1. introdução

Universidade de Santiago de Compostela
Facultad de Medicina y Odontología
Departamento de Ciencias Morfológicas
ESTUDIO ULTRASTRUCTURAL E
IMUNOHISTOQUÍMICO DE LOS
MIOFIBROBLASTOS DE LA CAVIDAD ORAL
TESIS DOCTORAL
MARCO ANDRÉ MELO DE SOUSA NICOLAU MARTINS
Director: Professor Doutor Juan Suárez Quintanilla
Co-director: Professor Doutor Fernando Jorge Neves Ferreira
SANTIAGO DE COMPOSTELA
ISBN 978-84-9887-620-8 (Edición digital PDF)
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Facultad de Medicina y Odontología
Hospital Clínico Universitario
c/ San Francisco, s/n
15782 Santiago de Compostela
D. Juan Antonio Suárez Quintanilla, Doctor en Medicina y Cirugía, profesor
Titular del Departamento de Ciencias Morfológicas de la Universidad de
Santiago y D. Fernando Jorge Neves Ferreira, Doctor en Odontologia, profesor
Titular del Departamento de Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica da
Cooperativa de Ensino Superior Politécnico e Universitário
CERTIFICAN:
Que
el
trabajo
titulado
―ESTUDO
ULTRASTRUTURAL
E
IMUNOHISTOQUÍMICO DOS MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL‖,
presentado por D. Marco André Melo de Sousa Nicolau Martins para optar al
Grado de Doctor en Odontologia, há sido realizado bajo nuestra dirección.
Revisado el mismo, quedamos conformes com su presentación para ser
juzgado como Tesis Doctoral por el correspondiente tribunal.
Para que conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en
Santiago de Compostela, a 2 de Septiembre.
Fdo.: Prof. Juan Suárez Quintanilla
Fdo.: Prof. Fernando Ferreira
Doutorando: Marco André Melo de Sousa Nicolau Martins
ESTUDIO ULTRASTRUCTURAL E
IMUNOHISTOQUÍMICO DE LOS
MIOFIBROBLASTOS DE LA CAVIDAD
ORAL
Marco André Melo de Sousa Nicolau Martins
2010
Agradecimentos
Aos Professores Doutores Juan Suarez Quintanilha e Fernando Jorge Neves
Ferreira pela sua disponibilidade, ensinamentos e conselhos que foram
imprescindíveis na execução desta Tese.
Ao Departamento de Ciências Morfológicas da Faculdade de Medicina e
Odontologia da Universidade de Santiago de Compostela que me aceitaram no
seu Programa de Doutoramento e por toda a atenção que recebi.
À Universidade de Barcelona, Instituição de acolhimento para o inicio dos
trabalhos de Doutoramento, na pessoa da Professora Doutora Cristina
Manzanares.
À C.E.S.P.U. (Cooperativa de Ensino Superior Politécnico e Universitário) por
todo o apoio institucional, pela ajuda, motivação, confiança e empenhamento
de todos os colegas membros dos Órgãos Sociais, para que fossem
ultrapassadas todas as dificuldades ao longo da preparação deste trabalho.
À Direcção do Instituto Politécnico de Saúde - Norte, ao Conselho Cientifico, ao
Conselho Pedagógico.
Ao Professor Doutor António Manuel de Almeida-Dias, Presidente do Instituto
Politécnico de Saúde – Norte, pela motivação que sempre me transmitiu para a
importância da realização da Tese de Doutoramento.
Ao Departamento de Ciências Dentárias, na pessoa do seu director, Professor
Doutor Joaquim Moreira, pelo seu apoio e sua disponibilidade.
Ao Dr. Fernando Figueira, Director do Serviço de Estomatologia e Medicina
Dentária do Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, pelo seu apoio e
principalmente pela sua amizade.
Ao Departamento de Anatomia Patológica Citológica e Tanatológica do Instituto
Politécnico de Saúde - Norte, por toda a dedicação e vontade que sempre
demonstraram em colaborar neste trabalho.
Ao Luís Monteiro, amizade mais recente sem dúvida, mas também ele sempre
que sentiu a minha necessidade de ajuda, de pronto me dedicou toda a
atenção necessária.
Ao Fernando Ferreira, pois desde a primeira hora me dedicou toda a sua
experiencia, conhecimento e amizade, o que permitiu a elaboração deste
trabalho.
À Filomena Salazar, de difícil descrição todas as lutas que temos travado
juntos, mas sem dúvida indicador que a nossa amizade é e será sempre
impenetrável.
Ao Professor Almeida Dias, meu Mestre, aquele que sempre se impõe, não
criando obrigatoriedades, mas pelo reconhecimento que se lhe tem.
À minha Madrinha, sustento de coesão nos momentos mais difíceis.
À minha Avó, Maria Beatriz Nicolau, que infelizmente não teve o prazer de
assistir a este momento da minha vida.
Ao meu Pai, por todo o apoio, dedicação e incentivo no decorrer da minha vida
pessoal e profissional.
À minha Mãe, pela aposta contínua e difícil a que se dedicou desde à 38 anos
e que com este trabalho vê realizar um dos seus sonhos - Obrigado minha
Mãe.
A ti Ana, mulher que me trouxe a felicidade que poucos conseguem alcançar,
ou seja, amar e ser amado.
A todos os meus amigos e colegas que me apoiam demonstrando a sua
verdadeira amizade.
Ao meu filho Diogo André,
pois ver o seu crescer dá-me alento
para concretizar a mais difícil das tarefas.
Índice
ABREVIATURAS .................................................................................................................................... 21
RESUMO .............................................................................................................................................. 23
ABSTRACT ............................................................................................................................................ 38
RESUMEN ............................................................................................................................................ 51
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................... 67
2. OBJECTIVOS ..................................................................................................................................... 73
3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ............................................................................................................... 77
3.1. ORIGEM DOS MIOFIBROBLASTOS ................................................................................................. 78
3.2. FACTORES DE CRESCIMENTO ........................................................................................................ 84
3.2.1. DIFERENCIAÇÃO MIOFIBROBLÁSTICA ...................................................................................................... 84
3.2.2. SISTEMAS DE ADESÃO DOS MIOFIBROBLASTOS......................................................................................... 96
3.2.3. INIBIÇÃO MIOFIBROBLÁSTICA.............................................................................................................. 103
3.3. PATOLOGIA COM ENVOLVIMENTO DE MIOFIBRO-BLASTOS ........................................................ 107
3.3.1. MIOFIBROBLASTOS NA CICATRIZAÇÃO .................................................................................................. 107
3.3.2. FIBROSE PULMONAR ......................................................................................................................... 108
3.3.3. MIOFIBROBLASTOS NAS NEOPLASIAS.................................................................................................... 113
3.3.4. MIOFIBROBLASTOS NA FIBROSE HEPÁTICA ............................................................................................. 115
3.3.5. MIOFIBROBLASTO NA PATOLOGIA CARDÍACA ......................................................................................... 116
3.4. MIOFIBROBLASTOS E A CAVIDADE ORAL .................................................................................... 117
3.5. MIOFIBRIBLASTOS E PATOLOGIAS CAVIDADE ORAL .................................................................... 118
3.5.1. FIBROMATOSE GENGIVAL HEREDITÁRIA................................................................................................. 118
3.5.2. CICATRIZAÇÃO DE LESÃO DO PALATO.................................................................................................... 119
3.5.3. MIXOMA ODONTOGÉNICO ................................................................................................................ 119
3.5.4. CARCINOMA ESPINO CELULAR (CEC)................................................................................................... 120
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................. 125
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ................................................................................................ 125
4.2. AVALIAÇÃO CLÍNICA .................................................................................................................... 125
4.3. TÉCNICA DE COLHEITA................................................................................................................. 127
4.4. FIXAÇÃO...................................................................................................................................... 127
4.5. PROCESSAMENTO ....................................................................................................................... 127
4.5.1.PROCESSAMENTO DOS TECIDOS PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA ............................................................. 127
4.5.2-PROCESSAMENTO DOS TECIDOS EM HISTOQUÍMICA ................................................................................. 129
4.5.2.1. Coloração de Hematoxilina – Eosina ................................................................................... 129
4.5.2.2. Tricrómio de Masson Especial ............................................................................................. 130
4.5.2.3. Van Gieson ........................................................................................................................... 132
4.6.TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA ............................................................................................ 134
4.7. OBSERVAÇÃO E FOTOGRAFIA...................................................................................................... 136
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................................. 137
5. RESULTADOS .................................................................................................................................. 143
5.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA........................................................................... 143
5.2. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO I ................................................. 149
5.3. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO II ................................................ 157
5.4. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO III ............................................... 165
6. DISCUSSÃO .................................................................................................................................... 177
7. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 183
8. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................ 187
Índice de figuras
FIGURA 1 - FIBROBLASTOS GENGIVAIS. HE X20 (SETAS) ......................................................................... 150
FIGURA 2 - FIBROBLASTOS GENGIVAIS. HE X40 (SETA) ........................................................................... 151
FIGURA 3 - FIBROBLASTOS GENGIVAIS. TRICRÓMIO DE MASSON 20X ................................................... 151
FIGURA 4 - TRANSIÇÃO EPITÉLIO-CONJUNTIVO. HE X 20. VASOS (SETAS) FIBROBLASTOS E COLAGÉNIO
(RECTÂNGULOS) .............................................................................................................................. 152
FIGURA 5 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. TRICRÓMIO DE MASSON X 20. FIBROBLASTO (SETA) ...... 152
FIGURA 6 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. VAN GIESON X 40. ........................................................... 153
FIGURA 7 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. REGIÃO VESTIBULAR. VAN GIESON X20 .......................... 153
