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Análise de carboidratos
•24/01/2016 Bromatologia II Paulo Figueiredo [email protected] Programa 1. Análise de carboidratos: extracção e separação; métodos de identificação. Determinação quantitativa: métodos físicos, químicos e biológicos. determinação de fibra. 2. Análise de lípidos: extracção e determinação quantitativa; identificação e quantificação de ácidos gordos. 3. Análise de proteínas: determinação de proteína total e azoto não proteico. Separação e identificação de proteínas e aminoácidos. 4. Análise da humidade: métodos físicos e químicos. Obtenção e determinação de cinzas. 6. Análise de minerais: identificação e determinção quantitativa. 7. Análise de vitaminas: identificação e determinação quantitativa de vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis. •1 •24/01/2016 Bibliografia 1. J. Adrian, J. Potus, A. Poiffait, P. Dauvillier, Análisis nutricional de alimentos, 2000, Acribia 2. R. Matissek, F. M. Schnepel, G. Steiner, Análisis de los alimentos. Fundamentos, métodos, aplicaciones, 1998, Acribia 3. H.-D. Belitz, W. Grosch, P. Schieberle, Food Chemistry, 2004, SpringerVerlag 4. O. R. Fennema, Food Chemistry, 1996, CRC 5. S. S. Nielsen, Food analysis, 2003, Springer 6. R. Owusu-Apenten, Introduction to food chemistry, 2004, CRC 7. A. Gomes de Castro, A química e a reologia no processamento dos alimentos, 2003, Instituto Piaget Web 1. http://www.pfigueiredo.org/uatla.html •2 •24/01/2016 Avaliação A. Exame – 100 % B. 5 trabalhos escritos individuais (máx. 10 pp) + Avaliação oral C. Avaliação contínua: 1. 2 Frequências – 25 % + 25 % 2. Discussão de artigos – 15 % 3. Participação + Assiduidade – 35 % Análise de carboidratos 6 Componentes mais abundantes dos alimentos funções: nutrientes adoçantes matéria-prima para produtos fermentados propriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetal responsáveis por reacções de escurecimento •3 •24/01/2016 Análise de carboidratos 7 podem ocorrer isolados, ou física ou quimicamente associados a outras moléculas glicoproteínas glicolípidos fibras dietéticas carboidratos não digeríveis lenhina Análise de carboidratos 8 razões para determinação de tipo e concentração de carboidratos nos alimentos: padronização alimentos devem ter composições que respeitem a legislação rotulagem nutricional informação ao consumidor sobre teor nutricional detecção de adulterações cada alimento tem a sua “impressão digital” de carboidratos qualidade alimentar propriedades físico-químicas dos alimentos dependem do tipo e concentração de carboidratos presentes doçura, aparência, estabilidade, textura económicas evitar desperdício de ingredientes dispendiosos processamento eficácia de diversas operações depende do tipo e concentração dos carboidratos presentes •4 •24/01/2016 Análise de hidratos de carbono 9 Amostragem moídas causar mínima alteração no teor de humidade lípidos e clorofila removidos por extracção com éter de petróleo carboidratos insolúveis outros interferentes removidos por: descoloração resinas de permuta iónica precipitação por agentes clarificantes Análise de carboidratos 10 Amostragem agentes clarificantes: solução básica de acetato de chumbo descolora a solução usado em polarimetria de soluções coloridas ácidos fosfotungístico e tricloroacético precipitam proteínas ferricianeto de potássio e sulfato de zinco precipitam proteínas descoloram parcialmente a solução sulfato de cobre específico para determinação da lactose em leite •5 •24/01/2016 Análise de carboidratos 11 Amostragem requisitos dos agentes clarificantes: remover completamente interferentes sem adsorver ou modificar açúcares excesso de clarificante não deve afectar procedimento precipitado deve ser pequeno procedimento relativamente simples Análise de carboidratos 12 Amostragem remoção de etanol evaporação sob vácuo •6 •24/01/2016 Análise de carboidratos 13 Análise de carboidratos 14 Amostragem Métodos qualitativos reacções colorimétricas condensação de produtos de degradação de açúcares em ácidos fortes com compostos orgânicos antrona e fenol são dos mais utilizados antrona reage especificamente com carboidratos em solução concentrada de H2SO4 cor verde azulada reacção com os produtos de degradação hidroximetilfurfural ou furfural •7 •24/01/2016 Análise de carboidratos 15 Métodos qualitativos reacções colorimétricas reacção de fenol com H2SO4 método simples, rápido, sensível, exacto e específico permite determinar quase todos os tipos de carboidratos cor produzida é estável resultados reprodutíveis poucos problemas com interferentes Análise de carboidratos 16 Métodos qualitativos propriedades redutoras do grupo carbonilo não específicas requerem