(Boophilus) microplus - Pós-graduação em Recursos Naturais do

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO
VALE DO SÃO FRANCISCO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
ANNE CAROLINE DOS SANTOS DANTAS
AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA DE PLANTAS DO
BIOMA CAATINGA NO CONTROLE DE CARRAPATOS
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI,1887)
PETROLINA
2014
ANNE CAROLINE DOS SANTOS DANTAS
AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA DE PLANTAS DO
BIOMA CAATINGA NO CONTROLE DE CARRAPATOS
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI,1887)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco –
UNIVASF, Campus Petrolina, como
requisito da obtenção do título de Mestre
em Recursos Naturais do Semiárido.
Orientador: Prof. Dr. Mauricio Claudio
Horta
PETROLINA
2014
Dantas, Anne C. S.
D192a
Avaliação in vitro da eficácia de plantas do bioma Caatinga no controle
de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus Cannestrini,1887) /
Anne Caroline dos Santos Dantas. -- Petrolina, 2014.
100 f.: il. ; 29cm.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Centro, Petrolina
- PE, 2014.
Orientador: Prof. Dr. Mauricio Claudio Horta.
Referência
1. Plantas da Caatinga – extrato. 2. Carrapatos - controle. 3. Boophilus
microplus. 4. Matéria Médica Vegetal. I.Título. II. Horta, Mauricio Claudio.
III. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 615.537
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
Anne Caroline dos Santos Dantas
AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA DE PLANTAS DO BIOMA
CAATINGA NO CONTROLE DE CARRAPATOS Rhipicephalus
(Boophilus) microplus (CANESTRINI,1887)
Dissertação apresentada como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Recursos Naturais do Semiárido, pela
Universidade Federal do Vale do São
Francisco.
Aprovada em: ___ de _______________ de _____.
Banca Examinadora:
__________________________________________
Prof. Dr. Mauricio Claudio Horta
__________________________________________
Profª. Drª. Xirley Nunes Pereira
__________________________________________
Prof. Dr. Luís Antônio Sangioni
À Deus por ter colocado as pessoas certas no meu
caminho.
Aos meus sábios e queridos pais Magnólia Augusta dos
Santos Freitas e Francisco Etizel Alves Dantas
Aos meus irmãos André Luciano Dantas, Ricardo
Alessandro Dantas e Simone Cristine Dantas Campos, pela
paciência e compreensão.
Ao meu companheiro e grande amigo Domingos Ramos
Brandão, que com seu amor me apoiou diariamente,
iluminando toda essa caminhada.
Dedico este trabalho.
Agradecimentos
Ao professor Mauricio Claudio Horta, um grande profissional e amigo, por seu
exemplo, por todos os ensinamentos e oportunidades e principalmente por ter
acreditado em meu trabalho.
Aos professores Dra. Edigênia Cavalcante, Dr. Wagner Félix, Dra. Xirley Nunes, pela
amizade, apoio e valoroso conhecimento que me transmitiram e em especial Dr.
Luciano Ribeiro por ter me prestado indispensável auxílio na análise estatística dos
meus experimentos, pela disposição em ajudar e apoiar meu trabalho desde o
primeiro momento.
Ao Prof. Dr. Jackson Roberto da Silva Guedes Almeida, pela grande dedicação,
presteza e seriedade que me ajudou.
Aos meus colegas de Mestrado, Edemir, Eliatânia, Igor, Leandra, Rafael, Suzana e
em especial Martapoliana, pela amizade, aceitação e parceria nos trabalhos.
Aos alunos e ex-alunos do NEZOON, Davi, Denise, Eline, Grace, Larissa, Maíra,
Thalita, Whitara, e em especial a Dália, pela colaboração e dedicação nos trabalhos
de laboratório e de campo.
Aos alunos do NEPLAME, em especial Graziella, Francisco Junior e Pedro Henrique
pela inestimável ajuda na confecção dos extratos.
Aos técnicos e companheiros de trabalho: Amanda, Ana Paula, Sílvio Alan, Roniere
Alencar e Leonardo Torres, pela ajuda e amizade.
A Sarah Raquel e Alessandra Pacheco, pela ajuda na realização deste trabalho,
pelas maravilhosas palavras de apoio em momentos tão difíceis e por toda
demonstração de carinho e amizade, vocês foram os “anjos” que Deus enviou para
me guiar nessa dura caminhada.
Ao meu amigo e grande amor Domingos Brandão, sem você esse trabalho nem teria
começado, obrigado pela determinação em procurar os professores, por lutar pelo
meu mestrado como se fosse seu. Pelas palavras de incentivo e apoio e
principalmente por toda a compreensão. Obrigada também por dedicar vários fins de
semanas e feriados, para ajudar na contenção das vacas e nos experimentos, para
você minha eterna gratidão.
A minha sobrinha Bruna Carolina, pelos fins de semanas que me ajudou a lavar as
vidrarias, os meus dias foram mais alegres com a sua presença.
A minha amiga do mestrado e companheira de viagens, Larissa Macêdo, que
possamos continuar vários anos procurando juntas à “cura”. Você foi a surpresa
doce e maravilhosa desse período de tantos conhecimentos.
Aos meus amigos Ana Lucila, Indira Brito, Juçara dos Santos, Mércia Fabiana,
Rafaella Cerqueira, Rafael de França que mesmo distantes, se fizeram presentes
durante todo esse processo, desde a minha aprovação até o momento da minha
defesa, me incentivando e torcendo por mim, o meu sincero obrigado!
Aos funcionários, Seu João e Seu Tonho e em especial ao Seu Reginaldo, por não
medir esforços e estar sempre disponível, mesmo nos domingos e feriados, para a
árdua tarefa de conter os animais.
A terceira das trigêmeas, Andryelly, pela presença, principalmente paciência (muita
paciência), por modificar a sua rotina em prol do meu trabalho, por me permitir dividir
os seus momentos e principalmente por me fazer lembrar que pessoas iluminadas
existem.
E em especial, a minha grande amiga e aluna do mestrado de Ciências Veterinárias,
Andreina, pela ajuda fundamental, incondicional (dia, noite, finais de semana e
feriados) e, acima de tudo, por me ajudar a ter forças e continuar em frente, levarei
você para sempre no meu coração, obrigada pela sua amizade.
E a todos que me apoiaram, estiveram ao meu lado nas minhas conquistas e
derrotas e que não foi possível mencionar devido ao espaço restrito.
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o
melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus,
não sou o que era antes”. (Martin Luther King)
RESUMO
O controle do carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é feito quase
que exclusivamente com produtos químicos. Esses produtos e seus resíduos podem
trazer sérios problemas à saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. Além
disso, existem relatos de resistência dos carrapatos a quase todos os produtos
químicos comercializados. As pesquisas no âmbito da fitoterapia vêm buscando a
possibilidade de descoberta de novos produtos para o controle do parasitismo,
representando fundamental importância na legitimação de extratos vegetais. O
objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade acaricida in vitro de extratos de plantas
do bioma Caatinga no controle de R. B. microplus. Os extratos de Amburana
cearensis, Morus nigra, Neoglaziovia variegata e Selaginella convoluta; e frações (5,
10 e 25 mg/mL), tiveram o perfil fitoquímico realizado por cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAD) e foram submetidos ao teste de imersão de adultos, para
verificação da porcentagem de eclosão dos ovos, inibição da oviposição, índice de
reprodução estimada e a eficácia dos extratos. Das quatro plantas avaliadas, as
cascas de A. cearensis e as folhas de N. variegata apresentaram as melhores
eficácias na fase hexânica (2,5%), obtendo 66,8% e 99,8%, respectivamente. M.
nigra obteve o melhor resultado na fase clorofórmica (2,5%), com 65,4% e o extrato
etanólico bruto de S. convoluta apresentou eficácia de 54,6%. Embora nem todas as
plantas tenham apresentado uma eficácia satisfatória, os resultados encontrados
podem sugerir um efeito auxiliar no controle de carrapatos. Novos estudos devem
ser realizados, a fim de detectar os componentes dessas plantas que possuem
atividade acaricida.
Palavras-chaves: Biocarrapaticidograma; Plantas; R. (B.) microplus
ABSTRACT
The control of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is done almost
exclusively with chemicals products and their residues, which can cause serious
health problems for humans, animals and the environment. In addition, there are
reports of resistance of ticks to almost all chemicals products. Researches in this
area have seeking the possibility of discover new products for the control of
parasitism, representing fundamental importance in legitimizing plant extracts. The
aim of this study was to evaluate the acaricidal activity in vitro of plant extracts from
the Caatinga biome in the control of R. B. microplus. The extracts of Amburana
cearensis, Morus nigra, Neoglaziovia variegata and Selaginella convoluta; and
fractions (5,10 e 25 mg/mL), had the phytochemical profile realized for high
performaced liquid chromatography (HPLC) and were tested in females by adult
immersion test for evaluation of hatching eggs percentage, oviposition inhibition,
estimated reproduction and efficacy of the extracts. The barks of A. cearensis and
leaves of N. variegata showed the best efficiencies in the hexane fraction (2.5%),
with 66.8% and 99.8%, respectively. M. nigra had the best result in the chloroform
phase (2.5%), with 65.4%; and the crude ethanol extract of S. convoluta showed
54.6% of efficacy. Although the great number of extracts have not showed
satisfactory efficacy, the results can be suggested an auxiliary effect of control of
ticks. New studies must be performed, to detect the components of these plants have
acaricidal activity.
Key words: adult immersion test; plants; R. (B.) microplus
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Amburana cearensis
35
Figura 2
Morus nigra
36
Figura 3
Neoglaziovia variegata
37
Figura 4
Selaginella convoluta
38
Figura 5
Cromatograma do extrato etanólico de Amburana cearensis
52
Figura 6
Cromatograma do extrato etanólico de obtido Morus nigra
53
Figura 7
Cromatograma do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata
54
Figura 8
Cromatograma do extrato etanólico de Selaginella convoluta
55
Figura 9
Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a ovipostura
do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL.
Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a eclosão dos
ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10
e 25 mg/mL
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Eficácia do extrato das folhas de A. cearensis no controle do
carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL
Efeito do extrato de M. nigra sobre a ovipostura do carrapato R.
(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL
Efeito do extrato das folhas de M.nigra sobre a eclosão dos ovos
do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL
Eficácia do extrato das folhas de M. nigra no controle do
mg/mL
Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a ovipostura do
carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL
Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a eclosão dos
56
57
59
60
61
63
64
e 25 mg/mL
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Eficácia do extrato das folhas de N. variegata no controle do
mg/mL
Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a
ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de
5, 10 e 25 mg/mL
eclosão dos ovos do carrapato R.(B.) microplus, nas
concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL
Eficácia do extrato das partes aéreas de N. variegata no controle
do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL
Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a ovipostura do
carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL
Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a eclosão dos
e 25 mg/mL
Eficácia do extrato das folhas de S. convoluta no controle do
mg/mL
65
67
68
69
71
72
73
75
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais metabólitos secundários dos extratos das 4 espécies
da caatinga por cromatografia em camada delgada
43
Tabela 2
Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das cascas 48
de Amburana cearensis
Tabela 3
Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Morus 49
nigra
Tabela 4
Caracterização fitoquímica
de
50
Tabela 5
Caracterização fitoquímica dos extratos das partes aéreas de
51
Tabela 6
Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Selaginella
convoluta
51
Tabela 7
Efeito do extrato das cascas de Amburana cearensis sobre a
reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus
58
Tabela 8
Efeito do extrato das folhas de M. nigra sobre a reprodução
estimada do carrapato R. (B.) microplus
62
Tabela 9
Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a reprodução
66
dos
extratos
das
folhas
Tabela 10
reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus
70
Tabela 11
Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a reprodução
74
Tabela 12
Eficácia comparativa entre as espécies A. cearensis, M. nigra, N.
variegata, e S. convoluta
76
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcOEt
Acetato de etila
ANOVA
Análise de variância
BOD
Demanda Bioquímica de Oxigênio
CHCl3
Clorofórmio
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-DAD
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de
Arranjo de Diodo
CRAD
Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas da
Caatinga
DAD
Detector de Arranjo de Diodo
EEB
Extrato Etanólico Bruto
EtOH
Etanol
H2SO4
Ácido Sulfúrico
H3PO4
Ácido Fosfórico
HVASF
Herbário Vale do São Francisco
IUCN
Conservação da Natureza dos Recursos Naturais
KI- HCI
Ácido clorídrico com iodeto de potássio
KOH
Hidróxido de Potássio
MEOH
Metanol
NCBI
National Center for Biotechnology Information Taxonomy
Ac- EEB
Extrato etanólico bruto de Amburana cearensis
Ac- AcOEt
Fase acetato de Amburana cearensis
Ac- CHCl3
Fase clorofórmica de Amburana cearensis
Ac- Hex
Fase hexânica de Amburana cearensis
Mn- EEB
Extrato etanólico bruto de Morus nigra
Mn- AcOEt
Fase acetato de Morus nigra
Mn- CHCl3
Fase clorofórmica de Morus nigra
Mn- HEX
Fase hexânica de Morus nigra
Nv-AcOEt
Fase acetato de Neoglaziovia variegata
Nv- Hex
Fase hexânica de Neoglaziovia variegata
Nv-CHCl3
Fase clorofórmica de Neoglaziovia variegata
Nv-EEB
Fase etanólica de Neoglaziovia variegata
Sc- EEB
Extrato etanólico bruto de Selaginella convoluta
Sc- AcOEt
Fase acetato de Selaginella convoluta
Sc- CHCl3
Fase clorofórmica de Selaginella convoluta
Sc- HEX
Fase hexânico de Selaginella convoluta
UEFS
Universidade Estadual de Feira de Santana
UNIVASF
Universidade Federal do Vale do São Francisco
UV
Ultra Violeta
UV-Vis
Ultra Violeta visível
LISTA DE SÍMBOLOS
ºC
Graus Celsius
cm
Centímetros
%
Por cento
Kg
Quilograma
US$
Dólar dos Estados Unidos
‘
Minutos
S
Sul
Km2
Quilômetros quadrados
m
Metros
g
Gramas
mm
Milímetros
mL
Mililitro
µL
Microlitro
nm
Nanômetro
=
Igual
x
Vezes
±
Mais ou menos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................
