18 universidade do sul de santa catarina carla antunes

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18
UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
CARLA ANTUNES PETERS
PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA DE
NANOCÁPSULAS CONTENDO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata
Tubarão
2012
CARLA ANTUNES PETERS
PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA DE
NANOCÁPSULAS CONTENDO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Ciências da Saúde, da
Universidade do Sul de Santa Catarina,
como requisito para obtenção do título de
Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Luiz Alberto Kanis, Dr.
Co-orientadora: Profa. Irene Clemes Külkamp Guerreiro, Dra.
Co-orientador: Prof. Rodrigo Rebelo Peters, Dr.
Tubarão
2012
Peters, Carla Antunes, 1985P57
Produção e avaliação da atividade anti-inflamatória tópica de
nanocápsulas contendo extrato de Wilbrandia ebracteata / Carla
Antunes Peters ; orientador: Luiz Alberto Kanis ; co-orientadora:
Irena Clemes Külkamp Guerreiro ; co-orientador: Rodrigo Rebelo
Peters. -- 2012.
114 f. : il. Color. ; 30 cm
Dissertação (mestrado)–Universidade do Sul de Santa Catarina,
Tubarão, 2012
Inclui bibliografias
1. Plantas medicinais. 2. Matéria médica vegetal. 3. Agentes
anti-inflamatórios. 4. Nanotecnologia. 5. Farmacologia. I. Kanis,
Luiz Alberto. II. Guerreiro, Irena Clemes Külkamp. III. Peters,
Rodrigo Rebelo. IV. Universidade do Sul de Santa Catarina Mestrado em Ciências da Saúde. V. Título.
CDD (21. ed.) 615.32
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária da Unisul
Ao meu esposo Giovane pelo amor
dedicado, suporte, incentivo, paciência,
compreensão e maravilhoso bom humor
que sempre salva os meus dias difíceis!!!
Aos meus pais Catarina e José Carlos
por terem me educado com tanto amor e
carinho, pelo apoio e incentivo eternos e
por serem os responsáveis pela pessoa
que sou hoje. Amo vocês.
Aos meus amigos Luiz e Rodrigo que
são meus verdadeiros tutores desde o
início da minha formação acadêmica, me
guiando, apoiando e incentivando pelos
caminhos da nossa linda profissão e nos
quais sempre procuro me espelhar.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Dr. Luiz Alberto Kanis, por esta orientação e por todas
as outras desde a iniciação científica. Agradeço também pelo tempo dedicado, pela
compreensão e pelo humor.
Ao prof. Dr. Rodrigo Rebelo Peters, pela disponibilidade de orientação na
parte farmacológica independente do horário!
À profa. Dra. Irene Clemes Külkamp Guerreiro e à Mari, pelo auxílio com
os testes realizados na UFRGS.
À profa. Dra. Karina Remor, pela orientação nos teses com ratos, bem
como à sua orientanda Luise, pelo auxílio na realização destes estudos.
Ao acadêmico Erlon, pela grande ajuda com os experimentos, mesmo nas
férias de verão!
Ao Diego e ao Moisés, pelo grande apoio nos testes realizados.
Ao farmacêutico Rodrigo, coordenador dos laboratórios da saúde, pela
atenção e pelo apoio durante os experimentos realizados nos laboratórios.
À família do meu esposo, pela compreensão nas ausências e pelo apoio.
Aos professores e aos meus colegas do Programa de Mestrado em
Ciências da Saúde, pela troca de experiências e pela amizade.
À Silvane e à Fram, por toda a ajuda durante o curso.
Ao Programa de Mestrado e a sua coordenadora Dra. Rosemeri Maurici
da Silva – “Foi um prazer inenarrável!”.
Às minhas amigas e amigos, pela compreensão nas ausências e pelo
incentivo.
À minha gerente e amiga Deise, pela compreensão nos momentos em que
tive de me ausentar devido aos experimentos e pelo apoio nos momentos difíceis.
Aos meus colegas de trabalho, “-Marias” e “-Josés”, pelo incentivo e pela
amizade!
À Austen Farmacêutica, por ter investido na minha formação, apoiando
financeiramente o curso e custeando todo o projeto juntamente com o Grupo de
Desenvolvimento em Tecnologia Farmacêutica (TECFARMA) e com o apoio da
FINEP, sem os quais não seria possível a realização deste Mestrado.
A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização
deste projeto. Obrigada!
RESUMO
A Wilbrandia ebracteata (Taiuiá) é uma planta medicinal brasileira conhecida por
seus efeitos terapêuticos no tratamento de reumatismos, úlceras, gastrites,
constipações e febre. Muitos estudos químicos e farmacológicos com esta planta
demonstraram que extratos obtidos das raízes da W. ebracteata possuem
flavonóides e cucurbitacinas, que podem ser os principais responsáveis pela sua
atividade anti-inflamatória. Com o advento da nanotecnologia na área farmacêutica,
é possível modificar uma resposta terapêutica de ativos isolados ou de extratos,
desta forma o objetivo deste trabalho foi validar uma metodologia analítica para a
quantificação de flavonóides no extrato de W. ebracteata, desenvolver nanocápsulas
de extrato de W. ebracteata padronizado em flavonóides e cucurbitacinas, e avaliar
a atividade anti-inflamatória por via tópica. Foi estabelecida e validada uma
metodologia analítica para o rápido doseamento de vitexina e isovitexina no extrato
de W. ebracteata por CLAE, na presença ou não de nanocápsulas de poli(εcaprolactona) (PCL). As condições cromatográficas estabelecidas foram: coluna:
C18 – partícula 2,4 µm – tamanho 100 x 4.6 mm, eluentes: ácido fórmico 0,67 % e
metanol (68:32), fluxo de 1,1 mL/min., temperatura de 40 oC e detecção em 330 nm.
A metodologia validada mostrou-se seletiva para detecção de vitexina e isovitexina,
com picos completamente separados e de simetria aceitável, sendo obtidos valores
de pratos teóricos superiores a 6000. Esta metodologia foi considerada linear,
precisa (CV = 1,91 % e 1,84 % para vitexina e isovitexina, respectivamente), exata
(99,65 % e 101,34 %, 101,47 % e 99,35 % para vitexina e isovitexina no extrato de
W. ebracteata (EWE) e na presença de nanocápsulas, respectivamente) e robusta
para as variações de temperatura de 39 a 40 °C e de fluxo de 1,1 a 1,13 mL/min.
Foram identificados e quantificados no EWE os flavonóides vitexina e isovitexina e
as cucurbitacinas dihidrocucurbitacina B e cucurbitacina B, sendo que o extrato rico
em flavonóides contém aproximadamente 10 % de sua massa em isovitexina e
vitexina e 0,3 % de dihidrocucurbitacina B. As análises de polidispersão e de
tamanho de partícula das nanocápsulas de PCL e triglicerídeos de ácido cáprico e
caprílico (TGL) produzidas foram avaliadas por difratometria de laser com diâmetros
médios (D[4,3]) de 130 nm a 186 nm. Os resultados de atividade anti-inflamatória
demonstraram que o EWE puro e nanoencapsulado (NEWE) apresentam atividade
antiedematogênica aguda para o modelo avaliado em camundongos. Os estudos
também indicaram que a nanoencapsulação do EWE não melhorou a resposta
terapêutica aguda do EWE, para os modelos avaliados. Nos estudos de atividade
anti-inflamatória crônica em camundongos as nanocápsulas apresentaram um efeito
edematogênico que pode ser atribuído à elevada concentração de tensoativos das
suspensões. Ainda, através do estudo de irritação primária de pele, o EWE e NEWE
não foram consideradas substâncias irritantes.
Palavras-chave: Atividade anti-inflamatória. Cucurbitacina B. Dihidrocucurbitacina B.
Isovitexina. Nanocápsulas. Vitexina. Wilbrandia ebracteata.
ABSTRACT
The Wilbrandia ebracteata (Taiuiá) is a Brazilian medicinal plant known for its
therapeutic effects in treating rheumatism, ulcers, gastritis, constipation and fever.
Many chemical and pharmacological studies with this plant have shown that roots
extracts of the W. ebracteata have flavonoids and cucurbitacines, which may be
primarily responsible for its anti-inflammatory activity. With the advent of
nanotechnology in the pharmaceutical area, it is possible to modify a therapeutic
response of isolated actives and extracts, thus the objective of this study was to
validate an analytical methodology for quantification of flavonoids in the W.
ebracteata extract, obtain nanocapsules of W. ebracteata extract cucurbitacines and
flavonoids standardized and evaluating its topical anti-inflammatory activity.
An
analytical methodology have been developed and validated for the simultaneous
assay of vitexin and isovitexin in W. ebracteata extract by HPLC in the presence or
absence of nanocapsules of poli(ε-caprolactone) (PCL). The chromatographic
conditions were set: column: C18 – particle 2.4 µm – 100 x 4.6 mm size, eluents:
0,67 % formic acid and methanol (69:32), flow: 1.1 mL/min., temperature: 40 °C and
detection at 330 nm. The methodology was validated and shown selective detection
for vitexin and isovitexin, with peaks of acceptable symmetry and completely
separated for these flavonoids, obtaining values of theorical plates above 6000. This
approach was considered linear, accurate (CV = 1.91% and 1.84% to vitexin and
isovitexin, respectively) and robust to variations in temperature 39 - 40 °C and flow
from 1.1 to 1.13 mL/min., with accuracy of 99.65%, 101.34%, 101.47% and 99.35%
for vitexin and isovitexin in the W. ebracteata extract (EWE) and in the presence of
nanocapsules, respectively. The flavonoids vitexin and isovitexin and the
dihidrocucurbitacin B and cucurbitacin B were identified and quantified in EWE, and
this extract rich in flavonoids (approximately 10% of its mass). Analyzes of
polydispersity and particle size of the nanocapsules PCL and triglycerides of capric
and caprylic (TGL) compounds were evaluated by laser diffractometry with average
diameter (D[4.3]) of 130 nm to 186 nm. The results of the anti-inflammatory activity
showed that pure EWE and nanoencapsuled EWE (NEWE) have antiedematogenic
activity in the acute model evaluated in mice. The studies also indicated that the
nanoencapsulation of EWE did not improve the EWE therapeutic response, for the
acute model evaluated. In chronic studies of anti-inflammatory activity in mice the
nanocapsules showed an edematogenic effects that can be attributed to the
surfactant concentration of the suspensions. The model to evaluated the primary skin
irritation of acute effect, showed that the EWE and NEWE were not irritants.
Keywords: Anti-inflammatory. Cucurbitacin B. Dihidrocucurbitacin B. Isovitexin.
Nanocapsules. Vitexin. Wilbrandia ebracteata.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Principais fontes que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários nas plantas ........................................................................................... 23
Figura 2 – Determinação dos parâmetros para o cálculo da resolução ................... 25
Figura 3 – Determinação dos parâmetros para o cálculo do fator de cauda ............ 26
Figura 4 – Determinação dos parâmetros para o cálculo dos pratos teóricos .......... 27
Figura 5 – Representação do esqueleto básico de flavonóides C-glicosídeos,
mostrando os três anéis, sendo dois, anéis aromáticos ........................................... 35
Figura 6 – Esqueleto cucurbitano destacando uma molécula de isopreno à direita . 35
Figura 7 – Representação da escala nanométrica ................................................... 37
Figura 8 – Representação da estrutura de nanoemulsão, nanoesfera e nanocápsula
................................................................................................................................. 39
Figura 9 – Representação do sistema de liberação de fármacos por difusão .......... 42
Figura 10 – Representação do sistema de liberação de fármacos por erosão ou
destruição da cápsula .............................................................................................. 42
Figura 11 – Representação da pele e suas camadas mais externas. Evidenciadas
algumas camadas da epiderme ............................................................................... 45
Figura 12 – Representação da ação nanocarreadora das nanopartículas pela via
transdérmica. Fármaco representado pelas esferas vermelhas e nanopartículas
representadas pelos círculos azuis .......................................................................... 46
Figura 13 – Método de precipitação de polímero pré-formado ................................. 59
Figura 14 – Delineamento dos estudos in vivo com camundongos.......................... 63
Figura 15 – Delineamento do estudo crônico ........................................................... 65
Figura 16 – Picos de vitexina e isovitexina em corridas cromatográficas de uma
solução contendo os dois padrões em comparação às corridas do EWE e do EWE
acrescido de nanocápsulas vazias ........................................................................... 68
Figura 17 – Curva analítica da vitexina .................................................................... 72
Figura 18 – Curva analítica da isovitexina ................................................................ 72
Figura 19 – Gráfico de resíduos para a curva analítica da vitexina .......................... 73
Figura 20 – Gráfico de resíduos para a curva analítica da isovitexina ..................... 73
Figura 21 – Corridas cromatográficas dos padrões sobrepostas para análise de
precisão do método .................................................................................................. 75
Figura 22 – Imagem do EWE ................................................................................... 78
Figura 23 – Perfil cromatográfico em 330 nm do EWE frente à vitexina e isovitexina
................................................................................................................................. 79
Figura 24 – Perfil cromatográfico do EWE obtido em 230 nm .................................. 80
Quadro 1 – Estruturas químicas de vitexina, isovitexina e dihidrocucurbitacina B com
os seus respectivos LogP e solubilidade em água calculados. ................................ 84
Figura 25 – Curva de distribuição granulométrica referente ao volume da suspensão
de nanocápsulas vazias (NV) ................................................................................... 85
NEWE 0,24 % .......................................................................................................... 85
NEWE 2,4 % ............................................................................................................ 86
Figura 28 – Efeito do tratamento tópico do EWE a 2,4 % e do NEWE 2,4 % em
edema de orelha agudo induzido por óleo de cróton em camundongos mostrando o
edema resultante após 4 h e após 6 h da aplicação do agente flogístico, com o erro
padrão ...................................................................................................................... 89
Figura 29 – Resultados da avaliação do edema de orelha de camundongos induzido
por óleo de cróton após tratamento prévio de 5 dias. .............................................. 91
Figura 30 – Efeito do EWE a 2,4 % e do NEWE 2,4 % em edema de orelha crônico
induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton em camundongos mostrando a
curva tempo-resposta do efeito durante 9 dias. ....................................................... 93
Figura 31 – Imagem comparativa das orelhas dos camundongos no 9° dia do estudo
crônico ...................................................................................................................... 95
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Condições cromatográficas .................................................................... 50
Tabela 2 – Preparo das soluções teste para eficiência do método .......................... 51
Tabela 3 – Preparo das soluções padrão de vitexina para linearidade .................... 52
Tabela 4 – Preparo das soluções padrão de isovitexina para linearidade ............... 53
Tabela 5 – Preparo das soluções teste e controle para exatidão ............................. 54
Tabela 6 – Preparo das soluções teste e controle para exatidão com nanocápsulas
................................................................................................................................. 55
Tabela 7 – Condições cromatográficas para o doseamento de cucurbitacinas ....... 57
Tabela 8 – Equação de reta para dihidrocucurbitacina B ......................................... 58
Tabela 9 – Composição das nanocápsulas preparadas ........................................... 59
Tabela 10 – Avaliação da irritação cutânea ............................................................. 66
Tabela 11 – Classificação da substância irritante .................................................... 67
Tabela 12 – Resultados de eficiência para vitexina ................................................. 69
Tabela 13 – Resultados de eficiência para isovitexina ............................................. 70
Tabela 14 – Resultados de precisão ........................................................................ 74
Tabela 15 – Resultados de exatidão para doseamento de vitexina e isovitexina no
EWE ......................................................................................................................... 75
EWE na presença de nanocápsulas ........................................................................ 76
Tabela 17 – Efeito de variação de fluxo para doseamento de vitexina e isovitexina no
EWE ......................................................................................................................... 77
Tabela 18 – Efeito de variação de temperatura para doseamento de vitexina e
isovitexina no EWE .................................................................................................. 77
Tabela 19 – Teor de vitexina, isovitexina, cucurbitacina B e dihidrocucurbitacina B no
EWE ......................................................................................................................... 80
Tabela 20 – Eficiência de encapsulação do EWE .................................................... 81
Tabela 21 – Resultados de análise granulométrica referente à faixa de distribuição
de volume ................................................................................................................. 86
de número de partículas ........................................................................................... 87
Tabela 23 – Resultados de irritação primária de pele em ratos para NEWE 2,4 % e
EWE 2,4 % (n = 8), apresentando os resultados do controle (acetona, n = 3) ......... 97
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico
AINES – Anti-inflamatórios Não Esteroidais
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COX – Ciclooxigenase
COX-1 – Ciclooxigenase 1
COX-2 – Ciclooxigenase 2
CV – Coeficiente de Variação
DAD – Diode Array Detector
DP – Desvio Padrão
E – Exatidão
E – Encapsulação
EROs – Espécies reativas de oxigênio
EWE – Extrato de Wilbrandia ebracteata
LOX – Lipoxigenase
LogP – Logarítimo do coeficiente de partição óleo/água
M – Média
N – Pratos teóricos
NEWE – Extrato de Wilbrandia ebracteata Nanoencapsulado
Nm – Nanômetros
NO – Óxido Nítrico
NV – Nanocápsulas Vazias
NV CONC – Nanocápsulas vazias concentradas
PACA – Polialquil Cianoacrilato
PCL – Poli є-caprolactona
PEG – Polietilenoglicol
PLA – Poliácido Láctico
PLA2 – Enzima Fosfolipase A2
PLGA – Poli Ácido Láctico-co-ácido-glicólico
R – Coeficiente de Correlação
RE – Resolução Executiva
Rs – Resolução
RT – Tempo de Retenção
SEI – Solução Estoque de padrão de isovitexina
SEV – Solução Estoque de padrão de vitexina
SEWE – Solução Estoque de EWE
SMD – Solução Mãe para diluição
T – Fator de Cauda
TGL – Triglicerídeos
US-FDA – Food and Drug Administration - United States
W – Wilbrandia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 19
2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 22
3.1 FITOTERÁPICOS .............................................................................................. 22
3.2 EXTRATOS VEGETAIS ..................................................................................... 22
3.3 VALIDAÇÃO ....................................................................................................... 24
3.3.1 Eficiência do método .................................................................................... 24
3.3.1.1 Tempo de retenção – RT.............................................................................. 24
3.3.1.2 Resolução – Rs ............................................................................................ 25
3.3.1.3 Fator de cauda – T ....................................................................................... 26
3.3.1.4 Pratos teóricos – N ....................................................................................... 27
3.3.2 Seletividade ................................................................................................... 28
3.3.3 Linearidade .................................................................................................... 28
3.3.4 Precisão ......................................................................................................... 29
3.3.5 Exatidão ......................................................................................................... 29
3.3.6 Robustez ........................................................................................................ 29
3.4 INFLAMAÇÃO .................................................................................................... 30
3.4.1 Agentes anti-inflamatórios ........................................................................... 31
3.4.1.1 Anti-inflamatórios não esteroidais – AINES .................................................. 32
3.4.1.2 Anti-inflamatórios hormonais – glicocorticóides ............................................ 33
3.4.1.3 Anti-inflamatórios fitoterápicos ..................................................................... 33
3.5 Wilbrandia ebracteata ........................................................................................ 34
3.6 NANOTECNOLOGIA ......................................................................................... 36
3.6.1 Nanotecnologia farmacêutica ...................................................................... 38
3.6.2 Principais nanoestruturas utilizadas na área farmacêutica ...................... 39
3.6.2.1 Nanoemulsões ............................................................................................. 39
3.6.2.2 Nanoesferas ................................................................................................. 40
3.6.2.3 Nanocápsulas ............................................................................................... 40
3.6.3 Polímeros utilizados na preparação de nanocápsulas .............................. 41
3.6.4 Metodologias utilizadas na preparação de nanocápsulas......................... 43
3.6.5 Nanotecnologia aplicada a sistemas transdérmicos ................................. 44
3.6.5.1 Nanotecnologia aplicada no tratamento de processos inflamatórios por via
transdérmica............................................................................................................. 47
4 OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 48
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 48
5 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 49
5.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata (EWE) .......................... 49
5.2 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DOSEAMENTO DE
VITEXINA E ISOVITEXINA EM EWE E NO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata
NANOENCAPSULADO (NEWE) POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA - CLAE ................................................................................................. 49
5.2.1 Método analítico ............................................................................................ 49
5.2.2 Soluções estoque .......................................................................................... 50
5.2.4 Seletividade para vitexina e isovitexina em EWE e em NEWE .................. 52
5.2.5 Linearidade .................................................................................................... 52
5.2.6 Precisão ......................................................................................................... 53
5.2.7 Exatidão ......................................................................................................... 53
5.2.8 Exatidão na presença de nanocápsulas...................................................... 54
5.2.9 Robustez ........................................................................................................ 55
5.3 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata - EWE ............. 56
5.3.1 Perfil cromatográfico do EWE ...................................................................... 56
5.3.2 Teor de vitexina e de isovitexina ................................................................. 56
5.3.3 Teor de cucurbitacina B e de dihidrocucurbitacina B................................ 56
5.3.4 Perda por dessecação .................................................................................. 58
5.4 DESENVOLVIMENTO DAS NANOCÁPSULAS ................................................. 58
5.4.1 Técnica de produção de nanocápsulas por nanoprecipitação de polímero
pré-formado ............................................................................................................ 58
5.5 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS.................................................... 60
5.5.1 Eficiência de nanoencapsulação ................................................................. 60
5.5.2 Determinação de tamanho de partícula por difratometria de laser........... 61
5.6 TESTES IN VIVO ............................................................................................... 62
5.6.1 Aspectos éticos ............................................................................................. 62
5.6.2 Animais .......................................................................................................... 62
5.6.3 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo utilizando modelos de
edema de orelha ..................................................................................................... 63
5.6.3.1 Delineamento experimental .......................................................................... 63
5.6.3.2 Modelo de avaliação do edema de orelha induzido pela aplicação tópica de
óleo de cróton........................................................................................................... 64
5.6.3.3 Modelo de inflamação crônica por edema de orelha induzido pela aplicação
múltipla do óleo de cróton ........................................................................................ 64
5.6.3.4 Análise dos resultados ................................................................................. 65
5.6.4 Avaliação da irritação primária de pele: efeito agudo em ratos ................ 65
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 68
VITEXINA E ISOVITEXINA EM EWE E NEWE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIÊNCIA - CLAE ................................................................................. 68
6.1.1 Seletividade ................................................................................................... 68
6.1.3 Linearidade .................................................................................................... 71
6.1.4 Precisão ......................................................................................................... 74
6.1.5 Exatidão ......................................................................................................... 75
6.1.6 Exatidão em presença de nanocápsulas..................................................... 76
6.1.7 Robustez ........................................................................................................ 77
6.2 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata - EWE ............. 78
6.3 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS.................................................... 81
6.3.1 Eficiência de encapsulação .......................................................................... 81
6.3.2 Determinação de tamanho de partícula por difratometria de laser........... 85
6.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO UTILIZANDO
MODELOS DE EDEMA DE ORELHA ...................................................................... 88
6.5 AVALIAÇÃO DA IRRITAÇÃO PRIMÁRIA DE PELE: EFEITO AGUDO IN VIVO97
7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 99
8 PERSPECTIVAS ................................................................................................. 102
REFERÊNCIAS...................................................................................................... 103
19
1 INTRODUÇÃO
A Wilbrandia ebracteata é uma planta popularmente conhecida por Taiuiá,
típica da flora brasileira e encontrada inclusive no estado de Santa Catarina. Na
medicina popular é utilizada na terapia de gastrites, úlceras, constipações e febre,
podendo-se ainda ressaltar o seu uso para o tratamento de reumatismos em geral
(1, 2).