remoção de outros agentes redutores solução de Fehling é reagente mais conhecido redução de cobre •8 •24/01/2016 Análise de carboidratos 17 Métodos quantitativos Munson-Walker método gravimétrico redução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos 2 reagentes de Fehling A – sulfato de cobre B – tartarato de sódio e potássio/NaOH reacção com carboidratos redutores forma precipitado de óxido de cobre pp filtrado num cadinho de fundo poroso pp lavado com água quente pp seco e pesado Análise de carboidratos 18 Métodos quantitativos Munson-Walker redução não é estequiométrica calibração com soluções padrão de cada carboidrato tabelas relacionam peso do pp com a quantidade de carboidrato, para cada carboidrato •9 •24/01/2016 Análise de carboidratos 19 Métodos quantitativos Lane-Eynon método titrimétrico redução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos adição da solução de carboidrato a mistura (1:1) em ebulição das soluções de Fehling azul de metileno usado como indicador mudança de cor no ponto de viragem método não é estequiométrico utilização de tabelas e padrões Análise de carboidratos 20 Métodos quantitativos Somogyi método microtitrimétrico redução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos usado para determinar pequenas quantidades de carboidratos reagente de cobre contém: tampão fosfato iodeto de potássio iodo vai oxidar ião cuproso sulfato de sódio minimiza oxidação do óxido cuproso por O2 do ar •10 •24/01/2016 Análise de carboidratos 21 Métodos quantitativos Somogyi reagente adicionado em excesso, mas em quantidade conhecida carboidrato redutor reduz Cu a óxido cuproso Cu2O oxidado pelo iodo excesso de iodo titulado com tiossulfato de sódio reacção não estequiométrica requer padronização Análise de carboidratos 22 Métodos quantitativos Métodos cromatográficos carboidratos separados e determinados individualmente separação baseada em: coeficiente de partição polaridade tamanho cromatografia em papel TLC cromatografia em coluna GC requer amostras voláteis em geral, necessário derivatizar HPLC actualmente mais rápido, específico, sensível e preciso HPLC e GC usados em conjunto com NMR e MS •11 •24/01/2016 Análise de carboidratos 23 Métodos quantitativos Métodos cromatográficos HPLC análise de monossacáridos e oligossacáridos também permite análise de polissacáridos, após hidrólise método rápido, com elevado grau de exactidão pode ser utilizado em ampla gama de concentrações não requer derivatização Análise de carboidratos Métodos quantitativos 24 Métodos cromatográficos HPLC fases estacionárias permuta aniónica permuta catiónica fase normal fase reversa •12 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos 25 Métodos cromatográficos HPLC fases estacionárias permuta aniónica carboidratos têm pKa entre 12-14 em solução básica, grupos OH podem ionizar separados em permuta aniónica sequência de eluição: açúcares álcoois (alditois)< monossacáridos < dissacáridos < outros oligossacáridos geralmente detectores electroquímicos 1. Glucose 2. Fructose 3. Maltose 4. Maltotriose 5. Maltotetraose 6. Maltopentaose 7. Maltohexaose 8. Maltoheptaose Análise de carboidratos Métodos quantitativos 26 Métodos cromatográficos HPLC fases estacionárias permuta catiónica separação por ordem decrescente de PM oligossacáridos (DP>3) < trissacáridos < dissacáridos < monossacáridos < alditois muito eficazes para resolver monossacáridos 1. 2. 3. 4. 5. Sucrose Glucose Fructose Mannitol Sorbitol •13 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos 27 Métodos cromatográficos HPLC fases estacionárias fase normal fase estacionária polar sílica gel com grupos amino fase móvel de polaridade crescente acetonitrilo (50-85 %)/água monossacáridos e alditois < dissacáridos < outros oligossacáridos açúcares redutores reagem com grupos amino deterioração da coluna Análise de carboidratos Métodos quantitativos 28 Métodos cromatográficos HPLC fases estacionárias fase reversa fase estacionária hidrofóbica sílica gel com cadeias alquilo ou fenilo fase móvel polar habitualmente água monossacáridos têm tempos de retenção muito curtos tendem a eluir num único pico não resolvido adição de sais pode aumentar Rt presença de anómeros duplicação e/ou alargamento dos picos adição de uma amina à fase móvel acelera anomerização e reduz problema •14 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos 29 Métodos cromatográficos HPLC fases estacionárias fase reversa 1. Fructose 2. Glucose 3. Maltose 4. Maltotriose 5. Maltotetraose 6. Maltopentaose 7. Maltohexaose 8. Maltoheptaose 9. Maltooctaose Análise de carboidratos Métodos quantitativos 30 Métodos cromatográficos HPLC detectores índice de refracção electroquímicos derivatização