19
2. OBJETIVOS ...........................................................................................
2.1 Objetivo geral .....................................................................................
2.2 Objetivos específicos ........................................................................
22
23
23
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................
3.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus ..............................................
3.1.1 Organização taxonômica ...................................................................
3.1.2 Distribuição geográfica ......................................................................
3.1.3 Ciclo evolutivo ...................................................................................
3.1.4 Mecanismo de sobrevivência dos carrapatos ao clima árido e
semiárido ....................................................................................................
3.1.5 Prejuízos atribuídos ao carrapato .....................................................
3.1.6 Resistência aos carrapaticidas ..........................................................
3.1.7 Plantas com atividade carrapaticida ..................................................
3.2 Bioma Caatinga ..................................................................................
3.2.1 Amburana cearensis .........................................................................
3.2.2 Morus nigra .......................................................................................
3.2.3 Neoglaziovia variegata ......................................................................
3.2.4 Selaginella convoluta ........................................................................
24
25
25
26
27
4. MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................
4.1 Material vegetal ..................................................................................
4.1.2 Morus nigra .......................................................................................
4.2 Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) e das frações das
espécies selecionadas .............................................................................
4.3 Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos ......
4.4 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ..........
4.5 Colônia de carrapatos ........................................................................
4.6 Teste de imersão de fêmeas ingurgitadas .......................................
4.6.1 Parâmetros analisados ......................................................................
4.7 Análise estatística ..............................................................................
40
41
41
41
41
41
5. RESULTADOS .......................................................................................
5.1 Triagem fitoquímica ...........................................................................
5.1.2 Morus nigra .......................................................................................
5.1.3.1 Folhas .............................................................................................
5.1.3.2 Partes aéreas .................................................................................
47
48
48
48
49
49
50
29
30
30
32
33
34
35
36
37
42
42
44
44
45
45
46
5.1.4 Selaginella convoluta .................
5.2 Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada a detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD) .........................
5.2.1 Análise em CLAE do extrato etanólico de Amburana cearensis .......
5.2.2 Análise em CLAE do extrato etanólico de Morus nigra .....................
5.2.3 Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata ...
5.2.4 Análise em CLAE do extrato etanólico de Selaginella convoluta ......
5.3 Teste de imersão ................................................................................
5.3.1.1 Inibição da oviposição (IO) .............................................................
5.3.1.2 Porcentagem de eclosão (%E) .......................................................
5.3.1.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER).............................................
5.3.1.4 Eficácia (EF) ...................................................................................
5.3.2 Morus nigra .......................................................................................
5.3.2.1 Inibição da oviposição (IO) ............................................................
5.3.2.2 Porcentagem de eclosão (%E) ......................................................
5.3.2.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) ............................................
5.3.2.4 Eficácia (EF) ...................................................................................
5.3.3.1 Folhas .............................................................................................
5.3.3.1.1 Inibição da oviposição (IO) ..........................................................
5.3.3.1.2 Porcentagem de eclosão (%E) ....................................................
5.3.3.1.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) .........................................
5.3.3.1.4 Eficácia (EF) ...............................................................................
5.3.3.2 Partes aéreas .................................................................................
5.3.3.2.1 Inibição da oviposição (IO) ..........................................................
5.3.3.2.2 Porcentagem de eclosão (%E) ....................................................
5.3.3.2.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) .........................................
5.3.3.2.4 Eficácia (EF) ................................................................................
5.3.4.1 Inibição da oviposição (IO) .............................................................
5.3.4.2 Porcentagem de eclosão (%E) .......................................................
5.3.4.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) ............................................
5.3.4.4 Eficácia (EF) ..................................................................................
5.3.5 Eficácia comparativa das plantas testadas .......................................
51
6. DISCUSSÃO ..........................................................................................
77
7. CONCLUSÕES ......................................................................................
84
8. REFERÊNCIAS ......................................................................................
86
ANEXOS ....................................................................................................
98
52
52
53
54
55
56
56
56
57
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66
67
67
68
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70
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71
72
73
74
76
1. INTRODUÇÃO
DANTAS, A.C.S. Avaliação in vitro da eficácia do extrato de plantas do bioma caatinga no controle de carrapatos
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887).
1. INTRODUÇÃO
O aumento da demanda mundial por proteínas de origem animal tem levado a
bovinocultura a usufruir de tecnologias que visem aumentar a produção em menor
tempo e espaço. Essas técnicas têm proporcionado grande desequilíbrio na interação
parasito-hospedeiro, levando a prejuízos cada vez maiores causados por parasitos,
como os carrapatos (LABRUNA; LEITE; OLIVEIRA, 1999).
Conhecido popularmente como o “carrapato do boi”, Rhipicephalus (Boophilus)
microplus, além de ser um dos mais importantes transmissores de patógenos para o
gado (DE CASTRO, 1997) é o responsável por grandes prejuízos ao setor
agropecuário (GEORGE; DAVEY; POUND, 2002).
O controle do carrapato bovino é geralmente efetuado por meio de produtos
químicos sintéticos convencionais, que acarretam problemas como o desenvolvimento
acelerado da resistência ao princípio ativo (LEAL; FREITAS; VAZ JÚNIOR, 2003).
Uma vez instaurada a resistência, o produtor frequentemente aumenta a dose do
pesticida ou a frequência das aplicações (THULLNER, 1997). O uso intensivo desses
produtos químicos tem levado a contaminação do meio ambiente, a exposição do
trabalhador rural e a presença de resíduos químicos no leite e na carne, o que tem
provocado grande preocupação na sociedade e órgãos governamentais (LEAL;
FREITAS; VAZ JÚNIOR, 2003).
Devido às inúmeras dificuldades no controle e combate desse artrópode, a
utilização de plantas medicinais é uma alternativa cada vez mais viável em países em
desenvolvimento como o Brasil, devido principalmente a grande variabilidade de
espécies existentes, baixo custo, fácil disponibilidade, rápida degradação quando
comparado aos produtos químicos e consequentemente diminuindo a contaminação
do ambiente, dos animais e dos homens (AGNOLIN, 2009), sendo esses os principais
motivos para o estudo de plantas que possuam real efeito acaricida (SOARES, 2003).
A Caatinga é o único bioma brasileiro cujos limites estão inteiramente restritos
ao território nacional, e é proporcionalmente o menos estudado entre as regiões
naturais brasileiras, com grande parte do esforço científico estando concentrado em
alguns poucos pontos em torno das principais cidades da região. Além disso, a
Caatinga é a vegetação brasileira menos protegida, pois as Unidades de
20
Conservação cobrem menos de 2% do seu território, como consequência, esse bioma
continua passando por um extenso processo de alteração e deterioração ambiental
provocado pelo uso insustentável dos seus recursos naturais, o que está levando a
rápida perda de espécies únicas, à eliminação de processos ecológicos chaves e a
formação de extensos núcleos de desertificação em vários setores da região (LEAL;
TABARELLI; SILVA, 2003).
Em virtude da pouca quantidade de espécies estudadas na Caatinga, a análise
fitoquímica de suas plantas é de grande importância e o estudo da atividade
carrapaticida desses extratos vegetais, poderá proporcionar o desenvolvimento de
métodos viáveis para reduzir a contaminação química na pecuária e minimizar um dos
grandes problemas enfrentados pelos pecuaristas: o aumento da resistência de R.
(B). microplus aos acaricidas sintéticos.
21
2. OBJETIVOS
22
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Este trabalho tem como objetivo avaliar a eficácia de plantas do Bioma
Caatinga, quanto à sua ação contra o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
2.2. Específicos
• Elaborar extratos para serem utilizados nos experimentos;
• Realizar triagem fitoquímica dos extratos vegetais, para a identificação das principais
classes de constituintes químicos;
• Detectar compostos presentes nos extratos de Amburana cearensis, Morus nigra,
Neoglaziovia variegata e Selaginella convoluta por cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC);
• Colher carrapatos em fase de parasitismo para a obtenção de uma colônia em
laboratório;
• Avaliar através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas se os extratos ou suas
frações causaram mortalidade ou interferiram em alguma fase de reprodução do R.
(B.) microplus;
• Realizar um estudo comparativo com os resultados das plantas avaliadas.
23
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
24
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. Rhipicephalus (Boophilus) microplus
3.1.1. Organização taxonômica
O carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887) foi reclassificado como
pertencente ao gênero Rhipicephalus, subgênero Boophilus, com base em análises
moleculares (MURREL; BARKER, 2003). No entanto, apesar de filogeneticamente
próximos, Caeiro (2006) faz uma reflexão sobre a sistemática do gênero
Rhipicephalus (Koch, 1844) e Boophilus (Curtice, 1891) e considera que suas
características morfológicas e biológicas distintas não permitem que o segundo seja
considerado um subgênero do primeiro. Apesar da opinião controvérsia, neste
trabalho será utilizada a nomenclatura dada por Murrell e Barker (2003):
Segundo o National Center for Biotechnology Information Taxonomy (NCBI)
(2011), a classificação deste carrapato é:
Filo: Arthropoda (Von Siebold e Slannius, 1845)
Subfilo: Chelicerata (Heymons, 1901)
Classe: Arachnida (Lamarck, 1802)
Subclasse: Acari (Leach, 1817)
Superordem: Parasitiformes (Renter, 1909)
Ordem: Ixodida (Leach, 1815)
Subordem: Metastigmata (Canestrini, 1891)
Superfamília: Ixodoidea (Murray, 1870)
Subfamília: Rhipicephalinae
Gênero: Rhipicephalus (Koch, 1844)
Subgênero: Boophilus (Curtice, 1891)
Espécie: Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887).
25
Existem cerca de 870 espécies de carrapatos descritas no mundo, todas
agrupadas na subordem Ixodida (Metastigmata), que se divide em três famílias.
A família Ixodidae abrange os carrapatos popularmente conhecidos como
“carrapatos duros”, com 685 espécies descritas; a família Argasidae inclui os
“carrapatos moles”, com 185 espécies; e a família Nuttalliellidae, com características
morfológicas intermediárias entre as duas primeiras, é representada por uma única
espécie, Nuttalliella namaqua (BEDFORD, 1931).
3.1.2. Distribuição geográfica
A espécie R. (B.) microplus, que seria originária da Ásia, foi introduzida na
maioria dos países tropicais e subtropicais, seguindo a migração do gado zebuíno
(LEAL; FREITAS; VAZ JÚNIOR, 2003) e distribui-se geograficamente por locais de
clima quente e úmido, condições que favorecem o desenvolvimento do seu ciclo de
vida (HOOGSTRAAL; WASSEF, 1985). Na região Neotropical, com exceção do Chile,
essa espécie está distribuída desde o norte da Argentina até o México, incluindo as
ilhas do Caribe e Antilhas. As áreas de distribuição geográfica ainda incluem a região
sul e ocidental da África, Madagascar, Índia, China, Coréia, Bornéu, Sumatra,
Filipinas, Japão, Nova Guiné, Ilha de Guam e região norte da Austrália (PEREIRA et
al., 2008). Populações estabelecidas de R. (B.) microplus foram relatadas pela
primeira vez na Costa do Marfim, África Ocidental (MADDER et al., 2007).
No Brasil, o carrapato bovino encontra condições climáticas favoráveis ao seu
desenvolvimento em regiões que vão do extremo Sul em direção ao Norte e Nordeste,
possibilitando-lhe completar de 2,5 a 3 ou de 3 a 4, e potencialmente até 5 gerações
por ano em regiões que apresentem temperaturas médias acima de 17ºC (VIDOTTO,
2002). Apesar da influência negativa do inverno, a região Sul é a mais afetada pela
ocorrência
de
carrapato
nos
bovinos.
Dois
fatores
parecem
contribuir
significantemente para isso: a predominância de animais de origem européia e a
maior densidade populacional de bovinos (HORN, 1983).
26
3.1.3.Ciclo evolutivo
R. (B.) microplus é uma espécie de carrapato que utiliza um único hospedeiro
no seu ciclo evolutivo (monoxênico), que pode ser dividido em dois tempos, ou fases
complementares: fase parasitária e fase não parasitária.
A fase parasitária pode ser sumariamente delimitada como tendo início com a
fixação das larvas em hospedeiro suscetível e término quando os adultos, incluídas as
fêmeas fecundadas e ingurgitadas, caem desse hospedeiro.
