AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae
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AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae
1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO Keidylania da Costa Santos AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae SOBRE A CONTRATILIDADE DE CÉRVICE OVINA PETROLINA - PE 2013 2 Keidylania da Costa Santos AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae SOBRE A CONTRATILIDADE DE CÉRVICE OVINA Trabalho apresentado a Universidade Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF, Campus Centro como requisito da obtenção do título de mestre. Orientador: Raimundo Campos Palheta Jr. PETROLINA - PE 2013 3 4 A minha família e Nina. Meu único verso, meu uni verso, meu universo. 5 AGRADECIMENTOS Agradeço a minha família. Foi por amor que vocês permaneceram ao meu lado e com amor eu agradeço a vocês e a Deus por tê-los em minha vida! A minha mãe, pelas palavras de apoio e o colo que me deu durante toda a minha vida. Você é o meu pilar e minha força. A meu pai, que sempre trabalhou muito para manter os estudos dos filhos. Muitas vezes abdicando de seus desejos a fim de satisfazer os nossos. Eu vejo o quanto vocês dois se esforçaram para nos dar uma vida longe das dificuldades que vocês tiveram. Muito obrigada. A meus irmãos, cunhado, sobrinha, avos, tios, primas. Saibam que vocês são extremamente importantes para mim. Amo muito vocês! Aos meus animais, a amizade que eu preciso para me fazer mais feliz e jamais poderia deixar de agradecer a estrelinha mais linda, brilhante, companheira que eu tive em minha vida: Nina. Amo muito e amarei sempre! A Altamir, meu príncipe, amigo e amor, por todo o apoio. À Leilianne, porque a amizade desperta o desejo de cuidar e proteger, a minha amiga e enfermeira. À Nayane, desde a infância e para sempre. À Vanessa, já passamos por muitos momentos e eu aprendi que a amizade simplesmente surge, minha parte divertida. À Valeria e Alane, porque a amizade nos ensina, nos apoia e ajuda, minha parte calma. À Jusciene, porque a amizade surge mesmo com todas as grandes semelhanças, até mesmo no temperamento, a parte que mais parece comigo. Ao Thiago, porque a amizade surge dos mais inimagináveis lugares. À Thayanne, Sabrina e Thais, minhas psicólogas. Sou abençoada por tê-los em minha vida. Ao Prof. Dr. Raimundo Campos Palheta Junior, pela oportunidade e apoio necessários para o meu amadurecimento científico. A professora Dr. Flaviane Monteiro por sua indispensável ajuda no início de toda essa jornada. Agradeço a cada educador que passou em minha vida. A educação é o único legado que verdadeiramente tem valor. Por isso valorizo cada um deles e agradeço imensamente a existência de cada um. Ao grupo LAFABI. Obrigada pelo convívio, carinho e apoio. Camilla, Noelly, Wagner, Anita, Vanessa, Viviane, Gilson, Suelen, Luciano, Rildo. A todos meu imenso carinho, agradecimento e infinito desejo que sejam imensamente felizes. A Capes pela concessão da bolsa e a toda equipe do Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido. 6 RESUMO Considerando as propriedades do extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae (EBEc) e a anatomia da cérvice ovina, cuja distribuição irregular dos anéis cervicais é um fator limitante para inseminação artificial, avaliou-se o efeito do extrato na contratilidade de cérvice ovina, bem como o possível mecanismo de ação. Para tanto, os segmentos circulares de cérvice foram conectados ao sistema isométrico de avaliação de contratilidade in vitro. Após o período basal, os segmentos foram submetidos à adição de EBEc (1-729 g.mL-1). Outros grupos de segmentos foram submetidos a contrações induzidas por KCl 90 mM ou CCh 30 µM seguidos da adição cumulativa de EBEc (1-729 g/mL-1). Outros segmentos foram pré-incubados com atosibana 10 µM, L-NAME 100 µM, L-NAME 100 µM + L-arginina 300 µM, TEA 0,3 mM, glibenclamida 1µM, ou verapamil 3µM seguidos da adição de EBEc. Além disto, um conjunto de animais foi submetido à infusão cervical com salina 0,15 M ou EBEc 2mg para análise da contração cervical in vivo após tais tratamentos. Os dados foram expressos (média ± E.P.M), e analisados após “t”Student ou ANOVA seguido do teste de Newman-Keuls, com p<0.05. O EBEc diminuiu a contratilidade cervical a partir da concentração 9 µg/mL (47,8 ± 6,5%) com efeito máximo de 85,4 ± 5,1% e EC50 17,9 ± 3,7 µg.mL-1. O EBEc também reduziu a contração induzida por K+ ou CCh na ordem de 17,7 ± 3,8% e 47,0 ± 8,9%, respectivamente. O L-NAME e o ODQ reduziram significativamente o efeito relaxante cervical induzido pelo EBEc (CE50 > 729). Já na presença de L-NAME + Larginina, o relaxamento induzido pelo EBEc foi parcialmente restaurado. Os bloqueadores de canais para potássio 4-AP, TEA e Glibenclamida não preveniram esta resposta desencadeada pelo EBEc. Na presença do verapamil, o EBEc reduziu a contração inicial induzida por ACh. Além disso, o EBEc 2 mg tópico por via intracervical provocou um relaxamento cervical in vivo de 56,6 ± 8,7%, efeito que perdurou por 20 min. Portanto, o EBEc possui efeito miorrelaxante frente a contração de cérvice ovina, cujo mecanismo de ação envolve a via do óxido nítrico mediada pela transdução celular via GMPc, culminando em uma redução do cálcio intracelular. Palavra Chave: Ovinocultura. Inseminação artificial. Extrato etanólico. 7 ABSTRACT Considering the properties of the crude ethanol extract of Erythroxylum caatingae (EBEc) and the anatomy of the ovine cervix, whose irregular distribution of cervical rings is a limiting factor for artificial insemination, we assessed the effect of the extract on contractility of ovine cervix as well as the possible mechanism of action.the circular segments were connected to the isometric system to in vitro contractility evaluation . After the basal period, the segments were subjected to addition of EBEc (1-729 µg/mL). Other segment’s groups were subjected to contractions induced by KCl 90 mM or CCh 30 mM followed by cumulative addition of EBEc (1-729 µg/mL). Other segments were pre-incubated with of atosibana 10 µM, L-NAME 100 µM, L -NAME 100 µM + L-arginine 300 µM, 4-AP 3mM, TEA 0.3 mM, glibenclamide 1 µM, or verapamil 3μM followed by the addition of EBEc. Besides, one group of animals was subjected to cervical infusion with 0.15M of saline or EBEc 2mg for analysis of cervical contraction in vivo after such treatments. Data were expressed (mean ± standard deviation) and analyzed after "t"-student test or ANOVA followed by Newman-Keuls tests, p <0.05. The EBEc decreased cervical contractility from concentration of 9 mg/ml (47.8 ± 6.5 %) with maximal effect of 85.4 ± 5.1 % and 17.9 ± 3.7 μg.mL of EC5. The EBEc reduced the contraction induced by K+ or CCh about 17.7 ± 3.8% e 47.0 ± 8.9%, respectively. The L-NAME and ODQ significantly reduced the cervical relaxant effect induced EBEc (EC50 > 729). In the presence of L -NAME + L-arginine the relaxation induced by EBEc was partially restored. 4-AP, TEA and glibenclamide, blockers of potassium channel, did not prevent this response triggered by EBEc. In the presence of verapamil, the EBEc to reduced the contraction induced by acetylcholine. Besides this, intracervical EBEc 2 mg caused cervical relaxation in vivo (56.6 ± 8.7%), which persist for 20 min later. Thus, EBEc has relaxant effect on ovine cervix contraction, whose mechanism of action involved a oxid nitric pathway mediated by GMPc cellular transduction, resulting in a reduction of intracellular calcium. Key word: Ovine breeding. Artificial Insemination. Ethanol Extract 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema representativo de eventos envolvidos na contração e relaxamento das células musculares lisas. 28 Figura 2. Via de transdução do sinal intracelular responsável pelo relaxamento da musculatura lisa, causado pelo mediador inibitório NANC, óxido nítrico (NO). 33 Figura 3. Representação de folhas (A) e frutos (B) da espécie Erythroxylum caatingae. 42 Figura 4. Esquema dos equipamentos utilizados nos experimentos de avaliação da contratilidade in vitro. 1) Transdutor de força (MLT 0202, Pan Lab); 2) Bomba de aeração; 3) Amplificador “bridge system” (Insight®, Brasil); Sistema EFF321(Insight®, Brasil); 5) Cuba de 10 mL; 6) Haste fixa; 7)Coletor. 46 Figura 5. Representação de experimento in vivo. A: Animal em estação. BTração da cérvice com o auxílio de duas pinças de Allis e um espéculo. C- Com a cérvice tracionada, a cânula foi inserida até 2º anel cervical D- Sonda acoplada a um transdutor de força. 50 Figura 6. A. Representação quantitativa do efeito inibitório do EBEc sobre a contração cervical de cérvice ovina avaliada in vitro. B. Traçado qualitativo do efeito do EBEc sobre a contração cervical de cérvice ovina. 40 Figura 7. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl 90 mM em cérvice ovina in vitro. A: Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice ovina pré-contraídos com KCl 90 mM. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl em cérvice ovina. 41 Figura 8. Efeito do EBEc sobre a contração tônica induzida por CCh em cérvice ovina in vitro. A: Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice ovina pré-contraídos com CCh 30 µM. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por CCh em cérvice ovina. 41 Figura 9. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc em segmentos de cérvice ovina na presença e ausencia de atosibana 10 µM. 42 9 Figura 10. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com L-NAME 100 µM, associação L-NAME 100 µM + L-arginina 300 µM ou controle. 43 Figura 11. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc segmentos de cérvice ovina pré-incubados com ODQ 10 µM 43 Figura 12. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com Tetraetilamônio 0,3mM, Glibenclamida 1µM ou 4-aminopiridina 3 mM. 44 Figura 13. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Acetilcolina em cérvice ovina in vitro. A: Representação gráfica da contração induzida por acetilcolina mediante efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice ovina. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl em cérvice ovina. 45 Figura 14. Representação quantitativa dose-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc na concentração de 2 mg/mL nos intervalos de 10, 20 e 30 minutos após infusão. 46 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AMPc 5'-AMP, 5'-monofosfato de adenosina, monofosfato de adenosina, fosfato de adenosina CaM cálcio-calmodulina, CaM, Ca2+ / calmodulina, Ca2+ / CaM CaV Canais para Ca2+ abertos por voltagem CCh Carbacol CE50 Concentração efetiva para se obter 50% da resposta estimada em 100% COX Ciclooxigenase DAG D-1,2-Diacilglicerol EBEc Extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae EDRF Fator relaxante do endotélio E.P.M. Erro padrão da média GCs Enzima guanilato ciclase solúvel GMPc Monofosfato cíclico do guanosina GPCR Receptores acoplados a proteína G IA Inseminação artificial IP3 Trifosfato de Inositol IA Inseminação artificial IP3 Trifosfato de Inositol KCl Cloreto de potássio MLCK Cinase de cadeia leve da miosina NaCl Cloreto de sódio NANC Nervos não adrenérgicos NOS Óxido nítrico sintases eNOS Óxido nítrico sintase endotelial nNOS Óxido nítrico sintase neuronal iNOS Óxido nítrico sintase induzida PIP2 Bifosfato de inositol PKA Proteína quinase A TEA Tetraetilamônio UI Unidades internacionais 4- AP 4-aminopiridina 11 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Produtos Naturais 16 2.2 Metabólitos secundários 18 2.3 Caatinga 19 2.4 Ovinocultura 21 2.5 Inseminação Artificial 22 2.6 Morfo-fisiologia da cérvice ovina 24 2.7 Músculo liso 26 2.8 Canais para cálcio 28 2.9 Óxido Nítrico 31 2.10 Canais para Potássio 33 2.11Tocolíticos 35 2.12 Dilatadores cervicais 37 2.13 Considerações sobre o gênero Erytroxylum 40 3 OBJETIVO 44 4 MATERIAL E MÉTODOS 45 4.1 Animais 45 4.2 Material Botânico 45 4.2.1 Preparação do extrato para os ensaios farmacológicos 45 4.3 Fármacos 45 4.4 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS IN VITRO 46 4.4.1 Preparo do tecido 4.4.2. Avaliação in vitro do efeito do EBEc sobre a contração em cérvice 46 ovina 4.4.3. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por potássio em cérvice 46 ovina 4.4.4. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Carbacol (CCh) em 47 cérvice ovina 4.4.5. Investigação do efeito do EBEc sobre a amplitude da contração de cérvice ovina pré-incubada com ocitocina ou atosibana 47 13 4.4.6. Avaliação do possível envolvimento do óxido nítrico no relaxamento 48 cervical induzido por EBEc 4.4.7 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no 48 relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Via GMPc 4.4.8 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no 49 + relaxamento cervical induzido pelo EBEc: canais para Potássio (K ) 4.4.9 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no 49 relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Liberação de Ca2+ intracelular mediado por ligante 4.5 PROTOCOLO EXPERIMENTAL IN VIVO 4.5.1.Avaliar a contração da cérvice ovina in vivo 49 4.6 Análise Estatística 51 5 RESULTADOS 52 6 DISCUSSÃO 59 7 CONCLUSÃO 68 8 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 69 14 1. INTRODUÇÃO O Brasil possui um expressivo rebanho de ovinos, com um efetivo de 17,3 milhões de cabeças (IBGE, 2010) ocupando a 17º colocação mundial em número de animais de acordo com a FAO (2012). Deste rebanho, 56,7% encontra-se na região Nordeste (SOUZA et al., 2012). Destacando o expressivo consumo per capita anuais em grandes cidades, a exemplo de Petrolina (11,7 kg) e Juazeiro (10,8 kg). Assim, a ovinocultura é uma atividade de grande relevância econômica e social, por fornecer carne a preços acessíveis às populações rurais e às periferias das grandes cidades do Nordeste Brasileiro. Entretanto, nessa região o sistema de produção na maioria das propriedades é extensivo caracterizando por baixos índices zootécnicos, abate de animais tardios, qualidade de carne incompatível com a demanda, além da constante irregularidade de oferta (NUNES et al., 2007). Tal déficit na produtividade também é reflexo da baixa utilização e difusão das biotécnicas da reprodução, que incorre em índices reprodutivos baixos, com uma significativa redução no retorno financeiro ao produtor rural (LOPES-JUNIOR, 2006). Por outro lado, quando devidamente utilizadas, as biotécnicas da reprodução, constituem fortes aliadas e resultam em significativas melhorias na produtividade e rentabilidade dos rebanhos (SIMPLÍCIO et al., 2007). Dentre essas técnicas de manejo reprodutivo, destacam-se a estação de monta, inseminação artificial (IA), sincronização/indução do estro, superovulação, produção in vivo e in vitro de embriões, transferência de embriões, diagnóstico precoce de gestação e, quando necessário, a indução do parto (KRUIP; REENEN, 2000). Ressalta-se que a IA é uma técnica que apresenta grande impacto em um programa de melhoramento genético, desde que bem conduzida. No entanto, no Brasil e no mundo, a IA ainda não é tão difundida em ovinos tanto quanto é em outros animais como os bovinos. Alguns fatores contribuem para isso, dentre os quais se destaca a anatomia da cérvice ovina, cuja distribuição irregular e interposição dos anéis resultam em uma luz cervical reduzida, dificultando a realização da IA pelo método transcervical (HAFEZ, 2004; LUZ et al., 2000; NAQVI et al., 1998). Na tentativa de atenuar as dificuldades em realizar a IA pela via transcervical em ovinos, alguns trabalhos vêm sendo desenvolvidos para induzir a dilatação 15 cervical (FALCHI et al., 2012; LEETHONGDEE et al., 2007; PERRY et al., 2010). Entretanto, as substâncias, alvos dessas pesquisas, além de caras, são de difícil acesso aos pequenos produtores em regiões mais distantes das grandes metrópoles. Neste contexto, devido à diversidade química estrutural de compostos bioativos obtidos de plantas, pesquisas são conduzidas para a elucidação de eventual aplicabilidade clínica das substâncias provenientes de produtos naturais. Inclusive tais estudos contribuem para a compreensão de eventos fisiológicos, como a contratilidade da musculatura lisa uterina (CHIWORORO; OJEWOLE, 2009). De fato, recentemente extratos obtidos de plantas do gênero Erythroxylum, cuja distribuição territorial abrange florestas úmidas da Mata Atlântica, nos Brejos de Altitude, nas Matas Serranas, nas Restingas e em áreas mais secas da Caatinga (LOIOLA, 2007), demonstraram efeito miorrelaxante sobre a musculatura lisa uterina e na traqueia de roedores (SANTOS et al., 2013; SILVA et al., 2010). Tais resultados corroboram os relatos da utilização medicinal de extratos obtidos deste gênero para o combate de afecções no sistema respiratório e genito-urinário (SILVA et al., 2001). Baseado nisso e considerando a necessidade de investigações de alternativas viáveis para dilatação cervical a fim de otimizar a IA transcervical em ovinos, este estudo avaliou o efeito do extrato de Erythroxylum caatingae sobre a contratilidade de cérvice ovina, bem como investigou o possível mecanismo de ação desencadeado por este extrato. Com a execução deste trabalho, almeja-se agregar valor a este produto natural obtido no Semiárido Nordestino ao suscitar a hipótese sobre sua eventual aplicabilidade no suporte a IA transcervical em ovinos. 