pós-coluna derivatização pré-coluna •15 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos 31 Métodos cromatográficos HPLC detectores índice de refracção aplicável a todos os carboidratos medidas lineares numa larga gama de concentrações principais limitações: não permite utilização de gradientes de eluição detecção mede massas, não concentrações Análise de carboidratos Métodos quantitativos 32 Métodos cromatográficos HPLC detectores electroquímicos detector de amperometria pulsada (PAD) usado habitualmente com cromatografia de permuta aniónica permite utilização de gradientes requer utilização a pH elevado •16 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos 33 Métodos cromatográficos HPLC detectores derivatização pós-coluna aumento da sensibilidade de detecção por adição de um grupo substituinte concentração medida por UV/Vis ou fluorescência maior sensibilidade que detectores de índice de refracção Análise de carboidratos Métodos quantitativos 34 Métodos cromatográficos HPLC detectores derivatização pré-coluna reacções têm que ser estequiométricas derivatização de oligossacáridos com grupos aromáticos aumento de resolução com HPLC em fase normal •17 •24/01/2016 Análise de carboidratos 35 Métodos quantitativos Métodos cromatográficos GC análise quantitativa e qualitativa necessário converter os carboidratos em compostos voláteis, por derivatização peracetatos de alditol peracetatos do ácido aldónico Análise de carboidratos Métodos quantitativos GC 36 Métodos cromatográficos principal problema: necessários 2 passos de preparação redução dos grupos aldeído a álcoois primários conversão do carboidrato reduzido num éster de peracetato volátil ou num éter pertrimetilsililado cada passo tem que ser estequiométrico •18 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos GC 37 Métodos cromatográficos aplicação a carboidratos neutros 1. redução a alditois carboidratos obtidos a partir do extracto com 80 % EtOH ou por hidrólise de polissacáridos redução com borohidreto de sódio dissolvido em hidróxido de amónio (T ambiente) adição de ácido acético, gota a gota até parar libertação de H2 destruição do borohidreto em excesso solução evaporada até secura adição de metanol e evaporação até eliminação de iões borato se frutose estiver presente reduzida a D-glucitol + D-manitol Análise de carboidratos Métodos quantitativos GC 38 Métodos cromatográficos aplicação a carboidratos neutros 2. acetilação de alditois adição de anidrido acético balão fechado e aquecido a 121 ºC arrefecido adição de água decomposição do anidrido acético em excesso evaporação até secura 3. GC dos peracetatos resíduo dissolvido em clorofórmio cromatografia isotérmica identificação através dos Rt relativamente a hexaacetato de inositol padrão interno •19 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos GC 39 Métodos cromatográficos aplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos necessário um método diferente 1. redução hidrolisado evaporado até secura resíduo dissolvido em sol. carbonato de sódio tratado com borohidreto de sódio em excesso adição de ácido acético decomposição do borohidreto em excesso adição de metanol e evaporação até eliminação de iões borato ácidos urónicos reduzidos a ácidos aldónicos e aldoses a alditois Análise de carboidratos Métodos quantitativos GC 40 Métodos cromatográficos aplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos 2. preparação dos derivados trimetilsililados e cromatografia ácidos aldónicos convertidos em éteres de per-TMS directamente injectados necessário utilizar gradiente de temperatura identificação através dos Rt •20 •24/01/2016 Análise de carboidratos Métodos quantitativos GC 41 Métodos cromatográficos detector mais usado FID Análise de carboidratos 42 Métodos quantitativos Métodos cromatográficos TLC usado em análise de rotina análise rápida e simultânea de diversas amostras identificação e quantificação de carboidratos em melaços •21 •24/01/2016 Análise de carboidratos 43 Métodos quantitativos Espectrometria de massa pouco usada não rotineiro MALDI-TOF em análise de séries homólogas de oligossacáridos Análise de carboidratos 44 Métodos quantitativos Métodos electroforéticos carboidratos derivatizados por reacção com boratos tornam-se electricamente carregados carboidratos aplicados num gel ao qual se aplica uma voltagem separação baseada no tamanho moléculas menores movem-se mais rapidamente no campo eléctrico •22 •24/01/2016 Análise de carboidratos 45 Métodos quantitativos Métodos ópticos refractometria índice de refracção da solução de carboidratos determinação de açúcares totais, como sólidos solúveis utilização em controlo de qualidade xaropes, geleias, sumos de fruta polarimetria