1.25 µM de cada oligonucleotídeo iniciador (Integrate DNA
36
Material e Métodos
Technologies, IDT, EUA); água estéril (Water, Molecular Biology Grade, Eppendorf
AG, Hamburg, Alemanha) q.s.p 50 µL. Foram pesquisados os genes codificadores de:
(a) cefalosporinases (blaAMPC); (b) serino-β-lactamases (blaTEM, blaSHV, blaGES, blaCTX-M,
blaBES, blaPER, blaKPC, blaSME); (c) oxacilinases (blaOXA-1, blaOXA-2, blaOXA-3, blaOXA-5, blaOXA7,
blaOXA-18, blaOXA-45, blaOXA-46, blaOXA-50, blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58, blaOXA-20,
blaOXA-48, blaOXA-62, blaOXA-143, blaOXA-198); (d) metalo-β-lactamases (blaIMP, blaVIM, blaSPM,
blaGIM, blaSIM, blaNDM) e (e) integrons de classe 1. As condições de termociclagem do
DNA
(Eppendorf,
Hamburg,
Alemanha)
e
os
oligonucleotídeos
iniciadores,
selecionados de acordo com os genes pesquisados, estão apresentados na Tabela 4
e 5.
A revelação dos produtos da PCR foi realizada por meio de eletroforese em gel
de agarose (UltrapureTM Agarose, Invitrogen, Carlsbad, EUA), sendo utilizada a
concentração de 2% para PCR multiplex e 1% para PCR convencional. As condições
de corrida foram: 110 V por 40 minutos em tampão TBE 0,5X (89 nM Tris-Borato e 2
mM EDTA pH 8.0). Como marcador de peso molecular, foi utilizado DNA ladder 100
pares de base (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O gel foi corado com brometo de etídio
(2,5 μg/mL) e as bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta - 320 nm (GelDoc
Quantity One; Bio-Rad Laboratories, EUA). As cepas controle utilizadas nas reações
de PCR estão listadas na Tabela 6.
37
Material e Métodos
Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores de β-lactamases pela técnica de PCR convencional e/ou
Sequência (5’ – 3’)
PreAmpC
ATG CAG CCA ACG ACA AAG G
PCR convencional
Serino-βlactamases
Serino-β-lactamases
Oligonucleotídeos
iniciadores
PCR multiplex
Tipo de reação
de PCR
PCR
convencional
AmpC
multiplex neste estudo.
Gene alvo
blaAMPC
PostAmpC
CGC CCT CGC GAG CGC GCT TC
MTEM F
CCC TTA TTC CCT TTY TTG CGG
MTEM R
AAC CAG CCA GCC WGA AGG
MSHV F
CTT GAC CGC TGG GAA ACG G
MSHV R
AGC ACG GAG CGG ATC AAC GG
MGES F
AGC AGC TCA GAT CGG TGT TG
MGES R
CCG TGC TCA GGA TGA GTT G
MCTX-1 e 2 F
ATG TGC AGY ACC AGT AA
MCTX-1 e 2 R
CGC TGC CGG TTT TAT CSC CC
MCTX-8 F
AAC RCR CAG ACG CTC TAC
MCTX-8 R
TCG AGC CGG AAS GTG TYA T
MCTX-14 F
GGT GAC AAA GAG ART GCA ACG GAT
MCTX-14 R
TTA CAG CCC TTC GGC GAT GA
BES-F
GGC GCA ATA CAA CGA AGG
BES-R
ATC TTG CAG TAC CAG TCG
PER-F
CGC TTC TGC TCT GCT GAT
Amplicom (pb)
1.243
Condições de termociclagem
Referência
Desnaturação: 95ºC - 10 min
Desnaturação: 95ºC - 30 s
Anelamento: 54ºC - 30 s
Extensão: 72ºC – 45s
Rodríguez-Martínez et
al. 2009a
30 ciclos
Extensão final: 72ºC - 10 min.
blaTEM-like
650
blaSHV-like
200
blaGES-like
750
blaCTX-M-1
876
blaCTX-M-8
512
blaCTX-M-14
333
Este estudo
30 ciclos
Denaturação: 94ºC – 10 min
blaBES
227
Denaturação: 94ºC – 30 seg
Anelamento: 53ºC – 1 min
Este estudo
Extensão: 72ºC – 1 min
blaPER
500
35 ciclos
38
Contexto genético
PCR convencional
PCR
convencional
Oxacilinase
PCR Multiplex Oxacilinases
Material e Métodos
PER-R
GGCAGCTTCTTTAACGCC
OXA-1_multi-F
TAT CTA CAG CAG CGC CAG TG
OXA-1_multi-R
TGC ACC AGT TTT CCC ATA CA
OXA-2_multi-F
CGA TAG TTG TGG CAG ACG AA
OXA-2_multi-R
TCT TTG CAC GCA GTA TCC AG
OXA-5_multi-F
TGG CAC AGA ATC AAG TCC TG
OXA-5_multi-R
TTG CCA TGA TTT TCG TTG AA
OXA-7_multi-F
TTT TCA AAT GGG ACG GAA AG
OXA-7_multi-R
CCA CTT GAT TAA CTG CGG AAA
OXA-18_multi-F
ATG CAA CGG AGC CTG TCC
OXA-18_multi-R
GGC AGG GTG TTG AGG AAC T
OXA-45_multi-F
GCA GAT GCT CGA ATG CAC
OXA-45_multi-R
GGC AAT GCC TTG AGG AAG
OXA-46_multi-F
GAT CAG CGA TGC GAA ATT CT
OXA-46_multi-R
ACC AGC CAA ACC TGC CTT C
OXA-50_seq-F
ATG CGC CYY CTC YTC TTS
Extensão final: 72ºC – 10 min.
blaOXA-1-like
601
blaOXA-2-like
504
blaOXA-5
146
blaOXA-7-like
237
blaOXA-18
806
blaOXA-45
705
blaOXA-46-like
318
blaOXA-50-like
OXA-50_seq-R
TCA GGG CAG YAY SCC SAG RG
IntI-1-F
GCC TGT TCG GTT CGT AAG CT
Intl1
QAC-R
CGG ATG TTG CGA TTA CTT CG
QacE∆1
789
Extensão: 72ºC - 1 min
Este estudo
35 ciclos
Este estudo
35 ciclos
-
Extensão: 72ºC - 2 min e 30 s
35 ciclos
Toleman et al., 2006
39
Material e Métodos
Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores de β-lactamases tipo carbapenemase neste estudo pela
técnica de PCR convencional e/ou multiplex.
Metallo-βlactamases
PCR multiplex
PCR convencional
Serino-βlactamases
PCR
convencional
Metallo-β-lactamases
Tipo de reação
de PCR
Oligonucleotídeos
iniciadores
IMP-F1 mult
GAA TAG RRT GGC TTA AYT CTC
IMP-R1 mult
CCA AAC YAC TAS GTT ATC
Gene alvo
Amplicom (pb)
blaIMP-like
188
blaSPM-1
382
blaSIM-1
798
SPM-F1 mult
CTA AAT CGA GAG CCC TGC TTG
SPM-R1 mult
CCT TTT CCG CGA CCT TGA TC
SIM-F1 mult
GTA CAA GGG ATT CGG CAT CG
SIM-R1 mult
TGG CCT GTT CCC ATG TGA G
VIM-F2 mult
GTT TGG TCG CAT ATC GCA AC
VIM-R2 mult
AAT GCG CAG CAC CAG GAT AG
GIM-F1 mult
TCA ATT AGC TCT TGG GCT GAC
GIM-R1 mult
CGG AAC GAC CAT TTG AAT GG
16S-8 F
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
Controle
16S-1493 R
ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT
Interno
Pre-NDM-F
blaVIM-like
569
blaGIM-1
72
Pre-NDM-R
CTG GGT CGA GGT CAG GAT AG
KPC-F
TCG CTA AAC TCG AAC AGG
KPC-R
TTA CTG CCC GTT GAC GCC CAA TCC
SME-F
AAC GGC TTC ATT TTT GTT TAG
SME-R
GCT TCC GCA ATA GTT TTA TCA
Referência
Extensão: 72ºC – 45 s
35 ciclos
Mendes et al., 2007
1.000
GGC GTT AGA TTG GCT TAC ACC
blaNDM-like
1.146
Extensão: 72ºC – 1min 30 s
Este estudo
35 ciclos
blaKPC
blaSME
762
830
35 ciclos
Este estudo
40
PCR convencional Oxacilinases
PCR Multiplex Oxacilinases
Material e Métodos
OXA 23-F
GAT CGC ATT GGA GAA CCA GA
OXA 23-R
ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT
OXA 24-F
GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA
OXA 24-R
AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT
OXA 51-F
TAA AGC TTT GAT CGC CCT TG
OXA 51-R
TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG
OXA 58-F
AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG
OXA 58-R
CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC
OXA-20_seq-F
TTG ATA ATC CGA TTT CTA GCA CTG
OXA-20_seq-R
CTA GTT GGG TGG CAA AGC AT
OXA-48-F
TTGGTGGCATCGATTATCGG
OXA-48-R
GAGCACTTCTTTTGTGATGGC
OXA-62-F
ACG CAC GCA AAC CTA TCA
blaOXA-23
501
blaOXA-24
246
blaOXA-51
353
blaOXA-58
599
blaOXA-20-like
801
blaOXA-48
743
Anelamento: 52ºC – 40 seg
Extensão: 72ºC – 50 seg
Woodford et al., 2006
35 ciclos
35 ciclos
blaOXA-62
OXA-62-R
Este estudo
Poirel et al., 2004b
Schneider et al. 2006
35 ciclos
ATG TTG ATC GCG ACG CTG
PreOXA-143 A
AGT TAA CTT TCA ATA ATT G
PreOXA-143 B
TTG GAA AAT TAT ATA ATC CC
OXA-198_seq-F
ATG CAT AAA CAC ATG AGT AAG CTC
OXA-198_seq-R
TTA TTC GAT GAT CCC CTT TGC
blaOXA-143
blaOXA-198
789
35 ciclos
Higgins et al., 2009
Este estudo
41
Material e Métodos
Tabela 6. Cepas controles utilizadas neste estudo para a detecção de genes
codificadores das -lactamases e carbapenemases, por meio da técnica de PCR
convencional e/ou multiplex.
a
Cepa e Número do
Bancoa
Tipo de β-lactamase
Classe Molecular de
Ambler (1980)
P.aeruginosa 238
AmpC
C
E. coli 248
TEM-1
A
E. coli 282
SHV-5
A
P.aeruginosa 233
GES-5
A
K. pneumoniae 308
CTX-M-2
A
E. cloacae 452
CTX-M-8
A
E. coli 391
CTX-M-14
A
S. marcescens 256
BES
A
P.aeruginosa 285
PER
A
K. pneumoniae 393
OXA-1
D
P.aeruginosa 394
OXA-2
D
E. coli 392
OXA-10
D
P. aeruginosa 298
OXA-18
D
P. aeruginosa 238
OXA-50
D
P.aeruginosa 131
IMP
B
E. cloacae181
VIM-1
B
P.aeruginosa 396
SPM-1
B
P.aeruginosa 219
GIM-1
B
A. baumannii 218
SIM-1
B
K. pneumoniae 462
NDM
B
K. pneumoniae 307
KPC-2
A
S. marcescens 274
SME
A
A. baumannii 216
OXA-23
D
A. baumannii 245
OXA-25
D
A. baumannii 216
OXA-51
D
A. baumannii 384
OXA-58
D
K. pneumoniae 283
OXA-48
D
A. baumannii 422
OXA-143
D
P. aeruginosa 385
OXA-161
D
Número da amostra referente ao banco de microrganismos do Laboratório Alerta.
42
Material e Métodos
4.6.2 Sequenciamento
As reações de PCR positivas para a pesquisa de genes codificadores de βlactamases foram confirmadas por uma segunda reação de PCR e tiveram sua
sequencia determinada por sequenciamento. Oprodutos de PCR foram purificados a
partir do gel de agarose com o kit QIAquick Gel Extraction, conforme as instruções do
fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA obtido foi quantificado utilizando o
espectrofotômetro digital NanoVue Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, Canadá)
e, então, 70 ƞg de DNA foi submetido à reação de sequenciamento no ABI 3500
Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, EUA) utilizando o kit Big Dye
Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, EUA).