16 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Produtos Naturais O conhecimento histórico do uso de plantas medicinais remonta às civilizações primitivas que perceberam a existência de plantas comestíveis dotadas de maior ou menor toxicidade, que, ao serem utilizadas no combate das enfermidades, revelavam potenciais preventivos e/ou terapêuticos (CAMARGO, 2006). Estima-se que no período anterior aos fármacos sintéticos, 80% dos medicamentos eram manipulados a partir de cascas, raízes e folhas vegetais (McCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). Nesse contexto surgiu a fitoterapia (do grego phyton = vegetal e therapeia = tratamento), baseada no estudo das plantas medicinais e suas aplicações na cura das doenças. Assim, planta medicinal é aquela que contém um ou mais princípios ativos com atividade terapêutica potencial. Estes princípios ativos, em sua maioria, são sintetizados a partir do metabolismo secundário dos vegetais (BRASIL, 2006). Cerca de 60% da população mundial depende dos produtos de origem vegetal, devido ao reconhecido efeito terapêutico dos fitoterápicos (HARVEY, 2000). Vale salientar que o Brasil, cuja biodiversidade abrange cerca de 25% das espécies vegetais encontradas no mundo, é considerado um país com grande potencial de plantas medicinais, exóticas e representa um vasto campo comercial, científico e tecnológico para ser explorado (MALUENDAS; PEITZ, 2004). Entretanto a exploração e validação de plantas medicinais em medicamentos eficazes e seguros não são feitos somente com base no conhecimento popular. É necessária a fundamentação científica demonstrando os benefícios e os possíveis riscos após sua administração em animais e/ou seres humanos (YUNES et al., 2001). Nesse sentido, a partir do interesse da indústria farmacêutica pelo uso da biodiversidade vegetal como fonte de novos medicamentos, iniciou-se uma nova fase para o isolamento dos constituintes vegetais dotados de atividade farmacológica, a fim de substituir o vegetal e/ou seus extratos pelos compostos bioativos com maior especificidade farmacológica da substância isolada (CORDELL, 2000; MOREIRA et al., 2010). Para isso, são levadas em consideração as 17 exigências de segurança, eficácia e qualidade das agências regulamentadoras para a utilização de produtos terapêuticos (HARVEY, 2007; PUPO; GALLO, 2007). Entretanto, devido ao custo elevado para que sejam desenvolvidas tais investigações aprofundadas sobre a composição química dos produtos naturais com potencial farmacológico, são considerados a composição química da espécie em questão ou de outras espécies do mesmo gênero ou família, o uso popular e os dados experimentais anteriores com animais de experimentação ou seres humanos. Em sua maioria os estudos pioneiros são conduzidos mediante a utilização de extratos brutos ou suas frações, ou simplesmente o chá obtido do vegetal (CHIWORORO; OJEWOLE, 2009; OLIVEIRA et al., 2011; ZHENG et al., 2010). Inclusive há o empenho no desenvolvimento de pesquisas utilizando extratos vegetais com atividade na musculatura lisa, estrutura responsável pelo controle da contratilidade de diferentes órgãos, a exemplo dos vasos sanguíneos, estômago, bexiga, vias aéreas, intestino e útero (AGUIAR et al., 2012; INTERAMINENSE et al., 2010; JUCÁ et al., 2011; SIQUEIRA et al., 2012). Considerando que a fisiopatologia de diversas enfermidades como hipertensão, cólica, asma brônquica e aborto têm sua gênese em alguns destes órgãos, é relevante a pesquisa sobre o desenvolvimento de medicamentos acessíveis e efetivos para prevenção ou tratamento destas e de outras alterações funcionais da musculatura lisa (WEBB, 2003). Uma das mais recentes conquistas da medicina alternativa é a portaria Interministerial (2.960/2008) assinada pelo Ministério da Saúde que instituiu o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que tem como objetivo garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade e desenvolvimento da cadeia produtiva e indústria farmacêutica nacional. Tendo em vista que o uso de plantas é prática prevalente em ampla faixa populacional brasileira, várias plantas poderão vir a ser incluídas na RENISUS (Relação Nacional de Plantas medicinais de interesse ao Sistema Único de Saúde) ratificando a necessidade de pesquisas que avaliem o potencial farmacológico das plantas (BRASIL, 2009). Apesar deste incentivo para utilização de substâncias advindas de produtos naturais em seres humanos, na medicina veterinária, apenas 1% do mercado de fitoterápicos no país é voltado ao segmento, apesar de estar em constante 18 crescimento, 25% ao ano, representando cerca de 6,7% do mercado total de medicamentos (QUINTELA, 2004). O fácil acesso, baixo custo, efeito terapêutico e profilático são fatores que contribuem para o uso frequente destes produtos, sendo assim uma alternativa viável para a saúde humana e animal (OZAKI; DUARTE 2006). 2.2 Metabólitos secundários Entende-se por metabolismo primário o conjunto de processos metabólicos que desempenham uma função essencial no vegetal, tais como a fotossíntese, respiração e o transporte de solutos. Os compostos envolvidos no metabolismo primário possuem uma distribuição universal nas plantas, a exemplo dos aminoácidos, nucleotídeos, lipídios, carboidratos e da clorofila. O metabolismo secundário origina compostos que não possuem uma distribuição universal, pois não são necessários para todas as plantas. Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos, compostos fenólicos e alcaloides (PEREZ, 2004). A espécie vegetal, partes estruturais, condições de crescimento, solo, água, temperatura, estação do ano e idade influenciam na variedade dos componentes químicos das plantas (PAGE et al., 2006). Além disso, estudos comprovam que a composição dos metabólitos secundários de uma planta pode variar consideravelmente durante o ciclo dia/noite. Tal conhecimento inclusive é utilizado desde a antiguidade, uma vez que a colheita de plantas como a Conium maculatum era realizada pela manhã, pois os níveis de coniina (substância neurotóxica, conhecida popularmente como cicuta, utilizada para a execução de prisioneiros na Grécia antiga) são maiores durante este período do dia (NETO; LOPES, 2007). De fato, os metabólitos secundários representam uma conexão química entre as plantas e o ambiente circundante, sendo sua síntese comumente influenciada por condições ambientais (KUTCHAN, 2001). Portanto, como os metabólitos sofrem influência da sazonalidade, a natureza do constituinte ativo pode variar ao longo do ano (JENKS et al., 1996). Sabe-se também que a fotossíntese, a mobilização de reservas e o crescimento podem ser alterados por estresse hídrico e consequentemente, levar a alterações no 19 metabolismo secundário (WALLAART, 2000). Isto é um fator preocupante quando ocorrem períodos longos de estiagem em regiões como o Semiárido nordestino. Por outro lado, os estímulos causados por chuvas ou os ferimentos advindos do granizo, invasão por patógenos e pastagem de herbívoros também podem influenciar a expressão do metabolismo secundário (BOWERS,1993). 2.3 Caatinga O Semiárido nordestino ocupa uma área equivalente a aproximadamente 10% do território brasileiro, tendo cerca de 800.000 km² (AB’SABER, 1974). Deste espaço, a Caatinga abrange 735.000 km2 e compreende áreas dos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e a parte nordeste de Minas Gerais (AB’SABER, 1977). De origem tupi o termo Caatinga significa mata branca, alusão ao aspecto desta vegetação durante a estiagem, quando as árvores perdem as folhas e os arbustos dominam a paisagem semiárida (PRADO, 2003). Características comuns às espécies dos gêneros Tabebuia (Bignoniaceae), Cavallinesia (Bombacaceae), Schinopsis e Myracrodruon (Anacardiaceae) e Aspidosperma (Apocynaceae), dominantes nos tempos pré-colombianos (COIMBRA-FILHO; CÂMARA, 1996). Apesar de há algum tempo a Caatinga ter sido classificada como um bioma de baixa biodiversidade (PRANCE, 1987; VANZOLINI et al., 1980), atualmente se sabe que o nível de distribuição de espécies vegetais é bastante alto. De fato, Giulietti et al. (2004) afirma que o bioma Caatinga detém 18 gêneros e 318 espécies endêmicas, pertencentes a 42 famílias, incluindo tanto plantas de áreas arenosas como rochosas. Fernandes (2006) afirma que tamanha biodiversidade está diretamente relacionada a um conjunto de influências tais como fatores paleoclimáticos, estrutura geológica e a natureza litológica do substrato, que levaram ao surgimento da vegetação peculiar com a respectiva caracterização florística. Deste modo, a Caatinga é um dos espaços semiáridos da América do Sul detentor de uma organização natural única, embasando a afirmação: a Caatinga é um bioma exclusivamente brasileiro. 20 Em virtude desta biodiversidade e de suas características particulares, a Caatinga é considerada um importante laboratório para estudos de plantas (LEAL et al., 2003). Apesar disso, a Caatinga ainda é o bioma menos estudado do Brasil (ALBUQUERQUE; ANDRADE, 2002). Todavia este bioma tem sido dominado por um cenário de degradação ambiental decorrente do binômio gado-algodão que trouxe riqueza para os proprietários sertanejos e pobreza para o cenário das Caatingas (LEAL, 2003). De acordo com Casteletti et al. (2004) estima-se que cerca de 30,4% a 51,7% da área da Caatinga foi alterada por atividade antrópica, tais como estradas, pastagens, terras agricultáveis e outros tipos de uso intensivo do solo. Além disso, o uso insustentável dos seus recursos naturais está levando à rápida perda de espécies endêmicas, eliminação de processos ecológicos chaves e formação de extensos núcleos de desertificação em vários setores da região (LEAL et al., 2003). Portanto, estudos voltados para biodiversidade vegetal e animal neste bioma são bastante animadores, pois através dessas investigações novos produtos com potencial econômico poderão ser desenvolvidos, contribuindo para a qualidade de vida das mais de 25 milhões de pessoas que vivem na Caatinga (MITTERMEIER et al., 2002), dentre as quais, a população rural que vive em situação de pobreza em decorrência das fortes estiagens, falta de investimento público e vontade política que em conjunto depreciam a produtividade da região, dentre outros fatores como a má distribuição de renda que também aflige outras regiões do Brasil (SAMPAIO; BATISTA, 2004). 2.4 Ovinocultura Do ponto de vista do potencial produtivo, a criação de ovinos é uma das primeiras atividades silvipastoris de que se tem relato. Teve sua criação baseada na possibilidade de fornecer alimento através da carne e leite, e prover proteção frente às intempéries pelo uso da lã (VIANA, 2008). Desde então a ovinocultura passou por muitas transformações, em especial nas últimas décadas, com a abertura do comércio internacional e estabilidade monetária que permitiram um cenário favorável para o seu desenvolvimento no Brasil. Inclusive, hoje se sabe que a ovinocultura 21 quando bem explorada é uma alternativa viável para diferentes ecossistemas (SIMPLICIO, 2001). Segundo o IBGE (2010), o Brasil possui 17,3 milhões de cabeças ovinas distribuídas por todo o país, porém, concentradas em grande número no estado do Rio Grande do Sul e na região Nordeste, particularmente na Bahia e Pernambuco, que contribuem com 58% dos ovinos do país (CNA, 2007). Em Pernambuco há elevada concentração de animais no Sertão, que detém 89,73% do total de animais, já o Agreste tem 8,50%, e a região litorânea 1,77%. Esta distribuição reflete a potencialidade da ovinocultura no sertão semiárido (CARVALHO; SOUSA, 2008). Segundo Sampaio et al. (2006) as três principais microrregiões pernambucanas que concentram quase dois terços do rebanho são Itaparica, Petrolina e Sertão do Moxotó. Há uma grande diferença nos dois polos principais de produção ovina no Brasil. No Rio Grande do Sul a criação é baseada em ovinos de raças de carne, lanadas e mistas, adaptadas ao clima subtropical, onde se obtém o produto lã e carne, já na região nordeste prevalece os ovinos de raças mestiças deslanadas, adaptadas ao clima tropical, com alta rusticidade e produtoras de carne e peles (IBGE, 2005). Segundo Nogueira Filho e Kasprzykowski (2006), na região Nordeste o consumo per capita é mais que o dobro do registrado no Brasil, chegando a um índice de 1,5 kg/hab/ano. Destacam-se as cidades de Juazeiro (BA) e Petrolina (PE) que apresentam consumo de 10,8 kg e 11,7 kg per capita anuais, respectivamente. Além da oferta na região e da característica cultural, um dos fatores que contribuem para o consumo da carne ovina é sua textura fina, gordura branca e compacta, cujo valor nutritivo é resultado principalmente de sua riqueza em proteínas, minerais, vitaminas e boa digestibilidade (GARCIA, 2004). Dessa forma a ovinocultura é uma atividade econômica em contínua expansão no Brasil. Dados do IBGE permitem observar que entre os anos de 1975 e 2003, o rebanho ovino brasileiro chegou a crescer até 455% em algumas regiões brasileiras. Isto mostra aumento da importância da atividade e sua contribuição para o produto interno bruto do agronegócio brasileiro, com expressivo impacto sócioeconômico na região (VASCONCELOS; VIEIRA, 2005). 22 2.5 Inseminação Artificial Assim, para que haja uma maior produtividade da ovinocultura, além do controle nutricional e sanitário, há necessidade de difusão da utilização de biotécnicas da reprodução que permitam o melhoramento genético de espécies, dentre estas biotécnicas destaca-se a Inseminação artificial (IA) devido a seu baixo custo quando comparado aos demais procedimentos (WULSTER-RADCLIFFE et al., 2004). A IA consiste na deposição do sêmen fresco ou congelado-descongelado no trato genital da fêmea (AX et al., 2000). O seu uso possibilita a utilização de sêmen de animais melhorados geneticamente ou dos que já vieram a óbito, também diminui a transmissão de doenças venéreas e facilita a realização de testes de progênie, inclusive permitindo que machos subférteis produzam proles (MIES FILHO, 1987), além de otimizar a obtenção de crias sem a necessidade de transportar os reprodutores, fato que minimiza o estresse (HAFEZ, 2004). Novas técnicas de inseminação artificial foram desenvolvidas haja vista a necessidade de adaptação da técnica para as diferentes espécies associadas ao melhor custo-benefício. Neste sentido, o método de deposição do sêmen no trato genital da fêmea ovina pode ser vaginal, cervical, transcervical e intra-uterina (DONOVAN et al., 2001; AX et al., 2000). Dentre os métodos de deposição intrauterina, destaca-se a inseminação laparoscópica, procedimento cirúrgico no qual o sêmen é depositado no lúmen dos dois cornos uterinos, permitindo assim a utilização de uma menor concentração espermática. Entretanto, esta técnica demanda equipamentos de elevado valor e mão-de-obra especializada (KING et al., 2004), dificultando o seu uso rotineiro em criações de pequenos produtores (BICUDO et al., 2003; KERSHAW et al., 2005). Com isso, os métodos não cirúrgicos (vaginal, cervical e transcervical) para deposição do sêmen são os mais usados, pois não demandam todo o aparato tecnológico e a mão de obra especializada utilizadas na laparoscopia. Em ovinos, a IA por via vaginal é a mais simples, deposita-se o sêmen na vagina com auxílio de uma pipeta sem nenhuma tentativa de localizar a cérvice, sendo por isso conhecida como “tiro no escuro” (AISEN, 2004). Entretanto, nessa técnica a fertilidade é altamente variável e este método é inadequado quando se faz uso de sêmen congelado (DONOVAN et al., 2001). 23 Outro método conhecido é a IA via cervical, onde o sêmen é depositado dentro da cérvice, o mais profundo possível (CHEMINEAU et al., 1991). A IA cervical com sêmen líquido é o método mais utilizado em ovelhas por quatro razões básicas: aplicação fácil, rápida, custos relativamente baixos e obtenção de resultados satisfatórios de fertilidade, desde que seja utilizado sêmen fresco (BODIN et al., 1997), visto que os índices médios de fertilidade obtidos com sêmen congelado são em geral insatisfatórios, variando de 6% a 45% (DONOVAN et al., 2004; CRUZ et al., 2006). Na tentativa de viabilizar o uso do sêmen congelado com custo reduzido na espécie ovina, foi desenvolvida a técnica de IA intrauterina transcervical que teria maior aplicabilidade por ser um método não-cirúrgico (RABASSA et al., 2007). Entretanto, apesar da crescente utilização da técnica de IA em ovinos, a maior difusão entre os produtores é dificultada pelas baixas taxas de fertilidade ovina quando comparadas à espécie bovina. Dentre outros fatores, a anatomia cervical ovina é caracterizada pelo formato irregular, o tamanho variável do canal cervical, além de diversos tipos de óstio cervical que dificultam a acessibilidade do local de deposição do sêmen. Baseado nesses fatores Wulster-Radcliffe et al. (2004) estabeleceram 3 métodos para atenuar tal dificuldade: - Método físico: com o auxílio de uma pinça hemostática a cérvice é tracionada e fixada com objetivo de alinhar o canal cervical, diminuindo as obstruções ao acesso do lúmen uterino. - Método químico: fármacos de diferentes classes são utilizados para relaxar a musculatura lisa cervical, conhecidos como dilatadores cervicais. - Método mecânico: utilizando um equipamento para inseminação artificial e transferência de embrião transcervical método apropriado para vencer as dificuldades físicas relacionadas com a cérvice ovina. 2.6 Morfo-fisiologia da cérvice ovina Diante dos fatores descritos anteriormente, a seguir foi feita uma breve abordagem das características morfofisiológicas da cérvice ovina. É um órgão tubular, longo, fibroso de natureza predominantemente conjuntiva, com uma camada 24 de serosa exterior e epitélio luminal interno medindo entre 4-7 cm que é responsável por conectar o útero à vagina (KERSHAW et al., 2005; CRUZ et al., 2006). Vale salientar que o comprimento da cérvice da ovelha é influenciado pela raça, idade, número de partos e estado fisiológico (KAABI et al., 2006). Na ovelha, a cérvice é composta por uma espessa parede e uma luz constrita, caracterizada pela presença de proeminências, denominadas anéis cervicais. Estes anéis interpõem-se uns aos outros, ocluindo a cérvice e tal disposição evita a ocorrência de infecções (EVANS; MAXWELL, 1990). Apenas durante o estro ou trabalho de parto a musculatura cervical relaxa o suficiente permitindo a entrada dos espermatozóides no útero ou a passagem do concepto (HAFEZ, 2004). Dentre as funções da cérvice, Hafez (2004) destaca o transporte espermático através do muco cervical para o interior do útero, uma vez que o muco cervical auxilia na condução do gameta masculino até o oócito. Outra função comum à cérvice é atuar tal qual um reservatório, além de selecionar espermatozóides viáveis, posto que após a cobertura uma quantidade maciça destes fica alojada nos anéis cervicais. Portanto, a cérvice pode atuar regulando a quantidade de espermatozóides que chegam ao local de fertilização, selecionando os mais viáveis, uma vez que a penetração destes gametas depende da viabilidade e da estrutura espermática (HAFEZ, 2004). O tecido conjuntivo do estroma cervical é composto por substância básica, constituintes fibrosos e elementos celulares. Basicamente, os padrões de organização e dissociação dos constituintes fibrosos intermedeiam o afrouxamento dos tecidos cervicais aumentando os espaços entre os feixes de colágenos promovendo a dilatação da cérvice (HAFEZ, 2004). Constatou-se ainda que o influxo de neutrófilos, pela produção de colagenases, para o interior da cérvice parece ser um importante componente para o amolecimento cervical (WESTERHAUSENLARSON et al., 1996). Outro constituinte da cérvice é o muco cervical, composto por macromoléculas de mucina de origem epitelial, carboidratos (galactose, a glicosamina, a fucose e o ácido siálico) e proteínas (pré-albumina, a lipoproteína, a albumina e as y-globulinas). O muco cervical contém ainda várias enzimas incluindo glucoronidase, amilase, fosforilase, estearase e fosfatases. A secreção de muco cervical é estimulada pelos estrógenos ovarianos e inibida pela progesterona. Estas diferentes respostas aos hormônios sexuais contribuem para as alterações nas 25 propriedades do muco cervical, como aumento na quantidade, viscosidade, cristalização e pH, assim como diminuição da viscosidade e do conteúdo celular que ocorrem durante o estro e a ovulação; já o inverso ocorre durante a fase luteínica (GONZALEZ, 2002). Quanto ao óstio cervical externo, existe uma classificação anatômica em 4 tipos: “flap” ou aba, bico de pato, espiral e roseta (HALBERT et al., 1990). Anos mais tarde, Kershaw et al. (2005) identificou mais um formato, o qual foi designado liso (fenda). Por fim, como já descrito, a distribuição irregular dos anéis cervicais atrelado ao tônus da musculatura lisa, resulta em uma luz cervical restrita à realização da IA pelo método transcervical. 