polarímetro mede rotação óptica de uma solução pura de um carboidrato densimetria medida da gravidade específica de uma solução açucarada densidade é função da concentração de carboidrato a uma dada temperatura (20 ºC) resultados exactos para soluções puras resultados aproximados para alimentos açucarados (xaropes, ...) Análise de carboidratos 46 Métodos quantitativos Métodos enzimáticos rápidos, muito específicos e sensíveis para baixas concentrações sequência de reacções enzimáticas é método preferencial para determinação de amido requerem pouca preparação da amostra alimentos líquidos podem ser analisados directamente alimentos sólidos requerem prévia dissolução em água existem diversos kits comerciais para analisar carboidratos específicos métodos mais frequentemente usados para determinar concentrações: permitir que a reacção enzimática finalize e medir a concentração do produto proporcional à concentração do substrato inicial medição da velocidade inicial da reacção enzimática proporcional à concentração do substrato •23 •24/01/2016 Análise de carboidratos 47 Métodos quantitativos Métodos enzimáticos Análise de carboidratos 48 Métodos quantitativos Métodos enzimáticos preparação da amostra recomendada utilização do tratamento de Carrez adição de sol. de hexacianoferrato de potássio adição de sol. de sulfato de zinco adição de sol. de NaOH destrói emulsões precipita proteínas absorve algumas cores suspensão filtrada filtrado límpido usado directamente para ensaios •24 •24/01/2016 Análise de carboidratos 49 Métodos quantitativos Métodos enzimáticos ex: D-glucose/D-frutose 1) conversão de glucose em glucose-6-fosfato por hexacinase e ATP 2) G6P oxidada por NADP+, na presença de G6P-desidrogenase G6P + NADP+ ↓ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ NADPH formado proporcional à concentração de G6P na amostra medido por espectrofotometria a 340 nm concentração de frutose determinada por conversão da frutose em glucose (por via enzimática) e repetição do procedimento Análise de carboidratos 50 Métodos quantitativos Métodos enzimáticos ex: maltose/sacarose 1) maltose e sacarose hidrolisadas por a-glucosidase maltose ↓ 2 Glu; sacarose ↓ Glu + Fru 2) concentrações de glucose e frutose determinadas pelo método anterior problema: se existirem outros oligossacáridos, estes também são hidrolisados •25 •24/01/2016 Análise de carboidratos 51 Métodos quantitativos Métodos físicos polarimetria mede o ângulo de rotação da luz polarizada no plano, ao atravessar uma solução extensão da polarização proporcional à concentração das espécies opticamente activas a = [a]lc a – ângulo de rotação medido [a] – actividade óptica (constante para cada espécie) l – percurso óptico c - concentração Polarímetro: •fonte de luz monocromática •polarizador •porta-amostra •analisador (mede ângulo de rotação) Análise de carboidratos 52 Métodos quantitativos Métodos físicos ângulo de rotação depende da temperatura e comprimento de onda usam-se condições padrão da risca D do sódio T = 20 ºC; l = 589.3 nm prepara-se uma curva de calibração a vs. c ou [a] tirado da bibliografia concentração do carboidrato determinada por medição do seu ângulo de rotação e comparando com valores da curva de calibração •26 •24/01/2016 Análise de carboidratos 53 Métodos quantitativos Métodos físicos refractometria determinação do índice de refracção (n) n c cm c – velocidade da luz no vácuo cm – velocidade da luz no material medição do ângulo de refracção (r) e do ângulo de incidência (i) numa zona fronteira entre o material da amostra e um padrão para carboidratos, o material de referência é quartzo Análise de carboidratos 54 Métodos quantitativos Métodos físicos índice de refracção de carboidratos aumenta proporcionalmente à concentração índice de refracção depende de temperatura e comprimento de onda medidas feitas a 20 ºC e 589.3 nm método rápido e simples uso rotineiro na indústria análise de xaropes, mel, melaços, compotas, … •27 •24/01/2016 Análise de carboidratos 55 Métodos quantitativos Métodos físicos infra-vermelho restantes componentes principais dos alimentos não absorvem radiação IV no mesmo comprimento de onda possibilidade de determinar concentrações processo rápido e não destrutivo densidade densidade de soluções aquosas aumenta com aumento da concentração de carboidratos densidade medida por densímetros ou garrafas de densidade uso de rotina na indústria determinação em sumos e outras bebidas Análise de carboidratos 56 Métodos quantitativos Ensaios imunológicos específicos para carboidratos de baixo peso molecular carboidrato de interesse ligado a uma proteína injectado num animal animal desenvolve anticorpos específicos para o carboidrato anticorpos