Estudos anteriores demonstraram que a Wilbrandia ebracteata possui
uma ação analgésica e uma potente atividade anti-inflamatória. Estas propriedades
foram atribuídas à presença de cucurbitacinas e flavonóides presentes nas raízes
desta planta medicinal (3, 4, 5).
As
cucurbitacinas
e
os
flavonóides
são
substâncias
químicas
provenientes do metabolismo secundário de várias plantas, que possuem atividade
biológica bem difundida dentro da comunidade científica. Estudos apontam que as
cucurbitacinas apresentam atividade antiviral, anti-inflamatória, antioxidante e
analgésica (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Os flavonóides apresentam atividade
antioxidante, hipoglicemiante, antiviral, anti-inflamatória e hepatoprotetora (3, 12, 13,
14, 15, 16).
A atividade anti-inflamatória da Wilbrandia ebracteata foi observada em
estudo in vivo e in vitro através de diferentes modelos experimentais em que se
observou a atividade antiedematogênica, antinociceptiva, inibição do influxo células
e de exudato para o local da inflamação (4, 5, 10, 11). Estudos complementares
sugeriram que estes efeitos estão relacionados, pelo menos em parte, com a
redução da síntese de prostaglandinas E2 devido à inibição da COX-2
(ciclooxigenase 2) e inibição da liberação de NO (óxido nítrico) (4, 5, 9, 10).
Para o desenvolvimento de um medicamento fitoterápico é indispensável
garantir a eficácia, segurança e reprodutibilidade da atividade farmacológica. Para
produtos de origem vegetal estes requisitos somente são alcançados com a
padronização de todo o processo produtivo e para isto é necessário o doseamento
de marcadores químicos, sejam eles ativos ou não, como forma de controlar o
desempenho e reprodutibilidade do processo (17, 18, 19, 20).
A incorporação de ativos em novos sistemas de liberação diferenciada
como
os
sistemas
nanoparticulados
tem
proporcionado
modificações
nos
20
comportamentos farmacocinéticos e de estabilidade, sendo que nas últimas décadas
começou a ser aplicada em extratos e derivados de origem vegetal por Granada e
colaboradores (21). Quando associadas a estes sistemas os ativos podem ter sua
biodisponibilidade melhorada, promover redução da dose terapêutica além de
promover uma ação localizada (22, 23).
A incorporação desta tecnologia a extratos de Wilbrandia ebracteata
padronizados pode ser uma alternativa para incrementar o potencial terapêutico
desta planta no tratamento de processos inflamatórios.
21
2 JUSTIFICATIVA
A larga utilização de medicamentos anti-inflamatórios para o tratamento
das mais diversas patologias e sintomatologias coloca esta classe de medicamentos
entre as mais utilizadas pela população em geral (24, 25).
Contudo, a alta prevalência da utilização dos antiinflamatórios tradicionais
– anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) e glicocorticóides, aumenta a incidência
de seus efeitos colaterais, que são muitos, como por exemplo, a retenção de
líquidos, a Síndrome de Cushing, as lesões gástricas, a insuficiência renal e o rash
cutâneo (26, 27, 28, 29).
A aplicação de anti-inflamatórios pela via tópica permite um menor índice
de efeitos colaterais sistêmicos, sendo indicado em algumas patologias, como na
osteoartrite. Porém a penetração no tecido-alvo é um grande problema que afeta a
eficácia destes, pois a maioria dos medicamentos transdérmicos só consegue
atravessar a epiderme pelos folículos pilosos e glândulas (30, 31).
Uma alternativa para os antiinflamatórios de uso tradicional é o
desenvolvimento de medicamentos à base de plantas medicinais com propriedades
antiinflamatórias. Estudos farmacológicos com estas plantas vêm viabilizando
tratamentos com menores efeitos colaterais. Isso se deve principalmente ao
sinergismo das diversas substâncias químicas presentes nas plantas medicinais,
que
agem
em
conjunto
sobre
vários
fatores
do
processo
inflamatório
simultaneamente, levando a um tratamento mais efetivo, com doses terapêuticas
mais baixas e com efeitos colaterais reduzidos (32, 33).
Entre as várias plantas medicinais com potencial para desenvolvimento
de novos medicamentos podemos destacar a Wilbrandia ebracteata. Esta planta
apresenta elevada atividade anti-inflamatória atribuída principalmente à presença de
cucurbitacinas e flavonóides (3, 34, 35, 36, 37).
A produção de um extrato nanoencapsulado padronizado em flavonóides
e cucurbitacinas a partir da Wilbrandia ebracteata para aplicação tópica pode vir a
ser uma nova alternativa terapêutica para o tratamento de processos inflamatórios. A
incorporação deste extrato em sistemas nanoparticulados,poderá permitir uma maior
permeação cutânea dos ativos, devido ao tamanho reduzido das partículas além de
aumentar a estabilidade destes.
22
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 FITOTERÁPICOS
Os fitoterápicos são medicamentos cujos princípios ativos devem ser
obtidos exclusivamente de matérias-primas vegetais, garantindo eficácia e
segurança.
Estas
podem
ser
comprovadas
por
meio
de
levantamentos
etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas, ou evidências clínicas. Além
disso, os fitoterápicos devem respeitar as mesmas condições de fabricação impostas
aos demais tipos de medicamentos (38).
Como a garantia da eficácia e da segurança de um medicamento
fitoterápico depende diretamente do derivado vegetal, que contém o princípio ativo
deste medicamento, a qualidade destas matérias-primas é de vital importância.
Estes derivados vegetais podem ser óleos essenciais, óleos fixos e extratos (18).
3.2 EXTRATOS VEGETAIS
Os extratos vegetais podem ser obtidos a partir de parte de uma planta
medicinal, como as folhas, a casca, o caule ou a raiz, ou de toda a planta. Esta
definição depende das substâncias químicas que se deseja extrair da planta, ou
seja, da parte da planta que possui maior concentração da substância ativa que se
precisa para a produção do extrato (39, 40, 41).
As substâncias ativas presentes nas plantas medicinais são resultado do
metabolismo secundário das mesmas, ou seja, além do metabolismo primário,
básico, que garante a vida às plantas, como por exemplo a fotossíntese, todas as
plantas produzem metabólitos secundários que são diferentes quantitativamente e
qualitativamente nas várias espécies de plantas existentes. Estes metabólitos
secundários exercem funções específicas em cada planta, como por exemplo,
defesa. Porém, para os seres humanos, algumas destas substâncias podem servir
como veneno ou como remédio (17, 18).
No entanto, mesmo para uma mesma espécie de planta medicinal,
podemos ter variações quantitativas dos princípios ativos, dependendo de vários
fatores que estimulam ou inibem as substâncias de nosso interesse durante o cultivo
23
desta planta. Estes fatores podem ser o aumento ou a redução da radiação
ultravioleta, as variações de temperatura, o índice pluviométrico da época, a
composição atmosférica, a composição do solo, a altitude, entre outros, como
mostra a figura 1. Além disso, esta variação está diretamente ligada à qualidade do
extrato a ser obtido (17).
Figura 1 – Principais fontes que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários nas plantas.
Fonte: Gobbo-Neto e Lopes (17).
A obtenção de um extrato de planta medicinal consiste em extrair a
substância desejada através da passagem de um solvente, também denominado
líquido extrator, pela parte da planta que contém esta substância. Esta extração
pode ocorrer através de diversas técnicas isoladas ou através da combinação de
algumas delas, como por exemplo, a maceração e a percolação (39, 40, 41).
Como a parte da planta que sofrerá a extração é composta de inúmeras
substâncias, os processos extrativos devem ser eficientes ao ponto de otimizar a
extração de substâncias ativas através da definição em estudos anteriores dos
melhores processos a serem empregados, assim como da composição ideal do
líquido extrator (39, 40, 41).
Esta otimização normalmente é possível através do acompanhamento da
concentração dos marcadores químicos, que são substâncias que se encontram em
maior concentração na planta em estudo, ou são as próprias substâncias ativas. A
24
definição de um ou mais marcadores químicos para uma determinada espécie de
planta medicinal é muito importante, pois é praticamente impossível dosar todas as
substâncias químicas presentes em um extrato (19, 20).
A padronização de um determinado extrato vegetal pode ser obtida a
partir do acompanhamento dos marcadores químicos no mesmo, uma vez que não
basta ter a técnica de obtenção do extrato padronizada, já que a composição
química das plantas pode sofrer muitas alterações. Sendo assim, sem a
padronização dos extratos vegetais seria impraticável a produção de medicamentos
fitoterápicos seguros e eficazes (18).
3.3 VALIDAÇÃO
Para se analisar o teor dos marcadores químicos de um extrato é
necessária uma metodologia analítica confiável. E para determinar se um método
analítico é confiável ou não, utiliza-se um conjunto de testes denominado validação
(42, 43).
Por definição, o termo validação significa dar validade, ou seja, uma
comprovação. A validação vai comprovar por meio de análises experimentais e
estatísticas que o método analítico que se pretende adotar contempla as
especificações necessárias para a utilização do método com confiabilidade (42, 43).
Para se validar uma metodologia analítica por cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), deve-se comprovar alguns parâmetros analíticos, como
eficiência do método, seletividade, linearidade, precisão, exatidão e robustez (43).
3.3.1 Eficiência do método
Um método analítico por CLAE pode ser considerado eficiente quando
apresenta
parâmetros
cromatográficos
como
número
de
pratos
teóricos,
variabilidade do tempo de retenção, resolução e fator de cauda aceitáveis (44, 45).
3.3.1.1 Tempo de retenção – RT
25
Em um sistema cromatográfico de CLAE, onde se tem uma fase móvel
(eluente) e uma fase estacionária (coluna), a amostra se distribui pelas duas fases
do sistema e passa a ser carregada pela fase móvel através da fase estacionária em
uma determinada velocidade, que é uma fração da velocidade da fase móvel. Desta
forma, o tempo necessário para que as moléculas de uma substância eluam por
todo o comprimento da coluna a essa velocidade média, é chamado de tempo de
retenção (44, 45).
O tempo de retenção (RT, do inglês “retention time”) de um pico
cromatográfico determina o tempo que a substância referente ao pico fica retida na
fase estacionária do sistema cromatográfico estabelecido (44, 45).
3.3.1.2 Resolução – Rs
A resolução determina a separação dos picos em um sistema
cromatográfico (44, 45, 46).
O valor da resolução entre dois picos é dado pela equação 1.
Rs = 2 x (RT1 – RT2) ÷ (W1 + W2)
(1)
Onde, RT1 e RT2 são os tempos de retenção em minutos das substâncias
1 e 2, respectivamente. E W1 e W2 são as larguras dos sinais em minutos das
substâncias 1 e 2, respectivamente, medidas entre as linhas tangentes ao pico junto
à linha de base, conforme apresentado na figura 2 (44, 45, 46).
Figura 2 – Determinação dos parâmetros para o cálculo da resolução.
RT2
RT1
W1
Fonte: Tosoh Bioscience LLC (47).
W2
26
Quanto maior o valor da resolução, maior a separação das substâncias.
Valores de Rs inferiores a 1,5 indicam uma separação parcial, enquanto que valores
superiores a 1,5 indicam uma separação completa, ou seja, até a linha de base.
Porém, é desejável valores de resolução maiores que 2 (44, 46).
Este parâmetro é muito importante para a eficiência do método quando se
pretende dosar o teor das substâncias através da área dos picos cromatográficos,
pois através de uma resolução total das substâncias envolvidas pode-se utilizar a
medida da área com confiabilidade (44).
3.3.1.3 Fator de cauda – T
O fator de cauda indica a simetria do sinal, e pode também ser denominado
fator de assimetria. Essa assimetria provém da ocorrência de caudas nos picos
cromatográficos, que podem reduzir a resolução entre picos e dificultar a integração
da área dos picos, reduzindo a eficiência do método, a sua precisão e a sua
exatidão (44).
O fator de cauda é calculado pela equação 2.
T = W0,05 ÷ 2 x f
(2)
Onde W0,05 é a medida da largura do sinal no ponto referente a 5 % (1/20
ou 0,05) da amplitude do sinal a partir da linha base. E f é a diferença entre o RT do
pico e o RT do início do sinal no ponto referente a 5 % da amplitude a partir da linha
base, como demonstrado na figura 3 (44).
Figura 3 – Determinação dos parâmetros para o cálculo do fator de cauda.
f
W0,05
27
O valor de T ideal é 1, que indica total simetria do pico, entretanto valores
entre 1,0 e 1,05 também são considerados excelentes. Valores próximos a 1,2 são
considerados aceitáveis, enquanto que valores acima de 2 são inaceitáveis (44, 46).
3.3.1.4 Pratos teóricos – N
O número de Pratos Teóricos (N) é usado como critério para
análise de eficiência da coluna e do sistema cromatográfico. Quanto maior o número
de pratos teóricos, maior a eficiência da coluna e do sistema (44, 45, 46).
Um prato teórico representa um momento de equilíbrio termodinâmico da
substância entre as duas fases, estacionária e móvel, de modo que quanto maior o
número de pratos teóricos, maior é a quantidade destes momentos de equilíbrio e
maior a eficiência do método. O cálculo do número de pratos teóricos é definido pela
equação 3 e os parâmetros necessários estão demonstrados na figura 4 (44, 45,
46).
N = 16 x (RT ÷ W)2
(3)
Figura 4 – Determinação dos parâmetros para o cálculo dos pratos teóricos.
RT
W
Segundo o reviewer guidance on Validation of Chromatographic Methods
da Food and Drug Administration – United States (46), o número de pratos teóricos
deve ser em geral maior que 2000.
28
3.3.2 Seletividade
A seletividade representa a capacidade de um método quantificar um
composto específico em presença de outros compostos, sem interferências de sinal
(42, 43, 44).
Para se avaliar a seletividade de um método para uma substância
específica em presença de outras substâncias também específicas, deve-se analisar
a metodologia proposta e comprovar experimentalmente que o sinal que está sendo
avaliado pertence exclusivamente à substância em análise. Esta comprovação pode
se dar pela análise dos cromatogramas do branco ou placebo verificando
visualmente a presença de interferentes. Outra opção é a adição de padrão ao
placebo, onde se pode analisar o aparecimento de novos sinais ou não, ou então
pela utilização de espectrometria de massas ou detectores de arranjo de fotodiodos
(DAD, do inglês “diode array detector”) (42, 43, 44).
3.3.3 Linearidade
A linearidade de um método representa o intervalo onde os sinais obtidos
experimentalmente correspondem diretamente às concentrações da substância em
análise (42, 43).
Para a determinação da linearidade são necessários pelo menos 5
concentrações
diferentes
de
análise,
cujos
sinais
e
concentrações
são
transformados em uma curva analítica que deve sofrer uma regressão linear para a
construção de uma linha de tendência, que deve apresentar um coeficiente de
correlação (r) no mínimo de 0,99. Quanto mais próximo de 1 o valor do coeficiente
de correlação, mais linear é o intervalo avaliado (42, 43).
Segundo a Resolução Executiva (RE) n° 899 de 2003 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (43), para comprovar a linearidade devese ainda realizar análises estatísticas de modo a apresentar a intersecção com o
eixo Y, o coeficiente angular, a soma residual dos quadrados mínimos da regressão
linear e o desvio padrão relativo.
29
3.3.4 Precisão
A precisão de um método determina a variação entre medidas de uma
mesma amostra, onde se avalia a proximidade dos resultados obtidos. Para um
método preciso, em várias medidas de uma mesma amostra, o resultado encontrado
deve se repetir, ou ficar muito próximo. Por esta definição a precisão também é
denominada de repetibilidade (42, 43, 44).
A precisão é calculada pelo coeficiente de variação encontrado entre os
resultados obtidos. O coeficiente de variação (CV) é calculado pela equação 4 (42,
43, 44).
CV% = (DP x 100) ÷ M
(4)
Onde DP é o desvio padrão da média M.
Segundo a RE 899 de 2003 da ANVISA (43), para um método ser
considerado preciso, não deve apresentar valores de CV% superiores a 5 %.
3.3.5 Exatidão
A exatidão (E) de um método é a medida da proximidade dos resultados
obtidos pelo método aos valores verdadeiros (42, 43, 44).
Para
se
verificar
a
exatidão,
comparam-se
os
valores
obtidos
experimentalmente para um padrão de referência da substância teste com os
valores conhecidos adicionados. Esta comparação é realizada calculando-se a taxa
de recuperação, ou a exatidão, obtida experimentalmente. Este cálculo pode ser
realizado através da equação 5 (42, 43, 44).
E% = (valor experimental x 100) ÷ valor real
(5)
3.3.6 Robustez
Um método analítico é robusto para uma determinada variação de um
determinado parâmetro, quando os resultados obtidos não são afetados por essa
30
variação. Ou seja, mesmo com alguma variação nas condições de análise, o método
continua a apresentar resultados exatos (42, 43).
Esta avaliação da robustez do método para alguns parâmetros também
permite encontrar as limitações da metodologia desenvolvida, a partir das quais se
podem definir os parâmetros que devem ser sempre controlados para o método em
questão (42, 43).
Para avaliar a robustez de um método, realiza-se testes de exatidão
diante de variações das condições de análise previamente definidas. Como
exemplo, pode-se alterar marca de solvente, temperatura, fluxo, espectro de
detecção, entre outros (42, 43).
3.4 INFLAMAÇÃO
A inflamação é uma resposta inata do organismo a uma agressão
causada a um tecido, sendo que esta objetiva a localização do tecido afetado, a
expulsão do agente agressor e a assistência para uma posterior reparação tecidual
(48).
