Tese - Cirurgiaonline

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
UNIFESP – EPM
GILMARA SILVA AGUIAR YAMAGUCHI
REPERCUSSÕES METABÓLICAS E MORFOLÓGICAS INTESTINAIS
APÓS INTERPOSIÇÃO ILEAL ISOLADA EM RATOS
São Paulo
2012
REPERCUSSÕES METABÓLICAS E MORFOLÓGICAS INTESTINAIS
APÓS INTERPOSIÇÃO ILEAL ISOLADA EM RATOS
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências
Orientador: Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo
Coorientadores: Profª. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves
Profª. Dra. Aparecida Emiko Hirata
São Paulo
2012
Aguiar-Yamaguchi, Gilmara Silva
Repercussões metabólicas e morfológicas intestinais após
interposição ileal isolada em ratos. /Gilmara Silva Aguiar-Yamaguchi. -- São
Paulo, 2012.
xx, 107f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-graduação em Medicina Translacional.
Título em inglês: Metabolic and morphological intestinal repercussions
after isolated ileal interposition in rats.
1.Cirurgia Bariátrica. 2. Diabetes Mellitus Tipo 2/cirurgia. 3. Peptídeo 1
Semelhante ao Glucagon. 4. Íleo/cirurgia. 5. Íleo/anatomia&histologia. 6.
Células Enteroendócrinas. 7. Animais. 8. Ratos.
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TRANSLACIONAL
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Álvaro Nagib Atallah
Coordenador do Programa: Profa. Dra. Dulce Elena Casarini
iii
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
TRANSLACIONAL
COORDENADORA: Profa. Dra. Dulce Elena Casarini
Repercussões metabólicas e morfológicas intestinais após
interposição ileal isolada em ratos
Presidente da Banca:
1. Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo
Prof. Livre Docente do Departamento de Cirurgia/ Universidade Federal de São
Paulo – UNIFESP.
BANCA EXAMINADORA
1. Prof. Dr. Otávio Cansanção de Azevedo
Preceptor da Residência Médica do Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica do
Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo – HSPE.
2. Prof. Dr. Gustavo Peixoto Soares Miguel
Prof. Adjunto do Departamento de Clínica Cirúrgica/ Universidade Federal do
Espírito Santo – UFES.
3. Prof. Dr. Ricardo Artigiani Neto
Prof. Adjunto do Departamento de Patologia/ Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP.
4. Prof. Dr. Evandro de Souza Portes
Diretor do Serviço de Endocrinologia e Metabologia do Hospital do Servidor Estadual
de São Paulo – HSPE.
MEMBROS SUPLENTES
1. Profa. Dra. Maria Teresa Zanella
Profa. Titular da Disciplina de Endocrinologia do Departamento de Medicina/
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.
2. Profa. Dra. Lila Missae Oyama
Profa. Adjunta do Departamento de Fisiologia / Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP.
iv
DEDICATÓRIA
Aos que me trouxeram à vida e são os principais responsáveis pela minha
formação: meus pais, Solon Humberto Barbosa de Aguiar e Neide da Silva
Aguiar. Esta é uma conquista nossa. Muito obrigada por todo amor, esforço e
sacrifício durante toda a vida para que pudéssemos receber a formação acadêmica
à qual não tiveram oportunidade. Meu eterno reconhecimento e agradecimento.
Aos meus irmãos, Glaucimar e Solon Neto, pelo amor e companheirismo
constante apesar de, muitas vezes, à distância. Obrigada, ainda, pelo auxílio com as
questões de informática.
Ao meu amado esposo, Fábio Yoriaki Yamaguchi, amigo, companheiro,
incentivador, exemplo de ser humano, marido e pai. Obrigada por toda a vida que
temos construído, pela família que somos e por todo apoio nos diversos âmbitos da
nossa feliz convivência.
À minha filha Lara, que faleceu antes de vir ao mundo e ensinou-me muito,
mesmo durante o seu pouco tempo de existência aqui conosco. Sua força foi
estimulante para o término deste trabalho. Um dia nos reencontraremos.
Ao meu filho Lucas, que está por chegar, que renovou as minhas forças e
mostrou-me que há sempre um caminho para seguir. Os seus “chutes” frequentes
lembram-me como a natureza é perfeita e que a vida renova-se sempre. Você é
querido, desejado e esperado com muito amor.
A todos da minha família – Silva, Aguiar, Yamaguchi e Ohkawara - pois
esta vitória só foi possível devido ao apoio e contribuição direta e indireta de várias
pessoas. Nenhuma conquista é alcançada por um indivíduo apenas. Sintam-se
orgulhosos por este passo, que é nosso.
v
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, que por meio dos
Programas de Pós-graduação em Cirurgia e Experimentação e Medicina
Translacional, recebeu-me e permitiu a realização deste estudo, bem como o meu
aprendizado e desenvolvimento como pesquisadora.
Ao Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo, Professor Livre
Docente do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP) e meu Orientador, que me acolheu como entusiasta inexperiente e
possibilitou trilhar os caminhos árduos da Pesquisa Científica. Pela incansável busca
do rigor e do método científico, em prol da qualidade; pelo estímulo e pelos
ensinamentos recebidos em diversos aspectos da vida.
À Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves, Professora Associada Livre
Docente e Chefe do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São
Paulo (UNIFESP) e minha Coorientadora, pela competência e paciência na
condução deste estudo, e por todo empenho e dedicação incansáveis que
possibilitaram a viabilização do mesmo. Agradeço, acima de tudo, por todo o carinho
que recebi sob a vossa orientação, que foram fundamentais para o meu crescimento
como pesquisadora e como ser humano.
À Profa. Dra. Aparecida Emiko Hirata, Professora Adjunta do Departamento
de Fisiologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e minha
Coorientadora, pela paciência e atenção constantes no desenvolvimento deste
trabalho, pelos ensinamentos e ideias que permitiram o início e o encaminhamento
do mesmo até à sua conclusão, e por todo o entusiasmo e disponibilidade para
orientar pesquisadores inexperientes como eu. Mais do que tudo, agradeço pela
inestimável amizade conquistada.
À Profa. Dra. Dulce Elena Casarini, Professora afiliada e Livre Docente da
Disciplina de Nefrologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de
São Paulo (UNIFESP), pela gestão instigante e desafiadora, pelo estímulo à
produção científica, pelo acolhimento inquestionável quando da minha transferência
para este Programa de Pós-graduação e pelo empenho e compreensão em viabilizar
a conclusão desta pesquisa.
vi
Aos
professores
do
Programa
de
Pós-graduação
em
Cirurgia
e
Experimentação da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Prof. Dr. José
Luiz Martins, Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero, Prof. Dr. Ivan Hong
Jun Koh, Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Prof. Dr. Murched Omar Taha, Prof.
Dr. Hélio Plapler, Profa. Dra. Simone de Campos Vieira Abib, Prof. Dr. Paulo de
Oliveira Gomes e Prof. Dr. Sérgio Tomaz Schettini, pelas colaborações, críticas,
ensinamentos, incentivos, e experiências transmitidas durante a maior parte do
desenvolvimento deste estudo. Os mesmos foram essenciais para a qualidade do
mesmo.
Ao
estimado
Colega
de
Pós-graduação,
Wellington
Cardia,
Gastroenterologista, Endoscopista, Nutrólogo e amigo, pelo apoio e trabalho
conjunto durante todos esses anos de convivência. Seu empenho, bom humor,
conselhos, críticas, competência e dedicação foram estímulos fundamentais.
Aos Colegas da Pós-graduação, principalmente Eduardo Bastos, Bianca
Marigliani e Linda Bernardes, pela convivência, críticas, sugestões e auxílio.
À Profa. Dra. Ângela Tavares Paes, Professora do Curso de Análise
Estatística, oferecido pelo Setor de Estatística Aplicada da Universidade Federal de
São Paulo (UNIFESP), doutora em Estatística pelo Instituto de Matemática e
Estatística da Universidade de São Paulo (IME-USP), responsável pelo despertar do
meu interesse e fascínio pela Estatística. Seus ensinamentos desvendaram
mistérios e trouxeram à realidade este campo da Ciência anteriormente obscuro
para mim.
Ao Prof. Pedro da Silva Peixoto, mestre e doutorando em Matemática
Aplicada no Instituto de Matemática e Estatística da Universidade de São Paulo
(IME-USP), pela paciência e competência com que me auxiliou nas análises
estatísticas deste trabalho.
Ao técnico do Biotério da Biofísica, Sr. Mauro, que cuidou dos animais
durante todo o período de observação desta pesquisa.
Aos técnicos dos laboratórios do Departamento de Patologia, Joaquim,
Tiago, Fernanda, Kátia e Maria José que participaram da confecção dos blocos e
lâminas para o estudo histológico. Em especial à Leonor Cristina Manoja Roman,
bióloga e mestra em imunohistoquímica que cuidou pessoalmente desta parte do
estudo.
vii
Aos estudantes de graduação de Medicina, bolsistas de iniciação científica,
Paolo Henrique Barganogo Lourenço e Marcelo Casciato Carlini, que
participaram dos procedimentos cirúrgicos e ajudaram na captura e análise das
imagens microscópicas.
Aos secretários da Patologia, Cirurgia Pediátrica e Técnica Cirúrgica, Sr.
Norberto Lobo, Sra. Valdelice Justiniano Soares, Sra. Elaine Bazzi e Sra.
Adriana Bazzi, que sempre foram solícitos em atender às necessidades dos pósgraduandos.
À Profa. Nadege da Silva Dantas, Professora de Língua Portuguesa e
Linguística da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), com mestrado em
Língua Portuguesa e Linguística pela Universidade Federal da Paraíba (UFPB), e
minha querida tia, pelo auxílio com a correção ortográfica deste texto.
À Sra. Ana Maria Castello, bibliotecária da Biblioteca Central da
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pelo auxílio com a ficha
catalográfica.
viii
EPÍGRAFE
“Não sei como pareço aos olhos do mundo, mas eu mesmo vejo-me como uma
criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa
vez ou outra, ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano
da verdade permanece completamente inexplorado diante de mim”.
Isaac Newton
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar.
Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
ix
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ............................................................................................................ v
AGRADECIMENTOS ................................................................................................. vi
EPÍGRAFE ................................................................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................xiii
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. xv
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ...............................................xvii
RESUMO................................................................................................................... xx
1
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1
1.1 OBJETIVOS ........................................................................................................ 6
2
MÉTODOS ............................................................................................................ 7
2.1 COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ................................................................... 7
2.2 AMOSTRA .......................................................................................................... 7
2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .............................................................. 7
2.3.1 Dieta ................................................................................................................. 7
2.3.2 Curva de peso e consumo de ração no pós-operatório (PO)............................ 8
2.3.3 Jejum ................................................................................................................ 8
2.3.4 Anestesia .......................................................................................................... 8
2.3.5 Coletas sanguíneas e testes laboratoriais ........................................................ 8
2.3.6 Dosagem de insulina ........................................................................................ 9
2.3.7 Dosagem de colesterol total, HDL-colesterol e triglicérides ............................ 10
2.4 PROCEDIMENTOS OPERATÓRIOS ............................................................... 10
2.5 EVOLUÇÃO PÓS-OPERATÓRIA ..................................................................... 13
2.6 EUTANÁSIA...................................................................................................... 14
2.7 ESTUDO HISTOLÓGICO ................................................................................. 14
2.7.1 Coloração com hematoxilina-eosina ............................................................... 15
2.7.2 Coloração com imunohistoquímica ................................................................. 15
2.8 ANÁLISE DAS IMAGENS MICROSCÓPICAS.................................................. 15
x
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 18
3
RESULTADOS.................................................................................................... 20
3.1 PESO ................................................................................................................ 20
3.2 CONSUMO ALIMENTAR .................................................................................. 21
3.3 TESTES LABORATORIAIS .............................................................................. 22
3.3.1 Glicemia basal ................................................................................................ 22
3.3.2 Insulina ........................................................................................................... 24
3.3.3 Teste se tolerância insulínica (TTI) ................................................................. 25
3.3.4 Colesterol........................................................................................................ 26
3.3.5 HDL-colesterol ................................................................................................ 28
3.3.6 Triglicérides .................................................................................................... 30
3.4 COMPRIMENTO DO INTESTINO DELGADO .................................................. 31
3.5 ESTRUTURA DA MUCOSA INTESTINAL ........................................................ 32
3.5.1 Jejuno ............................................................................................................. 32
3.5.2 Íleo .................................................................................................................. 36
3.5.3 Segmento Interposto....................................................................................... 40
3.6 CÉLULAS L ENTEROENDÓCRINAS ............................................................... 43
3.6.1 Jejuno ............................................................................................................. 43
3.6.2 Íleo .................................................................................................................. 45
3.6.3 Segmento interposto ....................................................................................... 46
4
DISCUSSÃO ....................................................................................................... 48
5
CONCLUSÕES ................................................................................................... 56
6
ANEXOS ............................................................................................................. 57
Anexo 1 – Formalina tamponada .............................................................................. 57
Anexo 2 – Protocolo de coloração com Hematoxilina-eosina ................................... 58
Anexo 3 – Protocolo de silanização de lâminas ........................................................ 59
Anexo 4 – Protocolo de coloração com imunohistoquímica ...................................... 60
7
REFERÊNCIAS .................................................................................................. 62
ABSTRACT ............................................................................................................... 82
APÊNDICES.............................................................................................................. 83
Apêndice 1 - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP ...................... 83
xi
Apêndice 2 – Emenda ao Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP .. 85
Apêndice 3 – Ficha de coleta de dados .................................................................... 86
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ................................................................................ 87
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Identificação e exposição do ceco e íleo terminal ..................................... 11
Figura 2 - a) Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e do
segmento a ser transposto no GI. No GS, as secções foram nas mesmas
regiões com anastomose em seguida, sem a transposição. b) Esquema
demonstrativo do segmento de íleo distal já interposto ao jejuno proximal
no GI......................................................................................................... 12
Figura 3 - Visão microscópica da anastomose intestinal terminoterminal (aumento de
4 vezes) .................................................................................................... 13
Figura 4 - Fotomicrografia de corte histológico de segmento de jejuno, em aumento
de 40 vezes, obtida pelo programa QCapture Pro® ................................. 16
Figura 5 - Fotomicrografia de corte histológico de segmento de íleo, em aumento de
40 vezes, obtida pelo programa QCapture Pro® ...................................... 17
Figura 6 - a) Fotomicrografia de corte histológico de segmento de íleo, em aumento
de 400 vezes, obtida pelo programa QCapture Pro®. b) Mesma
fotomicrografia editada no programa Adobe Photoshop CS4®, em que se
realizou a seleção e isolamento da região de criptas ............................... 18
Figura 7 - Evolução do peso médio (±erro padrão) nos dois grupos, após a operação
................................................................................................................. 20
Figura 8 - Variação percentual do peso médio (±erro padrão) nos dois grupos, em
relação à 12ª semana ............................................................................... 21
Figura 9 - Consumo alimentar médio diário (em gramas)(±erro padrão), nos dois
grupos ...................................................................................................... 21
Figura 10 - Consumo alimentar acumulado (em gramas), nos dois grupos, no final do
experimento .............................................................................................. 22
Figura 11 - Comparação da glicemia basal (mg/dL) em cada grupo, antes e depois
da operação ............................................................................................. 23
Figura 12 - Comparação da insulina basal (ng/mL) em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 25
Figura 13 - Comparação do TTI (%/min) em cada grupo, antes e depois da operação
................................................................................................................. 26
xiii
Figura 14 - Comparação do colesterol total (mg/dL) em cada grupo, antes e depois
da operação ............................................................................................. 28
Figura 15 - Comparação do HDL-colesterol (mg/dL) em cada grupo, antes e depois
da operação ............................................................................................. 29
Figura 16 - Comparação dos triglicérides (mg/dL) em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 31
Figura 17 - Altura das vilosidades no jejuno (µm) em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 33
Figura 18 - Profundidade das criptas no jejuno (µm) em cada grupo, antes e depois
da operação ............................................................................................. 34
Figura 19 - Relação vilosidade/cripta no jejuno em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 35
Figura 20 - Altura das vilosidades no íleo (µm) em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 37
Figura 21 - Profundidade das criptas no íleo (µm) em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 38
Figura 22 - Relação vilosidade/cripta no íleo em cada grupo, antes e depois da
operação .................................................................................................. 40
Figura 23 - Altura das vilosidades no segmento interposto (µm) em cada grupo,
antes e depois da operação ..................................................................... 41
Figura 24 - Profundidade das criptas no segmento interposto (µm) em cada grupo,
Figura 25 - Relação vilosidade/cripta no segmento interposto em cada grupo, antes e
depois da operação .................................................................................. 43
Figura 26 - Densidade de células L no jejuno (cel/µm2) em cada grupo, antes e
depois da operação .................................................................................. 44
Figura 27 - Densidade de células L no íleo (cel/µm2) em cada grupo, antes e depois
da operação ............................................................................................. 46
Figura 28 - Densidade de células L no segmento interposto (cel/µm 2) em cada grupo,
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Peso médio (em gramas) nos dois grupos, após a operação ................... 20
Tabela 2 - Variação percentual do peso médio nos dois grupos, após a operação .. 21
Tabela 3 - Glicemia basal (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação .... 23
Tabela 4 - Insulina basal (ng/mL) nos dois grupos, antes e depois da operação ...... 24
Tabela 5 - TTI (%/min) nos dois grupos, antes e depois da operação ...................... 25
Tabela 6 - Colesterol total (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação .... 27
Tabela 7 - HDL-colesterol (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação .... 29
Tabela 8 - Triglicérides (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação ........ 30
Tabela 9 - Comprimento do intestino delgado (cm) nos dois grupos, no momento da
operação .................................................................................................. 31
Tabela 10 - Altura das vilosidades no jejuno (µm) nos dois grupos, antes e depois da
operação ................................................................................................ 32
Tabela 11 - Profundidade das criptas no jejuno (µm) nos dois grupos, antes e depois
da operação ........................................................................................... 33
Tabela 12 - Relação vilosidade/cripta no jejuno nos dois grupos, antes e depois da
operação ................................................................................................ 35
Tabela 13 - Altura das vilosidades no íleo (µm) nos dois grupos, antes e depois da
operação ................................................................................................ 36
Tabela 14 - Profundidade das criptas no íleo (µm) nos dois grupos, antes e depois
da operação ........................................................................................... 37
Tabela 15 - Relação vilosidade/cripta no íleo nos dois grupos, antes e depois da
operação ................................................................................................ 39
Tabela 16 - Altura das vilosidades no segmento interposto (µm) nos dois grupos,
depois da operação ................................................................................ 40
Tabela 17 - Comparação da profundidade das criptas no segmento interposto (µm)
entre os grupos, depois da operação ..................................................... 41
Tabela 18 - Relação vilosidade/cripta no segmento interposto nos dois grupos,
Tabela 19 - Densidade de células L no jejuno (cel/µm2) nos dois grupos, antes e
xv
Tabela 20 - Densidade de células L no íleo (cel/µm2) nos dois grupos, antes e depois
da operação ........................................................................................... 45
Tabela 21 - Densidade de células L no segmento interposto (cel/µm2) nos dois
grupos, depois da operação ................................................................... 46
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
-
Subtração
%
Percentual
/
Dividido
+
Adição
<
Menor que
=
Igual
>
Maior que
±
Mais ou menos
®
Marca registrada
°C
Graus Celsius
µm
Micrômetro
125
Iodo 125
ANOVA
Análise de variância
BSA
Soro Albumina Bovina
CEDEME
Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais
cel
Célula
cm
Centímetro
COBEA
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DAB
Diaminobenzidina
dL
Decilitro
DP
Desvio padrão
Dr.
Doutor
Dra.
Doutora
EP
Erro padrão
EPM
Escola Paulista de Medicina
etc
Etecetera
EUA
Estados Unidos da América
f
Folhas
g
Grama
GI
Grupo Interposição
I
xvii
GIP
Gastric inhibitory polypetide
GLM
Modelo Linear Generalizado
GLP-1
Glucagon-like peptide 1
GLP-2
Glucagon-like peptide 2
GS
Grupo Sham
h
Hora
HCl
Ácido clorídrico
HDL
Colesterol em fração lipoproteína de alta densidade
HSPE
Hospital do Servidor Público Estadual
IgG
Imunoglobulina G
IIQ
Intervalo interquartil
IL
Íleo
IMC
Índice de massa corporal
IME
Instituto de Matemática e Estatística
JE
Jejuno
Kcal
Quilocaloria
Kg
Quilograma
Ln
Logaritmo neperiano
m
Metro
M
Mol
mg
Miligramas
MG
Minas Gerais
N
Número
ng
Nanograma
PBS
Tampão Salina Fosfato
pH
Potencial hidrogeniônico
PO
Pós-operatório
PR
Paraná
Prof.
Professor
Profa.
Professora
p-valor
Nível descritivo
PYY
Peptide tyrosine tyrosine
S12
Semana 12
t½
Meia-vida
xviii
T
Interposto
T
tempo
TTI
Teste de Tolerância Insulínica
UFCG
Universidade Federal de Campina Grande
UFES
Universidade Federal do Espírito Santo
UFPB
Universidade Federal da Paraíba
UI
Unidades internacionais
UNIFESP
Universidade Federal de São Paulo
USP
Universidade de São Paulo
α
Alfa (nível de significância)
xix
RESUMO
Objetivos: Conhecer os efeitos da interposição ileal isolada em animais de
experimentação normais (não obesos e não diabéticos), avaliando as modificações
metabólicas e morfológicas intestinais. Métodos: Estudo experimental em ratos
normais (Wistar-EPM1), com 12 semanas de vida, distribuídos em dois grupos,
Grupo Interposição (GI) com 11 animais, submetidos à interposição ileal isolada, e
Grupo Sham (GS) com 14 animais, submetidos à operação simulada. Foram
avaliados parâmetros metabólicos (peso, consumo alimentar e bioquímicos) e
histológicos (gerais e enteroendócrinos) antes e após oito semanas do procedimento
cirúrgico. Resultados: Não houve diferença entre os grupos quanto aos seguintes
parâmetros: peso, consumo alimentar, glicemia, insulina, teste de tolerância
insulínica (TTI), níveis de colesterol total, HDL-colesterol e triglicérides. No entanto,
na análise isolada de cada grupo, observou-se elevação dos níveis de glicemia
(p=0,032) e de triglicérides (p=0,009) apenas no GS ao final do experimento; bem
como diminuição dos níveis de colesterol total (p=0,004) e aumento dos níveis de
insulina (p=0,016) e de HDL-colesterol (p<0,001) apenas no GI. O segmento ileal
interposto no GI apresentou aumento da altura de vilosidades (p=0,002) e da relação
vilosidade/cripta (p=0,021), adquirindo características semelhantes ao jejuno.
Todavia, manteve a quantidade de células L enteroendócrinas inalterada. Os demais
segmentos intestinais não apresentaram diferenças estruturais entre os grupos.
Conclusões: A interposição ileal isolada não promove perda ponderal ou diminuição
da ingestão alimentar, não provoca hipoglicemia, nem modifica a sensibilidade à
insulina em animais euglicêmicos. Pode modificar favoravelmente alguns aspectos
do metabolismo glicídico e lipídico. O segmento ileal interposto mantém a
quantidade de células L enteroendócrinas após a interposição ileal isolada, apesar
da “jejunização” da mucosa. Por conseguinte, a interposição ileal isolada deve ser
considerada como um potencial procedimento cirúrgico para o tratamento de casos
selecionados de diabetes tipo 2.
xx
1
1
INTRODUÇÃO
Grande parcela da população mundial apresenta excesso de peso, e a
obesidade tem sido referida como uma epidemia mundial, com índices crescentes ao
longo das últimas décadas1-7, mesmo nos países em desenvolvimento8,9. Diversas
doenças estão relacionadas à obesidade, como distúrbios cardiovasculares,
hipertensão arterial sistêmica, diabetes9, neoplasias10, doenças osteoarticulares,
entre outras. Tudo isto acarreta grande impacto nos custos socioeconômicos7,11-13 e
na mortalidade relacionada14. A obesidade em níveis mais elevados proporciona
diminuição na expectativa de vida em cerca de 13 anos em relação a indivíduos com
peso normal15.
Uma das condições mais associadas à obesidade é o diabetes mellitus doença que também apresenta elevados índices de incidência e prevalência
mundial16, com previsões de dados alarmantes para as próximas décadas 17.
Ultimamente tem sido usado o termo “diabesidade”18 para referir-se a esta condição
mórbida, na qual a fisiopatologia central é um aumento na resistência à ação da
insulina. Trata-se de doença progressiva e de difícil controle clínico, mesmo com
cuidados intensivos e vigilância rigorosa19-24, e que produz complicações em
diversos órgãos e sistemas do organismo – nefropatias, retinopatias, doenças
cardiovasculares, neuropatias, distúrbios dentários, entre outros12,21,23,25,26 – que
representam as causas de morbimortalidade associadas à mesma14,27.
Os tratamentos conservadores para a obesidade grave (a partir do grau 3)
apresentam-se ineficazes em longo prazo28,29, sendo o tratamento cirúrgico
considerado mais duradouro30-32, proporcionando perda ponderal sustentada28,
controle e/ou remissão das doenças associadas33, melhora da qualidade de vida34 e
diminuição da mortalidade35-37. Assim, diante dos benefícios evidentes do tratamento
cirúrgico para a obesidade, tem ocorrido aumento progressivo na realização do
mesmo nos últimos anos no mundo inteiro29,35.