As sequências de DNA obtidas e as sequências proteicas derivadas foram
analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR, Madison,
WI) e comparadas com as sequências depositadas e publicadas nos bancos de dados
disponíveis
na
Internet
FASTA
e
BLAST
(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/
e
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
4.7 Avaliação fenotípica com inibidores de sistemas de efluxo e da βlactamase cromossomal AmpC
A fim de avaliar a influência dos mecanismos de resistências na CIM dos
carbapenens (imipenem e meropenem) foram realizados testes de microdiluição em
caldo na presença de inibidores da -lactamase cromossomal AmpC e de bombas de
efluxo.
Foram realizados testes iniciais que comprovaram o crescimento de todos os
isolados nas concentrações utilizadas para os dois inibidores usados, a fim de avaliar
se os mesmos não inibiriam o crescimento bacteriano.
43
Material e Métodos
4.7.1 Inibição da -lactamase cromossomal AmpC
Para a avaliação fenotípica da desrepressão da -lactamase cromossomal
AmpC, as CIMs foram determinadas para os antimicrobianos imipenem, meropenem e
ceftazidima como descrito no item 4.2, na ausência e na presença do inibidor de
AmpC, cloxacilina (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO, EUA) em concentrações
fixas de 200 μg/mL.
A diminuição da CIM ≥ 2 diluições, para a associação do antimicrobiano com
cloxacilina em relação à CIM do antimicrobiano sozinho foi considerada indicativa da
hiperexpressão da -lactamase cromossomal AmpC.
4.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo
O teste de inibição de bomba de efluxo foi realizado na presença de
fenilalamida arginina β-nafitilamida - PAβN (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO,
EUA), inibidor de sistemas de efluxo, em concentrações fixas de 50 μg/mL. As CIMs
foram determinadas para os antimicrobianos imipenem, meropenem e ciprofloxacino
como descrito no item 4.2, na ausência e na presença do inibidor.
A diminuição da CIM ≥ 2 diluições, para a associação do antimicrobiano com
PAβN em relação à CIM do antimicrobiano sozinho foi considerada indicativa da
hiperexpressão dos sistemas de bombas de efluxo.
4.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo
Real - qRT-PCR
A técnica de qRT-PCR (reação de polimerase em cadeia em tempo real) foi
utilizada para detecção e quantificação da transcrição dos genes que codificam
componentes dos sistemas de efluxo de P. aeruginosa avaliados, mexB, mexD, mexF,
mexY. Além da determinação da expressão das proteínas dos sistemas de efluxo,
foram também mensuradas as expressões da proteína de membrana externa oprD e
da β-lactamase cromossomal AmpC. Os resultados foram comparados às respectivas
transcrições desses genes na cepa selvagem PA01. A expressão destes mesmos
44
Material e Métodos
genes na ATCC de P. aeruginosa 27853 foi comparada àquelas da cepa selvagem
PA01.
4.8.1 Extração de RNA Total
Os isolados foram previamente semeados em ágar sangue e incubados
durante 18 - 20 horas a 37 ºC. Após esse período, estes isolados foram cultivados em
20 mL de caldo LB na presença de 0,5 µg/mL de imipenem a 37 ºC, sob agitação, até
atingirem a fase logarítmica de crescimento, correspondente à de 1,5 a 2,0 unidades
de absorbância a um comprimento de onda de 600 nm (DO 600nm = 0,5 – 0,6) em
espectrofotômetro Biomate 5 UV Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra).
Quando essa absorbância foi atingida, 1 mL da cultura bacteriana foi ressuspenso em
1
mL
de
RNA
ProtectTM
Bacteria
Reagent
(Qiagen,
Hilden,
Alemanha)
homogeneizado por completo em vórtex e incubado por 5 minutos em temperatura
ambiente. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm durante
10 minutos em temperatura ambiente (Eppendorf, Hamburg, Alemanha). Depois da
centrifugação, o sobrenadante foi aspirado em bomba a vácuo e o sedimento
ressuspenso em 100 μL de lisozima (Lysozyme from Chicken Egg White; Sigma,
Steinheim Alemanha), sob agitação moderada durante 5 minutos. A extração do RNA
bacteriano foi realizada com auxílio do Kit Rneasy Mini Kit conforme recomendações
do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). Para retirada de resíduos de DNA
bacteriano foi realizado um tratamento com RNAse Free-DNAse Set (Qiagen, Hilden,
Alemanha) durante a extração do RNA.
O RNA total foi quantificado utilizando-se o espectrofotômetro digital NanoVue
Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, Canadá).
Adicionalmente, foi realizada, para cada amostra de RNA total, uma PCR
utilizando oligonucleotídeos iniciadores que amplificam uma sequência do DNA
ribossomal de eubactérias, com o intuito de confirmar a ausência de resíduos de DNA
bacteriano contaminante na solução de RNA. Os oligonucleotídeos iniciadores
45
Material e Métodos
utilizados e as condições de termociclagem (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) estão
na Tabela 5.
4.8.2 Síntese de cDNA
A reação de transcriptase reversa foi realizada utilizando 30 ƞg de RNA de
cada amostra, com High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied
Biosystems, Warrington, United Kingdom), de acordo com as recomendações do
fabricante. A reação foi incubada por 10 minutos a 25 ºC, seguido por 120 minutos a
37 ºC, em termociclador (Eppendorf, Hamburg, Alemanha). O cDNA, produto da
reação de transcriptase reversa, foi armazenado em freezer -80 ºC até sua utilização.
4.8.3 Quantificação relativa da transcrição gênica
A quantificação relativa da expressão dos genes estudados foi realizada pela
técnica de qRT-PCR, cujo principio do método baseia-se na detecção da fluorescência
no tubo de reação à medida que a dupla fita DNA é gerada.
As reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata utilizando
12,5 µL de Platinum SyBR Green qPCR com ROX (Invitrogen, Eragny, France),
adicionado de 0,25 µL de cada oligonucleotídeo iniciador (10 μM). À mistura, foi
adicionado 2 µL de cDNA para obtenção de um volume final de 25 µL. A reação de
PCR foi realizada no equipamento Real Time 7500 (Applied Biosystems, Warrington,
United Kingdom). As reações foram incubadas a 50 oC por 2 minutos, seguidos de
mais 2 minutos a 95 oC. As condições de termociclagem a seguir foram: 40 ciclos de
95 oC durante 15 segundos, 55 °C por 15 segundos e 60 oC por 30 segundos, de
acordo com as recomendações do fabricante. A curva de desnaturação (melting curve)
foi determinada no final da termociclagem para se certificar que havia a presença de
uma única sequencia de DNA, resultado da reação de amplificação. O gene
ribossomal rpsL foi utilizado como gene de referência para normalização da expressão
dos genes alvos.
As sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a técnica de
qRT-PCR são apresentadas na Tabela 7.
46
Material e Métodos
Tabela 7. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de qRT-PCR para os genes alvos
mexB, mexD, mexF, mexY, oprD e ampC e para o gene de referência rpsL.
qRT-PCR
Tipo de
reação de
PCR
Oligonucleotídeos
iniciadores
mexB-F
GTG TTC GGC TCG CAG TAC TC
mexB-R
AAC CGT CGG GAT TGA CCT TG
mexD-F
CGA GCG CTA TTC GCT GC
mexD-R
GGC AGT TGC ACG TCG A
mexF-F
CGC CTG GTC ACC GAG GAA GAG T
mexF-R
TAG TCC ATG GCT TGC GGG AAG C
mexY-F
CCG CTA CAA CGG CTA TCC CT
mexY-R
AGC GGG ATC GAC CAG CTT TC
oprD-F
TCC GCA GGT AGC ACT CAG TTC
oprD-R
AAG CCG GAT TCA TAG GTG GTG
ampC-F
CTG TTC GAG ATC GGC TC
ampC-R
CGG TAT AGG TCG CGA G
rpsL-F
GCA AGC GCA TGG TCG ACA AGA
rpsL-R
CGC TGT GCT CTT GCA GGT TGT GA
Gene alvo
Referência
mexB
mexD
mexF
mexY
Xavier et al.,
2010
oprD
ampC
rpsL
4.8.4 Análise da quantificação relativa da transcrição gênica
A análise da expressão foi feita utilizando o software SDS v 2.0 (Applied
Biosystems, Warrington, Reino Unido) pelo método Ct comparativo (ΔΔCt), onde a
expressão normalizada (EN) e calculada de acordo com a formula:
ΔCt = Ctgene alvo - CtrpsL
onde, CT (Ciclo Threshold) é o ciclo em que foi detectado fluorescência durante a
amplificação na reação de qRT-PCR, acima do limite basal de fluorescência
observada no inicio na reação. Para a correção do cálculo da RQ, a eficiência da
reação de cada gene foi calculada utilizando o modelo matemático descrito por Pfaffl
et al. (2001), utilizando o software SDS v 2.0.
A eficiência das reações de amplificação dos genes estudados foi determinada
de acordo com a fórmula:
E = (10-1/slope -1) x 100
47
Material e Métodos
onde slope representa a inclinação da reta no gráfico de regressão linear das médias
dos valores de CT observadas nas 3 reações de qRT-PCR para as diluições seriadas
do extrato da solução de cDNA da amostra de P. aeruginosa PAO1.
A transcrição relativa de cada gene alvo para os isolados clínicos de P.
aeruginosa foi calculada em relação à transcrição de cada gene na cepa de P.
aeruginosa PAO1, a partir da diferença entre o ΔCt de cada gene alvo na amostra
referência e o ΔCt de cada gene na amostra a ser testada. Dessa forma, o valor de
RQ indica quantas vezes um gene foi transcrito em uma amostra em relação à
expressão quantificada na amostra usada como referência, utilizando a fórmula:
RQ = 2-ΔΔCt.
Nas isolados clínicos avaliados, foram consideradas significativas alterações na
transcrição gênica relativa de, no mínimo, duas e quatro vezes para os os genes mexB
e mexY e mínimo de 100 vezes para mexD e mexF. Para o gene que codifica a βlactamase cromossomal ampC, foram consideradas significativas alterações na
transcrição gênica relativa de, no mínimo, dez vezes e para o gene da proteína de
membrana externa oprD, foram consideradas significativas a redução de 30% da
transcrição dos genes dessa proteína em comparação à cepa referência PAO1 (Quale
et al., 2006; Rodriguez-Martinez et al., 2009b).
4.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo
A amplificação dos genes que codificam os componentes dos sistemas de
efluxo de P. aeruginosa avaliados, mexB, mexD, mexF, mexY, além da proteína de
membrana externa oprD e da β-lactamase cromossomal AmpC, foi realizada através
da corrida eletroforética da reação de qRT-PCR das amostras estudadas.
A revelação dos produtos da qRT-PCR foi realizada por meio de eletroforese
em gel de agarose (UltrapureTM Agarose, Invitrogen, Carlsbad, EUA), sendo utilizada a
concentração de 1,5%. As condições de corrida foram: 110V por 40 minutos em
tampão TBE 0,5X (89 nM Tris-Borato e 2 mM EDTA pH 8.0). Como marcador de peso
48
Material e Métodos
molecular, foi utilizado DNA ladder 100 pares de base (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O
gel foi corado com brometo de etídio (2,5 μg/mL) e as bandas foram visualizadas sob
luz ultravioleta - 320 nm (GelDoc Quantity One; Bio-Rad Laboratories, EUA).
4.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE
4.9.1 Extração de proteínas de membrana externa
Os isolados de P. aeruginosa foram cultivados em 15 mL de caldo LB na
presença de de 1 µg/mL de imipenem a 37 ºC, sob agitação, por 18-20 horas. Em
seguida, foram centrifugados a 4.000 rpm, por 15 minutos, a 4 ºC. O sedimento
bacteriano foi então ressuspenso em 1 mL de TrisMg (Tris 10mM; MgCl2 5mM), pH 7,3
e sonicado por 5 ciclos de 30 segundos, com intervalo de um segundo a cada 5
segundos corridos. Durante esse processo as amostras foram mantidas em banho de
gelo.