Os transtornos inflamatórios podem ser classificados em agudos e
crônicos. Dentre os transtornos inflamatórios agudos podemos destacar as luxações
– que são caracterizadas pelo desencaixe de uma articulação, as entorses – que
são pequenos estiramentos dos ligamentos – e as lombalgias – que promovem
dores na região lombar. Já com relação aos transtornos inflamatórios crônicos temos
a osteoartrite, a tendinite, a tenossinovite e a periartrite classificadas como as mais
comuns (49, 50, 51).
No Brasil, 37,5 % da população com idade acima dos 60 anos são
acometidas de artrite e/ou reumatismo (50).
Todos estes processos inflamatórios apresentam os cinco sinais cardinais
clássicos da inflamação, que são a dor, o rubor (vermelhidão), o calor no local da
lesão, o edema e por fim a perda da função do órgão acometido (27, 49, 52, 53).
Estes sinais e sintomas são os resultados dos eventos inflamatórios
celulares, dos eventos vasculares e da ação dos mediadores químicos inflamatórios
(49).
31
Os eventos celulares são caracterizados pela ativação das células de
defesa presentes no tecido afetado, como os mastócitos, os fibroblastos e os
macrófagos,
que
liberam
agentes
quimiotáticos
na
circulação
sanguínea
promovendo os eventos inflamatórios vasculares (27, 49, 52, 53).
Estes eventos vasculares incluem a transmigração de células de defesa
plasmáticas como leucócitos, linfócitos e monócitos, para o tecido alvo. Assim como
o aumento da permeabilidade vascular local e do fluxo sanguíneo local (27, 49, 52,
53).
Existem várias substâncias que funcionam como mediadores químicos
nos processos inflamatórios, como por exemplo, as prostaglandinas, que promovem
vasodilatação, febre e dor, os leucotrienos, responsáveis pela ativação e adesão de
leucócitos ao endotélio e sua posterior migração para o tecido, o óxido nítrico, que é
um potente vasodilatador além de relaxar a musculatura lisa e reduzir a agregação
plaquetária e a histamina, que também promove o aumento da permeabilidade
vascular (27, 48).
Estes processos inflamatórios têm início com a estimulação da membrana
celular, que vai desencadear a cascata de eventos celulares e vasculares. Um dos
primeiros eventos celulares que ocorre é a liberação de ácido araquidônico (AA) da
membrana celular através da ação da enzima fosfolipase A2 (PLA2) sobre os
fosfolipídios de membrana. O ácido araquidônico liberado é utilizado para a síntese
de prostaglandinas e tromboxanos, através da via da ciclooxigenase (COX) e para a
síntese de leucotrienos, pela via da lipoxigenase (LOX) (27, 49, 54).
Com a liberação de leucotrienos e prostaglandinas (eicosanóides) pelas
células, tem-se a estimulação de células inflamatórias, produção de outros
mediadores químicos inflamatórios e a promoção dos eventos vasculares. Desta
forma a cascata de eventos que se segue vai guiar o processo inflamatório até que o
mesmo seja encerrado fisiologicamente ou farmacologicamente (27, 49, 54).
3.4.1 Agentes anti-inflamatórios
Os
agentes
anti-inflamatórios
tradicionais
agem
localmente
ou
sistemicamente causando a inibição da síntese ou da interação dos agentes
químicos mediadores do processo inflamatório a seus receptores (55, 56).
32
3.4.1.1 Anti-inflamatórios não esteroidais – AINES
Os AINES estão entre os medicamentos mais utilizados em todo o
mundo, sendo caracterizados pelo seu mecanismo de ação sobre o processo
inflamatório e não estruturalmente ou quimicamente (54, 56).
De maneira geral, os AINES bloqueiam as enzimas ciclooxigenases
(COX), ocasionando a redução da síntese de prostaglandinas e tronboxanos.
Existem AINES que agem sobre as duas isoformas da COX, a COX-1 e a COX-2.
Desta forma, estes medicamentos além de reduzirem a síntese de prostaglandinas
inflamatórias (sintetizadas pela ação da COX-2), reduzem também a síntese de
prostaglandinas fisiológicas homeostáticas e de tromboxano A-2, que também é
fisiológico homeostático, sendo estas substâncias originarias da ação da COX-1.
Como exemplos de AINES não seletivos, têm-se o ibuprofeno e o naproxeno (54).
Dentre os AINES não seletivos, existem medicamentos que têm ação
predominante ou preferencial sobre COX-1, como a indometacina, o cetoprofeno e o
piroxicam. Da mesma forma, existem AINES não seletivos com atividade
preferencial sobre a COX-2, como o meloxicam, a nimesulida e o diclofenaco (54).
Os AINES seletivos para a COX-2 são denominados coxibes, e como
exemplos têm-se o celecoxibe, o etoricoxibe e o parecoxibe (56).
Os principais efeitos adversos dos AINES não seletivos, principalmente
dos preferenciais COX-1, incluem aumento da acidez gástrica, os rashes cutâneos –
reações eritematosas leves, urticárias, fotossensibilidade e a síndrome de StevensJohnson (rara) – queda da perfusão renal, retenção de sódio e água, hemorragias
decorrentes da redução da agregação plaquetária, toxicidade hepatocelular, entre
outros (54,56).
O aumento da acidez gástrica pode levar, em alguns casos, a úlceras e
hemorragias, devido à inibição da produção das prostaglandinas envolvidas na
proteção das células gástricas (54, 56).
O efeito adverso principal causado pelos AINES seletivos para a COX-2 é
principalmente o aumento do risco cardiovascular. Este risco é ocasionado pelo
desequilíbrio dos mecanismos anti e pró-trombóticos promovidos pela inibição de
prostaglandinas com ação vasodilatadora e antiagregante plaquetária, sem a
inibição do tromboxano A-2, que é agregante plaquetário e vasoconstritor (54).
33
3.4.1.2 Anti-inflamatórios hormonais – glicocorticóides
Os anti-inflamatórios hormonais são denominados corticosteróides por
serem hormônios produzidos pelo córtex adrenal, por exemplo a dexametasona, a
betametasona, a prednisolona e a prednisona (52, 54).
Estes anti-inflamatórios têm sua ação através da redução de células
inflamatórias circulantes e no local da inflamação, como os linfócitos T e B, os
macrófagos e os eosinófilos. Ainda inibem a atuação dos leucócitos em geral e dos
macrófagos. Bloqueiam a produção de prostaglandinas e leucotrienos pela inibição
da fosfolipase A-2, inibem a síntese de citocinas inflamatórias (54).
Os corticóides apresentam diversos efeitos adversos, principalmente por
interferirem em várias vias responsáveis pela homeostase. Os efeitos adversos
iniciais incluem queda da imunidade, hipertensão arterial sistêmica, hiperglicemia e
episódios de euforia e depressão. Com a administração contínua dos corticóides –
após 6 meses – os efeitos adversos tornam-se mais graves, podendo ocasionar
síndrome
de
Cushing,
osteoporose,
obesidade,
hipertensão
intracraniana,
hipertensão intra-ocular, gastrite, úlceras, colite e hemorragias (52, 54).
3.4.1.3 Anti-inflamatórios fitoterápicos
Como uma alternativa inovadora aos tratamentos anti-inflamatórios
tradicionais têm surgido inúmeros estudos farmacológicos com plantas medicinais,
que prometem tratamentos mais eficientes e com menores efeitos colaterais,
principalmente devido ao sinergismo das diversas substâncias químicas presentes
nas plantas medicinais. Ou seja, pode-se obter efeitos sobre mais de um fator do
processo inflamatório simultaneamente, o que pode promover um tratamento mais
efetivo, com doses mais baixas e com efeitos colaterais reduzidos (48, 57).
Dentre as várias plantas com propriedades anti-inflamatórias em estudo,
podemos citar a Caesalpinia férrea (Caeslpinioideae), cujo mecanismo de ação
proposto envolve a inibição de histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandina E2
e óxido nítrico (58), a Salvia officinalis L. (59), a Magnolia ovata (60), a Cordia
verbenácea DC (61), a Maytenus ilicifolia conhecida popularmente como espinheirasanta (62), a Lychnophora passerina, arnica, que tem a sua atividade anti-
34
inflamatória atribuída a inibição da produção de TNF-α e óxido nítrico, enquanto
aumenta a produção de IL-10 (57), a Passiflora edulis (63), a Baccharis illinita DC
(64), o Tupinambis merianae (65), o Byrsonima intermedia A. Juss. (66), o Baccharis
dracunculifolia DC (67), o Capsicum baccatum (68) e o Rosmarinus officinalis L (69),
entre outras plantas.
3.5 Wilbrandia ebracteata
A Wilbrandia ebracteata é uma planta medicinal nativa da Mata Atlântica,
sendo natural da América do Sul e típica das regiões sul e sudeste do Brasil. Esta é
uma planta trepadeira, podendo ter raízes de até 40 metros de comprimento e que é
conhecida popularmente pelo nome de Taiuiá (1, 2, 3, 6 8).
Esta planta é identificada botanicamente pela análise taxonômica de suas
flores e frutos, uma vez que existem espécies de aparência semelhante. Sendo
classificada como pertencente à família das Cucurbitáceas (2, 3, 6).
Popularmente, a raiz da Taiuiá é utilizada no preparo de medicamentos
caseiros como antirreumático, laxativo, anti-helmíntico e para o tratamento de
diversas afecções da pele, entre outros (1, 2, 3).
Diversos estudos investigaram a composição química da Wilbrandia
ebracteata. Coelho (70), Gonzalez (2) e Gazola e Schenkel (3) demonstraram que
as folhas da W. ebracteata apresentam principalmente flavonóides, enquanto que
estudos realizados por Santos, Santos e Schenkel (36), Gazola e Schenkel (3) e
Farias e colaboradores (34), concluíram que as raízes da W. ebracteata contém
flavonóides e cucurbitacinas.
A composição química quantitativa das raízes de W. ebracteata
apresentam em maior concentração os flavonóides Spinosina, Isovitexina,
Swertisina, Vitexina, 4’,5-diidroxi-7-metoxi-flavona, Isoswertisina e Vicenina-2,
seguidos das cucurbitacinas Dihidrocucurbitacina B, Cucurbitacina B e Cucurbitacina
E. E em menor quantidade os flavonóides Orientina e Isoorientina (3, 34, 35, 36, 37).
Os flavonóides são uma classe de substâncias químicas provenientes do
metabolismo secundário de algumas plantas e são caracterizados quimicamente por
serem polifenóis, que são compostos tricíclicos contendo dois anéis aromáticos,
como apresentado na figura 5 (3).
35
Figura 5 – Representação do esqueleto básico de flavonóides C-glicosídeos,
mostrando os três anéis, sendo dois, anéis aromáticos.
Fonte: Gazola e Schenkel (3).
Ainda com relação aos flavonóides, estes são conhecidos por
apresentarem
diversas
atividades
farmacológicas,
como
ação
antioxidante,
hipoglicemiante, antifúngica, antiviral, anti-inflamatória e hepatoprotetora (12, 14, 15,
16, 71, 72).
As
cucurbitacinas
são
metabólitos
secundários
encontrados
principalmente em plantas pertencentes à família cucurbitaceae e são responsáveis
pelo sabor amargo das mesmas. Também são conhecidas por apresentarem
atividade citotóxica, anticancerígena, vermífuga, laxante, contraceptiva, analgésica e
anti-inflamatória (3, 5, 8, 9, 10, 37, 76, 75, 80).
Quanto a sua estrutura, as cucurbitacinas são classificadas como
triterpenos, que são hidrocarbonetos formados pela condensação de 6 unidades de
isopreno (pirofosfato de isopentenila), resultando em uma molécula composta de 30
carbonos, conforme representado na figura 6 (3, 5, 8, 10, 37, 74, 75, 76, 77, 80).
Figura 6 – Esqueleto cucurbitano destacando uma molécula de isopreno à direita.
Isopreno
H2C
CH2
CH3
Fonte: Valente (37).
36
Um estudo químico das raízes de Wilbrandia ebracteata apresentou a
predominância de flavonóides C-glicosídeos e glicosídeos de cucurbitacinas, em
frações butanólicas e diclorometânicas respectivamente, sendo a isovitexina uma
das substâncias encontradas em maior quantidade na fração butanólica. (3) Alguns
estudos apontam as curcubitacinas como as responsáveis pelas ações terapêuticas
desta planta (5, 8, 9). Em outro estudo, foi demonstrado que a dihidrocurcubitacina B
é o principal componente da fração diclorometânica do extrato obtido das raízes de
Wilbrandia ebracteata e que esta substância exerce potente efeito anti-inflamatório
in vivo, evidenciado por uma diminuição do edema de pata e inibição da infiltração
de leucócitos no sítio inflamatório (10). Do mesmo modo, os flavonóides em geral
são reconhecidos por suas ações antioxidante e anti-inflamatória (78).
De acordo com outro estudos, o mecanismo de ação proposto para a
atividade anti-inflamatória da Wilbrandia ebracteata é multifatorial, envolvendo a
inibição de prostaglandinas E2, a inibição da COX-2 (ciclooxigenase 2), a inibição da
liberação de NO (óxido nítrico) e a inibição do fluxo de células e de exudato para o
local da inflamação (4, 5, 9, 10).
Através de diversos estudos farmacológicos realizados por, AndrighettiFröhner (79), Menezes, Schwarz e Santos (7) e Miró (8) com extratos e frações
extrativas de Wilbrandia ebracteata, foram demonstradas as propriedades
antioxidantes, antiviral e analgésica que esta planta medicinal possui. Ainda, estudos
preliminares de Dunkan e colaboradores (80), Konoshima e colaboradores (74) e
Lazaris e colaboradores (75) sugeriram um grande poder antitumoral das
cucurbitacinas.
3.6 NANOTECNOLOGIA
A nanotecnologia trata da tecnologia empregada na manipulação da
matéria em escalas nanométricas, ou seja, partículas de tamanho inferior a 1.000
nm (um mil nanômetros). Na figura 7 têm-se uma representação de algumas
estruturas em nanômetros (81, 82):
37
Figura 7 – Representação da escala nanométrica.
Molécula
de água
Bactéria
Anticorpo
10-1 nm
1 nm
10 nm
102 nm
Bola de
Tênis
Célula
Humana
Vírus
Glicose
103 nm
104 nm
105 nm
106 nm
107 nm
108 nm
Bola de
Futebol
109 nm
1010 nm
NANOPARTÍCULAS
Fonte: Buzea, Blandino e Robbie (83).
Cada vez mais a nanotecnologia vem sendo aplicada a diversas áreas
como, por exemplo, em microeletrônica, suplementos fotográficos, desenvolvimentos
de ossos sintéticos, próteses dentárias, componentes automotivos, equipamentos
esportivos, revestimentos de fibra óptica, neutralizadores de químicos nocivos e
vários instrumentos científicos, entre outros (23, 83).
Na indústria química a nanotecnologia também é muito utilizada no
desenvolvimento de novos pigmentos, novas tintas, borrachas sintéticas, adesivos,
aditivos de combustíveis, entre outros materiais. Já na indústria cosmética, é
utilizada para o desenvolvimento de novos protetores solares e cremes anti-idade,
entre outros (23, 83).
Como demonstrado na escala nanométrica da figura 4, as nanopartículas
possuem diâmetros inferiores ao tamanho de uma célula humana (10.000 nm). Este
fato estimulou muitos estudos de nanotoxicidade, que observaram os danos
celulares que nanopartículas podem exercer uma vez acumuladas dentro destas
células. Estes danos podem provocar sintomas com enjoos e dores de cabeça e até
mesmo causar doenças degenerativas e câncer (23, 83).
Entretanto, diversos estudos propõem que esta nanotoxicidade é
dependente do local de contato, da dose e do tamanho da nanopartícula. Assim,
pesquisadores propuseram que nanopartículas de tamanhos inferiores a 100 nm
apresentam maior toxicidade e maior tempo de retenção intracelular, sendo
consideradas de alta toxicidade quando comparadas a nanopartículas maiores (83).
Apesar dos riscos de toxicidade, a aplicação da nanotecnologia nos mais
diversificados ramos da ciência acabam por melhorar a qualidade de vida das
pessoas, principalmente com o advento desta tecnologia na área farmacêutica e da
nanomedicina. Desta forma, existe uma grande expectativa sobre as propriedades
38
únicas dos nanomateriais na área da saúde, que estimulam o desenvolvimento de
novos meios diagnósticos e tratamentos mais eficientes (23, 83).
3.6.1 Nanotecnologia farmacêutica
A nanotecnologia vem sendo aplicada na área farmacêutica com vários
objetivos. Pode ser utilizada para facilitar a chegada do fármaco ao seu tecido alvo,
para mascarar o sabor de um fármaco quando este é aplicado por via oral, neste
caso, muito importante em medicamentos pediátricos ou veterinários. Também é
aplicada com o intuito de aumentar a proteção deste fármaco às enzimas digestivas,
reduzir a hepatotoxicidade de um fármaco, reduzindo a sua biotransformação,
melhorar a sua biodisponibilidade, o que pode reduzir as doses diárias de
determinado medicamento e o aumento de sua eficácia. Na via transdérmica pode
ainda, aumentar o controle da liberação dos fármacos, proteger estes de agentes
degradantes, como a luz solar e ainda aumentar a permeabilidade cutânea, fazendo
com que o fármaco chegue ao seu alvo em maior concentração ou que se mantenha
no local lesado por mais tempo (22, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89).
Um dos objetivos principais da nanotecnologia farmacêutica é o de
aperfeiçoar as ideias de liberação controlada de fármacos. Neste contexto, a
nanotecnologia farmacêutica estuda nanoestruturas que podem carrear os fármacos
até o seu local de ação, direcionando ou vetorizando estes e consequentemente,
melhorando a biodisponibilidade dos mesmos (23, 81, 82).
Na teoria, a vetorização de fármacos funciona como um “cavalo de Tróia”,
onde a nanopartícula seria o cavalo que esconde os soldados inimigos dentro de si,
que neste caso seriam o fármaco, levando este sem danos até o seu alvo (22, 81,
82, 84, 85, 86, 87, 88, 89).
A
vetorização
dos
fármacos
pode
ocorrer
por
várias
vias
de
administração, como as vias oral, ocular, intramuscular, subcutânea, intravenosa, e
transdérmica (22).
Todos os sistemas nanoparticulados demonstram uma boa capacidade de
vetorização dos fármacos e o tamanho subcelular destas estruturas permite uma
ação intracelular alta se comparada a outros sistemas particulados (90).
39
3.6.2 Principais nanoestruturas utilizadas na área farmacêutica
As estruturas das nanopartículas apresentam em geral uma construção
cápsula-núcleo, na qual o fármaco fica retido abaixo de uma membrana polimérica
ou adsorvido na cápsula. Neste núcleo o fármaco pode estar sob a forma líquida,
sólida ou como uma dispersão molecular, dependendo do tipo de nanopartícula (81).
Dentre as principais nanoestruturas existentes, podemos destacar na área
de vetorização de fármacos a nanoemulsão, a nanoesfera e a nanocápsula,
representadas na figura 8 (91).
Figura 8 – Representação da estrutura de nanoemulsão, nanoesfera e nanocápsula.
Fonte: Elaboração da autora, 2011.
3.6.2.1 Nanoemulsões
As nanoemulsões são formadas por sistemas micelares dispersos em
água. Nestes sistemas, o fármaco fica dissolvido no meio oleoso, o qual é envolto
por uma micela de tensoativo. Estes sistemas são estabilizados por surfactantes ou
co-surfactantes que formam partículas menores ou iguais a 100 nm (81, 92).
Estes sistemas são ótimos carreadores de fármacos pouco solúveis, pois
são capazes de aumentar a solubilidades destes. Apresentam ainda, vantagens de
preparação, pois se formam espontaneamente e são termodinamicamente estáveis
(91, 93).
Outra característica das nanoemulsões é a sua capacidade de intensificar
a penetração de fármacos na pele, através da sua interação com a camada córnea
da epiderme, que sofre um rearranjo estrutural na sua membrana lipídica (22, 84,
90).
40
3.6.2.2 Nanoesferas
As nanoesferas são constituídas de estruturas poliméricas matriciais que
retêm o fármaco. Neste sistema o fármaco que está solubilizado em meio aquoso é
retido, adsorvido ou molecularmente disperso em uma matriz polimérica formada
pela precipitação do polímero neste mesmo meio aquoso (22, 81, 84, 89, 91).
3.6.2.3 Nanocápsulas
As nanocápsulas apresentam a estrutura cápsula-núcleo. Nestes
sistemas, os fármacos ficam solubilizados em um óleo carreador (núcleo), que é
envolvido por um invólucro de polímeros, que constituem a cápsula polimérica. Os
fármacos podem ainda estar adsorvidos na parede da cápsula polimérica (22, 90).