FIGURA 8 - TECIDO CONJUNTIVO GENGIVAL. VAN GIESON X20 ........................................................... 154
FIGURA 9 - TRANSIÇÃO EPITÉLIO-CONJUNTIVA. HE X20 ........................................................................ 154
FIGURA 10 - TRANSIÇÃO EPITÉLIO-CONJUNTIVA. REGIÃO VESTIBULAR. TRICRÓMIO DE MASSON X20 .. 155
FIGURA 11 - GENGIVA ADERIDA. REGIÃO VESTIBULAR. HE X20 ............................................................. 155
FIGURA 12- GENGIVA ADERIDA. REGIÃO VESTIBULAR. HE X40 ............................................................... 156
FIGURA 13 - INTERDIGITAÇÕES EPITÉLIO-CONJUNTIVAS. GENGIVA ADERIDA DA REGIÃO VESTIBULAR DO
DENTE 46. HE X40 ........................................................................................................................... 156
FIGURA 14 - INTERDIGITAÇÕES EPITÉLIO-CONJUNTIVAS. GENGIVA ADERIDA DA REGIÃO VESTIBULAR DO
DENTE 46. TRICRÓMIO DE MASSON X20 ........................................................................................ 157
FIGURA 15 - MIOFIBROBLASTOS DA REGIÃO VESTIBULAR. ACTINA X40(SETA) ..................................... 159
FIGURA 16 - MIOFIBROBLASTOS DA REGIÃO VESTIBULAR. ACTINA X20 .................................................. 159
FIGURA 17- MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. ACTINA X20 ......................................................... 160
FIGURA 18 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. P63 X20............................................................... 160
FIGURA 19 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. P63 X40............................................................... 161
FIGURA 20 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. VIMENTINA X20 .................................................. 161
FIGURA 21 - MIOFIBROBLASTOS FORTEMENTE POSITIVOS ..................................................................... 162
FIGURA 22 - BIÓPSIA DE GENGIVA ADERIDA. ACTINA X20 ...................................................................... 162
FIGURA 23 - BIÓPSIA DE GENGIVA ADERIDA. P63 X20 ............................................................................. 163
FIGURA 24 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. ACTINA X20 ........................................................ 163
FIGURA 25 - MIOFIBROBLASTOS DE GENGIVA ADERIDA. P63 X40 ........................................................... 164
FIGURA 26 - MIOFIBROBLASTOS DE GENGIVA ADERIDA. VIMENTINA X20 .............................................. 164
FIGURA 27 - MIOFIBROBLASTOS DA CAVIDADE ORAL. ACTINA X40 ........................................................ 165
FIGURA 28 - LEUCOPLASIA DA CAVIDADE ORAL. VIMENTINA X20 ........................................................... 166
FIGURA 29 - CARCINOMA PAVIMENTOSO DA CAVIDADE ORAL............................................................... 167
FIGURA 30 - CARCINOMA PAVIMENTOSO DA CAVIDADE ORAL............................................................... 167
FIGURA 31 - COLAGÉNIO (X 30.000) ......................................................................................................... 169
FIGURA 32 - FIBROBLASTO GENGIVAL (25.000X) ..................................................................................... 170
FIGURA 33 - MIOFIBROBLASTO (12.000X) ................................................................................................ 170
FIGURA 34 - MIOFIBROBLASTO (10.000X) ................................................................................................ 171
FIGURA 35 - FIBROBLASTO GENGIVAL (X 12.000) .................................................................................... 171
FIGURA 36 - FIBROBLASTO GENGIVAL (X 28.800) .................................................................................... 172
FIGURA 37 - COLAGÉNIO (50.000X) .......................................................................................................... 172
FIGURA 38 - COLAGÉNIO (20.000X) .......................................................................................................... 173
Índice de gráficos
GRÁFICO 1 - DISTRIBUÍÇÃO POR GÉNEROS DA AMOSTRA ESTUDADA (N=90) .................................. 143
GRÁFICO 2 - DESCRIÇÃO DA FREQUÊNCIA DEPENDENDO DA IDADE DO PACIENTE ........................... 144
GRÁFICO 3 - DISTRIBUIÇÃO POR IDADES NOS DIFERENTES GRUPOS ................................................... 145
GRÁFICO 4 - DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO ........................................................................ 145
GRÁFICO 5 - DISTRIBUIÇÃO ETÁRIA ...................................................................................................... 146
GRÁFICO 6 - DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS EM FUNÇÃO DO GÉNERO .................................................. 146
GRÁFICO 7 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR P63 NOS GRUPOS I, II E III ....................................... 147
GRÁFICO 8 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR DESMINA NOS GRUPOS I, II E III .............................. 147
GRÁFICO 9 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR ACTINA NOS GRUPOS I, II E III .................................. 148
GRÁFICO 10 - CARACTERIZAÇÃO DO MARCADOR VIMENTINA NOS GRUPOS I, II E III ........................ 148
GRÁFICO 11- IMUNOMARCAÇÃO EM FUNÇÃO DOS TRÊS GRUPOS ESTUDADOS ................................ 149
Índice de tabelas
TABELA 1 - CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO GRUPO I ....................................................... 138
TABELA 2 - CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO GRUPO II ...................................................... 139
TABELA 3 - CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO GRUPO III ..................................................... 140
TABELA 4 - CARACTERIZAÇÃO DOS INDIVÍDUOS DOS GRUPOS I, II E III ................................................... 145
Abreviaturas
FN: Factor de crescimento derivado das plaquetas.
IFN: Interferão.
TGF: Factor de transformação do crescimento.
mRNA: RNA mensageiro.
ADN: Ácido desoxirribonucleico
TNF: Factor de necrose tumoral.
EGF: Factor de crescimento epidérmico.
IGF: Factor de crescimento insulínico.
CTGF: Factor de crescimento do tecido conjuntivo.
MMP: Metaloproteinases.
FAP: Proteína de activação fibroblástica.
KGF: Factor de crescimento de queratinócitos.
TIMP: Factor Inibidor de metaloproteinases.
ANG II: Angiotensina II.
21
Resumo
1. INTRODUÇÃO
Os miofibroblastos são células que expressam a isoforma - actina da
célula muscular lisa. Estas células demonstram características intermediárias
entre fibroblastos e células musculares lisas, no entanto apresentam morfologia
similar aos fibroblastos. Miofibroblastos foram também denominados de
fibroblastos peri-tumorais, fibroblastos associados ao carcinoma e fibroblastos
activos do
estroma, mas hoje
são
mais trivialmente
chamados de
miofibroblastos. Estão presentes como uma pequena subpopulação celular em
quase todos os órgãos e são capazes de expressar e secretar uma extensa
quantidade de citoquinas, factores de crescimento, quimiocinas, hormonas,
neurotransmissores,
mediadores
inflamatórios,
proteínas
de
adesão
e
proteínas da MEC - matriz extra-celular.
Os miofibroblastos são também responsáveis pela produção acentuada
de material colagenar, metaloproteinases, gelatinases, glicosaminoglicanos e
factores de crescimento hepatocíticos e queratinocíticos.
Uma vez que o miofibroblasto manifesta a capacidade para expressar níveis
elevados de citoquinas, matriz extracelular e -actina do músculo liso,
desempenha papéis importantes na inflamação, deposita tecido conjuntivo, r,
esperando-se que estes possam contribuir para a resposta fibrótica através dos
respectivos fenótipos característicos.
Os miofibroblastos são caracterizados morfologicamente como células
alongadas, fusiformes ou estreladas com núcleo regular e central. Apresentam
um proeminente citoplasma de microfilamentos de actina (fibras de stress), um
retículo endoplasmático bem desenvolvido e estão conectados uns aos outros
23
através de aderências e junções do tipo gap junctions. Estas células também
estabelecem contactos com os componentes da matriz extracelular através de
fibronexus, que é um complexo transmembranar formado por actina, integrina e
fibronectina. Miofibroblastos são identificados através da expressão de -SMA
Este marcador citoplasmático é encontrado adicionalmente noutros 2
tipos celulares: células musculares lisas e células mioepiteliais. A presença de
outros marcadores como laminina, desmina, calponina, miosina de músculo
liso, caldesmonina e proteína de activação de fibroblastos tem sido utilizada
para caracterizar os miofibroblastos, mas o padrão de expressão é variável e
dependente principalmente da origem, localização e condição patológica.
Então, SMA é o melhor marcador celular para identificação dos
miofibroblastos, permitindo monitorizar e identificar o comportamento destas
células em situações clínicas e patológicas. Estas células podem ser
encontradas em inúmeras situações, participando tanto em processos
fisiológicos quanto patológicos. Os miofibroblastos contribuem para o
crescimento e diferenciação dos tecidos e órgãos, através de interacções com
células epiteliais, desempenhando também um importante papel no processo
de reparo, através da retracção do tecido de granulação e da síntese de MEC,
incluindo colágeno, fibronectina e proteoglicanos. Contudo, se estas células
persistirem, uma quantidade excessiva de colágeno é produzida, resultando em
desordens fibróticas, como quelóide e fibroses hepáticas.
24
2.OBJECTIVOS
Neste trabalho, foram observadas diferentes formas de expressão
imunocitoquímica, em diversos ambientes clínicos.
O objectivo foi estabelecer uma escala gradual de expressão biológica
com elevada aplicabilidade no contexto clínico ao nível do diagnóstico das
principais patologias da cavidade oral. Assim, são objectivos deste trabalho:
1. Caracterizar uma amostra das principais patologias da cavidade oral;
2. Avaliar a expressão fenotípica dos miofibroblastos nas principais
patologias da cavidade oral, através de um painel de anticorpos: actina, desmina, vimentina e P63;
3. Relacionar a intensidade da imunomarcação com a severidade das
principais lesões da cavidade oral.
25
3.MATERIAL E MÉTODOS
3.1.CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra estudada abrange 90 indivíduos, da consulta de Medicina
Dentária do Hospital Senhora da Oliveira – Guimarães, a Norte de Portugal,
entre os anos de 2003 e 2008.
A todos os indivíduos foi aplicado um protocolo de trabalho, previamente
definido, onde se registaram os principais elementos da sua identificação,
história clínica e localização exacta da colheita. Nos indivíduos dos grupos I e II
foram ainda registados os elementos relativos às patologias diagnosticadas.
3.2.AVALIAÇÃO CLÍNICA
A avaliação clínica foi feita através de uma anamnese e de um exame
objectivo. Na anamnese, foi elaborado um questionário sobre as principais
patologias locais e sistémicas, presentes ou passadas, hábitos e terapêuticas.
No exame objectivo foi efectuada uma observação clínica intra e extraoral.
No exame extraoral, foram despistadas as principais alterações
esqueléticas, de pele e mucosas. No exame intraoral, foram avaliadas as
mucosas de revestimento, mastigatória e especializada. Foram ainda
observadas as principais inserções de freios, tumefações, pigmentações
endógenas e exógenas dos tecidos moles e duros. Procedeu-se ao
preenchimento de uma ficha clínica periodontal para os respectivos registos.
O diagnóstico de periodontite teve por base o índice de extensão e
severidade.
27
As diferentes patologias da cavidade oral tiveram por base os
diagnósticos anátomo-patológicos.