Após essa etapa, foi realizada uma centrifugação a 8.000 rpm, por 5 minutos, a
4 ºC para a remoção dos restos celulares. O sobrenadante foi transferido para outro
tubo e centrifugado novamente a 17.000 rpm por 30 minutos a 4 ºC. O sobrenadante
então, foi descartado e adicionado 800 µL de Sarcosil 2% para precipitação das
proteínas de membrana externa (OMPs) por 30 minutos em temperatura ambiente. As
amostras foram novamente centrifugadas a 17.000 rpm por 30 minutos a 4ºC e o
sedimento foi lavado com TrisMg (Tris 10mM; MgCl2 5mM), pH 7,3 e centrifugado
novamente a 17.000 rpm por 30 minutos a 4 ºC. O sedimento, correspondente à
porção da membrana externa, foi ressuspenso em 40 µL de TrisMg (Tris 10mM; MgCl2
5mM), pH 7,3 e armazenado a uma temperatura de -80 ºC até sua utilização. Os
extratos proteicos foram quantificados com reagente de Bradford.
4.9.2 SDS-PAGE
Os extratos proteicos foram submetidos à análise do perfil de proteínas de
membrana externa pela técnica de SDS-PAGE. As concentrações dos extratos
proteicos foram igualadas com água estéril e depois adicionado 10 µL de tampão de
49
Material e Métodos
amostra Laemmi Sample Buffer (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA), após esta
etapa, os extratos foram aquecidos a 99 ºC por 5 minutos.
Vinte microlitros das amostras e 6 µL do padrão de peso molecular, Precision
Plus Protein Standards – dual color (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram
aplicados no gel de dodecil sulfato de sódio (SDS), contendo 15% de acrilamida (SDSPAGE 15%). A eletroforese foi realizada a uma voltagem de 10 V por 20 minutos para
a inicial introdução do extrato proteico no gel, seguido por uma voltagem de 180 V por
1 hora no sistema V-16 Vertical Gel Electrophoresis System (Gibco BRL Life
Technologies, Rockville, MD, EUA). Após a corrida eletroforética, o gel foi corado
durante 15 minutos com coomassie blue R250 (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, EUA).
Como descorante, foi utilizada solução de ácido acético a 10% e metanol a 45%. A
análise do perfil proteico das amostras foi realizada pela inspeção visual dos géis.
Como controle foi utilizada a amostra de P. aeruginosa PAO1 sensível a todos
os β-lactâmicos, aos aminoglicosídeos e às fluoroquinolonas testadas.
4.10 Pesquisa do Gene Codificador da Proteína de Membrana Externa –
OprD
A avaliação da presença do gene da oprD foi realizada pela técnica da reação
em cadeia da polimerase (PCR) convencional como descrito no item 4.4.1.
As condições de termociclagem (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) foram:
desnaturação inicial a 95 ºC por 10 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a
95 ºC por 45 segundos, anelamento dos oligonucleotídeos a 51 ºC por 45 segundos e
extensão das fitas a 72 ºC por 3 minutos. Após os 35 ciclos, foi realizada uma
extensão final a 72 ºC por 10 minutos. Na Tabela 8 encontram-se descritos os
oligonucleotídeos iniciadores utilizados neste estudo.
50
Material e Métodos
Tabela 8. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de PCR para a avaliação do gene
da oprD.
Oligonucleotídeos
iniciadores
OprD-F
CGC CGA CAA GAA GAA CTA GC
PCR
convencion
al
Tipo de
reação de
PCR
OprD-R
Gene
alvo
Amplicom
(pb)
Referência
oprD
1413
Este estudo
GTC GAT TAC AGG ATC GAC AG
4.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e
aso aminoglicosídeos
Para avaliar os mecanismos de resistência às quinolonas foram estudadas as
mutações nas regiões determinantes de resistência às quinolonas (QRDR) nos genes
gyrA e parC e a presença dos genes qnr e qepA. A pesquisa de 16S rRNA metilase e
aac6b’ foi realizada para avaliar o mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos.
Pela técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) convencional de
acordo com a técnica descrita no item 4.4.1, foi realizada a amplificação das QRDR
dos genes gyrA e parC, detecção dos genes codificadores de qnr, qepA e 16S rRNA
metilase. Foram avaliadas possíveis mutações nas regiões determinantes de
resistência às quinolonas (QRDR) nos genes gyrA e parC das amostras sensíveis às
quinolonas.
As condições de termociclagem do DNA (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) e os
oligonucleotídeos iniciadores estão apresentados na Tabela 9.
51
Material e Métodos
Tabela 9. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a caracterização dos mecanismos de resistência às fluoroquinolonas e aminoglicosídeos pela técnica
de PCR convencional e multiplex nos isolados resistentes a estes antimicrobianos.
qnr
PCR convencional qnr
PCR multiplex
PCR convencional QRDR
Tipo de reação
de PCR
Oligonucleotídeos
iniciadores
GyrA-F
CGT GTC CTT TAT GCC ATG
GyrA-R
GAT GTT GGT CGC CAT GC
Gene alvo
gyrA
ParC-F
Amplicom (pb)
390
TGA GCC TGG AAG GGG TC
ParC-R
GTC CAC CAG CGG ATA GC
QnrA-F
AGA GGA TTT CTC ACG CCA GG
QnrA-R
TGC CAG GCA CAG ATC TTG AC
QnrB-F
GGM ATH GAA ATT CGC CAC TG
QnrB-R
TTT GCY GYY CGC CAG TCG AA
QnrS-F
GCA AGT TCA TTG AAC AGG GT
QnrS-R
TCT AAA CCG TCG AGT TCG GCG
qnrC-F
GGG TTG TAC ATT TAT TGA ATC
qnrC-R
TCC ACT TTA CGA GGT TCT
qnrD-F
CGA GAT CAA TTT ACG GGG AAT A
qnrD-R
AAC AAG CTG AAG CGC CTG
qnrVC-F
CTT CTC ACA TCA GGA CTT GC
qnrVC-R
GCT CCA GTA ACT GTT CCT GT
parC
305
qnrA
580
qnrB
264
qnrS
428
qnrC
447
Referência
35 ciclos
35 ciclos
Este estudo
Cattoir et al., 2007
35 ciclos
qnrD
582
Anelamento: 50ºC – 45 seg
Este estudo
35 ciclos;
qnrVC
52
PCR convencional
Metilases
PCR Multiplex Metilases
PCR convencional
qepA
Material e Métodos
qepA F
CTG CAG GTA CTG CGT CAT G
qepA
qepA R
CGT GTT GCT GGA GTT CTT C
armA-F
ATT CTG CCT ATC CTA ATT GG
armA-R
ACC TAT ACT TTA TCG TCG TC
npmA-F
GGA GGG CTA TCT AAT GTG GT
npmA-R
GCC CAA AGA GAA TTA AAC TG
rmtA-F
CTA GCG TCC ATC CTT TCC TC
rmtA-R
TTG CTT CCA TGC CCT TGC C
rmtB-F
GCT TTC TGC GGG CGA TGT AA
rmtB-R
ATG CAA TGC CGC GCT CGT AT
rmtC-F
CGA AGA AGT AAC AGC CAA AG
rmtC-R
ATC CCA ACA TCT CTC CCA CT
rmtD-F
CGG CAC GCG ATT GGG AAG C
rmtD-R
CGG AAA CGA TGC GAC GAT
rmtD_tot_F
GAG CGA ACT GAA GGA AAA AC
CAG CAC GTA AAA CAG CTC
Este estudo
35 ciclos
armA
315
npmA
386
rmtA
635
rmtB
173
rmtC
711
rmtD
401
rmtD
rmtD_tot_R
850
Desnaturação: 95ºC – 5 min
730
Berçot et al., 2011
35 ciclos
Castanheira et al.,
2008
35 ciclos
53
Material e Métodos
Todas as amostras resistentes a ciprofloxacino e as amostras sensíveis
selecionadas, foram sequenciadas para avaliar as possíveis mutações presentes nas
QRDR, assim como a amostra de 16S rRNA metilase encontrada de acordo com o
descrito no item 4.4.2.
54
Resultados
5. RESULTADOS
5.1 Amostras Bacterianas
Foram estudados 25 isolados clínicos de P. aeruginosa. A maioria dos isolados
clínicos foi coletada de pacientes adultos, maiores de 18 anos de idade (92%) e do
sexo masculino (76%). A idade dos pacientes variou de 10 meses a 90 anos de idade.
Duas amostras clínicas apresentaram crescimento de dois isolados de P. aeruginosa
com diferentes características morfológicas, sendo todas incluídas no estudo. Os
isolados P5 e P6 foram recuperados da primeira amostra e P11 e P12 da segunda
amostra.
A Figura 1 ilustra a distribuição dos isolados de P. aeruginosa pelo seu sítio de
isolamento.
Figura 1. Distribuição (em porcentagem) dos isolados clínicos estudados por sítio de
isolamento.
5.1.1 Re-identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted
laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
Todos os isolados estudados foram corretamente re-identificados pelo MALDITOF MS como P. aeruginosa. Os scores de cada amostra variaram como pode ser
visto no Anexo 1.
55
Resultados
5.2
Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos
A sensibilidade dos isolados de P. aeruginosa aos diversos antimicrobianos foi
avaliada pela técnica de microdiluição em caldo. Na Tabela 10, podemos observar o
perfil de sensibilidade aos antimicrobianos testados de todas as amostras estudadas,
assim como, a menor concentração de cada antimicrobiano que inibiu o crescimento
de 50% e 90% das amostras (CIM50 e CIM90), respectivamente.
Tabela 10. Distribuição da potência e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados
clínicos de P. aeruginosa estudados.
Antimicrobianos
Amicacina
Gentamicina
Aztreonam
Ceftazidima
Cefepima
Ciprofloxacino
Imipenem
Meropenem
Piperacilina/tazobactam
Polimixina B
CIM (μg/mL)
CIM50
CIM90
Sensibilidade
S%
4
2
16
4
8
0,5
8
4
16/4
0,5
8
4
32
8
8
16
16
16
32/4
0,5
96
92
40
100
92
80
20
76
100
Intermediário
I%
Resistência
R%
24
8
36
20
-
4
8
36
20
100
44
4
-
O teste de sensibilidade aos antimicrobianos confirmou a resistência aos
carbapenens (imipenem e meropenem) para a maioria dos isolados clínicos de P.
aeruginosa, exceto para meropenem, onde 5 (20%) e 9 (36%) dos isolados foram
sensíveis e intermediários, respectivamente. Adicionalmente, todos os isolados
apresentaram sensibilidade à ceftazidima, no entanto 2 (8%) isolados apresentaram
resistência intermediária à cefepima (Figura 2).
56
Resultados
Figura 2. Porcentagem de sensibilidade aos diversos antimicrobianos dos isolados de P.
aeruginosa estudados.
Dentre as outras classes de antimicrobianos testados, 5 (20%) isolados
apresentaram resistência ao ciprofloxacino. A resistência aos aminoglicosídeos foi
encontrada em 2 isolados, sendo um deles resistente à amicacina e gentamicina e o
outro resistente apenas à gentamicina.
As CIMs de cada isolado de P. aeruginosa estudado frente aos antimicrobianos
testados estão apresentadas na Tabela 11.
57
Resultados
Tabela 11. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa, realizado pela técnica de microdiluição em caldo, segundo
as recomendações do CLSI (2013).
CIM (μg/mL)
Amostras
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
Amicacina
Gentamicina
Aztreonam
Ceftazidima
Cefepima
Ciprofloxacino
Imipenem
Meropenem
Piperacilina/
Tazobactam
Polimixina B
2
4
8
8
4
8
4
8
4
4
2
4
1
2
8
8
8
>128
2
8
1
4
16
4
4
1
2
4
4
2
4
2
4
2
2
2
2
0,5
2
4
4
4
>64
16
4
1
2
0,5
1
2
2
32
8
16
16
32
32
32
16
8
8
16
8
4
4
32
32
8
16
4
8
32
32
16
32
2
4
2
8
8
8
8
4
2
2
1
8
4
2
1
4
4
1
4
2
2
8
4
4
2
2
8
8
8
8
8
8
8
4
4
2
16
2
2
8
8
16
2
8
8
4
8
4
8
8
0,125
0,5
32
0,25
0,25
0,5
0,5
0,5
0,25
0,125
0,125
0,125
0,5
0,125
16
0,5
1
16
16
0,5
0,25
0,5
8
0,5
0,25
8
8
8
16
8
8
8
16
16
8
8
8
8
8
8
16
8
8
16
8
16
16
8
16
16
2
8
2
4
4
8
4
4
8
2
8
8
4
4
1
8
8
4
4
2
8
16
4
16
16
4/4
16/4
8/4
32/4
16/4
32/4
16/4
8/4
16/4
4/4
8/4
32/4
16/4
4/4
4/4
16/4
16/4
32/4
>128/4
4/4
8/4
16/4
32/4
16/4
16/4
0,25
0,5
0,125
0,5
0,25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0,25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,25
0,5
0,25
0,125
0,06
0,5
0,25
58
Resultados
5.3
Análise da similaridade genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis
(PFGE)
Para a análise da similaridade genética dos 25 isolados de P. aeruginosa foi
realizada a tipagem molecular pela técnica de PFGE. A análise do perfil eletroforético
não relevou a predominância de um perfil clonal predominante entre os isolados
estudados que foram agrupados em 17 padrões distintos de PFGE (A, B, C, D, E, F,
G, H, I, J, K, L, M, N, O, P e Q), segundo a interpretação de Tenover e colaboradores
(Tenover et al., 1995) (Figuras 3 e 4).