Para a obtenção de nanocápsulas são utilizadas várias metodologias,
como a nanoprecipitação, a emulsão-difusão, a dupla emulsificação, a emulsãocoacervação, a técnica do polímero de revestimento ou da camada por camada,
entre outras (81).
Na área farmacêutica as nanocápsulas apresentam vantagens em relação
a outros sistemas nanoparticulados, como uma alta eficiência de encapsulação do
fármaco, pois o núcleo oleoso da estrutura da nanocápsula otimiza a solubilidade do
fármaco (82, 94).
Outra vantagem das nanocápsulas é a baixa quantidade de polímero
utilizada em sua preparação, quando comparada às demais nanoestruturas
poliméricas (22, 81).
As nanocápsulas promovem a proteção do fármaco pela casca polimérica
contra fatores de degradação, reduzindo a irritação dos tecidos alvo, devido a esta
casca polimérica, apresenta ainda uma boa capacidade de liberação dos fármacos e
são altamente eficientes na nanoencapsulação de fármacos lipossolúveis (22, 81).
Este tipo de nanopartícula está sendo cada vez mais utilizada como
transportadores de fármacos devido às características citadas anteriormente e a sua
capacidade de mascarar o gosto desagradável dos fármacos, de fornecer
propriedades de liberação controlada de moléculas vulneráveis, por proteger a
substância ativa da degradação por fatores externos como a luz, o pH ou por ataque
41
enzimático, quando utilizada para otimizar a passagem de algum fármaco através do
trato digestivo e por aumentar a eficácia terapêutica através de uma melhora da
biodistribuição do fármaco (81).
Além disso, estes sistemas permitem um controle da sua alta perfusão
intracelular através da modificação das cargas superficiais das nanocápsulas e da
natureza hidrofóbica ou hidrofílica do polímero utilizado na produção do sistema
nano (81).
Em um estudo realizado por Külkamp e colaboradores (95), foi
demonstrado o efeito protetor que as nanocápsulas poliméricas exercem através do
acompanhamento da estabilidade do ácido lipoico livre e de nanocápsulas
poliméricas contendo ácido lipoico, preparadas pelo método de nanoprecipitação,
onde
houve
o
aumentando
da
estabilidade
físico-química
da
substância
encapsulada.
Em outro, realizado por Alves, Pohlmann e Guterres (96), foi demonstrado
que a nanoencapsulação da nimesulida modificou o perfil de liberação e de difusão
do fármaco em relação ao fármaco livre. Este estudo ainda constatou que as
nanocápsulas contendo nimesulida promoveram maior permeação cutânea do
fármaco quando comparadas com a nanoemulsão ou com as nanoesferas contendo
nimesulida.
3.6.3 Polímeros utilizados na preparação de nanocápsulas
Para definir o melhor polímero e método de obtenção dos sistemas
particulados deve-se levar em consideração o tamanho médio das partículas, o
potencial-zeta, a eficiência de encapsulação, a atividade de liberação do fármaco, a
estabilidade da nanodispersão e o comportamento da performance farmacológica in
vivo e in vitro. (81).
Os polímeros utilizados na preparação de nanocápsulas podem ser
classificados
em
biodegradáveis
e
não-biodegradáveis,
conforme
o
seu
comportamento no organismo (82, 93).
Os polímeros não-biodegradáveis, como o próprio nome sugere, não
podem ser metabolizados pelo organismo, portanto liberam os fármacos apenas por
difusão, ou seja, a velocidade de liberação do fármaco é determinada pela sua
42
solubilidade no núcleo oleoso, no polímero e no meio externo. Como principais
polímeros não-biodegradáveis temos o PEG – polietilenoglicol, o Poli N-acrilolamida,
o Polivinileno e o Polimetilmetacrilato (81, 82, 94). Na figura 9 há uma representação
do sistema de liberação dos fármacos por difusão.
Figura 9 – Representação do sistema de liberação de fármacos por difusão.
Meio externo
Polímero
não-biodegradável
formando a cápsula
Fármaco
Nanocápsula
Já os
polímeros
biodegradáveis
podem
ser
metabolizados
pelo
organismo, desta forma, nas nanocápsulas formadas por estes polímeros a
liberação do fármaco ocorre através da degradação ou erosão da cápsula, como
demonstrado na figura 10, o que permite uma liberação do fármaco mais
prolongada, um maior contato do fármaco no sítio de ação e uma menor toxicidade
das nanocápsulas (81, 82, 93, 94).
Figura 10 – Representação do sistema de liberação de fármacos por erosão ou
destruição da cápsula.
Polímero
biodegradável
formando a cápsula
Erosão da
cápsula
Meio externo
Nanocápsula
Fármaco
43
Os polímeros biodegradáveis podem ainda ser subclassificados em
reabsorvíveis e não-reabsorvíveis. Os polímeros reabsorvíveis são metabolizados
em moléculas que podem ser aproveitadas pelo organismo e transformadas em
outros metabólitos. Como exemplos de alguns polímeros reabsorvíveis temos o PLA
- poliácido láctico, a PCL – poli є-caprolactona e o PLGA – poli ácido láctico-coácido-glicólico (81, 82, 93).
Já os polímeros não-reabsorvíveis são metabolizados a moléculas que
devem ser excretadas do organismo, não podendo ser aproveitadas pelo mesmo. O
polímero PACA – polialquil cianoacrilato e seus derivados são os representantes
desta classe de polímeros (81, 82, 93).
3.6.4 Metodologias utilizadas na preparação de nanocápsulas
Existem várias metodologias utilizadas para a obtenção de nanocápsulas,
envolvendo materiais e processos diversos. Os processos mais comuns são os que
envolvem a polimerização in situ de monômeros ou a precipitação (deposição)
interfacial de polímeros pré-formados (91, 97).
A metodologia que envolve a polimerização in situ de monômeros
utilizada para a obtenção de nanocápsulas é a polimerização em emulsão, onde o
polímero que formará a nanocápsula será formado a partir dos monômeros
dispersos na emulsão contendo todos os materiais utilizados na síntese (91).
Como metodologias que envolvem a precipitação interfacial de polímeros
pré-formados temos, a emulsão-difusão, a emulsão-evaporação, a nanoprecipitação
e a dupla emulsificação, entre outras. Nestas metodologias, o polímero já formado é
depositado em volta do núcleo oleoso formando a nanocápsula (81, 91).
No método de emulsificação-difusão, uma fase oleosa, contendo um óleo
carreador, o fármaco e um solvente e uma fase aquosa, contendo um agente de
estabilização, são emulsionadas através de alta agitação mecânica. Esta emulsão é
então posteriormente diluída em uma fase de diluição, geralmente aquosa, sob
moderada agitação, para que ocorra a difusão do solvente e a precipitação do
polímero. Então o solvente e o excesso de água são evaporados sob pressão
reduzida (81).
44
Já na metodologia de dupla emulsificação as fases oleosa e aquosa são
emulsionadas por ultra-som, obtendo-se uma emulsão água em óleo. Após este
processo uma nova fase aquosa contendo um agente de estabilização é adicionada
a emulsão previamente formada e um novo processo de emulsificação é realizado
por ultra-som ou por alta agitação mecânica. Nesta última emulsificação ocorre a
difusão do solvente e a precipitação do polímero, formando-se as nanocápsulas.
Então os solventes são evaporados sob pressão reduzida obtendo-se nanocápsulas
endurecidas em um meio aquoso (81).
Outra metodologia de preparação de nanocápsulas bastante utilizada por
ser de simples execução, reprodutível e poder ser empregada em escala industrial, é
a metodologia de nanoprecipitação. Esta metodologia também é denominada de
método do deslocamento de solvente ou de método de deposição interfacial e foi
desenvolvida por Fessi e colaboradores em 1989 (97, 98).
A nanoprecipitação envolve a injeção lenta e sob agitação moderada de
uma fase oleosa, contendo o fármaco, um óleo carreador, um tensoativo e um
solvente, dentro de uma fase aquosa, contendo um tensoativo. Neste processo, o
polímero vai precipitar sobre o núcleo oleoso formando a cápsula polimérica. Após
este processo o solvente e o excesso de água são evaporados a pressão reduzida
obtendo-se uma suspensão de nanocápsulas (81, 91).
3.6.5 Nanotecnologia aplicada a sistemas transdérmicos
A via transdérmica é uma importante rota de administração de fármacos,
pois se trata de um meio não invasivo. Todavia, os sistemas de liberação de
fármacos por via transdérmica atuais precisam vencer a barreira que a pele impõe a
todos os invasores (30, 99).
A epiderme é a camada da pele mais externa e é também a responsável
pela resistência que essa barreira impõe. Esta camada da pele é formada por vários
tipos de células que estão em constante renovação e que se encontram divididas em
várias subcamadas. Dentre estas células destacamos os queratinócitos, que estão
distribuídos nas várias camadas da epiderme e que são produtores de queratina. A
queratina produzida é responsável pela queratinização das células das camadas
mais externas da epiderme, que após queratinizadas, sofrem apoptose e
45
posteriormente diferenciam-se em corneócitos. Estas células queratinizadas e
mortas formam a camada mais externa da epiderme, o extrato córneo, que impede a
perda de água e eletrólitos pela pele. Estas estruturas estão representadas na figura
11 (52, 53, 99).
Figura 11 – Representação da pele e suas camadas mais externas. Evidenciadas
algumas camadas da epiderme.
Após a epiderme, do meio externo para o meio interno, temos a derme,
que ao contrário da epiderme, possui vascularização e por este motivo representa o
local onde o fármaco deve chegar para ser distribuído ao organismo ou mesmo agir
localmente nos tecidos musculares ou articulares (52, 53).
A grande maioria dos medicamentos transdérmicos só chega até a derme
através dos folículos pilosos e das glândulas sebáceas e sudoríparas que são
estruturas da pele que transpassam a camada da epiderme até o meio exterior.
Contudo, com o advento da nanotecnologia, devido ao pequeno tamanho das
partículas envolvidas nesta ciência, pode-se atravessar a epiderme carreando
moléculas de fármacos para a derme sem grandes perdas (22, 30, 100).
Segundo Cevc e Vierl (30), para que as nanopartículas consigam atingir
um fluxo transdérmico eficiente, é necessário um tamanho de nanopartícula inferior
a 500 nm. Entretanto esta não é a única característica importante, pois para uma
ação carreadora transdérmica ideal, a nanopartícula deve interagir adequadamente
com a epiderme, eletronicamente e molecularmente.
46
Outra importante propriedade das nanopartículas para a aplicação
transdérmica é o caráter lipofílico ou hidrofílico, que pode facilitar a permeação
cutânea ou aumentar a taxa de liberação do ativo, depende do método de
preparação utilizado e das matérias-primas empregadas (90).
Na figura 12 temos uma representação da vetorização de fármacos por
nanocápsulas através da epiderme, onde pode ser obtida a retenção do fármaco na
pele, ou uma maior permeabilidade celular das nanocápsulas que promoverão uma
maior distribuição do fármaco, ou até mesmo uma distribuição sistêmica,
dependendo das características que se impõe à nanocápsula (22).
Figura 12 – Representação da ação nanocarreadora das nanopartículas pela via
transdérmica. Fármaco representado pelas esferas vermelhas e nanopartículas
representadas pelos círculos azuis.
Quando aplicados topicamente, as nanocápsulas reduzem a irritação
cutânea que alguns fármacos podem causar, pois neste sistema, como já
demonstrado anteriormente, o fármaco fica envolto na cápsula polimérica (22, 81).
47
3.6.5.1 Nanotecnologia aplicada no tratamento de processos inflamatórios por via
transdérmica
A aplicação da nanotecnologia para a otimização de tratamentos antiinflamatórios pela via transdérmica ainda é uma proposta recente. Abdel-Mottaleb,
Neumann e Lamprecht (90) nanoencapsularam ibuprofeno em 2010, Alves,
Pohlmann e Guterres (96) em 2005 e Alves, Scarrone, Santos, Pohlmann e Guterres
(84) em 2007, nanoencapsularam nimesulida, Friedrich e colaboradores (101)
nanoencapsularam dexametasona em 2008. Raffin e colaboradores em 2003 (82) e
Pohlmann e colaboradores em 2002 (102), nanoencapsularam indometacina.
Schaffazick e colaboradores em 2003 (91), nanoencapsularam diclofenaco.
Um estudo com a nimesulida, agente anti-inflamatório não esteroidal,
nanoencapsulada, aplicada por via transdérmica realizado por Lenz e Alves (22)
comprovaram que a utilização de um nanocarreador aumenta significativamente a
ação do agente anti-inflamatório em um estudo para quadros de inflamação crônica,
quando comparado ao mesmo agente na sua forma livre. Ainda constataram que a
atividade antioxidante da nimesulida também foi intensificada pelo nanocarreador.
Ainda, segundo Cevc e Vierl (30), nanopartículas aplicadas a sistemas de
vetorização de fármacos pela via tópica, podem melhorar a entrega do fármaco no
alvo, em razão da sua penetração espontânea no estrato córneo da epiderme, sem
causar desidratação ou aberturas na pele.
48
4 OBJETIVO GERAL
Desenvolver
nanocápsulas
de
extrato
de
Wilbrandia
ebracteata
padronizado em vitexina, isovitexina e dihidrocucurbitacina B e avaliar a atividade
anti-inflamatória por via tópica.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Validar metodologia analítica para doseamento simultâneo dos
flavonóides isovitexina e vitexina no extrato de Wilbrandia ebracteata
(EWE).
b) Caracterizar o EWE.
c) Produzir nanocápsulas contendo o EWE padronizado utilizando a
técnica de nanoprecipitação de polímero pré-formado.
d) Avaliar a eficiência de encapsulação.
e) Determinar
tamanho
e
polidispersão
das
nanocápsulas
por
difratometria de laser.
f) Investigar
a
propriedade
anti-inflamatória
tópica
do
EWE
nanoencapsulado e comparar com o EWE puro em modelos de
avaliação do edema de orelha induzido pela aplicação tópica de óleo
de cróton em camundongos.
g) Investigar
a
propriedade
anti-inflamatória
tópica
do
EWE
nanoencapsulado e comparar com o EWE puro em modelo de
avaliação de inflamação crônica por edema de orelha induzido pela
aplicação múltipla do óleo de cróton em camundongos.
h) Investigar a toxicidade dérmica do EWE e do EWE nanoencapsulado
em modelo de irritação primária de pele: efeito agudo em ratos.
49
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata (EWE)
O EWE foi obtido a partir das raízes secas de Wilbrandia ebracteata
produzidas na região de Grão Pará (SC). Esta planta foi identificada pelo botânico
Jasper Zanco do curso de agronomia da Universidade do Sul de Santa Catarina
(UNISUL).
Estas raízes secas foram moídas e tamisadas em peneira de análise
granulométrica Abronzinox (Brasil) de malha 60. Para produção do extrato foram
utilizadas partículas com tamanho inferior a 250 micrômetros, as quais foram
mantidas em maceração dinâmica durante 48 h em solvente acetato de etila (FMaia,
Brasil), utilizando agitador mecânico Heidolph RZR1 (Alemanha). A relação
planta:solvente utilizada foi 1:10. Após extração a solução resultante foi filtrada e o
solvente evaporado sob pressão reduzida em evaporador rotatório Heidolph VV2000
a temperatura de 50 °C, até a produção de um pó amarelado chamado de EWE.
VITEXINA E ISOVITEXINA EM EWE E NO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata
NANOENCAPSULADO (NEWE) POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA - CLAE
5.2.1 Método analítico
O teor de vitexina e isovitexina foi determinado por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) em Cromatógrafo Agilent 1200 (USA), utilizando
metodologia adaptada a partir das condições cromatográficas estabelecidas por Fu e
colaboradores (103) para separação de vitexina e isovitexina em extratos de feijão
gandu (Cajanus cajan). Foram alteradas algumas condições cromatográficas, bem
como a coluna cromatográfica, para uma coluna com partículas menores com o
objetivo de reduzir o tempo de análise. As condições cromatográficas estabelecidas
para o doseamento de vitexina e isovitexina no EWE estão descritas na tabela 1.
50
Tabela 1 – Condições cromatográficas
Coluna
Fase móvel
Isocrático
Fluxo
Temperatura
Volume injeção
Detecção
Kinetex C18 2,6 µm 100 A - (100 x 4.6 mm) Phenomenex® (EUA)
A: Ácido fórmico Lafan (Brasil) a 0,67 % em água
B: Metanol grau HPLC Vetec (Brasil)
A: 68 %
B: 32 %
1,1 mL/min.
40 oC
20 µL
330 nm
5.2.2 Soluções estoque
As soluções estoque utilizadas na validação da metodologia analítica
foram preparadas conforme descrito abaixo.
Para o preparo das soluções estoque dos padrões foram utilizados os
padrões de referência primários de vitexina e isovitexina ChromaDex™ (EUA)
(purezas de 99,2 % e 90,7 %, respectivamente), diluídos em metanol grau HPLC
proveniente de Vetec (Brasil).
 Solução Estoque de padrão de vitexina 0,1 mg/mL (SEV) – preparada pela
diluição do padrão primário de vitexina em metanol e conservada em
congelador.
 Solução Estoque de padrão de isovitexina 0,25 mg/mL (SEI) – preparada
pela diluição do padrão primário de isovitexina em metanol e conservada em
congelador.
 Solução Mãe para diluição (SMD) – utilizada para diluir as amostras.
Preparada com a mistura de 32 partes de metanol para 68 partes de solução
aquosa de ácido fórmico (Lafan, Brasil) na concentração de 0,67 %.
 Solução Estoque de EWE a 3,5 mg/mL (SEWE) – preparada pela diluição do
EWE na SMD. Conservada em 2 – 8 °C.
 Suspensão de nanocápsulas vazias (NV) – preparadas conforme tabela 9.
Armazenada em temperatura ambiente.
51
A eficiência do método foi avaliada através da análise, em triplicata, dos
parâmetros cromatográficos resolução, pratos teóricos e fator de cauda para os
picos de vitexina e de isovitexina obtidos nos cromatogramas de uma solução
contendo apenas os padrões de vitexina e de isovitexina, uma solução de EWE e
uma solução de EWE acrescido de nanocápsulas vazias. Estas soluções foram
preparadas conforme descrito na tabela 2.
Tabela 2 – Preparo das soluções teste para eficiência do método
Solução dos padrões
Isovitexina 0,03 mg/mL
Vitexina 0,005 mg/mL
Soluções
SEI 0,25 mg/mL
SEV 0,1 mg/mL
SEWE 3,5 mg/mL
NV
SMD
400
200
------2730
Solução de
EWE 0,35
mg/mL
Volumes (µL)
------200
---1600
Solução de
EWE mais NV
a 0,35 mg/mL
------200
200
1600
Após o preparo, as soluções foram filtradas por filtro de seringa 0,45 µm
VertiPure™ NYLON, 13 mm, Vertical® (Tailândia) e submetidas a banho ultrassônico
Faalk ULT-210 (Brasil) por 20 minutos.
A resolução da vitexina em todos os cromatogramas foi definida entre os
picos da vitexina e da isovitexina, enquanto que a resolução da isovitexina foi
definida entre os picos da vitexina e da isovitexina apenas no cromatograma da
solução dos padrões. Nos cromatogramas das soluções contendo EWE, a resolução
da isovitexina foi determinada entre o pico desta e o pico mais próximo.
Foram tomadas as medidas do tempo de retenção (RT) da vitexina, da
isovitexina e da substância seguinte a isovitexina. Foram também medidas as
larguras dos sinais (W) da vitexina, da isovitexina e da substância seguinte a
isovitexina referentes as tangentes da curva junto a linha base. O cálculo da
resolução foi realizado conforme a equação 1.
Para o cálculo do fator de cauda de cada pico foram medidas as larguras
dos picos de vitexina e de isovitexina no ponto referente a 5 % (1/20 ou 0,05) da
amplitude do pico a partir da linha base (W0,05) e os valores de f, calculados pela
52
diferença entre o RT do pico e o RT do início do sinal no ponto referente a 5 % da
amplitude a partir da linha base. A partir destes dados foi calculado o fator de cauda
para cada pico utilizando a equação 2. Já o número de pratos teóricos da vitexina e
da isovitexina nos cromatogramas avaliados foi determinado pela equação 3.
5.2.4 Seletividade para vitexina e isovitexina em EWE e NEWE
A seletividade do método para vitexina e isovitexina no EWE e no NEWE
foi verificada pela adição dos padrões de vitexina e de isovitexina à solução de
EWE, a fim de verificar o aparecimento de novos picos. Desta forma pode-se
analisar se os picos referentes aos padrões no cromatograma da solução de EWE
pertencem
realmente
a
estas
substâncias.
Ainda,
foram
avaliados
os
cromatogramas de uma solução de nanocápsulas vazias (NV) e da fase móvel
(SMD), para avaliar se estas soluções apresentam picos nos tempos de retenção
relativos à vitexina e isovitexina.