2.7 Músculo liso De acordo com Guyton (2006) fisiologicamente o músculo liso é dividido em dois tipos principais: músculo liso multiunitário e músculo liso de uma unidade só. O primeiro é formado por fibras independentes de músculo liso e inervado por terminação nervosa única, o que permite a contração independente de cada fibra muscular, sendo encontrado no músculo ciliar do olho, íris do olho, membrana nictitante e músculos piloeretores. O segundo tipo muscular tem como característica a habilidade de contrair suas fibras juntas, como uma só unidade. Logo, conhecido como “unidade só” ou músculo sincial. Para tanto, suas fibras possuem membranas celulares interconectas por junções abertas, o que permite o fluxo de íons de uma célula a outra, de modo que o potencial de ação seja propagado entre as fibras e assim a força gerada por uma fibra muscular possa ser transmitida à seguinte. Este tipo de músculo é encontrado em órgãos como o intestino, vias biliares, ureteres, útero e muitos vasos sanguíneos e por isto é conhecido por músculo liso visceral. A base química para a contração do músculo liso reside nos filamentos de actina e miosina. Entretanto, diferentemente dos músculos esqueléticos, o músculo liso não contém troponina. E isto configura um dos motivos pelo qual o seu mecanismo para o controle da contração é diferenciado. De fato, o tempo em que as 26 pontes cruzadas permanecem presas aos filamentos de actina é maior na musculatura lisa e isto implica na intensidade da força de contração. Uma provável razão para esses ciclos lentos é a de que as cabeças de miosina conteriam menor atividade de ATPase, de modo que a degradação do ATP, energia necessária para realizar os movimentos das cabeças, ficaria muito reduzida, com diminuição correspondente da frequência dos ciclos. A musculatura lisa das vísceras ocas permite que seus diâmetros luminais variem desde valores muito grandes até quase zero (WIDMAIER et al., 2006). Para tanto, a contração do músculo liso é um evento um tanto complexo e pode ser estimulado ou inibido a se contrair por múltiplos tipos de sinais: neural, hormonal e por vários outros meios. Sendo que a membrana do músculo liso contém muitos tipos distintos de proteínas receptoras, capazes de desencadear o processo contrátil, através da conexão entre os eventos da membrana e o aumento da concentração intracelular de Ca2+ (GOODMAN; GILMAN, 2006). De fato, para que ocorra a contração muscular são necessárias várias etapas que envolvem, quase sempre, aumento da concentração de Ca2+ no citosol. Este aumento pode ser proveniente da liberação dos estoques presentes no retículo sarcoplasmático ou ainda da entrada de Ca2+ a partir do meio extracelular através de canais presentes no sarcolema advindos da despolarização da membrana. Essa despolarização promove alteração da conformação espacial de determinadas proteínas presentes na membrana que funcionam como poros e, uma vez abertos, permitem a passagem seletiva de Ca2+ pelos chamados canais para Ca2+ abertos por voltagem (CaV) (SOMLYO, 2003). Na célula muscular lisa, a partir de um aumento na concentração citosólica de Ca2+, forma-se um complexo entre quatro átomos de Ca2+ e uma proteína citoplasmática chamada calmodulina (CaM), em combinação com a cinase de cadeia leve da miosina (MLCK, Myosin Light Chain Kinase), formarão um complexo responsável pela fosforilação da cadeia leve de miosina. A ligação do Ca2+ com a calmodulina aumenta a habilidade da actina em ativar a ação ATPásica da miosina, promovendo a quebra de trifosfato de adenosina (ATP) ligado à cabeça da miosina. Com a hidrólise do ATP, a cabeça de miosina, que teve conformação alterada se associa à actina e assim é capaz de gerar a contração através da efetivação destes ciclos (fig. 1) (AKATA, 2007; FRY et al., 2009). Em situação inversa, o relaxamento do músculo liso é resultado de vários mecanismos que promovem a redução da 27 concentração Ca2+ citosólico. Incluem-se os mecanismos relacionados ao sequestro de Ca2+ de volta para seus estoques intracelulares ou o seu bombeamento para o meio extracelular através de transportadores de membrana (WEBB, 2003). O sinal para o início da contração do músculo liso também pode ser gerado independentemente das alterações do potencial transmembrana, mediante ativação de receptores acoplados à proteína G (GPCR). A proteína G consiste em 3 subunidades α, β e γ que, em repouso, permanecem ligadas umas a outras e com um nucleotídeo de guanina (GDP) ligado a subunidade α. Na presença de um agonista, ocorre a mudança na conformação destas subunidades, provocando a dissociação do GDP e sua substituição por GTP, que leva a separação da subunidade α das subunidades β e γ, assumindo a forma ativa da proteína G. Desse modo à proteína G é o vínculo entre os receptores de membrana e a primeira etapa na cascata de transdução de sinais intracelulares mediada por segundos mensageiros que podem inclusive desencadear a abertura dos chamados canais para Ca2+ (RANG DALE, 2003; SOMLYO, 2003). Também existe a possibilidade de abertura de canais para Ca2+ abertos por estímulo mecânico, quando ocorre, por exemplo, estiramento do tecido visceral por presença de conteúdo no lúmen do órgão envolvido. Além desses, ainda existem os canais para Ca2+ abertos por estoques que parecem ser envolvidos com a regulação da concentração intracelular de Ca2+ após a depleção dos estoques reticulares desse íon (BERRIDGE, 2009). Figura 2. Esquema representativo de eventos envolvidos na contração e relaxamento das células musculares lisas (Adaptado de LIMA JR, 2010). 28 2.8 Canais para cálcio Vale destacar que o íon Ca2+ é um importante mensageiro intracelular, fundamental em outros processos metabólicos, como a atividade cardíaca, coagulação sanguínea, manutenção das membranas celulares e sinapses nervosas. Tais processos são desencadeados pelo fluxo de Ca 2+ celular (OIGMAN; FRITSCH, 1998). Visto que as concentrações de Ca2+ extracelular variam em torno de 5mM enquanto sua concentração no meio intracelular está entre 0,1 e 10 µM quantitativo, o que gera um gradiente eletroquímico favorável para a entrada de Ca2+ ao citoplasma, através de transportadores ou canais iônicos específicos presentes na membrana plasmática. Vale salientar que as mudanças na concentração de Ca2+ intracelular não ocorrem somente pela entrada e saída de cálcio através da membrana, mas também se dá através das constantes oscilações dos estoques de Ca2+ intracelular (ALBERTS et al., 2002). Os canais iônicos abertos por voltagem tem essa definição por serem na maioria dos casos proteínas de canal que permitem ou bloqueiam o fluxo de íons a depender da voltagem ou diferença de potencial de membrana da célula. Entre os canais iônicos abertos por voltagem estão os canais para K+, Na+ e Ca2+. Os canais para Ca2+ abertos por voltagem (CaV) são proteínas de membrana que conduzem Ca2+ e são ativados pela despolarização da mesma, promovendo o influxo do íon que serve como um segundo mensageiro intracelular, transformando sinais elétricos em químicos. Esse processo controla diversos eventos intracelulares, como exocitose, endocitose, contração muscular, transmissão sináptica e metabolismo (TREVESIAN, 2010). Os canais para Ca2+ dependentes de voltagem podem ser divididos em função de sua voltagem em L, N, P, Q, R e T. Os canais para Ca2+ do tipo L (canais de longa duração ou lentos) são canais localizados no músculo cardíaco, esquelético, retina e cérebro. A ativação deste canal se dá pela mudança abrupta na diferença de potencial (despolarização), porém o efeito sobre a inativação é pequeno; são também sensíveis aos antagonistas da dihidropirina – DHP 29 (nimodipina, nifedipina e nicardipina) e ao agonista BayK S-8644. Os canais para Ca2+ do tipo N, P, Q e R são canais que se localizam nos terminais pré-sinápticos, da mesma forma que os canais para Ca2+ do tipo L a ativação desses canais (N, P, Q e R) é mediada pela despolarização, porém essa despolarização surte pouco efeito na inativação e tem como função principal a liberação de neurotransmissores. Os canais para Ca2+ do tipo T estão localizados nos músculos cardíaco e liso vascular e no sistema nervoso. A ativação desses canais se dá quando a despolarização da célula está próxima do potencial de repouso e sua reativação requer uma intensa hiperpolarização, e tem como papel principal a propagação dos potenciais de ação dos neurônios e das células musculares cardíacas e vasculares (BOOTMAN et al., 2001; CATTERALL; PEREZ-REYES; SNUTCH et al., 2005). Em 2000 uma nomenclatura foi adotada baseada nos bem definidos canais para potássio. Assim, os canais para cálcio foram nomeados utilizando o símbolo do íon em questão “Ca” com a forma de controle “voltagem”. Deste modo os canais foram nomeados de Cav. A indicação numérica corresponde as subunidades. Assim Cav 1, subfamília (Cav 1.1 - Cav 1.4) é mediados pelo tipo de corrente L. O Ca v 2, subfamília (Cav 2.1 - Cav 2.3) é mediado por correntes do tipo P, Q, N e R. O Cav 3, subfamília (Cav 3.1 - Cav 3.3) é mediado por correntes do tipo T (CATTERALL; PEREZ-REYES; SNUTCH et al., 2005). Nas células musculares há uma proteína ligadora de Ca2+, a calmodulina. A ligação do Ca2+ à calmodulina permite a ativação ou inativação de uma variedade de enzimas, como por exemplo, a adenilato ciclase e/ou a fosfolípase C. A ativação da proteína ligadora de Ca2+ tem dois grandes efeitos: a inibição da adenilato ciclase e consequente diminuição do [AMPc]i ou a ativação da fosfolípase C, que conduz à formação dos mensageiros secundários diacilglicerol (DAG) e Trifosfoato de Inositol (IP3), a partir da hidrólise do fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) na membrana celular (PIMENTEL, 2003). Dentro do grupo de canais para Ca2+ abertos por mensageiros existem os canais para Ca2+ dependentes de nucleotídeos cíclicos (CNGs) que transportam ións Ca2+ assim que são ativados por três moléculas de ATP e os canais para Ca2+ dependentes do Ca2+ que funcionam como ATPases transportadoras de Ca2+, que são ativadas pela ligação de uma molécula de Ca2+ Ainda dentro do grupo de receptores dependentes de ligantes, existem os canais para Ca2+ sensíveis a rianodina e os canais para Ca2+ sensíveis ao IP3, estes canais atuam na liberação 30 das reservas de Ca2+ intracelular estocados no retículo sarcoplasmático, sendo importantes reguladores de vários processos fisiológicos dependentes do Ca2+ (PIMENTEL, 2003). Os receptores rianodínicos têm como função amplificar os sinais de Ca2+; sua ativação se dá pela atividade dos canais para Ca2+ sensíveis à dihidropiridina (DHP) utilizando como via de segundos mensageiros o ADPRibose cíclico (ADPRc) e a calmodulina. São moléculas grandes e complexas, e como tal possuem vários sítios e domínios de ligação para diversos receptores que controlam a atividade do canal, as funções do canal são possivelmente mediadas através das interações entre os domínios citosólicos e membranosos. Os receptores rianodínicos estão presentes em uma vasta quantidade de células, atuando nos mais diversos fenômenos, cujo ponto em comum é a mediação da sinalização feita pelo Ca2+ (OPPELT, 2002). 2.9 Óxido Nítrico Dentre os sinalizadores endógenos responsáveis pela modulação da contratilidade de músculos lisos no organismo, o óxido nítrico (NO), que foi inicialmente conhecido como fator relaxante derivado do endotélio (EDRF), é um gás incolor, relativamente instável, com hidrossolubilidade reduzida e meia-vida curta (em torno de 4 segundos) (BRIAN; GRISHAM, 2007). Devido a estas características, desempenha efeito parácrino em eventos como o relaxamento da musculatura lisa, no processo inflamatório e também como neurotransmissor. Entretanto, não age como os demais neurotransmissores, uma vez que não é armazenado em vesículas, sendo produzido onde e quando se faz necessário, sendo capaz de difundir-se livremente até sítios intracelulares em células vizinhas (DIAS et al., 2011). Vários fatores podem estimular a produção de NO, tais como 5hidroxitriptamina, acetilcolina, trombina, íons Ca2+, ácido aracdônico, alterações na pressão arterial ou estímulo elétrico (MONCADA et al., 1991; JIN; LOCALZO, 2010). A partir destes estímulos, o NO será sintetizado, a partir de seu precursor a larginina, em uma grande variedade de células mediante a atividade de uma família de enzimas chamadas de óxido nítrico sintases (NOS) que inclui a NOS endotelial 31 (eNOS ou NOS3), a NOS neuronal (nNOS ou NOS1) e a NOS induzida (iNOS ou NOS2) (LEONE et al., 1991; MONCADA et al., 1989). Duas destas enzimas são constitutivas, eNOS e nNOS. Elas produzem e liberam NO em quantidade nanomolar por um curto período de tempo em resposta a ligação de agonistas (ex: acetilcolina, bradicinina ou histamina) com receptores acoplados à proteína G na membrana plasmática ou em resposta a estímulos físicos (estresse de cisalhamento). Então, a partir da ativação desta proteína G, com gasto de energia na forma de GTP, a fosfolipase C é ativada e cliva os fosfolipídios de membrana em Diacilglicerol (DAG) e IP3. O DAG, porção apolar é mantido na membrana plasmática, entretanto a porção polar (IP3) se ligará a receptores ativados por IP3 na membrana do retículo sarcoplasmático liberando cálcio, este por sua vez se ligará a receptores rianodínicos ativados por Ca2+ induzindo ao aumento de cálcio citosólico. Este cálcio intracelular, juntamente com o DAG fosforila canais para cálcio abertos por voltagem presente na membrana plasmática da célula, permitindo o influxo de cálcio extracelular. Assim o Ca2+ intracelular se associa a calmodulina, ativando as isoformas constitutivas de NOS (figura 2). Por outro lado, a iNOS é induzida por estímulos imunológicos ou inflamatórios, ocorrendo em resposta ao estresse causado nos músculos lisos vascular ou uterino e tipos celulares, tais como o fibroblasto, macrófago, neutrófilo, endotélio, hepatócitos, neurônios e astrócitos. A ativação da iNOS requer concentrações nanomolares de cálcio equivalente ao nível basal intracelular, classificando-a como independente de cálcio e persiste por mais de 24 horas ativa (COSTA, 2012). Vale ressaltar que o NO participa como neurotransmissor dos nervos não adrenérgicos e não colinérgicos (NANC), responsável por mediar o processo de relaxamento do trato gastrointestinal, respiratório, musculatura cardiovascular e sistema urogenital (COELHO et al., 2003). Estudos demonstram que o mecanismo intracelular envolvido no relaxamento e na hiperpolarização da musculatura lisa mediado pelo NO envolve desde a ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) e consecutivo aumento do monofosfato cíclico do guanosina (GMPc), a ativação de um canal para K+ de alta condutância dependente de Ca2+ ou ativação de canal para K+ dependentes de ATP (VANNESTE et al., 2007; MATSUDA et al., 2009). O GMPc é um nucleotídeo sintetizado no interior da célula pela ação de uma enzima conhecida como guanilato ciclase. Esta enzima pode ser ativada pelo NO, 32 formando GMPc a partir do GTP (BEAVO, 1995). A produção do GMPc é o principal mecanismo pelo qual o NO produz muitos dos seus efeitos biológicos. Há evidências de que o NO e o GMPc podem atuar sobre diversos alvos como as proteínas quinases GMPc-dependentes, fosfodiesterases reguladas por GMPc e diferentes tipos de canais para K+ (BOLOTINA et al., 1994). Figura 2. Via de transdução intracelular responsável pelo relaxamento da musculatura lisa mediado pelo óxido nítrico (NO) (Adaptado de Palheta, 2011). 2.10 Canais para Potássio Os canais iônicos que permitem o efluxo de K+ através da membrana celular desempenham um papel importante na regulação do potencial da membrana celular, sendo fundamental para contratilidade (WRAY, 1993; KAWARABAYASHI, 1994). Canais para K+ é a classe mais abundante de canais iônicos, sendo descritos mais de 16 tipos e subtipos, de modo que as suas funções fisiológicas estão ainda longe de serem plenamente compreendidas (KAŽIC´ et al., 1999). Sabe-se, todavia, que os canais para K+ estão distribuídos pelo músculo liso, inclusive miométrio e desempenham uma função fundamental no controle do potencial de membrana e consequente excitabilidade celular, através do aumento da condutância do íon K+, caracterizando a hiperpolarização e diminuição da condutância ao íon, que induz a despolarização (KNOT et al., 1996). Deste modo, o tônus basal do músculo liso pode ser regulado por canais para K+, destacando-se: canais para K+ abertos por voltagem (Kv); canais para potássio de grande condutância ativados por Ca2+ (BKCa); canais para K+ de pequena condutância ativados por Ca (SKCa); canais para K+ retificadores de entrada (Kir) e canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP) 33 (THORNELOE; NELSON, 2005). No miométrio diferentes tipos de canais para K+ têm sido identificados, sendo o mais comum os canais para K+ de grande condutância ativados por Ca2+ (CHANRACHAKUL et al., 2004). Ainda a respeito de miométrio, estudos indicam que a expressão dos canais para KATP depende tanto da fase de gestação quanto no trabalho de parto (LONGO et al., 2003; BRAINARD, 2007). No final da gravidez, os canais para KATP são reprimidos, o que poderia facilitar o aumento da atividade miometrial necessária para as contrações. Estes dados indicam que, em humanos, a downregulation dos canais para KATP pode contribuir para o aumento da excitabilidade uterina e indução do trabalho de parto (BRAINARD et al., 2007). Brainard (2007) ainda afirma que os canais BKCa podem estar relacionado a atividade miometrial, uma vez que precisam ser ativados para produzir relaxamento uterino. Este canal é ativado por despolarização da membrana e também por um aumento na concentração de Ca2+ intracelular, assim desempenhando um papel central na modulação da contratilidade uterina e manutenção do Ca2+ no miométrio (KHAN, 2001; BRAINARD et al., 2007). A contribuição deste tipo de canal, assim como os canais para KATP dependente está relacionada com a fase gestacional. Segundo Okawa et al. (2000) os canais BKCa mediam o relaxamento uterino apenas na primeira metade do período gestacional, mas não no final da gravidez ou durante o parto de ratas. Com relação à musculatura lisa vascular, sabe-se que o aumento da condutância do íon K+, que ocorre a partir da abertura dos canais na musculatura lisa vascular, promove a vasodilatação, causando diminuição da pressão sanguínea. Por outro lado, uma vez desativado e com consequente diminuição da condutância do íon, a musculatura é levada a um estado de vasoconstrição. Assim como na musculatura lisa dos órgãos gastrointestinais e reprodutivos, quatro tipos de canais de potássio foram identificados na musculatura vascular: canais Kv, BKCa, Kir e KATP (BRAINARD et al., 2007). A repolarização ou hiperpolarização de membrana ocorre devido, 2+ principalmente, a ativação dos BKCa, que são ativados quando a [Ca ]c se eleva na ordem de µM, e a ativação dos Kv, em decorrência à despolarização de membrana (LEDOUX et al., 2006). Os canais Kv são ativados pela despolarização da membrana e atuam regulando o potencial de membrana. Os canais BKCa respondem a alterações dos níveis de Ca2+ intracelular para regularem o potencial de membrana. Os canais BKCa são essenciais na regulação do tônus das artérias de 34 maior resistência, auxiliando na regulação da resposta arterial à pressão e substâncias vasoconstritoras. Os canais Kir estão envolvidos na vasodilatação induzida pelo K+ extracelular. Os canais para K+ sensíveis ao ATP são ativados pela ligação ao ATP e constituem o alvo de alguns vasodilatadores (SOBEY, 2001). Diante do exposto, compostos como os ativadores de canais para K + podem hiperpolarizar a membrana e, indiretamente, fechar os Ca v, inibir o influxo de Ca2+ e, consequentemente, diminuírem a [Ca2+]c (LEDOUX et al., 2006; LIN et al., 2006). Por outro lado, o aumento da [Ca2+]c favorece a ligação do Ca2+ à calmodulina (CaM) e este complexo ativa a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK) para fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC) e promover a interação de miosina com actina, culminando com a contração muscular (SOMLYO; SOMLYO, 2003). 