Após a avaliação clínica e histopatológica, os indivíduos foram
distribuídos pelos respectivos grupos de estudo da seguinte forma:
- Grupo I: foram aqui colocados todos os indivíduos que não
apresentaram qualquer patologia sistémica ou localizada. Clinicamente
foram classificados como clinicamente saudáveis e serviram como grupo
de controlo.
- Grupo II: foram aqui colocados todos os indivíduos que não
apresentaram qualquer patologia sistémica mas evidenciaram perda de
inserção clínica de leve a moderada. Clinicamente foram classificados
como indivíduos com periodontite leve a moderada e sendo classificados
como grupo de periodontite.
A classificação leve a moderada foi baseada na classificação de
Armitage, 1999.
- Grupo III: foram aqui colocados todos os indivíduos que apresentaram
outras patologias da cavidade oral, previamente diagnosticadas.
Clinicamente foram classificados de acordo com as diferentes patologias
e serviram como base de referência para o estudo comparativo com os
outros dois grupos. As patologias estudadas foram: leucoplasia,
carcinoma espinocelular, líquen plano, fibroma, hiperplasia fibro-epitelial,
epúlide fibrosa e epúlide granulomatosa.
3.3.TÉCNICA DE COLHEITA
Os tecidos foram colhidos em ambiente asséptico, pela técnica de
biopsia convencional, ao nível da região vestibular dos 3º e 4º quadrantes, na
28
transição entre a gengiva livre e gengiva aderida com tamanhos que oscilaram
entre os 2x2mm e os 10x5mm.Todas as biópsias foram efectuadas com
anestesia locoregional à base de lidocaína a 2%, após consentimento prévio do
paciente obtido por escrito de forma esclarecida e voluntária, em modelo
próprio, aprovado pela comissão de ética do Hospital Senhora da Oliveira –
Guimarães.
3.4.FIXAÇÃO
Todos os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados com
formaldeído tamponado a 10%, numa quantidade de correspondeu a pelo
menos dez vezes o volume do tecido fixado.
Os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados em tampão
cacodilato de sódio a 0,1 M (pH 7,4). Em alguns casos foi feito o
processamento directo a partir da fixação para microscopia óptica.
3.5.PROCESSAMENTO
3.5.1.Processamento dos tecidos para microscopia electrónica
A partir das amostras incluídas em blocos de parafina, efectuou-se uma
selecção da área de maior interesse, a qual foi removida, cuidadosamente,
com ajuda de um bisturi. O fragmento foi cortado em pequenos pedaços e
colocados em xilol durante 24 horas de modo a remover toda a parafina.
Seguiu-se uma hidratação numa série decrescente de álcool com passagens
de 1 hora em etanol a 100% e de 30 minutos em etanol a 90% e 70%, sempre
com duas mudanças para cada álcool.
De seguida, os fragmentos foram mergulhados em tampão cacodilato de
sódio a 0,1 M (pH 7,4) durante 1 hora e 30 minutos, fazendo mudanças do
29
tampão a cada 30 minutos. Seguiu-se a etapa de pós-fixação durante 1 hora (a
4ºC) com tetróxido de ósmio a 1%, em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (pH
7,4). Posteriormente, efectuou-se uma desidratação numa série ascendente de
álcool, com passagens de 10 minutos por soluções de etanol a 50%, 75%, 90%
e 95%, sempre à temperatura de 4ºC, seguidas de três passagens, também de
10 minutos cada, em etanol absoluto.
Na última mudança de etanol absoluto o processamento passou a ser à
temperatura ambiente. Seguiram-se mais duas passagens, de 10 minutos
cada, mas agora por óxido de propileno. A impregnação das amostras na
resina de inclusão consistiu em submeter os fragmentos em misturas de óxido
de propileno e uma resina tipo Epoxy (Epon®) nas proporções de 3:1, 1:1 e
1:3, respectivamente, com a duração de 1 hora em cada mistura.
Finalmente os fragmentos foram mergulhados em Epon puro, no qual
ficaram durante 1 hora à temperatura ambiente e durante 30 minutos a 50ºC.
Seguiu-se a inclusão, realizada em moldes de borracha os quais, depois de
preenchidos com um fragmento em cada extremidade e cheios com Epon,
foram colocados na estufa à temperatura de 60ºC durante 2 dias para
polimerização da resina. Os cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de
diamante, num ultramicrótomo (Leica Ultracut®), e recolhidos em grelhas de
cobre com 200 mesh. Uma dupla contrastação dos cortes foi efectuada
manualmente, tendo-se emergido, primeiramente, as grelhas com os cortes
uranilo durante 20 minutos e posteriormente, numa solução de citrato de
chumbo durante 10 minutos. A observação foi feita num microscópio
electrónico de transmissão JEOL 100CXII, no qual foram efectuados registos
de algumas imagens sob a forma de microfotografias.
30
3.5.2.PROCESSAMENTO DOS TECIDOS EM HISTOQUÍMICA
3.5.2.1.Coloração de Hematoxilina – Eosina
A coloração de Hematoxilina-Eosina foi usada em todos os tecidos
estudados como primeira coloração. É o principal método histoquímico
efectuado
na
rotina
histopatológica,
acompanhando
sempre
técnicas
complementares de diagnóstico como a imunohistoquímica. É utilizada por ser
aquela que nos oferece uma relação núcleo-citoplasma mais fidedigna e por
ser a que melhor demonstra a arquitectura tecidular, sendo uma técnica capaz
de demonstrar os principais elementos tecidulares: o núcleo, o citoplasma e o
colagénio.
Procedimento técnico:
Os tecidos foram preparados tendo por base o protocolo aferido pelo
laboratório de Anatomia Patológica e seguiu os passos que a seguir se
descrevem:
Os tecidos foram submetidos a três banhos sucessivos em xilol, estando
precisamente 10 minutos em cada banho. Em seguida, os tecidos foram
hidratados passando para tal por uma série descrescente de álcoois,
respectivamente a 100%, 95%, 80%, 50% e finalmente colocados em água.
Depois de lavados, foram corados pela hematoxilina durante 3 minutos, e
novamente lavados em água para serem de seguida colocados no Ácido
Clorídrico para diferenciação. Seguidamente foram lavados em água corrente
durante 10 minutos e posteriormente corados pela eosina durante 3 minutos.
Depois de corados pela eosina, os cortes foram lavados, removidos os
excessos de corante e depois secos em estufa durante 10 minutos.
Depois de secos os cortes, procedeu-se à montagem em meio resinoso
(Entellan®).
31
3.5.2.2. Tricrómio de Masson Especial
Esta coloração especial foi particularmente importante na identificação
das fibras de colagénio e sua localização, para a compreensão de processos
patológicos associados aos miofibroblastos, como a expressão do tecido
conjuntivo no processo de reparação, e padronização das alterações
histológicas em resposta a agressões físicas ou químicas.
Procedimento:
Foi feita inicialmente uma desparafinação a que se seguiu a hidratação e
lavagem. Os tecidos foram passados por água destilada e corados com
azulceleste durante 5 minutos.
De seguida, os cortes foram escorridos e corados os núcleos com
Hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Cobriram-se com álcool-pícrico durante
5 minutos e depois foram abundantemente lavados com água corrente.
Depois de bem lavados, foram corados durante 5 minutos pela solução
Ponceau-Fucsina. Lavaram-se de seguida com água destilada e colocaram-se
no mordente Ácido Fosfomolíbdico 1% durante 5 minutos. Foram novamente
lavados com água destilada e corados pelo azul de anilina num tempo que
variou entre 2 a 5 minutos.
Finalmente e após nova lavagem em água destilada foram desidratados
os tecidos, diafanizados e posteriormente montados em meio de montagem
resinoso.
Os resultados encontrados nos diferentes cortes foram de acordo com a
técnica clássica, ou seja, os núcleos coraram de azul-escuro, o colagénio de
azul, as fibras musculares de vermelho, os eritrócitos de amarelo a laranja, os
citoplasmas de vermelho, as estruturas nervosas de azul e o fibrinogénio de
vermelho escuro.
32
3.5.3.TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA
Os
tecidos
estudados
foram
submetidos
a
uma
técnica
imunohistoquímica para avaliação da presença de actina, vimentina, desmina e
p63 utilizando os anticorpos NCL–SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESM-DERII e
NCL-p63
(mouse
monoclonal
antibody,
Novocastra
Laboratories
Ltd.,
Newcastle upon Tyne, UK), respectivamente.
Para este efeito, as lâminas com cortes histológicos foram desparafinadas
durante 20 minutos em xilol e hidratadas numa série decrescente de álcoois até
à água (álcool 100 % 5 minutos, álcool 100% 5 minutos, álcool 70% 5 minutos,
álcool 50% 5 minutos e água corrente 5 minutos).
As amostras utilizadas foram fixadas com formaldeído tamponado a 10%
e incluídas em parafina. O processo de fixação de tecidos em formaldeído
proporciona a formação de ligações cruzadas que mascaram os epítopos
antigénicos. Assim sendo, alguns anticorpos requerem recuperação antigénica
para detectar o seu epítopo antigénico específico. Nesta série, com os
anticorpos anti-vimentina e anti-actina não foi necessário proceder à
recuperação antigénica visto que estes anticorpos detectam os seus epítopos
antigénios específicos sem que seja necessário quebrar as ligações cruzadas
provocadas pela fixação em folmaldeído. No entanto, para a detecção dos
epítopos antigénicos p63 e desmina, foi necessário realizar a recuperação
antigénica utilizando altas temperaturas. Neste trabalho, a recuperação
antigénica foi efectuada com uma solução comercial (RA Epitope Retrival
Solution pH6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK)
semelhante à solução de tampão citrato original (10mM, pH=6,0), em
banhomaria a 98ºC durante 30 minutos.
O sistema de detecção utilizado para a reacção de imuno-histoquímica
foi um kit de detecção com polímero de peroxidase (Novolink Polymer
Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK),
sendo que a detecção dos diferentes tipos de anticorpos foi efectuada seguindo
33
as instruções do fabricante deste sistema de detecção: Bloqueio da Peroxidase
endógena com a Peroxidase Block, durante 5 minutos; Inibição das reacções
inespecíficas com Protein Block, durante 5 minutos; incubação dos anticorpos
primários (anti-actina, diluição 1/200 e incubação durante 15 minutos à
temperatura ambiente; anti-desmina, diluição 1/50 e incubação à temperatura
ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, diluição de 1/200 e incubação à
temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63, diluição 1/10 e incubação
à temperatura ambiente durante 60 minutos); incubação do reagente Post
Primary Block, durante 30 minutos; Incubação com Polymer, durante 30
minutos; revelação com DAB, durante 5 minutos. Após a marcação
imunohistoquímica,
os
cortes
histológicos
foram
contrastados
com
Hematoxilina, durante 2 minutos, desidratados numa se série crescente de
álcoois (álcool 50 % durante 2 minutos, álcool 80% durante 2 minutos, álcool
95% durante 2 minutos, duas vezes álcool 100% durante 2 minutos),
diafanizados em xilol e montados.