podem ser extraídos usados como parte de kits para determinação da concentração do carboidrato em alimentos •28 •24/01/2016 Análise de carboidratos 57 Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores Reagentes amostra 500 mL solução A: sulfato cúprico + H2SO4 500 mL solução B: tartarato de sódio e potássio + NaOH solução de ferrocianeto de potássio 0.025 M solução de acetato de zinco 1.0 M, com ác. acético 20 mL/L solução de azul de metileno 1 % HCl conc. papel indicador de vermelho Congo NaOH 40 % HCl 1 N NaOH 0.1 N Análise de carboidratos 58 Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores Preparação da amostra pesar ou pipetar quantidade suficiente para obter 250 mL de sol. com ~1 % de carboidratos juntar 50 mL H2O agitar neutralizar até pH 7.00 com NaOH 0.1 N passar sol. para balão volumétrico de 250 mL clarificar volumes iguais de K4Fe(CN)6 e Zn2(CH3COO)2 agitar completar volume do balão com H2O filtrar sobre papel de filtro seco obtém-se sol. a •29 •24/01/2016 Análise de carboidratos 59 Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores Inversão da sacarose para determinação de carboidratos totais pipetar 50 mL da sol. a para balão volumétrico de 100 mL adicionar 5 mL HCl conc. aquecer em banho-maria a 68-70 ºC (5 min) arrefecer colocar papel indicador no balão neutralizar com NaOH 40 % até papel ficar roxo completar volume com H2O agitar obtém-se sol. b Análise de carboidratos 60 Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores Método de Lane-Eynon preparar licor de Fehling misturar partes iguais de sols. A e B agitar bem 1 mL = 5.00 mg glucose colocar sol. a numa bureta de 50 mL pipetar 10 mL do licor de Fehling para erlenmeyer de 125 mL juntar igual volume de H2O aquecer em bico de Bunsen até fervura juntar 5 mL da sol. a deixar ferver adicionar 3-4 gotas de azul de metileno 1 % reiniciar titulação adição de porções de 0.5 mL da sol. a perto do ponto final, cor da espuma sobrenadante começa a desaparecer pp vermelho tijolo (óxido cuproso) •30 •24/01/2016 Análise de carboidratos 61 Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores Método de Lane-Eynon continuar titulação gota a gota no ponto final, sobrenadante totalmente incolor repetir titulação com sol. a adicionar de uma vez o volume gasto na anterior, menos 1 mL ao recomeçar a ferver, juntar 3-4 gotas de azul de metileno continuar titulção gota a gota, até desparecer a cor repetir procedimento com sol. b Análise de polissacáridos e fibra 62 Fibra bruta materiais não digeríveis e insolúveis em ácidos e bases diluídas celulose, lenhina, pentosanas sem valor nutritivo acção peristáltica do intestino segundo as funções: polissacáridos estruturais celulose, hemicelulose, pectinas compostos estruturais não polissacáridos lenhina polissacáridos não estruturais gomas, mucilagens, carragenano, agar •31 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 63 importância da determinação da fibra bruta em alimentos e rações avaliação nutritiva de rações rações com muita fibra têm baixo valor nutritivo eficiência na moagem e refinação de farinhas verificação da maturação de fibras e vegetais produtos muito maduros têm maior quantidade de fibra adulterações cascas em nozes moídas, sementes em frutas processadas Análise de polissacáridos e fibra 64 1967 introdução do conceito de fibra dietética digestão clássica com ácido e base para obter fibra bruta conduz a incertezas e variabilidade relativamente ao valor nutritivo determinação inclui parte das proteínas e conduz a perca de parte da lenhina mais adequado separar lenhina, celulose e hemicelulose e minimizar o teor de azoto digestão enzimática fibra dietética – matérias vegetais insolúveis que não são digeríveis por enzimas proteolíticas e diastáticas e que não podem ser utilizadas, excepto por fermentação microbiana no sistema digestivo •32 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 65 fibra dietética conjunto de todos os componentes não digeríveis de um alimento todos os polissacáridos, excepto amilose e amilopectina fibra insolúvel celulose, celulose microcristalina, lenhina, hemiceluloses e amido resistente fibra solúvel restantes polissacáridos, pectina, gomas e hidrocolóides Análise de polissacáridos e fibra 66 consumo tem benefícios fisiológicos prevenção de: cancros doenças cardíacas diabetes •33 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 67 Análise de amido amostragem: em alimentos naturais encontra-se sob forma de grânulos necessário separá-lo dos outros componentes secagem, trituração, maceração, filtração, centrifugação em alimentos termicamente processados é uma mistura de amilose e amilopectina secos, triturados e dispersos em EtOH/H2O (80:20) monossacáridos e oligossacáridos solúveis amido insolúvel separado por filtração ou centrifugação se algum amido em grânulos estiver presente: amostra dispersa em água quente (> 65 ºC) com ácido perclórico ou cloreto de cálcio gelatinização do amido Análise de polissacáridos e fibra 68 Análise de amido métodos para determinação da concentração: enzimas adicionadas a uma solução de amido para o degradar a glucose glucose analisada pelos métodos anteriores concentração de amido calculada a partir da concentração de glucose adição de iodo leva à formação de um complexo insolúvel determinado por gravimetria secagem e pesagem do precipitado formado determinado por titulação quantidade de iodo necessária para precipitar o amido utilização de métodos físicos densidade, refractometria, polarimetria desde que não existam componentes interferentes na solução •34 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 69 Análise de amido concentrações de amilose e amilopectina determinadas pelos mesmos métodos usados para amido necessário primeiro separar a amilose da amilopectina agentes químicos que precipitem selectivamente um dos dois determinação da concentração do amido resistente necessário adicionar DMSO dissolve o amido antes de prosseguir com a análise Análise de polissacáridos e fibra 70 Análise de amido •35 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 71 Análise de amido ex: amostra finamente triturada adicionado EtOH 80 % adição de DMSO agitar e aquecer em banho-maria adicionar sol. tamponizada de a-amilase agitar em vortex recolocar no banho após 5 min, levar a 50 ºC adicionar sol. de glucoamilase e tampão de acetato de sódio (pH 4.5) misturar e incubar a 50 ºC transferir para balão volumétrico e perfazer volume com H2O tirar aliquotas tratar com reagente glucose oxidase/peroxidase e incubar a 50 ºC medir absorvância Análise de polissacáridos e fibra 72 Análise de gomas e hidrocolóides polissacáridos adicionados aos alimentos + gelatina produtos cárneos processados chocolates e derivados gelados molhos para saladas análise difícil: estruturas químicas diversas diferentes solubilidades diversos pesos moleculares procedimento geral: extracção da goma e fraccionamento do extracto identificação e quantificação dos monossacáridos após hidrólise ácida fraccionamento provoca alguma perca de material •36 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 73 Análise de gomas e hidrocolóides Análise de polissacáridos e fibra 74 Análise de gomas e hidrocolóides amostra seca e pulverizada preferível por liofilização remoção de substâncias lipídicas extracção em Soxhlet clorofórmio/metanol (95:5) solvente removido por secagem ao ar, seguido de exsicador •37 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 75 Análise de gomas e hidrocolóides adição de EtOH 80 % remoção de carboidratos solúveis, outros compostos de baixo PM e cinzas remoção de proteínas (para facilitar digestão) extracto disperso em tampão de acetato de sódio (pH 6.5), com NaCl mistura aquecida adição de papaína mistura incubada arrefecimento da mistura e adição de NaCl adição de 4 volumes EtOH polissacáridos precipitam mistura centrifugada Análise de polissacáridos e fibra 76 Análise de gomas e hidrocolóides resíduo suspenso em tampão acetato (pH 4.5) adicionar sol. de glucoamilase/amiloglucosidase, no mesmo tampão incubar remoção de amido e fibra insolúvel por centrifugação arrefecer e adicionar NaCl adicionar 4 volumes EtOH precipita polissacáridos solúveis mistura centrifugada resíduo insolúvel é a fibra dietética solúvel resíduo suspenso em água desionizada diálise contra azida de sódio anti-microbiana diálise contra água desionizada remoção da azida resíduo liofilizado •38 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 77 Análise de gomas e hidrocolóides resíduo colocado em frasco fechado adicão de ácido trifluoroacético solução aquecida arrefecer e evaporar até secura corrente de ar ou N2 determinação de monossacáridos HPLC ou GC Análise de polissacáridos e fibra 78 Análise de pectina não é uma substância única diversos graus de esterificação e amidação principal componente comum: éster metílico do ácido a-D-galacturónico não existem métodos oficiais para determinação estratégia mais comum: precipitação com álcool •39 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 79 Análise de pectina difícil hidrolisar ligações glicosídicas em ácidos urónicos provoca decomposição não é possível usar hidrólise ácida seguida de cromatografia saponificação em NaOH acidificação adição de Ca2+ precipitação da pectina pectato de cálcio lavado, seco e medido por gravimetria Análise de polissacáridos e fibra 80 Análise de pectina grau de esterificação parâmetro