2.11 Tocolíticos Apesar da evolução nas estratégias de prevenção durante o pré-natal e da assistência neonatal, o nascimento prematuro continua com uma elevada incidência, morbidade e suas complicações estão entre as principais causas de mortalidade neonatal, principalmente nos países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento (CUNNINGHAM et al., 2005; IAMS et al., 2004; PARK et al., 2005). Sabe-se que a redução temporária das contrações uterinas possibilita a ocorrência do parto em centros especializados em atendimento de recém-nascido pré-termo (KING et al., 2007). Além disso, a inibição das contrações uterinas é o último recurso que a obstetrícia dispõe para completar um ciclo de corticosteroides antenatal (CABAR et al., 2008). Bittar et al., (2005) afirmam que a tocólise mostra comprovado benefício clínico por curto período de tempo (48-72 horas). E, salvo as indicações, os tocolíticos, em maior ou menor grau, apresentam segurança discutível em relação aos efeitos colaterais maternos e fetais. Drogas como os bloqueadores do canal para Ca 2+, prostaglandinas, antagonista para ocitocina (atosibana) e doadores de óxido nítrico são consideradas tocolíticos. Entretanto apenas a ritodrina, um agente beta (β)-agonista, e a atosibana foram sintetizadas para esta finalidade, as demais foram adaptadas para este fim, 35 uma vez que direta ou indiretamente, estes medicamentos modificam as concentrações do Ca2+ intracelular nas células do miométrio (CABAR, 2008). Dentre os beta (β)-agonistas utilizados terapeuticamente tem-se a terbutalina, sabultamol, fenoterol e ritodrina. Esta classe tem como principais alvos os receptores β2 presentes no miométrio, vasos sanguíneos e via respiratória e ainda, com menor especificidade, atuam em receptores β 1. Tais receptores estão acoplados a proteína Gs, cujo mecanismo de transdução intracelular consiste na ativação da enzima adenilciclase, responsável pela catalisação da conversão do ATP no segundo mensageiro monofosfato cíclico de adenosina (AMP c) que por sua vez ativa a enzima proteínoquinase, responsável pela diminuição do Ca2+ citosólico, resultando em relaxamento da musculatura uterina, explicando a redução no número de partos prematuros após a utilização destes agentes (ANOTAYANONTH et al., 2007). Entretanto, estes agentes podem atravessar a placenta e desencadear os efeitos colaterais no feto, entre os quais taquicardia, hiperinsulinismo, hipoglicemia, hipocalemia e hipotensão arterial (ACOG, 1995). Outra classe farmacológica importante como tocolítico é o antagonista para ocitocina (atosibana), peptídeo sintético que compete com a ocitocina pelos receptores ocitocinérgicos distribuídos pelo organismo, e uma vez ligado ao receptor localizado na célula miometrial reduz os efeitos contráteis mediados pela ocitocina. Segundo Moutquin et al. (2000) as propriedades tocolíticas da atosibana são semelhantes aos β agonistas, porém com o benefício da redução de efeitos colaterais maternos e perinatais. De fato, um ensaio clínico randomizado incluindo 63 mulheres em trabalho de parto prematuro mostrou semelhança quanto à eficácia e à efetividade para tocólise entre nifedipina e atosibana, entretanto houve maiores efeitos colaterais nas pacientes que utilizaram o antagonista de canais para Ca 2+ (AL-OMARI et al., 2006). Vale salientar que dos bloqueadores de canais para Ca 2+, a nifedipina é a melhor opção de agente tocolítico quando comparada aos demais agentes farmacológicos presente no mercado, inclusive é a mais utilizada (SOUZA et al., 2008). Entretanto, Bittar et al. (2005) relatam que alguns estudos em animais sugerem que os bloqueadores de canais para Ca2+ reduzem o fluxo sanguíneo uterino e a oxigenação fetal. Portanto, ainda há necessidade da elucidação quanto à aplicabilidade e segurança destas drogas no trabalho de parto pré-maturo. 36 Os inibidores de prostaglandinas atuam inibindo a enzima ciclooxigenase (COX) necessária à conversão de ácido araquidônico em prostaglandinas, e aparentemente são eficazes como tocolíticos (MELO, 2007). No entanto, são pouco utilizados pelos efeitos colaterais perinatais (BITTAR, 2005). Por esses motivos há a busca de um agente tocolítico, responsável pela inibição do trabalho de parto prematuro, com a menor dose possível e com ausência ou mínimos efeitos colaterais, proporcionando segurança para o binômio maternofetal (PAPATSONIS et al., 2007; ANOTAYANONTH, 2007; KING et al., 2007). Neste sentido algumas pesquisas utilizando doadores do óxido nítrico foram conduzidas, uma vez que o NO inibe contrações espontâneas de útero humano e de animais (MIRABILE et al., 2000; RIZZO et al., 2011). Entretanto, outros trabalhos mostraram que o miométrio é pouco sensível ao segundo mensageiro GMPc formado a partir do NO (COSTA, 2006). 2.12 Dilatadores cervicais Apesar da interconexão anatômica entre o útero e a cérvice, estas porções do trato genital feminino parecem, pelo menos em parte, diferir quanto à resposta fisiológica e/ou farmacológica aos diversos agentes bioativos (FERNANDES et al., 2002). Vale salientar que esta diferença pode contribuir para eventos como o parto, onde há uma demanda extra para contração uterina seguida de relaxamento cervical (SHISEI et al., 2010). Do ponto de vista farmacológico, podemos citar a aplicabilidade da atosibana, um antagonista de receptores ocitocinérgicos, utilizado para induzir relaxamento uterino (KUĆ et al., 2011), por outro lado a própria ocitocina parece estar envolvida no efeito de relaxamento cervical juntamente com o 17β-estradiol (SAYRE; LEWIS, 1996). A ocitocina é um peptídeo sintetizado no hipotálamo e armazenado na neuro-hipófise (SHYKEN et al., 1995), cuja liberação ocorre de forma pulsátil e mediada por estímulos neuro-sensoriais como a amamentação, estímulos em órgãos genitais e durante a dilatação cervical (GRAVES, 1996).Tais conhecimentos são aplicados as biotécnicas da reprodução, uma vez que a dilatação provocada pela ocitocina permite uma maior profundidade de penetração da pipeta de inseminação, sendo encontradas taxas de fertilidade 0% para ovelhas não tratadas, 37 e 60% em ovelhas tratadas com 50 e 100 unidades internacionais (UI) de ocitocina, e de até 100% para as que receberam de 200 e 400 UI (SAYRE; LEWIS,1996). Em um grupo de ovelhas inseminadas 30 minutos após a administração de 200 UI de ocitocina, pelo método transcervical, foi observado que no grupo controle 80% dos animais não permitiram passagem transcervical, sendo feita deposição do sêmen somente no orifício externo da cérvice e 20% permitiram transposição cervical, enquanto que no grupo tratado com esse hormônio houve sucesso na passagem transcervical bem superior (SAYRE; LEWIS, 1997). Segundo Devonish et al. (2003) com a utilização de ocitocina são observadas maiores taxas de concepção, número de ovelhas paridas e número de bezerros nascidos. Apesar de ser apontada como um bom dilatador cervical a utilização da ocitocina pode levar a uma diminuição drástica das taxas de fertilidade devido a indução de contrações tetânicas no útero, cujas durações são proporcionais às doses administradas (SAYRE; LEWIS, 1997). Dessa forma, faz-se necessário pesquisar as possíveis doses e vias de administração de ocitocina que viabilizem a inseminação artificial por tração cervical. Há relatos que a ocitocina desempenha efeito dual no útero, regula a atividade contrátil do miométrio e estimula a liberação de prostaglandinas pelas células endometriais (BOSSMAR et al., 1994). Esse aumento nos níveis de prostaglandina no momento do parto coincide com o amolecimento cervical de grande importância neste processo (ELLWOOD, 1980; OWINY; FITZPATRICK, 1992). Existem ainda diferentes prostaglandinas que podem ser mais específicas neste sentido como a do tipo E em comparação com as do tipo F (O’BRIEN,1995). Em mulheres, a administração de prostaglandinas como PGE 1, PGE2, PGF2, PGI2 e PGF1-α, por via intracervical, antes do parto induz a dilatação cervical (BRYMAN et al., 1986; LAVOIR ; BETTERIDGE, 1996; NUNES et al., 1999). Essas prostaglandinas promovem a diminuição da contratilidade da musculatura cervical, sendo a PGE2 a mais potente (BRYMAN et al.,1986). Já em ovelhas, a administração local de PGE2, no final da gestação, provoca um aumento da dilatação cervical, quatro vezes maior que em ovelhas não tratadas, no entanto, não há indução de contrações uterinas (LEDGER et al., 1983; OWINY; FITZPATRICK, 1990). Sabe-se que as prostaglandinas em parte auxiliam a dilatação cervical pela indução da liberação de colagenases que por sua vez provocam o amolecimento do 38 colágeno, apesar disso, estudos quanto ao efeito da PGE 2 na atividade muscular da cérvice são escassos (ELLWOOD, 1980; OSMERS et al., 1991; SAYRE; LEWIS, 1997). Um análogo sintético da PGE1, o misoprostol, tem sido apontado na literatura como um medicamento eficiente tanto na abertura cervical, como no estímulo da atividade contrátil do miométrio (NUNES et al., 1999; KARTZ et al., 2000). Esse fármaco tem sido utilizado na obstetrícia pela ação útero tônica e amolecimento do colo uterino e cérvice, além de casos de indução do aborto legal, promovendo abertura cervical para procedimentos de curetagem, indução do trabalho de parto e no tratamento e prevenção de hemorragias pós-parto (SOUZA et al., 2010). Como descrito anteriormente, outros fármacos como agonistas β2-adrenérgicos, o clenbuterol, além de induzirem o relaxamento do miométrio promovem o estiramento in vitro das tiras cervicais (OWINY; FITZPATRICK, 1992; RAMOS; NORONHA, 2000), assim como a terbutalina que diminui a contratilidade da musculatura cervical (BRYMAN et al., 1986). A terbutalina associado ao misoprostol foi utilizado para promoção de dilatação cervical em IA transcervical, com sêmen fresco em ovelhas, entretanto, não foram encontradas diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo tratado com esta associação de fármacos e foi sugerido que o tempo entre a aplicação dos dilatadores e a IA, de 15 minutos, é insuficiente para a promoção do relaxamento da cérvice (BARBAS et al., 2001). Monte et al. (2011) utilizando ovelhas da raça Dorper mostraram que o grau de flexibilidade da cérvice foi superior nos animais tratados com ocitocina quando comparado ao grupo controle. Já nos animais tratados com associação de sulfato de terbutalina e misoprostol administrados por via vaginal 60 minutos antes da IA, o sucesso da tração cervical e consequentemente da IA intrauterina por via transcervical foi superior ao grupo tratado apenas com ocitocina 200 UI, I.V administrado 5 minutos antes da inseminação (100% vs 47,4%). Além disso, os mesmos autores observaram uma redução no tempo de inseminação artificial quando utilizou essa associação (terbutalina e misoprostol) em comparação aos demais grupos citados. A importância da maior flexibilidade cervical e um menor tempo de inseminação tem grande repercussão do ponto de vista do bem estar animal ao 39 promover menores traumas no ato da tração cervical, o que, inclusive, pode influenciar positivamente na fertilidade (REBASSA et al., 2007). Diante disto, inúmeros são os trabalhos que estão sendo desenvolvidos para aperfeiçoar a acessibilidade uterina pela via transcervical, e assim otimizar a técnica de IA transcervical. Entretanto, como foi abordado, as substâncias sintéticas disponíveis atualmente não são isentas de efeitos adversos. Assim, faz-se necessária a busca por novas substâncias com atividade sobre a contratilidade cervical, que sejam de baixo custo, fácil aquisição e seguras para serem utilizadas em animais. Neste cenário, as possíveis substâncias bioativas obtidas de produtos de origem natural, dentre estes os vegetais, são fontes de novos possíveis fármacos com atividade no sistema reprodutivo. 2.13 Considerações sobre o gênero Erytroxylum A família Erythroxylaceae compreende quatro gêneros: Erythroxylum P. Browne Aneulophus Benth, Nectaropetalum Engl e Pinacopodium Exell;Mendonça englobando cerca de 240 espécies e com endemismo na Venezuela, Brasil e Madagascar (DALY, 2004). A maioria das espécies pertence ao gênero Erythroxylum, que com cerca de 230 espécies é o maior gênero e o único representante da família na região Neotropical, (PLOWMAN; HENSOLD, 2004) com ampla distribuição nas regiões tropicais da Austrália, Ásia, África e Américas (LOIOLA, 2007). No Brasil há espécie do gênero Erythroxylum P. Browne nos mais diversos tipos de vegetação; desde as florestas úmidas da Amazônia e Mata Atlântica, até as matas secas do Cerrado e da Caatinga, reflexo da versatilidade ecológica do grupo (PLOWMAN; HENSOLD, 2004; DALY, 2004). O interesse pelo gênero intensificou-se no século XIX, após a descoberta das atividades farmacológicas apresentadas pelas folhas de Erythroxylum coca Lam., que, quimicamente, são caracterizadas pela presença de alcaloides do tipo tropano, dentre os quais destaca-se a cocaína, empregado como anestésico local em pequenas cirurgias durante muito tempo (BOHM et al., 1982; GRIFFIN; LIN 2000) 40 que posteriormente transformou-se em um grande problema de saúde pública por suas propriedades psicoativas (ALAGILLE et al., 2005; CHIN et al., 2006; QUEIROZ et al., 2009). Diversas espécies do gênero também foram investigadas quanto as possíveis atividades farmacológicas, dentre as quais: E. vacciniifolium, que detém os alcaloides tropânicos da série catuabina (A, B e C), mostrou efeito anti-HIV e contra infecções oportunas em pacientes com HIV (ZANOLARI et al., 2003); Já as Pervilleinas A e B, isoladas de E. pervillei, inibiram o crescimento de carcinoma de pele (MI et al., 2002), e outros tipos de alcaloides extraídos de E. rotundifolium também apresentaram atividade antitumoral (CHÁVEZ et al., 2002). A E. moonii apresentou atividade antimicrobiana frente as cepas de bactérias, fungos e leveduras, além de fornecer os alcaloides tropânicos mooniina A e B (RAHMAN et al., 1998). Os alcaloides tropânicos encontrados em algumas espécies vegetais destacam-se por desempenhar atividades farmacológicas como efeito analgésico, anestésico, anticolinérgico, antiemético, e anti-hipertensivo, entre outras atividades farmacológicas (GRYNKIEWICZ; GRADZIKOWSKA, 2008). De fato, alguns vegetais deste gênero apresentam propriedades antiinflamatória, antibacteriana, tônica e estimulante, atuando como um poderoso diurético, tratamento de afecções renais, vesiculares, doenças venéreas e distúrbios musculares (PLOWMAN; HENSOLD, 2004). Pertencente a este gênero a espécie Erythroxylum caatingae (Fig.3) (Quadro.1) tem como características botânicas arbusto ou arvoretas com até 3,0 m de altura e ramos não patentes, castanho-avermelhados e poucas lenticelas quando jovens. Seus catafilos são menores que as estípulas, adensados na base dos ramos jovens. As estípulas em média medem 3-4 mm comprimento, nérveas, estreitamente triangulares (LOIOLA et al., 2007). Tais características morfológicas são importantes para a identificação minuciosa da espécie, e a partir disso, as possíveis investigações bioquímicas e farmacológicas são conduzidas. 41 A B Figura 3. Representação das folhas (A) e flores (B) da espécie Erythroxylum caatingae. Fonte: http://www.univasf.edu.br/~hvasf/. Quadro 1: classificação botânica das espécies Erythroxylum caatingae CRONQUIST (1988). Reino Planta e Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Ordem Malpighiales Família Erythroxylaceae Gênero Erythroxylum Espécies Erythroxylum caatingae Neste sentido, quanto a sua atividade bioativa, recentemente foi observado que o extrato bruto da folha de Erythroxylum caatingae, assim como o alcaloide obtido deste vegetal apresentou atividade antimicrobiana e antitumoral (AGUIAR et al., 2012). Além disso, o extrato bruto de Erythroxylum caatingae desencadeou relaxamento da musculatura lisa de útero e traqueia de roedores (SANTOS et al., 2013; SILVA et al., 2010). Tais resultados ratificaram a potencial aplicabilidade de vegetais do gênero Erythroxylum no tratamento de doenças venéreas, amenorreia e hemorragias genitais e afecções respiratórias (GONZÁLEZ-GUEVARA et al., 2006; SILVA et al., 2001). Entretanto para validação de plantas potencialmente terapêuticas são necessárias diversas investigações que vão desde a relação medicina tradicional e popular; isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos; observação da estrutura/atividade e investigação farmacológica de extratos e/ou seus constituintes 42 químicos isolados e finalmente a operação de formulações para a produção de fitoterápicos (SANTOS et al., 2013). 43 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Avaliar a ação do Extrato Etanólico Bruto de folhas de Erythroxylum caatingae (EBEc) sobre a contratilidade da cérvice ovina. 3.2 Objetivos específicos - Avaliar a contratilidade in vitro de cérvice ovina exposta a concentrações crescentes de EBEc. - Verificar o efeito do EBEc sobre a contração in vitro de cérvice ovina induzida por cloreto de potássio (KCl). - Verificar o efeito do EBEc sobre a contração in vitro de cérvice ovina induzida por carbacol (CCh). - Verificar o efeito do EBEc sobre a amplitude da contração in vitro de cérvice ovina pré-incubada com atosibana. - Verificar a participação do óxido nítrico no relaxamento cervical induzido por EBEc. - Verificar o mecanismo de transdução intracelular através da utilização de bloqueadores da guanilato ciclase ou de canais para potássio ou cálcio no relaxamento cervical induzido pelo EBEc. - Avaliar o padrão de contração da cérvice de ovinos in vivo. - Avaliar o efeito do EBEc sobre a contração de cérvice de ovinos in vivo. 4. METODOLOGIA 44 4.1 Animais Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal, Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, Brasil (número 0008/261011). As cérvices ovinas foram cedidas pelo abatedouro localizado no município de Juazeiro (ABATAL Abatedouro Almeida Ltda, Inscrição Estadual: 72.756.197 NO). Decorrido o abate do animal, as cérvices foram imersas em solução nutritiva de Krebs (Em mM: NaCl – 118,0; KCl – 4,55; MgSO4 – 5,70; NaHCO3 - 11; CaCl2 – 2, 52; KH2PO4 – 1,10; Glicose 11, pH: 7,38 -7,42) e transportada em caixa térmica guarnecidas com gelo ao Laboratório de Pesquisas do Vale do São Francisco (LAPEVALE) da Universidade Federal do Vale do São Francisco. Foram utilizadas outras substâncias nutritivas, a exemplo da solução de Tyrode e de Jalon. Entretanto a que demonstrou o melhor resultado para a manutenção do tecido foi a solução de Krebs utilizada durante todo o experimento. 4.2 Material Botânico Foi utilizado extrato etanólico bruto obtido das folhas de Erythroxylum caatingae, fornecido por pesquisadores do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). As folhas de Erythroxylum caatingae Plowman foram coletadas na cidade de Souza, Paraíba, Brasil. As folhas secas e pulverizadas (500 g) foram maceradas com etanol a 95% à temperatura ambiente durante 72 h. A solução foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida em um evaporador ratativo a 50°C, produzindo 53 g de extrato etanólico (EBEc). 4.2.1 Preparação do extrato para os ensaios farmacológicos 45 O extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae (EBEc) foi solubilizado em cremofor (3% v/v) e diluído em água destilada até a concentração de 10 mg/mL (solução estoque). 