A precisão da técnica de imuno-histoquímica depende da obtenção de
uma marcação altamente específica prevenindo a reacções inespecífica do
anticorpo primário no tecido. Na imuno-histoquímica é necessário assegurar
que cada anticorpo é utilizado na diluição apropriada, não evapore durante a
incubação e que seja removido completamente, se não estiver ligado, antes
que o próximo reagente seja adicionado. Por esta razão em cada ensaio
realizado foram incluídos lâminas com cortes histológicos de tecidos com
presença dos epítopos antigénicos em questão e, antes da realização da
técnica, procedeu-se à padronização das condições mais adequadas,
adaptando-se para cada anticorpo primário, a utilização de recuperação
antigénica e o tempo de incubação, temperatura e diluição do anticorpo
primário. A técnica foi realizada em câmara húmida e cada corte foi isolado
com caneta hidrofóbica. Em cada reacção, foram incluídos cortes histológicos
de apêncide íleo-cecal como controlo positivo para o anticorpo anti-actina,
antidesmina e anti-vimentina, e cortes histológicos de próstata como controlo
positivo para o anticorpo anti-p63.
34
4.DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
O fenótipo do músculo liso que apresenta as células mioepiteliais, é
demonstrado pela marcação positiva para a actina da célula muscular lisa.
Estes marcadores, em especial a -actina são determinantes para a
identificação dos miofibroblastos num estroma complexo e por vezes
desmoplásico.
No contexto da doença periodontal é frequente a expressão fenotípica
da -actina por parte dos miofibroblastos, particularmente ao nível da gengiva
aderida. A marcação do citoesqueleto é igualmente positiva para os filamentos
de vimentina e desmina. A sua expressão é evidente, no entanto, inferior à
observada para os indivíduos que apresentam patologias de tipo desmoplásico
ou mesmo neoplásico (grupo III).
Do estudo efectuado podem retirar-se as seguintes conclusões:
1. As principais patologias da cavidade oral podem ser acompanhadas de
forma
directa
e
proporcional
pela
expressão
fenotípica
dos
miofibroblastos.
2. A intensidade da imunomarcação pela -actina, desmina, vimentina e
P63 é directamente proporcional à severidade das principais lesões da
cavidade oral.
3. A intensidade da imunomarcação pela -actina, desmina, vimentina e
P63 é um importante factor de diagnóstico e prognóstico das principais
lesões da cavidade oral.
35
4. A imunomarcação pela -actina, desmina, vimentina e P63 é
tendencialmente negativa na ausencia de fenómenos proliferativos.
5. A imunomarcação pela -actina, demonstra a evolução da severidade
da doença periodontal.
36
Abstract
1.INTRODUCTION
The myofibroblasts are cells which express the α-actin isoform of the
smooth muscle cell. These cells show intermediate characteristics between
fibroblasts and smooth muscle cells, although they present similar morphology
to the fibroblasts. Myofibroblasts were also called as peritumoral fibroblasts,
carcinoma-associated fibroblasts and active fibroblasts of the stroma.
Nowadays, they are more commonly called as myofibroblasts. They are present
as a small cellular subpopulation in almost every organ, and they are able to
express and segregate an extensive quantity of cytokines, growth factors,
chemokines, hormones, neurotransmitters, inflammatory mediators, adhesion
proteins and ECM proteins - extracellular matrix.
The myofibroblasts are also responsible for the important production of
collagen material, metalloproteinases, gelatinases, glycosaminoglycans and
hepatocytic and keratinocytic growth factors.
Since the myofibroblast manifests the capacity of expressing high levels
of cytokines, extracellular matrix and smooth muscle α-actin, it plays important
roles in the inflammation, it places connective tissue, r, waiting that these can
contribute for the fibrotic answer through its characteristic phenotypes.
The myofibroblasts are morphologically characterised as oblong, fusiform
and stellate cells with regular and central nucleus. They show a prominent
cytoplasm
of
actin microfilaments
(stress
fibbers),
a
well developed
endoplasmic reticulum, and they are connected with each other through
adherences and junctions of the gap junctions type. These cells also establish
contacts with extracellular matrix components through the fibronexus, which is a
transmembrane complex composed by actin, integrin and fibronectin.
37
Myofibroblasts are identified through the α-SMA expression. This cytoplasmic
marker is additionally found in other 2 cellular types: smooth muscle cells and
myoepithelial cells. The presence of other markers such as laminin, desmin,
calponin, smooth muscle myosin, caldesmon and fibroblast activation protein,
has been used to characterise the myofibroblasts, but the expression pattern is
variable and mainly dependent of the origin, location and pathological condition.
Therefore, α-SMA is the best cellular marker for the identification of
myofibroblasts, allowing the behaviour supervision and identification of these
cells in clinical and pathological situations. These cells can be found in
numerous situations, part of physiological and pathological processes. The
myofibroblasts contribute to the growth and differentiation of tissues and
organs, through interactions with epithelial cells, playing also an important role
in the repair process, through the retraction of the granulation tissue and the
ECM synthesis, including collagen, fibronectin and proteoglycans. However, if
these cells persist, an excessive quantity of collagen is produced, which results
in fibrotic disorders, such as keloid and hepatic fibrosis.
38
2.GOALS
In this work, different forms of immunocytochemical expression, in
several clinical environments.
The aim was to establish a gradual scale of the biological expression with
high applicability in the clinical context at the diagnosis level of the main
pathologies of the oral cavity. Therefore, the goals of this work are:
1. Characterise a sample of the main pathologies related with the oral
cavity;
2. Evaluate the phenotypic expression of the myofibroblasts in the main
pathologies related with the oral cavity, through an antibody panel:
alpha-actin, desmin, vimentine and P63;
3. Relate the immunomarking with the severity of the main lesions in the
oral cavity.
39
3.MATERIAL AND METHODS
3.1.SAMPLE CHARACTERISATION
The studied sample includes 90 individuals, from the Dentistry
consultation of the Hospital Senhora da Oliveira – Guimarães, in the North of
Portugal, between 2003 and 2008.
A previously defined work protocol was applied to each person, where it
was registered the main elements of his/her identity, clinical history and exact
location of the sampling. In individuals of the groups I and II, elements related
with the diagnostic pathologies were also registered.
3.2.CLINICAL ASSESSMENT
The clinical assessment was made through an anamnesis and an
objective examination. In the anamnesis, a questionnaire was made about the
main local and systemic, current and past pathologies, habits and therapies.
In the objective examination, an intra and extra-oral clinical observation
was made. In the extra-oral exam, the main skeletal, skin and mucosal changes
were screened. The covering, masticatory and specialised mucosas were
evaluated in the intra-oral exam. The main bridle insertion, tumefactions,
endogenous and exogenous pigmentations of the soft and hard tissues where
also observed. A periodontal record was filled in for the respective records.
The periodontitis diagnosis was based on the extension index and
severity.
41
The different pathologies of the oral cavity were based in the anatomicpathological diagnosis.
After the clinical and histopathological assessment, the individuals were
divided in study groups as following:
-
Group I: all the individuals that did not present any systemic or
localised pathology. Clinically, they were classified as clinically
healthy and they used as control group.
-
Group II: all the individuals that did not present any systemic
pathology, but who evidentiate loss of clinical insertion from mild to
moderate. Clinically, they were classified as individuals with mild to
moderate periodontitis, and they were classified as the periodontitis
group. The mild to moderate classification was based in Armitage
classification, 1999.
-
Group III: all the individuals who present other pathologies,
previously diagnosed in the oral cavity. Clinically, they were classified
according to the different pathologies, and they were used as
reference to the comparative study with the other two groups. The
pathologies studied were: leukoplakia, spinocellular carcinoma, lichen
planus, fibroma, fibroepithelial hyperplasia, fibrous epulides and
granulamatous epulides.
3.3.COLLECTION TECHNIQUE
The tissues were collected in an aseptic environment, by the
conventional biopsy technique, in the vestibular region of the 3 rd and 4th
quadrants, in the transition between the free gum and the joined gum, with sizes
that vary between the 2x2mm and 10x5mm. All the biopsies were done with
local-regional anaesthesia of lidocaine 2%, after previous consent of the patient,
which was obtained in a written document in an explicit and volunteer way, in a
42
model approved by the Ethics Commission of the Hospital Senhora da Oliveira
– Guimarães.
3.4.FIXATION
All the tissues studied in optical microscopy were fixed with buffered
formaldehyde 10%, in a quantity which corresponded to at least ten times the
volume of the fixed tissue.
The tissues studied in optical microscopy were fixed in sodium
cacodylate buffer 0.1 M (pH 7.4). In some cases, the direct processing was
done from the fixation for the optical microscopy.
3.5.PROCESSING
3.5.1.Tissue processing for electronic microscopy
From the samples included in paraffin blocks, a selection of the most
interesting area was made, which was carefully removed with the help of a
scalpel. The fragment was cut in small pieces, and they were put in xylol for 24
hours, in order to remove the paraffin. Then, it was done a hydration in a
decreasing series of alcohol with immersions of 1 hour in ethanol 100% and 30
minutes in ethanol 90% and 70%, always with two changes for each alcohol.
