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AVALIAÇÃO QUALITATIVA DE OOCISTOS DE Cryptosporidium sp. EM
AMOSTRAS FECAIS DE PACIENTES ATENDIDOS NO INSTITUTO
FERNANDES FIGUEIRA/FIOCRUZ
TATIANA VALENTIM¹; SERGIAN VIANNA CARDOZO2
1
Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas (Escola de Ciências da Saúde, Unigranrio); 2Docente do Curso de Ciências Biológicas
(Escola de Ciências da Saúde, Unigranrio).* [email protected], Rua Professor José de Souza Herdy, 1160. CEP 25071-200, Duque
de Caxias, RJ.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar qualitativamente através da técnica de safranina-azul de metileno a
prevalência de oocistos de Cryptosporidium sp. nas fezes de pacientes que deram entrada no Instituto
Fernandes Figueira/ FIOCRUZ. Contudo, 50 amostras foram coletadas e acondicionadas em frascos contendo
formalina a 5% e em seguida encaminhadas para o laboratório de Parasitologia da UNIGRANRIO, sendo
submetidas à técnica de centrifugo-sedimentação e posteriormente coradas pela técnica safranina-azul de
metileno para determinar através da microscopia em positiva ou negativa. As amostras foram divididas de
acordo com ambulatório correspondente a especialidade que solicitou o exame, sendo assim em ambulatório
de ginecologia onde tiveram nove amostras positivas e 10 negativas num total de 19 amostras avaliadas, e
ambulatório de pediatria que tiveram 18 amostras positiva e 13 negativas num total de 31 amostras
analisadas. Das 50 amostras juntando os dois ambulatórios obtivemos um total de 27 amostras positivas que
corresponde a 57% e 23 amostras negativas que correspondem a 43%. Fica evidente a eficácia que técnica
safranina azul de metileno é especifica na identificação de oocistos de Cryptosporidium sp. bem como
necessária para adequação na pesquisa de rotina laboratorial para saúde pública, para melhor terapia evitando
continuas dispersões no ambiente e contaminações.
Palavras-chave: Criptosporidiose, safranina-azul de metileno, FIOCRUZ.
QUALITATIVE VALUATION OF Cryptosporidium sp. OOCYSTS IN FECAL
SAMPLES FROM PATIENTS IN INSTITUTO FERNANDES
FIGUEIRA/FIOCRUZ
ABSTRACT
The aim of this work was to evacuate qualitatively, using the technique of safranin-methylene blue, the
prevalence of Cryptosporidium sp. Oocysts in the faeces of patients from Institute Fernandes Figueira /
FIOCRUZ. To do this, 50 samples were collected and placed into vials containing formalin (5%) and, then
forwarded to the Laboratory of Parasitology of the UNIGRANRIO. Were subjected to the technique of
centrifugal-sedimentation and subsequently, stained by technique of safranin-methylene blue to determine via
microscopy in positive or negative. The samples were divided according to the specialty clinic, 9 samples
were positive and 10 negative in amount of 19 samples tested. In pediatric outpatient clinic, 18 samples were
positive and 13 negative in amount of 31 samples tested. Among the 50 samples we had an amount of 27
positive samples corresponds to 57% and 23 negative samples corresponding 43%. It is evident the
effectivaness of the safranin methylene blue technique in the identification of Cryptosporidium sp. oocysts
and is necessary the your implementation in to routines of researchs laboratory for public health to a better
therapy, avoiding continuous dispersions in the environments and contaminations.
Keywords: Criptosporidiosis, safranin-methylene blue, FIOCRUZ.
INTRODUÇÃO
Criptosporidiose é uma doença causada
por um protozoário parasita do gênero
Cryptosporidium
pertencentes
ao
filo
Apicomplexa, e suas espécies parasitam as
Saúde & Amb. Rev., Duque de Caxias, v.6, n.1, p.11-16, jan-jun 2011.
microvilosidades das células epiteliais do trato
gastrointestinal. A localização deste protozoário
caracteriza-se por ser intracelular, porém
extracitoplasmático, ocasionando danos aos
microvilos e deficiência de absorção dos
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nutrientes contidos na luz intestinal (Fayer, et. al.,
1997).