A fase não parasitária, inicia com a fêmea fecundada e ingurgitada, depois que
ela se desprende do hospedeiro, caindo no chão para realizar a oviposição e termina
em uma de quatro alternativas: 1) produz ovos inférteis; 2) quando a fêmea morre
sem realizar a oviposição; 3) quando as larvas oriundas de ovos dessa fêmea
ganham acesso ao hospedeiro suscetível 4) ou suas larvas morrem sem alcançar
hospedeiro adequado.
Assim, o início e o término do ciclo realizam-se quase sempre no pasto, onde
geralmente se integram o parasito, o hospedeiro e o ambiente comum a ambos
(PEREIRA et al., 2008).
O ciclo evolutivo inicia com a cópula. O macho é pequeno, e se coloca sob a
fêmea partenógina que está fixada na pele do bovino. Este utiliza o hipóstomo (rostro)
e introduz um espermatóforo no orifício genital. A fêmea adulta, uma vez fecundada,
se desprende do bovino e cai no pasto, onde inicia a postura no terceiro dia, com
duração de aproximadamente 12 dias. Em condições adversas, como baixa
temperatura, a teleógina, embora não faça a postura, não morre, aguardando
condições favoráveis para reiniciar o processo. Dessa forma, o período de postura
pode se prolongar de vários dias, até meses, dependendo das condições climáticas
(GONZALES, 1975).
Cada fêmea põe de 2000 a 3000 ovos, de acordo com o tamanho de seu corpo
ingurgitado. A incubação dos ovos demanda calor e umidade. No verão, sob
condições ambientais normais, a incubação dura cerca de 30 dias e no inverno, até
83 dias. A larva recém - nascida necessita de três a quatro dias para que se formem
os órgãos bucais e, a seguir, procura se fixar no couro dos bovinos. Normalmente são
muito vivazes, e estimuladas pelo calor úmido (verão e sereno), sobem rapidamente
27
nas folhas e hastes do pasto, aguardando a passagem de um hospedeiro. Fixam-se
de preferência, onde a pele é mais fina: axilas, entre as pernas, região genital, sob a
cauda, na bolsa escrotal e outras partes. As ninfas aparecem mediante mudança de
pele que se processa depois de 10 a 12 dias da fixação da larva no hospedeiro. As
larvas e ninfas possuem três e quatro respectivamente e ainda são assexuadas. Após
o décimo quinto dia da infestação, aparecem as metaninfas, que produzirão
indivíduos sexuados, machos e fêmeas. Os machos são pequenos, possuem o corpo
oval quase inteiramente coberto pelo escudo dorsal e um pequeno apêndice caudal.
As fêmeas quando jovens não diferem dos machos. Quando adultas vão tomando
uma cor amarela-palha ou verde oliva e, crescem rapidamente alcançando 1 cm de
comprimento (PEREIRA et al., 2008).
Enquanto a fase parasitária evolui sem interferências climáticas, sendo
praticamente a mesma nas diversas regiões e países, a fase de vida livre é sensível a
estas, havendo alterações nos seus períodos, afetados especialmente pela
temperatura e umidade relativa do ar. Temperaturas menores que 5ºC não permitem
que se realize a oviposição e, umidade relativa do ar menor que 70% impossibilitam a
eclosão dos ovos (GONZALES, 1975). As diversas pesquisas feitas sobre a fase de
vida livre desse parasito mostram uma grande variabilidade entre os períodos de prépostura, postura, eclosão, neolarva e longevidade das larvas infestantes, sendo que
essa variabilidade acontece em decorrência das condições climáticas locais, incluindo
macro e microclimas (SOUZA, 1985).
A compreensão do ecossistema do carrapato é fundamental para que se
estabeleçam medidas efetivas de controle, que visem evitar a superpopulação desses
parasitos. Para Gonzales (1975), a resistência nada mais é do que a manifestação do
desequilíbrio ecológico. A situação crítica é notada de um momento para o outro, mas
o processo do desequilíbrio ecológico é bem anterior e passou despercebido. Um dos
fatores que contribuiu para esse quadro foi a concentração dos animais em áreas
cada vez menores, pela pressão de se produzir mais alimentos. Quando as áreas de
criação concentravam um menor número de animais, a maioria das larvas não
encontrava o hospedeiro e, consequentemente morriam por falta de alimento, ao
contrário do que se observa hoje, onde as larvas não sucumbem, pois há hospedeiros
por toda a parte.
28
3.1.4. Mecanismo de sobrevivência dos carrapatos ao clima árido e semiárido
Segundo Londt (1975), o sucesso do desenvolvimento embrionário é
indiretamente dependente das condições prevalentes de umidade relativa e
diretamente dependente do conteúdo de água dos ovos por ocasião da postura.
Quando esses ovos perdem mais de 35% de sua massa inicial por meio da
evaporação, o metabolismo nitrogenado, indicado pela produção de guanina, é
seriamente afetado, acarretando a morte do embrião. O autor observou que a
produção de guanina diminuiu ou cessou completamente quando os ovos foram
submetidos à umidade relativa inferior a 70-80%.
Ao contrário das larvas (LONDT; WHITEHEAD, 1972) ou dos adultos (SAUER;
HAIR, 1971), os ovos não absorvem água mesmo quando submetidos à umidade
relativa de 95% (RECHAV; MALTZAHN, 1977). Segundo estes últimos autores, a
existência de carrapatos em regiões áridas ou semiáridas depende da capacidade
dos ovos desses carrapatos reterem água em quantidade suficiente para que se
estabeleça o desenvolvimento embrionário. Afirmam que a umidade relativa crítica
para cada espécie de carrapato é provavelmente uma função da qualidade da
camada de cera que envolve os ovos, isto é, características endógenas do carrapato
que impedem ou diminuem a taxa de perda de água dos ovos.
Lees e Beament (1948), ao estudarem a função do órgão de Gene e da cera
protetora produzida por ele, concluem que essa cera é responsável pela
impermeabilidade conferida à cutícula ou casca do ovo. Quando os ovos são
submetidos a determinadas temperaturas críticas, a cera sofre reorganização
molecular, permitindo evaporação mais rápida da água. Segundo Legg (1930), se os
ovos forem submetidos a fortes correntes líquidas, a proteção impermeabilizante pode
ser retirada, com conseqüente absorção de água. Durante o desenvolvimento
embrionário, o aparelho excretor, representado pelo saco renal e os túbulos de
Malpighi, fica repleto de resíduos provenientes do crescimento embrionário, que
consiste principalmente de cristais de ácido úrico, os quais são expelidos após a
emergência larval sob a forma de pequenas gotas esbranquiçadas.
A resistência dos ovos à perda de água talvez dependa da sua capacidade de
impedir a evaporação através da superfície, ficando ressaltada a importância, no
29
desenvolvimento embrionário, das condições microclimáticas e do efeito da camada
protetora de cera que os envolve (LONDT, 1975).
3.1.5. Prejuízos atribuídos ao carrapato
Os carrapatos são ectoparasitos importantes para a Saúde Pública e sanidade
animal por transmitirem agentes infecciosos e causarem injúrias a seus hospedeiros
durante a hematofagia (PEREIRA et al., 2008). Entre essas injúrias, destaca-se a
espoliação sanguínea, com reflexos diretos nos animais relacionadas ao ganho de
peso e produção leiteira, que variam de acordo com a carga parasitária Pode ocorrer,
também, a inoculação de toxinas na corrente circulatória do hospedeiro, que
interferem na síntese protéica, resultando numa desproporção proteína-gordura, com
prevalência desta última. A transmissão de agentes infecciosos como bactérias do
gênero Anaplasma e protozoários do gênero Babesia, são responsáveis pela doença
comumente chamada de Tristeza Parasitária Bovina. Essa doença se manifesta
clinicamente por febre, anemia, hemoglobinúria, icterícia, anorexia, emagrecimento, e,
nos casos de bovinos sensíveis, até a mortalidade (KESSLER; SCHENK, 1998).
Ao realizar uma pesquisa no Brasil, Horn (1983), com base em informações
colhidas junto às Secretarias de Agricultura dos Estados, estimou que os prejuízos
causados pelo carrapato R. (B.) microplus aos bovinos, considerando aspectos
relacionados à mortalidade (1,2%), diminuição do ganho de peso (6kg /animal/ ano),
efeitos sobre o couro, gastos com carrapaticidas, diminuição na produção de leite (1,5
bilhão de litros), chegavam a US$ 968 milhões. Em função do crescimento do
rebanho bovino de 76 milhões de cabeças em 1983, para 204 milhões em 2004,
essas perdas facilmente ultrapassam os dois bilhões de dólares (PEREIRA et al.,
2008).
3.1.6. Resistência aos carrapaticidas
Com aproximadamente 400 milhões de anos, os artrópodes são organismos
bem mais antigos que o homem, genotipicamente estão totalmente evoluídos, sendo
considerados de grande longevidade (BORDIN, 1998). Sua aptidão e resistência
30
permitiram sua sobrevivência, encaixado-os devidamente no paradigma darwianiano
de mutação-evolução e, por conseguinte, com adaptação à sobrevivência do mais
forte. Segundo esse autor, apesar das inúmeras pesquisas relacionadas à biologia,
ecologia e epidemiologia do carrapato, e ao diversificado arsenal da indústria químicofarmacêutica, ainda é muito difícil manter esse parasitismo compatível com a
produção de medicamentos. Essa situação deve-se provavelmente à mutabilidade
potencial do parasito, ao grau variável de desafio relacionado com a variabilidade
epidemiológica entre períodos favoráveis e adversos, habilidade bioquímica da
espécie, inadequação de algumas práticas terapêuticas, dosagens errôneas e outros
fatores.
Outro mecanismo de resistência é a propagação do alelo resistente, por
pressão de seleção, isto acontece quando a resistência está instalada em uma
população de carrapatos até mesmo antes de entrarem em contato com determinado
produto. Isso ocorre porque já existiam, na população, alguns indivíduos naturalmente
resistentes. A predominância do alelo resistente ou aparecimento da resistência é o
momento em que a maior parte da população descende de carrapatos resistentes,
carregando, em maior ou menor porcentagem, os genes responsáveis pela alteração
de comportamento, capaz de fazê-los sobreviver ao veneno (FURLONG; MARTINS,
2000). Os mesmos autores relatam que os principais mecanismos utilizados pelos
carrapatos resistentes para sobreviver aos acaricidas são: a redução da taxa de
penetração do produto, alterando o tegumento externo; as mudanças no metabolismo,
armazenamento e excreção do produto químico e, mudanças no local de ação do
produto.
A eficiência dos carrapaticidas, em sua grande maioria, também deixa a
desejar, permitindo que os carrapatos em contato com eles sobrevivam e dessa forma
ativem seu sistema enzimático de defesa, transmitindo às gerações seguintes todos
os caracteres de resistência adquiridos (GONZALES, 1975).
Em 1930, foram identificados os primeiros casos de resistência ao carrapato
Boophilus microplus. Desde então, diversos princípios ativos carrapaticidas têm sido
testados e utilizados comercialmente, tendo sido observado um aumento da
resistência a esses produtos (OLIVEIRA et al., 2002).
31
3.1.7. Plantas com atividade carrapaticida
O metabolismo secundário das plantas possui grande diversidade de
compostos com ação pesticida que podem ser explorados através dos extratos
vegetais. Os biopesticidas normalmente apresentam baixo custo, podem diminuir o
impacto ambiental e são de pequena toxicidade ao homem e a organismo não alvo
(MOREIRA et al., 2007; BAGAVAN et al., 2009). O metabolismo secundário de
plantas pode variar consideravelmente dependendo de vários fatores, como:
sazonalidade, índice pluviométrico, radiação UV, composição atmosférica (CO2, SO2,
NO2 e O2), herbivoria e ataque de patógenos, temperatura, ritmo circadiano, etc.
Estes fatores provocam variações fisiológicas no desenvolvimento dos órgãos,
alterações morfológicas nas flores e folhas e modificações nas estruturas secretoras
(SEPÚLVEDA-JIMENEZ et al., 2003; FIGUEIREDO et al., 2008). Métodos mais
apurados de pesquisa, de separação e quantificação de princípios ativos estão
conseguindo encontrar e medir com sucesso essas substâncias presentes em plantas
(Taylor et al., 2001). As espécies botânicas mais usadas como plantas pesticidas
pertencem às famílias Meliaceae, Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae, Lamiaceae e
Canellaceae (JACOBSON, 1989). Atualmente, com relação à atividade carrapaticida,
várias espécies estão sendo pesquisadas, tais como: Azadirachta indica (MARTINEZ,
2002); Cymbopogon nardu (OLIVO et al., 2008), Lavandura angustifoli (PIRALIKHEIRABADI; SILVA, 2010), Tetradernia riparia (GAZIM et al., 2011), Nicotiana
tabacum (RODRIGUEZ; RODRIGUEZ; CRUZ, 2010) entre outras. Assim estas
plantas poderão ser utilizadas posteriormente em programas de controle, na tentativa
de reduzir a utilização de carrapaticidas organossintéticos. A toxicidade de uma planta
contra artrópodes não a qualifica necessariamente como um pesticida. Vários
aspectos devem ser levados em consideração, tais como: forma de extração, eficácia
em baixas concentrações, ausência de toxicidade para mamíferos e animais
superiores, (VIEGAS JUNIOR, 2003).