Figura 3. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de
P. aeruginosa do H1 e H2 pela técnica de PFGE. λ. padrão de
peso molecular (Kb).
59
Resultados
Figura 4. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de P. aeruginosa do H3 pela
técnica de PFGE. λ. padrão de peso molecular (Kb).
A análise do perfil eletroforético revelou a predominância do perfil F (5
amostras) e I (3 amostras) no H3. As amostras pertencentes ao grupo F foram
divididas em dois subtipos: F1 (2 isolados) e F2 (2 isolados), sendo os dois isolados
do subtipo F1 recuperados do mesmo paciente e os outros três isolados (P6, P22 e
P23) de diferentes pacientes. O grupo I foi dividido também, em dois subtipos: I1 (1
isolado) e I2 (1 isolado), sendo os três isolados recuperados do mesmo paciente. Os
isolados P5 e P6, recuperados da mesma amostra clínica apresentaram perfil clonal
diferente. No entanto, os isolados P11 e P12 foram agrupados como um subclone.
As 5 amostras de P. aeruginosa resistentes ao ciprofloxacino (P3, P15, P18,
P19 e P23) pertenciam a padrões diferentes de PFGE. Assim como as amostras de P.
aeruginosa resistentes aos aminoglicosídeos (P18 e P19).
60
Resultados
As duas amostras pertencentes ao padrão E foram recuperadas do mesmo
paciente em momentos diferentes. No entanto, as duas amostras (P21 e P22)
pertencentes ao padrão K não foram recuperadas do mesmo paciente.
A análise dos géis de PFGE, a partir do dendrograma obtido utilizando o
programa BioNumerics (coeficiente de DICE 1,0%), demonstrou a presença de 17
padrões, sendo que 5 padrões apresentaram amostras relacionadas (Figura 5).
P2
P3
P4
P18
P12
P14
P11
P20
P25
P21
P22
P8
P15
P7
P16
P17
P6
P23
P24
P13
P1
P5
P9
P10
P19
Figura 5. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de
PFGE dos isolados de P. aeruginosa avaliados neste estudo.
61
Resultados
5.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI)
Os valores de pI das bandas detectadas foram calculados a partir da curva de
regressão linear obtida com a focalização das β-lactamases presentes nos extratos
das amostras-controles, que apresentou coeficiente R2=0,9873 (Figura 6).
Apenas uma banda foi observada na focalização do pI dos extratos protéicos
dos isolados de P. aeruginosa estudados, que apresentou valor de pI igual a 8,2.
Outra banda de valor de pI igual a 6,5 foi visualizada na amostra P18.
Figura 6. Curva de regressão linear da focalização das β-lactamases presentes nos isolados de P.
aeruginosa.
62
Resultados
5.5. Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens
5.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria
Entre as 25 amostras de P. aeruginosa estudadas, nenhuma apresentou
hidrólise enzimática frente aos carbapenens testados (Figura 7).
Figura 7. A. Isolado KPC-2 na presença de imipenem; B. Isolado KPC-2 na presença de meropenem;
C. Isolado de P. aeruginosa P2 na presença de imipenem; D. Isolado de P. aeruginosa P2 na
presença de meropenem.
5.5.2 Teste de Hidrolise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
A maioria dos isolados de P. aeruginosa não apresentou hidrólise enzimática
frente ao imipenem no MALDI-TOF MS, no entanto quatro isolados apresentaram
resultados duvidosos no teste (P11, P13, P15 e P16) (Figura 8).
63
Resultados
Figura 8. A. Imipenem puro; B. Isolado KPC-2 na presença de imipenem; C. Isolado de P. aeruginosa
P13 na presença de imipenem; D. Isolado de P. aeruginosa P15 na presença de imipenem.
5.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases
Não houve detecção de nenhum gene codificador das serino-β-lactamases
blaTEM, blaSHV, blaGES, blaCTX-M, blaBES, blaPER, blaKPC e blaSME; das oxacilinases blaOXA-1,
blaOXA-2,
blaOXA-5,
blaOXA-18,
blaOXA-45
e
blaOXA-46;
das
oxacilinases
do
tipo
carbapenemase blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48, blaOXA-51, blaOXA-58, blaOXA-20, blaOXA-48,
blaOXA-62, blaOXA-143 e blaOXA-198; das metalo-β-lactamases blaIMP, blaVIM, blaSPM, blaGIM,
blaSIM e blaNDM nos isolados de P. aeruginosa estudados. No entanto, foi detectado em
um isolado o gene blaOXA-7. Todos os isolados de P. aeruginosa apresentaram
amplificação para a β-lactamase cromossomal AmpC e para a oxacilinase blaOXA-50
(Figura 9).
64
Resultados
Figura 9. PCR convencional de todos os isolados de P. aeruginosa. A. β-lactamase
cromossomal AmpC (1.243pb); B. OXA-50 (789 pb); a. P. aeruginosa ATCC 27853; *. P.
aeruginosa PAO1; λ. padrão de peso molecular (Kb).
O sequenciamento dos amplicons obtidos por amplificação do gene codificador
das oxacilinases do grupo OXA-7 confirmou a presença do gene blaOXA-56 no isolado
P18. O sequenciamento das porções adjacentes ao gene blaOXA-56, demonstraram que
o mesmo encontra-se em um integron de classe 1 (Figura 10).
attI1
59’-be
3´CS
5´CS
intI1
aacA4
blaOXA-56
qacEΔ1/Sul1
Figura 10. Representação esquemática do integron In163, abrigando os dois determinantes de
resistência: aacA4, seguido pela blaOXA-56, que foram sequenciados. As flechas representam os
genes do integron e o sentido das flechas representa o sentido da transcrição dos genes.
65
Resultados
O sequenciamento dos amplicons obtidos por amplificação de blaOXA-50 revelou
uma grande variedade de mutações na maioria dos isolados de P. aeruginosa
estudados. No entanto, todos apresentaram a sequencia STYK, comum na OXA-50 e
nenhuma mutação nos 5 elementos estruturais da sequencia consenso das βlactamases da classe D (DBLs). Dentre os isolados avaliados, 12 apresentaram
mutações diferentes das já descritas.
5.7 Avaliação Fenotípica com inibidores
Todos os isolados de P. aeruginosa cresceram nas concentrações utilizadas de
PAβN (50 μg/mL) e Cloxacilina (200 μg/mL) nos testes para avaliação do crescimento
bacteriano.
5.7.1 Inibição da β-lactamase cromossomal AmpC
Na avaliação fenotípica da hiperexpressão β-lactamase cromossomal AmpC,
as CIMs variaram pouco para meropenem e ceftazidima, sendo que somente 4
isolados (16%) tiveram diminuição das suas CIMs ≥ 2 diluições para ceftazidima. No
entanto para o imipenem, podemos notar que 15 isolados (60%) tiveram uma
diminuição da CIM ≥ 2 diluições (Tabela 12).
66
Resultados
Tabela 12. Teste de inibição da β-lactamase cromossomal AmpC, na presença de cloxacilina
(200 μg/mL), aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa.
Amostras
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
Imipenem
Imipenem
+
Cloxacilina
8
8
8
16
8
8
8
16
16
8
8
8
8
8
8
16
8
8
16
8
16
16
8
16
16
2
2
4
4
4
4
2
4
4
4
4
4
4
4
2
4
4
4
4
2
4
4
2
4
4
CIM (μg/mL)
Meropenem
Meropenem
+
Cloxacilina
2
8
2
4
4
8
4
4
8
2
8
8
4
4
1
8
8
4
4
2
8
16
4
16
16
2
8
2
4
2
4
4
4
8
2
8
8
4
4
1
8
4
4
4
2
8
8
2
8
8
Ceftazidima
Ceftazidima
+
Cloxacilina
2
4
2
8
8
8
8
4
2
2
1
8
4
2
1
4
4
1
4
2
2
8
4
4
2
1
4
2
4
2
1
1
4
2
2
1
1
2
2
1
4
2
1
2
2
2
4
2
2
2
5.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo
A grande maioria dos isolados de P. aeruginosa (92%) apresentaram uma
diminuição da CIM ≥ 2 diluições para imipenem, no entanto para meropenem apenas
10 isolados (40%) apresentaram esta diminuição. Todos os isolados tiverem uma
diminuição da CIM ≥ 2 diluições para ciprofloxacino, inclusive os 5 isolados resistentes
a este antimicrobiano (Tabela 13).
67
Resultados
Tabela 13. Teste de inibição de bomba de efluxo, na presença de PAβN (50 μg/mL), aos
antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa.
Amostras
Imipenem
Imipenem
+
PAβN
8
8
8
16
8
8
8
16
16
8
8
8
8
8
8
16
8
8
16
8
16
16
8
16
16
2
1
0,5
0,5
1
2
2
2
1
4
4
2
1
1
2
2
1
1
2
1
2
2
2
2
2
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
CIM (μg/mL)
Meropenem
Meropenem
+
PAβN
2
8
2
4
4
8
4
4
8
2
8
8
4
4
1
8
8
4
4
2
8
16
4
16
16
2
4
0,5
0,5
4
4
4
4
1
2
4
2
4
1
1
4
2
1
2
2
4
4
2
4
4
Ciprofloxacino
Ciprofloxacino
+
PAβN
0,125
0,5
32
0,25
0,25
0,5
0,5
0,5
0,25
0,125
0,125
0,125
0,5
0,125
16
0,5
1
16
16
0,5
0,25
0,5
8
0,5
0,25
0,03
0,06
2
0,015
0,015
0,03
0,06
0,03
0,015
0,015
0,03
0,03
0,06
0,015
4
0,06
0,06
2
4
0,03
0,03
0,03
0,06
0,03
0,015
5.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo
Real - qRT-PCR
Os valores da média da expressão relativa dos genes estudados nas 25
amostras de P. aeruginosa estão apresentados na Tabela 14. Os valores da
expressão relativa dos genes avaliados de cada isolado clínico, da ATCC de P.
aeruginosa e da cepa referência PA01 estão apresentados no Anexo 2.
68
Resultados
Tabela 14. Média da expressão relativa dos genes estudados nos isolados
clínicos de P. aeruginosa em relação a cepa PAO1.
Gene
Média
Desvio Padrão
Intervalo
mexB
1,92
1,11
0,64 - 4,61
mexD
2,69
0,85
1,68 - 4,61
mexF
6,04
2,03
3,23 - 10,45
mexY
1,56
1,57
0,12 - 5,12
ampC
9,21
4,97
2,59 - 19,37
oprD
0,20
0,16
0,01 - 0,50
Das 25 amostras clinicas de P. aeruginosa, 9 (36%) espressavam mexB, no
mínimo, duas vezes mais que a cepa referência PAO1 (Figura 11). Quando avaliamos
a expressão de mexD, 20 (80%) isolados, expressavam duas vezes mais que a cepa
referência PAO1. No entanto se utilizarmos os parâmetros estabelecidos para avaliar a
transcrição deste gene, nenhum isolado apresentou aumento da transcrição (Figura
12).
Onze (44%) amostras clinicas de P. aeruginosa, espressavam mexF, no
mínimo, seis vezes mais que a cepa referência PAO1 (Figura ). No entanto, quando
utilizarmos os parâmetros estabelecidos para avaliar a transcrição deste gene, todos
os isolados apresentaram transcrição basal (Figura 13).