A
primeira
descrição
do
Cryptosporidium em células do epitélio
gastrointestinal foi por Tizzer em 1912, localizado
na mucosa do intestino delgado de ratos,
denominando a espécie de C. parvum que é
responsável por infectar o intestino delgado de
humanos e grande variedade de mamíferos. Sendo
considerada uma espécie de caráter zoonótico
(Villacorta et. al., 1988; Fayer, 2000; Morgan et.
al., 1999).
A transmissão da doença acontece por
meio de oocistos de Cryptosporidium sp., em sua
forma robusta infectante, capaz de sobreviver à
maior parte dos ambientes por longos períodos de
tempo, habitar todos os climas e locais, e infectar
vários hospedeiros diferentes. A infecção
acontece geralmente, fecal-oral, através do
contato pessoa-pessoa, animal-pessoa, águas e
alimentos contaminados por fezes.
A Criptosporidíose algumas vezes pode
ser transmitida também através de lagos e piscinas
quando pessoas com diarréia causada por
criptosporidíose nadam em suas águas, ou quando
a água torna-se contaminada pelo esgoto ou por
fontes animais com criptosporidíose. Estes
parasitas podem sobreviver na água, e infectar
pessoas que nadem nela, e que venham a ingerir
ou mesmo molhar os lábios com essa água
(Robertson et. al., 2000).
A Criptosporidíose, acomete indivíduos
imunocompetentes se manifestando de forma
assintomática causando apenas uma diarréia autolimitada (Heyworth, 1992), e em indivíduos
imunocomprometidos como crianças, idosos,
doentes imunossupressores e doentes com
síndrome da imunodeficiência adquirida, esta
doença se manifesta de forma mais grave,
caracterizando-se por uma diarréia severa, crônica
delimitante, colocando a vida do indivíduo em
risco podendo levar a óbito (Forney, Yang e
Healey, 1996; Harp et. al., 1996; Priest et.al.,
1999).
No entanto, o estado imunológico do
indivíduo não está relacionado à presença da
doença, uma vez que a infecção pode ocorrer em
indivíduos saudáveis, os quais apresentam um
quadro clínico auto-limitante. Isso torna
preocupante a ocorrência de portadores
assintomáticos para a saúde pública, pelo fato de
ser uma zoonose e pela necessidade de se adequar
à pesquisa de rotina de exames parasitológicos, e
conseqüentemente a conduta terapêutica eficaz
contra a doença, evitando continuas dispersões no
ambiente e contaminações.
Saúde & Amb. Rev., Duque de Caxias, v.6, n.1, p.11-16, jan-jun 2011.
Muitos fatores podem contribuir para a
falta de conhecimento sobre a epidemiologia do
parasita. Entre eles destaca-se a ausência da
prática de notificação da doença por parte dos
médicos e dos laboratórios. Além das técnicas
diagnósticas utilizadas pela maioria dos
laboratórios não permitem a identificação do
parasita em um exame parasitológico de fezes
rotineiro.