Nas últimas décadas, com a observação cuidadosa dos resultados obtidos
após as operações bariátricas, evidenciou-se a existência de um complexo sistema
enteroendócrino envolvido nos mecanismos de controle da fome e da saciedade, na
motilidade gastrintestinal e no metabolismo glicídico e lipídico38-45. Foram
identificados diversos hormônios produzidos pelo trato gastrintestinal que têm ação
em vários segmentos do tubo digestório, no sistema nervoso central, no pâncreas,
2
nos tecidos periféricos, entre outros. Alguns desses hormônios são: grelina,
glucagon-like peptide 1 (GLP-1), peptide tyrosine tyrosine (PYY) e gastric inhibitory
polypetide (GIP)39,40,42,44,46-53.
Ao observar que os pacientes diabéticos conseguem um controle mais rápido
da glicemia após a cirurgia bariátrica, antes mesmo que haja perda de peso
significativa, passou-se a investigar os possíveis mecanismos de interação entre os
êntero-hormônios
ponderal
e
o
metabolismo
glicídico,
independente
da
perda
18,39,40,43-45,54
. Sabe-se, há longa data, da ocorrência do “efeito incretínico”
que designa a amplificação da secreção de insulina por hormônios secretados pelo
trato gastrintestinal em resposta à chegada de nutrientes no lume intestinal55,56.
Estes hormônios são designados como “incretinas”53,57,58. Atualmente o GLP-1 é o
hormônio incretínico mais associado aos efeitos antidiabéticos da cirurgia
bariátrica54,59-63.
O GLP-1 é um polipeptídeo secretado pelas células L intestinais, células
enteroendócrinas existentes em maior número no intestino delgado distal, em
resposta à chegada de alimentos na luz intestinal56,64-70. As ações do GLP-1 incluem
efeito sacietógeno direto no hipotálamo56,67,69,71-74, diminuição da absorção de
gorduras pelo trato gastrintestinal75-77 e inibição da motilidade intestinal78-80.
Entretanto, suas principais ações são a estimulação da liberação de insulina pelas
células beta das ilhotas pancreáticas, a diminuição da liberação de glucagon pelas
células alfa, a diminuição da apoptose de células beta e a melhora da sensibilidade
periférica à insulina52,59,60,79,81-96. Por isso, esse hormônio tem sido o centro dos
estudos voltados ao tratamento do diabetes tipo 230,74,81-83,86,88,92,97-100.
Os procedimentos cirúrgicos que abreviam o percurso do alimento ingerido
através do tubo digestório, permitindo que este (ainda não digerido) entre em
contato com as células do intestino delgado distal, provocam a liberação maior e
mais precoce de GLP-1 pelas células L e são os mais eficazes em controlar o
diabetes, como o “bypass” gástrico em Y-de-Roux (operação de Fobi-Capella)18,40,45,
ou as operações que predominantemente diminuem a absorção como o “bypass”
jejunoileal101,102 e as derivações biliopancreáticas103-106.
Por outro lado, apesar dos bons resultados das operações bariátricas, as
intervenções realizadas na atualidade não são isentas de efeitos adversos
importantes
107,108
, que podem ser graves, principalmente em longo prazo, a saber:
vômitos frequentes, síndrome de dumping51, tendência à ocorrência de úlceras
3
pépticas101,109, fístulas gastrogástricas e enteroentéricas109, cálculos renais,
deficiências nutricionais, desnutrição protéica101, descalcificação e osteoporose,
hipocalemia51,101,109,110, dilatação do “pouch” gástrico, estenoses das anastomoses e
diarreia crônica101,111. Também deve ser considerada a dificuldade de acesso
endoscópico para diagnóstico de doenças nas áreas excluídas do tubo digestório112114
, que podem apresentar hemorragias ou neoplasias tardiamente.
Assim, diante das dificuldades de controlar clinicamente o diabetes, das
evidências dos benefícios metabólicos duradouros das operações bariátricas e do
conhecimento cada vez mais aprofundado do sistema enteroendócrino, atualmente,
utiliza-se o termo “Cirurgia Metabólica” ao invés de “Cirurgia Bariátrica”. De forma
que se busca, cada vez mais, entender os mecanismos fisiológicos e, principalmente
hormonais, relacionados a essa condição para melhorar o tratamento desses
pacientes. Pesquisam-se tratamentos farmacológicos mais eficazes e com menos
efeitos colaterais81,82,92,94,97,99,115-117 e procedimentos cirúrgicos que estimulam ou
inibem determinados hormônios sem que sejam necessários a retirada ou o desvio
de grandes segmentos gastrintestinais118-126, com o intuito de tratar os distúrbios do
metabolismo e minimizar os efeitos adversos das operações atualmente realizadas.
Duas grandes teorias na atualidade norteiam os estudos nesta área: a teoria
do “foregut” e a teoria do “hindgut”. A primeira baseia-se na observação dos
resultados obtidos após as operações bariátricas de “bypass” gastroduodenal e
derivação biliopancreática que promovem desvio do trânsito de alimentos ingeridos
através do duodeno e de parte do jejuno, obtendo melhores resultados no controle
do diabetes do que as operações apenas restritivas como, por exemplo, a banda
gástrica ajustável101,104,106. Infere-se um possível fator “anti-incretínico” produzido
nesses segmentos intestinais que, quando desviados do trânsito intestinal, pode ter
sua produção e/ou ações reduzidas, promovendo assim um benefício no
metabolismo glicídico e melhorando o controle do diabetes44,125.
Estudos experimentais em ratos diabéticos não obesos, submetidos a desvio
gastrojejunal sem redução do estômago, demonstraram melhora na tolerância à
glicose e na sensibilidade à insulina44,125. Também foram replicados esses
resultados em estudos clínicos com diabéticos não obesos127,128 e/ou com obesidade
grau I129. Em contrapartida, estudo com ratos com obesidade induzida por dieta
realizando esse procedimento, não foi observada nenhuma melhora na sensibilidade
à insulina130. Além disso, ainda não foi identificada nenhuma substância que tenha
4
exatamente essa função “antidiabética”, nem se conhecem os efeitos em longo
prazo dessa operação.
A teoria do “hindgut” – na qual está inserida a interposição ileal - baseia-se no
fato de que as operações bariátricas que encurtam o caminho dos alimentos através
do tubo digestório, permitindo a chegada mais precoce de alimentos não digeridos
ao intestino delgado distal, promovem a liberação de hormônios, pelas células L do
íleo distal, que interferem no metabolismo da glicose, principalmente o GLP-1.
Consequentemente, os resultados mais eficazes dessas operações no controle do
diabetes em longo prazo.
Nessa ordem de ideias, apenas a transposição de um segmento do íleo distal
para uma porção mais proximal do tubo digestório pode estimular a liberação do
hormônio GLP-1, de maneira a influir beneficamente no metabolismo glicídico, sem
que
haja
removidos
segmentos
gastrintestinais
exclusos
do
trânsito
alimentar
e/ou
75,131-141
.
Na última década foram demonstrados resultados clínicos animadores com a
interposição ileal. No entanto, esta operação tem sido realizada de forma combinada
a outras operações118-124, de maneira que não se conhece o papel de cada
procedimento isoladamente.
A interposição ileal foi realizada em humanos obesos e com síndrome
metabólica, em associação ao procedimento restritivo de gastrectomia vertical,
sendo demonstrados bons resultados: controle da obesidade em 86,4%; do diabetes
em 84,2%; da hipertensão arterial em 88,4% e da dislipidemia em 82,3%; num
tempo de seguimento médio de 38,4 ± 10,2 meses, com complicações maiores em
5,9%118.
Vale salientar ainda um dado muito importante que é o fato de que, apesar de
o diabetes estar mais comumente associado à obesidade, observa-se uma
prevalência crescente da doença em indivíduos eutróficos ou apenas com
sobrepeso9,16,142,143. De maneira que são necessárias formas de tratamento mais
eficazes para o controle da mesma, sem que necessariamente induzam perda
ponderal significativa.
Estudos com interposição ileal em humanos diabéticos com IMC abaixo de 35
Kg/m2, demonstraram modesta diminuição de peso e ingestão alimentar, com
satisfatório controle de comorbidades (diabetes, hipertensão arterial, dislipidemia,
etc) e com poucas complicações maiores precoces119,144,145. No entanto, estes
5
ensaios clínicos também associaram o procedimento de gastrectomia vertical, não
havendo nenhuma pesquisa conduzida com a interposição ileal isolada.
No campo da pesquisa experimental, têm sido realizados nos últimos 30 anos
experimentos com transposição de segmentos intestinais com objetivos diversos.
Estudos com interposição ileal em animais obesos demonstraram perda ponderal e
menor ingestão alimentar, sem alterações na absorção de nutrientes133,138,141. Outros
estudos demonstraram ainda os efeitos metabólicos desse procedimento em animais
diabéticos, obesos146 e não obesos75,84,135, com melhora na tolerância à glicose e na
sensibilidade à insulina em curto e médio prazos75,84,135,146. A melhora na tolerância à
glicose foi demonstrada mesmo em animais não obesos e euglicêmicos 84.
Demonstrou-se ainda aumento nos níveis séricos de hormônios intestinais após
esse procedimento75,136,139.
Por outro lado, pesquisas anteriores em que foi alterada a anatomia do tubo
digestório, com a diminuição do seu comprimento ou com a transposição de
segmentos - naquela ocasião visando melhorar o tratamento da “síndrome do
intestino curto” - demonstraram a ocorrência de modificações (ou adaptações) dos
segmentos intestinais remanescentes e do segmento transposto em longo prazo,
adquirindo este a morfologia e/ou a função aproximada da região para o qual foi
transferido147-153.
Dentro deste contexto, compreender os efeitos dos diversos procedimentos
cirúrgicos, os mecanismos de atuação dos diferentes êntero-hormônios, as células
que os produzem, onde e como atuam, com o intuito de estabelecer tratamentos
mais efetivos para as doenças metabólicas, principalmente o diabetes mellitus é, no
momento, o alvo de inúmeras pesquisas científicas. Estudos histológicos e
moleculares podem fornecer informações para o desenvolvimento de substâncias
que possam ser usados em tratamentos farmacológicos.
Além disso, atualmente não se conhecem as alterações enteroendócrinas em
longo prazo ocorridas após a transposição isolada de um segmento de íleo distal
para uma situação proximal no jejuno; se há a presença de células L funcionais
tardiamente no segmento intestinal interposto154; ou se os resultados clínicos obtidos
são devido, principalmente, aos procedimentos associados realizados, uma vez que
não se realizou a interposição ileal isolada.
Diante disto, este estudo propôs-se a pesquisar as alterações metabólicas
gerais e bioquímicas, bem como as modificações morfológicas no intestino delgado,
6
após o procedimento de interposição ileal isolada, em animais de experimentação
normais (não obesos e não diabéticos), visando avaliar a segurança e eficácia do
mesmo.
1.1
OBJETIVOS
Geral
Avaliar os efeitos da interposição ileal isolada em ratos normais (não obesos e
não diabéticos).
Específicos
Avaliar os efeitos no peso e no consumo alimentar;
Pesquisar as modificações no metabolismo glicídico e lipídico;
Estudar as alterações estruturais no intestino delgado; e
Verificar a presença de células L enteroendócrinas no intestino delgado.
7
2
2.1
MÉTODOS
COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
O projeto de pesquisa foi encaminhado para o Comitê de Ética em Pesquisa
Experimental da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina
(UNIFESP-EPM) e aprovado em 21 de dezembro de 2007 sob o número 1478/07.
2.2
AMOSTRA
Foram utilizados 25 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar-EPM1,
com 11 semanas de idade, fornecidos pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos
Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) - Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM).
Os animais foram transferidos para o Biotério Setorial da Biofísica, alojados
em gaiolas coletivas e mantidos com temperatura ambiente controlada de 23  2C,
umidade relativa de 55  15%, e com dispositivo automático (Timer – Kienzle)
proporcionando ciclo de alternância de luminosidade entre claro e escuro de 12 por
12 horas (6h/ 18 h). Esta transferência dos animais foi realizada de maneira
escalonada, de forma a proporcionar grupos de animais com diferentes idades em
acompanhamento no alojamento.
Após uma semana de aclimatação ao novo ambiente, os animais foram
distribuídos em dois grupos: Grupo Interposição (GI) – submetido à interposição
ileal, com 11 animais; e Grupo Sham (GS) – submetido à operação simulada, com
14 animais.
Todos os animais foram acompanhados até a 8ª semana do pós-operatório
(PO), com 21 semanas de vida, quando foram sacrificados.
2.3
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
2.3.1 Dieta
Durante todo o estudo, todos os animais receberam, ad libitum, a dieta padrão
Nuvilab CR-1, normocalórica (4,5 Kcal/g), peletizada, com 10% de gorduras, 22% de
8
proteínas e 68% de carboidratos, da marca Nuvital (Colombo, PR, Brasil) e fornecida
pelo CEDEME.