Considerando o parâmetros estabelecido para identificar a transcrição de
mexY, apenas três (12%) isolados apresentaram um aumento na transcrição deste
gene. (Figura 14). No entanto, 13 (52%) apresentaram expressão menor que aquela
observada entre a cepa referência PAO1.
69
Resultados
Figura 11. Quantificação da transcrição relativa do gene mexB para os isolados de P.
aeruginosa e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em relação a cepa PAO1.
Figura 12. Quantificação da transcrição relativa do gene mexD para os isolados de P.
70
Resultados
Figura 13. Quantificação da transcrição relativa do gene mexF para os isolados de P.
Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene mexY para os isolados de P.
71
Resultados
Os cinco isolados sensíveis a meropenem (CIM, 2 μg/mL e 1 μg/mL)
expressavam 2 e 4 vezes mais, em relação a PAO1, os genes mexD e mexF,
respectivamente. Apenas um isolado, P3, apresentou expressão maior que duas
vezes do gene mexB. Nove isolados apresentaram resistência intermediária ao
meropenem (CIM, 4 μg/mL) e apenas dois (P7 e P8) hiperexpressavam o gene mexB.
Os dois isolados que apresentaram resistência intermediária à cefepima (CIM,
16 μg/mL) apresentaram expressão maior que duas vezes do gene mexD e mexY,
assim como de quatro vezes para o gene mexF.
Dentre os cincos isolados resistentes a ciprofloxacino, apenas um (P3)
apresentou expressão maior que duas vezes paro o gene mexB. No entanto, todos os
isolados apresentaram uma expressão, no mínimo, maior que três vezes para mexF.
Três destes isolados (P18, P19 e P23) tiveram uma expressão menor do que a cepa
referência PAO1 para o gene mexY.
Os dois isolados (P18 e P19) resistentes aos aminoglicosídeos testados,
apresentaram expressão similar para os genes mexB, mexF e mexY, no entanto para
o gene mexD, o isolado P18 expressou cerca de duas vezes mais este gene.
Dez (40%) isolados de P. aeruginosa tiveram a expressão de ampC,
aumentada em no mínimo 10 vezes; enquanto, 20 (80%) isolados tiveram a expressão
de ampC, aumentada em no mínimo 5 vezes, em relação a cepa referência PAO1
(Figura 15). Todos os isolados de P. aeruginosa estudados tiveram redução na
expressão de oprD em relação a cepa referência PAO1 (Figura 16).
72
Resultados
Figura 15. Quantificação da transcrição relativa do gene ampC para os isolados de P.
Figura 16. Quantificação da transcrição relativa do gene oprD para os isolados de P.
73
Resultados
5.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo
Todos os isolados de P. aeruginosa estudados apresentaram amplificação dos
genes que codificam os componentes dos sistemas de efluxo avaliados, mexB (244
pb), mexD (165 pb), mexF (255 pb), mexY (250 pb), além da β-lactamase
cromossomal AmpC (166 pb) e da proteína de membrana externa oprD (191 pb).
5.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE
Todos os isolados de P. aeruginosa estudados apresentam a OprF (32 kDa)
sem nenhuma alteração, assim como a OprE (43 kDa). No entanto, na analise visual
do gel de SDS-PAGE podemos notar a ausência da banda de 46 kDa, equivalente a
OprD em todos os isolados. No entanto uma banda de aproximadamente 48 kDa pode
ser visualizada em todos os isolados clínicos de P. aeruginosa estudados (Figura 17).
Figura 17. Perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE dos isolados de P.
aeruginosa. a. P. aeruginosa ATCC 27853; *. P. aeruginosa PAO1; λ. padrão de peso
molecular (kDa).
74
Resultados
5.10 Avaliação da presença do Gene Codificador da Proteína de Membrana
Externa – OprD
A maioria dos isolados de P. aeruginosa estudados apresentaram um amplicon
de 1.400 pb, compatível com a oprD da cepa referência PAO1. No entanto, cinco
isolados (P5, P9, P13, P15 e P21) apresentaram um amplicon de aproximadamente
2.100 pb e dois isolados (P7 e P22) não apresentaram nenhum amplicon com os
oligonucleotídeos iniciadores utilizados (Figura 18). Todos estes isolados eram do H3.
Figura 18. PCR convencional do gene codificador da proteína de membrana
externa oprD dos isolados de P. aeruginosa. (1413pb); a. P. aeruginosa
ATCC 27853; *. P. aeruginosa PAO1; λ. padrão de peso molecular (Kb).
5.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e
aos Aminoglicosídeos
Entre os 25 isolados de P. aeruginosa estudados, 5 (20%) isolados
apresentaram resistência a ciprofloxacino e 2 (8%) apresentaram resistência aos
aminoglicosídeos e com isso foram realizadas as pesquisas de genes codificadores de
qnr, qepA e 16S rRNA metilase, assim como, a amplificação das QRDR dos genes
gyrA e parC.
75
Resultados
Todos os isolados resistentes a ciprofloxacino, assim como, as amostras
sensíveis selecionadas, tiveram os genes gyrA (390 pb) e parC (305 pb)
amplificados e sequenciados. Apenas um isolado, resistente à amicacina e à
gentamicina, amplificou para a 16S rRNA metilase rmtD.
No sequenciamento para avaliação das mutações no QRDR, pudemos
constatar que os cinco isolados apresentaram uma mutação no gene gyrA e uma
mutação no gene parC, como pode ser visto na Tabela 15. Os isolados sensíveis
selecionados para controle, não apresentaram nenhuma mutação no QRDR.
Tabela 15. Mutações no QRDR dos isolados de P. aeruginosa estudados.
Mutações
Mudança de
aminoácido
Gene
Isolados
Códon
gyrA
P3
P15
P18
P19
P23
83
83
83
83
83
ACC
ACC
ACC
ACC
ACC
-
ATC
ATC
ATC
ATC
ATC
Thr
Thr
Thr
Thr
Thr
-
Ile
Ile
Ile
Ile
Ile
parC
P3
P15
P18
P19
P23
87
87
87
87
87
TCG
TCG
TCG
TCG
TCG
-
TTG
TTG
TTG
TTG
TTG
Ser
Ser
Ser
Ser
Ser
-
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
No sequenciamento do gene codificador da 16S rRNA metilase, rmtD, no
isolado P18, constatou-se 100% de similaridade com o gene descrito previamente por
Doi e colaboradores (2007a).
76
Discussão
6
DISCUSSÃO
P. aeruginosa é um patógeno humano oportunista e que apresenta alta
capacidade de adaptação ao meio hospitalar. Apresenta resistência intrínseca e uma
grande habilidade de desenvolver resistência à maioria dos antimicrobianos (Kiska &
Gillian, 2003; Strateva & Yordanov, 2009).
Hoje é um dos principais agentes etiológicos de infecções relacionadas à
assistência à saúde, principalmente no Brasil (Gales et al., 2012). Este patógeno está
relacionado a infecções nosocomiais graves, com elevada mortalidade, podendo esta
taxa variar de 18% a 39% (Safdar et al., 2004; Osmon et al., 2004; Suàrez et al.,
2009). Juntamente com o aumento na prevalência das infecções causadas por P.
aeruginosa, podemos constatar um aumento nas taxas de resistência aos
antimicrobianos utilizados no tratamento destas infecções (Diekema et al., 1999).
Destacando-se a diminuição de sensibilidade aos antibióticos de maior espectro de
ação para estes isolados, como as cefalosporinas de amplo espectro e os
carbapenens (Gales et al., 2012). Sendo a produção de β-lactamases, principalmente
as carbapenemases, o mecanismo de resistência mais importante descrito em P.
aeruginosa (Goldberg, 2000; Kiska & Gillian, 2003; Landman et al., 2007).
Outra característica preocupante relacionada à P. aeruginosa, é a resistência
cruzada aos antimicrobianos, resultante da presença de múltiplos mecanismos de
resistência num único isolado (Livermore, 2002; McGowan, 2006).
Para esta tese, foram estudados isolados clínicos de P. aeruginosa
recuperados de diversos sítios infecciosos de três hospitais localizados na cidade de
São Paulo durante o ano de 2012 e 2013. Foram recuperados 25 isolados que
apresentavam resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de
amplo espetro. A maioria dos isolados de P. aeruginosa estudados foram recuperados
do trato respiratório inferior (56%) e de urina (20%). De um modo geral, estas são as
fontes de isolamento mais frequentes deste patógeno (de Freitas & Barth, 2002). A
grande maioria das amostras não é isolada de sítios estéreis, dificultando estabelecer
77
Discussão
o real papel patogênico destas cepas. Este estudo teve como objetivo caracterizar
microbiológicamente as cepas de P. aeruginosa, mas não o estudo epidemiológico,
incluindo o modo de aquisição destas cepas. De qualquer maneira, o quadro de
colonização geralmente precede o de infecção.
Todos os isolados de P. aeruginosa estudados apresentaram o fenótipo
incomum de resistência a pelo menos um dos carbapenens e sensibilidades às
cefalosporinas de amplo espectro. A taxa de resistência ao imipenem foi de 100%
(CIM50, 8 µg/mL), entretanto para meropenem (CIM50, 4 µg/mL), as taxas encontradas
foram menores, sendo que 20% e 36% do isolados apresentaram sensibilidade ou
resistência intermediaria, respectivamente. Entre as cefalosporinas de amplo espectro,
notamos uma maior sensibilidade para ceftazidima (100%; CIM50, 4 µg/mL) em relação
à cefepima (92%; CIM50, 8 µg/mL). Este fenótipo de resistência tem sido pouco
reportado, mas é cada vez mais comum o seu aparecimento na rotina dos laboratórios
de microbiologia do Brasil. A confirmação deste fenótipo reforça a dificuldade para a
seleção de antimicrobianos efetivos para o tratamento das infecções causadas por
esse patógeno.
Uma boa taxa de sensibilidade à piperacilina/tazobactam (76%; CIM50, 16/4
µg/mL) foi encontrada nos isolados clínicos de P. aeruginosa estudados. Em estudo
do Programa SENTRY com isolados clínicos de P. aeruginosa, procedentes dos cinco
continentes, demonstrou que as maiores taxas de sensibilidade encontradas para esse
antimicrobiano foram observadas na América do Norte (83%), enquanto a menor taxa
foi encontrada na América Latina (74,8%) (Jones et al., 2009). Esses resultados
sugerem que piperacilina/tazobactam poderia constituir uma boa opção terapêutica
contra infecções causadas por P. aeruginosa na maioria das regiões geográficas. No
entanto, em estudo mais recente do Programa SENTRY, avaliando isolados da
América Latina, esta taxa caiu para 55,6% (Gales et al., 2012). Em outro estudo
realizado na cidade de São Paulo, as taxas de sensibilidade a piperacilina/tazobactam
foram mais baixas (36,5%) que a encontrada neste estudo (Picão et al., 2009b).
78
Discussão
Provavelmente, as porcentagens de sensibilidade à piperacilina/tazobactam em nosso
estudo foram superiores as encontradas anteriormente, porque a produção de
carbapenemases conhecidas, como SPM-1 e GES-5, não foi encontrada em nenhum
isolado clínico de P. aeruginosa.
Apenas 5 isolados apresentaram resistência a ciprofloxacino (20%; CIM50, 0,5
µg/mL). Esse valor é discrepante daqueles descritos por Fehlberg e colaboradores
(2012), onde nos isolados recuperados de um centro norte americano as taxas de
resistência foram de 75% (CIM50, 4 µg/mL) e no centro brasileiro esta taxa chegou a
51,2% (CIM50, 4 µg/mL). O aumento da resistência à ciprofloxacino entre isolados
bacterianos hospitalares e comunitários pode ser decorrente da ampla utilização das
quinolonas para o tratamento de várias infecções, como as infecções do trato urinário
adquiridas na comunidade e doenças sexualmente transmissíveis causadas por
Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia trachomatis. A ciprofloxacina é também,
frequentemente, utilizada no tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa,
principalmente em pacientes com fibrose cística (Yao & Moellering, 2007).
Em estudo recente do programa SENTRY a resistência aos aminoglicosídeos
foi de 23,2% (CIM50, 4 µg/mL) e 35,2% (CIM50, ≤2 µg/mL) para amicacina e
gentamicina, respectivamente (Gales et al., 2012). No entanto, neste estudo
observamos uma taxa de resistência muito baixa para essa classe de antimicrobianos.