A criptosporídiose gastrointestinal nos
humanos inicia-se ao ingerir ou inalar oocistos,
estes oocistos são esféricos ou levemente
ovalados, podendo medir de 4 a 6 micrômetros,
possuem um corpo residual composto por
grânulos, em estágios endógenos possuem
organela de adesão. A parede dos oocistos é lisa,
composta por duas camadas eletrodensas
constituídas por glicoproteínas e separadas por
uma camada glicolipídica intermediária (Fayer e
Ungar, 1986; Fall et. al., 2003) e uma satura
linear na metade da parede por onde elimina os
esporocistos durante o processo de excistação
(Smith et. al., 2002). No intestino delgado (íleo),
ocorre a excistação pela ação de enzimas
proteolíticas e sais biliares, liberando os quatro
esporozoítos que invadem as células epiteliais do
trato gastrointestinal. E sua localização é
intracelular, extracitoplasmática, dentro de um
vacúolo parasitóforo que adere a membrana apical
da célula (Casemore et. al., 1985; Fayer et. al.,
2000; Current e Garcia, 1991; Zhu et. al., 2000;
Hashim, et al., 2006; Xiao, et. al., 2000; 2004a),
após aderência do esporozoíto, as células da
mucosa epitelial liberam citocinas que ativam
fagócitos, e quando estas células são ativadas
liberam fatores solúveis como histamina,
serotonina, adenosina, prostaglandina e fatores
ativadores de plaquetas que atuam sobre os nervos
entéricos aumentando a secreção intestinal de
água e cloretos e inibindo a absorção.
Posteriormente, as células morrem por resultado
direto da invasão, multiplicação e expulsão do
parasito, ou as células se danificam devido à
inflamação, causando distorção das vilosidades,
má absorção de nutrientes, desidratação e
desequilíbrio eletrolítico (Fayer e Ungar, 1986;
Hunter e Nichols, 2002; Smith et al, 2006). Assim
ele processa seu ciclo de vida se multiplicando
assexuadamente por merogonia com duas
gerações de merontes e um de multiplicação
sexuada por gametogonia com formação de macro
e micromerontes. Os micromerontes ou
microgametas rompem a célula hospedeira e
invadem outra célula contendo macrogameta, que
se fertilizam formando o zigoto. Este zigoto se
reveste de parede formando dois tipos de oocistos:
um de parede fina (20%) e outro de parede grossa
Página 12
(80%), ambos infectantes e com esporozoítos
livres. Os oocistos de parede fina são
responsáveis pela auto–infecção liberando os
esporozoítos ainda no intestino infectando novas
células. Já os oocistos de parede grossa, estão
envolvidos por uma parede dupla, conferindo-os
maior resistência, são eliminados com fezes para
o meio ambiente, infectando novos hospedeiros
(Casemore et al, 1985; Dillingham et al, 2002;
Joachim, 2004; Sunnotel et al, 2006 a).
O presente trabalho tem como objetivo
avaliar qualitativamente a freqüência de oocistos
de Cryptosporidium na população de indivíduos
que deram entrada no Instituto Fernandes Figueira
hospital da FIOCRUZ, através da técnica
safranina azul de metileno (BAXBY et al., 1984).
E observar o efeito da técnica sobre a avaliação
dos oocistos nas fezes obtidas aleatoriamente
verificando as amostras positivas ou negativas.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção das amostras e local de
experimentação:
Foram
coletadas
fezes,
individualmente, de um total de 50 pacientes em
tratamento ou rastreio da clínica patológica do
Instituto
Fernandes
Figueira/FIOCRUZ
(IFF/FIOCRUZ), de diferentes idades, indicações
clínicas, sessão ou especialidade requisitante,
levando em conta a seguinte observação: Que o
IFF/FIOCRUZ é uma unidade de saúde voltada
para mulher, criança e adolescente, não atendendo
o público masculino. Entretanto quando se referir
em amostrar aleatórias é referente ao público em
questão. As amostras foram acondicionadas em
frascos limpos e mantidas sob refrigeração
armazenadas em uma caixa térmica devidamente
identificada como material infectante. Tais
amostras foram coletadas três vezes por semana
(terça, quarta e sexta-feira) do laboratório de
patologia geral do IFF/FIOCRUZ e encaminhadas
ao laboratório de parasitologia da UNIGRANRIO
onde foram realizadas as análises.
Preparo do material e confecção das
lâminas: As lâminas foram preparadas a partir das
amostras acondicionadas em formalina a 5%. O
material foi homogeneizado com água destilada,
com auxílio de um bécker com capacidade para
100 ml, um bastão de vidro e filtrado em tamis
com gaze dobrada quatro vezes e colocado em
tubos de ensaio cônico de vidro com capacidade
para 10 ml e posteriormente centrifugado à 1500
rotações por 5 minutos. Em seguida o
sobrenadante foi desprezado, e o sedimento foi
acrescido água destilada para melhor diluição.