32
3.2. Bioma Caatinga
A província das caatingas no nordeste do Brasil estende-se de 2 54’ a 17 21’ S
(estimada em cerca de 800.000 km2) e inclui os estados do Ceará, Rio Grande do
Norte, a maior parte da Paraíba e Pernambuco, sudeste do Piauí, oeste de Alagoas e
Sergipe, região norte e central da Bahia e uma faixa estendendo-se em Minas Gerais
seguindo o Rio São Francisco, juntamente com um enclave no vale seco da região
média do Rio Jequitinhonha (ANDRADE-LIMA, 1981). O nome “Caatinga” é de origem
Tupi-Guarani e significa “floresta branca”, que certamente caracteriza bem o aspecto
da vegetação na estação seca, quando as folhas caem e apenas os troncos brancos
e brilhosos das árvores e arbustos permanecem na paisagem seca (ALBUQUERQUE;
BANDEIRA, 1995).
O estudo e a conservação da diversidade biológica da Caatinga é um dos
maiores desafios da ciência brasileira. Há vários motivos para isto: A Caatinga é a
única grande região natural brasileira cujos limites estão inteiramente restritos ao
território nacional; e proporcionalmente menos estudada entre as demais regiões
naturais brasileiras, com grande parte do esforço cientifico estando concentrado em
alguns poucos pontos em torno das principais cidades da região. É a região natural
brasileira menos protegida, pois as Unidades de Conservação cobrem menos de 2%
do seu território; continua passando por um extenso processo de alteração e
deterioração ambiental provocado pelo uso insustentável dos seus recursos naturais,
o que está levando a rápida perda de espécies vegetais únicas, à eliminação de
processos ecológicos chaves e a formação de extensos núcleos de desertificação em
vários setores da região (LEAL; TABARELLI; SILVA, 2003).
Segundo Taberelli et al. (2000), 41,1% da caatinga ainda não foi amostrada e
80% da áreas está sub-amostrada, sendo as áreas menos perturbadas aquelas com
menores esforços de coleta. Mesmo assim, atualmente são conhecidas 932 espécies
de plantas (380 endêmicas); 148 espécies de mamíferos (10 endêmicas); 348
espécies de aves (15 espécies e 45 subespécies endêmicas) e entre os anfíbios e
repteis, 15% também são endêmicos.
Várias espécies de plantas da caatinga são amplamente conhecidas e
utilizadas tanto na medicina popular como para exploração comercial, entre elas: A.
33
cearensis, M. nigra, N. variegata e S. convoluta. Apesar da sua grande diversidade
cultural e biológica, poucos estudos etnobotânicos e farmacológicos são realizados no
bioma caatinga (ALBUQUERQUE et al., 2007).
3.2.1. Amburana cearensis
Amburana cearensis (Fabaceae), conhecida popularmente por “cumaru” ou
“imburana-de-cheiro”, é uma árvore de importância econômica, típica do sertão
nordestino, onde é amplamente empregada em carpintaria, perfumaria e para fins
farmacêuticos (MAIA, 2004). A casca do caule, indicada para o tratamento de
afecções respiratórias, é largamente utilizada na medicina popular no preparo de uma
formulação caseira, chamada de “lambedor”, e também na produção industrial do
fitoterápico “xarope de cumaru” (LEAL et al., 1997).
A eficácia do uso popular de A. cearensis é comprovada por estudos
farmacológicos a partir do extrato hidroalcoólico da casca do caule e de alguns dos
seus
constituintes
químicos,
os
quais
demonstraram
atividade
analgésica,
broncodilatadora e anti-inflamatória (LEAL et al., 2003). Quimicamente, a casca do
caule é basicamente constituída de cumarina, responsável pelo seu odor peculiar, dos
flavonoides isocampferídeo, campferol e afromosina, pelos glicosídeos fenólicos
amburosideos, dos ácidos fenólicos, ácido vanílico e acido protocateuico, alem de
quantidades abundantes de sacarose (BRAVO et al., 1999). Estudos revelaram que a
cumarina, o isocamferideo e o amburosídeo A possuem efeitos anti-inflamatório,
antioxidante e broncodilatador, sendo indicados como princípios ativos da planta. Os
glicosídeos fenólicos, amburosídeo A e B, com moderada atividade biológica,
mostraram atividade antimalárica, antiprotozoária, antifúngica e antibacteriana in vitro
(LEAL et al., 2003). Estudos realizados com o extrato etanólico das cascas de A.
cearensis, sugerem ação nociceptiva (OLIVEIRA et al., 2009). Entretanto, a crescente
demanda na exploração econômica da A. cearensis, causada pelo seu uso madereiro
e medicinal, tem provocado uma séria ameaça a sua sobrevivência, já que segundo a
União Internacional para a Conservação da Natureza dos Recursos Naturais – IUCN,
esta espécie sofre risco de extinção (Ministério da saúde).
34
Figura 1 – Amburana cearensis.
Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/amburana-cearensis.html.
3.2.2. Morus nigra
Morus nigra L., Moraceae, conhecida popularmente como “amoreira” é uma
espécie vegetal que tem sua origem na Ásia, frutificando com maior intensidade e
abundância, sobretudo na Ásia Menor e estando plenamente aclimatizada no Brasil
(CRUZ, 1979). O gênero Morus é constituído de aproximadamente 24 espécies, uma
subespécie, sendo descrito pelo menos 100 variedades (MACHII et al., 2000; TUTIN
et al., 1996).
Diferentes grupos de compostos químicos têm sido investigados no gênero
Morus, tais como alcalóides, cumarinas, flavonoides, triterpenos e esteroides
(TOSHIO et al., 2005). Na medicina chinesa, as plantas do gênero Morus são usadas
como antiinflamatório, diurético, antitussígeno, analgésico e antipirético (NOMURA,
1998; JIANG, 1977). As raízes são utilizadas no tratamento de hipertensão arterial,
reumatismo, problemas oculares e espasmos infantis. Almeida et al. (2011),
realizaram um estudo sobre o potencial hipoglicêmico das folhas M. nigra, e
observaram que o extrato não produziu o efeito hipoglicemiante esperado. O fruto da
amora é utilizado para doenças hepáticas e renais e suas folhas utilizadas para o
tratamento de febre, dor de cabeça, beribéri, vômitos e dor estomacal causada pelo
agente da cólera. Os ramos jovens da árvore são usados para o tratamento de
hipertesão e paralisia de braços e pernas (JIANG, 1977). Oliveira et al. (2013),
realizaram um estudo para observar a toxicidade do chá das folhas de M. nigra,
35
concluindo que nas condições do estudo, o chá pode ser considerado de baixa
toxicidade, pois não produziu efeitos tóxicos nos animais tratados.
Na região do Vale do São Francisco-Brasil, essa espécie é conhecida
popularmente como “amora-miúra”. O chá das folhas (decocto) é bastante utilizado
pela população local para o tratamento de diabetes, dislipdemia, problemas
cardiovasculares, obesidade e gota. A planta foi trazida para a região por imigrantes
japoneses, adaptando-se bem às condições de clima e solo (OLIVEIRA et al., 2013).
Figura 2 – Morus nigra
Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/morus-nigra.html.
3.2.3. Neoglaziovia variegata
A espécie Neoglaziovia variegata Mez. é uma Bromeliaceae endêmica do
Brasil, conhecida popularmente como “caroá”, amplamente distribuída na região da
caatinga por todo o semiárido do nordeste brasileiro (RIBEIRO, 2007), e parte da
região Sudeste (Minas Gerais) (FORZZA et al., 2011). Pode ser encontrada no interior
de matas mais fechadas até as áreas mais abertas, em solos compactos e pouco
profundos. Esta planta possui folhas longas que medem de 100 a 200 cm, com
espinhos nos bordos curvados para o ápice da folha, nervuras paralelinérveas, face
adaxial esparsamente prurinosa-lepidota, face abaxial glabra, verde com manchas
irregulares cinza; inflorescência de 18 a 30 cm, racemosa, ereta, multiflora e flores
pedicelada 1 cm, com pétalas avermelhadas e anteras amarelas.
36
O caroá apresenta potencialidades econômicas centradas nas folhas, as quais
se constituem de fibras de alta resistência. Na década de 40, o extrativismo do caroá
alcançou níveis mais significativos (PEREIRA; QUIRINO, 2008). Nessa época a
espécie foi bastante importante para a economia nordestina, porém, sua exploração
foi abandonada com o surgimento das fibras sintéticas (RIBEIRO, 2007). Atualmente,
as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de emprego e renda para
diversas famílias nordestinas, com a fabricação artesanal de chapéus, bolsas, entre
outros produtos.
Vários estudos têm demonstrado que N. variegata têm propriedades biológicas
tais como gastroprotetora (MACHADO et al., 2013), fotoprotetora (OLIVEIRA-JÚNIOR
et al., 2013), antibacteriana (OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2012), anti-nociceptiva (LIMASARAIVA et al., 2012a) e antioxidante (LIMA-SARAIVA et al. 2012b).
Figura 3 – Neoglaziovia variegata.
Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/neoglaziovia-variegata.html.
3.2.4. Selaginella convoluta
A família Selaginellaceae possui um único gênero, Selaginella, o qual possui
aproximadamente de 700 a 750 espécies. O gênero é amplamente distribuído na
América, África e Europa (JUDD et al., 1999; TRYON; TRYON, 1982). Os membros
da família Selaginellaceae são principalmente terrestres, plantas herbáceas e perenes
37
e variam muito em tamanho, algumas pequenas espécies têm hastes de
aproximadamente 3 cm de comprimento, enquanto as espécies maiores têm hastes
50 cm a cerca de 1 m de comprimento, mas com menos de 2 cm de altura (JUDD et
al., 1999; TRYON; TRYON, 1982).
Na região Nordeste do país, principalmente na região semiárida, há a
predominância da espécie S. convoluta, conhecida popularmente como “jericó”, “mãofechada”, “mão-de-sapo”, sendo utilizada como planta medicinal para o tratamento de
diversas enfermidades, tais como antidepressivo (GIORGETTI; NEGRI; RODRIGUES,
2007; SANTOS et al., 1994), afrodisíaco, diurético, distúrbios da amenorréia (AGRA et
al., 2007), analgésico e anti-inflamatório (ALMEIDA et al., 2005).
Frequentemente, os espécimes de S. convoluta apresentam-se como ripícolas
e crescem sobre uma fina camada de húmus nas encostas dos morros graníticos e
paredões rochosos, mas podem ser também terrestres, ocupando barrancos.
Preferencialmente, ocorrem em locais secos e expostos ao sol (HIRAI; PRADO,
2000).
Estudos realizados recentemente com várias espécies de Selaginella,
revelaram que o gênero é rico em esteroides, biflanoides, alcalóides e lignanas (SÁ et
al., 2012).
Figura 4 – Selaginella convoluta.
Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/ selaginella-convoluta.html.
38
Tendo em vista a ampla distribuição dessas espécies no bioma caatinga e os
poucos estudos químicos e da atividade biológica, esse trabalho apresenta pela
primeira vez, os resultados da avaliação da atividade carrapaticida de Amburana
cearensis, Morus nigra, Neoglaziovia variegata e Selaginella convoluta. Assim,
pretendemos fornecer informações a respeito das propriedades carrapaticidas dessas
espécies, visando á realização de novos estudos nas áreas de química e
farmacologia, bem como contribuir para a conservação e manejo sustentável das
mesmas na região do semiárido.
39
4. MATERIAIS E MÉTODOS
40
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Material vegetal
As cascas do tronco de A. cearensis foram coletadas no município de Petrolina.
Uma exsicata da planta (5545) está depositada no Herbário Vale do São Francisco
(HVASF) da Universidade Federal do Vale do São Francisco.
4.1.2. Morus nigra
As folhas de M. nigra L. foram coletadas na Fazenda Ouro Verde, município de
Casa Nova-BA, em agosto de 2011. Uma exsicata da planta (1764) está depositada
no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade Federal do Vale do São
Francisco.
As folhas e partes aéreas de N. variegata foram coletadas no município de
Petrolina, Estado de Pernambuco em janeiro de 2010. Uma exsicata da planta está
depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade Federal do
Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o código 6441.
As folhas de S. convoluta foram coletadas em agosto de 2009 no Campus de
Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco, localizado na
zona rural de Petrolina - PE. Uma exsicata da planta (6440) foi depositada no herbário
Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade Federal do Vale do São Francisco.
41
Todos os materiais botânicos foram identificados pelo biólogo André Paviotti
Fontana do Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradas da Caatinga
(CRAD)
4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) e das frações das espécies
selecionadas
O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração fracionada
com etanol a 95%. Foram realizadas quatro extrações com intervalos de 72 horas
entre cada extração. A solução foi filtrada e concentrada em evaporador rotatório.
Após evaporação do solvente em rotavapor, obteve-se o extrato etanólico bruto das
plantas estudadas, a partir de:
- 714 g do pó seco das folhas de M. nigra foram obtidos 69 g do extrato
etanólico bruto (9,67% de rendimento em relação ao peso seco da planta).
- 1.174 g do pó seco das folhas de N. variegata foram obtidos 45 g do extrato
etanólico bruto (3,83% de rendimento em relação ao peso seco da planta).
- 361 g do pó seco das folhas de S. convoluta foram obtidos 27 g do extrato
etanólico bruto (7,48% de rendimento em relação ao peso seco da planta)
Parte do EEB das espécies selecionadas foram reservadas para os testes
posteriores e outra parte foi submetida à partição por solventes orgânicos (hexano,
clorofórmio e acetato de etila) em ordem crescente de polaridade.