4.3 Fármacos Para a execução dos protocolos experimentais foram utilizadas as seguintes drogas e reagentes: carbacol (Sigma-Aldrich®), cloreto de potássio (Vetec®), l-name (Sigma-Aldrich®), ODQ (Sigma-Aldrich®), atosibana (Sigma-Aldrich®), l-arginina (Sigma-Aldrich®) 4-aminopiridina (Fluka®), tetraetilamônium (Fluka®), glibenclamida (Sigma-Aldrich®), acetilcolina (Sigma-Aldrich®) e verapamil (Sigma-Aldrich®). 4.4 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS in vitro 4.4.1 Preparo do tecido As cérvices foram transferidas para placa de petri onde foram dissecadas para confecção dos segmentos da musculatura circular com cerca de 10 mm de comprimento. Em seguida os tecidos foram imersos em cubas (10 mL) contendo solução nutritiva de Krebs a 37°C, aerados e submetidos à tensão longitudinal de 1,5 g através de fios de algodão conectados a transdutores de força, MLT 0202 Pan Lab (PEREIRA et al., 2007). Os sinais das respostas isométricas dos tecidos foram condicionados e registrados em um sistema de aquisição computadorizado EFF321(Insight®, Brasil), representado na figura 4. 46 Figura 4. Esquema simplificado dos equipamentos utilizados nos experimentos de avaliação da contratilidade in vitro. 1) Transdutor de força (MLT 0202, Pan Lab); 2) Bomba de aeração; 3) Amplificador “bridge system” (Insight®, Brasil); 4) Sistema EFF-321(Insight®, Brasil); 5) Cuba de 10 mL; 6) Haste fixa; 7) Coletor (Adaptado de Jucá, 2011). 4.4.2. Avaliação in vitro do efeito do EBEc sobre a contração em cérvice ovina Após o período de estabilização, que variou entre 50-90 min., para análise da integridade do tecido foram obtidas contrações tônicas induzidas por 90 mM de KCl. A seguir o tecido foi lavado com solução de Krebs e, após estabilização do tônus basal, o tecido foi exposto a adição de Erythroxylum caatingae nas concentrações crescentes de 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.L-1, a intervalos de 5 minutos. 47 4.4.3. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Cloreto de Potássio em cérvice ovina Após o período de estabilização, para análise da integridade do tecido e do padrão de contração da cérvice ovina foram obtidas contrações tônicas induzidas por KCl (15-120 mM). A seguir o tecido foi lavado com solução de Krebs e após estabilização do tônus basal, foi induzida a contração com KCl 90 mM e após 5 minutos foram adicionadas a cuba, concentrações crescentes de EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos. 4.4.4. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Carbacol em cérvice ovina Após o período de estabilização, para análise da integridade do tecido e do padrão de contração da cérvice ovina, foram obtidas contrações tônicas induzidas por CCh (0,1-100 µM). A seguir o tecido foi lavado com solução de Krebs e após estabilização do tônus basal, foi induzida uma nova contração com CCh 30 µM e após 5 minutos foram adicionadas a cuba concentrações crescentes de EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos. 4.4.5. Investigação do efeito do EBEc sobre a amplitude da contração de cérvice ovina pré-incubada com atosibana Após período de estabilização e em tônus basal os segmentos foram préincubados com atosibana (10 µM), um inibidor de receptores para ocitocina. Decorridos 10 minutos. e ainda na presença deste antagonista ocitocinérgico adicionou-se concentrações cumulativas do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos. 4.4.6. Avaliação do possível envolvimento do óxido nítrico no relaxamento cervical induzido por EBEc 48 Passado o período de estabilização e em tônus basal os tecidos foram préincubados com 100 µM de L-NAME, um inibidor não seletivo da enzima óxido nítrico sintase (NOS), e após 10 minutos foram adicionadas as concentrações cumulativas do EBEc. Outro conjunto de segmentos foi pré-incubado com 100 µM de L-NAME e após 10 minutos foi adicionado 300 µM de l-arginina, um substrato para enzima NOS. Decorridos 10 minutos, foram adicionadas concentrações cumulativas do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos. 4.4.7 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Via GMPc Visando investigar o envolvimento do segundo mensageiro GMPc no efeito relaxante do EBEc em cérvice de ovelha foi utilizado um bloqueador da guanilato ciclase, o 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3,-a]quinoxalin-1-one (ODQ). Após intervalo de estabilização e em tônus basal, as preparações foram pré-incubadas com 5µM de ODQ por 10 minutos e na presença deste bloqueador foi adicionado concentrações cumulativas do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos. 4.4.8 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no relaxamento cervical induzido pelo EBEc: canais para Potássio (K+) Após período de estabilização e em tônus basal foi adicionado 1µM de glibenclamida, bloqueador seletivo para os canais para K ATP dependentes. Além disso, em outro grupo de amostras foram adicionadas 3mM de 4-aminopiridina (4AP), um bloqueador não seletivo dos canais Kv ou 0,3mM de Tetraetilamônio (TEA), um bloqueador de canais para K+ ativados por Ca2+ (BKCa). A seguir, na presença de um destes bloqueadores de canais para K+, foi adicionado concentrações crescentes do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos. 4.4.9 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Liberação de Ca2+ intracelular mediado por ligante 49 Após período de estabilização foi realizada uma contração com acetilcolina (ACh) (60 µM), considerada o controle, o tecido foi lavado. A seguir, e uma vez estabelecida a contração inicial, 3µM de verapamil foi adicionado a cuba e, decorridos 5 minutos, o tecido foi novamente estimulado com 60 µM de ACh. Por fim, após lavagem e período de estabilização foi adicionado na cuba de verapamil seguido de EBEc 729 μg.mL-1, para em seguida, a cérvice ser novamente estimulada com 60 µM de ACh. 4.5 PROTOCOLO EXPERIMENTAL in vivo 4.5.1. Avaliação da contração da cérvice ovina in vivo Foram utilizadas 05 ovelhas da raça Santa Inês, pluríparas, hígidas, com faixa etária entre dois a cinco anos, mantidas em regime intensivo de manejo, alimentadas diariamente com pasto de capim-elefante e concentrado a base de farelo de soja, milho e torta de algodão, fornecidos segundo recomendações para manutenção de animais do National Research Council (NRC,1985). Para análise da contração cervical, as fêmeas foram mantidas em estação, numa plataforma de contenção (Figura 5A). A seguir, foi realizada antissepsia com solução de iodopovidona 0,2%, para infiltração de 5 mL de lidocaína a 1,0% sem vasoconstrictor, com auxílio de agulha 22 G na região epidural entre as vértebras L 5S1. Após a promoção da anestesia epidural, realizou-se a higienização da região perineal com solução de NaCl 0,15 M, e a seguir, com auxílio de um espéculo vaginal visualizou-se a cérvice, e com o auxílio de duas pinças de Allis foi tracionada até o ponto mais próximo possível do vestíbulo vaginal (Figura 5B) segundo LopesJunior (2006). Com o auxílio de um mandril, uma sonda nasogástrica (BRASMED) n° 10 a qual foi acoplada em sua extremidade distal um balão de látex com diâmetro de ~2 cm foi introduzida no interior da cérvice (Figura 5C), o balão ficou acomodado ~3 cm adiante no canal cervical. Esta sonda foi a seguir conectada ao transdutor de pressão (MLT 1050) que foi acoplado ao sistema de aquisição de sinais biológicos (PowerLab®) e este integrado a um computador contendo um software específico (LabChart v4) que registrou todas as atividades de contração e relaxamento cervical ao longo de 60 minutos. 50 Figura 5: Representação de experimento para avaliação da contração cervical em ovinos in vivo. A. Animal em estação no sistema de contenção para inseminação artificial. B. Tração cervical com o auxílio de duas pinças de Allis e um espéculo vaginal. C. Inserção da cânula até 2º anel cervical D. Conexão da sonda contendo um balão posicionado na cérvice com o transdutor de força acoplado. Após registro do período basal durante 30 minutos, com auxílio de bomba de infusão contínua (Modelo EFF-311, Insight®) foi instilada 1 ml (taxa de infusão 0,1mL/min) de solução NaCl 0,15M (controle) através de uma sonda de polietileno (PE 10, DE 0.64mm e DI 0.28 mm) que foi posicionada a 0,5 cm do balão cervical. Decorridos 30 minutos foi instilado, mediante bomba de infusão, 1 ml da solução do EBEc na dose de 2 mg e a atividade cervical foi registrada ao longo dos 30 minutos seguintes. 4.6 Análise Estatística Foi utilizado o programa graphpad prism para a análise dos dados que foram expressos em percentagem relativa aos valores obtidos no período basal (contração inicial), de acordo com os diversos protocolos instituídos. Os resultados referentes à 51 CE50 (concentração efetiva para se obter 50% da resposta estimada em 100%) foram obtidos através da interpolação semi-logarítmica e expressos como média ± erro padrão da média. Para comparação dos dados intragrupos foi utilizado o método de análise de variância (ANOVA) seguido do teste post-roc Newman-Keuls, já as comparações intergrupos utilizou-se o teste “t” de student. Diferenças com p< 0.05 foram consideradas significativas. 52 5. RESULTADOS A figura 6 representa o efeito miorrelaxante concentração-dependente do EBEc sobre a cérvice ovina a partir da concentração 9 µg.mL-1, cujo relaxamento foi de 47,8 ± 6,5%, chegando aos 85,4 ± 5,1% quando o tecido foi incubado com 729 µg.mL-1, com obtenção final de uma EC50 17,9 ± 3,7 µg.mL-1. Figura 6. A. Representação quantitativa do efeito inibitório do EBEc sobre a contração cervical da cérvice ovina avaliada in vitro. B. Traçado qualitativo do efeito do EBEc sobre a contração cervical da cérvice ovina. Colunas indicam as médias e as linhas verticais representam o E.P.M. *p<0,05 vs. Contração inicial, após ANOVA seguido de Newman-Keuls. 53 Com a finalidade de avaliar a ação do EBEc sobre a contração induzida pelo agente despolarizante e contrátil KCl 90 mM, uma contração tônica foi induzida, como representada na figura 7B, em seguida foram adicionadas as concentrações cumulativas de EBEc, percebendo-se que a partir da concentração de 9 µg.mL-1 houve redução desta contração tônica em 16,4 ± 3,9%, com efeito máximo obtido com a concentração de 729 µg.mL-1 (17,7 ± 3,8%, ver figura 7A). Figura 7. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl 90 mM em cérvice ovina in vitro. A. Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice ovina pré-contraídos com KCl 90 mM. Colunas indicam as médias e as linhas verticais representam o E.P.M. *p<0,05 vs. Contração induzida por KCl, após ANOVA seguido de Newman-Keuls. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl em cérvice ovina. Quando foi induzida uma contração pelo agonista colinérgico carbacol 30 µM (Figura 8B), o EBEc na concentração 9 µg.mL-1 reduziu a contração em 23,1 ± 54 3,0%, tal efeito chegou a ordem de 47,0 ± 8,9% quando os segmentos foram incubados com 729 µg.mL-1, ver figura Figura 8A. Figura 8. Efeito do EBEc sobre a contração tônica induzida por CCh em cérvice ovina in vitro. A: Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice ovina pré-contraídos com CCh 30 µM. Colunas indicam as médias e as linhas verticais representam o E.P.M. *p<0,05 vs. Contração induzida por CCh, após ANOVA, seguido de Newman-Keuls. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por CCh em cérvice ovina. Considerando que a ocitocina é um hormônio largamente utilizado para dilatação cervical em medicina veterinária, partiu-se para avaliar o possível efeito do EBEc em receptores para ocitocina. Para isso os segmentos foram pré-incubados com atosibana na concentração 10 µM. Com isso, foi observado que não houve 55 diferença significativa do relaxamento induzido pelo EBEc nessas tiras préincubadas com atosibana, cujo relaxamento final com a concentração de 729 µg.mL1 foi de 73,3 ± 6,7 % em relação aos 85,4 ± 5,1% do grupo controle, além disso a CE50 foi de 11,8 ± 5,9 µg.mL-1, nesse grupo pré-incubado com atosibana (figura 9). Figura 9. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, 9, 27, 81, -1 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com atosibana 10 µM () ou não (, controle). Os valores foram expressos como percentual da contração controle. As barras verticais indicam o erro padrão da média (E.P.M.). Continuando a investigação do possível mecanismo envolvido no relaxamento induzido por EBEc, e considerando a atividade do NO em musculatura lisa de diversas porções do organismo, buscou-se avaliar se o EBEc interage em algum ponto da via de sinalização deste mediador biológico. Desta forma, foi observado na figura 10 que o L-NAME 100 µM reduziu significativamente o efeito relaxante cervical induzido pelo EBEc nas concentrações utilizadas, sendo que o efeito máximo relaxante produzido por EBEc 729 µg.mL-1 foi de apenas 32,3 ± 7,8%. Vale ressaltar que neste grupo, com as concentrações utilizadas neste trabalho, não foi possível determinar com precisão a CE50 (>729 µg/mL). Por outro lado, ao adicionarmos Larginina (300 µM) nas cubas contendo o L-NAME 100 µM, o relaxamento induzido pelo EBEc foi parcialmente restaurado (74,9 ± 3,1%), CE50 24,6 ± 11,5 µg.mL-1. 56 Figura 10. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, 9, 27, -1 81, 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com L-NAME 100 µM (), associação L-NAME 100 µM + L-arginina 300 µM () ou controle (, controle). Os valores foram expressos como percentual da contração controle. As barras verticais indicam o erro padrão da média (E.P.M.). * p< 0,05 vs. EBEc (controle), após teste “t” student. Deste modo foi iniciada a avaliação da possível via de transdução do sinal intracelular mediado pelo segundo mensageiro GMPc. Para tal as cubas foram préincubadas com ODQ 5 µM, inibidor da guanilato ciclase. Com isso a Figura 11 demonstra que o segmento cervical na presença de ODQ apresentou um menor padrão de miorrelaxamento quando comparado ao grupo controle nas concentrações 9, 81, 243 e 729 µg/mL (26,0 ± 5,9 vs. 47,8 ± 6,5%; 39,9 ± 8,1 vs. 57 75,7 ± 6,2%; 48,0 ± 6,3 vs. 76,8 ± 7,4%; 47,0 ± 7,6 vs. 85,4 ± 5,1%, respectivamente). Inclusive, a CE50 obtida nas cubas pré-incubadas com ODQ foi > 729 µg.mL-1. Figura 11. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, -1 9, 27, 81, 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina préincubados com ODQ 10 µM () ou não (, controle). Os valores foram expressos como percentual da contração controle. As barras verticais indicam o erro padrão da média (E.P.M.). *p< 0,05 vs. EBEc (controle), após teste “t” student. 58 Prosseguindo o estudo com a avaliação da participação dos canais para K + voltagem dependente nas cubas contendo 4-AP, houve um relaxamento cervical induzido por EBEc similar (relaxamento máximo 73,0 ± 3,1% e CE50 21,3 ± 8,6 µg.mL-1) ao observado nos segmentos incubados apenas com EBEc. Do mesmo modo, nas cubas em que foram adicionados as concentrações do EBEc na presença do TEA, o relaxamento cervical atingiu os 77,2 ± 10,0% na maior concentração do extrato, com CE50 de 13,5 ± 7,3 µg.mL-1. Ainda com relação ao bloqueio de canais para K+, a glibenclamida também não preveniu o efeito miorrelaxante induzido pelo EBEc, com relaxamento máximo de 79,6 ± 9,7% na concentração de 729 µg/mL, e CE50 9,8 ± 2,1 µg.mL-1. Figura 12. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, 9, 27, -1 81, 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com Tetraetilamônio 0,3 mM (TEA, ), Glibenclamida 1 µM () ou 4-aminopiridina 3 mM (4-AP, ). Os valores foram expressos como percentual da contração controle. As barras verticais indicam o erro padrão da média (E.P.M.). 59 Para avaliar o efeito do EBEc sobre a liberação de cálcio dos estoques intracelulares mediados por ligante, foram instituídos experimentos em cubas contendo o verapamil 3 µM. A contração induzida por Ach 60 µM causou uma contração fásica. Na presença do verapamil a contração foi de 41.3 ± 6.3% da contração inicial induzida por este agonista colinérgico. Quando o EBEc foi adicionado a cuba contendo verapamil, essa contração foi reduzida a 88.5 ± 2.2% da contração inicial induzida por ACh, ver figura 13. Figura 13. Efeito do EBEc sobre a contração in vitro induzida por Acetilcolina (ACh) em cérvice ovina. A. Representação qualitativa do efeito do verapamil, ou verapamil + EBEc sobre a contração induzida por ACh. Colunas indicam as médias e as linhas verticais representam o E.P.M. B. Representação gráfica quantitativa do efeito do verapamil (), ou verapamil + EBEc ( ) sobre a contração induzida por ACh. *p<0,05 vs. somente verapamil (controle) após teste “t” student. 60 Desta forma, obtidos bons resultados com relação à atividade miorrelaxante, iniciou-se a avaliação in vivo do efeito do EBEc em cérvice ovina. Com isso observou-se na figura 14 que a resposta contrátil da cérvice após o tratamento com solução salina 0,15M foi de 90,8 ± 6,6% da amplitude de contração basal. Entretanto a infusão de EBEc 2mg provocou um relaxamento da musculatura da cérvice uterina de 56,6 ± 8,7%, que perdurou ao longo dos 20 minutos seguintes (43,5 ± 9,0 % e 45,6 ± 7,3%, respectivamente 10 e 20 min.). Entretanto, decorridos 30 minutos da infusão, o efeito do EBEc foi dissipado e a amplitude da contração cervical voltou aos valores próximos aos iniciais (87,7 ± 9,4% da amplitude basal). 61 Figura 14. Avaliação do efeito do EBEc sobre a contratilidade cervical de ovinos in vivo (A) registro típico do traçado mostrando a diminuição da pressão intracervical de ovinos induzida pelo EBEc 2 mg (B) Gráfico mostrando os valores médios do efeito miorrelaxante do EBEc 2 mg sobre as contrações espontâneas da cérvice ovina. Os valores foram expressos como a percentagem da amplitude da contração basal do período controle. As colunas mostram a média e as linhas verticais mostram o desvio padrão dos dados (C) Esquema de avaliação da pressão intracervical de ovinos. (1) Balão cervical (2) Tubo de polietileno (PE 10). *p<0,05 vs. controle, após ANOVA seguido do teste de Newman-Keuls. 