2.3.2 Curva de peso e consumo de ração no pós-operatório (PO)
Foi realizada a pesagem semanal, em todos os grupos, desde a décima
segunda semana de vida até a oitava semana de pós-operatório, com balança
apropriada (Filizola BP-6), e o peso foi expresso em gramas. O consumo de ração
foi avaliado semanalmente, nos dois os grupos, da décima segunda à vigésima
primeira semana de vida, calculando-se a diferença do peso da ração oferecida e a
restante na gaiola, entre duas semanas consecutivas, fazendo-se assim o cálculo da
estimativa de consumo diário médio de ração, em gramas.
2.3.3 Jejum
Durante as seis horas que antecederam a coleta de sangue, o teste de
tolerância insulínica (TTI) e o procedimento cirúrgico, os animais permaneceram em
jejum, sendo oferecido somente água.
2.3.4 Anestesia
Foi realizada anestesia geral dissociativa para as coletas sanguíneas e as
intervenções cirúrgicas, utilizando Zoletil 50® (tiletamina+zolazepan) na dose de 20
mg/Kg e Fentanil® na dose de 0,025 mg/Kg, coletados na mesma seringa e
injetados simultaneamente por via intramuscular. O animal foi mantido em ventilação
espontânea durante os procedimentos, e o plano anestésico foi controlado mediante
avaliação periódica (a cada 45 minutos) dos reflexos auricular e interdigital, que
deveriam estar abolidos. Sempre que houve o reaparecimento desses reflexos,
realizou-se suplementação anestésica com 1/3 da dose inicial155.
2.3.5 Coletas sanguíneas e testes laboratoriais
Foram realizadas coletas sanguíneas sete dias antes do dia da operação (12ª
semana de vida) e na ocasião da eutanásia.
9
Inicialmente, realizou-se a coleta de 1 mL de sangue através de punção da
veia da cauda para determinações séricas de insulina, colesterol total, HDLcolesterol e triglicérides. Em seguida, a amostra foi transferida para frascos
apropriados devidamente identificados e congelada a –4oC até a análise laboratorial.
Após 10 minutos da coleta sanguínea, foi realizada a determinação da glicose
sérica com uma gota de sangue, obtida por puntura da cauda, depositada em fita
reagente e avaliada com glicosímetro (Kit Accu-Chek Advantage, Roche®)
(Mannheim, Alemanha). Sequencialmente, procedia-se ao Teste de Tolerância
Insulínica (TTI): infusão de uma solução de insulina recombinante humana (Humulin
R®, Eli Lilly) (Indianapolis, Indiana, EUA) na concentração de 1 UI/Kg de peso
corpóreo, através da veia peniana e, em seguida, efetuou-se dosagens de glicemia,
pelo mesmo método da glicemia basal, nos tempos 4, 8, 12 e 16 minutos após a
injeção de insulina. A velocidade de desaparecimento da glicose foi calculada pela
fórmula 0,693 / t ½. O t ½ da glicose foi calculado a partir da inclinação da curva de
regressão mínima durante a fase linear de declínio da concentração plasmática de
glicose156. Esses resultados foram avaliados utilizando o software PRISMA para
cálculo do TTI.
2.3.6 Dosagem de insulina
A dosagem da insulina sérica foi determinada por radioimunoensaio. Para
tanto, a solução reagente inclui uma quantidade conhecida de anticorpo, uma
quantidade conhecida do hormônio marcado radioativamente (insulina marcada com
iodo –
125
I, Amershan Biosciences, Inglaterra) e uma quantidade desconhecida de
hormônio não radioativo (amostra). Como as duas formas de hormônio, radioativo e
não radioativo, competem por um mesmo número de locais de ligação ao anticorpo,
quanto mais hormônio não radioativo estiver presente, menos o hormônio radioativo
irá se ligar. O complexo formado, insulina-anticorpo marcado, é precipitado com
polietilenoglicol (PM 6000) e dosado em contador tipo gama (PerkinElmer, Turku,
Finlândia). Uma curva padrão foi preparada, na qual a relação ligação/livre para o
hormônio radioativo é plotada com função da concentração do hormônio não
radioativo. A relação ligado/livre do hormônio radioativo é maior quanto menor
número de não radioativo estiver presente. A curva padrão foi utilizada para
determinar a concentração do hormônio em cada amostra.
10
2.3.7 Dosagem de colesterol total, HDL-colesterol e triglicérides
As dosagens de colesterol total e de triglicérides foram realizadas pelo
método enzimático monorreagente e o HDL-colesterol pelo método enzimático
birreagente. Nestas análises foram utilizados kits comerciais da marca Labtest
Diagnóstica (Lagoa Santa, MG, Brasil).
2.4
PROCEDIMENTOS OPERATÓRIOS
Nos dias determinados, na 13ª semana de vida, dois ratos foram separados e,
aleatoriamente, distribuídos no GS e no GI, mediante sorteio com moeda para cada
animal.
Os animais anestesiados foram posicionados em decúbito dorsal horizontal
na mesa cirúrgica, com as patas e a cauda devidamente imobilizadas. A antissepsia
da região abdominal foi feita com clorohexidine em veículo aquoso.
Utilizou-se campo cirúrgico esterilizado fenestrado na região abdominal do
animal, sendo realizada uma incisão longitudinal mediana da parede, com
aproximadamente 5 cm de extensão, utilizando-se bisturi descartável de lâmina
número quinze.
Inicialmente, o ceco foi identificado e exposto, juntamente com o íleo terminal
(Figura 1). Foi realizada a mensuração do intestino delgado, em centímetros,
utilizando-se segmento de fio previamente medido. Em seguida, em ambos os
grupos, seccionou-se perpendicularmente o intestino delgado na região distando 5
cm da transição ileocecal e removeu-se um segmento ileal de 1 cm para estudo
histológico.
11
Figura 1 - Identificação e exposição do ceco e íleo terminal
No GI, o íleo foi perpendicularmente seccionado a 5 cm e a 15 cm da
transição ileocecal, dessa forma, separando-se um segmento de 10 cm (Figura 2a),
o qual foi envolto em gaze umedecida com solução aquecida de cloreto de sódio a
0,9%. Em seguida, foi restabelecida a continuidade do tubo digestório mediante a
anastomose dos segmentos do íleo remanescente. O jejuno foi, então, seccionado
numa região distante 5 cm da transição duodenojejunal, removendo-se um
segmento de 1 cm para estudo histológico. O segmento do íleo distal, anteriormente
separado, foi agora interposto aos segmentos do jejuno seccionado, em posição
isoperistáltica (Figura 2b).
12
Figura 2 - a) Esquema demonstrativo das regiões de secção intestinal e do
segmento a ser transposto no GI. No GS, as secções foram nas mesmas
regiões com anastomose em seguida, sem a transposição. b) Esquema
demonstrativo do segmento de íleo distal já interposto ao jejuno proximal
no GI
No GS, o intestino foi seccionado perpendicularmente nas regiões distantes, 5
cm e 15 cm da transição ileocecal e 5 cm da transição duodenojejunal, com imediata
reconstrução do tubo digestório, sem a transposição do segmento ileal (Figura 2a).
Foram retirados segmentos de 1 cm do íleo distal e do jejuno proximal para estudo
histológico.
Todas as anastomoses intestinais foram terminoterminais e realizadas com 6
pontos totais separados, utilizando-se fios de polipropileno 7-0 pré-montados em
agulha cilíndrica (Figura 3).
13
Figura 3 - Visão microscópica da anastomose intestinal terminoterminal (aumento de
4 vezes)
O fechamento da parede abdominal foi realizado com sutura contínua em
monobloco do peritônio parietal, da camada muscular e da aponeurose utilizando-se
fio de poliglactina 4-0 pré-montado em agulha cilíndrica. Na pele, realizou-se sutura
contínua, utilizando-se fio de poliglactina 4-0 pré-montado em agulha cilíndrica, com
pontos invertidos.
Ao término da operação, foi realizada hidratação com injeção de solução
fisiológica 0,5% subcutânea no dorso dos animais, na dose de 10 mL/Kg de peso.
2.5
EVOLUÇÃO PÓS-OPERATÓRIA
Os animais foram mantidos em observação até a recuperação completa da
anestesia, quando, então, foram colocados em gaiolas individuais e encaminhados
para a sala de albergue, no Biotério da Biofísica, sob as mesmas condições
ambientais pré-operatórias.
14
Foram reintroduzidas dieta e água, ad libitum, tão logo houve recuperação
anestésica.
Os animais foram acompanhados até a 8ª semana do PO, ou seja, até 21
semanas de vida.
2.6
EUTANÁSIA
A eutanásia ocorreu pela técnica de decapitação, conforme orientação do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), na 8ª semana de PO (21
semanas de vida). Em ambos os grupos, foram realizados os mesmos
procedimentos de jejum, anestesia, pesagem, coleta de sangue e testes
laboratoriais descritos por ocasião dos procedimentos da décima segunda semana.
2.7
ESTUDO HISTOLÓGICO
No momento da realização das operações, foram coletadas as seguintes
amostras para avaliação histológica:
a) Segmento de jejuno proximal – Segmento JE 1 (jejuno, no tempo 1); e
b) Segmento de íleo distal – Segmento IL 1 (íleo, no tempo 1).
Após a eutanásia, foram coletadas as seguintes amostras para avaliação
histológica:
c) Segmento de íleo interposto no GI e o segmento correspondente no GS
(segmento de íleo entre as duas anastomoses ileoileais) – Segmento T 2
(segmento interposto, no tempo 2);
d) Segmento de jejuno proximal à anastomose jejunoileal no GI e
jejunojejunal no GS – Segmento JE 2 (jejuno, no tempo 2); e
e) Segmento de íleo, distal à anastomose ileoileal – Segmento IL 2 (íleo, no
tempo 2).
As amostras foram enviadas ao Departamento de Patologia fixadas em
formalina tamponada (Anexo 1), em um volume aproximado de vinte vezes o volume
do espécime, por um período compreendido entre 12 e 24 horas. Em seguida,
procedeu-se à desidratação do tecido com cinco banhos, de uma hora cada, de
álcool etílico em concentrações progressivamente maiores até 100%. A diafanização
15
foi feita com dois banhos consecutivos de xilol, de uma hora cada e, após, realizouse a embebição em parafina líquida para confecção dos blocos e posterior
microtomia.
2.7.1 Coloração com hematoxilina-eosina
Realizou-se cortes histológicos a partir dos blocos de parafina, com 3 m de
espessura, utilizando-se micrótomo rotativo. Estes cortes foram colocados em
lâminas que foram para estufa, por 20 minutos, para adesão.
As lâminas com os cortes histológicos seguiram protocolo para coloração com
hematoxilina e eosina (Anexo 2).
2.7.2 Coloração com imunohistoquímica
Foram realizados cortes histológicos a partir dos blocos de parafina, em
micrótomo rotativo do tipo Minot regulado para 3 m de espessura, e colocados em
lâminas tratadas com organosilano para imunohistoquímica (Anexo 3).
As lâminas com os cortes histológicos seguiram protocolo para coloração com
método imunohistoquímico (Anexo 4), utilizando o anticorpo primário policlonal
Rabbit anti-GLP-1 (7-37) – IgG - Código T4362 – Lote 023583 - Peninsula
Laboratories, Bachem Group) (San Carlos, California, EUA), diluídos em BSA 1% em
titulação 1:1000.
2.8
ANÁLISE DAS IMAGENS MICROSCÓPICAS
Para a captura das imagens, utilizou-se um sistema computadorizado,
constituído por microscópio de luz (Olympus - Modelo BX4OF-3), adaptado a uma
câmera de alta resolução (Olympus – Modelo QColor 3) e monitor de vídeo colorido
(LG Flatron®). Foram realizadas fotomicrografias utilizando o programa QCapture
Pro® (desenvolvido pela QImaging, Surrey, Canadá), em equipamento disponível no
Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM.
A análise morfométrica das vilosidades e criptas intestinais foi realizada em
cortes histológicos corados pela hematoxilina-eosina, no aumento de 40 vezes,
digitalizando-se 10 imagens microscópicas com adequada preservação da
16
integridade mucosa (Figura 4 e Figura 5). As imagens digitalizadas foram analisadas
através do programa Imagetool®, fornecido pelo Health Science Center da
Universidade do Texas (San Antonio, Texas, EUA). Os seguintes parâmetros foram
avaliados: a) média da altura das vilosidades mensuradas (em micrômetros); b)
média da profundidade das criptas mensuradas (em micrômetros); e c) relação
vilosidade/cripta.
Figura 4 - Fotomicrografia de corte histológico de segmento de jejuno, em aumento
de 40 vezes, obtida pelo programa QCapture Pro®
17
Figura 5 - Fotomicrografia de corte histológico de segmento de íleo, em aumento de
40 vezes, obtida pelo programa QCapture Pro®
A avaliação da expressão do GLP-1 foi realizada em cortes histológicos
corados por imunohistoquímica, no aumento de 400 vezes, de imagens digitalizadas
compreendendo todo o perímetro intestinal. A partir destas imagens, selecionaramse os locais de criptas na mucosa como objeto de interesse, delimitando esta área
com o auxílio do programa Adobe Photoshop® CS4 (Adobe Systems Incorporated,
California, EUA) (Figura 6). Em seguida, estas imagens trabalhadas foram avaliadas
através do programa Image J®, fornecido pelo National Institute of Mental Health
(Bethesda, Maryland, EUA), sendo mensurada a área da imagem digitalizada (em
micrômetros quadrados) e o número de células que expressaram GLP-1 (coloração
marrom-acastanhada – padrão citoplasmático). Os resultados obtidos foram
expressos a partir da relação entre estes dois parâmetros.