5.2.5 Linearidade
A linearidade para a vitexina e para a isovitexina foi determinada
separadamente. As soluções utilizadas na linearidade da vitexina e da isovitexina
foram preparadas utilizando soluções estoque dos padrões de referência descritas
no item 5.2.2, conforme as tabelas 3 e 4 respectivamente e após o preparo, as
soluções foram submetidas a banho de ultrassônico por 20 minutos.
Tabela 3 – Preparo das soluções padrão de vitexina para linearidade
Soluções adicionadas (µL)
SEV 0,1
mg/mL
SMD
Concentração
corrigida
(mg/mL)
0,0025
25
975
0,00246
0,0040
40
960
0,00396
0,0050
50
950
0,00494
0,0060
60
940
0,00594
0,0075
75
925
0,00742
Concentração
de vitexina
(mg/mL)
53
Tabela 4 – Preparo das soluções padrão de isovitexina para linearidade
Concentração
de isovitexina
(mg/mL)
Soluções adicionadas (µL)
SEI 0,25
mg/mL
SMD
Concentração
corrigida
(mg/mL)
0,015
60
940
0,01358
0,0225
90
910
0,02045
0,030
120
880
0,02697
0,0375
150
850
0,03368
0,045
180
820
0,04110
As concentrações corrigidas foram calculadas conforme a pureza dos
padrões de referência e as calibrações dos micropipetadores utilizados –
micropipetas de volume variável 10 µL a 100 µL e 100 µL a 1000 µL Digipet (Brasil).
Foram realizadas as análises de regressão linear, resíduos e definidas as
equações das linhas de tendência obtidas entre as concentrações e as áreas dos
sinais.
5.2.6 Precisão
Foi avaliada a precisão do método através da análise de repetibilidade de
seis determinações de uma solução contendo os dois padrões (vitexina e
isovitexina) em concentrações lineares (43). A solução foi preparada a partir das
soluções estoque de cada padrão, diluídas em SMD, descritas no item 5.2.2. Após o
preparo, as soluções foram submetidas a banho de ultrassônico por 20 minutos.
O resultado foi expresso pelo coeficiente de variação percentual das seis
determinações conforme equação 4.
5.2.7 Exatidão
A exatidão do método para o doseamento de vitexina e isovitexina foi
determinada pela técnica de adição de quantidade conhecida dos padrões a uma
solução de EWE, onde se avaliou a porcentagem de recuperação dos padrões
adicionados (43).
54
As soluções teste possuíam concentração de isovitexina e de vitexina
próximo ao centro das respectivas curvas analíticas. Foram preparadas duas
soluções estoque conforme descrito abaixo, as soluções teste e de controle foram
preparadas conforme descrito na tabela 5:
 Solução Estoque de Padrões 0,03 mg/mL de isovitexina e 0,005 mg/mL de
vitexina – prepara pela diluição de 360 µL de SEI e de 150 µL de SEV em
2.490 µL de SMD.
 Solução Estoque de EWE 0,35 mg/mL – prepara pela diluição de 3,5 mg de
EWE em 10 mL de SMD.
Tabela 5 – Preparo das soluções teste e controle para exatidão
Solução
controle dos
padrões
Solução
controle
de EWE
Volume final
Concentração teórica de
isovitexina (mg/mL)
Concentração teórica de
vitexina (mg/mL)
Solução
teste 2
Solução
teste 3
Volumes (µL)
Soluções
Solução EWE 0,35 mg/mL
Solução estoque dos
padrões (0,03 mg/mL
isovitexina e 0,005 mg/mL
vitexina)
SMD
Solução
teste 1
----
500
600
500
400
500
----
400
500
600
500
500
----
----
----
1000
1000
1000
1000
1000
0,015
0,015
0,030
0,030
0,030
0,0025
0,0025
0,0050
0,0050
0,0050
Após o preparo, as soluções foram filtradas por filtro de seringa 0,45 µm e
submetidas a banho ultrassônico por 20 minutos.
Para as análises de recuperação as concentrações foram corrigidas
conforme a pureza dos padrões de referência e conforme as calibrações das
micropipetas utilizadas e as exatidões foram calculadas conforme a equação 5.
5.2.8 Exatidão na presença de nanocápsulas
Para avaliar a exatidão do método para o doseamento de vitexina e
isovitexina no EWE em soluções contendo nanocápsulas, foi determinada a
55
porcentagem de recuperação de vitexina e de isovitexina em soluções de EWE
contendo concentrações conhecida destas substâncias e contaminadas com
nanocápsulas vazias (43). Foram utilizadas três concentrações referentes a 80 %,
100 % e 120 % das curvas analíticas. A solução estoque de EWE foi preparada
como descrito abaixo e as soluções teste foram preparadas segundo a tabela 6.
 Solução Estoque de EWE 0,35 mg/mL – prepara pela diluição de 3,5 mg de
EWE em 10 mL de SMD.
Tabela 6 – Preparo das soluções teste e controle para exatidão com nanocápsulas
Solução
controle
de EWE
Solução
teste 80 %
Solução
Solução
teste 100 % teste 120 %
Volumes (µL)
Soluções
Solução EWE 0,35
mg/mL
NV
240
190
240
290
----
150
190
230
SMD
760
660
570
480
Volume final
Concentração teórica
de isovitexina (mg/mL)
Concentração teórica
de vitexina (mg/mL)
1000
1000
1000
1000
0,030
0,024
0,030
0,036
0,0050
0,0040
0,0050
0,0060
Após o preparo, as soluções foram filtradas por filtro de seringa 0,45 µm e
submetidas a banho ultrassônico por 20 minutos.
Para as análises de recuperação as concentrações foram corrigidas
conforme as calibrações das micropipetas utilizadas e as exatidões foram calculadas
conforme a equação 5.
5.2.9 Robustez
Para avaliar a robustez do método foi verificada a sua exatidão perante a
alteração do fluxo (1,07 mL/min. e 1,13 mL/min.) e da temperatura (39 °C e 41 °C),
separadamente, utilizando uma solução de EWE a 0,35 mg/mL em comparação a
mesma solução em condições normais.
56
5.3 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata - EWE
5.3.1 Perfil cromatográfico do EWE
O EWE foi caracterizado pelo seu perfil cromatográfico perante os
flavonóides vitexina e isovitexina e perante as cucurbitacinas cucurbitacina B e
dihidrocucurbitacina B.
O
perfil
cromatográfico
para
flavonóides
foi
determinado
por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em Cromatógrafo Agilent 1200
(USA), utilizando como referência padrões de vitexina e isovitexina. A metodologia
analítica foi validada segundo item 5.2 e as condições cromatográficas estão
descritas na tabela 1.
Já para a determinação do perfil cromatográfico cucurbitano foi utilizada
metodologia por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em Cromatógrafo
Shimadzu 10A (Japão), utilizando como referência padrões de cucurbitacina B e
dihidrocucurbitacina B. A metodologia utilizada está descrita no item 5.3.3.
5.3.2 Teor de vitexina e de isovitexina
A vitexina e a isovitexina foram utilizadas como marcadores químicos do
EWE por serem importantes flavonóides presentes nas raízes da Wilbrandia
ebracteata (3, 36).
O teor de vitexina e de isovitexina foram determinados por CLAE em
Cromatógrafo Agilent 1200 (USA), utilizando técnica descrita na tabela 1 e
metodologia validada segundo item 5.2.
5.3.3 Teor de cucurbitacina B e de dihidrocucurbitacina B
A dihidrocucurbitacina B e a cucurbitacina B foram dosadas no EWE por
serem cucurbitacinas importantes na constituição química das raízes da Wilbrandia
ebracteata (35).
57
O teor de dihidrocucurbitacina B e de cucurbitacina B no EWE foi
determinado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em Cromatógrafo
Shimadzu 10A (Japão).
Para a análise das amostras de EWE, foi realizada a extração prévia com
diclorometano Vetec (Brasil). As amostras foram diluídas em água para a
concentração de 0,75 mg/mL. Em seguida foram realizadas duas extrações com
diclorometano na proporção de 4 partes de solução para 1,5 partes de
diclorometano. Após este processo o diclorometano foi evaporado sob pressão
reduzida em evaporador rotatório e a fração resultante foi ressolubilizada em
metanol. Esta solução foi analisada conforme método descrito por Krepsky e
colaboradores (35), cujas condições cromatográficas estão descritas na tabela 7.
Tabela 7 – Condições cromatográficas para o doseamento de cucurbitacinas
Coluna
Fase móvel
Isocrático
Fluxo
Temperatura
Volume injeção
Detecção
Luna C18 5 µm - (150 x 4.6 mm) Phenomenex® (EUA)
A: Água
B: Acetonitrila grau HPLC Carlo Erba (Itália)
A: 60 %
B: 40 %
1,2 mL/min.
40 oC
20 µL
230 nm
A cucurbitacina B foi identificada e a sua concentração no EWE foi
estimada por comparação direta com o padrão primário de cucurbitacina B
ChromaDex™ (EUA) (pureza ajustada 93,8 %).
Para o doseamento da dihidrocucurbitacina B, foi estabelecida uma
equação de reta obtida a partir de uma curva de calibração realizada com o padrão
de dihidrocucurbitacina B produzido, isolado e identificado conforme descrito por
Farias (105). O padrão de dihidrocucurbitacina B foi diluído em metanol grau HPLC
proveniente de Vetec (Brasil), nas concentrações de 0,05, 0,10, 0,25, 0,40 e 0,50
mg/mL.
A equação da reta referente à curva de calibração para o doseamento de
dihidrocucurbitacina B no EWE está apresentada na tabela 8.
58
Tabela 8 – Equação de reta para dihidrocucurbitacina B.
Y = a + b.X
a
4698,84354
b
3313250
r
0,99964
5.3.4 Perda por dessecação
A determinação da perda por dessecação do EWE foi realizada por
método gravimétrico, no qual se avalia o percentual volatilizado após dessecação a
105 °C. (105).
Foi pesado em balança analítica eletrônica Q-500L210C Quimis (Brasil)
exatamente 0,1 g de EWE em vidro de relógio previamente dessecado a 105 °C
durante 30 minutos em estufa de secagem Q-317M32 Quimis (Brasil) e pesado. O
vidro de relógio com a amostra foi levado à estufa de secagem a 105 °C por duas
horas. Após isso, a amostra foi resfriada em dessecador e pesada. Esta operação foi
realizada até a obtenção de uma massa final constante, ou seja, diferença inferior a
0,5 mg por grama de amostra entre duas pesagens. Entre cada pesagem foi
realizada uma secagem de no mínimo uma hora. Esta análise foi realizada em
triplicata (105).
5.4 DESENVOLVIMENTO DAS NANOCÁPSULAS
5.4.1 Técnica de produção de nanocápsulas por nanoprecipitação de polímero
pré-formado
Para
desenvolver
as
nanocápsulas
foi
utilizado
o
método
de
nanoprecipitação de polímero pré-formado desenvolvido por Fessi e colaboradores
em 1989 (98), conforme a figura 13. Sendo que o polímero utilizado foi a Poli(єcaprolactona) (PCL) Sigma-Aldrich (EUA), que é um polímero biodegradável
reabsorvível.
59
Figura 13 – Método de precipitação de polímero pré-formado.
Fonte: Schaffazick e colaboradores (90).
Segundo o método de nanoprecipitação de Fessi e colaboradores (98),
primeiramente foi dissolvido o EWE (48 mg) em uma fase orgânica contendo 0,16
mL do óleo carreador (triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico – TGL –
Cosmetrade (Brasil)), 38 mg de monoestearato de sorbitano Sigma-Aldrich (EUA),
100 mg de PCL e 27 mL de acetona Vetec (Brasil). A fase orgânica foi vertida,
através de um funil, dentro de uma fase aquosa contendo 77 mg de polissorbato 80
Vetec e 53 mL de água purificada, a qual foi mantida sob agitação magnética por 10
minutos em agitador magnético Fisatom 752A (Brasil) (95, 101).
Após o período de precipitação, a suspensão de nanocápsulas foi
submetida à evaporação sob pressão reduzida à temperatura de aproximadamente
35 °C a 45 °C, para um volume final de 20 mL em evaporador rotatório VV 2000
Heidolph (Alemanha), para evaporação do excesso de água e solvente (95, 101).
Foram preparadas diferentes nanocápsulas que variaram quanto à
concentração final da suspensão, conforme a tabela 9.
Tabela 9 – Composição das nanocápsulas preparadas.
Materiais
PCL
Acetona
Monoestearato de sorbitano
TGL
EWE
NV
100 mg
27 mL
38 mg
0,16 mL
---
Formulações
NV
NEWE
CONC.
0,24 %
100 mg
100 mg
27 mL
27 mL
38 mg
38 mg
0,16 mL
0,16 mL
--48 mg
NEWE
2,4 %
100 mg
27 mL
38 mg
0,16 mL
48 mg
Polissorbato 80
Água purificada
77 mg
53 mL
77 mg
53 mL
77 mg
53 mL
77 mg
53 mL
Volume final
20 mL
2 mL
20 mL
2 mL
---
---
0,24 %
2,4 %
Concentração final de EWE
60
As concentrações de EWE nas formulações descritas na tabela 9 foram
definidas a partir de estudos preliminares da inibição do edema de orelha induzido
por óleo de cróton (2,5 %) em camundongos, pelo tratamento tópico do EWE,
realizados pelo Grupo de Pesquisa de Produtos Naturais (GRUPNAT) coordenado
pela Dra. Anna Paula Piovezan (dados não publicados), em que foi observada
inibição a partir da dose de EWE 1 %.
Para alcançar uma concentração de EWE superior a 1 %, foi produzida a
NEWE 2,4 %, a qual foi preparada da mesma forma que as demais formulações,
porém com alteração na última etapa do processo, evaporando-se a suspensão sob
pressão reduzida até um volume final de 2 mL.
5.5 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS
5.5.1 Eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação foi determinada em função do teor de
isovitexina, vitexina e dihidrocucurbitacina B.
Para determinar o rendimento de encapsulação foi utilizado o método de
ultrafiltração-centrifugação, onde as nanocápsulas foram separadas do ultrafiltrado
que contém apenas EWE livre (não nanoencapsulado).
As suspensões de nanocápsulas foram diluídas (4 vezes para a
suspensão NEWE 0,24 % e 40 vezes para NEWE 2,4 %) e desta diluição, foram
transferidos 500 µL para um dispositivo de ultrafiltração de membrana de celulose
regenerada com abertura de 10.000 daltons AMICON® ULTRACEL® Millipore (EUA)
em um eppendorf. Esta suspensão então foi submetida ao processo de ultrafiltraçãocentrifugação, em microcentrífuga CT-14000R Cientec (Brasil) por 10 minutos a
11.000 rmp (12.332 x g) (95, 101).
As concentrações livres de vitexina, isovitexina e dihidrocucurbitacina B
no ultrafiltrado foram analisadas por CLAE, conforme item 5.3.2 para os flavonóides
e conforme item 5.3.3 para dihidrocucurbitacina B.
O percentual de encapsulação (E) foi determinado a partir da razão entre
a
diferença
da
concentração
total
teórica
de
vitexina,
isovitexina
ou
dihidrocucurbitacina B na amostra (CT) e a concentração de vitexina, isovitexina ou
61
dihidrocucurbitacina B livre no ultrafiltrado (CL) e a concentração total, multiplicados
por 100 % (Equação 6) (91, 94, 97, 101, 106, 107). Esta análise foi realizada em
triplicata.
E = [(CT – CL) ÷ CT] x 100 %
(6)
5.5.2 Determinação de tamanho de partícula por difratometria de laser
A distribuição do tamanho das partículas, o diâmetro médio e a
polidispersão das nanocápsulas foram determinadas por difratometria de laser por
via úmida, através do equipamento Mastersizer 2000 Malvern (Inglaterra) na
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), utilizando látex de
poliestireno como padrão e água como meio dispersante.
As amostras foram adicionadas diretamente ao equipamento até
atingirem o valor de obscurecimento de laser especificado pelo equipamento (acima
de 2 %). Estas avaliações foram realizadas em triplicata.
O diâmetro médio das partículas foi expresso por (D[4,3]), calculado
estatisticamente pela derivada dos diâmetros descrita na equação 7 e o valor de
polidispersão (Span) através da equação 8 (91, 108, 109, 110, 111).
1
p
p+ f
D[p + f, f ]= �
∑ nd
∑ nd
�
(7)
Onde os valores 4 e 3 entre colchetes derivam, respectivamente, dos
expoentes p+f e f, onde o índice p = 1 expressa o tamanho individual da partícula em
função do seu comprimento e o índice f = 3 indica a freqüência de distribuição de
tamanho expressa pelo volume e pela massa das partículas (110).
Span =
d(0,9)- d(0,1)
d(0,5)
(8)
Onde d(0,1) é o tamanho de partícula abaixo do qual 10 % da amostra se
encontra, d(0,9) é o tamanho de partícula abaixo do qual 90 % da amostra se
62
encontra e d(0,5) é a mediana da distribuição de volume ou de número, conforme
distribuição avaliada (91, 108, 109, 110, 111).
5.6 TESTES IN VIVO
5.6.1 Aspectos éticos
Os pesquisadores participantes seguiram adequadamente a legislação
pertinente (Lei 11.794/2008 de 08/10/2008), sobre o manejo, arraçoamento, técnicas
de contenção e sobre as técnicas específicas ligadas aos procedimentos
experimentais. Ainda, com o objetivo de minimizar as variações da técnica, os
experimentos foram conduzidos sempre pelos mesmos pesquisadores.
Os estudos foram realizados após a aprovação pelo Comitê de ética no
uso de animais (CEUA) da UNISUL sob o código 11.037.4.03.IV.
5.6.2 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos com 25 a 35 g e 60 dias de
idade ao início dos testes e ratos Wistar machos com 230 a 300 g. Os animais foram
mantidos em sala com condições controladas de temperatura (22 ± 2 ºC) e
luminosidade artificial (ciclo claro/escuro de 12 horas), com livre acesso à ração e
água e em gaiolas com no máximo 6 animais, permanecendo neste local por
aproximadamente 3 (três) dias para os estudos agudos e 15 (quinze) dias para o
estudo crônico e de irritação dérmica. Os camundongos e os ratos foram mantidos
em biotérios diferentes durante os testes (9, 112, 113).
A categoria em qual os estudos se enquadram é a de estudos com
animais que produzem pequeno ou nenhum desconforto. E foram adotados os dois
tipos de estudo: agudo e crônico.
A forma de eutanásia adotada foi por meio da aplicação de anestésico
geral injetável (Ketamina e Xilasina Syntec (Brasil)), realizada por um médico
veterinário, conforme Resolução N° 714, de 20 de junho de 2002 do Conselho
Federal de Medicina Veterinária (114).
63
5.6.3 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo utilizando modelos de
edema de orelha
5.6.3.1 Delineamento experimental
Para os modelos de edema de orelha foram utilizados camundongos
SWISS machos. Cada grupo teste utilizou em média 6 (seis) camundongos, que
foram divididos aleatoriamente (26, 28).
O edema de orelha foi induzido por óleo de cróton Sigma-Aldrich (EUA) e
a resposta foi determinada pela medida do aumento da espessura das orelhas dos
camundongos, conforme metodologia revisada por Hecker e Schmidt (115). A
espessura da orelha foi medida próxima à extremidade medial com o auxílio de um
micrômetro digital MDC-25SB Mitutoyo (Japão) e foi expressa em micrômetros (µm).
As substâncias testes, o controle e o agente flogístico (óleo de cróton)
foram aplicados topicamente na superfície interna e externa da orelha direita dos
camundongos diluídos em acetona, em volumes de 20 µL por orelha com o auxílio
de micropipeta de volume fixo 20 µL Digipet (Brasil) (26, 28).
Como controle positivo dos métodos agudos e do método crônico, foi
utilizado dexametasona (Tianjin Tian Mao – China) a 1 % diluída em acetona,
utilizando-se 20 µL por orelha. E como controles negativos, foram utilizadas
suspensões de nanocápsulas vazias e/ou nenhum tratamento.
O delineamento dos estudos in vivo em camundongos está representado
na figura 14.
Figura 14 – Delineamento dos estudos in vivo com camundongos.
Controle
positivo
Controle
negativo
5-7
camundongos
Swiss
camundongos
Swiss
Dexametasona
1%
Nenhum
tratamento
5-7
Nanocápsulas
vazias
5-7
camundongos
Swiss
Extrato de raízes
de Wilbrandia
ebracteata
padronizado
(EWE)
5-7
camundongos
Swiss
Extrato de raízes de
Wilbrandia
ebracteata
padronizado
nanoencapsulado
(NEWE)
5-7
camundongos
Swiss
64
Segundo vários autores, deve-se utilizar em média 6 animais por grupo
teste para que se obtenha uma análise estatística dos resultados (9, 10, 11, 26, 28,
113).