Com uma pipeta de 20µl semi-automática de dois
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estágios de desprezo de material, foi feito um fino
esfregaço numa lâmina de vidro devidamente
limpa e identificada, deixando secar ao ambiente.
Depois de seca a lâmina passou para o processo
de fixação e coloração do material, mergulhandoa em metanol clorídrico à 1% cerca de 3 à 5
minutos. Ao retirar a lâmina do metanol clorídrico
deixar secar ao a livre. Através de uma pipeta
Pasteur foi gotejada safranina aquosa a 1% sobre
o esfregaço fixado esperar por 1minuto e levar na
chama quente do bico de bunsein por três vezes
até levantar fervura, esperar esfriar desprezar o
corante e lavar com água destilada. Em seguida
contra-corar com azul de metileno à 1% por 30
segundos, lavar com água destilada e deixar secar
ao ambiente para fazer microscopia.
Identificação de oocistos por amostra de
fezes: As lâminas com identificação dos pacientes
contendo esfregaços devidamente fixados e
corados pela técnica safranina-azul de metileno
(BAXBY et al., 1984), foram examinadas em toda
sua extensão utilizando-se o microscópio
binocular Bioval modelo L2000A na objetiva de
100X em óleo de imersão, onde foram
classificadas de acordo com sua positividade ou
negatividade.
Detecção do parasito: O parasito foi
visualizado devido suas características marcantes
mostradas através da técnica utilizada. Sua
estrutura sub-esférica a oval, com coloração
variando de vermelho rosa mais ascesa, com
aparência granulosa devido a presença dos
esporozoítos, coloração mais evidente de
vermelho bem aberto, sua parede sem nenhuma
abaulação, contrastando com fundo azul. Como
mostra na fotomicrografia (figura 2) feita através
do microscópio binocular Bioval modelo L2000A
acoplado a câmera fotográfica digital Panassonic
Lumix modelo DMC-FP8 12 mega pixels em 8X
de ampliação.
Amostragem: A amostra consiste de 50
pacientes do IFF/FIOCRUZ. Para garantir uma
amostragem não-tendenciosa, de modo aleatório,
procedemos à coleta de materiais em diferentes
dias (26/10, 26/10, 29/10, 06/11, 11/11), além de
dividir em dois grupos (Ambulatório Ginecologia
e Ambulatório Pediatria). Comprovando que não
foram escolhidas e sim coletas de acordo que iam
dando entrada.
Análise Estatística: Para analise estatística
foi usado o Teste Exato de Fisher como teste
comparativo de nossos resultados visto que os
experimentos foram realizados sob uma amostra
relativamente pequena (cinqüenta pacientes).
Página 13
RESULTADOS
O resultado da análise é mostrado na tabela
1 e nos gráficos 1 e 2. Na tabela 1 descrevemos a
distribuição das freqüências de resultados
positivos e resultados negativos versus
sessão/Especialidade: Ambulatório Ginecologia e
Ambulatório Pediatria.
Obtemos que os
diagnósticos de positivo (significância p = 0, 328)
e negativo (significância p = 0, 466) não estão
associados à sessão/Especialidade.
TABELA 1. Dispõe a distribuição nos casos positivos
e negativos em uma amostra de 50 pacientes do
Instituto Fernandes Figueira no ano de 2010.
Positivo
Negativo
Total II
Ginecologia
9
10
19
Pediatria
18
13
31
Total I
27
23
50
FIGURA 1. Oocistos de Cryptosporidium sp. oriundos
das fezes de pacientes infectados do IFF/FIOCRUZ.
Corados pela técnica safranina-azul de Metileno,
observada no microscópio em objetiva de 100X.