18
Figura 6 - a) Fotomicrografia de corte histológico de segmento de íleo, em aumento
de 400 vezes, obtida pelo programa QCapture Pro®. b) Mesma
fotomicrografia editada no programa Adobe Photoshop CS4®, em que se
realizou a seleção e isolamento da região de criptas
2.9
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Inicialmente realizou-se uma análise exploratória dos dados. Para as variáveis
de natureza quantitativa, foram calculadas medidas-resumo, como média, mediana,
valor mínimo, valor máximo, desvio-padrão, e confeccionados gráficos do tipo
boxplot. Nos boxplots, destacou-se a média com um símbolo de losango e os
valores extremos (outliers) com asteriscos (menos extremos) ou círculos (mais
extremos). As análises descritivas foram feitas no Microsoft Excel 2010 com auxílio
do complemento PTS Charts – Box and Whisker Plot para o Excel.
Analisaram-se as distribuições das variáveis quantitativas quanto a outliers,
desvio da média em relação à mediana e normalidade (teste de Anderson-Darling) e
optou-se por usar testes não paramétricos na grande maioria das variáveis, com
exceção das variáveis peso e consumo alimentar, para as quais utilizou-se
metodologia paramétrica do tipo ANOVA. As análises inferenciais empregadas
foram:
a) Modelo linear generalizado (GLM), do tipo ANOVA com medidas repetidas
e 2 fatores (tempo e grupo), com testes de Tukey como post-hoc na
19
análise da evolução do peso e consumo alimentar (software SigmaPlot
12.0);
b) Teste Mann-Whitney na comparação entre os grupos (GS e GI), antes e
depois da intervenção cirúrgica (software ExStat - Excel Statistics
Calculator 1.8);
c) Teste de Sinais de Postos de Wilcoxon na comparação entre os
momentos antes e depois da operação para cada grupo (GS e GI)
(software ExStat - Excel Statistics Calculator 1.8).
Em todas as conclusões obtidas através das análises inferenciais foi utilizado
o nível de significância α igual a 5%, e níveis descritivos (p-valor) inferiores a esse
valor foram considerados significantes.
20
3
3.1
RESULTADOS
PESO
Os grupos apresentaram peso inicial e evolução ponderal semelhante durante
todo o seguimento pós-operatório, não havendo efeito de interação entre grupo e
tempo (p>0,999), conforme se verifica na Tabela 1 e na Figura 7. Ou seja,
independentemente do momento de avaliação, não houve diferença entre os grupos
(p=0,190), com ambos apresentando aumento ponderal significante ao longo do
tempo (p=001).
Tabela 1- Peso médio (em gramas) nos dois grupos, após a operação
Tempo (semanas)
Grupo
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
GS
408,08
396,54
407,31
420,38
432,69
449,23
456,54
465,38
471,92
477,31
GI
406,36
399,18
400,91
414,09
426,36
438,64
445,45
454,55
462,27
462,18
GLM: Fatores analisados: Grupo p=0,190; Tempo p=0,001; GrupoXTempo p>0,999
500
480
Peso (gramas)
460
440
420
400
380
360
340
GI
320
300
12
13
14
15
16
17
Tempo (semanas)
18
19
20
21
GS
Figura 7 - Evolução do peso médio (±erro padrão) nos dois grupos, após a operação
Na primeira semana pós-operatória, como era esperado, ocorreu uma
diminuição do peso médio dos animais, voltando os mesmos a elevarem
progressivamente nas semanas seguintes.
Ao comparar-se a evolução percentual do peso semanal, entre os grupos,
observou-se um discreto ganho ponderal maior no Grupo Sham em relação ao
Grupo Interposição. No entanto, não foi detectada diferença estatisticamente
significante entre os grupos (Tabela 2 e Figura 8).
21
Tabela 2 - Variação percentual do peso médio nos dois grupos, após a
operação
Tempo (semanas)
Grupo
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
GS
0,00
-2,51
0,20
3,41
6,40
10,57
12,32
14,52
16,15
17,43
GI
0,00
-1,66
-1,41
1,88
4,96
7,90
9,59
11,78
13,72
13,62
GLM: Fatores analisados: Grupo p=0,090; Tempo p=0,010; GrupoxTempo p=0,990
25
Peso (% S12)
20
15
10
5
0
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
-5
GI
-10
GS
Tempo (semanas)
Figura 8 - Variação percentual do peso médio (±erro padrão) nos dois grupos, em
relação à 12ª semana
3.2
CONSUMO ALIMENTAR
A Figura 9 mostra o consumo alimentar médio diário dos animais.
35
Consumo (gramas)
30
25
20
**
15
10
*
5
GI
0
12
13
14
15
16
17
Tempo (semanas)
18
19
20
21
GLM: Fatores analisados: Grupo p=0,046; Tempo p=0,010; GrupoxTempo p=0,037
Pós-HOC (Teste de Tukey): *p=0,008; **p=0,010
Figura 9 - Consumo alimentar médio diário (em gramas)(±erro padrão), nos dois
grupos
GS
22
Houve uma menor ingestão alimentar na primeira semana pós-operatória nos
dois grupos, sendo a média normal esperada recuperada nas semanas seguintes.
No entanto, esta diminuição da ingestão foi maior no GI do que no GS (Semana 13:
p=0,008), bem como a recuperação foi mais lenta no GI do que no GS (Semana 15:
p=0,010). A partir da Semana 16, os dois grupos apresentaram consumo
semelhante de dieta. O consumo alimentar acumulado no final do experimento foi
semelhante nos dois grupos (Figura 10).
2500
Consumo Acumulado (gramas)
2000
1500
1000
500
0
GS
GI
Teste de Mann-Whitney: p=0,176
Figura 10 - Consumo alimentar acumulado (em gramas), nos dois grupos, no final do
experimento
3.3
TESTES LABORATORIAIS
3.3.1 Glicemia basal
Não houve diferença entre os grupos antes e depois do procedimento
cirúrgico (Tabela 3).
23
Tabela 3 - Glicemia basal (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação
GS
GI
p-valor*
12
11
Média (DP)
113,67 (32,02)
117,64 (24,55)
Mediana (IIQ)
108,50 (51,75)
110,00 (36,00)
60,00-169,00
80,00-164,00
14
11
Média (DP)
130,29 (36,90)
120,36 (26,60)
Mediana (IIQ)
111,50 (48,50)
116,00 (37,00)
99,00-225,00
84,00-178,00
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,200
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,371
*Teste de Mann-Whitney
No entanto, ao avaliar cada grupo, separadamente, verifica-se que o GS
apresentou uma glicemia basal mais elevada no momento da eutanásia. Tal
evolução não ocorre no GI, conforme se vê na Figura 11.
250
*
**
Glicemia (mg/dL)
200
150
100
50
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Teste de Wilcoxon: * p=0,032; **p=0,278
Figura 11 - Comparação da glicemia basal (mg/dL) em cada grupo, antes e depois
da operação
24
3.3.2 Insulina
Não houve diferença entre os grupos, antes e depois da operação, em
relação à insulinemia basal (Tabela 4).
Tabela 4 - Insulina basal (ng/mL) nos dois grupos, antes e depois da operação
GS
GI
9
8
Média (DP)
3,73 (5,35)
1,84 (0,94)
Mediana (IIQ)
1,86 (2,15)
1,71 (1,13)
Mínimo-máximo
1,20-17,70
1,00-3,87
7
8
Média (DP)
9,18 (11,58)
8,28 (10,76)
Mediana (IIQ)
3,32 (10,79)
2,47 (13,80)
1,70-33,66
1,62-30,78
p-valor*
Pré-operatório
N
0,200
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,200
Ao avaliar a evolução em cada grupo, separadamente, constatou-se um
aumento significante na insulinemia no GI e não no GS, conforme ilustrado na Figura
12.
25
40
*
35
**
Insulina (ng/mL)
30
25
20
15
10
5
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 12 - Comparação da insulina basal (ng/mL) em cada grupo, antes e depois da
operação
3.3.3 Teste se tolerância insulínica (TTI)
Não houve diferença entre os grupos, nos dois momentos (Tabela 5).
Tabela 5 - TTI (%/min) nos dois grupos, antes e depois da operação
GS
GI
13
11
Média (DP)
2,68 (1,56)
2,62 (1,59)
Mediana (IIQ)
2,60 (2,65)
2,15 (2,27)
0,69-5,69
0,66-5,23
14
11
Média (DP)
3,59 (2,23)
2,45 (1,18)
Mediana (IIQ)
3,31 (3,95)
2,26 (1,86)
0,75-8,29
0,20-4,01
p-valor*
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,442
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,136
26
Na análise da evolução do TTI em cada grupo, separadamente, não foi
detectada diferença significante antes e depois da operação (Figura 13).
9
*
8
**
TTI (%/min)
7
6
5
4
3
2
1
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Teste de Wilcoxon: *p=0,095; **p=0,384
Figura 13 - Comparação do TTI (%/min) em cada grupo, antes e depois da operação
3.3.4 Colesterol
Não houve diferença significante entre os dois grupos nos dois momentos
(Tabela 6).
27
Tabela 6 - Colesterol total (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da
operação
GS
GI
12
10
Média (DP)
109,99 (35,10)
123,65 (49,00)
Mediana (IIQ)
101,66 (42,50)
121,66 (97,49)
30,00-169,98
43,32-189,98
11
9
Média (DP)
94,95 (41,94)
75,54 (43,75)
Mediana (IIQ)
99,99 (45,47)
63,27 (51,67)
3,33-153,32
3,33-156,65
p-valor*
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,200
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,150
Analisando cada grupo, isoladamente, observou-se que o GI apresentou
redução significante nos níveis de colesterol no pós-operatório. Tal fato não ocorreu
no GS, conforme se verifica na Figura 14.
28
200
*
180
**
160
Colesterol (mg/dL)
140
120
100
80
60
40
20
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 14 - Comparação do colesterol total (mg/dL) em cada grupo, antes e depois
da operação
3.3.5 HDL-colesterol
Não houve diferença entre os grupos, antes e depois do procedimento
29
Tabela 7 - HDL-colesterol (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação
GS
GI
p-valor*
6
7
Média (DP)
27,95 (5,28)
21,99 (9,78)
Mediana (IIQ)
29,08 (10,38)
18,27 (20,11)
21,62-33,63
11,39-36,81
10
4
Média (DP)
24,53 (8,42)
26,70 (9,78)
Mediana (IIQ)
24,11 (14,31)
26,79 (18,94)
12,96-39,38
15,36-37,87
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,166
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,200
No entanto, ao avaliar a evolução em cada grupo, separadamente, observouse aumento do HDL-colesterol no GI e não no GS (Figura 15).
45
*
HDL-colesterol (mg/dL)
40
**
35
30
25
20
15
10
5
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Teste de Wilcoxon: *p=0,437; **p<0,001
Figura 15 - Comparação do HDL-colesterol (mg/dL) em cada grupo, antes e depois
da operação
30
3.3.6 Triglicérides
Não houve diferença entre os grupos, antes e depois do procedimento
Tabela 8 - Triglicérides (mg/dL) nos dois grupos, antes e depois da operação
GS
GI
12
9
Média (DP)
47,69 (17,08)
59,49 (19,22)
Mediana (IIQ)
47,69 (23,84)
64,62 (40,00)
15,39-76,93
33,84-83,08
11
9
Média (DP)
99,87 (77,44)
88,87 (35,24)
Mediana (IIQ)
83,08 (76,93)
76,93 (49,32)
Mínimo-máximo
30,77-273,85
27,69-141,54
p-valor*
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,116
Pós-operatório
N
0,200
Analisando a evolução dos triglicérides, em cada grupo, separadamente,
observou-se aumento significante no GS no momento da eutanásia, e não no GI,
conforme ilustrado na Figura 16.
31
300
*
**
Triglicérides (mg/dL)
250
200
150
100
50
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 16 - Comparação dos triglicérides (mg/dL) em cada grupo, antes e depois da
operação
3.4
COMPRIMENTO DO INTESTINO DELGADO
A Tabela 9 mostra o comprimento do intestino delgado mensurado no
momento do procedimento cirúrgico, nos dois grupos. Vê-se que os dois grupos
apresentaram dados semelhantes.