importante em produtos naturais ou em que se adiciona pectina directamente medido por titulação antes ou depois da saponificação pectina isolada lavada com EtOH acidificado grupos carboxilato convertidos em grupos ácido carboxílico livres ácido em excesso eliminado dispersão do ácido pectínico em água titulada com base diluída (NaOH), em excesso saponificação dos grupos metiléster titulação com ácido determinação de base não saponificada grau de esterificação •40 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 81 Análise de pectina grau de esterificação também pode ser medido por GC medição do MeOH libertado pela saponificação medição por NMR Análise de polissacáridos e fibra 82 Análise de fibras procedimentos habituais: remoção de lípidos amostra seca, finamente triturada lípidos removidos por extracção com solvente remoção de proteínas hidrolisadas e solubilizadas enzimas, ácidos fortes, bases fortes aminoácidos separados da fibra por filtração ou precipitação selectiva com soluções de EtOH remoção de amido amido gelatinizado em água quente amido hidrolisado e solubilizado enzimas, ácidos fortes, bases fortes glucose separada por filtração ou precipitação selectiva com soluções de EtOH •41 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 83 Análise de fibras precipitação selectiva de fibras fibras separadas por precipitação selectiva com soluções de EtOH análise de fibras teor em fibra determinado por gravimetria pesar uma fracção de fibra insolúvel, isolada da amostra teor em fibra determinado quimicamente fibra hidrolisada a monossacáridos concentração medida pelos métodos descritos Análise de polissacáridos e fibra 84 Análise de fibras •42 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 85 Análise de fibras métodos gravimétricos carboidratos digeríveis, lípidos e proteínas solubilizados selectivamente por reagentes químicos ou hidrolisados enzimaticamente matéria não solúvel ou não digerida filtrada resíduo de fibra calculado por gravimetria métodos químicos carboidratos digeríveis removidos por via enzimática componentes da fibra hidrolisados por ácido monossacáridos obtidos medidos (valor da fibra) Análise de polissacáridos e fibra 86 Análise de fibras em ambos os métodos é necessário remover completamente o amido digerível provoca sobreestimação do valor da fibra •43 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 87 Análise de fibras preparação da amostra amostras com > 10 % lípidos remoção de lípidos por extracção com éter de petróleo ou hexano centrifugação para remover solvente extracção repetida 2 vezes amostra seca a 70 ºC estufa de vácuo, durante a noite amostra triturada passar num filtro com malha de 0.3-0.5 mm regista-se a perca de peso para corrigir no cálculo de fibra dietética devida a perca de gordura e humidade Análise de polissacáridos e fibra 88 Análise de fibras preparação da amostra amostras não sólidas com < 10 % fibra liofilizadas antes da análise amostras não sólidas com > 10 % fibra liofilização não necessária •44 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 89 Análise de fibras métodos gravimétricos método da fibra bruta simples; não adequado para análise de alimentos determina celulose e lenhina mas não hemiceluloses, pectinas e hidrocoloides digeridos pelo ácido e pela base tende a cair em desuso valor aproximado da fibra não digerível nos alimentos extracção sequencial de uma amostra (após remoção de lípidos) com 1.25 % H2SO4 e 1.25 % NaOH resíduo insolúvel recolhido por filtração seco, pesado e incinerado (correcção para contaminação com minerais) Análise de polissacáridos e fibra 90 Análise de fibras •45 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 91 Análise de fibras métodos gravimétricos método da fibra total sancionado pela AOAC utilizado pela indústria para vários alimentos isolamento da fracção de interesse por precipitação selectiva determinação da sua massa por pesagem alimento sofre eliminação de gorduras, secagem e gelatinização digestão enzimática do amido e proteínas a-amilase, amiloglucosidase, protease adição de 95 % EtOH precipitação de toda a fibra solução filtrada fibra recolhida, seca e pesada Análise de polissacáridos e fibra Análise de fibras 92 método da fibra total amostra misturada com tampão adição de a-amilase ajuste de pH mistura aquecida em banho-maria gelatinização e digestão do amido arrefecimento e adição de protease digestão da proteína ajuste do pH e adição de glucoamilase total digestão do amido passos subsequentes dependem de se querer determinar fibra total, insolúvel ou solúvel •46 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra Análise de fibras 93 método da fibra total determinação de fibra insolúvel e