As polimixinas B e E (Colistina) apresentam atividade bactericida contra
isolados de P. aeruginosa, e as taxas de resistência tem se mantido relativamente
baixa, aproximadamente, 0,1% (Gales et al., 2011; Gales et al., 2012). Neste estudo
pudemos constatar que todos os isolados eram sensíveis a este antimicrobiano (CIM50
e CIM90, 0,5 µg/mL). No tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa
multirresistentes, em muitos casos, as polimixinas são uma das únicas opções clínicas
disponíveis para tratamento.
A análise do padrão de similaridade genética dos 25 isolados de P. aeruginosa
deste estudo demonstra uma grande variabilidade genética em relação ao fenótipo
79
Discussão
estudado. Nossos resultados evidenciaram que vários clones vem circulando ao
mesmo tempo nos diferentes hospitais estudados, sugerindo que o uso de
antimicrobianos age na seleção para o surgimento de clones resistentes distintos. Não
havendo, portanto, evidência de uma transmissão intra-hospitalar de um único clone.
Apenas no Hospital 3, isolados clonalmente relacionados foram encontrados, o que
demonstra uma evolução distinta em cada instituição. As amostras que foram
recuperadas do mesmo material clínico apresentaram variação clonal, o que sugere
uma evolução destas cepas.
A focalização do ponto isoelétrico permite a identificação do número e tipos de
β-lactamases produzidas por um isolado bacteriano. No entanto, os valores de pI
obtidos não correspondem aos pI reais, mas sim àqueles calculados a partir de uma
curva de regressão linear. Com isso, os valores de pI obtidos não são exatos, e
pequenas variações devem ser consideradas. Assim como, nem todos os géis de pI
conseguem detectar perfeitamente pIs de β-lactamases próximas aos limites do gel
(3,5 e 9,0). Em todos os isolados de P. aeruginosa, foi observada uma banda de pI
com valor igual a 8,2. Esta banda poderia corresponder à β-lactamase cromossomal
AmpC, que apresenta uma variação de formas, com pI de 7,6, 8,2, 8,3, 8,7 e 9,1 em
isolados de P. aeruginosa (Walther-Rasmussen et al., 1999). Além disso, as bandas
obtidas poderiam corresponder à enzima OXA-50, pois o gene codificador desta
enzima é intrínseco às bactérias pertencentes a este gênero, e apresenta pI com valor
igual a 8,6 (Girlich et al., 2004). Poderiamos também, ter outra β-lactamase, não
conhecida, que tenha sido cofocalizada neste mesmo pH. Somente a amostra P18
apresentou uma outra banda, de pI aproximado de 6,5, correspondente a OXA-56
presente nesta amostra (Poirel et al., 2004a).
Os testes da hidrólise enzimática aos carbapenens empregados neste estudo
tiveram uma correlação maior que 80%, sendo que nenhum isolado de P. aeruginosa
apresentou hidrólise no teste de espectrofotometria e quatro isolados apresentaram
um resultado duvidoso no teste realizado no MALDI-TOF MS. Esse resultado
80
Discussão
discrepante pode ser em decorrência da diferença de sensibilidade dos testes, assim
como, da subjetividade da análise no teste realizado no MALDI-TOF MS já que foi
utilizado como substrato o imipenem, e neste caso, os picos da matriz se interpõem
com os picos de massa do imipenem. No entanto resultados excelentes com
carbapenemases conhecidas já foram descritas para este teste (Carvalhaes et al.,
2013).
A disseminação de genes codificadores de β-lactamases têm sido relatados em
diversas partes do mundo (Patzer et al., 2004; Nordmann & Poirel, 2002; Walsh et al.,
2003; Toleman et al., 2005), e a produção de β-lactamases adquiridas em P.
aeruginosa causa um impacto clínico significativo nos serviços de assistência à saúde
em todo o mundo e, em particular, no Brasil. Muitas vezes as infecções causadas por
microrganismos
produtores
de β-lactamases estão relacionadas com
falhas
terapêuticas e, assim, elevam o tempo de hospitalização, os custos e as taxas de
mortalidade (Juan et al., 2009). Apesar da disseminação de isolados de P. aeruginosa
produtores de MβL, GES-5 e ESβL no Brasil (Martins et al., 2007; Picão et al., 2009a;
Picão et al., 2009b; Polotto et al., 2012), nenhuma β-lactamase adquirida ou
carbapenemase foi encontrada nos isolados estudados.
Apenas um isolado apresentou a oxacilinase de espectro restrito OXA-56. Essa
oxacilinase foi descrita pela primeira vez em 2004, em isolados clínicos de P.
aeruginosa, produtores de SPM-1, em um hospital de Recife (Poirel et al., 2004a). A
OXA-56, no sequenciamento, apresentava três substituições em relação à OXA-7
(oxacilinase de espectro restrito) e OXA-35 (oxacilinase do tipo EsβL). Esta enzima
não era inibida pelo ácido clavulânico (Poirel et al., 2004a). Em 2006, Carvalho e
colaboradores relataram a presença de OXA-56 em isolados de P. aeruginosa
produtores de SPM-1, no Rio de Janeiro. Nesse estudo, demonstraram que o gene
blaOXA-56 estava localizado em um integron de classe 1, nomeado como In163. Esse
integron era composto, além do gene codificador da OXA-56, de dois genes cassetes
que conferiam resistência aos aminoglicosídeos (aacA4 e aadA7). Doi e colaboradores
81
Discussão
(2008) descreveram o contexto genético de um isolado produtor de rmtD e
caracterizaram com isso, o integron completo da OXA-56, que estava localizado à
montante do gene da rmtD. Na amostra estudada P18, o gene blaOXA-56 estava
localizado à jusante do gene aacA4 e à montante do cassete gênico qacEΔ1/sul1,
demonstrando um arranjo igual aquele descrito previamente (Carvalho et al., 2006; Doi
et al., 2008). O fato de este isolado carrear o gene rmtD também reforça a estrutura
descrita por Doi e colaboradores (2008). Não houve a detecção da OXA-56 em
nenhum outro país até o momento e talvez a disseminação restrita do gene blaOXA-56
esteja relacionado a coprodução da SPM-1.
Apesar de todos os isolados apresentarem um baixo grau de resistência aos
carbapenens (MIC90, 16 µg/mL para imipenem e meropenem) o que desfavorece o
encontro de carbapenemases, dois relatos recentes em nosso país demonstrou a
presença de isolados produtores de MβLs em isolados sensíveis aos carbapenens. No
primeiro relato, Pellegrino e colaboradores (2009) isolaram uma P. aeruginosa
produtora de SPM-1, sensível aos carbapenens. Em 2012, Picão e colaboradores
descreveram dois isolados de P. aeruginosa produtores de IMP-16, com baixa
resistência a imipenem e sensíveis ao meropenem.
Como esperado, todos os isolados de P. aeruginosa carreavam as enzimas
cromossomais e intrínsecas desta espécie, OXA-50 e AmpC. Diversas variantes de
OXA-50 já foram descritas em isolados clínicos de P. aeruginosa de várias regiões
geográficas, sendo denominadas de OXA-50a a OXA-50j (Girlich et al., 2004; Empel et
al., 2007; Seok et al., 2011). Nos 25 isolados de P. aeruginosa estudados, pudemos
constatar uma grande diversidade de OXA-50, assim como, um grande número de
novos mutantes. Porém, estas mutações não estavam localizadas nos 5 elementos
estruturais conservados da sequência consenso das DBLs, este fato poderia estar
relacionado a uma alteração no perfil hidrolítico da enzima, no entanto mais estudos
são necessários para se comprovar tal fato (Girlich et al., 2004). Dos quatro isolados
que apresentaram hidrólise duvidosa na técnica de MALDI-TOF, três apresentaram
82
Discussão
novas mutações e apenas um isolado apresenta a OXA-50e. No entanto, maiores
esclarecimentos sobre o perfil hidrolítico destas enzimas nestas amostras se fazem
necessários.
Diversos trabalhos já demonstraram a utilização de cloxacilina, um β-lactâmico,
para inibir a atividade da β-lactamase cromossomal AmpC (Corvec et al., 2003; Poirel
et al., 2003; Jiang et al., 2006). Neste estudo notamos que a ceftazidima foi menos
influenciada pela ação de inibição da cloxacilina que o imipenem. Este resultado
poderia estar relacionado com alguma mutação no gene da β-lactamase cromossomal
AmpC ou até mesmo com alguma alteração no perfil hidrolítico da OXA-50. No estudo
de Rodríguez-Martínez e colaboradores (2009a) todos os isolados hiperprodutores de
AmpC tiveram as CIMs de ceftazidima reduzidas na presença de cloxacilina. O
inibidor, PAβN, foi o primeiro inibidor de bombas de efluxo de amplo espectro descrito
(Ueda et al., 2005). Este inibidor foi capaz de potencializar de 8 a 64 vezes a atividade
de levofloxacina contra cepas mutantes que hiperexpressavam o sistema MexABOprM quanto comparadas às cepas selvagens de P. aeruginosa (Kaatz, 2005). Os
substratos, assim como, o inibidor foram escolhidos de acordo com estudos prévios
(Lomovskaya et al., 2001; Denny et al., 2005). Todos os isolados apresentaram
redução da CIM para cirpofloxacino na presença de PAβN, demonstrando o
envolvimento de sistemas de bombas de efluxo no aumento da CIM para este
antimicrobiano. Em um estudo recente de Sonnet e colaboradores (2012) foram
avaliados isolados de P. aeruginosa com resistência às fluoroquinolonas. A CIM50 de
ciprofloxacino reduziu três diluições (CIM50, de 16 µg/mL para 2 µg/mL) na presença
de PAβN, assim como foi observado que a sensibilidade foi recuperada em 22,2% dos
isolados estudados. Vários sistemas de bombas de efluxo estão envolvidos na
resistência ás fluoroquinolonas (Lister et al., 2009). Diversos estudos demonstram que
o PAβN é rotineiramente combinado com antibióticos da classe das fluoroquinolonas,
mas poucos estudos avaliaram a sua utilidade em combinação com antibióticos βlactâmicos. Ainda que de forma mais discreta, as CIMs para imipenem também
83
Discussão
diminuíram cerca de duas diluições. Lamers e colaboradores (2013) notaram que o
PAβN reduziu as CIMs de vários β-lactâmicos em isolados de P. aeruginosa, no
entanto, as alterações de sensibilidade não eram inteiramente devido à inibição de
bombas de efluxo. O PAβN permeabilizou a membrana externa de todos os isolados
de P. aeruginosa testados, aumentando a concentração da β-lactamase cromossomal
AmpC e permitindo a entrada de moléculas que normalmente não atravessam a
membrana externa de P. aeruginosa.
A resistência aos antimicrobianos em isolados clínicos de P. aeruginosa, pode
ser atribuída à associação de diferentes mecanismos de resistência, como, por
exemplo, o efluxo ativo e a redução da permeabilidade da membrana externa. Os
sistemas de bombas de efluxo expelem uma variedade de classes de antimicrobianos
utilizados para o tratamento de infecções causadas por esse patógeno, reduzindo a
concentração dos mesmos no interior celular. No entanto, pouco se conhece sobre o
impacto clínico que esses sistemas podem causar (Yoshihara et al., 2009). Não existe
um consenso que defina os limites de hiperexpressão dos sistemas de efluxo com a
elevação da CIM para os substratos destes sistemas, sendo estes por sua vez muito
arbitrários. No entanto, nesse estudo, utilizamos os critérios estabelecidos
anteriormente: aumento da transcrição de no mínimo duas e quatro vezes para os
genes mexB e mexY, mínimo de 100 vezes para mexD e mexF, mínimo de dez vezes
para a β-lactamase cromossomal ampC e redução de 30% da transcrição do gene
oprD em comparação com a cepa referência PA01 (Quale et al., 2006, RodriguezMartinez et al., 2009b).
Neste estudo a média do aumento da transcrição dos genes que codificam os
sistemas de efluxo avaliados foi maior para o sistema EFN (6,04) nos isolados clínicos
de P. aeruginosa estudados, seguido pelo sistema CDJ (2,69).