Tabela 9 - Comprimento do intestino delgado (cm) nos dois grupos, no
momento da operação
GS
GI
14
11
Média (DP)
112,50 (16,14)
120,91 (24,88)
Mediana (IIQ)
110,00 (21,25)
120,00 (45,00)
85,00-150,00
85,00-155,00
N
Mínimo-máximo
p-valor*
0,229
32
3.5
ESTRUTURA DA MUCOSA INTESTINAL
3.5.1 Jejuno
Ao comparar as características morfológicas nos dois grupos, antes e depois
dos procedimentos cirúrgicos, observou-se diferença significante na altura das
vilosidades do jejuno, após a operação (Tabela 10).
Tabela 10 - Altura das vilosidades no jejuno (µm) nos dois grupos, antes e
depois da operação
GS
GI
13
11
Média (DP)
381,74 (48,25)
409,85 (72,89)
Mediana (IIQ)
384,43 (72,86)
417,96 (109,04)
Mínimo-máximo
311,86-485,45
197,92-547,21
11
8
Média (DP)
390,81 (91,80)
500,70 (53,18)
Mediana (IIQ)
370,46 (150,55)
484,66 (69,07)
272,83-552,86
416,510-588,95
p-valor*
Pré-operatório
N
0,129
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,007
Analisando cada grupo, separadamente, antes e depois da operação,
comprovou-se aumento das vilosidades do jejuno apenas no GI e não no GS,
conforme demonstra a Figura 17.
33
700
*
**
Vilosidades jejuno (µm)
600
500
400
300
200
100
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Teste de Wilcoxon: * p=0,480; **p<0,001
Figura 17 - Altura das vilosidades no jejuno (µm) em cada grupo, antes e depois da
operação
Em relação às criptas, não foi detectada diferença entre os grupos nos dois
momentos, conforme evidenciado na Tabela 11.
Tabela 11 - Profundidade das criptas no jejuno (µm) nos dois grupos, antes e
GS
GI
13
11
Média (DP)
246,77 (50,75)
253,12 (41,07)
Mediana (IIQ)
252,29 (62,28)
258,04 (59,11)
Mínimo-máximo
145,81-348,33
182,29-309,51
11
8
Média (DP)
252,69 (47,40)
291,58 (66,04)
Mediana (IIQ)
248,56 (87,47)
322,12 (107,06)
Mínimo-máximo
196,01-346,73
178,12-353,62
p-valor*
Pré-operatório
N
0,311
Pós-operatório
N
0,100
34
Também não houve diferença na profundidade das criptas em cada grupo
avaliado isoladamente, entre os dois momentos, conforme demonstra a Figura 18.
400
*
**
350
Criptas jejuno (µm)
300
250
200
150
100
50
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 18 - Profundidade das criptas no jejuno (µm) em cada grupo, antes e depois
da operação
A análise da evolução da relação vilosidade/cripta não evidenciou diferença
estatisticamente significante entre os grupos nos dois momentos, conforme se
verifica na Tabela 12.
35
Tabela 12 - Relação vilosidade/cripta no jejuno nos dois grupos, antes e depois
da operação
GS
GI
p-valor*
13
11
Média (DP)
1,62 (0,45)
1,67 (0,50)
Mediana (IIQ)
1,58 (0,26)
1,57 (0,35)
0,90-2,88
1,16-3,00
11
8
Média (DP)
1,60 (0,53)
1,83 (0,59)
Mediana (IIQ)
1,53 (0,69)
1,63 (0,94)
0,90-2,82
1,27-2,95
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,442
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,200
Também não houve diferença em cada grupo avaliado separadamente antes
e depois da operação, conforme mostra a Figura 19.
3,5
Relação vilosidade/cripta jejuno
*
**
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 19 - Relação vilosidade/cripta no jejuno em cada grupo, antes e depois da
operação
36
3.5.2 Íleo
Não foi detectada diferença na altura das vilosidades no íleo entre os grupos,
nos dois momentos (Tabela 13).
Tabela 13 - Altura das vilosidades no íleo (µm) nos dois grupos, antes e depois
da operação
GS
GI
14
11
Média (DP)
273,97 (34,91)
274,05 (49,00)
Mediana (IIQ)
282,42 (47,08)
266,66 (81,25)
Mínimo-máximo
206,43-323,45
209,17-354,31
13
10
Média (DP)
348,59 (45,11)
376,51 (87,93)
Mediana (IIQ)
358,00 (61,69)
348,87 (106,90)
Mínimo-máximo
272,47-440,56
298,04-466,57
p-valor*
Pré-operatório
N
0,456
Pós-operatório
N
0,309
No entanto, avaliando separadamente cada grupo nos dois momentos,
observou-se que ambos apresentaram aumento significante na altura das
vilosidades do íleo, após a operação (Figura 20).
37
700
*
**
Vilosidades íleo (µm)
600
500
400
300
200
100
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 20 - Altura das vilosidades no íleo (µm) em cada grupo, antes e depois da
operação
A Tabela 14 mostra que não houve diferença entre os grupos quanto à
profundidade das criptas no íleo, antes e depois da operação.
Tabela 14 - Profundidade das criptas no íleo (µm) nos dois grupos, antes e
GS
GI
14
11
Média (DP)
257,04 (49,95)
240,90 (54,07)
Mediana (IIQ)
245,41 (77,34)
220,26 (100,40)
Mínimo-máximo
187,87-348,70
179,08-329,99
13
10
Média (DP)
266,60 (61,05)
241,73 (30,68)
Mediana (IIQ)
275,24 (88,74)
256,79 (47,30)
Mínimo-máximo
139,06-347,76
183,78-281,31
p-valor*
Pré-operatório
N
0,190
Pós-operatório
N
0,053
38
A Figura 21 mostra a evolução das profundidades das criptas no íleo, antes e
após a operação, nos dois grupos, que não apresentou modificação significante.
400
*
**
350
Criptas íleo (µm)
300
250
200
150
100
50
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 21 - Profundidade das criptas no íleo (µm) em cada grupo, antes e depois da
operação
Quanto à relação vilosidade/cripta no íleo, verificou-se que não houve
diferença entre os grupos nos dois momentos (Tabela 15).
39
Tabela 15 - Relação vilosidade/cripta no íleo nos dois grupos, antes e depois
da operação
GS
GI
14
11
Média (DP)
1,08 (0,12)
1,16 (0,15)
Mediana (IIQ)
1,11 (0,21)
1,18 (0,31)
0,89-1,29
0,94-1,39
13
10
Média (DP)
1,41 (0,59)
1,57 (0,39)
Mediana (IIQ)
1,21 (0,50)
1,46 (0,29)
0,88-3,17
1,31-2,63
p-valor*
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,085
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,060
No entanto, avaliando-se cada grupo separadamente, nos dois momentos,
observou-se que houve aumento significante na relação vilosidade/cripta no íleo de
ambos os grupos, após o procedimento cirúrgico (Figura 22).
40
3,5
*
**
Relação vilosidade/cripta íleo
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 22 - Relação vilosidade/cripta no íleo em cada grupo, antes e depois da
operação
3.5.3 Segmento Interposto
A Tabela 16 mostra a altura das vilosidades no segmento interposto do GI e
simulado do GS (íleo entre anastomoses), após a operação, que foram diferentes.
Tabela 16 - Altura das vilosidades no segmento interposto (µm) nos dois
grupos, depois da operação
GS
GI
11
7
Média (DP)
341,96 (62,22)
503,11 (100,46)
Mediana (IIQ)
349,85 (87,89)
473,83 (97,29)
Mínimo-máximo
245,24-462,55
367,68-689,60
N
p-valor*
0,002
As vilosidades do segmento interposto no GI e simulado no GS aumentaram
(em relação ao íleo no pré-operatório), após o procedimento cirúrgico, conforme
mostra a Figura 23.
41
800
*
**
Vilosidades interposto (µm)
700
600
500
400
300
200
100
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 23 - Altura das vilosidades no segmento interposto (µm) em cada grupo,
antes e depois da operação
Os dois grupos foram semelhantes quanto à profundidade das criptas no
segmento interposto, após a operação (Tabela 17).
Tabela 17 - Comparação da profundidade das criptas no segmento interposto
(µm) entre os grupos, depois da operação
GS
GI
11
7
Média (DP)
288,08 (51,97)
288,93 (66,79)
Mediana (IIQ)
284,32 (89,25)
299,56 (120,32)
Mínimo-máximo
219,12-356,74
188,92-381,48
N
p-valor*
0,200
No entanto, avaliando separadamente cada grupo, antes e depois da
operação, quanto à profundidade das criptas, observou-se aumento significante
apenas no GI, conforme evidenciado na Figura 24.
42
450
*
Criptas interposto (µm)
400
**
350
300
250
200
150
100
50
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 24 - Profundidade das criptas no segmento interposto (µm) em cada grupo,
A relação vilosidade/cripta no segmento interposto foi diferente entre os
grupos, após a operação (Tabela 18).
Tabela 18 - Relação vilosidade/cripta no segmento interposto nos dois grupos,
GS
GI
11
7
Média (DP)
1,22 (0,29)
1,83 (0,58)
Mediana (IIQ)
1,15 (0,56)
1,58 (0,90)
0,87-1,63
1,20-2,80
N
Mínimo-máximo
p-valor*
0,021
A relação vilosidade/cripta no segmento interposto do GI aumentou
significantemente no pós-operatório, conforme mostrado na Figura 25.
43
Relação vilosidade/cripta interposto
3
*
**
2,5
2
1,5
1
0,5
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 25 - Relação vilosidade/cripta no segmento interposto em cada grupo, antes e
3.6
CÉLULAS L ENTEROENDÓCRINAS
3.6.1 Jejuno
Os dois grupos apresentaram semelhante densidade de células L no jejuno,
antes e após a operação (Tabela 19).
44
Tabela 19 - Densidade de células L no jejuno (cel/µm2) nos dois grupos, antes e
GS
GI
p-valor*
14
11
Média (DP)
1,37 (0,50)
1,46 (0,75)
Mediana (IIQ)
1,35 (0,82)
1,25 (0,52)
0,72-2,36
0,74-3,42
12
10
Média (DP)
1,34 (0,38)
1,19 (0,30)
Mediana (IIQ)
1,50 (0,59)
1,20 (0,52)
0,63-1,83
0,74-1,69
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,434
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,143
* Teste de Mann-Whitney
Também não houve modificação quando se avaliou cada grupo isoladamente
(Figura 26).
Densidade cel L jejuno (x100000)
4
*
3,5
**
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 26 - Densidade de células L no jejuno (cel/µm2) em cada grupo, antes e
45
3.6.2 Íleo
Não houve diferença na densidade de células L no íleo nos dois grupos, antes
ou após a operação (Tabela 20).
Tabela 20 - Densidade de células L no íleo (cel/µm2) nos dois grupos, antes e
GS
GI
p-valor*
12
11
Média (DP)
2,96 (0,93)
3,19 (0,61)
Mediana (IIQ)
2,80 (1,27)
3,26 (0,97)
1,96-4,80
2,17-4,05
14
11
Média (DP)
3,35 (0,98)
3,33 (1,01)
Mediana (IIQ)
3,26 (0,95)
3,39 (1,27)
1,90-5,40
2,12-5,52
Pré-operatório
N
Mínimo-máximo
0,171
Pós-operatório
N
Mínimo-máximo
0,500
Também
não
foi
separadamente (Figura 27).
observada
modificação
em
cada
grupo
avaliado
46
6
Densidade cel L íleo (x100000)
*
**
5
4
3
2
1
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 27 - Densidade de células L no íleo (cel/µm2) em cada grupo, antes e depois
da operação
3.6.3 Segmento interposto
Não houve diferença entre os grupos quanto à densidade de células L no
segmento interposto do GI e simulado do GS, após a operação (Tabela 21).
Tabela 21 - Densidade de células L no segmento interposto (cel/µm2) nos dois
grupos, depois da operação
GS
GI
13
11
Média (DP)
3,01 (0,87)
3,26 (0,94)
Mediana (IIQ)
2,78 (1,63)
3,31 (1,35)
1,68-4,17
1,48-4,81
N
Mínimo-máximo
p-valor*
0,311
Avaliando-se a evolução na densidade de células L no segmento interposto
em cada grupo, antes e após a operação, observou-se que não houve diferença,
entre os dois momentos, em nenhum dos grupos, conforme se vê na Figura 28.
47
Densidade cel L interposto (x100000)
6
*
**
5
4
3
2
1
0
GS Antes
GS Depois
GI Antes
GI Depois
Figura 28 - Densidade de células L no segmento interposto (cel/µm2) em cada grupo,
48
4
DISCUSSÃO
A difusão das operações bariátricas em todo o mundo, as observações
clínicas e as pesquisas relacionadas levaram à identificação de um sistema
enteroendócrino mais complexo do que se sabia previamente 38,43-45,52,53. Foram
observadas novas funções de hormônios já conhecidos53,54, e descobertos novos
hormônios39,40,48,73,157 e novas células endócrinas em diferentes segmentos do tubo
digestório49,64-66,68. O conhecimento de que determinados hormônios intestinais
atuam
no
ciclo
fome-saciedade46,71,
na
motilidade
gastrintestinal53,
no
pâncreas57,82,93 e no metabolismo glicídico e lipídico75,77,158,159, entre outros órgãos e
funções, suscita a idealização de mecanismos para estimular e/ou inibir
determinados hormônios no intuito de melhorar o tratamento de diversas doenças
metabólicas, principalmente a obesidade e o diabetes mellitus81,86,92,97.