Desta forma, conforme a figura 14, para cada modelo de avaliação de
atividade anti-inflamatória foram necessários 5 grupos de animais, totalizando 30
animais por teste. Como no presente estudo foram avaliados 3 ensaios de atividade
anti-inflamatória, foram necessários 90 camundongos.
5.6.3.2 Modelo de avaliação do edema de orelha induzido pela aplicação tópica de
óleo de cróton
Neste modelo foi simulada uma inflamação cutânea aguda através da
aplicação de 20 µL de solução de óleo de cróton a 2,5 % nas orelhas dos
camundongos. Após foram aplicados os controles e os testes (116, 117).
A espessura da orelha dos camundongos foi medida após 4 e 6 horas da
aplicação do agente flogístico (116).
A avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizada pela análise da
diferença entre as espessuras médias das orelhas obtidas entre os grupos de
controle negativo e dos testes.
5.6.3.3 Modelo de inflamação crônica por edema de orelha induzido pela aplicação
múltipla do óleo de cróton
Neste modelo foi simulada uma inflamação cutânea crônica através da
aplicação de 0,4 mg de solução de óleo de cróton diluído em 20 μL de acetona nas
orelhas dos camundongos por 9 dias, em dias alternados. A figura 15 mostra o
delineamento do estudo crônico (28, 113, 118).
65
Figura 15 – Delineamento do estudo crônico.
A espessura da orelha dos camundongos foi medida diariamente antes
das aplicações (118).
Os controles e os testes foram aplicados a partir do quinto dia do
experimento duas vezes ao dia (118).
A avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizada pela análise da
diferença entre as espessuras médias das orelhas obtidas entre os grupos de
controle negativo e dos testes.
5.6.3.4 Análise dos resultados
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. As
variáveis avaliadas foram os diâmetros das orelhas dos testes em relação aos dos
controles negativos, comparando ainda os resultados obtidos para o extrato com os
obtidos para o extrato nanoencapsulado. Foram avaliados por análise de variância
(ANOVA) de uma via seguido de teste Tukey, sendo considerados como
estatisticamente significativos valores de P menores que 0,05 (p < 0,05) (9, 28).
5.6.4 Avaliação da irritação primária de pele: efeito agudo em ratos
Neste modelo foi avaliada a toxicidade das nanocápsulas vazias
concentradas (NV CONC.) e do EWE nanoencapsulado concentrado (NEWE 2,4 %)
através da verificação de irritação dérmica em ratos.
Foram utilizados 8 ratos WISTAR machos para cada grupo teste e 3
animais para o grupo controle, totalizando 19 animais.
66
Os animais foram pesados em balança de precisão BG 2000 Quimis
(Brasil), anestesiados com Ketamina e Xilasina (50:50) e submetidos a tricotomia
dorsal com o auxílio de um tricótomo golden two speed AS® 708005 Oster (EUA)
sem causar danos ao tecido. Após este procedimento o dorso dos animais foi lavado
com solução detergente a 1 % e seco, onde foi demarcada a área de teste de
aproximadamente 4 x 4 cm (119).
Papéis filtro de tamanho 2 x 2 cm foram impregnados com 100 µL das
substâncias testes ou acetona (controle) e então posicionados no dorso dos animais,
fixados por fita micropore hipoalergênica 25 mm x 10 mm 3M (Brasil).
A pele dos animais ficou exposta aos testes e ao controle por 4 horas e
após este período foi retirado o material e a região lavada novamente com solução
detergente 1 %.(119)
As observações foram realizadas após 60 minutos, 24 e 72 horas, da
aplicação e após este período em dias alternados até o 14° dia (119).
A avaliação da irritação cutânea se deu pela análise visual de edema e/ou
eritema classificados conforme Federal Hazardous Substances Act of the USA,
apresentada na tabela 10 (119).
Tabela 10 – Avaliação da irritação cutânea.
Formação de edema
Lesão
Valor
Sem presença de edema
0
Formação de eritema
Lesão
Valor
Sem presença de eritema
0
Edema ligeiramente
perceptível
Edema discreto
Edema moderado
(aprox. 1 mm)
Edema severo
(maior que 1 mm)
Eritema ligeiramente
perceptível
Eritema bem definido
Eritema de moderado a
severo
Eritema severo com
formação de escaras
1
2
3
4
1
2
3
4
Fonte: Brito (119).
A partir da pontuação obtida para as avaliações de edema e de eritema
em todas as análises foi calculada uma média aritmética e a pontuação resultante foi
determinante da classificação da substância teste conforme tabela 11 (119).
67
Tabela 11 – Classificação da substância irritante.
Fonte: Brito (119).
Classificação
Pontuação
Não irritante
0,0 – 1,0
Irritante moderado
1,1 – 2,0
Irritante grave
2,1 – 3,0
Corrosivo
3,1 – 4,0
68
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
VITEXINA E ISOVITEXINA EM EWE E NEWE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIÊNCIA - CLAE
6.1.1 Seletividade
Na figura 16 estão apresentados os cromatogramas obtidos para a
solução contendo apenas os padrões de vitexina e de isovitexina, para a solução de
EWE, para a solução de EWE acrescida dos padrões vitexina e isovitexina, para a
solução de EWE acrescido de nanocápsulas vazias (NV), para a solução de
nanocápsulas vazias (NV) e para a solução dos solventes (SMD).
Figura 16 – Picos de vitexina e isovitexina em corridas cromatográficas de uma
solução contendo os dois padrões em comparação às corridas do EWE e do EWE
acrescido de nanocápsulas vazias.
700
VWD 1
FASE MÓVEL
FASE MÓVEL - CORRIDA 04.dat
VWD 1
NANO VAZIA
NANO VAZIA - CORRIDA 03.dat
VWD 1
EXATIDÃO EWE:PADRÕES (50:50)
EXATIDÃO EWE PADRÕES (50 50) - CORRIDA 5.dat
ISOVITEXINA
VWD 1
EXATIDÃO NANO - 80 %
EXATIDÃO NANO - 80 % - CORRIDA 2.dat
600
700
VWD 1
EXTRATO SOLU
EXTRATO SOLU
600
500
500
VITEXINA
PADRÕES
400
400
mAU
mAU
EWE
300
300
EWE + PADRÕES
200
200
EWE + NV
100
100
NV
SMD
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0
5,5
6,0
Minutes
Pela análise dos cromatogramas da SMD e da NV pode-se observar que
não ocorrem picos nos tempos de retenção referentes aos padrões, o que pode
69
indicar que estes materiais não interferem na análise da vitexina e da isovitexina, no
método desenvolvido.
No cromatograma obtido para a solução de EWE acrescido de NV em
comparação ao cromatograma da solução contendo apenas EWE, pode-se observar
que não ocorrem novos picos, nem alterações nos picos da vitexina e da isovitexina,
indicando não ocorrer alterações no cromatograma destas substâncias pela
presença das nanocápsulas.
Na figura 16, avaliou-se também o cromatograma da solução contendo
EWE e os padrões de vitexina e de isovitexina, onde houve um aumento dos picos
destas substâncias em comparação aos outros picos do cromatograma do extrato
(EWE). Ainda, não foi observado o aparecimento de outros picos que não
estivessem presentes no cromatograma do extrato.
Estes resultados indicam que os picos referentes à vitexina e à isovitexina
no cromatograma do EWE, são reflexos dos sinais obtidos para estas substâncias
exclusivamente. E deste modo, o método proposto pode ser considerado seletivo
para estas substâncias.
As tabelas 12 e 13 mostram os resultados dos parâmetros tempo de
retenção (RT), resolução (Rs), fator de cauda (T) e pratos teóricos (N), obtidos para
a vitexina e a isovitexina na solução contendo apenas os padrões (0,03 mg/mL de
isovitexina e 0,005 mg/mL de vitexina), na solução de EWE 0,35 mg/mL e na
solução de EWE 0,35 mg/mL mais nanocápsulas vazias (NV).
Tabela 12 – Resultados de eficiência para vitexina
Solução dos padrões
(0,03 mg/mL isovitexina
e 0,005 mg/mL
vitexina)
Solução de EWE 0,35
mg/mL
Solução de EWE 0,35
mg/mL mais
nanocápsulas
RT (min.)
Rs
T
N
(média ± DP)
(média ± DP)
(média ± DP)
(média ± DP)
2,88 ± 0,002
5,21 ± 0,048
1,33 ± 0,098
6.955 ± 211
2,88 ± 0,003
5,76 ± 0,075
1,26 ± 0,112
9.249 ± 24
2,88 ± 0,004
5,86 ± 0,091
1,19 ± 0,199
9.305 ± 562
70
Tabela 13 – Resultados de eficiência para isovitexina
RT
Rs
T
N
(média ± DP)
(média ± DP)
(média ± DP)
(média ± DP)
Solução dos
padrões (0,03
mg/mL isovitexina
e 0,005 mg/mL
vitexina)
3,62 ± 0,003
5,21 ± 0,048
1,32 ± 0,016
9.407 ± 315
Solução de EWE
0,35 mg/mL
3,62 ± 0,003
3,04 ± 0,042
1,17 ± 0,131
10.563 ± 434
Solução de EWE
0,35 mg/mL mais
nanocápsulas
3,63 ± 0,005
3,08 ± 0,058
1,24 ± 0,047
11.214 ± 222
A análise dos tempos de retenção (RT) demonstra um coeficiente de
variação (CV) de 0,15 % para vitexina e de 0,12 % para isovitexina. Sendo que não
há diferenças estatisticamente significativas entre os tempos de retenção obtidos
nas corridas dos padrões, do EWE e do EWE mais nanocápsulas, para as duas
substâncias (ANOVA de uma via seguido de Teste Tukey, p < 0,05).
Os resultados de resolução (Rs) para os picos da isovitexina e da
vitexina, tanto nas determinações apenas dos padrões, quanto nas determinações
do EWE e do EWE com nanocápsulas, apresentaram valores acima de 3 (de 3,04 a
5,86), o que indica uma separação total dos picos, pois valores de Rs acima de 1,5
já sugerem a separação completa dos picos, conforme Ciola (44) e US-FDA (46).
Ainda, os resultados de resolução dos picos para as duas substâncias
dos cromatogramas de EWE e de EWE mais nanocápsulas podem ser considerados
iguais estatisticamente (ANOVA de uma via seguido de Teste Tukey, p < 0,05), o
que sugere que a presença de nanocápsulas não interfere na análise da vitexina e
da isovitexina neste método.
Quanto à simetria dos picos da vitexina e da isovitexina pode-se avaliar
como aceitável, pois se obteve valores em torno de 1,2 e abaixo de 2,0 para todas
as situações testadas. Este parâmetro também não foi afetado pela adição de
nanocápsulas, pois não há diferenças estatisticamente significativas entre os valores
de simetria dos picos de vitexina e de isovitexina entre os cromatogramas dos
padrões, do EWE e do EWE mais nanocápsulas (ANOVA de uma via seguido de
Teste Tukey, p < 0,05).
71
Na análise dos pratos teóricos desta metodologia para a vitexina e para a
isovitexina, obteve-se valores acima de 6000, acima do mínimo desejado (2000),
conforme
preconizado
pela
US-FDA
(46).
Ainda,
não
houve
diferença
estatisticamente significativa entre os pratos teóricos obtidos para as duas
substâncias quando analisadas nas soluções de EWE e de EWE mais nanocápsulas
(ANOVA de uma via seguido de Teste Tukey, p < 0,05), demonstrando assim a
eficiência do método.
Como todos os parâmetros avaliados se apresentaram satisfatórios,
podemos concluir que a metodologia definida é eficiente, apresentando ainda um
tempo de análise reduzido, 4 minutos, em comparação a outras metodologias
descritas para estas substâncias, que apresentam tempos de análise próximos de
20 min. (120), 40 min. (103) e 136 min. (120).
Este tempo de análise reduzido deve-se também a coluna cromatográfica
escolhida, Kinetex C18 2,6 μm 100A (100 x 4,6 mm) Phenomenex® (EUA), que
possui partículas menos porosas e de 2,6 μm de diâmetro médio, que são menores
que as partículas porosas utilizadas comumente nas colunas C18, em média 3 a 5
μm de diâmetro. Desta forma, as moléculas de uma mesma substância saem mais
próximas, reduzindo as caudas e os tempos de retenção. (123)
6.1.3 Linearidade
As figuras 17 e 18 apresentam as curvas analíticas obtidas para a vitexina
e para a isovitexina respectivamente.
72
Figura 17 – Curva analítica da vitexina.
Concentração
de vitexina
(mg/mL)
0,00246
0,00396
0,00494
0,00594
0,00742
400000
350000
Área
300000
250000
Área
125413
209284
253074
306225
391948
Y = a + b.X
a = - 4833,14691
b = 52999000
r = 0,99926
200000
150000
100000
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
Vitexina mg/mL
Figura 18 – Curva analítica da isovitexina.
2400000
Concentração
de isovitexina
(mg/mL)
0,01358
0,02045
0,02697
0,03368
0,04110
2200000
2000000
1800000
Área
1600000
1400000
1200000
Área
681291
1101128
1408156
1810947
2195793
Y = a + b.X
a = - 47497,19942
b = 54782000
r = 0,99937
1000000
800000
600000
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
0,045
Isovitexina (mg/mL)
As curvas de concentração x área apresentaram-se lineares para as duas
substâncias analisadas, com coeficiente de correlação r igual a 0,99937 para
isovitexina e 0,99926 para vitexina, sendo estes valores aceitáveis segundo
resolução RE 899/2003 (43), que preconiza valores acima de 0,99.
Nas figuras 19 e 20 encontram-se os gráficos de resíduos das curvas
analíticas da vitexina e da isovitexina, respectivamente.
73
Figura 19 – Gráfico de resíduos para a curva analítica da vitexina.
1,5
Resíduo estandarizado
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
100000
150000
200000
250000
300000
Valor ajustado (área)
350000
400000
Figura 20 – Gráfico de resíduos para a curva analítica da isovitexina.
1,5
Resíduo estandarizado
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
500000
750000
1000000
1250000 1500000 1750000
Valor ajustado (área)
2000000
2250000
Os resíduos obtidos nas análises das curvas analíticas tanto para vitexina
como para isovitexina apresentaram-se homogeneamente dispersos em torno do
zero (0), com valores positivos e negativos, não demonstrando tendências de
desvio.
74
6.1.4 Precisão
Os resultados de precisão obtidos estão apresentados na tabela 14.
Tabela 14 – Resultados de precisão
Vitexina
Isovitexina
Área
Concentração
(mg/mL)
Área
Concentração
(mg/mL)
1
234759
0,00452
1267732
0,02401
2
230992
0,00445
1227114
0,02327
3
242158
0,00466
1275087
0,02414
4
229772
0,00443
1211744
0,02299
5
236374
0,00455
1248830
0,02366
6
233542
0,00450
1227557
0,02328
Média
235426
0,00453
1245395
0,02360
DP
4590,8
0,000087
23740,9
0,000433
CV %
1,95 %
1,91%
1,91 %
1,84%
Determinações
A análise de repetibilidade demonstrou que o método é preciso para a
determinação de vitexina e de isovitexina, com coeficientes de variação de 1,91 % e
1,84 %, respectivamente, sendo estes valores inferiores a 5 %, de acordo com o
preconizado pela RE 899/2003 (43). As concentrações foram calculadas a partir da
equação da reta obtida da linearidade. As seis corridas podem ser observadas
sobrepostas na figura 21.
75
Figura 21 – Corridas cromatográficas dos padrões sobrepostas para análise de
precisão do método.
250
250
VWD 1
PRECISÃO VITEXINA ISOVITEXINA SOLUÇÃO 2
PRECISÃO VITEXINA ISOVITEXINA SOLUÇÃO 2 - CORRIDA 7.d
VWD 1
PRECISÃO VITEXINA ISOVITEXINA SOLUÇÃO 2 - CORRIDA 8.dat
VWD 1
PRECISÃO VITEXINA ISOVITEXINA SOLUÇÃO 2 - CORRIDA 9.dat
225
225
200
200
175
175
150
150
125
125
mAU
mAU
ISOVITEXINA
100
100
75
75
VITEXINA
50
50
25
25
0
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
6.1.5 Exatidão
Os resultados de recuperação dos padrões adicionados ao EWE, obtidos
no ensaio de exatidão estão apresentados na tabela 15, onde os valores de
concentração teórica foram calculados com base nos resultados da solução controle
de padrões.
EWE
Vitexina
Isovitexina
[ ] Padrão [ ] Padrão
[ ] Padrão [ ] Padrão
Exatidão
Exatidão
adicionado recuperado
adicionado recuperado
Média (%)
Média (%)
(mg/mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
Solução
0,00186 ±
100,40 ±
0,0110 ±
102,73 ±
0,00185
0,0107
0,000042
2,361
0,00027
2,794
teste 1
Solução
0,00226 ±
98,34 ±
0,0132 ±
100,22 ±
0,0023
0,013
0,000062
2,829
0,00020
1,662
teste 2
Solução
0,00274 ±
100,16 ±
0,0158 ±
101,40 ±
0,00274
0,0156
0,000070
2,647
0,000086
2,568
teste 3
Média
Exatidão
99,65 ± 2,370 %
101,34 ± 2,173 %
76
A exatidão do método para a vitexina foi de 99,65 ± 2,370 % e para a
isovitexina foi de 101,34 ± 2,173 %, segundo pode-se concluir que os valores obtidos
experimentalmente nesta metodologia encontram-se muito próximos aos valores
reais conforme preconizado pela resolução RE n° 899 de 2003 da ANVISA (43).
6.1.6 Exatidão em presença de nanocápsulas
Os resultados de recuperação de vitexina e de isovitexina no EWE
acrescido de nanocápsulas vazias estão descritos na tabela 16, onde a
concentração teórica foi calculada com base no resultado da solução controle de
EWE.
EWE na presença de nanocápsulas
Solução
80 %
Solução
100 %
Solução
120 %
Média
Exatidão
Vitexina
Isovitexina
[ ]
[ ] teórica
Exatidão
encontrada
(mg/mL)
Média (%)
(mg/mL)
0,0041 ±
101,06 ±
0,0041
0,00002
0,006
0,0052 ±
101,63 ±
0,0051
0,00012
0,024
0,0062 ±
101,70 ±
0,0061
0,00017
0,028
[ ]
[ ] teórica
Exatidão
encontrada
(mg/mL)
Média (%)
(mg/mL)
0,0217 ±
98,54 ±
0,022
0,0003
0,014
0,0274 ±
99,33 ±
0,00276
0,00059
0,021
0,033 ±
100,17 ±
0,033
0,0005
0,016
101,47 ± 0,019 %
99,35 ± 0,017 %
A taxa de recuperação de isovitexina e vitexina adicionadas em uma
suspensão de nanocápsulas vazias foi de 101,47 ± 0,019 % e 99,35 ± 0,017 %
respectivamente. De acordo com a resolução RE n° 899 de 2003 da ANVISA (43),
estes resultados demonstram que a presença de nanocápsulas não afetou a
exatidão da metodologia, pois os valores de exatidão obtidos estão muito próximos a
100 %.
77
6.1.7 Robustez
Os resultados de robustez quanto à variação de fluxo e de temperatura
estão apresentados nas tabelas 17 e 18 respectivamente.
Tabela 17 – Efeito de variação de fluxo para doseamento de vitexina e isovitexina no
EWE
Vitexina
Fluxo
Isovitexina
(mL/min)
Concentração
encontrada (mg/mL)
Exatidão
Média (%)
Concentração
encontrada (mg/mL)
Exatidão
Média (%)
1,1
0,00515 ± 0,000149
100,00 ± 2,886
0,0278 ± 0,00031
100,00 ± 1,128
1,07
0,00541 ± 0,000098
105,01 ± 1,893
0,0286 ± 0,00033
102,95 ± 1,203
1,13
0,00515 ± 0,000088
99,95 ± 1,696
0,0276 ± 0,00033
99,42 ± 1,178
Tabela 18 – Efeito de variação de temperatura para doseamento de vitexina e
isovitexina no EWE
Vitexina
Temp.