O sistema MexAB-OprM é expresso constitutivamente em cepas selvagens de
P. aeruginosa e contribui significativamente para a resistência aos antimicrobianos.
Este sistema responsável, muitas vezes, pela resistência de P. aeruginosa aos β-
84
Discussão
lactâmicos, com exceção do imipenem, e a sua hiperexpressão pode comprometer
também a sensibilidade às fluoroquinolonas (Poole, 2007, Lister et al., 2009). O
aumento dos níveis transcricionais de mexB foi de 36% no isolados estudados e
diversos trabalhos no mundo todo já demonstraram a relação da hiperexpressão do
sistema ABM com a resistência aos agentes β-lactâmicos e com baixos níveis de
sensibilidade à ciprofloxacino (Ziha-Zarifi et al., 1999; Hocquet et al., 2007). Esses
achados podem explicar, parcialmente, os resultados obtidos na inibição com PAβN e
à ciprofloxacino.
Em nosso estudo, nenhum isolado de P. aeruginosa apresentou aumento da
transcrição para mexD e mexF de, no mínimo,100 vezes, em relação à cepa referência
PA01. No entanto, se utilizarmos o critério sugerido por Hocquet e colaboradores
(2006), 80% e 100% dos isolados hiperexpressaram os sistemas CDJ e EFN,
respectivamente. Cepas de P. aeruginosa que hiperexpressam o sistema MexCDOprJ, geralmente apresentam sensibilidade ao imipenem e aminoglicosideos (Wolter
et al., 2005). A hiperexpressão do sistema MexEF-OprN, geralmente está associada a
sensibilidade a maioria dos antimicrobianos, relacionando-se assim, com o fenótipo
dos isolados de P. aeruginosa estudados (Okamoto et al., 2002). Existem relatos
sobre a capacidade que o sistema MexEF-OprN tem em diminuir a expressão do
sistema MexAB-OprM, numa atividade corregulatória (Maseda et al., 2004).
O sistema XY é um dos principais responsáveis pela resistência intrínseca, em
cepas selvagens de P. aeruginosa, sendo as fluoroquinolonas e a cefepima substratos
preferenciais desse sistema de efluxo (Strateva & Yordanov, 2009). A hiperexpressão
do sistema de efluxo MexXY-OprM esta relacionada a isolados resistentes à cefepima,
porém, sensíveis à ceftazidima (Hocquet et al., 2006). A transcrição do gene mexY foi
menor do que o da cepa referência em 52% dos isolados estudados. Apesar do
sistema MexXY-OprM ser um dos principais mecanismo de resistência de P.
aeruginosa aos aminoglicosideos (Morita et al., 2006), os dois isolados resistentes aos
aminoglicosídeos não hiperexpressavam esse sistema de efluxo.
85
Discussão
Hocquet e colaboradores (2006) sugeriram que os sistemas de efluxo estão
hiperexpressos quando a sua expressão é duas vezes maior quando comparado com
a amostra referência. Evidenciamos, assim, a falta de critérios que definam os limites
adequados para a hiperexpressão dos sistemas de efluxo. Se considerarmos um
ponto de corte da expressão de três vezes mais em relação a PAO1, observamos que
20%, 28%, 100% e 20% dos isolados hiperexpressam os sistemas ABM, CDJ, EFN e
XY, respectivamente. Esses índices são menores ainda quando consideramos uma
expressão maior que quatro vezes em relação à PA01 (8% para ABM, 8% para CDJ,
40% EFN). Estudos adicionais são necessários para o estabelecimento de criterios
que possam detectar corretamente a presença de hiperexpressão de efluxo entre
isolados clínicos de P. aeruginosa.
Em 2010, o trabalho publicado por Xavier e colaboradores demonstrou que os
sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM eram frequentemente mais
transcritos que os sistemas de efluxo MexEF-OprN e MexCD-OprJ (3,5%) em isolados
clínicos de P. aeruginosa em um hospital da cidade de São Paulo. Resultados
semelhantes foram reportados no estudo de Fehlberg e colaboradores (2012), no qual
se verificou que o sistema de efluxo mais expresso foi o MexXY-OprM (41,6%) no
centro Brasileiro. No entanto, quando foram avaliados os isolados do centro Norte
Americano o sistema de efluxo mais expresso foi o MexAB-OprM (26,4%). Ambos os
estudos avaliaram amostras do mesmo hospital de São Paulo, enquanto este estudo
avaliou, na sua maioria, amostras de outros dois hospitais demonstrando que padrões
de uso de antimicrobianos e políticas de controle de infecção hospitalar podem
influenciar na seleção de cepas com distintos padrões de resistência.
A hiperexpressão da β-lactamase cromossomal AmpC e a redução na
expressão
de oprD representam importantes mecanismos de resistência aos β-
lactâmicos amostras clinicas de P. aeruginosa (Poole, 2004). A contribuição da βlactamase cromossomal AmpC para a resistência aos carbapenens parece ser mínima
(Poole et al., 1996). No entanto, já foram descritas variantes da β-lactamase
86
Discussão
cromossomal AmpC em P. aeruginosa cujo espectro hidrolítico inclui o imipenem,
essas enzimas foram denominadas ESAC. Três variantes, PDC-2, PDC-4 e PDC-8
apresentaram resistência a imipenem e sensibilidade à ceftazidima, no entanto todas
apresentaram resistência ou resistência intermediária à cefepime (Rodriguez-Martinez
et al., 2009a). Neste estudo, a caracterização hidrolítica da β-lactamase cromossomal
AmpC não foi realizada, não podendo assim, ser afirmado se esses isolados
apresentam uma ESAC. O aumento da transcrição do gene ampC associado à
redução da transcrição de oprD parece afetar, principalmente, o imipenem,
apresentando pouco efeito contra o meropenem (Livermore, 1992).
O gene ampC apresenta expressão basal em cepas selvagens de P.
aeruginosa, podendo a sua expressão ser induzida a altos níveis na presença de βlactâmicos indutores, como o imipenem. 40% dos isolados estudados tiveram um
aumento da transcrição desse gene, no entanto se utilizarmos um critério de
expressão quatro vezes maior que à cepa referência PAO1, 88% dos isolados tiveram
um aumento da transcrição desse gene. Isolados de P. aeruginosa que produzem
altos níveis da β-lactamse cromossomal AmpC estão, frequentemente, associados à
falha terapêutica, quando cefalosporinas de amplo espectro são utilizadas (Tam et al.,
2007). A expressão de OprD estava reduzida em todos os isolados e a média da
expressão da OprD foi de 0,2 nos isolados de P. aeruginosa estudados. A redução na
expressão de OprD, configurou-se assim, como o principal mecanismo de resistencia
ao imipenem. Estudos demonstram que a regulação do gene oprD por si só seria
suficiente para elevar as CIMs do imipenem (Livermore, 1992). Assim como, a perda
ou redução da transcrição do gene oprD, associado à hiperexpressão de diferentes
sistemas de efluxo, contribui significamente para o aumento das CIMs dos
carbapenens, especialmente do imipenem (Quale et al., 2006, Zavascki et al., 2010).
Um estudo espanhol avaliou a expressão da β-lactamase cromossomal AmpC,
MexB, MexD, MexF e mexY, e demonstrou que 39% dos isolados hiperexpressavam
pelo menos ums dos mecanismos, sendo a AmpC o mecanismo mais predominante.
87
Discussão
Assim como também, todos os isolados resistentes à imipenem apresentaram
mutações de inativação no gene oprD (Cabot et al., 2011).
As mudanças na expressão da porina da membrana externa OprD é um dos
principais mecanismos de resistência aos carbapenens em isolados de P. aeruginosa
(Yoneyama e Nakae, 1993). A perda da porina OprD têm sido associada, cada vez
mais, a resistência ao imipenem (Livermore, 2001; Tomás et al., 2010; Fournier et al.,
2013). Existem relatos na literatura científica que indicam que existem homólogos da
proteína OprD, o que pode gerar porinas de tamanhos diferenciados (Tamber et al.,
2006; Tamber & Hancock, 2006). Assim, a ausência de proteínas de 45 até 49 kDa
são relatados e relacionados com fenótipos de resistência a imipenem (Nikaido et al.,
1991; Müller-Premru & Lejko-Zupanc, 2002; Li et al., 2012). Todos os isolados de P.
aeruginosa estudados não apresentaram a porina de 46 kDa, mas apresentaram uma
porina de aproximadamente 48 kDa, no gel de SDS-PAGE, fato este que sugere que
nenhum isolado perdeu a OprD. Entretanto, a presença desta banda não garante que
esta seja a OprD, sendo necessários experimentos de Western-blot para a
confirmação dos resultados.
A resistência ao imipenem está associada a alterações na OprD que podem
ser: alterações na transcrição do gene ou em genes reguladores da transcrição,
mutações no gene estrutural e sequencias de inserção (Pirnay et al., 2002; Wolter et
al., 2004b). Cinco isolados de P. aeruginosa apresentaram uma banda de
aproximadamente 2.100 pb, sugerindo a presença de sequencias de inserção no gene
codificador da OprD, como já descrito previamente (Evans & Segal, 2007). Dois
isolados não tiveram amplificação com os oligonucleotideos iniciadores utilizados, fato
este que sugere a presença de sequencias de inserção ou mutações na região de
anelamento. No entanto, não podemos garantir que os isolados que apresentaram
uma banda de 1.400 pb estejam codificando uma proteína funcionalmente ativa.
Em um estudo avaliando seis isolados de P. aeruginosa pan-resistentes foi
constatado a deficiência da OprD, devido a uma supressão parcial do gene oprD,
88
Discussão
mutações pontuais levando a um stop códon prematuro, ou a falta de expressão de
OprD na ausência de mutações do gene (Moyá et al., 2012). No entanto, um estudo
realizado na Espanha demonstrou que a inativação por mutações na OprD em
isolados clínicos de P. aeruginosa não se restringe apenas a isolados resistentes aos
carbapenens, mas também aqueles sensíveis (CIMs para imipenem ou meropenem CIMs 0,06 a 4 µg/ml) (Ocampo-Sosa et al., 2012). No entanto, estudos mais
aprofundados ainda devem ser feitos para a caracterização molecular do gene oprD e
com isso podermos explicar a variabilidade de bandas no gel de SDS-PAGE e nas
bandas obtidas pela amplificação do gene oprD, evidenciando se estes isolados
apresentam a OprD mutada ou expressam outra porina.
O fato dos cinco isolados que apresentaram elevado grau de resistência à
ciprofloxacina, não terem suas CIMs reduzidas para serem categorizadas como
sensíveis à ciprofloxacino na presença de PAβN sugere, que além da influência das
bombas de elfuxo, exista a presença de mutações nas regiões de determinantes de
resistência às quinolonas dos genes gyrA e parC. Mutações nos genes das
topoisomerases II e IV é o principal mecanismo de resistência às fluoroquinolonas em
diversas
espécies
bacterianas.
Outros mecanismos de resistência como
a
hiperexpressão dos sistemas de efluxo ou alterações das proteínas da membrana
externa, podem estar relacionados com a resistência a ciprofloxacino (Nakano, 1997;
Poole, 2000). Um estudo com isolados de P. aeruginosa recuperados de diferentes
sítios corpóreos de pacientes com fibrose cística em um hospital dinamarquês,
demonstrou que a coexpressão dos sistemas CDJ e EFN estava associada a isolados
recuperados de infecções pulmonares, enquanto as mutações nos genes gyrA e parC
foram encontradas em isolados clínicos recuperados do trato urinário e de feridas
(Jalal et al., 2000). No nosso estudo, dos cinco isolados que apresentaram mutações
no QRDR dos genes gyrA e parC, três foram isolados de urina.
O sequenciamento da QRDR do gene gyrA e parC apresentaram uma mutação
no códon 83 e 80 em todos os isolados resistentes a ciprofloxacino, respectivamente.
89
Discussão
Estes resultados são consistentes com aqueles reportados em estudos prévios com
cepas clínicas de P. aeruginosa resistentes a essa classe. No, nosso estudo, como
nos outros o ponto de mutação na posição 83 de gyrA sempre conduz à substituição
de uma treonina para uma isoleucina (Thr83Ile) e na posição 80 de parC leva à
substituição de uma serina para uma leucina (Ser80Leu). Estes resultados reforçam a
hipótese de que estes aminoácidos podem ter um papel importante na formação de
um sítio de ligação da DNA girase com as fluoroquinolonas (Mouneimné, 1999;
Yonezawa, 1995; Akasaka et al., 2001; Oh et al., 2003; Lee et al., 2005b; Hansen,
2006).