O íleo terminal tem um papel importante nesse eixo enteroendócrino, onde há
uma densidade maior das células endócrinas L, produtoras de GLP-1 e PYY –
hormônios com diversas funções já identificadas, principalmente relacionadas ao
metabolismo glicídico. No entanto, com as operações bariátricas atualmente
aprovadas para execução na prática clínica, não há como estudar isoladamente a
função desse segmento intestinal, uma vez que os procedimentos envolvem, na
maior parte das vezes, um componente restritivo e outro que dificulta a absorção,
que proporcionam perda de peso, diminuição de ingestão alimentar, má-absorção e
exclusão de partes de estômago e/ou intestino delgado que também ocasionam
alterações endócrinas. De forma que há uma sobreposição de fatores e segmentos
do tubo digestório envolvidos e modificados, decorrentes das operações realizadas
na prática médica, que confundem a avaliação dos efeitos do íleo e do GLP-1.
Assim, a escolha do modelo de interposição ileal isolada deveu-se ao objetivo
de avaliar as modificações decorrentes desse procedimento isolado, estudando o
papel do íleo terminal no metabolismo do indivíduo. Esse é o único modelo em que é
possível realizar a análise da função do íleo terminal isoladamente, permitindo
estimular a liberação mais precoce dos hormônios produzidos pelas células L e
avaliar os efeitos disso. Permite, ainda, que sejam analisadas também as possíveis
modificações/adaptações
ocorridas
deslocado da sua posição normal.
tardiamente
nesse
segmento
intestinal
49
Além disso, escolhemos utilizar animais normais (sem obesidade e/ou
diabetes) para estudar os efeitos desse procedimento em relação aos aspectos
nutricionais e metabólicos, visando avaliar a segurança do mesmo. Nesse sentido,
se o procedimento mostrar-se seguro, sem determinar perda ponderal e/ou
desnutrição, interferir positivamente no metabolismo glicídico e lipídico, e não houver
falha em longo prazo, pode ser uma opção terapêutica em pacientes diabéticos não
obesos.
No presente estudo, os grupos foram homogêneos, não ocorrendo diferença
em nenhum dos dados biométricos, bioquímicos e/ou histológicos avaliados no préoperatório.
O número diferente de animais dos grupos deveu-se à randomização, uma
vez que foi realizado sorteio para cada animal, de forma que havia igual
probabilidade de ser direcionado para qualquer grupo. Além disso, houve perda de
animais: 8 óbitos no pós-operatório imediato (6 do GI e 2 do GS) – que foram
atribuídas ao trauma cirúrgico/anestésico e não a complicação da técnica cirúrgica
diretamente - e 1 óbito no 14º PO (do GS), de causa não esclarecida. E ainda, o
número diferente nos diversos parâmetros avaliados deveu-se à impossibilidade de
coleta de dados de alguns animais, por motivos diversos: dificuldade de coleta de
amostra sanguínea suficiente, impossibilidade de cateterização venosa, hemólise
acentuada que inviabilizou a mensuração, autólise de mucosa intestinal em algumas
amostras teciduais e intensa “reação de fundo” na coloração imunohistoquímica que
dificultou a avaliação.
A evolução do peso corporal foi semelhante nos dois grupos. No entanto,
houve diminuição de peso nas primeiras duas semanas após a operação e retorno
ao aumento progressivo de peso após esse período. Atribuímos essa queda inicial
ao trauma cirúrgico, uma vez que ocorreu em ambos os grupos de maneira similar.
No final do experimento, os dois grupos apresentaram peso corpóreo médio
semelhante, evidenciando que não houve deficiência calórica com a interposição
ileal em animais não obesos e não diabéticos. Ao analisarmos a variação percentual
do peso semanal, observamos que houve um discreto ganho ponderal maior no
Grupo Sham em relação ao Grupo Interposição, no entanto não foi detectada
diferença estatisticamente significante entre os grupos. Esses resultados foram
coincidentes com os observados previamente em outros estudos experimentais com
ratos normais84,88,135,160.
50
Quanto à ingestão alimentar observamos diminuição importante nas primeiras
semanas de pós-operatório nos dois grupos, sendo esta diminuição mantida por
mais tempo no GI (até a quarta semana após a operação). Isso pode ser devido ao
aumento na liberação de hormônios anorexígenos pelo íleo terminal, exposto ao
conteúdo da luz intestinal mais precocemente no GI. Apesar de não termos
analisado estes hormônios no presente estudo, outros trabalhos realizados com
ratos
submetidos
mesmos
à
interposição
ileal
demonstraram
o
aumento
dos
84,133,160,161
. Tardiamente, não houve diferença entre os grupos, quanto ao
consumo alimentar. Fato também demonstrado em outro experimento com duração
de seis semanas após procedimento cirúrgico semelhante161.
Estudos que avaliaram a absorção de gorduras em ratos submetidos a
interposição ileal demonstraram não haver disabsorção com este procedimento 133.
Apesar de não analisarmos a absorção alimentar em nosso estudo, podemos inferir,
a partir dos dados anteriormente demonstrados, que a interposição ileal não
proporciona restrição alimentar nem disabsorção de nutrientes.
Ao avaliarmos os efeitos da interposição ileal em relação à glicemia e à
tolerância insulínica, observamos que não houve diferença entre os grupos, antes e
depois do procedimento cirúrgico. Este resultado coincide com o de outros
experimentos realizados com ratos euglicêmicos e não obesos88,135,160, o que
corrobora a idéia de que o GLP-1 não influencia diretamente na sensibilidade à
insulina, como demonstrado em estudo utilizando clamp hiperinsulinêmico e
euglicêmico em humanos euglicêmicos162.
Além disso, a ação dos hormônios incretínicos, principalmente o GLP-1,
parece ser dependente dos níveis de glicemia. O presente estudo não avaliou o
GLP-1, porém estudos experimentais prévios, utilizando a interposição ileal isolada
em animais não obesos e não diabéticos, demonstraram mudança na secreção dos
hormônios produzidos pelo íleo terminal, seja um pico de secreção mais elevado ou
uma liberação mais prolongada84,88,139. Assim, apesar do provável aumento nos
níveis de GLP-1, não ocorreu hipoglicemia.
Analisando separadamente cada grupo do presente estudo, percebemos que
o GS apresentou aumento dos níveis glicêmicos ao longo do tempo, o que não
aconteceu no GI. Observamos, ainda, aumento dos níveis séricos de insulina no GI
e não no GS. Assim, não sabemos se o aumento dos níveis glicêmicos é a evolução
natural com o envelhecimento dos animais, ou se a interposição ileal realizada no GI
51
modificou a mesma, através da interferência nas incretinas e justificando a glicemia
estável. Se assim o for, é mais um dado a favor da interferência positiva desse
procedimento no metabolismo glicídico.
Em relação ao metabolismo lipídico, não observamos diferença entre os
grupos no momento da eutanásia. No entanto, ao avaliarmos a evolução
isoladamente dentro de cada grupo, comparando o pré e o pós-operatório, pudemos
verificar que houve diminuição dos níveis de colesterol total no GI e não no GS, bem
como aumento dos níveis de triglicérides no GS e não no GI. Isso coincide com
resultados obtidos previamente em estudos com animais diabéticos75,77, levando a
crer, também, numa possível associação entre a melhora do diabetes e/ou da
tolerância à glicose e a diminuição dos níveis lipídicos, possivelmente influenciada
pelos hormônios GLP-1 e PYY, bem como pela modificação do círculo ênterohepático de sais biliares com a exposição e absorção mais precoce destes pelo
segmento de íleo interposto.
Estudos realizados em humanos com síndrome metabólica, utilizando a
interposição ileal associada à gastrectomia vertical, também demonstraram
resultados positivos no tocante à melhora do perfil lipídico, com diminuição de
colesterol total e triglicérides, bem como aumento dos níveis de HDL-colesterol119,163.
Este último parâmetro laboratorial também foi demonstrado no presente estudo, com
aumento no GI e não no GS.
A influência da interposição ileal no círculo êntero-hepático de sais biliares e
no metabolismo lipídico foi analisada em outro estudo com ratos alimentados com
dieta hiperlipídica e submetidos à interposição ileal, sendo obtidos resultados
semelhantes aos deste estudo, com diminuição dos níveis de colesterol nos animais
do Grupo Interposição e não do Grupo Sham. Foram avaliadas, ainda, a quantidade
e a composição de ácidos biliares intraluminais ao longo do tubo digestório, sendo
evidenciada uma absorção mais precoce nos animais do Grupo Interposto em
relação aos do Grupo Sham, com aumento dos níveis séricos destas substâncias,
sem modificação nos níveis das proteínas hepáticas relacionadas ao metabolismo
das mesmas161. Assim, infere-se atualmente um possível papel importante dessa
modificação na recirculação dos ácidos biliares nos benefícios metabólicos obtidos
após as operações bariátricas que “encurtam o caminho” dos alimentos até o íleo
terminal, assim como a interposição ileal.
52
No tocante às análises morfométricas intestinais do presente estudo,
observamos que os animais apresentavam morfologia semelhante no pré-operatório,
tanto quanto ao comprimento intestinal quanto aos dados microscópicos.
Sabe-se que alterações na anatomia do tubo digestório, com modificações no
comprimento (com retiradas de segmentos), no calibre ou com a realização de
desvios de segmentos, ocasionam modificações nas partes remanescentes do
intestino. Estudos experimentais da década de 90, utilizando modelos de síndrome
de intestino curto, em que foi realizada a interposição de um segmento de cólon
entre os segmentos de jejuno e íleo remanescentes, demonstraram a ocorrência de
modificação na estrutura intestinal como forma provável de adaptação. Foi
demonstrado, no segmento colônico interposto, aumento na altura da mucosa
intestinal com proliferação das criptas
151
, aumento na absorção de glicose149 e
modificações na motilidade148. Isto também foi evidenciado em humano com
síndrome do intestino curto, em que ocorreu hiperplasia de criptas e aumento na
altura da mucosa no segmento colônico interposto, bem como o surgimento de
células semelhantes às típicas células de Paneth presentes no intestino delgado 164.
No entanto, um questionamento a fazer é se estas modificações poderiam ser
devidas à adaptação a uma condição de diminuição do comprimento do tubo
digestório, com a diminuição da superfície absortiva, e não à transposição de
segmentos.
Com o advento das operações bariátricas e a identificação de diversos
hormônios gastrintestinais que influenciam no metabolismo dos indivíduos, passouse a estudar também a interposição ileal isolada, sem modificações na extensão do
intestino. Demonstrou-se, em diversos estudos, que este procedimento produz
aumento da espessura da mucosa em todo o intestino delgado 132,152,153,165, com uma
“jejunização” do segmento ileal transposto tornando-se o mesmo indistinguível dos
segmentos jejunais adjacentes153.
Neste estudo, ocorreu aumento na altura das vilosidades e na relação
vilosidade/cripta do segmento ileal interposto do GI, de forma que este adquiriu
características morfológicas semelhantes ao jejuno adjacente - posição para o qual
foi transportado. No segmento jejunal, houve aumento significante nas vilosidades
no GI e não no GS, no entanto, como também ocorreu aumento na profundidade das
criptas (não estatisticamente significante), a relação vilosidade/cripta não foi
alterada. Em relação ao íleo em sua posição normal, observamos que houve um
53
aumento na altura das vilosidades e na relação vilosidade/cripta em ambos os
grupos, ao longo do tempo, não havendo diferença entre os mesmos.
Isso evidencia provável manutenção dos mecanismos tróficos intestinais, e
com possível mediação hormonal, como demonstrado em estudos prévios que
analisaram os níveis dos êntero-hormônios - enteroglucagon132 e glucagon-like
peptide 2 (GLP-2)166 - após este procedimento cirúrgico.
O GLP-2 foi identificado como hormônio com função trófica sobre a mucosa
intestinal, sendo o mesmo também produzido pelas células L intestinais em resposta
à presença de nutrientes na luz intestinal70,157,167,168. O aumento na produção desse
hormônio parece explicar estas modificações existentes quando o íleo terminal é
exposto mais precocemente aos alimentos ainda não digeridos, como avaliado em
estudo experimental realizado com ratos submetidos à ressecção de jejuno ou de
íleo ou interposição ileal. Houve aumento significante no peso e nas áreas de
mucosa e musculatura intestinais nos animais submetidos à ressecção de jejuno e
interposição ileal, com aumento concomitante nos níveis séricos de GLP-2; o que
não ocorreu no grupo submetido à ressecção de íleo166.
Para esclarecer dúvidas quanto à viabilidade do procedimento de interposição
ileal como mecanismo de estimulação mais precoce de liberação do GLP-1 pelas
células L do segmento ileal interposto, avaliamos a densidade destas células neste
segmento após o referido procedimento.