solúvel mistura filtrada sob Celite fibra insolúvel retida no filtro lavada com água o filtrado contém fibra solúvel adição de EtOH e lavagem com água pp fibra solúvel filtrada sob vácuo, com Celite resíduo lavado 3 vezes com EtOH Análise de polissacáridos e fibra Análise de fibras 94 método da fibra total resíduos de fibra (total, insolúvel ou solúvel) nos filtros lavados com EtOH 95 % e acetona filtros secos na estufa, arrefecidos e pesados alguma proteína e minerais complexam com constituintes da parede celular necessidade de corrigir se se pretende determinar amido resistente análise de triplicado de amostra se não se pretende determinar amido resistente amostras em duplicado uma amostra para determinar teor em azoto Kjeldahl outra incinerada para determinar teor em cinzas •47 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra Análise de fibras 95 método da fibra total fibra dietética expressa em percentagem de peso seco fibra dietética total = fibra insolúvel + fibra solúvel Branco (mg) = R1 +R 2 -P-A 2 R 1 +R 2 -P-A-B 2 Fibra (%) = x100 m1 +m2 2 Análise de polissacáridos e fibra 96 Análise de fibras métodos gravimétricos método da fibra total processo alternativo: componentes da fibra solúveis em água e insolúveis determinados após filtração da amostra digerida fibra solúvel fica no filtrado fibra insolúvel no retentado componente insolúvel seco e pesado componente solúvel precipitado por adição de EtOH 95 % filtrado, seco e pesado determina-se proteína e cinzas das diversas fracções para corrigir o resultado fibra = peso residual – peso (proteína + cinza) tendência para sobrestimar o teor de fibra em alimentos com teores elevados de monossacáridos monossacáridos “presos” no pp •48 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 97 Análise de fibras métodos químicos teor de fibra considerado igual à soma dos monossacáridos mais a lenhina restante (após remoção dos carboidratos) monossacáridos determinados segundo métodos descritos Análise de polissacáridos e fibra 98 Análise de fibras métodos químicos método Englyst-Cummings elimina-se a gordura da amostra amostra aquecida em água gelatinização do amido amido e proteínas digeridos por enzimas fibra precipitada com EtOH 100 % pp separado por centrifugação, lavado e seco fibra hidrolisada por H2SO4 conc. concentração dos monossacáridos obtidos determinada por colorimetria, cromatografia, ... massa da fibra na amostra considerada igual à massa de monossacáridos •49 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 99 Análise de fibras métodos químicos método Englyst-Cummings teores de fibra solúvel e insolúvel passos de separação semelhantes aos dos métodos gravimétricos não dá informação sobre teor de lenhina digestão ácida não conduz à sua degradação alimentos que contêm elevados teores de lenhina (raros) analisados por outro método Análise de polissacáridos e fibra 100 Análise de fibras métodos químicos método Englyst-Cummings •50 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 101 Análise de fibras métodos químicos método Englyst-Cummings mais rápido menos requisitos técnicos equipamento menos especializado mais reprodutível que método da AOAC Análise de polissacáridos e fibra 102 Análise de fibras métodos detergentes fibra por detergente ácido Acid Detergent Fibre (ADF) muito utilizado em rações determinação de celulose + lenhina W teor de fibra % = 100 2 W1 W1 – peso da amostra (g) W2 – peso do resíduo (g) •51 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 103 Análise de fibras métodos detergentes fibra por detergente neutro Neutral Detergent Fibre (NDF) método oficial para determinação da fibra dietética em grãos de cereais determinação de celulose + hemicelulose + lenhina teor de fibra % = 100 (peso do cadinho + paredes celulares) - peso do cadinho peso da amostra paredes celulares ≡ resíduos de fibra Análise de polissacáridos e fibra 104 Ex: Determinação de fibra por detergente ácido Reagentes amostra (ração animal) sol. detergente ácido adicionar 20 g CTAB a um balão volumétrico de 1 L acertar volume com H2SO4 1 N Procedimento pesar 1 g da amostra moer finamente e secar colocar em frasco de refluxo com 100 mL do detergente ácido aquecer até ebulição (5-10 min) refluxar 60 min terminar refluxo agitar o frasco e filtrar em cadinho previamente incinerado e pesado adicionar água quente (90-100 ºC) até 2/3 do cadinho deixar repousar 15-30 s •52 •24/01/2016 Análise de polissacáridos e fibra 105 Ex: Determinação de fibra por detergente ácido secar sob vácuo repetir lavagem com água quente lavar 2 vezes com acetona até total desaparecimento da cor secar acetona sob vácuo secar cadinho com a fibra estufa com ventilação (3 h, 100 ºC) pesar •53