Afterwards, the fragments were immersed in sodium cacodylate buffer
0.1 M (pH 7.4) for 1 hour and 30 minutes, changing the buffer each 30 minutes.
This was followed by the postfixation phase for 1 hour (at 4ºC) with osmium
tetroxide 1%, in sodium cacodylate buffer 0.1 M (pH 7.4). Subsequently, a
dehydration was done in an increasing series of alcohol, with immersions of 10
minutes in ethanol solutions at 50%, 75%, 90%, and 95%, always at a
temperature of 4ºC, followed by three immersions, also with 10 minutes each in
absolute ethanol. In the last change of absolute ethanol, the processing was
43
done at room temperature. Two more immersions were done of 10 minutes
each, but now in propylene oxide. The impregnation of the samples in inclusion
resin consisted of submitting the fragments in mixtures of propylene oxide and a
resin of Epoxy type (Epon®), in the ratios of 03:01, 01:01 and 01:03,
respectively, with 1 hour for each mixture. Finally, the fragments were immersed
in pure Epon, in which they stood for 1 hour at room temperature and 30
minutes at 50ºC. This procedure was followed by the inclusion, done in rubber
moulds which, after being filled with a fragment in each end and filled with
Epon, they were put in a dryer at a temperature of 60ºC for 2 days, for the resin
polymerisation. The ultra-thin cuts were made with a diamond knife, in an
ultramicrotome (Leica Ultracut®), and colleted in copper grids with 200 mesh. A
doubled etching of the cuts is manually made. For that, the grids with the cuts
were emerged in a saline solution of uranyl acetate for 20 minutes and then, in
a solution of lead citrate for 10 minutes (Reynolds, 1963). The observation was
made in a transmission electron microscope JEOL 100CXII, in which records of
some images were made as microphotographs.
3.5.2.Tissue processing in histochemistry
3.5.2.1. Haematoxylin-eosin Staining
The haematoxylin-eosin staining was used in all the studied tissues as
the first staining. This is the main histochemical method executed in the
histopathological routine, following always complementary diagnosis techniques
such as the histochemistry. It is used because it is the one which offers a more
trustworthy nucleus-cytoplasm relation and because it is the staining that better
shows the tissue architecture. This technique is able to demonstrate the main
tissue elements: the nucleus, the cytoplasm and the collagen.
Technical procedure:
The tissues were prepared based on the protocol defined by the
Pathological Anatomy laboratory and followed the steps described below:
44
The tissues were submitted to three successive baths in xylol, and they were
precisely 10 minutes in each bath. Then, the tissues were hydrated through a
decreasing series of alcohols, at 100%, 95%, 80%, 50% respectively, and finally
put in water.
After being washed, they were stained by haematoxylin for 3 minutes,
and then, they were washed once again with water to be put in Hydrochloric
Acid for differentiation. Afterwards, the tissues were washed with fresh water for
10 minutes and then stained by eosin for 3 minutes. After being stained by
eosin, the cuts were washed, the staining excesses were removed and then
dried in a dryer for 10 minutes.
After the cuts being dried, we proceeded the assembly in resinous
environment (Entellan®).
3.5.2.2. Special Masson Trichrome stain
This special staining was particularly important in the identification of the
collagen fibres and its location, for the comprehension of the pathological
processes associated with the myofibroblasts, such as the expression of the
connective tissue in the repair process, and the standardization of the
histological changes as an answer to physical and chemical strength.
Procedure:
In the beginning, a deparaffination was done and was followed by the
hydration and washing. The tissues were passed by water and stained with sky
blue for 5 minutes.
Then, the cuts were exuded, and the nucleuses were stained with Gill's
Haematoxylin for 5 minutes. They were covered with picric alcohol for 5 minutes
and then, they were washed in abundance with fresh water.
After being washed, they were stained for 5 minutes with the PonceauFucsina solution. They were washed afterwards with distilled water, and they
were put phosphomolybdic acid stain 1% for 5 minutes. They were once again
washed with distilled water and stained with aniline blue, in a period of time that
varied between 2 to 5 minutes.
45
Finally, and after a new washing with distilled water, the tissues were
dehydrated, diaphanized and then assembled in a resinous mounting
environment.
The results found in the different cuts were done according to the classic
technique, i.e., the nucleuses stained of dark blue, the collagen of blue, the
muscle fibres of red, the erythrocytes of yellow to orange, the cytoplasms of red,
the nervous structures of blue, and the fibrinogen of dark red.
3.5.3. Immunohistochemical Technique
The studied tissues were submitted to an immunohistochemical
technique for assessment the presence of actin, vimentine, desmin and p63,
using respectively, the antibodies NCL–SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESMDERII and NCL-p63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories
Ltd., Newcastle upon Tyne, UK).
For this effect, the blades with histological cuts were desparaffined for 20
minutes in xylol and hydrated in a decreasing series of alcohols to water
(alcohol 100% for 5 minutes, alcohol 100% for 5 minutes, alcohol 70% for 5
minutes, alcohol 50% for 5 minutes and fresh water for 5 minutes).
The used samples were fixed with buffered formaldehyde 10%, and
included in paraffin. The tissue fixation process in formaldehyde provides the
formation of crossed connections which masked the antigenic epitopes. This
way, some antibodies need an antigenic recovery to detect their specific
antigenic epitope. In this series, with the anti-vementine and anti-actin
antibodies, it was not necessary to proceed with the antigenic recovery, since
these antibodies detect their antigenic epitopes, without being necessary to
break the crossed connections created by the fixation in formaldehyde.
However, to detect the antigenic epitopes p63 and desmin, the antigenic
recovery was necessary, using high temperatures. In this work, the antigenic
46
recovery was done with a commercial solution (RA Epitope Retrival Solution
pH6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) similar to the
solution of original citrate buffer (10mM, pH=6.0), in water bath at 98ºC, for 30
minutes.
The detection system used for the immunohistochemical reaction was a
detection kit with peroxidase polymer (Novolink Polymer Detection System,
Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), and the detection of
the different types of antibodies was made following the manufacturer
instructions for this detection system: endogenous Peroxidase Block with a
Peroxidase Block, for 5 minutes; unspecific reaction inhibition with Protein
Block, for 5 minutes; incubation of the primary antibodies (anti-actin, 1/200
dilution and incubation for 15 minutes at room temperature; anti-desmin, 1/50
dilution and incubation at room temperature for 60 minutes; anti-vimentine,
1/200 dilution and incubation at room temperature for 30 minutes; anti-p63, 1/10
dilution and incubation at room temperature for 60 minutes); reagent incubation
with Post Primary Block, for 30 minutes; Incubation with Polymer, for 30
minutes; revelation with OBD, for 5 minutes. After the immunohistochemical
marking, the histological cuts were contrasted with Haematoxylin for 2 minutes,
dehydrated in an increasing series of alcohols (alcohol 50% for 2 minutes,
alcohol 80% for 2 minutes, alcohol 95% for 2 minutes, two times alcohol 100%
for 2 minutes), diaphanized in xylol and assembled.
The precision of the immunohistochemical technique depends on getting
an highly specific marking, preventing an unspecific reaction of the primary
antibody in the tissue. In immunohistochemistry, it is necessary assure that
each antibody is used in the appropriate dilution, it does not evaporate during
the incubation and it is removed completely if it is not connected, before the
next reagent is added. For this reason, in each executed test, blades with
histological cuts of tissues with the presence of antigenic epitopes were
included and, before the technique execution, the standardization of the most
appropriate conditions was done, adapting it for each primary antibody, the use
47
of antigenic recovery and the incubation time, temperature and primary antibody
dilution. The technique was developed in a humidity cabinet and each cut was
isolated with hydrophobic pen. In each reaction, histological cuts of ileocecal
appendix as positive control to the anti-actin, anti-desmin and anti-vimentine
antibody, and histological cuts of prostate as positive control to the anti-p63
antibody were included.
48
4. DISCUSSION AND CONCLUSIONS
The smooth muscle phenotype which shows the myoepithelial cells is
demonstrated by positive marking for the actin of the smooth muscle cell. These
markers, specially the α-actin, are determinant for the identification of the
myofibroblasts in a complex stroma and, sometimes, desmoplastic.
In the periodontal disease context, it is frequent the phenotype
expression of the α -actin by the myofibroblasts, especially at the level of the
joined gum. The cytoskeleton marking is also positive for the vimentine and
desmin filaments. Its expression is obvious; however, it is inferior to the
observed for the individuals who present pathologies of desmoplastic or even
neoplasic type (group III).
From the developed study, the following conclusions can be obtained:
1. The main pathologies of the oral cavity can be followed directly and
proportionally by the phenotypic expression of the myofibroblasts.
2. The immunomarking intensity by the α-actin, desmin, vimentine and
P63 is directly proportional to the severity of the main lesions in the
oral cavity.
3. The immunomarking intensity by the α-actin, desmin, vimentine and
P63 is an important diagnosis and prognosis factor of the main
lesions in the oral cavity.
49
4. The immunomarking by the α-actin, desmin, vimentine and P63 tends
to be negative in the absence of proliferative phenomena.
5. The immunomarking by the α-actin shows the evolution of the
periodontal disease severity.
50
Resumen
1. INTRODUCCIÓN
Los miofibroblastos son células que expresan la isoforma α-actina de la
célula muscular lisa. Estas células exhiben características intermedias entre
fibroblastos y células musculares lisas; sin embargo revelan una morfología
similar al de los fibroblastos. Los miofibroblastos también han sido llamados de
fibroblastos peri-tumoral, fibroblastos asociados al carcinoma y fibroblastos
activos del estroma, pero hoy son comúnmente conocidos por miofibroblastos.
Ellos se presentan como una pequeña subpoblación celular en casi todos los
órganos y son capaces de expresar y secretar una gran cantidad de citocinas,
factores
de
crecimiento,
quimiocinas,
hormonas,
neurotransmisores,
mediadores inflamatorios, proteínas de adhesión y proteínas de la MEC - matriz
extracelular.
Los miofibroblastos son también responsables por la alta producción de
material colágeno, metaloproteinasas, gelatinases, glicosaminoglicanos y
factores
de
crecimiento
de
hepatocitos
y
queratinocitos.
Con base en su capacidad de expresar altos niveles de citocinas, matriz
extracelular y α-actina del músculo liso vascular, el miofibroblasto desempeña
una participación muy importante durante la inflamación, deposita tejido
conectivo, r, esperándose que estos puedan contribuir a la respuesta fibrótica a
través de los fenotipos característicos concernientes.
Los miofibroblastos se caracterizan morfológicamente como células
alargadas, fusiformes o estrelladas con un núcleo regular y central. Ellos
presentan un prominente citoplasma de microfilamentos de actina (fibras de
estrés), un retículo endoplasmático bien desarrollado y están conectados entre
sí a través de nudos y adhesiones del tipo gap junctions. Estas células también
establecen contactos con los componentes de la matriz extracelular a través de
51
fibronexus, que es un complejo transmembrana formado por la actina, la
fibronectina y la integrina. Los miofibroblastos son identificados a través de la
expresión de α-SMA.