6. DISCUSSÃO 62 O presente estudo demonstrou que o EBEc possui efeito miorrelaxante concentração-dependente sobre a contratilidade de cérvice ovina. Nesse sentido, o extrato reduziu a resposta contrátil fásica e tônica aos agonistas colinérgicos, acetilcolina e carbacol, respectivamente, bem como ao agente despolarizante KCl. Já os bloqueadores de canais para K+ 4-AP, TEA e glibenclamida não preveniram esta resposta desencadeada pelo EBEc, podendo inferir que não há participação de canais Kv, BKCa e KATP para este efeito miorrelaxante. Entretanto, mesmo na presença de verapamil, a contração induzida pela ACh foi atenuada pelo EBEc, indicando que o efeito miorrelaxante promovido pelo EBEc envolva a redução da liberação de Ca2+ intracelular. De fato, como o L-NAME e o ODQ atenuaram tal resposta miorrelaxante induzida pelo EBEc, este efeito tem mediação da via NO com transdução intracelular pelo GMPc, reconhecido segundo mensageiro responsável pelo sequestro de Ca2+ do interior de células da musculatura lisa. Estes achados fortalecem os relatos na literatura acerca do potencial relaxante do EBEc em modelos experimentais de avaliação da contratilidade in vitro em musculatura lisa (AGUIAR, 2012; OLIVEIRA, 2011; REIS et al., 2010; OLIVEIRA, 2012; SANTOS et al., 2013). Entretanto, neste trabalho, além das evidências farmacológicas de que o EBEc apresenta efeito relaxante sobre a contratilidade in vitro da cérvice ovina, foi demonstrado também que este efeito pode ser reproduzido em modelo experimental de avaliação da contratilidade in vivo. Nesse contexto, vale destacar que a partir de trabalhos destinados a avaliação da contração uterina em ovinos, seres humanos e animais de experimentação (BENOUSSAIDH et al., 2005; CHUA et al., 1998; MIRABILE et al., 2000; MUELLER et al., 2006), foi adaptado um modelo para a avaliação da atividade cervical de fêmeas ovina adultas mediante a utilização de um balão acoplado a uma cânula, ambos preenchidos com líquido e conectados aos transdutores de pressão pertencentes ao sistema de aquisição de sinais biológicos. Tal metodologia foi capaz de captar variações na amplitude da contração cervical similares aos dados referentes ao tônus uterino para a espécie (MIRABILE et al., 2000). Portanto, esse estudo parece ser pioneiro quanto aos dados na literatura que tivemos acesso a respeito da avaliação in vivo de cérvice ovina, e da obtenção de resultados animadores quanto ao efeito de uma substância oriunda do sertão semiárido nordestino com propriedade miorrelaxante, o que abre novas perspectivas para a busca de novas substâncias que atuem como dilatador cervical ou tocolítico em 63 ovinos. Entretanto, esta metodologia de avaliação in vivo ainda é uma alternativa pouco viável para condições experimentais limitadas. Uma vez que o processo de pesquisa e desenvolvimento de fármacos é complexo, longo e de alto custo (LIMA et al., 2003), para uma investigação mais minuciosa acerca do possível mecanismo de ação de uma substância como o EBEc seriam necessários um quantitativo bastante expressivo de animais. Baseado nisso, nesta pesquisa foi utilizada uma metodologia que minimizasse o uso de animais para experimentação e ao mesmo tempo mantivesse a veracidade dos resultados, portanto optou-se pela avaliação da contratilidade cervical in vitro que, inclusive, constitui a base para estudos farmacológicos e desenvolvimento de fármacos, e já foi utilizada por outros autores nesta espécie (PARKINGTON, 1985; PEREIRA et al., 2007). Existem vantagens em utilizar as metodologias in vitro, as quais se destacam: a diminuição de intervenções dolorosas aos animais, a considerável praticidade, menor tempo para condução e baixo custo por não demandar um grande número de animais para sua realização, assim obedecendo ao princípio dos três “Rs” (reduction, refinement, replacement) (CAZARIN et al., 2004). Portanto, considerando estudos prévios quanto ao biopotencial do EBEc (OLIVEIRA et al., 2011; SILVA et al., 2010; SANTOS et al., 2013), foram feitos ensaios in vitro para avaliação das propriedades biológicas deste extrato em cérvice ovina. Entretanto, não pode deixar de serem mencionados alguns contratempos referentes à manutenção da viabilidade do tecido cervical durante o transporte, para isto o tecido foi armazenado em solução nutritiva de Krebs à temperatura ± 20°C. Não é de hoje que produtos naturais ocupam lugar de destaque como fonte de novos medicamentos. Inclusive, a ação desses produtos em órgãos compostos por músculo liso é extremamente importante, uma vez que podem atuar em processos fisiopatológicos de alguns órgãos e sistemas dos animais e seres humanos (GALVÃO et al., 2012; PEREIRA et al., 2004; TAKAHASHI, 1988). De fato, muitas pesquisas comprovam o efeito de produtos naturais sobre músculo liso, a exemplo de Soares (2008) que avaliou a ação miorrelaxante do extrato hidroalcóolico de Polygala paniculata L. em aorta isolada de rato através de ensaios in vitro e in vivo, assim como Murtala e Salahdeen (2012) que revelaram efeito miorrelaxante do extrato de T. procumbens em aorta. Com relação ao tecido uterino, em roedores, Martinez et al. (2010) demonstraram o efeito espasmolítico do extrato de folhas de Aloysia triphylla e 64 Chiwororo e Ojehole (2009) avaliaram efeito espasmolítico de Psidium guajava.Tais investigações científicas corroboraram o uso popular destes vegetais no combate às cólicas menstruais. Do mesmo modo, e baseado em evidências do potencial farmacológico dos produtos naturais na musculatura lisa, foram realizados protocolos experimentais com o EBEc e verificou-se que este extrato possui efeito miorrelaxante em traqueia, vaso e útero de roedores, dados que o incluíram no hall de produtos naturais com bioatividade antiespasmódica e/ou espasmolítica (SANTOS et al., 2013; SILVA et al., 2010). No intuito de expandir a utilidade farmacológica deste extrato e verificar o possível efeito em outra espécie, no presente trabalho verificou-se o efeito do extrato etanólico de EBEc no músculo cervical ovino e foi constatado que este extrato possui efeito miorrelaxante em segmentos de cérvice ovina a partir da concentração 9 µg/mL, relaxando 47,8% em comparação a variação da amplitude basal (p<0,05), sendo que até a concentração avaliada, 729 µg/mL, este relaxamento chegou a ordem de 85,4%. É de conhecimento comum que o efeito miorrelaxante de um extrato está relacionado à composição fitoquímica do extrato, à espécie animal de experimentação utilizado, bem como ao tecido envolvido na pesquisa. De fato, o extrato hidroalcoólico das folhas de Erythroxylum argentinum na concentração 0,25 a 2 mg/mL também diminuiu a contração máxima induzida por acetilcolina e ocitocina em útero de ratas (TAKAHASHI et al., 1988). Além disso, este mesmo extrato bruto das folhas de E. argentinum teve um efeito dose-dependente sobre a contração induzida por acetilcolina no músculo reto abdominal de sapo, indicando seu potencial antagonista para receptores nicotínicos (TAKAHASHI, 1988). Sabe-se que o útero possui uma rica inervação do sistema nervoso autonômico com origem no núcleo dorsal motor do vago (COLLINS et al., 1999; ORTEGA-VILLALOBOS et al., 1990) na coluna intermédia lateral da medula espinhal toracolombar e no núcleo sacral parassimpático (TRAURIG; PAPKA, 1993). Esse núcleo motor autonômico recebe informações das estruturas supraespinhais e periféricas. Os neurônios préganglionares de tais núcleos autonômicos estabelecem diversas sinapses nervosas com neurônios pós-ganglionares em uma gama de gânglios autonômicos pré e paravertebrais. As sinapses ganglionares são colinérgicas nicotínicas (PAPKA et al.,1995). Baseado nisso e considerando a presença de inervação adrenérgica e colinérgica no miométrio e no endométrio (TRAURING; PAPKA, 1993; TETSURO et al., 1994), foram desenvolvidos protocolos de avaliação do efeito do EBEc sobre a 65 contração cervical induzida pelo agonista colinérgico carbacol (CCh). Após a realização destes protocolos observou-se que o EBEc reduziu 46,1% da contração induzida pelo CCh. A partir deste resultado, surgiu um novo questionamento: será que o EBEc age bloqueando receptores muscarínicos para promover seu efeito espasmolítico em cérvice de ovelha? De fato, visto que os alcaloides tropanos apresentam potencial em bloquear receptores muscarínicos (SCHMELLER et al., 1995) e estes compostos já foram isolados de vegetais do gênero Erythroxylum (AGUIAR, 2012; OLIVEIRA, 2011) não descartamos a possibilidade destes compostos químicos serem responsáveis pelo efeito miorrelaxante na cérvice ovina. Vale salientar que no presente trabalho o EBEc 729 µg/mL também reduziu a contração induzida por K+ 90 mM em 17,75%. O K+ despolariza a membrana devido ao alto influxo de íons K+ resultando na abertura dos canais para K+ nas células da musculatura lisa, este influxo de íons K+ é seguido pelo fechamento dos canais para potássio voltagem dependentes Ca2+, o que resulta em um menor influxo de íons Ca2+ e o efeito de relaxamento. Em contrapartida, a inibição dos canais para potássio K+ leva a despolarização da membrana e o efeito de contração muscular (NELSON e QUAYLE, 1995). Neste contexto, avaliou-se o efeito relaxante do EBEc na presença e na ausência da 4-AP, um bloqueador seletivo dos Kv, e foi constatado que o EBEc não age via canais para potássio voltagem dependente. Uma vez que a 4-AP não antagonizou o efeito relaxante do EBEc, quando comparado ao grupo controle. Os canais Kv são abertos mediante a despolarização da membrana plasmática na musculatura lisa das células vasculares. O fluxo de íons K + através dos canais induz a repolarização da membrana para seu estado de repouso (KURIYAMA, 2007). Estes canais contribuem também para a regulação do potencial de membrana em células eletricamente excitáveis, entre elas as encontradas na musculatura lisa. Do mesmo modo, foram avaliados os canais para KATP, que estão presentes em diferentes tipos de músculo liso, sendo característica primordial a sua abertura ser inibida por concentrações basais de ATP intracelular, sulfoniluréias (ex. Gliblenclamida) e baixas concentrações de Ba (STANDEN et al., 1989; SANBORN, 2000). Sabe-se ainda que as correntes através dos KATP estão implicadas na função miometrial. Os ativadores dos KATP, como o pinacidil, diminuem as contrações uterinas, sendo mais potentes em miométrio não gravídico (SANBORN, 2000; NOVAKOVIC et al., 2007). Entretanto, no presente trabalho, o uso de Glibenclamida, bloqueador de canais para KATP dependente também não 66 demonstrou alteração no miorrelaxamento do extrato EBEc frente a cérvice ovina. Considerando que poucos canais BKCa precisam ser ativados para produzir relaxamento uterino, principalmente em úteros gravídicos, onde há uma maior expressão desses canais (BRAINARD; KOROVKINA; ENGLAND, 2007), foi avaliado a possível participação dos canais BKCa no miorrelaxamento induzido pelo extrato EBEc. Entretanto o bloqueador TEA não preveniu o relaxamento cervical induzido pelo EBEc. Diante disto, ressaltamos que utilizamos tiras de cérvice de animais não prenhes, e sabendo que existem mudanças morfofisiológicas de acordo com o estado reprodutivo do animal, isto pode ter interferido na bioatividade da substância teste (AUGHEY et al., 1983; PEREIRA et al., 2007). A presença de bloqueadores de canais para K+ estudados não interferiu no efeito do EBEc sobre a contração cervical, sugerindo que o EBEc desencadeia mecanismo de ação diferente da ativação de canais para K+. Neste sentido, assim como o NO vários outros agentes promovem seus efeitos relaxantes em musculatura lisa por meio do aumento da atividade da guanilato ciclase solúvel, que por sua vez induz a produção de GMPc (FORSTERMAN et al., 1986; IGNARRO et al., 1986). Considerando esta sequencia de eventos na sinalização mediada pelo NO em musculatura lisa, como a cérvice (TEIXEIRA, 2006), foram realizados protocolos mediante a incubação com L-NAME ou ODQ, inibidores da enzima óxido nítrico sintase e guanilato ciclase solúvel, respectivamente, seguidos da adição do EBEc. Nesse sentido foi observado que ambos os fármacos diminuíram significativamente o efeito relaxante mediado pelo EBEc em cérvice ovina, resultados que sugerem que o mecanismo deste relaxamento no canal reprodutivo de ovinos é provavelmente mediado pela ativação da enzima NOS, seguidos da sinalização intracelular advindo do aumento do GMPc intracelular, que dentre outros efeitos coordena o aumento da captação de Ca2+ citosólico para o retículo sarcoplasmático e isto promove o relaxamento muscular (EMILIANO, 2002). Além da participação do NO, a motilidade uterina é controlada por hormônios esteroides e peptídicos, a exemplo, da ocitocina, prostaglandinas e neurotransmissores liberados pelo sistema nervoso autonômico (HARPER, 1994). Dessa forma, o sistema nervoso autonômico controla a motilidade uterina através de várias vias. Sabe-se ainda que as vias colinérgicas desenvolvem um papel importante no controle da motilidade uterina (SATO et al., 1996). Os neurônios parassimpáticos pós-ganglionares não sintetizam e liberam apenas acetilcolina 67 (PAXINOS ; WATSON, 1998), mas também outros importantes mediadores como o NO2, dessa forma conclui-se que o sistema nervoso central pode usar um ou vários mecanismos no controle da motilidade uterina, ativação neuroendócrina libera ocitocina, ativando as várias vias autonômicas. Em adição, a resposta tecidual de extratos pode ser influenciada por diferenças fisiológicas e anatômicas, tal como presença de receptores diversos a depender do órgão alvo, além disso, é possível que as fases estrais influenciem no padrão de resposta contrátil advinda da exposição do miométrio ao extrato. De fato a indução de estro em ratas induz um aumento no número de receptores para ocitocina no miométrio, assim como em outros músculos lisos do trato gastrointestinal (RAMSEY, 2011). A ocitocina que é liberada na corrente sanguínea pelos terminais neuronais (RUSSEL et al., 2003) alcança o útero e se liga aos receptores ocitocinérgicos, acoplados a proteína G e ativa a via do fosfatidilinositol intracelular responsável pela liberação do Ca2+ intracelular responsável por desencadear a contração muscular (WHITEAKER et al., 1995; FRANCZAK et al., 2005; HIRST et al., 2005). Já é bem documentado na literatura o uso de ocitocina como estimulante para contrações uterinas, que apresentam uma alta resposta contrátil na presença de baixas concentrações de ocitocina (KINSLER et al., 1996). No miométrio a afinidade dos receptores ocitocinérgicos aumenta no decorrer da gestação (ANOUAR et al.,1996). Por outro lado, os inibidores de ocitocina parecem reduzir a atividade da contração uterina tanto in vivo quanto in vitro (BERKLEY, 1993). Essa redução na atividade se exemplifica quando observada a administração do peptídeo ocitocina/V1a, atosibana, um peptídeo que age como antagonista da ocitocina, e é administrado em mulheres durante o trabalho de parto (DALLE et al., 2000). Já foi demonstrado na literatura que o atosibana reduz as contrações espontâneas do miométrio in vitro. Sabe-se ainda que a inibição da produção de prostaglandina está associada a uma pequena incidência de junções gap, resultando em uma queda nos receptores para ocitocina no miométrio e endométrio de ovelhas (GARFIELD et al., 1980; WU et al., 1999). Deste modo e considerando a utilização da ocitocina na medicina veterinária como agente relaxante cervical (STELLFLUG et al., 2001) e contracturante uterino (KINSLER et al., 1996), surgiu a possibilidade do EBEc estar agindo através de receptores ocitocinérgicos. Deste modo os segmentos foram pré-incubados com atosibana, antagonista do receptor para ocitocina que age indiretamente ao prevenir 68 o aumento do cálcio intracelular em resposta ao aumento de trifosfato de inositol induzido pela ocitocina, entretanto na presença de atosibana não foi constatado inibição do relaxamento cervical induzido pelo EBEc. A contração no músculo liso é composta por duas fases: um componente fásico rápido seguido por um lento mais sustentado, o componente tônico (BOLTON, 1979). Esta resposta bifásica acontece devido à fonte dupla de Ca2+ no músculo liso (meio extra e intracelular). Os agonistas colinérgicos com atividade contrátil sobre a musculatura lisa podem se ligar aos receptores acoplados à proteína Gq ativando uma cascata de fosfoinositídios através da produção de IP3 que, ao se ligarem aos receptores para rianodina, desencadeiam a liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático (FUKATA; AMANO; KAIBUCHI, 2001). A elevação da [Ca2+]c, também pode ocorrer através de receptores para rianodina e estimular a entrada de Ca2+ através dos múltiplos tipos de canais, incluindo canais de membrana para Ca2+ operados por estoque, por receptor ou por voltagem (SANDERS, 2001; McFADZEAN; GIBSON, 2002). Segundo Jim et al. (1981), o influxo de Ca2+ acontece principalmente através dos canais para Ca2+ voltagem dependente, uma vez que a contração tônica é suprimida pelo bloqueador de canais para Ca2+ dependente de voltagem do tipo L, o verapamil. Considerando o possível envolvimento da variação da concentração intracelular de Ca2+ no relaxamento cervical ovino induzido pelo EBEc e na tentativa de excluir o influxo de cálcio Ca 2+ advindos do meio extracelular, utilizou-se o verapamil neste trabalho (GOULART, 2003). Após pré incubarmos o segmento cervical com verapamil, houve redução da resposta contrátil a acetilcolina em 41,3% e, ao ser adicionado o extrato na cuba, esta contração foi reduzida para 88,5%. Esta mudança de resposta tecidual na presença do EBEc sugere que o mecanismo de ação envolva redução dos níveis de cálcio advindo do meio citosólico, provavelmente, mediado pelo GMPc. Segundo Santos (2013) o mecanismo de ação pelo qual os extratos de Erythroxylum spp. exercem efeito em traqueia isolada de cobaia em parte pode envolver alteração do influxo de Ca2+, levando assim a uma diminuição das concentrações intracelulares desse íon e, consequentemente o relaxamento muscular. Entretanto, como descrito anteriormente, não descartamos a possibilidade do EBEc desempenhar um antagonismo com receptores colinérgicos, uma vez que outros extratos oriundos do gênero Erythroxylum desempenham tal efeito farmacológico (CHIN et al., 2007). 69 Alguns estudos foram realizados para avaliar a contratilidade cervical ovina in vitro (PARKINGTON, 1985; PEREIRA et al., 2007) ou in vivo (AYAD et al., 2004), mas a maioria da pesquisas in vivo que utilizam diversos tratamentos farmacológicos tomam como referência da dilatação cervical a distância que o aparelho de inseminação consegue progredir além do óstio cervical (FALCHI et al., 2012; LEETHONGDEE et al., 2007; NAQVI et al., 1998; PERRY et al., 2010). No presente estudo foram avaliados os possíveis efeitos locais in vivo do EBEc 2 mg sobre a contratilidade cervical de ovinos através da monitoração das variações da pressão cervical. A aplicabilidade deste método foi satisfatório, mas duas ovelhas foram excluídas do estudo, porque aparentemente, ambas tinham o trato reprodutivo infantis, e o balão cervical não pode ser introduzido adequadamente no canal cervical. Com a realização destes protocolos, corroboramos os ensaios in vitro, uma vez que o EBEc induziu o relaxamento da musculatura da cérvice uterina, efeito que perdurou ao longo dos 20 minutos subsequentes. Entretanto, o efeito do EBEc foi dissipado aos 30 minutos do término da infusão, isto pode ser reflexo da absorção da substância após este período e/ou metabolização do extrato. Considerando o tempo necessário para realização de uma possível inseminação artificial em torno de 10-20 minutos, o EBEc possui potencial para ser utilizado como ferramenta farmacológica para tal biotécnica em ovinos. Apesar de ter sido relatada a intoxicação em ovinos por folhas de Erythroxylum deciduum pela via digestiva (BORELLI et al., 2011), nenhum sinal foi detectado na presente pesquisa e o seu efeito miorrelaxante in vivo, de fato corroborou os achados in vitro deste trabalho, e com o potencial miorrelaxante do gênero observados em roedores (OLIVEIRA et al., 2012; SANTOS, 2013). Diante do observado neste trabalho, a utilização do EBEc pode ser promissora na rotina da inseminação artificial transcervical em ovinos. Entretanto, estudos devem ser realizados para determinar a dose mínima eficaz para a dilatação cervical e os efeitos deste extrato sobre a motilidade uterina, o transporte de espermatozóides e a fertilidade dos animais. Vale salientar que em virtude do material analisado ser um extrato etanólico de um vegetal, e, portanto composto por várias substâncias diferentes, ainda não podemos determinar qual o composto responsável por este efeito miorrelaxante. 70 Uma vez que a ciência está em constante desenvolvimento, a busca do princípio ativo presente neste extrato é alvo de futuros estudos com tal espécie. 