Isovitexina
(°C)
Concentração
encontrada (mg/mL)
Exatidão
Média (%)
Concentração
encontrada (mg/mL)
Exatidão
Média (%)
40
0,00515 ± 0,000149
100,00 ± 2,886
0,0278 ± 0,00031
100,00 ± 1,128
39
0,0050 ± 0,0001
96,14 ± 0,850
0,0285 ± 0,00070
102,55 ± 2,512
41
0,0053 ± 0,00007
102,40 ± 1,303
0,0284 ± 0,00033
102,46 ± 1,178
O método pode ser considerado robusto para a análise de isovitexina nas
variações de fluxo de 1,07 mL /min. até 1,13 mL/min. e de temperatura de 39 °C até
41 °C, pois os resultados de exatidão obtidos nestas condições em comparação aos
resultados obtidos nas condições normais de temperatura e de fluxo (40 °C e 1,1
mL/min.) encontram-se próximos a 100 %, sendo 102,95 ± 1,203 %, 99,42 ± 1,178
%, 102,55 ± 2,512 % e 102,46 ± 1,178 %, respectivamente. Ainda, para a
isovitexina, os valores de concentração obtidos não são diferentes estatisticamente,
para todas as circunstâncias testadas (ANOVA de uma via seguido de Teste Tukey,
p < 0,05).
Para a vitexina, o método também é robusto para a variação de
temperatura avaliada (39 °C até 41 °C) e para a variação de fluxo somente de 1,1
mL/min. até 1,13 mL/min., pois nestas condições, além de apresentar valores de
78
exatidão próximos a 100 % (96,14 ± 0,850 % e 102,40 ± 1,303 %, para 39 °C e 41
°C, respectivamente e 99,95 ± 1,696 % para 1,13 mL/min.) não foi constatada
diferença estatisticamente significativa entre os resultados de concentração obtidos.
Apenas para a variação de fluxo de 1,07 mL/min., a concentração detectada
apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparada com os
outros fluxos, com uma exatidão de 104,17 ± 1,878 % (ANOVA de uma via, seguida
de Teste Tukey, p < 0,05).
6.2 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE Wilbrandia ebracteata (EWE)
O EWE preparado conforme item 5.1, apresentou rendimento de 1,06 %.
Na figura 22 está apresentado o aspecto do extrato obtido.
Figura 22 – Imagem do EWE.
O EWE apresentou aparência de um pó higroscópico amarelo, com um
odor característico. Apresentando um resultado de perda por dessecação de 17,18 ±
0,721 % (média ± DP).
Na figura 23 está apresentado o perfil cromatográfico do EWE frente aos
flavonóides vitexina e isovitexina.
79
Figura 23 – Perfil cromatográfico em 330 nm do EWE frente à vitexina e isovitexina.
400
VWD 1
EXATIDÃO NANO - CONTROLE EWE
EXATIDÃO NANO - CONTROLE EWE - CORRIDA 5.dat
350
350
ISOVITEXINA
mAU
300
300
250
250
200
200
150
150
mAU
400
VITEXINA
100
100
50
50
0
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Os flavonóides identificados na figura 23, vitexina e isovitexina, foram
descritos por Santos, Santos e Schenkel (36) como constituintes da fração
butanólica de um extrato obtido das raízes de Wilbrandia ebracteata.
O perfil cromatográfico do EWE obtido a 230 nm pela metodologia
descrita no item 5.3, está apresentada na figura 24.
80
Figura 24 – Perfil cromatográfico do EWE obtido em 230 nm.
600000
500000
Área
400000
300000
Dihidrocucurbitacina B
200000
Cucurbitacina B
100000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo (min.)
Na figura 24 pode-se observar em 12,4 min. o pico da cucurbitacina B e
em 13,6 min. o pico da dihidrocucurbitacina B, as mesmas cucurbitacinas
observadas por Krepsky e colaboradores (35) em fração diclorometânica de um
extrato etanólico de Wilbrandia ebracteata.
Os teores de vitexina, isovitexina, cucurbitacina B e dihidrocucurbitacina B
no EWE, quantificados utilizando as metodologias descritas nos itens 5.3.3 e 6.1,
estão apresentados na Tabela 19.
Tabela 19 – Teor de vitexina, isovitexina, cucurbitacina B e dihidrocucurbitacina B no
EWE.
Substância
Teor em mg/g
(Média ± DP)
Isovitexina
81,6 ± 4,40
Vitexina
15,1 ± 0,58
Cucurbitacina B
(valor aproximado)
3,05 ± 0,219
0,025
81
Os resultados demonstram que aproximadamente 8 % de EWE é
composto de isovitexina e 1,5 % de vitexina. Isto indica que o EWE é extremante
rico em flavonóides, sendo que aproximadamente 10 % de sua massa é constituída
apenas destas substâncias.
Em relação às cucurbitacinas, o EWE possui aproximadamente 0,3 % de
dihidrocucurbitacina B e para a cucurbitacina B foram detectadas concentrações
abaixo da capacidade de quantificação do método analítico. Desta forma os
resultados para cucurbitacina B são determinações aproximadas.
6.3 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS
6.3.1 Eficiência de encapsulação
Os resultados de eficiência de encapsulação do EWE, obtidos para as
suspensões de nanocápsulas NEWE 0,24 % e NEWE 2,4 % estão apresentados na
tabela 20.
Tabela 20 – Eficiência de encapsulação do EWE.
Encapsulação Média (%)
Vitexina
Isovitexina
NEWE 0,24 %
47,3 ± 0,98
53,5 ± 0,94
ND *
NEWE 2,4 %
39,1 ± 0,58
50,3 ± 1,90
88,6 ± 0,69
*ND = não determinado devido à concentração de dihidrocucurbitacina B encontra-se abaixo da
capacidade de detecção do método na suspensão NEWE 0,24 %.
Para a formulação NEWE 0,24 %, foi obtida uma eficiência de
encapsulação de 47,3 % para a vitexina e de 53,5 % para a isovitexina. Enquanto
que para a formulação concentrada, NEWE 2,4 %, os valores de eficiência de
encapsulação obtidos foram de 39,1 %, 50,3 % e 88,6 % para vitexina, isovitexina e
dihidrocucurbitacina B, respectivamente.
Os resultados de eficiência de encapsulação da isovitexina obtidos para o
NEWE 0,24 % e o NEWE 2,4 % não apresentaram diferença estatisticamente
significativa (ANOVA de uma via seguido por Teste Tukey, p < 0,05), porém
82
mostraram uma tendência de redução no NEWE 2,4 %. Entretanto, para a vitexina,
houve diferença significativa entre as taxas de encapsulação obtidas para as
formulações avaliadas (p < 0,05).
A diferença observada pode ser associada ao processo de produção do
NEWE 2,4 %, em que a suspensão de nanocápsulas NEWE 0,24 % foi concentrada
até um décimo de seu volume. Este processo requereu a manutenção adicional da
suspensão de nanocápsulas na temperatura de 45 °C por 13 minutos,
aproximadamente. Esta exposição extra das nanocápsulas da formulação NEWE
2,4 % à temperatura de 45 °C pode ter favorecido a difusão dos flavonóides do
núcleo, ou da superfície das nanocápsulas para o meio aquoso. Como a vitexina é
mais solúvel em água que a isovitexina (solubilidade teórica da vitexina e isovitexina,
respectivamente, 3,92 mg/mL e 1,72 mg/mL) (123), pode-se sugerir que o processo
de concentração promoveu maior migração de vitexina para o meio aquoso (externo)
do que de isovitexina.
As taxas de encapsulação de polifenóis pelo método de nanoprecipitação
relatados na literatura apresentam em média valores superiores a 90 %, superiores
aos valores observados para vitexina e isovitexina neste trabalho (124, 125, 130).
Ainda, em estudos de encapsulação de quercetina, um flavonóide com estrutura
similar a vitexina e a isovitexina, Wu e colaboradores (106) obtiveram eficiência de
encapsulação superior a 99 % com o método de nanoprecipitação, utilizando poly
(lactide-co-glycolide) (PLGA) e Eudragit E® e Ghosh e colaboradores (127)
obtiveram uma eficiência de encapsulação de 68 ± 3,2 %, utilizando PLGA como
polímero e um método modificado de emulsão-difusão-evaporação. A menor taxa de
encapsulação da isovitexina e vitexina em relação ao observado com a quercetina
pode estar associado às diferenças de solubilidade e lipossolubilidade destas
substâncias. A quercetina apresenta um coeficiente de partição óleo/água (logP)
teórico de 1,48 e solubilidade em água de 0,06 mg/mL enquanto que a vitexina e
isovitexina apresentam logP e solubilidade de
0,32 e 3,92 mg/mL, 0,37 e 1,72
mg/mL, respectivamente. A maior lipossolubilidade da quercetina e consequente
menor solubilidade em água favorece a sua difusão e permanência no núcleo oleoso
da nanocápsula (90, 123).
Desta forma, sugere-se que a menor encapsulação dos flavonóides em
comparação aos dados da literatura não esteja relacionada ao método utilizado
83
(nanoprecipitação) e sim a outros fatores, como a lipossolubilidade dos flavonóides
analisados, ou ainda a escolha do núcleo oleoso (TGL), pois a taxa de encapsulação
depende da solubilidade das substâncias neste. (90)
A encapsulação da dihidrocucurbitacina B obtida foi de 88,6 %,
quantidade superior ao obtido para os flavonóides. Na literatura não foram
encontrados relatos de nanoencapsulação da dihidrocucurbitacina B, entretanto
estes resultados são semelhantes aos obtidos por Molavi e colaboradores (128) na
encapsulação da cucurbitacina B em micelas de copolímero em bloco poli(óxido de
etileno)-block-poli(benzil carboxilato-caprolactona) (PEO-b-PBCL 5.000-4.700) por
um método de evaporação do co-solvente, onde obtiveram uma encapsulação de
92,9 %. A superior taxa de encapsulação pode ser atribuída à elevada
lipossolubilidade destas moléculas, fato que favorece sua difusão e permanência no
núcleo oleoso.
No quadro 1 estão apresentadas as estruturas químicas das moléculas de
vitexina, isovitexina e dihidrocucurbitacina B, bem como os seus respectivos LogP e
solubilidade em água calculados por Madison Metabolomics Consortium Database
(123).
84
Quadro 1 – Estruturas químicas de vitexina, isovitexina e dihidrocucurbitacina B com
os seus respectivos LogP e solubilidade em água calculados.
LogP (octanol/água): 3,84
Solubilidade em água: 0,01 mg/mL
Isovitexina
Vitexina
Fontes: CUI (123) e ZHANG (129).
Como apresentado no quadro 1, o LogP calculado da dihidrocucurbitacina
B (3,84) é maior que os LogP calculados dos flavonóides (0,37 para isovitexina e
0,32 para vitexina). Assim a dihidrocucurbitacina B, por ter maior afinidade com o
núcleo oleoso (TGL) das nanocápsulas apresentou maior encapsulação (88,6 %)
enquanto que os flavonóides, mais solúveis em água que a dihidrocucurbitacina B,
ficaram retidos em menor proporção nas nanocápsulas (39,1 % para vitexina e 50,3
% para isovitexina).
Da mesma forma, a diferença de encapsulação encontrada entre a
vitexina (39,1 %) e a isovitexina (50,3 %) para uma mesma formulação, também
pode ser explicada pela solubilidade destas substâncias em água, 3,92 mg/mL e
1,72 mg/mL respectivamente. Justificando a menor eficiência de encapsulação
85
obtida para a vitexina, que apresenta maior solubilidade em água quando
comparada com a isovitexina.
6.3.2 Determinação de tamanho de partícula por difratometria de laser
As nanocápsulas descritas na tabela 9, preparadas conforme item 5.4.1,
foram analisadas por difratometria de laser e as curvas de distribuição
granulométrica estão apresentadas nas figuras 25 a 27. Os resultados das análises
granulométricas frente à distribuição de volume estão descritos na tabela 21.
de nanocápsulas vazias (NV).
NEWE 0,24 %.
86
NEWE 2,4 %.
de volume.
Suspensões de
nanocápsulas
NV
d(0,1)
(µm)
d(0,5)
(µm)
d(0,9)
(µm)
D[4,3]
(µm)
Span
0,079
0,126
0,195
0,132
0,917
NEWE 0,24 %
0,076
0,123
0,196
0,130
0,973
NEWE 2,4 %
0,103
0,238
45,928
12,117
192,927
Nas análises granulométricas referentes à distribuição de volume, as
medianas da distribuição de volume (d(0,5)) das amostras de NV e NEWE 0,24 %
apresentaram-se próximas a 120 nm, conforme também pode ser observado nas
figuras 25 e 26. Enquanto que a amostra de NEWE 2,4 %, que sofreu um processo
de concentração maior, apresentou uma mediana de 238 nm, que pode ser
visualizada
na
figura
27.
Estas
medianas
apresentam
uma
diferença
estatisticamente significativa para um p < 0,05 (ANOVA de uma via seguido por
Teste Tukey).
Quanto ao diâmetro médio, expresso por D[4,3], as formulações de NV e
NEWE 0,24 % apresentaram valores médios de 132 nm e 130 nm, respectivamente,
sendo estes valores iguais estatisticamente (p < 0,05). Já a formulação NEWE 2,4
%, apresentou um diâmetro médio superior a 10.000 nm, saindo da faixa de
nanopartículas (até 1.000 nm). Estes resultados são devidos a avaliação frente à
distribuição volumétrica das partículas, onde o volume decorrente de uma pequena
87
quantidade de partículas micrométricas ou da agregação de partículas nanométricas
pode ter uma alta influência. A presença destas partículas micrométricas ou dos
agregados das partículas pode ser observada na figura 27.
A presença destas partículas volumosas também afetou a avaliação de
polidispersão (Span) da suspensão de nanocápsulas NEWE 2,4 %, que apresentou
um alto valor de polidispersão,192,927. No entanto, as formulações NV e NEWE
0,24 % apresentaram distribuições estreitas na faixa de polidispersão, 0,917 e 0,973,
respectivamente.
Frente às influências das partículas de maior volume nos parâmetros
avaliados, foram analisados estes mesmos parâmetros das análises granulométricas
frente à distribuição de número de partículas, apresentados na tabela 22.
de número de partículas.
Suspensões de
nanocápsulas
NV
d(0,1)
(µm)
d(0,5)
(µm)
d(0,9)
(µm)
D[4,3]
(µm)
Span
0,059
0,086
0,136
0,132
0,897
NEWE 0,24 %
0,055
0,081
0,131
0,130
0,937
NEWE 2,4 %
0,062
0,094
0,163
0,186
1,079
Na análise granulométrica frente à distribuição de número de partículas as
distribuições apresentaram-se estreitas, com valores médios de polidispersão
(Span), de 0,897 para NV, 0,937 para NEWE 0,24 % e 1,079 para NEWE 2,4 %,
confirmando que o número de partículas de tamanho micro, ou o número de
partículas agregadas deve ser baixo.
Ainda, através desta análise foram obtidas medianas de distribuição de
número (d(0,5)) de 81 a 94 nm, dentro da faixa nanométrica. Sendo que as
medianas obtidas para NV e NEWE 0,24 % são estatisticamente iguais (ANOVA de
uma via seguido por Teste Tukey, p < 0,05).
Através da análise do diâmetro médio frente à distribuição de número de
partículas por tamanho (D[4,3]), que apresentou valores dentro da escala
nanométrica (130 a 186 nm) para todas as formulações testadas, pode-se concluir
88
que o número de partículas de maior volume (micrométricas) deve exercer pouca
influência na média.
Apesar de a análise granulométrica frente à distribuição de número de
partículas demonstrar baixa quantidade de partículas de tamanho micro, como
observado nas figuras 25 a 27 estas partículas ocorreram apenas na formulação que
sofreu o maior processo de concentração (NEWE 2,4 %). Desta forma, pode-se
sugerir que o processo de concentração pode ser a causa das alterações
encontradas. A agregação das partículas e a formação de microcápsulas podem ter
sido favorecidas principalmente pela exposição prolongada a temperatura de 45 °C,
ou a alta concentração de nanocápsulas na formulação que pode favorecer um
processo de agregação das nanopartículas.
Ainda, os tamanhos de nanocápsulas obtidos, estão semelhantes aos
citados na literatura, onde polifenóis como a quercetina e a curcumina
nanoencapsulados pelo método de nanoprecipitação, apresentaram tamanhos
médios em torno de 85 nm (130).
6.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO UTILIZANDO
MODELOS DE EDEMA DE ORELHA
Estudos realizados pelo Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais
(GRUPNAT) coordenado pela Dra. Anna Paula Piovezan demonstraram que o
tratamento dos animais com doses acima de EWE 1 % foram capazes de inibir o
formação do edema induzido pelo óleo de cróton (2,5 %) (Dados não publicados). A
partir destes resultados foi escolhida a dose de 2,4 % do EWE puro ou
nanoencapsulado, para a realização dos experimentos.
Os resultados do tratamento tópico do EWE 2,4 % e do NEWE 2,4 %
sobre edema de orelha de camundongos induzido pela aplicação tópica de óleo de
cróton (2,5 %) estão apresentados na figura 28.
89
Figura 28 – Efeito do tratamento tópico do EWE a 2,4 % e do NEWE 2,4 % em
edema de orelha agudo induzido por óleo de cróton em camundongos mostrando o
edema resultante após 4 h e após 6 h da aplicação do agente flogístico, com o erro
padrão. A espessura da orelha foi medida utilizando micrômetro digital. O efeito dos
compostos foi avaliado através da variação da espessura da orelha, calculada como
a diferença entre a espessura inicial e final. N = 6-5 animais. Análise estatística:
ANOVA de uma via seguido por Teste Tukey. * p < 0,01; ** p < 0,001; *** p < 0,0001
em relação ao controle negativo (C). Sendo DEX = dexametasona 1 % e NV CONC.
= nanocápsulas vazias concentradas 10 vezes.
350
300
Edema (Δµm)
250
*
**
* **
200
4H
150
6H
100
*** ***
50
0
C
DEX
NV CONC.
NEWE 2,4 % EWE 2,4 %
A aplicação do óleo de cróton (2,5 %) na orelha de camundongos induziu
a formação do edema expresso em 305,0 ± 7,19 µm de espessura, após 6 horas de
sua administração.
O tratamento tópico dos animais com dexametasona (1 %), considerado
controle positivo do teste, inibiu a formação do edema em 86,9 %. Esta inibição
também foi observada com o tratamento dos animais com EWE 2,4 % e NEWE 2,4
% (tópico) em 31,2 % e 26,2 % respectivamente (Figura 28).
Os resultados de inibição de edema obtidos para o EWE 2,4 % e NEWE
2,4 % não apresentaram diferença estatística, para um p < 0,05. Este resultado pode
significar que a nanoencapsulação do EWE não conferiu maior atividade antiinflamatória sobre o processo inflamatório agudo gerado pelo óleo de cróton (2,5 %,
tópico).
90
A atividade antiedematogênica do EWE 2,4 % e do NEWE 2,4 % pode ser
atribuída à presença de flavonóides como a vitexina e a isovitexina e a presença de
cucurbitacinas
(cucurbitacina
B
e
dihidrocucurbitacina
B)
identificadas
e
quantificadas no EWE (item 6.2).
Alguns estudos de avaliação de atividade anti-inflamatória de flavonóides
como a quercetina e o kaempferol têm demonstrado significativa ação antiinflamatória, atribuída à inibição das enzimas fosfolipase A2 (PLA2), lipoxigenase
(LOX), ciclooxigenase (COX) e inibição da produção de óxido nítrico (NO) através da
modulação da enzima NO sintase induzível (iNOS). (131, 132, 133). Ainda, em um
modelo que imita a inflamação pulmonar (camundongos expostos a aerossóis de
lipopolissacarideo), a vitexina (400 µg/Kg) reduziu de modo dose-dependente 80 %
do influxo de neutrófilos pulmonares (132).
O mecanismo inflamatório do óleo de cróton pela via tópica envolve a
ativação da proteína quinase C (PCK) e de uma cascata de eventos inflamatórios
que promovem a ativação da PLA2, assim como das enzimas COX e LOX, migração
de neutrófilos e liberação de histamina e serotonina (134, 135, 136). Devido ao
mecanismo de ação relatado a alguns flavonóides, em maior concentração no EWE
(aproximadamente 10 % do EWE) e a presença de cucurbitacinas, pode-se sugerir
que a atividade antiedematogênica tópica observada para o EWE 2,4 % (31,2 %) e o
NEWE 2,4 % (26,2 %) pode estar associada à inibição das enzimas COX e LOX
e/ou PLA2, reduzindo prostaglandinas e leucotrienos.
Com o objetivo de avaliar se a administração prévia e consecutiva de
EWE e NEWE pode incrementar a atividade antiedematogênica observada no
modelo anterior, foi realizado um estudo de avaliação de anti-inflamatória aguda pela
medida da inibição de edema de orelha em camundongos, produzido pela aplicação
tópica de óleo de cróton (2,5 %) mediante tratamento prévio dos animais com 20 µL
de EWE 2,4 % ou NEWE 2,4 % (tópico) diários, por 5 dias.