4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos
Os extratos foram avaliados em placas cromatográficas de sílica gel com
suporte de alumínio, aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de
42
solventes, conforme descrito por Wagner e Bladt (1996), procurando-se evidenciar os
principais grupos de metabólitos secundários (Tabela 1).
Tabela 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar as principais
classes de metabólitos secundários das 4 espécies da caatinga por cromatografia em
camada delgada (WAGNER; BLADT, 1996).
Classe química
Sistema eluente
Tolueno:acetato de
Alcalóides gerais etila:dietilamina
(70:20:10)
Acetato de etila:ácido
fórmico:ácido acético
Flavanóides
glacial:água
(100:11:11:26)
Tolueno:éter etílico
Cumarinas
(1:1 saturado com ácido
acético 10%)
Acetato de
Derivados
etila:metanol:água
antracênicos
(100:13,5:10)
Clorofórmio:metanol:água
Lignanas
(70:30:4)
Tolueno:ácido fórmico
Naftoquinonas
(99:1)
Clorofórmio:ácido
Saponinas
acético:metanol:água
(64:32:12:8)
Acetato de etila:ácido
Taninos
acético glacial:ácido
condensados
fórmico:água
(100:11:11:26)
Taninos
n-Butanol:acetona:tampão
hidrolisáveis
fosfato (40:50:10)
Triterpenos e
Tolueno:clorofórmio:etanol
esteroides
(40:40:10)
Padrão
Revelador
Yoimbina
Quinina
Dragendorff
Rutina
Quercetina
NEU
Escopoletina
KOH etanólico 10%
Aloína
KOH etanólico 10%
Estrato de
linhaça
Biflorina
Lapachol
Vanilina fosfórica
KOH etanólico 10%
Saponina
Anisaldeído
sulfúrico
Catequina
Epicatequina
Vanilina clorídrica
Ácido gálico
Ácido tânico
Lupeol
Sitosterol
Sulfato de ferro
amoniacal( 1%)
LiebermanBurchard
43
4.4. Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A análise do perfil de compostos foi realizada em CLAE, modelo Lachrom Elite,
coluna de fase reversa LiCospher RP18 (5mm) com dimensões (150 mm x 4 mm)
Merck, equipado com detector de arranjo de diodo (DAD). A fase móvel utilizada foi
uma solução de H20/H3PO4 0,1% (A) e MeOH (B), inicialmente 75% de A e 25% de B,
por 25 minutos. A temperatura da coluna foi mantida constante em 30ºC, com fluxo de
1,0 mL/ min. Para o extrato foi utilizado um volume de injeção de 20 µL. Os dados
espectrais foram registrados em 320-322 nm durante a corrida inteira. A análise em
CLAE-DAD foi realizada no Laboratório de Fitoquímica da Universidade Estadual de
Feira de Santana (UEFS), Bahia.
4.5. Colônia de carrapatos
Foram coletadas fêmeas ingurgitadas (entre 4 e 8 mm) de vida parasitária, em
bovinos naturalmente infestados por R. (B.) microplus isentos de carrapaticida
químico, acondicionadas em recipiente plástico fechado, e levados ao laboratório de
parasitologia da UNIVASF em caixa térmica com gelo, para diminuir a mobilidade e
evitar a oviposição prematura das fêmeas (BROGLIO-MICHELLETI et al., 2009).
Para a criação dos R. (B). microplus foram utilizados dois bovinos (Bos taurus),
adultos, pesando entre 200-250 Kg, provenientes do Centro de Ciências Agrárias da
UNIVASF, que foram mantidos em baias individuais com alimentação e água ad
libitum. Aproximadamente 200 larvas foram infestadas na região dorsal dos animais,
para a realização do seu ciclo de vida. Após 21 dias, foram obtidas teleóginas, que
foram coletadas, acondicionadas e levadas ao laboratório de Parasitologia, e
incubadas em estufa B.O.D, a temperatura de aproximadamente 27ºC e umidade
relativa maior que 90%. Após a postura dos ovos e eclosão dos mesmos, o
procedimento foi repetido, para obtenção de mais carrapatos com o objetivo de serem
testados com os extratos das plantas, nos testes de imersão de fêmeas ingurgitadas,
também conhecido como biocarrapaticidograma.
44
4.6. Teste de imersão de fêmeas ingurgitadas
Os carrapatos coletados e levados ao laboratório de Parasitologia da UNIVASF
foram submetidos ao teste de imersão, segundo Drummond et al. (1973), ao chegar
no laboratório, os mesmo foram lavados em água corrente, secos em papel
absorvente e selecionados por tamanho em grupos de tratamentos homogêneos
quanto a aparência, motilidade, integridade física e ingurgitamento (ARANTES, 1995).
Foram divididos em grupos de 10 teleóginas por tratamento, sendo os testes
realizados em triplicatas.
Os grupos foram pesados em balança analítica e submetidos ao banho de
imersão por cinco minutos em soluções de 20 mL dos extratos diluídos em
percentuais de 0,5%, 1,0% e 2,5%. No grupo controle, o líquido de imersão utilizado
foi água destilada e, quando necessário, realizou-se o controle com o surfactante
Cremophor. Após a imersão, foram secos e transferidos para placas de petri
devidamente identificadas e mantidas em estufa B.O.D, a temperatura de
aproximadamente 27ºC e umidade relativa maior que 90%. Ao fim da oviposição, as
posturas foram removidas, pesadas em balança analítica e transferidas para tubos de
ensaio vedados com tampo de algodão hidrófilo e mantidos nas mesmas condições.
4.6.1. Parâmetros analisados
Os dados como peso das teleóginas (PT), peso dos ovos (PO) e percentual de
eclosão (%E), foram avaliados e posteriormente calculados a inibição da oviposição
(%IO), índice reprodução estimada (IRE) e a eficácia (EF) (DRUMMOND et al., 1973).
•
Inibição de oviposição (%IO) = {(IO (controle) – IO (tratamento)/ IO (controle)) * 100};
•
Índice de Reprodução Estimada (IRE) = (PO/ PT) * (%Ex 0,01) x 20000;
•
Eficácia (EF) = {(EF (controle)-EF (tratamento)/EF (controle) * 100}.
45
4.7 Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad Prism,
versão 5.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças
estatísticas significantes entre os grupos foram calculadas pela aplicação de uma
análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey e confirmado pelo teste t de
Student (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).
46
5. RESULTADOS
47
5. RESULTADOS
5.1 Triagem fitoquímica
5.1.1 Amburana cearensis
A análise preliminar da fitoquímica do extrato etanólico bruto das cascas de A.
cearensis (Ac-EEB) apresentou reação positiva para derivados antracênicos,
cumarinas, flavonoides, taninos, lignanas, monoterpenos e diterpenos, naftoquinonas,
triterpenos e esteroides e reação negativa para alcalóides.
Tabela 2 - Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das cascas de
Amburana cearensis.
Grupo Metabólico
EEB
Alcaloides
-
Derivados Antracênicos
+
Cumarina
+
Flavonoides e Taninos
+
Lignanas
+
Mono e diterpenos
+
Naftoquinonas
+
Triterpenos e esteroides
+
EEB (Extrato Etanólico Bruto); (-): não detectado; (+): presença.
5.1.2 Morus nigra
A triagem fitoquimica do extrato etanólico bruto das folhas de M. nigra (MnEEB) apresentou reação positiva para alcaloides. Cumarinas, flavonoides, triterpenos
e esteroides foram positivos para todas as frações. Apenas na fração acetato (MnAcOEt) está presente os derivados antracênicos. Em contrapartida apenas essa
fração, mostrou-se negativa para a presença de mono e diterpenos e naftoquinonas.
Lignanas foram identificadas nas frações etanólicas e acetato.
48
Tabela 3 - Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Morus nigra.
Grupo Metabólico
EEB
Hexano
CHCl3
AcOEt
Alcaloídes
+
-
-
-
-
-
-
+++
Cumarina
++
+
+++
++
Flavonoides e taninos
++
++
++
+++
Lignanas
+
-
-
+++
Mono e diterpenos
+
+++
+
-
Naftoquinonas
+
+++
+
-
++
+++
+++
++
EEB (Extrato Etanólico Bruto); CHCl3 (Clorofórmio); AcOEt (Acetato de etila); (-): não detectado;
(+):pouca presença; (++) presença moderada; (+++): forte presença.
5.1.3 Neoglaziovia variegata
5.1.3.1 Folhas
A análise preliminar demonstrou que todos os extratos foram positivos para a
presença de flavonoides e taninos. A exceção da fração clorofórmica (Nvf-CHCl3),
todas as frações deram reação positiva para a presença de derivados antracênicos,
monoterpeno, diterpenos, triterpenos e esteroides. Nvf-CHCl3 e fração acetato de N.
variegata (Nvf-AcOEt) foram positivos para a presença de cumarina e naftoquinonas.
Todos os extratos foram negativos para a presença de alcalóides e lignanas (Tabela
4).
49
Tabela 4 - Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Neoglaziovia
variegata.
AcOEt
Grupo Metabólico
EEB
Hexano
CHCl3
Alcaloide
Derivados Antracênico
Cumarina
Flavonoide e tanino
Lignana
Mono e diterpeno
Naftoquinona
Triterpeno e esteroide
-
-
-
-
++
++
+
-
-
-
++
++
++
++
++
++
-
-
-
-
+++
+++
++
-
-
-
+
+
++
++
+++
-
EEB (Extrato Etanólico Bruto); CHCl3 (Clorofórmio); AcOEt (Acetato de etila). (-): não detectado; (+):
pouca presença; (++) presença moderada; (+++): forte presença.
5.1.3.2 Partes aéreas
A análise preliminar demonstrou que o extrato etanólico (Nvpa-EEB) e hexânico
(Nvpa-HEX), foram positivos para a presença de derivados antracênicos, flavonoide,
tanino, monoterpeno e diterpeno. O extrato hexânico também apresentou reação
positiva para triterpenos e esteroides. O extrato clorofórmico (Nvpa-CHCl3) foi positivo
para a presença de derivados antracênicos, cumarinas, flavonoides e taninos, mono e
diterpenos e naftoquinonas. O extrato de acetato de etila (Nvpa-AcOEt) foi positivo
para a presença de cumarinas, flavonoides e taninos, lignanas e naftoquinonas.
Todos os extratos foram negativos para a presença de alcalóides (Tabela 5).
50
Tabela 5 - Caracterização fitoquímica dos extratos das partes aéreas de Neoglaziovia
variegata.
Grupo Metabólico
Alcaloides
EtOH
-
Hexano
-
CHCl3
-
AcOEt
-
++
++
+
-
-
-
++
++
++
++
++
+++
Lignanas
-
-
-
++
Mono e diterpenos
+
+++
++
-
Naftoquinonas
-
-
+
+
-
++
-
-
Cumarina
EEB (Extrato Etanólico Bruto); CHCl3 (Clorofórmio); AcOEt (Acetato de etila). (-): não detectado; (+):
pouca presença; (++) presença moderada; (+++): forte presença.
5.1.4 Selaginella convoluta
Na triagem fitoquímica preliminar, o extrato etanólico bruto (Sc-EEB)
apresentou reação positiva para a presença de fenóis, taninos, flavonoides,
esteroides e terpenoides. Não foi constatada para o Sc-EEB presença de alcaloides
(Tabela 6).
Tabela 6 - Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Selaginella
convoluta.
Grupo Metabólico
EEB
Alcaloides
-
Cumarina
-
+
Lignanas
-
Mono e diterpenos
-
Naftoquinonas
-
+
EEB (Extrato Etanólico Bruto). (-): não detectado; (+): presença.
51
5.2. Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a
detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD)
5.2.1. Análise em CLAE do extrato etanólico de Amburana cearensis
O perfil cromatográfico em 322 nm para Ac-EEB é apresentado na Figura 5. O
cromatograma mostra a presença de quatro picos com tempos de retenção diferentes:
15,68 (1), 16,94 (2), 18,6 (3), 19,65 (4). Com base nos dados espectrais de UV-Vis e
nos tempos de retenção, os compostos têm características da banda de UV para
flavonoides.
Figura 5 – Cromatograma do extrato etanólico de Amburana cearensis obtido por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em
220 nm.
52
5.2.2. Análise em CLAE do extrato etanólico de Morus nigra
O perfil cromatográfico avaliado em 320 nm para o Mn- EEB é apresentado na
Figura 6. O cromatograma mostra a presença de quatro picos com tempo de retenção
entre 5 e 20 minutos. Com base nos dados espectrais de UV-Vis e nos tempos de
retenção, os compostos têm características de banda de UV para compostos
fenólicos, ácido cinâmico ou possivelmente derivados da flavanona.
Figura 6 – Cromatograma do extrato etanólico de Morus nigra obtido por cromatografia
líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em 320 nm.
1
2
3
4
53
5.2.3. Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata
O perfil cromatográfico avaliado em 322 nm para as folhas do extrato de N.
variegata (Nvf-EEB) é apresentado na Figura 7. O cromatograma mostra a presença
de oito picos com tempos de retenção diferentes: 9,6 (1), 10,89 (2), 11,80 (3), 14,44
(4), 15,16 (5), 15,58 (6), 16,69 (7) e 17,62 (8). Com base nos dados espectrais de UVVis e nos tempos de retenção, os compostos têm características da banda de UV
para derivados do ácido cinâmico, cumarinas ou flavonoides.