Este marcador citoplasmático se encuentra, además, en otros dos tipos
de células: células musculares lisas y células mioepiteliales. La presencia de
otros marcadores como la laminina, desmina, calponina, miosina del músculo
liso, caldesmonina y proteína de activación de los fibroblastos ha sido utilizada
para caracterizar los miofibroblastos, pero el patrón de expresión es variable y
depende principalmente del origen, ubicación y condición patológica. Por
consiguiente, α-SMA es el mejor marcador celular para la identificación de
miofibroblastos, permitiendo identificar y supervisar el comportamiento de estas
células en contextos clínicos y patológicos. Estas células pueden encontrarse
en inúmeras situaciones, participando ya sea en procesos fisiológicos o bien en
procesos patológicos. Los miofibroblastos contribuyen para el crecimiento y
diferenciación de los tejidos y órganos, a través de la interacción con las
células epiteliales, y también desempeñan un papel importante en el proceso
de reparación, a través de la retracción de tejido de granulación y de la síntesis
de MEC, incluyendo el colágeno, fibronectina y proteoglicanos. Sin embargo, si
persisten estas células, una cantidad excesiva de colágeno se produce, lo que
resulta en transtornos fibróticos tales como la fibrosis hepática y queloides.
52
2.OBJETIVOS
En este trabajo, son observadas diferentes formas de expresión
inmunocitoquímica, en diversos entornos clínicos.
El objetivo fue establecer una escala progresiva de expresión biológica
con alta aplicabilidad en el contexto clínico con respecto al diagnóstico de las
principales patologías de la cavidad oral. Por lo tanto, son objetivos de este
trabajo:
1. Caracterizar una muestra de las principales patologías de la cavidad
oral.
2. Evaluar la expresión fenotípica de los miofibroblastos en las
principales patologías de la cavidad oral a través de un panel de
anticuerpos: alfa-actina, desmina, vimentina y P63.
3. Relacionar la intensidad de la inmunomarcación con la severidad de
las principales lesiones de la cavidad oral.
53
3.MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra estudiada es formada por 90 personas, de la consulta de
Medicina Dental, del Hospital Senhora da Oliveira – Guimarães, en el norte de
Portugal, entre los años 2003 y 2008.
A todos los individuos se aplicó un protocolo de trabajo, previamente
establecido, en el cual se han listado los principales elementos de su identidad,
su historia clínica y la ubicación exacta de la cosecha. En las personas de los
grupos I y II se registró también la información relativa a las patologías
diagnosticadas.
3.2.EVALUACIÓN CLÍNICA
La evaluación clínica se realizó a través de una anamnesis y de un
examen objetivo. En la anamnesis, se ha elaborado un cuestionario sobre las
principales patologías locales y sistémicas, presentes o pasadas, hábitos y
terapéuticas.
En el examen objetivo se ha realizado una observación clínica, intra y
extraoral. En el examen extraoral, fueron descartados los principales cambios
esqueléticos, de la piel y mucosas. En el examen intraoral, se evaluó las
mucosas de revestimiento, masticatoria y especializada. Además se observó
las principales inserciones de frenillos, tumefacciones, pigmentaciones
exógenas y endógenas de los tejidos blandos y duros. A continuación, se
completó un ficha clínica periodontal para los respectivos registros.
El diagnóstico de periodontitis se basa en el índice de extensión y
severidad.
55
Las diversas patología de la cavidad oral se basaron en los diagnósticos
anatomopatológicos.
Después de la evaluación clínica y histopatológica, los individuos fueron
asignados por sus grupos de estudio de la siguiente manera:
-
Grupo I: Aquí han sido colocadas todas las personas que no
manifestaron ninguna patología sistémica o localizada. Clínicamente
se clasifican como clínicamente sanos y actuaron como grupo de
control.
-
Grupo II: Aquí han sido colocadas todas las personas que no han
demostrado ninguna patología sistémica, pero que han todavía
manifestado una pérdida de la inserción clínica de leve a moderada.
Clínicamente se clasifican como personas con periodontitis leve a
moderada y actuaron como grupo de periodontitis. La clasificación
leve a moderada se basó en la clasificación de Armitage, 1999.
-
Grupo III: Aquí han sido colocadas todas las personas que
presentaron otras patologías de la cavidad oral, previamente
diagnosticadas. Clínicamente fueron clasificadas de acuerdo con las
distintas patologías y sirvieron de base para un estudio comparativo
con los otros dos grupos. Las patologías estudiadas fueron:
leucoplasia, carcinoma de células escamosas, liquen plano, fibroma,
fibroma, hiperplasia fibroepitelial, épulis fibromatoso
y épulis
granulomatosa.
3.3. TÉCNICA DE COSECHA
Los tejidos fueron recolectados en ambiente aséptico, por medio de la
técnica de biopsia convencional al nivel de la región vestibular de los 3º y 4º
cuadrantes, en la transición entre la encía libre (marginal) y encía adherida con
56
tamaños que oscilaron entre 2x2mm y 10x5mm. Todas las biopsias se
realizaron con anestesia loco-regional à base de lidocaína al 2%, después del
consentimiento previo del paciente obtenido por escrito de manera informada y
voluntaria, en formulario apropiado, aprobado por el comité de ética del
Hospital Senhora da Oliveira - Guimarães.
3.4. FIJACIÓN
Todos los tejidos estudiados en microscopía óptica fueron fijados con
formaldehído tamponado al 10%, en una cantidad que representaba a lo menos
diez veces el volumen del tejido fijado.
Los tejidos estudiados en microscopía óptica fueron fijados en buffer
cacodilato de sodio a 0,1 M (pH 7,4). En algunos casos se efectuó el
procesamiento directo desde la fijación para la microscopía óptica.
3.5. PROCESAMIENTO
3.5.1. Procesamiento de tejidos para la microscopía electrónica
A partir de las muestras incluidas en los bloques de parafina, se ha
realizado una selección del área de mayor interés, que ha sido retirada,
cuidadosamente, con la ayuda de un bisturí. El fragmento fue cortado en
pedazos pequeños y se colocaron en xilol durante 24 horas para eliminar toda
la parafina. Se procedió a una hidratación por una serie decreciente de
alcoholes con pasajes de 1 hora por etanol al 100% y de 30 minutos por etanol
al 90% y 70%, siempre con dos reemplazamientos para cada alcohol.
A continuación, los fragmentos han sido sumergidos en buffer cacodilato
de sodio a 0,1 M (pH 7,4) por 1 hora y 30 minutos, haciendo cambios en el
buffer cada 30 minutos. Se procedió a la etapa de post-fijación durante 1 hora
(a 4º C) con tetraóxido de osmio al 1%, en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M
57
(pH 7,4). Posteriormente, se llevó a cabo una deshidratación por serie de
alcoholes de gradación creciente, con pasajes de 10 minutos en solución de
etanol al 50%, 75%, 90% y 95%, siempre a una temperatura de 4º C, seguidas
de tres pasajes, también de 10 minutos cada uno, en etanol absoluto. En el
último reemplazamiento de etanol absoluto, el procesamiento ha sido realizado
a temperatura ambiente. En seguida, dos pasajes más de 10 minutos cada
uno, pero ahora por óxido de propileno. La impregnación de las muestras en la
resina de inclusión consistió en presentar los fragmentos en mezclas de óxido
de propileno y una resina tipo Epoxy (Epon ®) en las proporciones de 3:1, 1:1 y
1:3, respectivamente, con una duración de 1 hora en cada mezcla.
Por último, los fragmentos fueron sumergidos en Epon puro, en el cual
quedaron durante 1 hora a temperatura ambiente y durante 30 minutos a 50 º
C. A esto se siguió la inclusión, realizada en moldes de goma los cuales,
después de completados con un fragmento en cada extremo y llenos de Epon,
fueron incubados en estufa a una temperatura de 60 º C durante 2 días para la
polimerización de la resina. Los cortes ultrafinos fueron realizados con un
bisturí de diamante, en un ultramicrótomo (Leica Ultracut ®), y fueron recogidos
en mallas de cobre con 200 mesh. Se llevó a cabo manualmente, una doble
contrastación de los cortes, sumergiéndose, en primer lugar, las mallas con los
cortes en una solución salina de acetato de uranilo durante 20 minutos y
posteriormente, en una solución de citrato de plomo durante 10 minutos. La
observación se hizo en un microscopio electrónico de transmisión JEOL
100CXII, donde se efectuaron registros de algunas imágenes en forma de
micrografías.
3.5.2. Procesamiento de tejidos en histoquímica
3.5.2.1. Coloración de Hematoxilina – Eosina
La coloración de Hematoxilina-Eosina fue utilizada en todos los tejidos
estudiados como primera coloración. Este procedimiento es el principal método
histoquímico realizado en la rutina histopatológica, acompañando siempre las
58
técnicas complementarias de diagnóstico como la inmunohistoquímica. Se
utiliza puesto que es la técnica que nos proporciona una relación núcleocitoplasma más fiable y porque es la que mejor demuestra la estructura del
tejido. Esta es también una técnica capaz de exponer los elementos principales
de tejidos: el núcleo, el citoplasma y el colágeno.
Procedimiento técnico:
Los tejidos se prepararon sobre la base del protocolo, establecido por el
laboratorio de Anatomía Patológica y siguió los pasos que se detallan a
continuación:
Los tejidos fueron sometidos a tres baños sucesivos en xilol, con tan
sólo 10 minutos por cada baño. En seguida, los tejidos fueron hidratados por
una serie de alcoholes de gradación decreciente, respectivamente al 100%,
95%, 80%, 50% y, por último, fueron colocados en agua.
Después de lavarse los tejidos, fueron coloreados con hematoxilina durante 3
minutos, y se lavó nuevamente en agua para colocarse en seguida en Ácido
Clorhídrico para la diferenciación. Subsiguientemente fueron lavados con agua
corriente durante 10 minutos y luego coloreados por la eosina durante 3
minutos. Después de coloreados por la eosina, las secciones fueron lavadas,
se eliminó los excesos de colorante, y se incubaron en estufa durante 10
minutos.
Después del secado de las secciones, se procedió a la montaje en
medio resinoso (Entellan ®).
3.5.2.2. Tricrómico de Masson Especial
Esta coloración especial fue muy importante en la identificación de las
fibrillas de colágeno y su ubicación, para la comprensión de los procesos
patológicos asociados a los miofibroblastos, como la expresión del tejido
conectivo en el proceso de reparación, y normalización de los cambios
histológicos en respuesta a agresiones físicas o químicas.