7. CONCLUSÃO No estudo do efeito do extrato etanólico bruto de folhas de Erythroxylum caatingae em cérvice ovina, bem como do mecanismo de ação, pode-se concluir que: - O extrato etanólico inibiu as contrações isométricas basais de segmentos de cérvice ovina; - O extrato etanólico reduziu a contração tônica induzida tanto pelo potássio quanto pelo carbacol, sendo que tal efeito foi mais intenso na contração induzida pelo carbacol, indicando o envolvimento de um processo fármaco-mecânico. - Este efeito miorrelaxante é mediado pelo óxido nítrico, através da via de transdução orquestrada pelo GMPc. - O extrato etanólico reduziu a contração cervical de ovino induzida pela acetilcolina, na presença de verapamil, indicando o envolvimento de um sequestro de cálcio intracelular. - O extrato etanólico tem efeito local ao reduzir a pressão intracervical de ovinos. 71 8. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA AB'SABER, A. N. O domínio morfoclimático das caatingas brasileiras. São Paulo, Instituto de Geografia, USP, Geomorfologia, 1974. n. 43. AB'SABER, A. N. Problemática da desertificação no Brasil intertropical. São Paulo, Instituto de Geografia, USP, Geomorfologia, 1977, n. 53. ACOG Committee Opinion. Antenatal corticosteroid therapy for fetal maturation. Number 147-December 1994. Committee on Obstetric Practice. American College of Obstetricians and Gynecologists. Int J Gynaecol Obstet. 1995. v.48. n3, p.340-2. AGUIAR, J. S. et al. Antimicrobial, antiproliferative and proapoptotic activities of extract, fractions and isolated compounds from the stem of Erythroxylum caatingae Plowman. Int. J. Mol. Sci., Basel, 2012. v. 13, n. 4, p. 4124-4140. AISEN, E.G. Reproduccion ovina y caprina. Buenos Aires: inter Médica, 2004.216 p. 72 AKATA, T. Cellular and molecular mechanisms regulating vascular tone . Part 1 : basic mechanisms controlling cytosolic Ca concentration and the Ca dependent regulation of vascular tone, 2007. p.220–231. ALAGILLE, D.; BALDWIN, R.M; ROTH, B.L.; WROBLEWSKI, J.T.; GRAJKOWSKA, E. ; TAMAGNAN, G.D.. Functionalization at position 3 of the phenyl ring of the potent mGluR5 noncompetitive antagonists MPEP. Bioorganic ; Medicinal Chemistry Letters, 2005. V.15.p 945–949. ALBERTS, B. A.; JOHNSON, J.; LEWIS, M.; RAFF, K.; ROBERTS, P. WALTER, P. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. arland Science, New York. 2002. ALBUQUERQUE, U.P.; ANDRADE, L.H.C. Uso de plantas em uma comunidade rural no semi-árido do estado de Pernambuco, município de Alagoinha (Nordeste do Brasil). Interciência, 2002.v.26, n.7, p.336. AL-OMARI WR, AL-SHAMMAA HB, AL-TIKRITI EM, AHMED KW. Atosiban and nifedipine in acute tocolysis: a comparative study. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006. n 128, p.129-34. ANOTAYANONTH S; SUBHEDAR N.V; NEILSON J.P; HARIGOPAL S. Betamimetics for inhibiting preterm labour (Cochrane Review). In: The Cochrane Library, Issue 1, 2007. Oxford: Update Software. ANOUAR A; CLERGET M.S; DURROUX T; BARBERIS C; GERMAIN G. Comparison of vasopressin and oxytocin receptors in the rat uterus and vascular tissue. Eur J Pharmacol, 1996. V. 308, p. 87–96. ARGIOLAS A; MELIS M.R The neurophysiology of the sexual cycle. J Endocrinol Invest, 2003. V.26 , p.20–22. AUGHEY E, CALDER AA, COUTTS JR, FLEMING R, MCMANUS TJ, MUNRO. CD.Pregnancy-associated changes in the physical and microscopic characteristics of the ovine cervix. J Anat. 136(Pt 2):389-99, 1983. AX, R.L., et al. Artificial insemination. In: HAFEZ, E.S.E. ; HAFEZ, B. Reproduction in Farm Animals. 7º ed. Philadelphia: Lippincott Williams ; Wilkins, 2000. P.376-389. AYAD V.J, LEUNG S.T, PARKINSON T.J, WATHES D.C. Coincident increases in oxytocin receptor expression and EMG responsiveness to oxytocin in the ovine cervix at oestrus. Anim Reprod Sci. 80(3-4):237-50, 2004. 73 BARBAS, J.P; GONÇALVES, S.C.; MARQUES, C.C; HORTA, A.E.M. efeito da aplicação vaginal de agentes dilatadores do cérvix durante a fase folicular do ciclo em ovelhas. iii congresso ibérico de reprodução animal, 2001. p. 299-307. BEAVO, J.A. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: functional implications of multiple isoforms. Physiol. Rev, 1995. v. 75, p.725-745. BENOUSSAIDH A, MAURIN Y AND RAMPIN O Spinal effects of oxytocin on uterine motility in anesthetized rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2004. v.287:p. 446–453. BERKLEY K.J; HUBSCHER C.H; WALL P.D. Neuronal responses tostimulation of the cervix, uterus, colon, and skin in the rat spinal cord.J Neurophysiol, 1993.v. 69: p.545–556. BERRIDGE, M. J.; BOOTMAN, M. D.; RODERICK, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular cell biology, 2003.v.4, n.7. p. 517–29. BICUDO, S.D. ; SOUSA, D.B. Associação de progestágeno, prostaglandina e ecg em protocolo de curta duração para indução/sincronização do estro em ovelhas suffolk. Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, Porto Seguro – BA. Anais, 2003. BITTAR, R. E.; CARVALHO, M.H.B.; ZUGAIB, M. Condutas para o trabalho de parto prematuro.Rev. Bras. Ginecol. Obstet. [online]. 2005, vol.27, n.9, p. 561-566 BODIN, L.; DRION, P.V.; REMY, B.; BRICE, G.; COGNIÉ, Y.; BECKERS, J.F. AntiPMS Gantibody levels in sheep subjected annually to oestrus synchronization. Reproduction Nutrition Development, 1997. v.37, p.651-660. BOHM, B.A.; GANDERS, F.R. ; PLOWMAN, T. 1982. Biosystematics and evolution of cultivated coca (Erythroxylaceae). Systematic Botany v.7, p.121133. BOLOTINA, V. M.; NAJIBI, S.; PALACINO, J. J.; PAGANO, P. J.; COHEN, R. Nitric oxide directly activates calcium-dependent potassium channels in vascular smooth muscle. Nature, 1994. v. 362, p. 850-853. 74 BOLTON T.B. Mechanism of action of transmitters and other substances on smooth muscle. Physiol Rev, 1979. V.59: 606-718. BOOTMAN, M. D.; COLLINS, T. J.; PEPPIATT, C. M.; PROTHERO, L. S., MACKENZIE, L.; DE SMET, P.; TRAVERS, M., et al. Calcium signalling-an overview. Seminars in cell ; developmental biology, 2001. v.12, n.1, p.3–10. BORELLI, V. et al.Intoxicação espontânea e experimental por folhas e frutos de Erythroxylum deciduum (cocão) em ovinos no Estado de Santa Catarina. Pesq. Vet. Bras. 2011, vol.31, n.3, pp. 213-218 BOSSMAR T, AKERLUND M, FANTONI G et al. — Receptors and myometrial responses to oxytocin and vasopressin in pre-term and term human pregnancy: effects of the oxytocin antagonist atosiban. Am J Obstet Gynecol, 1994;171:1634-1642. BOWERS, M. D.; Stamp, N. E.; Ecology 1993, 74, 1778 BRAINARD A.M; KOROVKINA V.P. ENGLAND S.K. Potassium channels and uterine function. Semin Cell Dev Biol, 2007. v.18. n.3, p.332-9. BRASIL, Ministério da Saúde RENISUS. Relação nacional de plantas medicinais de interesse ao SUS. Espécies vegetais. Disponível em: <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/RENISUS.pdf>. Acesso em: 12 Março. 2013. BRYAN N.S.; GRISHAM M.B.; Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med, 2007.v.43, n.5, p.645-57. BRYMAN I, NORSTROM A, LINDBLOM B. Influence of prostaglandins and adrenoceptor agonists on contractile activity in the human cervix at term. Obstet Gynecol, 1986. v.67. p. 574-578. CABAR, F.R.; BITTAR, R.E.; GOMES, C.M.; ZUGAIB, M. O atosibano como agente tocolítico: uma nova proposta de esquema terapêutico. Rev. Bras. Ginecol. Obstet. [online]. 2008, v.30, n.2, pp. 87-92 CAMARGO J.R. O campo das plantas medicinais do Brasil: lições de uma história. Hist. Cienc. Saúde-Manguinhos Rio de Janeiro, Jan-Mar, 2006. v. 13 n. 1. 75 CARMICHAEL M.S, HUMBERT R, DIXEN J, PALMISANO G, GREENLEAF W DAVIDSON CARTER C.S Oxytocin and sexual behavior. Neurosci Biobehav Ver, 1992. v.16, p.131–144. CARVALHO, D. M., SOUSA, J. P. Análise da Cadeia Produtiva da Caprinoovinocultura em Garanhuns. UFRPE/CNPQ. Garanhuns, 2008. CASTELLETTI, C.H.M., J.M.C. SILVA, M. TABARELLI ; A.M.M. SANTOS.. Quanto ainda resta da Caatinga? Uma estimativa preliminar. In: J.M.C. Silva, M. Tabarelli, M.T. Fonseca ; L.V. Lins (orgs.). Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, 2004.p. 91-100. CAZARIN, K.C.C; CORREA, C.L.; ZAMBRONE, F.A.D. Redução, refinamento e substituição do uso de animais em estudos toxicológicos: uma abordagem atual. Rev. Bras. Cienc. Farm. [2004, v.40, n.3, p. 289-299. CHEMINEAU, P.; COGNIÉ, Y.; GUÉRIN Y.; ORGEUR, P.; VALLET, J.C. Training manual on artificial insemination in sheep and goats. Animal Production and Health, Rome: FAO, 1991. n.83,.p. 222. JONES W.P; WAYBRIGHT T.J; MCCLOUD T.G; RASOANAIVO P; CRAGG G.M; CASSADY J.M; KINGHORN A.D. Tropane aromatic ester alkaloids from a large-scale re-collection of Erythroxylum pervillei stem bark obtained in Madagascar. J Nat Prod. 2006 March; v. 69, n.3, p. 414–417. CHIWORORO W.D.; OJEWOLE J.A. Spasmolytic effect of Psidium guajava Linn. (Myrtaceae) leaf aqueous extract on rat isolated uterine horns. Journal of Smooth Muscle Research, 2009. v.45, n.1, p.31-8. CHUA S; LEE, M; VANAJA K; CHONG Y.S; NORDSTROM L, ARULKUMARAN S. The reliability of catheter-tip transducers for the measurement of intrauterine pressure in the third stage of labour. Br J Obstet Gynaecol. 1998. V.105, n3. P.352-6. COELHO, T.H.; OLIVEIRA, S.M. Aula Teórico-Prática: REGULAÇÃO DO TONO VASCULAR, 2002.Porto. 76 COIMBRA-FILHO, A.F.; CÂMARA, I.G. Os limites originais do bioma Mata Atlântica na região Nordeste do Brasil. Fundação Brasileira para Conservação da Natureza, 1996, Rio de Janeiro. COLLINS J.J.; LIN C.E.; BERTHOUD H.R.; PAPKA R.E.; Vagal afferents from the uterus and cervix provide direct connections to the brainstem. Cell and Tissue Research. 1999. v.295, p.43–54. Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil , CNA, 2007 CORDELL, G. Phytochemistry, 2000, 55, p.463. In: CALIXTO, J. B. Estudo farmacológico pré-clínico de plantas medicinais. In: CALIXTO, J. B.; YUNES, R. A. Plantas medicinais sob a ótica da Química Medicinal Moderna. Santa Catarina: ed. Argos, 2001, p. 77-99. COSTA, R.S.A; ASSREUY J. Multiples potassium channels mediate nitric oxideinduced inhibition of rat vascular smooth cell proliferation. Nitric oxide, 2005. v.13. p.145-151. CRUZ, A. D.; CARDOSO, E.; CRUZ, J. F.; LOPES, A. L.; LEÃO, M. R.; CRUZ, M. H. C; OLIVEIRA, B. F. L. Inseminação artificial cervical e por laparoscopia utilizando sêmen congelado em ovelhas da raça Santa Inês. IV CONGRESSO NORDESTINO DE PRODUÇÃO ANIMAL, Petrolina, 2006. Anais..., Petrolina, 2006, p. 1117-1120. CUNNINGHAM FG, LEVENO KJ, BLOOM SL, HAUTH JC, GISTRAP III LC, WENSTROM KD. WILLIAMS obstetrics. 22nd ed. New York: McGraw-Hill; 2005. p. 855-80. DALLE LUCCA J.J; ADEAGBO A.S; ALSIP N.L. Oestrous cycle and pregnancy alter the reactivity of the rat uterine vasculature. Hum Reprod ,2000. V. 15: 2496– 2503. DALY, D.. Erythroxylaceae. In: N. Smith; S.A. Mori, A. Henderson et al. (eds.). Flowering Plants of Neotropics. USA, The New York Botanical Garden. Princeton University Press, 2004.p.143-145. DEVONISH, E.; ROBERTS, E.; HUNTE, M.; THOMAS, G. Use of exogenous oxytocin in non-surgical artificial insemination of the Barbados Blackbelly sheep, Barbados, Groelândia, 2003. In: Ministry of Agriculture and Rural Development, Greenland, St. Andrew, Barbados 2003. 77 DIAS R.G.; NEGRÃO C.E.; KRIEGER M.H. Nitric oxide and the cardiovascular system: cell activation, vascular reactivity and genetic DONOVAN, A.; HANRAHAN, J.P.; KUMMEN, E.; DUFFY, P.; BOLAND, M.P. Fertility in the ewe following cervical insemination with fresh or frozen–thawed semen at a natural or ynchronised oestrus. Animal Reproduction Science, 2004 v.84, p.359–368. DONOVAN, A.; HANRAHAN, J.P.; LALLY, T.; BOLAND, M.P.; BYRNE, G.P.; DUFFY, P.;LONERGAN, P.; O’NEILL, D.J.. AI for sheep using frozen-thawed semen. In: End of Project Report: Sheep Series, 2001. n. 11. ELLWOOD, D.A., The hormonal control of connective-tissue changes in the ovine cervix in pregnancy and at parturition. Biochem. Soc. Trans., 1980. V.8: p. 662-667. EMILIANO,A.F. Efeito vasodilatador do Extrato Hidro-alcoólico da Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt e Smith no leito vascular mesentérico de rato, 2002. EVANS, G.; MAXWELL, W.M.C, Fisiologia de La reprodución em ovejas e cabras. In: inseminación Artificial de Ovejas e Cabras. 1 ed. Argentina:Acribia, S.A., 1990, P.4155. FALCHI L.; TAEMA M.; LA CLANCHE S.; SCARAMUZZI R.J.; The pattern of cervical penetration and the effect of topical treatment with prostaglandin and/or FSH and oxytocin on the depth of cervical penetration in the ewe during the peri-ovulatory period. Theriogenology, 2012. v.15, n 2, p.376-84, Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2012 FORSTERMAN U, HERTTING G, NEUTANG B. The role of endothelial and nonendothelial prostaglandins in the relaxation of isolated blood vessels 1986. v.87. p. 21-32. FUKATA, Y.M.; AMANO, M.; KAIBUCHI. Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of non muscle cells.Trends Pharmacol Sci v.22, p. 32-9, 2001. 1986. 78 GARCIA, C. A. Ovinocultura e Caprinocultura. Marília: Universidade de Marília, 2004. 22 f. Apostila. GIULIETTI, A.M., et al. 2004. Diagnóstico da vegetação nativa do bioma Caatinga. In: J.M.C. Silva, M. Tabarelli, M.T. Fonseca ; L.V. Lins (orgs.). Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. pp. 4890. Ministério do Meio Ambiente, Brasília. GOBBO-NETO, L.; LOPES, N.P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Quím. Nova, 2007. vol.30, n.2 p. 374-381. GONZALES, F.H.D. Introdução à endocrinologia reprodutiva veterinária. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 2002. GOODMAN, L. S.; GILMAN, A. G. As bases farmacológicas da terapêutica, 10. ed., Rio de Janeiro:McGraw-Hill, 2005. p.1647. GOULART, M.G.V. Efeitos do Verapamil (Dilacoron), bloqueador dos canais de calcio, na regenaração do figado de ratos apos hepatectomia parcial; Unicamp, 2003. GRAVES C.R. Fármacos que Provocam Contração ou Relaxamento do Útero, em: Goodman ; Gilman — As Bases Farmacológicas da Terapêutica, 8ª Ed, New York, McGraw-Hill, 1996; 693-700. GRIFFIN, W.J. ; LIN, G.D. Chemotaxonomy and geographical distribution of tropane alkaloids.Phytochemistry, 2000.v.53, p.623-637. GRYNKIEWICZ, G. AND GADZIKOWSKA, M. 2008. Tropane alkaloids as medicinally useful natural products and their synthetic derivatives as new drugs. Acta Pol Pharm – Drug Res, 2008, v.60,p. 439-463 GUYTON, A. C.; HALL, J. E.; Tratado de fisiologia médica, 11. ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. HAFEZ, E.S.E.; HAFEZ, B. Reprodução Animal. 7. ed., São Paulo: Manole, 2004. HALBERT, G.W.; et al. The structure of cervical canal of the ewe. Theriogenology, 1990. v.33, p.977-992. 79 HARPER M.J.K. Gamete and zygote transport. In: The Physiology of Reproduction, edited by Knobil E and Neill JD. New York: Raven, 1994, p. 123–187. HARVEY, A. Natural products as a screening resource. Current Opinion in Chemical Biology, 2007. v. 11, p. 480–484. HARVEY, A. Strategies for discovering drugs from previously unexplored natural products. Drug Discovery Today, 2000. v. 5, p. 294-300. HIRST J.J; PARKINGTON H.C; YOUNG I.R; PALLISER H.K; PERI K.G; OLSON D.M. Delay of preterm birth in sheep by THG113.31, a prostaglandin F2alpha receptor antagonist. Am J Obstet Gynecol, 2005. V.193, p.256–266. IAMS JD, CREASY RK. Preterm labor and delivery. In: Creasy RK, Resnik R, Iams JD, editors. Maternal-fetal medicine: principles and practice. 5ed. Philadelphia: Saunders; 2004. p. 623-61. IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística). Mapa de vegetação do Brasil. IBGE, Rio de Janeiro, 1993. IBGE :: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2005 IBGE :: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2010 IBGE :: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2010. IGNARRO I.J.; BYRNS R.E.; WOOD K.S. Biochemical and pharmacological properties of endothelium-derived relaxing factor and its similarity to nitric oxide radical. In: Vanhoutte PM. Vasodilatation: vascular smooth muscle, peptides, autonomic nerves and endothelium. New York: Raven Press, 1988. p 427-36. IGNARRO L.J; WOOD K.S; BYRNS R.E. Pharmacological and biochemicalis closely related to nitric oxide (NO) radical. Circulation 1986; 74: II287. INTERAMINENSE, L.F.L.; DE SIQUEIRA, R.J.B.; XAVIER, F.E.; DUARTE, G.P.; MAGALHÃES, P.J.C.; DA SILVA, J.K.; MAIA, G.S.; SOUSA, P.J.C.; LEALCARDOSO, J.H.; LAHLOU, S. Cardiovascular effects of 1-nitro-2- henylethane, 80 the main constituent of the essential oil of Aniba canelilla, in spontaneously hypertensive rats. Fundam. Clin. Pharmacol, 2010. J.M. Plasma oxytocin increase in the human sexual response. J Clin Endocrinol Metab, 1987, v. 64, p.27–31. JENKS M.A; Tuttle H.A; Feldmann K.A. The vegetable materia medica of western India. Phytochemistry, 1996. v.42, p. 29-33. JIM K, HARRIS A, ROSENBERGER L.B, TRIGGLE D.J.Stereoselective and nonstereoselective effects of D 600 (methoxyverapamil) in smooth muscle. Eur J Pharmacol, 1981. v.76, p. 67-72. JUCÁ, D.M. Propriedades farmacológicas dos monoterpenos α- e β- Pineno no músculo liso gastrintestinal de ratos: efeito miorrelaxante e pró-cinético. 87 f. Dissertação - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, 2007. KAABI, M.; ALVAREZ, M.; ANEL, E.; CHAMORRO, C.A.; BOIOXO, J.C.; PAZ, P.; ANEL, L. Influence of breed and age on morphometry and depth of inseminating catheter penetration in the ewe cervix: a postmortem study. Theriogenology, 2006. V.66, p.1876-1883. KATZ R.L. Antiarrhythmic and cardiovascular effects of synthetic oxytoxin. Anesthesiology, 1964; v.25, p.653-661. KERSHAW, C.M.; KHALID, M.; MCGOWAN, M.R.; INGRAM, K.; LEETHONGDE E, S.; WAX, G.; SCARAMUZZI, R.J. The anatomy of the sheep cervix and its influence on the transcervical passage of an inseminating pipette into the uterine lumen. Theriogenology, 2005.v.64, p.1225-1235. KING J.F; FLENADY V.J; PAPATSONIS D.N.M; DEKKER G.A; CARBONNE B. Calcium channel blockers for inhibiting preterm labour (Cochrane Review). In: The Cochrane Library, Issue 1, 2007. KING, M.E.; MCKELVEY, W.A.C.; DINGWALL, W.S.; MATTHEWS, K.P. GEBBIE, F.E.MYLNE, M.J.A.; STEWART, E.; ROBINSON, J.J. Lambing rates and litter sizes followingintrauterine or cervical insemination of frozen/thawed semen with or without oxytocin administration. Theriogenology, 2004. v.62, p.1236-1244. 81 KOBAYASHI S, KITAZAWA T, SOMLYO A.V, SOMLYO A.P. Cyitosolic heparin inhibits muscarinic and a-adrenergic Ca2+-release in smooth muscle: physiological role of inositol 1,4,5-triphosphate in pharmacomechanical coupling. J Biol Chem, 1989. V.264: 17997-18004. KRUIP, Th. A. M.; Van REENEN, C. G. New biotechniques and their consequences for farm animal welfare. Reproduction in Domestic Animals.2000. v.35, p.247-252. KURIYAMA, H.; KITAMURA, K.; NABATA, H. Pharmacological and physiological significance of ion channels and factors that modulate them in vascular tissues. Pharmacological Reviews, v. 47, n. 3, p. 387-573, 1995. KUTCHAN T.M; Herbal mixtures in the traditional medicine of Eastern Cuba. Plant Physiol, 2001.v.125. p.58-62. LAVOIR, C. E BETTERIDGE, K. The use of prostaglandins and oxytocin for transcervical recovery of bovine fetuses at days 33-58 of gestation. Journal of Reproduction and Fertility, 1996. v.106, p. 95-100 LEAL, I.R., M. TABARELLI ; J.M.C. SILVA. Ecologia e conservação da Caatinga. Editora Universitária, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil, 2003. LEDGER, W.L.;WEBSTER, M.; ANDERSON, A. E TURNBULL, A. Effect of inhibition of prostaglandin synthesis on cervical softening and uterine activity during ovine parturition resulting from progesterone withdrawal induced by epostane. J. Endocrinol., 1985. v.105 , n.2. p. 227-233. LEETHONGDEE S.; KHALID M.; BHATTI A.; PONGLOWHAPAN S.; KERSHAW C.M.; SCARAMUZZI R.J. The effects of the prostaglandin E analogue Misoprostol and follicle-stimulating hormone on cervical penetrability in ewes during the peri-ovulatory period. Theriogenology, 2007. v.67, n.4, p.767-77. LEONE A.M, PALMER R.M.J, KNOWLES R.G, FRANCIS P.L, ASHTON D.S, MONCADA S. Constitutive and inducible nitric oxide synthases incorporate molecular oxygen into both nitric oxide and citrulline. J Biol Chem, 1991. v.266. n.237 p. 90-5. LIMA, J. S.; REZA, D. L.; TEIXEIRA, S.; COSTA, C. Pesquisa clínica: fundamentos, aspectos éticos e perspectivas. Revista da Sociedade de Cardiologia do Estado do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2003. v.16, n.4, p.225-233. 