46%
54%
No entanto, o gráfico 1 nos revelará uma
situação alarmante. O resultado positivo se
confirmou em 54% dos pacientes e negativos para
os demais 46% o que representa um valor alto.
Uma análise mais minuciosa é feita no
gráfico 2, onde detalhamos o diagnóstico por
faixa etária. Nota-se que 71,4 % das crianças
examinadas, na faixa etária entre 0 e 5 anos, estão
infectadas. Se considerarmos os pacientes entre 0
e 15 anos, observamos que 51,6 % estão
infectados o que estatisticamente permite nos
concluir que esta faixa etária não é um fator que
contribui para a infecção (p = 0,445) haja visto o
gráfico 1 dos percentuais de infecção da amostra
em consonância com este percentual. No entanto,
deste percentual, 32,2 % estão na faixa entre 0 e 5
anos. Sendo que neste caso, podemos concluir que
estatisticamente a faixa etária entre 0 e 5 anos e
mais propensa a contrair a infecção em relação a
faixa etária entre 5 e 15 anos (p=0,049). Uma
hipótese para os altos índices de infecção é a
imunodeficiência dos pacientes tomados como
amostra. De fato, em sua maioria os pacientes
amostrais são crianças nos primeiros anos de vida,
0 a 5 anos (em um total de 14 de 50) ou em rotina
pré natal (em um total de 20 de 50). Revelando
assim, uma classe de pacientes a ser monitorada
com relação à presença de Cryptoporidium sp.
(Figura 1) em suas fezes.
Saúde & Amb. Rev., Duque de Caxias, v.6, n.1, p.11-16, jan-jun 2011.
Positivo
Negativo
GRÁFICO
1.
Percentuais
de
diagnóstico
positivo/negativo para infecção por Cryptosporidium
em amostras de pacientes do Instituto Fernandes
Figueira – 2010.
10
Positivo
8
Negativo
6
4
2
0
0a5
5 a 10
10 a 15 15 a 20 20 a 25 25 a 30 35 a 40
GRÁFICO 2. Distribuição das freqüências (em
quantidade de pacientes) de casos positivo/negativo
para infecção por Cryptosporidium sp. por faixa etária
(em anos) em uma amostra de 50 pacientes do Instituto
Fernandes Figueira – 2010.
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Quanto aos resultados obtidos da
avaliação sobre a presença de oocistos de
Cryptosporidium sp. através da técnica utilizada
safranina azul de metileno merece atenção pela
Página 14
sua porcentagem positiva de 57% sobre o total de
cinqüenta amostras mostrando assim a eficácia da
técnica para o diagnóstico. Conforme os
resultados encontrados por Carvalho-Costa, et.
al (2007), que concluíram que Cryptosporidium
sp. tem uma correlação com a desnutrição e
desenvolvimento de diarréia crônica. No trabalho
de Muza (1994) o índice de Cryptoporidium sp.
foi baixo, mesmo assim ele também sugere sua
presença relacionada com o desencadeamento do
quadro diarréico. Já Ribeiro, (2004) destaca a
ocorrência de taxa de infecção considerável, fato
que sugere a presença do problema de difícil
controle e, conseqüentemente, de sua dispersão
para o ambiente externo, a partir do hospital,
desta forma, a presença de infecções por
Cryptosporidium merece atenção evitando
possíveis epidemias. Portanto é iminente a
necessidade do conhecimento da doença tanto por
parte dos médicos que fazem a solicitação do
exame parasitológico e lida com populações de
risco (crianças e gestantes) quanto do laboratório,
a saber, da técnica específica para detecção dos
oocistos. Evitando assim o risco de subestimar a
terapia adequada para o diagnóstico correto.
Principalmente se levarmos em consideração o
impacto que doença exerce sobre a saúde pública
por ser uma zoonose. Sendo assim há necessidade
de maiores meios de informações, diagnósticos e
controle sobre a doença, para evitar continuas
dispersões no ambiente e contaminações.
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