Inicialmente, o presente estudo confirmou a sua presença em maior
densidade no íleo do que no jejuno, como já previamente demonstrado 65,68. E, mais
importante, não ocorreu mudança deste parâmetro no período do experimento em
nenhum dos segmentos intestinais avaliados. Especificamente o segmento
interposto, mesmo tendo apresentado alterações estruturais importantes, não
apresentou modificação na quantidade de células L nos distintos períodos da
pesquisa, ou seja, permaneceu com características enteroendócrinas ileais apesar
da “jejunização” da mucosa.
Estudo anterior com ratos Long-Evans evidenciou aumento no número das
células L no segmento ileal interposto seis semanas após o procedimento cirúrgico.
Diferentemente deste trabalho, naquele estudo foi utilizada dieta hipercalórica e
hiperlipídica desde seis semanas antes até seis semanas depois dos procedimentos
cirúrgicos, com o aumento dos níveis de gordura corporal dos animais e nos níveis
de leptina. Os autores não publicaram dados de pré-operatório em relação ao
54
metabolismo glicídico, de forma que não está evidente se houve ou não o
desenvolvimento de distúrbios no mesmo, o que poderia justificar a diferente
resposta histológica. Além disso, a análise das células L foi realizada mais
precocemente (duas semanas antes) que no nosso estudo161.
Este estudo trouxe conhecimentos novos na medida em que foi realizada a
interposição ileal isolada em animais de experimentação, não doentes (não obesos e
não diabéticos) e com um tempo de acompanhamento razoável (8 semanas)154.
Permitiu-nos observar tratar-se de procedimento seguro, no sentido de não provocar
diminuição no consumo alimentar nem no peso dos animais, não produzir
hipoglicemia e não haver modificação na sensibilidade à insulina com os testes
realizados. O mesmo pode ter modificado a evolução natural em alguns aspectos do
metabolismo dos animais, na medida em que foi observado elevação dos níveis de
glicemia e de triglicérides no GS ao final do experimento e não no GI, bem como
diminuição dos níveis de colesterol total e aumento do HDL-colesterol no GI e não
no GS. No entanto, a principal contribuição deste estudo foi no tocante à avaliação
histológica realizada, demonstrando-se que, apesar das modificações estruturais
ocorridas na mucosa do segmento de íleo interposto, este manteve as células L sem
diminuição da sua quantidade.
Assim, este pode representar um potencial procedimento cirúrgico para o
tratamento
de
determinadas
doenças
metabólicas,
principalmente
casos
selecionados de diabetes tipo 2 sem boa resposta ao tratamento convencional com
dieta e medicamentos. No entanto, estudos clínicos controlados devem ser
realizados no intuito de verificar e avaliar melhor os seus efeitos em seres humanos,
e o presente estudo serve de subsídio para estudos subsequentes nessa linha de
pesquisa.
Perspectivas futuras
O tema em questão é atual e relevante, no sentido de estar relacionado a
condições mórbidas com grande prevalência mundial e com elevados custos
envolvidos no tratamento das mesmas.
O presente estudo está inserido numa linha de pesquisa de cirurgia bariátrica
e metabólica, da qual é o marco inicial na pesquisa experimental com a interposição
ileal isolada. Consideramos de fundamental importância estudos subsequentes, que
55
analisem os efeitos deste procedimento em animais obesos e/ou diabéticos e
estudos clínicos para avaliar os efeitos deste procedimento no tratamento do
diabetes mellitus em indivíduos não obesos.
56
5
CONCLUSÕES
1. A interposição ileal isolada não promove diminuição no consumo alimentar
nem no peso, em ratos normais;
2. A interposição ileal isolada não modifica os níveis glicêmicos nem a
sensibilidade insulínica, em ratos normais;
3. A interposição ileal isolada promove diminuição dos níveis de colesterol
total e aumento nos níveis de HDL-colesterol, em ratos normais;
4. A interposição ileal isolada promove uma “jejunização” no segmento ileal
interposto, com aumento na altura das vilosidades e na relação
vilosidade/cripta;
5. A interposição ileal isolada não modifica a densidade de células L nos
diversos segmentos intestinais; e
6. Após a interposição ileal isolada, o segmento de íleo interposto mantém as
células L em quantidade semelhante ao íleo em sua posição normal.
57
6
ANEXOS
ANEXO 1 – FORMALINA TAMPONADA
A formalina tamponada apresenta um percentual de formaldeído variável
entre 3,7 e 4% com pH estável em 7,4.
Fórmula para preparo de 1 litro de formol tamponado:
1. Diluir 6,5g de fosfato de sódio dibásico anidro em 450 mL de água filtrada;
2. Diluir 4g de fosfato de sódio monobásico monohidratado em 450 mL de
água filtrada;
3. Juntar as duas soluções;
4. Acrescentar 100 mL de formol comercial a 37% ou 40%.
58
ANEXO 2 – PROTOCOLO DE COLORAÇÃO COM HEMATOXILINA-EOSINA
a) Três lavagens com xilol de cinco minutos cada;
b) Quatro lavagens com álcool 100%;
c) Água para hidratação;
d) Hematoxilina por cinco minutos. Diferenciar com 0,5 mL de HCl para 100
mL de água;
e) Lavagem das lâminas em água;
f) Lavagem das lâminas em água amoniacal;
g) Lavagem das lâminas em água;
h) Eosina por três minutos;
i) Quatro passagens em álcool; e
j) Quatro passagens em xilol.
59
ANEXO 3 – PROTOCOLO DE SILANIZAÇÃO DE LÂMINAS
Lâmina Silanizada: (3–Aminopropyl) triethoxy-silane, minimum 98% (Sigma
A3648).
Protocolo de silanização das lâminas:
As lâminas são colocadas em carrinhos de metal (usa-se luvas).
Em cubas de vidro com capacidade para aproximadamente 500ml são
colocados os seguintes reagentes:
1. Álcool absoluto: submersão do carrinho com as lâminas por três minutos;
2. Álcool absoluto: submersão do carrinho com as lâminas por três minutos;
3. Silano 4% em acetona: submersão do carrinho com as lâminas por três
minutos;
4. Álcool absoluto: seis a dez banhos de imersão; e
5. Álcool absoluto: seis a dez banhos de imersão;
Ao passar o carrinho de uma cuba para outra, esgotar bem o excesso do
reagente, para não “contaminar” o reagente seguinte.
Retira-se o excesso de acetona em papel toalha e seca-se as lâminas em
estufa, a 80ºC, por trinta minutos. As lâminas são guardadas em caixas, ficando
protegidas de poeira.
60
ANEXO 4 – PROTOCOLO DE COLORAÇÃO COM IMUNOHISTOQUÍMICA
a) Desparafinação: as lâminas foram deixadas em estufa a 60ºC, por 12
horas, para melhor adesão do tecido e, em seguida, desparafinadas com 3
banhos em xilol, por 5 minutos cada, em temperatura ambiente;
b) Hidratação: as lâminas foram submersas duas vezes em etanol absoluto,
por 5 minutos, e lavadas com água corrente, por 2 minutos, para
hidratação dos cortes;
c) Recuperação antigênica: as lâminas foram colocadas em solução de
citrato de sódio 10 mM pH 6,0, por 3 minutos, em panela de vapor (95ºC),
deixando-se depois esfriar, à temperatura ambiente, por 20 minutos, e
lavadas em PBS (Tampão Salina Fosfato) 0,05M, pH 7,4; três vezes, por 3
minutos cada;
d) Bloqueio da peroxidase endógena: as lâminas foram incubadas com
peróxido de hidrogênio 3%, quatro vezes, por 5 minutos cada, e, em
seguida, lavadas com água corrente e tampão PBS pH 7,4; três vezes, por
3 minutos cada;
e) Bloqueio de sítios inespecíficos: as lâminas foram incubadas em PBS pH
7,4 + BSA (Soro Albumina Bovina) 1%, por 30 minutos, em temperatura
ambiente;
f) Ligação com anticorpo primário: os cortes histológicos de cada lâmina
foram incubados com o anticorpo primário (anticorpo policlonal Rabbit antiGLP-1 (7-37) – IgG - Código T4362 – Lote 023583 - Peninsula
Laboratories, Bachem Group) (San Carlos, California, EUA), diluídos em
BSA 1% em titulação 1:1000, em câmara úmida a 4ºC, por 16 a 18 horas
e, posteriormente, lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes;
g) Ligação do anticorpo secundário biotinilado: os cortes foram incubados
com o anticorpo secundário conjugado com biotina do kit Dako LSAB, por
30 minutos, à temperatura ambiente, em câmara úmida e, após a
incubação, as lâminas foram lavadas em PBS pH 7,4, por 3 vezes, e
novamente incubadas com o Kit de amplificação estreptavidina Biotina
conjugada com peroxidase (Dako – K0690), por 30 minutos, e, em
seguida, foram lavadas com tampão PBS pH 7,4 por três vezes;
61
h) Revelação: os cortes foram cobertos com solução de cromógeno
3,3’diaminobenzidina (DAB) líquido (Dako – K3468);
i) Contracoloração: os cortes foram lavados em água corrente, por 5
minutos, e, em seguida, contracorados com hematoxilina de Harris, por 3
minutos; e
j) Desidratação e montagem: as lâminas foram lavadas em água corrente,
por 10 minutos, submersas em etanol absoluto, quatro vezes, e, a seguir,
em xilol, por 3 vezes, e levadas para montagem com lamínula e em meio
de montagem Enttelan® (Merck) e identificadas.
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ABSTRACT
Purposes: To evaluate the effects of isolated ileal interposition in experimental
animals (non-obese and non-diabetic), analysing modifications in metabolism and in
the intestinal morphology. Methods: Experimental study in 12-week-old normal rats
(Wistar-EPM1), distributed into two groups, Interposition Group (GI) composed of 11
animals submitted to isolated ileal interposition, and Sham Group (GS) composed of
14 animals submitted to sham operation. Metabolic (body weight, food intake and
biochemical) and histological (general and enteroendocrine) parameters were
analyzed before the surgery and eight weeks after it. Results: There was no
difference between groups in relation to the following parameters: weight, food
intake, blood glucose, insulin, insulin tolerance test (ITT), total cholesterol, HDLcholesterol and triglycerides levels. Nevertheless, when analyzing each group
separately, it was observed an increase of blood glucose (p = 0,032) and
triglycerides (p = 0,009) levels only in the GS at the end of the experiment. It was
also possible to observe a decreased in total cholesterol (p = 0,004) and increased
insulin levels (p = 0,016) and HDL-cholesterol (p <0,001) levels only in the GI. The
interposed ileal segment of the GI showed an increased in villi size (p = 0,002) and in
increased villous/crypt ratio (p = 0,021), acquiring similar characteristics of the
jejunum. However, the enteroendocrine L cell quantity remained the same. Other
intestinal
segments
did
not
show
structural
differences
between
groups.
Conclusions: Isolated ileal interposition does not cause weight loss, food intake
decrease, hypoglycemia, or modifications in insulin sensitivity in euglycemic rats.
This surgery can favorably change some aspects of glycidic and lipid metabolism.
The interposed ileal segment keeps the amount of L enteroendocrine cells after ileal
interposition alone, despite the mucosal "jejunization". Consequently, isolated ileal
interposition must be considered a potential surgical procedure for the treatment of
selected cases of type 2 diabetes.
APÊNDICES
APÊNDICE 1 - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA
UNIFESP
APÊNDICE 2 – EMENDA AO PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA DA UNIFESP
APÊNDICE 3 – FICHA DE COLETA DE DADOS
ANIMAL Nº __________
NASCIMENTO _____/ ______/______
PESO ____________________________________________________
DATA DAS COLETAS _____ / _____/_____ E ______/ _____/_______
ANESTESIA/DOSES________________________________________
SANGUE PARA EXAME LABORATORIAL 1/ CÓDIGO____________________
DADOS DO TTI: DOSE DE INSULINA____________________
DATAS
TEMPO
GLICEMIA
GLICEMIA
0
4’
8’
12
16’
20’
DATA DA OPERAÇÃO______/ _______/ _________
OPERAÇÃO REALIZADA____________________________________________
COMPRIMENTO DO INTESTINO______________________________________
TEMPO OPERATÓRIO______________________________________________
MATERIAIS COLETADOS PARA EXAME HISTOLÓGICO:
_____________________________CÓDIGO____________
_____________________________CÓDIGO____________
DATA DA EUTANÁSIA________/_______/________
SANGUE PARA EXAME LABORATORIAL 2 / CÓDIGO____________________
MATERIAIS COLETADOS PARA EXAME HISTOLÓGICO:
_____________________________CÓDIGO____________
_____________________________CÓDIGO____________
_____________________________CÓDIGO____________
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Saúde. Biblioteca Virtual em Saúde. DeCS – Descritores em Ciências da Saúde
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2012
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São
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BIREME.
Disponível
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http://decs.bvs.br/cgi-bin/wxis1660.exe/decsserver/
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Paulo, 2005.

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