Figura 7 – Cromatograma do extrato etanólico de obtido por Neoglaziovia variegata de obtido
por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD)
em 322 nm.
7
6
4
5
3
2
1
8
54
5.2.4. Análise em CLAE do extrato etanólico de Selaginella convoluta
O perfil cromatográfico e espectral do extrato etanólico de S. convoluta (ScEEB), obtido pela técnica CLAE-DAD e registrado em 320 nm é mostrado na Figura 8.
O cromatograma mostra a presença de um único pico, com tempo de retenção de
19,41 minutos. O composto tem banda de UV característica de um flavonoide.
Figura 8 – Cromatograma do extrato etanólico de Selaginella convoluta obtido por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em
320 nm.
55
5.3. Teste de imersão
5.3.1.1. Inibição da oviposição (IO)
Através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas foi possível observar que o
extrato hexânico de A. cearensis (Ac-HEX) inibiu a oviposição das fêmeas em todas
as doses do extrato (5, 10 e 25 mg/mL), apresentando percentuais de inibição de
13,25%, 20,83% e 52,73%, quando comparado ao grupo controle (Figura 9). Nas
mesmas concentrações, o grupo tratado com o extrato clorofórmico de A. cearensis
(Ac-CHCl3) obteve percentual de inibição menores 5,26%, 24,10% e 28,08% . O
grupo tratado com extrato acetato de etila (Ac-AcOEt) obteve percentuais de 6,84%,
13,85% e 11,79%, enquanto o grupo tratado com Ac-EEB obteve 8,49%, 6,91% e
31,91%, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL. Não houve diferença significativa
em nenhuma das fases.
Figura 9 – Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a ovipostura do carrapato R.
(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de A.
cearensis B) Extrato Acetato de Etila de A. cearensis C) Extrato Clorofórmico de A. cearensis
D) Extrato Hexânico de A. cearensis. Valores são média ± E.P.M (n=10). *P< 0,05. Anova one
way.
56
5.3.1.2. Porcentagem de eclosão (%E)
A porcentagem de eclosão, foi o segundo parâmetro avaliado, o melhor
resultado para a A. cearensis foi Ac-HEX na concentração de 25 mg/mL,
apresentando 39% de eclosão, essa mesma fase a eclosão foi de 81,67% e 76,33%
nas concentrações de 5 e 10 mg/mL, respectivamente. Para Ac-CHCl3, observou-se
uma eclosão de 94,67%, 91,27% e 75,83% e Ac-AcOEt a eclosão em 83%, 82,83% e
58,67%. O extrato etanólico bruto apresentou inibição de 52% para a concentração
mais alta, 2,5% e 84,67% e 83,67% para as concentrações de 0,5% e 1%,
respectivamente. Não houve diferença estatística entre o controle 1 (água) que
apresentou 99% de eclosão e o controle 2 (água/ cremophor). Houve diferença
estatística entre todas as frações (2,5%) e o controle (Figura 10).
Figura 10 – Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a eclosão dos ovos do
carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico
Bruto de A. cearensis B) Extrato Acetato de Etila de A. cearensis C) Extrato Clorofórmico de
A. cearensis D) Extrato Hexânico de A. cearensis. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P<
0,05 significativamente diferente do grupo controle. Anova one way.
A. cearensis - EEB
A. cearensis - AcOEt
100
100
*
40
60
20
0
0
C
on
tr
ol
e
C
on
tr
ol
e
20
A
*
40
C
re
m
op
ho
r
A
cA
cO
E
t0
,5
%
A
cA
cO
E
t1
,0
%
A
cA
cO
E
t2
,5
%
Eclosão (%)
80
60
C
re
m
op
ho
r
A
cE
E
B
0,
5
%
A
cE
E
B
1%
A
cE
E
B
2,
5%
Eclosão (%)
80
A.cearensis - HEX
A. cearensis - CHCl3
100
*
80
Eclosão (%)
80
60
40
60
0
C
on
tr
ol
e
C
on
tr
ol
e
20
0
C
re
m
op
ho
A
r
cC
H
C
l3
0,
5%
A
cC
H
C
l3
1,
0%
A
cC
H
C
l3
2,
5%
20
C
*
40
C
re
m
op
ho
r
A
cH
E
X
0,
5%
A
cH
E
X
1,
0%
A
cH
E
X
2,
5%
100
Eclosão (%)
B
D
57
5.3.1.3. Índice de eficiência reprodutiva (IER)
A. cearensis foi capaz de inibir em todas as fases a reprodução estimada das
fêmeas ingurgitadas, sendo esse efeito mais evidente em Ac-HEX, apresentando
7664, 6594 e 3271, para as concentrações de 0,5, 1 e 2,5%, respectivamente. AcCHCl3 nas mesmas concentrações, apresentou o menor efeito com 8864, 6838 e
6235. O grupo tratado com Ac-AcOEt não inibiu significativamente a reprodução
estimada, apresentando o melhor efeito para a concentração de 25 mg/mL com
inibição de 5621 e os grupos tratados com Ac-EEB apresentaram uma reprodução
estimada de 8021 para a concentração de 0,5% e 4910 para a concentração de 2,5%.
Os grupos controle 1 (água) com RE em 10050 e o grupo controle 2 (água e
cremophor) com RE de 10089 não apresentaram diferença estatística (Tabela 7).
Tabela 7 – Efeito do extrato das cascas de Amburana cearensis sobre a reprodução estimada
do carrapato R. (B.) microplus.
FRAÇÃO
EXTRATO
REPRODUÇÃO ESTIMADA
HEXANO
5
10
25
7664 ± 1435
6594 ± 2231
3271 ± 3783
CLOROFÓRMIO
5
10
25
8864 ± 745,1
6838 ± 895,2
6235 ± 984
ACETATO DE
ETILA
5
10
25
7999 ± 2310
7257 ± 1851
5621 ± 2074
ETANOL
5
10
25
8021 ± 2187
7753 ± 1555
4910 ± 2637
CONTROLE 1
10050 ± 139,1
CONTROLE 2
10089 ± 458,6
Controle 1(Apenas água); Controle 2 (Água+cremophor)
58
5.3.1.4 Eficácia (EF)
Através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas foi possível comprovar que
A. cearensis possui atividade carrapaticida. Ac-HEX, apresentou eficácia de 66,68%
para a concentração de 2,5%, sendo que para as concentrações de 0,5% e 1%, esses
resultados foram 22,67% e 66,68%, respectivamente (Figura 11). Para Ac-EEB foi
evidenciado uma redução gradual da eficácia, obtendo-se 20%, 21,78% e 52,03%
para as mesmas concentrações descritas acima. As menores eficiências foram
obtidas por Ac-AcOEt e Ac-CHCl3, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL,
apresentaram eficácia 20,21%, 27, 66% e 43,98% e 6,5%, 27,5% e 35,78%,
respectivamente. Houve diferença significativa entre Ac-AcOEt 0,5% e 2,5%.
Figura 11 – Eficácia do extrato das folhas de A. cearensis no controle do carrapato R. (B.)
microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de A. cearensis
B) Extrato Acetato de Etila de A. cearensis C) Extrato Clorofórmico de A. cearensis D) Extrato
Hexânico de A. cearensis. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.
59
5.3.2. Morus nigra
Para a inibição de postura o extrato clorfórmico de M. nigra (Mn-CHCl3) obteve
a melhor resposta na concentração de 25 mg/mL, apresentando inibição de 62,61%
quando comparado ao controle (Figura 12), em menores concentrações a inibição foi
de 4,2% e 6,65% para 5 e 10 mg/mL. Extrato hexânico de M.nigra (Mn-HEX), MnAcOEt e Mn-EEB, não apresentaram efeito gradual com o aumento da concentração,
obtendo 12,10%, 10,24 % e 11,00% de inibição para Mn-HEX, 9,52%, 11,53% e
3,66% para Mn-AcOEt e 12,47%, 8,62% e 19,03% para Mn-EEB, nas concentrações
de 5, 10 e 25 mg/mL. Não houve diferença estatística em nenhuma das fases.
Figura 12 – Efeito do extrato de M. nigra sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus
nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de M. nigra B) Extrato
Acetato de Etila de M. nigra C) Extrato Clorofórmico de M. nigra D) Extrato Hexânico de M.
nigra. Valores são média ± E.P.M (n=10). P< 0,05. Anova one way.
60
Para a eclosão dos ovos, o extrato de M. nigra não apresentou diferença
estatística em nenhuma das suas fases quando comparada ao controle. Ac-CHCl3
apresentou a maior inibição da eclosão dos ovos para esse extrato, obtendo 39,33%
de eclosão na concentração de 25 mg/mL, em menores concentrações (5 e 10
mg/mL) apresentou 91,17% e 81,17% de eclosão. Logo em seguida, Ac-HEX também
na concentração de 25 mg/mL, obteve 71,5% de eclosão, Ac-AcOEt e Ac-EEB a 2,5%
eclodiram 73,17% e 86,37% dos seus ovos respectivamente. Não houve diferença
estatística entre os extratos e os controles (Figura 13).
Figura 13 – Efeito do extrato das folhas de M.nigra sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.)
microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de M.nigra B) Extrato
Acetato de Etila de M.nigra C) Extrato Clorofórmico de M.nigra D) Extrato Hexânico de M.nigra. Valores
são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.
61
O extrato de M. nigra apresentou efeito sobre a reprodução estimada das
fêmeas
ingurgitadas,
principalmente
Mn-CHCl3,
apresentando
diminuição
da
reprodução estimada em 3334 na concentração de 25 mg/mL, quando comparado ao
grupo controle que apresentou RE de 9457, para as concentrações de 5 e 10 mg/mL
alcançou RE de 6608 e 6069, respectivamente. Nas mesmas concentrações, MnHEX apresentou 8268, 6608 e 6069, Mn-AcOEt 8012, 7130 e 7378 e Mn-EEB 7430,
8557 e 7479, respectivamente (Tabela 8).
Tabela 8 – Efeito do extrato das folhas de M. nigra sobre a reprodução estimada do carrapato
R. (B.) microplus.
FRAÇÃO
EXTRATO
HEXANO
5
10
25
8268 ± 1662
6608 ± 2058
6069 ± 1633
CLOROFÓRMIO
5
10
25
8712 ± 571,4
6293 ± 1539
3334 ± 4130
ACETATO DE
ETILA
5
10
25
8012 ± 815,4
7130 ± 906,5
7378 ± 2456
ETANOL
5
10
25
7430 ± 1553
8557 ± 719
7479 ± 1016
CONTROLE 1
9457 ± 817,7
CONTROLE 2
9273 ± 1402
5.3.2.4. Eficácia (EF)
A atividade carrapaticida do extrato de Morus nigra, foi mais evidente na fase
clorofórmica, alcançando 65,44% de eficácia na concentração de 25 mg/mL, em
menores concentrações (5 e 10 mg/mL) obteve 9,15% e 35,57%. O extrato hexânico
também apresentou carrapaticida quando comparado ao grupo controle, obtendo
62
20,55%, 37,09% e 42,10% para as concentrações de 5, 10, e 25 mg/mL. O extrato
etanólico bruto e acetato não apresentaram resposta gradual com o aumento da
concentração (5, 10 e 25 mg/mL) com 22,68%, 31,10% e 28,37% para Mn-AcOEt e
23,55%, 11,12% e 22,57 % para Mn-EEB.
Figura 14 – Eficácia do extrato das folhas de M. nigra no controle do carrapato R. (B.)
microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de M. nigra B)
Extrato Acetato de Etila de M. nigra C) Extrato Clorofórmico de M. nigra D) Extrato Hexânico
de M. nigra. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.
63
5.3.3.1. Folhas
5.3.3.1.1. Inibição da oviposição (IO)
As folhas de N. variegata apresentaram forte inibição da ovipostura. Extrato
hexânico das folhas de N. variegata (Nvf-HEX) 2,5% apresentou inibição máxima de
94,14% quando comparado ao controle, em menores concentrações observou-se
inibição da ovipostura de 18,59% e 61,22% para as concentrações de 0,5% e 1%,
respectivamente. Houve diferença estatística entre Nvf-HEX 1% e 2,5% quando
comparados com Nvf-HEX 0,5%. Nvf-EEB também obteve forte inibição, apresentando
diferença estatística entre os extratos de 0,5 e 2,5%, com percentuais de 21,65%,
41,3% e 84,56% para as doses de 5, 10 e 25 mg/ml. Nv-CHCl3 e Nvf-AcOEt
apresentaram respectivamente, 13,04%, 31,04% e 33,22% e 18,8%, 22,52% e
28,56%, para as concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL (Figura 15).
Figura 15 – Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a ovipostura do carrapato R.
(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N.
variegata B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata
D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova
one way.