82 LOIOLA, M. I. B.; AGRA, M; F.; BARACHO, G, S., QUEIROZ, R T. Flora da Paraíba, Brasil: Erythroxylaceae Kunth. Acta Bot. Bras.[online], 2007. v.21, n.2, p. 473-487. LOIOLA,M..I.B.; AGRA, M.F; BARACHO, G.S; QUEIROZ, R.T. Flora da Paraíba, Brasil: Erythroxylaceae Kunth.Acta Bot. Bras. [online]. 2007, v.21, n.2 LONGO, M.; JAIN, V; VEDERNIKOV, Y.P.; HANKINS, G.D.V.; . GARFIELD. R.E; SAADE ,G.R. Effects of L‐type Ca‐channel blockade, K+ATP‐channel opening and nitric oxide on human uterine contractility in relation to gestational age and labour. Mol Hum Reprod. 2003 Mar;9(3):159-64. LOPES JÚNIOR, E. S. et al. Influência dos níveis plasmáticos de progesterona sobre a resposta ovariana e produção embrionária de ovelhas Morada Nova (variedade branca). Acta Vet. Sci., v. 34, supl. 1, p. 510, 2006. LOSCALZO, R.C.J. Vascular nitric oxide: formation and function. J Blood Med, 2010. v.1. p.147-62. LUZ, S. L. N.; NEVES, J. P.; GONÇALVES, P. B. D. Parâmetros utilizados na avaliação do sêmen congelado ovino para inseminação laparoscópica. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. 2000. v. 37, n. 2, p. 10-18. MALAFAIA O.; Campos A.C.L; Torres O.; Goldenberg S. Os fitoterápicos e seu potencial na cicatrização em cirurgia. Acta Cirúrgica Brasileira. 2006, 21: 1-2. MALUENDAS, E. W. B.; PEITZ, C. Yerbalatina Phytoatives, a menor distância entre você e a natureza. In: JÚNIOR, C. C.; GRAÇA, L. R.; SCHEFFER, M. C. Complexo Agroindustrial das Plantas Medicinais, Aromáticas e Condimentares no Estado do Paraná – Diagnóstico e Perspectivas. Santa Catarina: Sociedade Paranaense de Plantas Medicinais, 2004. p. 208-211. MATSUDA, N. M., LEMOS, M. C. ; FEITOSA JR, R. L.. Effect of nitric oxide inactivators and guanylate cyclase on nitrergic nerve-induced relaxations of human and opossum lower esophageal sphincter (LES). Fundamental ; Clinical Pharmacology, 2008. v.22, p. 299-304. McCHESNEY, J. D.; VENKATARAMAN, S. K.; HENRI, J. T. Plants natural produtcts: Back to the future or into extinction. Phytochemistry, 2007. v. 68, p. 2015-2022. 83 McFADZEAN, I.; GIBSON, A. The developing relationship between receptoroperated and store-operated calcium channels in smooth muscle. The British Journal of Pharmacology, 2002. v. 135, p. 1-13,. MIES FILHO, A. Inseminação Artificial. 6 a edição. Porto Alegre: Sulina, 1987. 750p. MIRABILE C.P JR; MASSMANN G.A; FIGUEROA J.P. Physiologic role of nitric oxide in the maintenance of uterine quiescence in nonpregnant and pregnant sheep. Am J Obstet Gynecol. 2000, v.183, n.1, p.191-8. MITTERMEIER, R.A., C.G. MITTERMEIER, P. ROBLES GIL, J. PILGRIM, G.A.B. DA FONSECA, T. BROOKS ; W.R. KONSTANT (eds.). Wilderness: earth’s last wild places. Cemex, Agrupación Serra Madre, S.C., México, 2002. MONCADA S.; PALMER R.M.J.; HIGGS E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 1991;43(2):109-42. MONCADA S.; RADOMSKI M.W.; PALMER R.M.J.; Endothelium-derived relaxing factor: identification as nitric oxide and role in the control of vascular tone and platelet function. Biochem Pharmacol. 1988. v.37, p.2495-2501. MONTER,H.P.;MARTÍNEZ, E.F.; ORTIZ,M.I. MONTIEL, M.R.; -ELIZALDE, D.C; HERNÁNDEZ, N.P;CORTÉS, R.C. Spasmolytic and anti-inflammatory effects of Aloysia triphylla and citral, in vitro and in vivo studies J. Smooth Muscle Res. (2010) 46 (6): 309–319 309. MOREIRA, T.M.S.; SALGADO, H.R.N.; PIETRO, R.C.L.R. O Brasil no controle de qualidade de plantas medicinais. Ver. Bras. Farmacognosia, p 436. 2010. MOUTQUIN JM, SHERMAN D, COHEN H, MOHIDE PT, HOCHNER-CELNIKIER D, FEJGIN M, et al. Double-blind, randomized, controlled trial of atosiban and ritodrine in the treatment of preterm labor: a multicenter effectiveness and safety study. Am J Obstet Gynecol. 2000; v.182, n.5, p.1191-9. MUELLER, A.; THEODOROS, M.; HOFFMANN, I; MATTHIAS, W. BECKMANN; DITTRICH, R. Extracorporeally perfused nonpregnant swine uteri:amodel for evaluating uterine contractility, peristalsis and TRANSPORT MECHANISMS Medical hypotheses and research,v. 3,n. 2, 2006. 84 MURPHY M.R, CHECKLEY S.A, SECKL JR; LIGHTMAN S.L Naloxone inhibits oxytocin release at orgasm in man. J Clin Endocrinol Metab 1990. V.71, p.1056– 1058. NAQVI, S.M.K.; JOSHI, A.; MATHUR, A.K.; BAS, S.; MITTAL, J.P. Intrauterine artificial insemination of Malpura ewes in natural estrus with frozen ram semen. Small Ruminants Research, v. 29, p.329-333, 1998. NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of sheep. 6.ed. Washington, D.C.: National Academy Press, 1985. 99p. NELSON, M.T.; QUAYLE, J.M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. Am. J. Physiol. 1995. V. 268: C799–C822. NOGUEIRA FILHO, A.; KASPRZYKOWSKI, J. W. A.. O agronegócio da caprinoovinocultura no Nordeste brasileiro. Fortaleza: Banco do Nordeste do Brasil,2006. (Série Documentos do Etene, n.09) NOVAKOVIC R; MILOVANOVIC S; PROTIC D, DJOKIC ; HEINLE H, GOJKOVICBUKARICA L. The effect of potassium channel opener pinacidil on the nonpregnant rat uterus. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2007. V. 101, n.3, p.181-6. NUNES F., RODRIGUES R., MEIRINHO M. Randomized comparison between intravaginal misoprostol and dinoprostone forcervical ripening and induction of labor. Am J Obstet Gynecol, 1999, v.181, n.3, p. 626-629. NUNES, H.; ZANINE, A. de M.; MACHADO, T.M.M.; CARVALHO, F.C. de. Alimentos alternativos na dieta dos ovinos: uma revisão. Archivos Latinoamericanos de Producción Animal, 2007. v.15, p.141-158. O’BRIEN, W. The role of prostaglandins in labor and delivery. Clin. Perinatol., 1995. V.22, n.4, p. 973-984. of the rabbit induced by acetylcholine and bradykinin. Br. J. Pharmacol. OIGMAN, W.; FRITSCH, M.T. Drogas reninaangiotensina, Hiperativo, 1998. v.5, n.2. que intervêm no sistema 85 OKAWA T, VEDERNIKOV YP, SAADE GR, GARFIELD RE. Effect of nitric oxide on contractions of uterine and cervical tissues from pregnant rats. Gynecol Endocrinol. 2004. V.18, n.4, p.186-93. OLIVEIRA, A. C. et al. Erythroxylum pungens elicits vasorelaxation by reducing intracellular calcium concentration in vascular smooth muscle cells of rats. Rev. Brasileira de Farmacognosia., Curitiba, 2012. v. 22, n. 2, p. 436-442,. OLIVEIRA, S. L. et al. Tropane Alkaloids from Erythroxylum caatingae Plowman. Chemistry ; Biodiversity, Zürich, 2011. v. 8, n. 1, p. 155-165. OPPELT, D.M. Papel das reservas intracelulares de cálcio no efeito de aminoácidos excitatórios sobre a fosforilação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) em hipocampo de ratos jovens. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2002. ORTEGA-VILLALOBOS M; GARCIA-BAZAN M; SOLANO-FLORES L.P; NINOMIYAALARCON J.G; GUEVARA-GUZMAN R; WAYNER M.J. Vagus nerve afferent and efferent innervation of the rat uterus: an electrophysiological and HRP study. Brain Res Bull, 1990.v. 25.p. 365–371. OSMERS, R., RATH, W., ADELMANN-GRILL, B.C., FITTKOW, C., SZEVERENYI, M., KUNH, W. Collagenase activity in the human cervix uteri after prostaglandin E2 application during the first trimester. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 1991, v.42, p. 29-32 OWINY, J.R., FITZPATRCK, R.J. The effect of administration of Clenbuterol (4amino a- [(tert-butyl-amino) methyl]-3,5-dichlorbenzoylalcohol), a b2-mimetic, and of sodium meclofenamate, a prostaglandin synthetase inhibitor, on cervical ripening in periparturient sheep. Animal Reproduction Science, 1993. 27 : 41-48 OZAKI, A.C; DUARTE, P.C. Fitoterápicos utilizados na medicina veterinária em cães e gatos, Infarma, 2006. v.18, nº 11/12. PAGE, C.; CURTIS, M.; SUTTER, M.; WALKER,M; HOFFMAN, B. Farmacologia Integrada. 2º ed. Barueri, SP: Manole, 2004. PAPATSONIS D; FLENADY V; COLE S; LILEY H. Oxytocin receptor antagonists for inhibiting preterm labour (Cochrane Review). In: The Cochrane Library, Issue 1, 2007. 86 PAPKA R.E; MCNEILL D.L; THOMPSON D; SCHMIDT H.H. Nitric oxide nerves in the uterus are parasympathetic, sensory, and contain neuropeptides. Cell Tissue Res, 1995. V.279. p. 339–349. PAPKA R.E; TRAURIG H.H. Autonomic efferent and visceral sensory innervation of the female reproductive system: special reference to neurochemical markers in nerves and ganglionic connections. In: Nervous Control of the Urogenital System, edited by Maggi CA. Chur, Switzerland: Harwood Academic, 1993p. 423–466. PARK J.S; PARK C.W; LOCKWOOD C.; NORWITZ E.R. Role of cytokines in preterm labor and birth. Min Ginecol. 2005. V. 57, p.349-66. PARKINGTON H.C. Some properties of the circular myometrium of the sheep throughout pregnancy and during labour. The Journal of Physiology 1985, V.359, 1-15. PAXINOS, G.; WATSON,C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. San Diego, California: Academic Press, 4 ed.,1998. PEREIRA, R. B. Efeito da Doença Periodontal sobre a Reatividade Vascular de Camundongos Ateroscleróticos Tese (doutorado) 72 f.: – Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da Saúde, 2008 PERES, L. E. P. Metabolismo Secundário. Piracicaba – São Paulo: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. ESALQ/USP, p. 1-10, 2004. PERRY K; HARESIGN W; WATHES D.C; KHALID M. Intracervical application of hyaluronan improves cervical relaxation in the ewe. Theriogenology, 2010. v.74, p.1685-1690,. PLOWMAN TC, HENSOLD N. Names, types and distribution of neotropical species of Erythroxylum(Erythroxylaceae). Brittonia, 2004. V.56,p.1-53. PRADO, D. As caatingas da América do Sul. In: I.R. Leal, M. Tabarelli ; J.M.C. Silva (eds.). Ecologia e conservação da Caatinga. pp. 3-73. Editora Universitária, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil, 2003. 87 PRANCE, G.T. 1987. Vegetation. In: T.C. Whitmore ; G.T. Prance (eds.). Biogeography and Quaternary history in tropical. PUPO, M.T.; GALLO, M. B. C. Biologia Química: uma estratégia moderna para a pesquisa em produtos naturais. Química Nova, 2007. v. 30, n. 6, p. 1446-1455,. QUEIROZ E.F; ZANOLARI B; MARSTON A; GUILET D; BURGENER L; PAULO M.D.E. Q; HOSTETTMANN K. Two new tropane alkaloids from the bark of Erythroxylum vacciniifolium Mart. (Erythroxylaceae). Nat Prod Commun, 2009. v.4. p. 1337-1340. RABASSA, V.R.; TABELEÃO, V.C.; PFEIFER, L.F.M.; SCHNEIDER, A.; ZIGUER, E.A.; SCHOSSLER, E.; SEVERO, N.C.; PINO DEL, F.A.B.; CORRÊA, M.N. Efeito das técnicas transcervical e laparoscópica sobre a taxa de prenhez de ovelhas inseminadas em tempo-fixo. Ciência Animal Brasileira, 2007. v.8, n.1, p.127-133. RAMOS, F. E NORONHA DA SILVEIRA, M. Agonistas adrenérgicos b2 e produção animal: I mecanismo de acção. Revista. Portuguesa de Ciências Veterinárias, 2000. Vol XCV, nº 535: 99-110. RANG, H. P. DALE, M. M.; RITTER, J. M.; MOORE, P. K. Farmacologia. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. REIS, M.R; ALBUQUERQUE, J.M; TAVARES, J.F; SILVA, D.F. Efeito vasodilatador do extrato metanólico de Erythroxylum caatingae Plowman sobre anéis mesentéricos de ratos espontaneamente hipertensos Revista de Ciências Médicas e Biológicas, 2010. RUSSELL J.A; LENG G; DOUGLAS A.J. The magnocellular oxytocinsystem, the fount of maternity: adaptations in pregnancy. Front Neuroendocrinol, 2003.v.24, p. 27–61. SALAHDEEN, H.M.; MURTALA, B.A Vasorelaxant effects of aqueous leaf extract of Tridax procumbens on aortic smooth muscle isolated from the rat. J. Smooth Muscle Res. (2012) 48 (2;3): 37–45 SAMPAIO, B. R.; SAMPAIO, Y. DE S. B.; LIMA, R. C.; VIEIRA, A. A.; SAMPAIO, G. R. Perspectivas para a caprinocultura no brasil: o caso de pernambuco.IN: XLIV CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ECONOMIA E SOCIOLOGIA RURAL. SOBER: ANAIS... Fortaleza. 23-27 Julho de 2006. 88 SAMPAIO, G. R. Perspectivas para a caprinocultura no brasil: o caso de pernambuco.IN: XLIV CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ECONOMIA E SOCIOLOGIA RURAL. SOBER: ANAIS... Fortaleza. 23-27 Julho de 2006. SAMPAIO, Y. ; J.E.M. BATISTA. Desenvolvimento regional e pressões antrópicas no bioma Caatinga. In: J.M.C. Silva, M. Tabarelli, M.T. Fonseca ; L.V. Lins (orgs.). Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. P. 311-324. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, 2004. SANBORN, B. M. Relationship of Ion Channel Activity to Control of Myometrial Calcium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation, v. 7, p. 4–11, 2000. SANDERS, K. M. Mechanisms of calcium handling in smooth muscles. Journal of Applied Physiology, 2001. v. 91, p. 1438-1449. SANTOS, A.S.S.; SILVA, M.V.R.;OLIVEIRA, S.L. et al., Avaliação da atividade relaxante do extrato etanólico bruto obtido de Erythroxylum caatingae, Erythroxylum subrotundum e Erythroxylum revolutum (erythroxylaceae) em traquéia isolada de cobaia. Evolvere Scientia, v. 1, n. 1, p. 119-133, 2013. SAYRE B.L.; LEWIS G.S.; Fertility and ovum fertilization rate after laparoscopic or transcervical intrauterine artificial insemination of oxytocin-treated ewes. Theriogenology. v. 48. n.2. p.267-75. 1997. SCHMELLER, T. F. SPORER, M.; SAUERWEIN, M. Binding of tropane alkaloids to nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors. Pharmazie. 1995. v. 50. p. 493-495. SHYKEN J.M; PETRIE R.H.The use of oxytocin. Clinics in Perinatology, 1995;22:907-931. SILVA G.L.; CUI B.; CHAVEZ D; et al. Modulation of the multidrug-resistance phenotype by new tropane alkaloid aromatic esters from Erythroxylum pervillei. Journal of Natural Products. 2001. v.64. p.1514–1520. SILVA, F.P.R, RAMOS,M.S. PARTATA; A.K. Misoprostol: propriedades gerais e uso clínico. Revista Científica do ITPAC, Araguaína, v.6, n.4, Pub.3, Outubro 2013. 89 SILVA, M. TABARELLI, M.T. FONSECA ; L.V. LINS (orgs.). Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, 2004.p. 91-100. SILVA, P.L. Ação antiespasmódica do trans-cariofileno e o bloqueio de canais para Ca em músculo liso traqueal de rato f:95 – Fortaleza, 2010. SIMPLÍCIO A.A.; FREITAS J.V.F.; FONSECA J.F. Biotécnicas da reprodução como técnicas de manejo reprodutivo em ovinos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.31, p.234-246, 2007. SIMPLÍCIO, A.A. A caprinovinocultura na visão do agronegócio. Revista Conselho Federal de Medicina Veterinária, Brasília/DF, 2001.n.24, ano VII, p.15-18,. SIQUEIRA, R.J.B. Efeito do estragol sobre o potencial de ação composto de nervo vago de ratos. 176 F. tese (doutorado) Universidade Federal do Ceará, Faculdade Medicina, 2011. SOMLYO, A. P.; SOMLYO A. V. Ca Sensitivity of Smooth Muscle and Nonmuscle Myosin II: Modulated by G Proteins, Kinases, and Myosin Phosphatase. Physiol Ver. 2003. v. 83, p. 1325–1358. SOUZA, A.S.R.S; LIMA, M.MS.L; AMORIM, M.M.R.A, MORON, A.F., DINIZ, C.P. Efeitos hemodinâmicos da nifedipina na inibição do trabalho de parto premature. FEMINA | Agosto 2008 | vol 36 | nº 8 491 A 496. SOUZA, J.D.F; SOUZA, O.R.G; CAMPEÃO, P. Mercado e comercialização na ovinocultura de corte no Brasil. Agricultura e Desenvolvimento rural com sustentabilidade. 50º Congresso da Sober. Vitória, 2012. STANDEN, N.B., QUAYLE, J.M., DAVIES, N.W., BRAYDEN, J.E., HUANG, Y. NELSON, M.T. Hyperpolarising vasodilators activate ATP-sensitive K+ channels in arterial smooth muscle. Science 1989. v.245, p. 177–180.. STELLFLUG J.N; WULSTER-RADCLIFFE M.C; HENSLEY EL; COWARDIN E.A; SEALS R.C; LEWIS G.S. Oxytocin-induced cervical dilation and cervical manipulation in sheep: effects on laparoscopic artificial insemination. Journal of Animal Science. 2001. v.79. n.3. p.568-73. 90 TAKAHASHI, R. N; CALIXTO, J.B; COSTA, I.M et al. Análise química e perfil farmacológico do Erythroxylum argentinum. Acta Amazônica, v. 18 (suplemento), 1988. n. 1-2, p. 407- 424. TETSURO et al., J. Auton. Pharmacol., 14: 213-227, 1994. TREVISAN, A. Expressão gênica e protéica do canal de cálcio do tipo L e seu envolvimento com o mecanismo de secreção de insulina em ilhotas de langerhans de ratos submetidos à restrição protéica e suplementados com leucina. Universidade Estadual de Campinas. Instituo de Biologia. Campinas, SP, 2010. VANNESTE, G.;DHAESE, I.; SIPS, P.; BUYS, E.; BROUCKAERT, P. ; LEFEBVRE, R. A.. Gastric motility in soluble guanylate cyclise alfa 1 knock-out mice. Journal of Physiology, 2007. v.584, p. 907-920. VANZOLINI, P.E.; RAMOS-COSTA, A.M.M.; VITT. L.J.. Répteis das Caatingas. Academia Brasileira de Ciências, Rio de Janeiro, 1980. variant. Arq Bras Cardiol. 2011. v. 96, n.1, p.68-75. VASCONCELOS, V.R.; VIEIRA, L.S. A evolução da caprino-ovinocultura brasileira. Embrapa Caprinos, 2005. Disponível em < http://www.cnpc.embrapa.br/artigos.htm >. VIANA. PANORAMA GERAL DA OVINOCULTURA NO MUNDO E NO BRASIL. Porto Alegre: 2008 .v. 12, Ano 4. WALLAART T.E; PRAS N; BEEKMAN A.C; QUAX W.J Seasonal variation of artemisinin and biosynthetic precursors in plants of Artemisia annua of different geographical origin: Proof for the existence of chemotypes. Planta Med, 2000. V. 66.p. 57-62. WEBB, R. C. Smooth muscle contraction and relaxation. Advances in Physiology Education, 2003. v. 27, p.201-206. WESTERHAUSEN-LARSON, A.; OWINY, J.R.; NATHANIELSZ, P.W. et al. Type XIV collagen in the pregnant ovine cervix is removed during labor in a leucocyte mediated process. J. Soc. Gynecol. Invest., 1996. v.3, n.2 WHITEAKER S.S; MIRANDO M.A; BECKER W.C; PETERS D.N. between phosphoinositide hydrolysis and prostaglandin F2 Relationship secretion in 91 vitro from endometrium of cyclic pigs on day 15 postestrus. Domest AnimEndocrinol, 1995. 12,95–104. WIDMAIER, E. P. Fisiologia Humana - Os Mecanismos das Funções Corporais Editora Guanabara Koogan. 2006 WU, W. X.; VERBALIS, J. G.; HOFFMAN, G. E.; DERKES, J. A.; NATHANIELSZ, P. W. Characterization of oxytocin receptor expression and distribution in the pregnant sheep uterus. Endocrynology, 1996b. v. 137, n. 2, p. 722-728,. WULSTER-RADCLIFFE, M.C.; WANG, S.; LEWIS, G.S. Transcervical artificial insemination in sheep: effects of a new transcervical artificial insemination instrument and traversing the cervix on pregnancy and lambing rats. Theriogenology, 2004. v.62, p.990-1002,. YAMAGUCHI, E.T.; CARDOSO, M.M.S.C; TORRES, M.L.A.Ocitocina em cesarianas: qual a Melhor Maneira de Utilizá-la?. Rev. Bras. Anestesiol. [online]. 2007, vol.57, n.3, pp. 324-350. YUNES, R. A; KUROSHIMA, K. N.; de CAMPOS, F de SOUZA, M. M.; DELLE MONACHE, F.; CECHINEL FILHO, V. Phytochemical and pharmacological investigations of Virola oleifera leaves. Z Naturforsch [C]. 56: (9-10) 703-6 2001. ZHENG X. Antihyperglycemic activity of Selaginella tamariscina (beauv.) spring. Journal of Ethnopharmacology, 2011. v. 133, p. 531–537. ZUANAZZI J.A., TREMEA V., LIMBERGER R.P., SOBRAL M. ; HENRIQUES AMÉLIA T. Alkaloids of Erythroxylum (Erythroxylaceae) species from Southern Brazil. Biochem. Sys. Ecol. 2001. v.29, p.819-825.