Após o tratamento prévio dos camundongos com os testes e com o
controle de NV CONC, foi identificado visualmente edema e eritema em alguns
grupos. Desta forma, os resultados apresentados na figura 29 não estão descritos
em variação de espessura (edema) e sim em espessura (µm).
91
Figura 29 – Resultados da avaliação do edema de orelha de camundongos induzido
por óleo de cróton após tratamento prévio de 5 dias. Efeito do EWE 2,4 % e do
NEWE 2,4 % em edema de orelha agudo induzido por óleo de cróton em
camundongos mostrando a espessura média da orelha antes e após 6 h da
aplicação do agente flogístico, com o erro padrão. A espessura da orelha foi medida
utilizando micrômetro digital. O efeito dos compostos foi avaliado através da
comparação da espessura da orelha dos testes com o controle. N = 6-5 animais.
Análise estatística: ANOVA de uma via seguido por Teste Tukey. * p < 0,05; ** p <
0,0001 em relação ao controle negativo (C). Sendo DEX = dexametasona 1 % e NV
CONC. = nanocápsulas vazias concentradas 10 vezes.
700
600
**
Espessura (µm)
500
**
400
*
BASAL
300
6H
200
100
0
C
Nos
resultados
DEX
NV CONC. EWE 2,4 % NEWE 2,4 %
apresentados
na
figura
29
observa-se
a
ação
edematogênica do óleo de cróton (2,5 %) em orelhas de camundongos onde
promoveu o aumento da espessura da medida basal destas de 340,0 ± 3,21 µm para
644,0 ± 5,11 µm, 6 horas após a aplicação.
O controle positivo realizado pela aplicação tópica de dexametasona (1
%) no dia do teste inibiu a formação do edema em 86,8 %.
O tratamento tópico das orelhas dos animais com 20 µL de EWE 2,4 %
durante os 4 dias anteriores ao teste e no dia do teste, reduziu a espessura das
orelhas em 48,2 %, em relação ao controle negativo, com significância estatística (p
< 0,0001). Este resultado de atividade antiedematogênica é superior ao obtido com
uma única aplicação do EWE 2,4 % (31,2 %), o que sugere que o pré-tratamento
aumenta a atividade anti-inflamatória do extrato.
92
Neste estudo, a espessura basal média das orelhas do grupo NV CONC.
aumentou significativamente em relação à espessura basal média do controle
negativo (22,9 %) (p < 0,05), indicando que o pré-tratamento com as nanocápsulas
testadas pode causar edema. Este fato também foi evidenciado visualmente, onde
os pesquisadores observaram edema nas orelhas dos camundongos dos grupos NV
CONC. e NEWE 2,4 % no dia do teste. Razão pela qual justificou a avaliação dos
resultados em espessura da orelha e não em variação de edema, pois a avaliação
tradicional resultaria em um falso resultado para os grupos que possuíam um edema
inicial no dia do teste.
O pré-tratamento dos animais com o NEWE 2,4 % (tópico), não
apresentou atividade antiedematogênica no estudo, conforme visualizado na figura
30. Entretanto, o NEWE 2,4 % apresentou esta atividade no modelo agudo (figura
28). Como as nanocápsulas vazias (NV CONC.) promoveram edema no prétratamento (figura 29), pode-se sugerir que o edema promovido pelas nanocápsulas
neste modelo pode ter ocultado a expressão da atividade antiedematogênica do
EWE nanoencapsulado.
Posteriormente foi avaliada a atividade anti-inflamatória sobre edema de
orelha crônico induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton, cujos resultados
estão apresentados na figura 30.
93
Figura 30 – Efeito do EWE a 2,4 % e do NEWE 2,4 % em edema de orelha crônico
induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton em camundongos mostrando a
curva tempo-resposta do efeito durante 9 dias. Pontos escuros sob os dias indicam
quando a aplicação do óleo de cróton ocorreu. A espessura da orelha foi medida
diariamente, utilizando micrômetro digital. No quinto dia do estudo ocorreu a primeira
aplicação dos controles e dos testes, duas vezes por dia, até o oitavo dia (as setas
indicam os dias em que o tratamento ocorreu). O efeito dos compostos foi avaliado
através da variação da espessura da orelha, calculada como a diferença entre a
espessura inicial e final. N = 7-4 animais. Análise estatística: ANOVA de uma via
seguido por Teste Tukey. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001 em relação ao
controle negativo (C). Sendo DEX = dexametasona 1 % e NV CONC. =
nanocápsulas vazias concentradas 10 vezes.
A figura 30 mostra a evolução do edema de orelha dos grupos avaliados,
onde na fase inicial do estudo, até o dia 5, não foi observado diferenças entre os
grupos, apenas uma variação no edema associado à aplicação do óleo de cróton em
dias alternados. Este comportamento é esperado, pois neste período não foi iniciada
a aplicação dos ativos.
A partir do dia 6, é possível observar variações no edema produzidas pela
aplicação do extrato, do extrato nanoencapsulado e dos controles duas vezes ao
dia, promovendo resultados de edema diferentes entre os grupos avaliados.
94
O tratamento tópico das orelhas dos camundongos em dias alternados
com o óleo de cróton (0,4 mg) mostrou um edema agudo no dia seguinte a
aplicação, seguido de brusca redução no terceiro dia. A partir da segunda aplicação
do óleo de cróton, que ocorreu no terceiro dia, houve um aumento do edema que
nos dias subsequentes não apresentou reduções expressivas, indicando que o
processo inflamatório crônico foi estabelecido.
Os resultados demonstram uma redução progressiva do edema de orelha
a partir do início da aplicação tópica da dexametasona (1 %). Esta atividade
demonstrou diferença significativa (p < 0,0001) quando comparado com a evolução
do controle.
O EWE 2,4 % promoveu uma pequena redução do edema a partir do
primeiro dia de tratamento tópico das orelhas dos camundongos, se mantendo ao
longo do estudo. Esta redução não apresentou significância estatística quando
comparada ao controle negativo (p < 0,05).
O modelo de avaliação de atividade anti-inflamatória crônica utilizado
promove um edema decorrente de um processo inflamatório previamente
estabelecido através da aplicação múltipla de óleo de cróton. O processo
inflamatório crônico gerado neste modelo está associado a uma intensa infiltração
de neutrófilos, migração de macrófagos e células T (CD4+ e CD8+) e hiperproliferação
da epiderme (28, 113, 137). Neste modelo, a redução do edema pode ser
conseguida por substâncias anti-inflamatórias cujo mecanismo de ação envolva a
inibição da 5-LOX ou por corticoesteróides, como a dexametasona, utilizada como
controle (137). Assim, segundo Green e Shuster (137), o edema gerado por este
modelo sofrerá pouca ou nenhuma redução quando tratado com substâncias
inibidoras da COX ou anti-histamínicas, que possuem atividade no modelo agudo.
Desta forma, comparando os resultados obtidos com o tratamento dos
animais com o EWE 2,4 % nos modelos agudo e crônico, com outros estudos de
avaliação de atividade anti-inflamatória realizados com a Wilbrandia ebracteata, que
propõe um mecanismo de ação envolvendo a inibição de prostaglandinas E2 pela
inibição da COX-2 (4, 5, 10, 11), pode-se sugerir que a atividade do EWE envolva a
inibição das enzimas COX-2 e/ou PLA2 pelas cucurbitacinas e pela capacidade dos
flavonóides de seqüestrar espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio,
95
incluindo os radicais superóxido, peroxil e peroxinitrito os quais estimulam COX-2
(138).
Os tratamentos realizados com NEWE 2,4 % e NV CONC. promoveram
aumento do edema a partir do primeiro dia de tratamento (tópico) das orelhas dos
camundongos, permanecendo este edema superior ao controle negativo até o final
do teste para os dois tratamentos. Os edemas médios gerados pelo NEWE 2,4 % e
pelo NV CONC. no oitavo dia do estudo foram respectivamente 51,0 % e 47,0 %
superiores ao gerado pelo controle negativo (p < 0,0001) (figura 30). Estes
resultados sugerem que as nanocápsulas produzidas neste estudo, na concentração
avaliada, podem gerar edema no modelo avaliado.
Nos grupos de animais tratados com suspensões de nanocápsulas
concentradas (NV CONC. e NEWE 2,4 %), foram observadas várias lesões geradas
durante o teste crônico, que estão apresentados nas imagens das orelhas dos
camundongos no 9° dia do estudo na figura 31.
Figura 31 – Imagem comparativa das orelhas dos camundongos no 9° dia do estudo
crônico.
Controle
negativo
NV CONC.
NEWE 2,4 EWE 2,4 %
DEX
%
Conforme visualizado na figura 31, ao final do teste crônico, as orelhas
dos camundongos não tratados (controle negativo) e dos tratados com EWE 2,4 %
não apresentaram lesões nem eritema expressivo, apenas perda de pêlos na orelha
e em suas proximidades. Enquanto que os animais tratados com dexametasona (1
96
%), não apresentam edema, eritema ou perda de pêlos por analise visual realizada
no 9° dia.
A análise visual dos animais tratados topicamente com NEWE 2,4 % e
com NV CONC. no último dia do estudo crônico sugere que os tratamentos
realizados
com
estas
formulações
causaram
irritação
nas
orelhas
dos
camundongos, principalmente devido ao aparecimento de lesões, cascas, eritema,
edema e grande queda dos pelos observados.
A necessidade de concentração da formulação para a obtenção de um
produto final na concentração de 2,4 % de EWE produziu formulações contendo
57,5 mg/mL de tensoativos (polissorbato 80 e monoestearato de sorbitano). Esta
quantidade de tensoativos aplicada a um tecido com processo inflamatório
previamente instalado pode ter acentuado as alterações dérmicas observadas.
Em grandes quantidades, os tensoativos podem causar a desestruturação
da bicamada lipídica, favorecendo a permeação cutânea de outras substâncias, o
que pode ter exacerbado a ação do óleo de cróton, pois as suspensões de
nanocápsulas foram aplicadas cerca de 30 minutos após a aplicação do óleo de
cróton (139).
Em
geral
os
tensoativos
podem
promover
irritação
dérmica,
principalmente após vários dias de aplicação (140). O polissorbato 80, presente a
3,85 % nas suspensões de nanocápsulas concentradas, causou irritação moderada
em pele íntegra de coelhos em um estudo de 30 dias realizado com o a aplicação
diária de uma solução aquosa a 5 % (141). Como a concentração de polissorbato 80
e o monoestearato de sorbitano (1,9 %) resultam em uma suspensão com 5,75 % de
tensoativos nas formulações de nanocápsulas concentradas, pode-se considerar
que as reações de irritação observadas no estudo crônico, em que a pele tratada
apresentava-se previamente irritada pelo agente flogístico do teste, podem ter sido
decorrentes desta alta concentração de tensoativos.
Baseado nas considerações descritas acima, conclui-se que o efeito
edematogênico das suspensões de nanocápsulas contendo elevada concentração
de tensoativos interferiu na determinação da atividade anti-inflamatória do extrato
nanoencapsulado, quando avaliado nos modelos de avaliação de atividade antiinflamatória crônico e agudo com pré-tratamento, induzidos pela aplicação tópica de
óleo de cróton em orelhas de camundongos.
97
Desta forma, não foi possível definir se o NEWE 2,4 % apresenta
atividade anti-inflamatória crônica. Para isso, existe a necessidade da utilização de
outros modelos de avaliação de atividade anti-inflamatória tópica onde o estímulo ao
processo inflamatório não ocorra por processos de irritação dérmica.
Devido ao efeito edematogênico das nanocápsulas e às lesões
observadas no estudo crônico de atividade anti-inflamatória, tornou-se necessário a
avaliação da toxicidade dérmica das formulações.
6.5 AVALIAÇÃO DA IRRITAÇÃO PRIMÁRIA DE PELE: EFEITO AGUDO IN VIVO
Os resultados do estudo de irritação primária de pele de efeito agudo em
ratos estão apresentados na tabela 23.
Tabela 23 – Resultados de irritação primária de pele em ratos para NEWE 2,4 % e
EWE 2,4 % (n = 8), apresentando os resultados do controle (acetona, n = 3).
Pontuação de irritação (média ± desvio padrão)
NEWE 2,4 %
Tempo após
aplicação (h) Edema Eritema
EWE 2,4 %
Controle
Edema
Eritema
Edema
Eritema
1
0
0,5 ± 0,53
0
0,375 ± 0,5175
0
0
24
0
0,5 ± 0,53
0
0
0
0
72
0
0
0
0
0
0
120
0
0
0
0
0
0
168
0
0
0
0
0
0
216
0
0
0
0
0
0
264
0
0
0
0
0
0
312
0
0
0
0
0
0
Conforme a tabela 23, os ratos expostos ao controle (acetona), não
apresentaram edema nem eritema em nenhum momento do teste, totalizando uma
pontuação 0 (zero).
Na primeira avaliação, realizada após 1 hora da exposição dos ratos aos
testes, não foi observado edema para nenhum dos grupos. Entretanto, na avaliação
de eritema, foram observados eritemas ligeiramente perceptíveis para os grupos
98
expostos ao NEWE 2,4 % e ao EWE 2,4 %, totalizando uma pontuação média de 0,5
± 0,53 para o NEWE 2,4 % e de 0,375 ± 0,5175 para o EWE 2,4 %.
Após 24 horas da exposição, a avaliação dos animais expostos ao EWE
2,4 % não acusou eritema nem edema. Este comportamento se manteve até o final
do estudo (312 horas após a exposição).
Para o grupo de animais expostos ao NEWE 2,4 %, passadas 24 horas
da exposição, não foi observado o aparecimento de edema, porém foi analisado um
eritema classificado como ligeiramente perceptível, resultando em uma pontuação
média de 0,5 ± 0,53. Nos demais momentos de análises do teste não foram
observados formação de edema e eritema nos animais do grupo.
Os resultados obtidos nas avaliações de edema e eritema durante o
estudo de irritação primária de pele de efeito agudo, classificam o EWE 2,4 % e o
NEWE 2,4 % como não irritantes, segundo a Federal Hazardous Substances Act of
the USA e Brito (119). Sugerindo assim, que as formulações testadas possam ter
uma boa aceitabilidade pela via tópica.
Desta forma, estes resultados tornam-se mais um indicativo que a não
possibilidade de avaliação de atividade anti-inflamatória crônica pelas nanocápsulas
deve-se ao efeito associado do óleo de cróton com a elevada concentração de
tensoativos das suspensões de nanocápsulas testadas. Confirmando a necessidade
da realização de testes com outros modelos.
99
7 CONCLUSÕES
•
Foi estabelecido e validado um método de cromatografia líquida de alta
eficiência para o rápido doseamento simultâneo de vitexina e isovitexina no extrato
de Wilbrandia ebracteata, na presença ou não de nanocápsulas de PCL.
•
A metodologia validada mostrou-se seletiva para detecção de vitexina e
isovitexina, com completa separação dos picos e simetria aceitável, sendo ainda
considerada eficiente, linear, robusta para as variações de temperatura de 39 a 40
°C e de fluxo de 1,1 a 1,13 mL/min., e exata, de acordo com a RE n° 899 de 2003
publicada pela ANVISA.
•
O extrato de Wilbrandia ebracteata obtido (EWE) mostrou-se rico em
flavonóides, sedo aproximadamente 10 % de sua massa constituída de vitexina (1,5
%) e isovitexina (8 %) e o teor de dihidrocucurbitacina B no extrato foi de 3,05 mg/g.
•
Foi possível obter suspensões de nanocápsulas contendo o EWE nas
concentrações de 0,24 % e 2,4 % através do método de nanoprecipitação de
polímero pré formado com PCL e núcleo de TGL.
•
As nanocápsulas vazias ou com o EWE produzidas apresentaram uma
estreita polidispersão com valores de Span entre 0,897 e 1,079 e diâmetros médios
(D[4,3]) entre 130 nm e 186 nm, em função da distribuição de número obtida por
difratometria de laser.
•
O processo de concentração das suspensões de nanocápsulas de 0,24 %
para 2,4 % de EWE promoveu um aumento na polidispersão das partículas, bem
como um aumento no diâmetro médio (D[4,3]) tanto em função da distribuição de
número quanto da distribuição volumétrica.
•
As taxas de encapsulação médias da vitexina e isovitexina (43,2 e 51,9 %
respectivamente) foram menores que as obtidas para outros flavonóides descritos
na literatura e este resultado está associado às diferenças de lipossolubilidade. A
taxa de encapsulação da dihidrocucurbitacina B foi de 88,9 %, resultado esperado
para moléculas mais lipossolúveis como esta.
•
O EWE apresentou atividade antiedematogênica na concentração de 2,4
%, assim como o extrato nanoencapsulado (NEWE 2,4 %) no modelo de edema de
orelha agudo induzido pela aplicação tópica de óleo de cróton em camundongos.
100
•
A ação antiedematogênica do EWE 2,4 % e do NEWE 2,4 % foi
considerada estatisticamente igual, sugerindo que a nanoencapsulação do extrato
não melhorou a atividade observada para o extrato, no modelo de edema de orelha
agudo induzido pela aplicação tópica de óleo de cróton em camundongos.
•
A atividade antiedematogênica do EWE 2,4 % e do NEWE 2,4 % pode ser
atribuída à presença de flavonóides como a vitexina e a isovitexina e à presença de
cucurbitacinas
(cucurbitacina
B
e
dihidrocucurbitacina
B)
identificadas
e
quantificadas no extrato.
•
O pré-tratamento dos animais por 5 dias consecutivos com EWE 2,4 %
aumentou a atividade antiedematogênica do EWE em comparação a uma única
aplicação, enquanto que o pré-tratamento com o NEWE 2,4 % não demonstrou
atividade no modelo de edema de orelha agudo induzido pela aplicação tópica de
óleo de cróton em camundongos. Sugerindo que o pré-tratamento pode aumentar a
atividade anti-inflamatória do extrato.
•
O EWE 2,4 % não apresentou atividade anti-inflamatória significativa no
modelo de avaliação de atividade anti-inflamatória crônica pela aplicação múltipla de
óleo de cróton em orelhas de camundongos, apresentando uma tendência de
redução de edema durante o teste.
•
Os resultados dos testes de atividade anti-inflamatória realizados
sugerem que atividade do EWE pode estar relacionada com a inibição das enzimas
COX-2 e/ou PLA2 pelas cucurbitacinas e à capacidade dos flavonóides de
seqüestrar espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio, incluindo os radicais
superóxido, peroxil e peroxinitrito os quais estimulam COX-2.
•
Os estudos de atividade anti-inflamatória aguda em camundongos com
pré-tratamento e o estudo crônico demonstraram que as nanocápsulas vazias
concentradas (NV CONC.) têm ação edematogênica. Este efeito pode estar
associado à elevada concentração de tensoativos na formulação.
•
O extrato nanoencapsulado concentrado (NEWE 2,4 %) demonstrou
atividade edematogênica no estudo crônico. Sendo que foi sugerida a hipótese de
que a suspensão concentrada de nanocápsulas possa ter causado uma irritação
dérmica, interferindo assim, na determinação da atividade anti-inflamatória crônica
do extrato nanoencapsulado.
101
•
O EWE a 2,4 % e o NEWE 2,4 % foram classificados como substâncias
não irritantes através do estudo de irritação primária de pele de efeito agudo, o que
sugere que tanto o EWE como a formulação de nanocápsulas produzida possam ter
uma boa aceitabilidade pela via tópica.
Conclui-se que é possível nanoencapsular o extrato de Wilbrandia
ebracteata obtendo-se partículas nanométricas com reduzida polidispersão e taxas
de encapsulação aceitáveis, para flavonóides e cucurbitacinas. E que o extrato de
Wilbrandia ebracteata produzido possui potencial para o desenvolvimento de uma
nova alternativa terapêutica para o tratamento de processos inflamatórios, porém a
nanoencapsulação deste extrato exige outros estudos para avaliar se este processo
farmacotécnico pode potencializar a atividade farmacológica.
102
8 PERSPECTIVAS
•
Estudar o efeito de outros núcleos oleosos para aumentar a taxa de
encapsulação dos flavonóides.
•
Avaliar a estabilidade das suspensões e a cinética de liberação dos
marcadores químicos.
•
Estudos de avaliação da atividade anti-inflamatória crônica do extrato
nanoencapsulado devem ser realizados utilizando modelos onde o estímulo ao
processo inflamatório não promova irritação dérmica.
•
Estudar a participação dos flavonóides vitexina e isovitexina no
mecanismo de ação anti-inflamatório da Wilbrandia ebracteata, sendo que estes se
apresentaram em maior concentração no extrato produzido quando comparados às
cucurbitacinas.
103
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