64
5.3.3.1.2. Porcentagem de eclosão (%E)
Nvf-HEX apresentou a maior inibição da eclosão dos ovos para o extrato de N.
variegata, obtendo 0,33% de eclosão na concentração de 25 mg/mL e em menores
concentrações (5 e 10 mg/mL) apresentou 70,17% e 26,67%, houve diferença
estatística entre todas as concentrações de Nvf- HEX quando comparados ao
controle. Nvf-EEB também apresentou boa atividade contra a eclosão dos ovos de
R.B. microplus, obtendo 78,83%, 58,83% e 10% nas concentrações de 5, 10 e 25
mg/mL, respectivamente. Houve diferença estatística entre Nvf- EEB 1% e 2,5%
quando comparados ao controle. Nvf-CHCl3 e Nv-AcOEt obtiveram 66,50%, 50,00% e
45,67% e 68,67%, 72,33% e 74% de eclosão, respectivamente (Figura 16).
Figura 16 – Efeito do extrato das folhas de N.variegata sobre a eclosão dos ovos do
Bruto de N.variegata B) Extrato Acetato de Etila de N.variegata C) Extrato Clorofórmico de N.
variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05.
Anova one way.
65
5.3.3.1.3. Indice de eficiência reprodutiva (IER)
O extrato de N. variegata apresentou efeito sobre a reprodução estimada das
fêmeas
ingurgitadas,
principalmente
Nvf-HEX,
apresentando
diminuição
da
reprodução estimada em 19,83 na concentração de 25 mg/mL, quando comparado ao
grupo controle que apresentou RE de 10236, para as concentrações de 5 e 10 mg/mL
alcançou RE de 6139 e 2135, respectivamente. Nas mesmas concentrações, Nv- EEB
apresentou 7023, 4749 e 768,5, Nvf-AcOEt 6335, 6552 e 6333 e Nvf-CHCl3 6157,4008
e 3933, respectivamente (Tabela 9).
Tabela 9 – Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a reprodução estimada do
carrapato R. (B.) microplus
FRAÇÃO
EXTRATO
HEXANO
5
10
25
6139 ± 975,6
2135 ± 1603
19,83 ± 34,35
CLOROFÓRMIO
5
10
25
6157 ± 2450
4008 ± 2190
3933 ± 4025
ACETATO DE
ETILA
5
10
25
6335 ± 1909
6552 ± 3171
6333 ± 2103
ETANOL
5
10
25
7023 ± 903,1
4749 ± 2672
768,5 ± 193,6
CONTROLE 1
10236 ± 75488
CONTROLE 2
10116 ± 586,7
5.3.3.1.4. Eficácia (EF)
As folhas de N. variegata apresentaram o melhor efeito carrapaticida quando
comparados ao grupo controle. Nvf-HEX obteve 37,63%, 78,07% e 99,81% de eficácia
para as concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL. Nas mesmas concentrações, Nvf-EEB
obteve eficácia de 33,91%, 54,83% e 92,55%. Nvf-CHCl3 e Nvf-AcOEt obtiveram
66
eficácia de 38,42%, 61,07% e 61,80 % para o primeiro e 40,30%, 38,38% e 40,38%
para o segundo.
Figura 17 – Eficácia do extrato das folhas de N. variegata no controle do carrapato R. (B.)
microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N. variegata
B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata D) Extrato
Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.
5.3.3.2. Partes aéreas
5.3.3.2.1. Inibição da oviposição (IO)
As partes aéreas de N. variegata obteve o melhor resultado na fração
hexânica, com inibição de 20,76%, 26,50% e 46,57% nas concentrações de 5, 10 e
25 mg/mL. Nvpa-EEB apresentou 18,73%, 30,24% e 40,34% de inibição nas mesmas
concentrações. Nvpa-AcOEt e Nvpa-CHCl3 apresentaram fraca inibição da ovipostura,
obtendo-se 13,64%, 16,30% e 17,13% e 8,82%, 22,46% e 25,84%, respectivamente
(Figura 18).
67
Figura 18 – Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a ovipostura do
carrapato R. (B.) microlus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto
de N. variegata B) Extrato acetato de etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N.
variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). *P< 0,05.
Anova one way.
5.3.3.2.2. Porcentagem de eclosão (%E)
Nvpa-HEX apresentou os melhores resultados, para as concentrações de 5, 10
e 25 mg/mL foi possível observar 56,17%, 52,83% e 42,50% de eclosão, houve
diferença estatística entre Nvpa-HEX 2,5% e o controle. Nvpa-CHCl3 nas mesmas
concentrações, obteve 69,67%, 58,50% e 51,67% de eclosão. Os extratos etanólico
bruto e acetato obtiveram 84,33%, 65,57% e 57,17% de eclosão para o primeiro e
85,17, 74 e 70% de eclosão para o segundo. Existiu diferença estatística entre NvpaEEB 1 e 2,5% e o controle (Figura 19).
68
Figura 19 – Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a eclosão dos ovos do
Bruto de N. variegata B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de
N. variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P<
0,05. Anova one way.
5.3.3.2.3. Índice de eficiência reprodutiva (IER)
As partes aéreas de N. variegata apresentou efeito sobre a reprodução
estimada
das
fêmeas
ingurgitadas,
principalmente
Nvpa-HEX,
apresentando
diminuição da reprodução estimada em 3604 na concentração de 25 mg/mL, quando
69
comparado ao grupo controle que apresentou RE de, para as concentrações de 5 e
10 mg/mL alcançou RE de 4829 e 4140, respectivamente. Nas mesmas
concentrações, Nvpa-EEB apresentou 7109, 5412e 4219, Nvpa-AcOEt 6963, 6162 e
6276 e Nv-CHCl3 6315, 5461 e 4656, respectivamente (Tabela 10).
Tabela 10 – Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a reprodução
estimada do carrapato R. (B.) microplus.
FRAÇÃO
EXTRATO
HEXANO
5
10
25
4829 ± 1890
4140 ± 1942
3604 ± 1914
CLOROFÓRMIO
5
10
25
6315 ± 2249
5461 ± 3254
4656 ± 2955
ACETATO DE
ETILA
5
10
25
6963 ± 1069
6162 ± 365,7
6276 ± 2571
ETANOL
5
10
25
7109 ± 722,2
5412 ± 1593
4219 ± 1356
CONTROLE 1
5221 ± 1,61
CONTROLE 2
4855 ± 3,25
5.3.3.2.4. Eficácia (EF)
As partes aéreas de N.variegata apresentaram efeito carrapaticida quando
comparados ao grupo controle. Nvpa-HEX apresentou os melhores resultados, sendo
que, na concentração de 5, 10 e 25 mg/mL, obteve-se 49,88%, 56,37% e 61,92% de
eficácia. Nas mesmas concentrações, observou-se 30,76%, 38,04% e 57,25 % para
Nvpa-EEB. Nvpa-CHCl3 apresentou eficácia similar as outras fases, obtendo 34,84%,
42,15% e 50,66%. Com menor eficácia Nvpa-AcOEt, obteve 27,86%, 36,19% e
34,42% para as mesmas concentrações.
70
Figura 20 – Eficácia do extrato das partes aéreas de N. variegata no controle do carrapato R.
(B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N.
variegata B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata
D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova
one way.
Para a inibição de ovipostura, Sc-EEB apresentou os melhores resultados entre
as fases testadas, observou-se 27,91%, 29,68% e 37,13% para as concentrações de
5, 10 e 25 mg/mL. O extrato acetato de S. convoluta (Sc-AcOEt) 0,5% também
apresentou baixa inibição, chegando a 18,97% de inibição da postura das fêmeas
ingurgitadas, ao aumentar a concentração para 1% e 2,5%, observou-se o aumento
da inibição para 20,66% e 30,94%, respectivamente. Nas doses de 50, 100 e 250
mg/mL foi possível observar uma inibição de 10,41%, 10,69% e 25,35% para extrato
hexânico de S. convoluta (Sc-HEX) e 12,03%, 16,02% e 19,03% para extrato
clorofórmico de S. convoluta (Sc-CHCl3) (Figura 21).
71
Figura 21 – Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a ovipostura do carrapato R.
(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de S.
convoluta B) Extrato Acetato de Etila de S. convoluta C) Extrato Clorofórmico de S. convoluta
D) Extrato Hexânico de S. convoluta. Valores são média ± E.P.M (n=10). *P< 0,05. Anova one
way.
Sc-EEB apresentou o maior controle na eclosão dos ovos quando comparado
ao grupo controle, chegando a apresentar uma eclosão de 50,70% na concentração
de 25 mg/mL e 63,93% e 57,97% para as concentrações de 5 e 10 mg/mL, houve
diferença significativa entre todas as concentrações de Sc-EEB e o controle.
Observou-se eclosão de 88,9%, 83,17%, 75,93% para Sc-HEX nas doses de 5, 10 e
25 mg/mL. Sc-AcOEt e Sc-CHCl3 apresentaram variação na diminuição da eclosão
72
com o aumento da concentração, demonstrando 84,93%, 86,53% e 79,43% para ScCHCl3 e 79,27%, 86,30% e 65,40 % para Sc-AcOEt (Figura 22)
Figura 22 – Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a eclosão dos ovos do
Bruto de S. convoluta B) Extrato Acetato de Etila de S. convoluta C) Extrato Clorofórmico de
S. convoluta D) Extrato Hexânico de S. convoluta. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P<
0,05. Anova one way.
Para a reprodução estimada, Sc-EEB apresentou melhor atividade em todas as
concentrações, tendo como resultado 4933, 4409 e 4329 para as concentrações de 5,
10 e 25 mg/ml. Sc-HEX apresentou RE de 8211, 7914 e 6963 para as mesmas
concentrações descritas acima. Sc-CHCl3 e Sc- AcOEt não apresentaram resposta
73
dose-dependente, obtendo dessa forma 7685, 7774 e 7132 e 7144, 7482 e 5425,
respectivamente.
Tabela 11 – Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a reprodução estimada do
carrapato R. (B.) microplus.
FRAÇÃO
EXTRATO
HEXANO
5
10
25
8211 ± 651,3
7914 ± 493,8
6963 ± 2414
CLOROFÓRMIO
5
10
25
7685 ± 724,2
7774 ± 269,4
7132 ± 1082
ACETATO DE
ETILA
5
10
25
7144 ± 544,8
7482 ± 1074
5425 ± 1149
ETANOL
5
10
25
4933 ± 936,3
4409 ± 1269
4329 ± 1187
CONTROLE 1
9560 ± 699,8
CONTROLE 2
9634 ± 569,3
Controle 1 (Apenas água); Controle 2 (Água + cremophor)
5.3.4.4. Eficácia (EF)
O extrato etanólico bruto de S. convoluta, apresentou o melhor efeito
carrapaticida dentre as frações dessa planta, obtendo 49,04%, 53,72% e 54,66% de
eficácia para 5, 10 e 25 mg/ml do extrato. Nas mesmas concentrações, obteve-se um
efeito 14,35%, 17,55% e 26,64% para Sc-HEX. Sc-CHCl3 e Sc-AcOEt não
apresentaram aumento da resposta com o aumento da dosagem, obtendo 19,83%,
19,04% e 25,5% de eficácia para a primeira e 25,75%, 22,10% e 43,24% para a
segunda.
74
Figura 23 – Eficácia do extrato das folhas de S. convoluta no controle do carrapato R. (B.)
microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de S. convoluta
B) Extrato Acetato de Etila de S. convoluta C) Extrato Clorofórmico de S. convoluta D) Extrato
Hexânico de S. convoluta. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.
75
5.3.5. Eficácia comparativa das plantas testadas
A eficácia das plantas testadas, frações e concentrações podem ser
visualizadas comparativamente na Tabela 12.
Tabela 12 – Eficácia comparativa entre as espécies A. cearensis, M. nigra, N. variegata, e S.
convoluta.
Extrato (mg/mL)
A. cearensis
(cascas)
M. nigra
(folhas)
N. variegata
(folhas)
N. variegata
(partes aéreas)
S. convoluta
(folhas)
Hexano
5
22,7 ± 14
20,5 ± 15,21
37,63 ± 11,84
49,88 ± 21,09
14,35 ± 11,41
10
34,7 ± 22
37,09 ± 16,84 78,07 ± 16,33
56,37 ± 22,09
17,55 ± 8,72
25
66,9 ± 38,6
42,10 ± 13,02
99,81 ± 0,32
61,92 ± 21,43
26,64 ± 28,92
5
6,5 ± 6,7
9,15 ± 14,96
38,42 ± 26,47
34,84 ± 24,07
19,83 ± 11,49
10
27,5 ± 12,5
35,57 ± 10,12 61,07 ± 20,35
42,15 ± 36,03
19,04 ± 7,03
25
35,8 ± 4,5
65,44 ± 41,86 61,80 ± 37,99
50,66 ± 32,43
25,5 ± 14,29
5
20,21 ± 23,86
22,68 ± 11,33 40,30 ± 18,33
27,86 ± 14,93
25,75 ± 5,99
10
27,66 ± 18,98
31,10 ± 12,34 38,38 ± 29,80
36,19 ± 7,62
22,10 ± 13,00
25
43,98 ± 20,85
28,37 ± 27,05 40,38 ± 19,89
34,42 ± 29,28
43,24 ± 14,13
23,55 ± 7,87
33,91 ± 8,040
30,76 ± 9,10
49,04 ± 6,69
Clorofórmio
Acetato de etila
Etanol
5
20 ± 22,58,
10
21,78 ± 1505
11,12 ± 2,54
54,83 ± 23,76
38,04 ± 14,92
53,77 ± 15,44
25
52,03 ± 23,36
22,57 ± 3,49
92,55 ± 1,742
57,25 ± 13,03
54,66 ± 14,47
76
6. DISCUSSÃO
77
6. DISCUSSÃO
A partir dos dados obtidos na triagem fitoquímica foi possível identificar que os
flavonoides e taninos foram os constituintes que estavam em maior quantidade em
todas as plantas analisadas. Os flavonoides compõem uma classe de substâncias de
origem natural com extensa diversidade estrutural, e atualmente já foram identificadas
mais de nove mil substâncias pertencentes a este grupo (MARTENS; MITHOFER,
2005).