59
Procedimiento:
Inicialmente se hizo una desparafinación, seguida por una hidratación y
lavado. Los tejidos fueron lavados con agua destilada y coloreados con azul
celeste durante 5 minutos.
En seguida, los cortes fueron aclaradas y los núcleos fueron coloreados
con hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Los cortes fueron cubiertos con el
alcohol pícrico durante 5 minutos y luego lavados abundantemente con agua
corriente.
Después de bien lavados, fueron coloreados durante 5 minutos por una
solución de Ponceau-Fucsina. En seguida, fueron lavados con agua destilada y
se colocaron en el mordiente Ácido Fosfomolíbdico al 1% durante 5 minutos.
Los cortes fueron lavados nuevamente con agua destilada y coloreados por el
azul de anilina durante un tiempo que osciló entre 2 a 5 minutos.
En último lugar, y después de nuevo lavado con agua destilada, los tejidos
fueron deshidratados, y diafanizados y en seguida se procedió a la montaje en
medio resinoso.
Los resultados encontrados en los diferentes cortes estaban en
consonancia con la técnica clásica, es decir, los núcleos se tiñeron de azul
oscuro, el colágeno de azul, las fibras musculares de rojo, los glóbulos rojos de
color amarillo a naranja, los citoplasmas de rojo, las estructuras nerviosas de
azul y el fibrinógeno de rojo oscuro.
3.5.3. Técnica De Inmunohistoquímica
Los
tejidos
estudiados
fueron
sometidos
a
una
técnica
inmunohistoquímica para una evaluación de la presencia de actina, vimentina,
desmina y p63, utilizando los anticuerpos NCL-SMA, NCL-L-VIM-572, NCLDESM-DERII
y
NCL-p63
(mouse
monoclonal
antibody,
Novocastra
Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), respectivamente.
Con este propósito, las láminas con cortes histológicas fueron
desparafinadas durante 20 minutos en xilol y hidratadas por una serie
decreciente de alcoholes hasta el agua (alcohol al 100% 5 minutos, alcohol al
60
100% 5 minutos, alcohol al 70% 5 minutos, alcohol al 50% 5 minutos y agua
corriente 5 minutos).
Las muestras utilizadas fueron fijadas con formaldehído tamponado al
10% e incluidas en parafina. El proceso de fijación de los tejidos en
formaldehído proporciona la formación de enlaces cruzados que enmascaran
los epítopes antigénicos. Por lo tanto, algunos anticuerpos requieren la
recuperación antigénica para detectar a su epítope antigénico específico. En
esta serie, con los anticuerpos anti-vimentina y anti-actina no fue necesario
procederse a la recuperación antigénica ya que estos anticuerpos detectan a
sus epítopes antigénicos específicos sin tener que romper los enlaces cruzados
causados por la fijación en formaldehído. Sin embargo, para la detección de
epítopes antigénicos p63 y desmina, fue necesario realizar la recuperación
antigénica utilizando altas temperaturas. En este estudio, la recuperación
antigénica se realizó con una solución comercial (RA Epitope Retrival Solution
pH6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) similar a la
solución de tampón citrato original (10mm, pH = 6,0) en baño maría a 98° C
durante 30 minutos.
El sistema de detección utilizado para la reacción de inmunohistoquímica
fue un kit de detección con polímero de peroxidasa (Novolink Polymer
Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), y
la detección de los diferentes tipos de anticuerpos se hizo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante de este sistema de detección: Bloqueo de la
Peroxidasa endógena con la Peroxidase Block, durante 5 minutos; inhibición de
las reacciones inespecíficas con Protein Block, durante 5 minutos; incubación
de los anticuerpos primarios (antiactina, dilución de 1/200 y incubación durante
15 minutos a temperatura ambiente; anti-desmina, dilución de 1/50 y
incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, dilución
de 1/200 y incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63,
dilución de 1/10 y incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos);
incubación del reactivo Post Primary Block, durante 30 minutos; Incubación con
Polymer, durante 30 minutos; revelación con DAB, durante 5 minutos. Después
61
de
la
marcación
inmunohistoquímica,
los
cortes
histológicos
fueron
contrastados con Hematoxilina, durante 2 minutos, deshidratados por una serie
creciente de alcoholes (alcohol al 50% durante 2 minutos, alcohol al 80%
durante 2 minutos, alcohol al 95% durante 2 minutos, dos veces alcohol al
100% durante 2 minutos), diafanizados en xilol y montados.
La exactitud de la técnica de inmunohistoquímica depende de la
obtención de una marcación muy específica previniendo así las reacciones
inespecíficas del anticuerpo primario en el tejido. En la inmunohistoquímica es
necesario garantizar que cada anticuerpo se usa en la dilución adecuada, que
no se evapora durante la incubación y que es eliminado completamente, si no
está ligado, antes de añadir el reactivo siguiente. Por este motivo, en cada
ensayo realizado se incluyeron láminas con cortes histológicos de tejidos con la
presencia de los epítopes antigénicos en cuestión y, antes de la realización de
la técnica se procedió a la normalización de las condiciones más adecuadas,
adaptándose a cada anticuerpo primario, el uso de la recuperación antigénica y
el tiempo de incubación, la temperatura y la dilución del anticuerpo primario. La
técnica se llevó a cabo en cámara húmeda y cada corte se aisló con pluma
hidrofóbica. En cada reacción, se incluyeron cortes histológicos de apéndice
íleocecal como control positivo para el anticuerpo anti-actina, anti-desmina antivimentina, y cortes histológicos de la próstata como control positivo para el
anticuerpo anti-p63.
62
4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
El fenotipo del músculo liso que presenta las células mioepiteliales, es
demostrado por la marcación positiva para la actina de la célula muscular lisa.
Estos marcadores, en particular la α-actina, son fundamentales para la
identificación de los miofibroblastos en un estroma complejo y, a veces,
desmoplásico.
En el contexto de la enfermedad periodontal es frecuente la expresión
fenotípica de la α-actina por parte de los miofibroblastos, en particular en la
encía adherida. La marcación del citoesqueleto es igualmente positiva para los
filamentos de vimentina y desmina. Su expresión es clara, sin embargo, inferior
a la observada para las personas que presentan patologías del tipo
desmoplásico o incluso neoplásico (Grupo III).
De los análisis realizados se pueden extraer las siguientes conclusiones:
1. Las principales patologías de la cavidad oral pueden ser acompañadas
de una forma directa y proporcional por la expresión fenotípica de los
miofibroblastos.
2. La intensidad de la inmunomarcación por la α-actina, desmina, vimentina
y P63 es directamente proporcional a la severidad de las principales
lesiones de la cavidad oral.
3. La intensidad de la inmunomarcación por la α-actina, desmina, vimentina
y P63 es un factor importante de diagnóstico y pronóstico de las
principales lesiones de la cavidad oral.
4. La inmunomarcación por la α-actina, desmina, vimentina y p63 es
tendencialmente negativa en la ausencia de fenómenos proliferativos.
63
5. La inmunomarcación por la α-actina, muestra la evolución de la
severidad de la enfermedad periodontal.
64
INTRODUÇÃO
Introdução
1. INTRODUÇÃO
Os miofibroblastos são células que expressam a isoforma α-actina da
célula muscular lisa (Powell et al., 2005). Estas células demonstram
características intermediárias entre fibroblastos e células musculares lisas, no
entanto apresentam morfologia similar aos fibroblastos (Powell et al., 2005;
Desmoulière et al., 2004; Grotendorst et al., 2004). Miofibroblastos foram
também denominados de fibroblastos peri-tumorais, fibroblastos associados ao
carcinoma e fibroblastos activos do estroma, mas hoje são mais trivialmente
chamados de miofibroblastos (Lewis et al., 2004). Estão presentes como uma
pequena subpopulação celular em quase todos os órgãos e são capazes de
expressar e secretar uma extensa quantidade de citocinas, factores de
crescimento,
quimiocinas,
hormonas,
neurotransmissores,
mediadores
inflamatórios, proteínas de adesão e proteínas da matriz extra celular (Orimo &
Weinberg, 2006; Desmoulière et al., 2004).
Os miofibroblastos são também responsáveis pela produção acentuada
de colagénio, metaloproteinases, gelatinases, glicosaminoglicanos e factores
de crescimento hepatocíticos e queratinocíticos (Jester et al. 1999, 2002).
Uma vez que o miofibroblasto manifesta a capacidade para expressar
níveis elevados de citoquinas, matriz extracelular e α-actina do músculo liso,
desempenha um papel chave na inflamação, depositando tecido conjuntivo e
contribuindo para a resposta fibrótica através dos respectivos fenótipos
característicos (Phan et al., 2002; Ferreira et al.).
Os miofibroblastos são caracterizados morfologicamente como células
alongadas, fusiformes ou estreladas, com núcleo regular e central (Mike &
67
Introdução
Östman, 2004). Possuem características intermediárias entre fibroblastos e
células musculares lisas (B. Li & J.H.-C. Wang, 2009; Powell et al., 2005;
Desmoulière et al., 2004; Grotendorst et al., 2004). Apresentam um
proeminente citoplasma com microfilamentos de actina (fibras de stress), um
retículo endoplasmático bem desenvolvido e estão conectados uns aos outros
através de aderências e junções do tipo gap junctions (Mike & Östman, 2004;
Tang et al., 1996; Darby et al., 1994). Estas células também estabelecem
contactos com os componentes da matriz extracelular através de fibronexus,
que é um complexo transmembranar formado por actina, integrina e
fibronectina (Powell et al., 1999; Eyden, 1993). Os miofibroblastos são
identificados através da expressão de α-actina (Desmoulière et al., 2004). Este
marcador citoplasmático é encontrado adicionalmente noutros dois tipos
celulares: células musculares lisas e células mioepiteliais. A presença de outros
marcadores como laminina, desmina, calponina, miosina de músculo liso,
caldesmonina e proteína de activação de fibroblastos, têm sido utilizadas para
caracterizar os miofibroblastos, mas com padrão de expressão variável e
dependente principalmente da origem, localização e condição patológica (Mike
& Östman, 2004). Então, a α-actina é o melhor marcador celular para
identificação dos miofibroblastos, permitindo monitorizar e identificar o
comportamento destas células em situações clínicas e patológicas. Estas
células podem ser encontradas em inúmeras situações, participando tanto de
processos fisiológicos quanto patológicos. Os miofibroblastos contribuem para
o crescimento e diferenciação dos tecidos e órgãos, através de interacções
com células epiteliais, desempenhando também um importante papel no
processo de reparação, através da retracção do tecido de granulação e da
síntese
de
matriz
extracelular,
incluindo
colágenio,
fibronectina
e
proteoglicanos (Gailit et al., 2001). Contudo, se estas células persistem, uma
quantidade excessiva de colágeno é produzida, resultando em desordens
fibróticas, como quelóide e fibroses hepáticas (Desmoulière et al., 2003;
Vaquero et al., 1999; Gunhan et al., 1995).