Os aminoglicosídeos, geralmente, são utilizados em esquemas terapêuticos
combinados com β-lactâmicos em infecções graves por P. aeruginosa, minimizando
assim, os riscos de falha terapêutica e a seleção de cepas resistentes (Safdar et al.,
2004). No entanto, nos últimos anos a resistência à amicacina e gentamicina vem
aumentando no mundo e no Brasil. As 16S RNA metilases vem sendo cada vez mais
descritas como um importante mecanismo de resistência aos aminoglicosideos em
patógenos Gram negativos, incluindo P. aeruginosa isoladas no Brasil (Doi & Arakawa,
2007; Doi et al., 2007a; Doi et al., 2007b; Castanheira et al., 2008; Lincopan et al.,
2010). No presente estudo, apenas o isolado resistente a ambos os aminoglicosídeos,
carreava o gene rmtD. Este gene foi descrito pela primeira vez em um isolado de P.
aeruginosa produtor de SPM-1 no Brasil (Doi et al., 2007a). Existem diversos relatos
de isolados coprodutores de ESβLs ou MβLs com 16S RNA metilases, contribuindo
assim, para o aparecimento de isolados multirresistentes. Coincidentemente, o isolado
P18, que carregava o gene blaOXA-56 e rmtD apresenta perfil clonal fortemente
relacionado ao clone produtor de SPM-1 disseminado no nosso país desde 2001
(Toleman et al., 2002), mas não apresentava o gene blaSPM-1. Este fato pode indicar
que o clone endêmico pode ter adquirido o gene blaSPM-1, ou que o isolado estudado
perdeu o gene que carreava esta MβL.
90
Discussão
Os resultados encontrados neste estudo sugerem o envolvimento de múltiplos
mecanismos cromossomais no fenótipo incomum de resistência aos carbapenens e
sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro dos isolados clínicos de P.
aeruginosa. Refletindo a complexidade dos mecanismos em sua maioria, intrínsecos e
reforçando a dificuldade da compreensão do papel individual que estes mecanismos
cromossomais de resistência possam estar exercendo em isolados clínicos de P.
aeruginosa. Este fenótipo incomum entre estes isolados clínicos de P. aeruginosa
alerta para uma adaptação à pressão seletiva exercida por antimicrobianos e
desenvolvimento de resistência às drogas. Com isso favorecendo a sobrevivência de
isolados de P. aeruginosa, aumentando, assim, a chance de adquirir outros
determinantes de resistência no ambiente hospitalar e contribuindo para o surgimento
de cepas altamente resistentes a varias classes de antimicrobianos.
Devido à importância crescente de P. aeruginosa como agente de infecções
relacionadas à assistência a saúde e ao surgimento constante de amostras
multirresistentes e com fenótipos incomuns, que tornam, muitas vezes, inviável
qualquer esquema terapêutico antimicrobiano, é de grande relevância a vigilância
constante para detectar precocemente o aparecimento e disseminação destes
isolados.
91
Conclusões
7
CONCLUSÕES
 Todos os isolados clínicos de P. aeruginosa tiveram o fenótipo de resistência a
pelo menos um dos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de amplo
espectro confirmado pelo método de referência.
 A polimixina B foi o antimicrobiano mais ativo frente aos isolados de P.
aeruginosa.
 Uma alta diversidade de padrões de PFGE foi verificada nos isolados clínicos
de P. aeruginosa.
 Todos os isolados apresentaram as β-lactamases cromossomais e intrínsecas
desta espécie, OXA-50 e β-lactamase cromossomal AmpC.
 A produção da OXA-56 foi observada em apenas um isolado clinico de P.
aeruginosa.
 Dentre as bombas de efluxo avaliadas nesse estudo, a hiperexpressão do
sistema MexEF-OprN apresentou maior frequência, seguida pela hiperexpressão
do sistema MexCD-OprJ.
 A hiperexpressão da β-lactamase cromossomal AmpC parece desempenhar
um papel importante na resistência ao imipenem.
 A redução da transcrição do gene oprD foi o mecanismo mais frequente entre
os isolados de P. aeruginosa estudados e pode desempenhar um importante
papel na resistência ao imipenem.
 Nos cinco isolados de P. aeruginosa resistentes à ciprofloxacino, mutações na
QRDR dos genes gyrA e parC foram detectados, parecendo ser o principal
mecanismo de resistência relacionado. No entanto, o envolvimento dos sistemas
de bombas de efluxo também foi evidenciado através da redução das CIMs na
presença de PAβN.
92
Conclusões
 A presença do gene rmtD foi confirmada em um único isolado resistente aos
aminoglicosídeos testados. Este isolado era produtor da OXA-56 e fortemente
relacionado ao clone produtor de SPM-1 disseminado em nosso país.
93
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ABSTRACT
Objective: The aim of this study was to evaluate the resistance mechanisms in clinical
isolates of P. aeruginosa, which showed resistance to carbapenems but susceptibility
to broad spectrum cephalosporins. Methods: A total of 25 isolates of P. aeruginosa
recovered from different sites of infection in three different hospitals in the city of São
Paulo was evaluated. The antimicrobial susceptibility profile was confirmed by broth
microdilution (CLSI, 2012). Genetic relationship was assessed by PFGE technique,
and carbapenem hydrolysis was carried out by spectrophotometer and MALDI-TOF
assays. The presence of β-lactamase-encoding genes was investigated by PCR
followed by DNA sequencing. Derepression of AmpC β-lactamase and efflux pump
overexpression was phenotypically evaluated by inhibition with cloxacillin and PaβN,
respectively. The transcription of genes mexB, mexD, mexF and mexY, AmpC
chromosomal β-lactamase and porin oprD was assessed by qRTPCR. The profile of
outer membrane proteins was performed by SDS-PAGE and PCR technique.The
resistance to aminoglycosides and ciprofloxacin was evaluated by PCR followed by
sequencing. Results: The phenotype of resistance to at least one of the carbapenems
(imipenem and meropenem) and susceptibility to broad spectrum cephalosporin
(cefepime and ceftazidime) was confirmed in all clinical isolates studied. The resistance
to ciprofloxacin, and aminoglycosides was observed in five (20%) and two (8%) of
these isolates, respectively. The isolates were clustered into 17 genotypes without
predominance of a specific pattern. Carbapenem hydrolysis was not detected by
spectrophotometer, however, by MALDI-TOF, four isolates showed equivocal findings
but search for carbapenemases known encoding genes was negative. Chromosomal
blaOXA-50 and blaampC genes were amplified and blaOXA-50 sequencing revealed multiple
mutations. One of these isolates carried blaOXA-56. MICs varied ≥ 2 dilutions of the
antimicrobials for the majority of the isolates tested in the presence of cloxacillin and
PaβN. The average relative expression of genes mexB, mexD, mexF and mexY were
1.92, 2.69, 6.04 and 1.56, respectively. The AmpC β-lactamase was hyperexpressed in
40% of the isolates of P. aeruginosa, while all isolates had a decrease in the OprD
expression. The SDS-PAGE assay suggested a change in the 46 kDa porin in all
clinical isolates studied. Ciprofloxacin-resistant isolates presented QRDR mutations in
gyrA and parC genes and only one isolate resistant to the aminoglycoside carried rmtD
gene. Conclusion: Our results suggest the involvement of multiple chromosomal
mechanisms, overexpression of the AmpC chromosomal β-lactamase and reduced
expression of OprD in the phenotype of resistance to carbapenems and sensitivity to
extended-spectrum cephalosporins among clinical isolates of P. aeruginosa.
127
ANEXOS
Anexo 1. Scores da identificação bacteriana pela técnica de MALDI-TOF MS.
Isolados
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
Score MALDI-TOF MS
2.303
(+++)
2.263
(++)
2.263
(++)
2.411
(+++)
2.047
(++)
2.200
(++)
2.039
(++)
1.982
(+)
1.982
(+)
1.897
(+)
2.129
(++)
2.070
(++)
2.130
(++)
1.736
(+)
2.009
(++)
2.074
(++)
1.896
(+)
2.323
(+++)
1.959
(+)
1.716
(+)
2.189
(++)
2.006
(++)
2.071
(++)
1.838
(+)
2.103
(++)
2.253
(++)
2.218
(++)
2.218
(++)
2.525
(+++)
2.253
(++)
2.133
(++)
1.941
(+)
2.021
(++)
2.021
(++)
2.035
(++)
2.052
(++)
1.954
(+)
2.035
(++)
2.114
(++)
2.048
(++)
2.164
(++)
1.935
(+)
1.957
(+)
1.894
(++)
1.894
(+)
2.348
(+++)
2.005
(++)
2.088
(++)
2.057
(++)
1.932
(+)
Gênero e Espécie
2.428
(+++)
2.182
(++)
2.182
(++)
2.363
(+++)
1.860
(+)
1.968
(+)
2.064
(++)
1.948
(+)
1.948
(+)
1.882
(+)
2.038
(++)
2.036
(++)
2.098
(++)
2.012
(++)
1.943
(+)
2.316
(+++)
2.003
(++)
2.194
(++)
2.186
(+)
2.256
(++)
2.047
(++)
2.306
(+++)
2.207
(++)
1.945
(+)
2.301
(+++)
128
Anexo 2. Expressão relativa dos genes avaliados neste estudo para os 25 isolados clínicos de
P. aeruginosa e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em comparação à cepa referência PA01.
Isolados
Genes
mexB
mexD
mexF
mexY
ampC
oprD
P1
1,55
2,94
5,51
2,63
5,61
0,50
P2
3,24
2,46
6,43
1,61
6,29
0,43
P3
2,09
2,34
4,44
3,20
10,09
0,41
P4
1,48
4,61
9,77
4,50
6,10
0,10
P5
1,29
2,17
7,61
2,17
2,59
0,01
P6
2,10
2,17
5,50
0,49
10,35
0,18
P7
2,46
2,54
5,60
0,43
8,02
0,02
P8
4,61
1,80
3,98
0,12
4,35
0,25
P9
1,41
2,67
8,73
3,54
3,94
0,07
P10
1,29
2,06
5,38
0,13
7,37
0,37
P11
1,23
3,82
6,04
1,16
9,71
0,19
P12
1,09
3,27
7,12
2,61
14,67
0,07
P13
0,64
1,84
10,45
0,20
17,93
0,19
P14
0,86
2,84
7,42
0,55
18,76
0,08
P15
0,73
2,71
5,66
5,12
12,18
0,01
P16
3,16
2,02
3,92
1,13
5,83
0,14
P17
1,41
2,14
4,98
2,33
5,27
0,13
P18
1,33
3,85
4,50
0,24
13,75
0,26
P19
1,28
1,68
3,23
0,36
19,37
0,50
P20
1,30
4,55
9,64
4,38
13,01
0,13
P21
4,57
3,18
6,08
0,32
4,95
0,25
P22
3,40
3,58
3,52
0,27
6,06
0,10
P23
1,11
2,24
7,34
0,37
2,68
0,01
P24
2,66
1,96
4,40
0,95
8,25
0,14
P25
1,70
1,80
3,77
0,15
13,18
0,47
ATCC PSA
1,13
0,38
12,04
0,24
0,51
0,52
PAO1
1
1
1
1
1
1
129
Anexo 3. Curva de amplificação dos isolados de P. aeruginosa, ATCC de P. aeruginosa 27853
e cepa referência PAO1 para os genes mexB, mexD, mexF, mexY, ampC e oprD.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
130
Anexo 4. Curva de melting dos isolados de P. aeruginosa, ATCC de P. aeruginosa 27853 e
cepa referência PAO1 para os genes mexB, mexD, mexF, mexY, ampC e oprD.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
131
Anexo 5. Dendograma dos isolados de P. aeruginosa estudados, relacionados por padrão de PFGE, hospital, fenótipos, PCR e qRT-PCR.
* Espectrof. – Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria; Neg –Negativo; Duv – Duvidoso; AMI – Amicacina; GEN – Gentamicina; CAZ – Ceftazidima; CEP – Cefepima; IMI – Imipenem; MER – Meropenem; CIP – Ciprofloxacino; CLOX – Cloxacilina.
132

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