O extrato etanólico bruto das cascas de A. cearensis apresentou reação
positiva para fenóis, flavonoides, esteroides, e reação negativa para alcalóides.
Quimicamente, a casca do caule de A. cearensis é basicamente constituída de
cumarinas, responsável pelo seu odor peculiar, e também dos flavonoides
isocampferídeo, campferol e afrormosina (BRAVO et al., 1999). Estudos recentes
revelaram que a cumarina, o isocampferídeo e o amburosídio A possuem efeitos antiinflamatório, antioxidante e broncodilatador, sendo indicados como princípios ativos
da planta (LEAL et al., 2005).
Nas folhas de M. nigra foi possível identificar a presença de praticamente todos
os metabólitos secundários no extrato e suas frações, havendo maior ou menor
proporção de acordo com a polaridade dos compostos. Estudos realizados por Song
et al. (2009) confirmaram a presença de flavonoides, compostos fenólicos,
antocianinas e alcaloides nas folhas e frutos de plantas do gênero Morus.
Como esperado, fenóis foram encontrados nas folhas e partes aéreas de N.
variegata. Entre os compostos fenólicos, os flavonoides e taninos estavam em maior
quantidade. Estes resultados estão de acordo com as principais classes de
metabólitos secundários encontrados na família Bromeliaceae (MANNETI et al.,
2009).
O extrato etanólico bruto de S. convoluta apresentou reação positiva para a
presença de fenóis, taninos, flavonoides e esteroides. Não foi constatada no EEB a
78
presença de alcaloides. Os flavonoides também são os principais constituintes
químicos da família Selaginellaceae. Entre eles destacam-se os biflavonoides,
dímeros de flavonoides, cuja função na planta é agir como antifúngico ou alimento
dissuasivo para insetos, além de protegerem contra os raios ultravioletas que incidem
principalmente sobre as folhas (SIMÕES et al., 2004).
Os dados da análise fitoquímica preliminar foram corroborados com os
resultados obtidos através da análise por cromatografia líquida de alta eficiência com
detecção de díodos (CLAE-DAD), que constitui uma técnica essencial e viável para a
caracterização de compostos fenólicos, devido a sua versatilidade, precisão e custo
relativamente baixo. Com base nas suas UV-Vis, dados espectrais e seu tempo de
retenção, os compostos isolados apresentaram as seguintes características de faixa:
flavonoides para Ac-EEB e Sc-EEB; compostos fenólicos, ácido cinâmico ou
derivados da flavonona para Mn-EEB; e ácido cinâmico, cumarinas ou flavonoides
para Nv-EEB. Todos esses compostos estão sob investigação, porém dados na
literatura mostram que o biflavonoide amentoflavona é o principal constituinte de
vários extratos de espécies de Selaginella (MA et al., 2001).
Esse é o primeiro trabalho que avaliou a atividade acaricida em A. cearensis,
M. nigra, N. variegata e S. convoluta. É mais provável encontrar atividade biológica
em plantas orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantas
escolhidas ao acaso (PIVOTO et al., 2010). Porém, as espécies estudadas nesse
trabalho foram selecionadas por serem abundantes no bioma caatinga e também por
possuírem classes de substâncias, que podem ser inéditas quanto ao efeito acaricida.
No sentindo de localizar os princípios ativos com ação acaricida, os
extratos brutos das plantas foram particionados (FILHO; YUNES, 1998) e avaliados
através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas. Esse teste tem sido utilizado
para detectar a resistência dos acaricidas, e nos últimos anos têm sido amplamente
empregado para avaliar a eficácia dos fitoterápicos.
Nos testes de imersão, as cascas de Amburana cearensis (FABACEAE),
apresentou eficácia de 66,68% para a fração hexânica (2,5%), sendo essa fração
responsável pelos melhores resultados da planta em todos os parâmetros avaliados.
A. cearensis não apresentou mortalidade direta sobre as fêmeas ingurgitadas em
79
nenhuma das suas frações, porém a fração hexânica reduziu a ovipostura (52,73%) e
principalmente a eclosão dos ovos (39%), apresentando efeito acaricida parcial sobre
a fertilidade das fêmeas. Resultados semelhantes foram obtidos por Monteiro et al.
(2010) ao pesquisarem o efeito do monoterpeno timol sobre as fêmeas ingurgitadas
de R. (B.) microplus, onde observaram que o percentual de eclosão foi mais baixo que
os valores dos controles. No entanto, quando os ovos foram tratados diretamente, o
timol 2% não afetou significantemente este parâmetro, dessa forma, pode-se inferir
que o timol não tinha uma ação deletéria direta na incubação dos ovos.
Para a M. nigra, a fração clorofórmica obteve resultados semelhantes à fração
hexânica de A. cearensis, alcançando 62,61% de eficácia e apresentando ação
acaricida, tanto na fertilidade das fêmeas como na viabilidade dos ovos. A
porcentagem de eclosão foi de apenas 39,33% e a inibição da oviposição atingiu
62,61%.
Foram avaliadas as folhas e partes aéreas de N. variegata, sendo que ambas
obtiveram os seus melhores resultados na fração hexânica. O extrato hexânico de
suas partes aéreas não apresentou mortalidade direta sobre R. (B.) microplus, porém
apresentou um baixo efeito sobre a ovipostura (46,57%), e em sua maior
concentração (25 mg/mL) sobre a porcentagem de eclosão (42,5%), demonstrando
que esse extrato possui pequena ação sobre o carrapato bovino, com eficácia de
apenas 42,5%. Apesar das folhas e partes aéreas apresentarem uma triagem
fitoquímica semelhante, o efeito acaricida das folhas de N. variegata foi bem mais
acentuado, sua fração hexânica teve ação direta sobre as fêmeas ingurgitadas,
apresentando mortalidade superior a 90% e inibindo a ovipostura em 94,14%, em
comparação ao controle. Além do forte efeito na oviposição, o extrato hexânico das
folhas inviabilizou os ovos, apresentando um percentual de eclosão de apenas 0,33%
e alcançando a melhor eficácia (99,81%) entre todas as plantas avaliadas nesse
estudo. Catto, Bianchini e Satio (2009) relataram que pode existir diferentes níveis de
atividade entre as diferentes partes da planta, devido a presença ou não do composto
ativo. No caso de N. variegata, possivelmente as folhas possuem maior quantidade
das substâncias acaricidas ativas, quando comparada às partes aéreas.
80
O extrato bruto e as frações das folhas de S. convoluta não apresentaram
mortalidade direta sobre as fêmeas ingurgitadas. A ação mais evidente em todas as
frações foi sobre a ovipostura, atingindo inibição máxima (37,13%) com o extrato
etanólico bruto (2,5%). Borges et al. (2003), trabalhando com extrato de Melia
azedarach (Meliaceae) (cinamomo) a 0,25%, observaram, in vitro, a inibição total da
oviposição de fêmeas ingurgitadas imersas em extrato bruto de frutos maduros,
extraídos com diferentes solventes, sendo que o extrato não inviabilizou as fêmeas
adultas, mas inibiu total ou parcialmente a produção de ovos e a embriogênese.
O diluente utilizado na solubilização do extrato tem importância significativa,
uma vez que pode potencializar a eficácia do extrato ou não (PIVOTO et al., 2010).
Os solventes de baixo peso molecular e com pouca viscosidade são preferíveis para
os testes de imersão (CHAGAS et al., 2012). No presente trabalho, a água foi
utilizada como diluente, e para as substâncias insolúveis em água foi adicionado o
surfactante cremophor. Não existem dados na literatura que relatem o efeito do
cremophor sobre as fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus, porém não houve
diferença significativa entre os grupos controle 1 (água) e controle 2 (água e
cremophor), avaliados nesse estudo.
A. cearensis e N. variegata apresentaram maior atividade acaricida nos
extratos hexânicos. Esses resultados foram semelhantes ao estudo de RosadoAguilar et al. (2010), que por meio de extrato bruto geraram partições, a fim de avaliar
o perfil metabólico de Petiveria alliacea (raiz-de-guiné). A fração hexânica de P.
alliacea obteve maior eficácia contra larvas de R. (B.) microplus. Com esse resultado,
e levando-se em consideração a utilização de solventes de polaridade crescente na
coluna cromatográfica, foi possível identificar que a ação carrapaticida estava entre os
compostos apolares da planta.
Embora M. nigra tenha apresentado o melhor efeito na fase clorofórmica, seus
resultados continuam de acordo com os relatados na literatura, uma vez que essa
fase apresenta tendência a possuir compostos mais apolares.
No extrato apolar podem ser encontradas substâncias como esteroides,
terpenos, acetofenonas, agliconas, ceras, sapogeninas, iridoides e sesquiterpenos,
81
substâncias
altamente
lipofílicas
(CECHINEL;
YUNES,
1998;
CANTRELL;
FRANZBLAU; FISCHER, 2001; SONAGLIO et al., 2010). Os terpenos são relatados
na literatura por possuírem ação acaricida, sendo por isso alvo de vários estudos.
Essa classe de metabólitos abrangem uma grande variedade de substâncias de
origem vegetal e sua importância ecológica como defensivos já está bem
estabelecido. Vários monoterpenos foram isolados e avaliados quanto à toxicidade
frente a diferentes insetos e artrópodes (VIEGAS JUNIOR, 2003)
Em contrapartida, os extratos de S. convoluta apresentaram os melhores
efeitos nas frações polares (EEB e acetato). As plantas podem apresentar diferentes
metabólitos secundários (CECHINEL; YUNES, 1998), que mesmo em pequenas
proporções podem impedir a atividade de outros compostos bioativos ou apresentar
sinergismo com substâncias que sozinhas não produziriam atividade, ou até mesmo
ser a fração mais eficaz (PONTES et al., 2007). Essas interações poderiam justificar
os diferentes resultados de eficácia obtidos no presente estudo.
A portaria nº 48, de 12 de maio de 1997, da Secretaria de Defesa
Agropecuária, que aprova o Regulamento Técnico para Licenciamento e/ou
Renovação de Licença de Produtos Antiparasitários de Uso Veterinário, determinou
que no Teste de Eficácia para Carrapaticidas, o produto deve apresentar uma eficácia
de no mínimo 95% para obter a aprovação (BRASIL, 1997). Os dados aqui
apresentados mostram que apenas o extrato hexânico das folhas de N. variegata
(2,5%) poderia ser utilizado no controle de R.(B.) microplus. Domingues et al., 2013,
avaliaram o efeito acaricida do abacaxi (Ananas comosus), uma bromeliaceae
amplamente cultivada em regiões tropicais e subtropicais. Além do extrato aquoso da
planta foi avaliado a bromelina isolada, obtendo eficácia máxima de 59% para o
extrato aquoso e 55% para a bromelina na concentração de 500 mg/mL. Mesmo
utilizando o dobro da concentração, os resultados foram muito inferiores quando
comparados com as folhas de Nv-HEX.
O extrato hexânico das folhas de N. variegata em baixas concentrações,
mostrou eficácia superior a uma variedade de agentes sintéticos e extratos naturais
relatados na literatura. Olivo et al. (2008) observaram que ao testar várias
concentrações do óleo de citronela (Cymbopogon nardus), obteve eficácia de 89,5%
82
para a maior concentração (100%). O mesmo atribuiu essa ação ao princípio ativo
citronelal, que possui atividade inseticida e acaricida (CHAGAS et al., 2002). Outro
metabólito muito estudado é a azadiractina, presente no “neem”, conhecido por seu
forte poder inseticida, entretanto, um estudo realizado por Broglio-Micheletti et al.
(2010), mostrou eficácia de 73,2% para o extrato hexânico (2%) das suas sementes.
Nossos resultados comprovam o potencial carrapaticida de espécies de plantas
da Caatinga, o que poderá contribuir para as políticas de conservação e manejo
adequado dessas espécies, visto que, além do potencial econômico, elas podem vir a
ser exploradas como fontes de novas substâncias biologicamente ativas.
83
7. CONCLUSÕES
84
7. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:
- No estudo comparativo das plantas, as frações hexânicas, apresentaram os
melhores resultados, sugerindo que a atividade carrapaticida seja proveniente de
moléculas com características apolares.
- Todos os extratos e frações apresentaram controle parcial sobre o R.(B.)
microplus, porém apenas a fração hexânica de N. variegata (2,5%) apresentou
eficiência superior a 95%, sendo considerado um excelente carrapaticida. No entanto,
mais estudos são necessários para a melhor elucidação do mecanismo de ação e dos
bioativos que produzem esse efeito.
Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para as
espécies em estudo, dessa forma uma importante contribuição foi dada para a
farmacologia de plantas do Bioma Caatinga.
85
8. REFERÊNCIAS
86
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ANEXOS
98
ANEXO A – Carta de submissão do artigo
99
ANEXO B – Aprovação do comitê de ética
100

(Boophilus) microplus - Pós-graduação em Recursos Naturais do

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