Li & Wang (2010) reportaram que os miofibroblastos podem derivar de
células epiteliais tubulares através da transição epitélio-mesênquima (EMT),
podendo adiconalmente derivar de células precursoras fibrócitárias, circulantes
68
Introdução
no sangue periférico, as quais representam uma sub-população de leucócitos
originários da medula óssea que possuem características semelhantes aos
fibroblastos. Outra possibilidade defendida é que estes derivam de células
estaminais tecido-específicas que sobre determinado estímulo (ex.mecânico)
se diferenciam em miofibroblastos.
69
OBJECTIVOS
Objectivos
2. OBJECTIVOS
Hipótese: Os miofibroblastos estão presentes na gengiva e no ligamento
periodontal de doentes com patologia da cavidade oral
Hipótese nula: Os miofibroblastos não estão presentes na gengiva e no
ligamento periodontal de doentes com patologia da cavidade oral
O objectivo principal foi estabelecer uma escala gradual de expressão
biológica por observação de diferentes formas de expressão imunohistoquímica, com elevada aplicabilidade no contexto clínico ao nível do
diagnóstico das principais patologias da cavidade oral. Assim, são objectivos
secundários deste trabalho:
 Caracterizar uma amostra das principais patologias da cavidade oral.
 Avaliar a expressão fenotípica dos miofibroblastos presenes nas
principais patologias da cavidade oral, através de um painel de
anticorpos: alfa-actina, desmina, vimentina e P63.
 Relacionar a intensidade da imunomarcação com a severidade das
principais lesões da cavidade oral.
73
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Fundamentos Teóricos
3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
O estudo dos miofibroblastos há muito que tem sido investigado por
diversos autores. Na realidade, podemos dizer que o grande pioneiro destes
estudos foi Carrel, tendo publicado trabalhos científicos relacionados com os
tratamentos e cicatrização de lesões (Carrel, 1910; 1916). Abercrombie et al.,
(1956) relacionaram células do tecido conectivo com a geração de forças de
tensão responsáveis pela contracção do mesmo.
O tecido de granulação de uma lesão foi definido como o ―órgão de
contractura‖ (Billingham and Russel, 1956). Outros estudos posteriores
demonstraram que as células geradoras de força estavam localizadas nas
margens da lesão e não no centro do tecido de granulação, conforme era
descrito anteriormente (Watts et al., 1958).
Também outros autores seguiram o trabalho de Carrel, tendo concluído
que as forças contrácteis residem no tecido de granulação que preenche a
lesão (James, 1964; Ross, 1968; Van Winkle, 1967). Subsequentemente,
Gabbiani et al. (1972) demonstraram ―in vitro‖ que o tecido de granulação
apresentava um comportamento semelhante ao de uma contracção do músculo
liso e descobriram que as células no seu interior exibem algumas
características de células musculares lisas, tal como feixes de filamentos de
actina (fibras de stress). Mediante o seu comportamento, e dado que as
77
Fundamentos Teóricos
mesmas são as responsáveis pela geração de força, Majno et al. (1971)
atribuíram-lhe o nome de ―miofibroblastos‖. Já Skalli and Gabbiani, (1988) e
Rudolph et al. (1992) os referiram como sendo a característica comum de
tecidos que sofram este tipo de contracção.
Hinz (2007), define ―miofibroblasto como uma célula reparadora do
tecido conjuntivo, que contribui para a reconstrução de tecido danificado, pela
produção de nova matriz extra-celular (MEC) e por exercer uma elevada força
contráctil,
mantendo
determinadas
características‖.
As
características
associadas ao miofibroblasto são: um extenso sistema fibrilar citoplasmático;
uma marcação imuno-histoquímica do seu citoplasma com soro humano antimúsculo liso; um núcleo com pregas e múltiplas indentações indicativas de
contracção celular como no músculo liso, miocárdio, endotélio vascular; uniões
de célula com célula e de célula com estroma.
3.1. ORIGEM DOS MIOFIBROBLASTOS
A origem dos miofibroblastos permanece por esclarecer. Apesar da sua
importância na fibrose, a origem dos miofibroblastos e a génese das diversas
subpopulações caracterizadas por distintos fenótipos permanecem pouco
claros. Têm sido descrito fenótipos distintos e relativamente estáveis em
miofibroblastos isolados a partir de tecidos submetidos a remodelação, que não
estavam presentes no tecido normal intacto. Isto indica um processo pelo qual
estas distintas subpopulações de miofibroblastos poderiam surgir a partir de
progenitores ou células precursoras residentes e/ou serem recrutados a partir
de vários tecidos, tais como a medula óssea. As provas para estas
possibilidades são analisadas, mas há ainda um entendimento incompleto
sobre as células precursoras e a sua potencial interrelação entre os vários
fenótipos, especialmente quanto à forma como estes se relacionam com o
fenótipo distinto do miofibroblasto. Além disso, a complexidade do mecanismo
para a génese destes fenótipos, tais como o miofibroblasto, é destacado pela
regulação dos vários processos de diferenciação, com evidência para a
78
Fundamentos Teóricos
importância das várias vias
sinalizadoras, factores de transcrição e
mecanismos epigenéticos.
Na pele lesionada, uma proporção substancial de miofibroblastos
expressam marcadores de superfície, nomeadamente CD13 e CD45, os quais
não poderiam ser expressos se se diferenciassem a partir dos fibroblastos.
Ultra-estruturalmente os miofibroblastos são distintos dos fibroblastos, por
apresentarem abundantes aderências inter-celulares, predominantemente
junções de hiato e microfilamentos citoplasmáticos contrácteis (fibras de
estresse), que compõem o aparelho contráctil da célula (Li & J.H.-C. Wang,
2009).
De facto, das experiências de Mori et al, (2005) estas, indicaram que o
tecido de fibroblastos não apresenta imunoreactividade ao CD13 e ao CD45.
Os fibrócitos representam a única população celular conhecida que expressa
CD13 e CD45 em conjugação com a α-actina (Metz, 2003). Ao examinarem o
fenótipo dos fibrócitos isolados da ferida em diferentes pontos temporais, Mori
et al., (2005) descobriram que 61,4% destas células tornaram-se α-actina
positivas entre o quarto e o sétimo dia pós-lesão, indicando uma proporção
substancial de fibrócitos que começam a sua diferenciação em miofibroblastos
nesse local do tecido. Embora tenha sido encontrada a diferenciação dos
fibrócitos em miofibroblastos ―in vitro‖, quando estimulados com citoquinas
fibrogénicas envolvidas na reparação tecidular (como a TGF-β1), poucos
estudos (Schmidt et al, 2003) apresentam evidências dos miofibroblastos se
poderem formar a partir dos fibrócitos ―in vivo‖. Simultâneamente, existem
documentos contraditórios e inconclusivos sobre a origem dos fibrócitos a partir
da medula óssea (Phillips et al, 2004). No entanto, Mori et al, (2005) obtiveram
resultados que indicaram a formação dos fibrócitos a partir da derivação de
precursores da medula óssea e que, os mesmos, contribuem para a população
de miofibroblastos presentes nas lesões. Também é suportada a hipótese de
que os fibrócitos medeiam a reparação do tecido e da sua remodelação.
O desenvolvimento destes estudos contribui para uma evidência
crescente de que as células da medula óssea contêm stem cells que se podem
79
Fundamentos Teóricos
diferenciar quer em células hematopoiéticas (incluindo macrófagos) como
também em células não hematopoiéticas (incluindo células endoteliais,
perícitos, condrócitos, osteoblastos, adipócitos, células de componente neural,
fibroblastos e naturalmente queratinócitos), sendo no entanto, importante referir
que todas apresentam papéis importantes no processo de reparação tecidular
(Badiavas et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005). Surpreendentemente, tem-se
visto que as células da medula óssea se diferenciam em células mesangiais
glomerulares, hepatócitos e células miogénicas, incluindo nestas últimas,
células miocárdicas e mioblastos, após a sua entrada no microambiente do
tecido específico (nicho). No entanto até à data, o efeito das células da medula
óssea na reparação de lesões ainda não foi totalmente esclarecido (Badiavas
et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005).
Actualmente, tem sido aceite que a modulação miofibroblástica dos
fibroblastos inicia-se com o aparecimento de protomiofibroblastos, cujas fibras
de stress contêm apenas actinas citoplasmáticas do tipo β e γ. Em cultura, o
protomiofibroblasto é um fenótipo estável, representando um passo intermédio
na maior parte das condições ―in vivo‖ onde se procede em direcção ao
miofibroblasto diferenciado, que é caracterizado pela expressão de novo de αactina músculo liso, o seu mais comum marcador molecular utilizado.
Apesar destas células tenderem a evoluir para miofibroblastos diferenciados, a
variante mais comum desta célula, com fibras de stress contendo α-actina,
dever-se-á referir que existem casos excepcionais. Os miofibroblastos podem,
de acordo com a situação clínica ou experimental, expressar uma outra
proteína contráctil da célula muscular lisa, tal como a cadeia pesada de miosina
ou a desmina (Desmoulière et al, 1993). No entanto, torna-se importante
destacar que a presença do α-actina representa o marcador mais seguro do
fenótipo miofibroblástico (Tomasek et al, 2002).
Embora a modulação para protomiofibroblastos não esteja bem
conhecida até ao presente, o mesmo não pode ser dito em relação à mudança
destes para miofibroblastos diferenciados. Na verdade, esta mudança tem
vindo a ser referenciada através de células inflamatórias e de células
fibroblásticas, apresentando-se o Transforming growth factor-β1 (TGF-β1),
80
Fundamentos Teóricos
como o estimulador mais aceite para esta diferenciação miofibroblástica
(Desmoulière et al, 1993).
Quanto à diferenciação dos miofibroblastos a partir dos fibroblastos,
vários estudos têm sido realizados. Na córnea, observa-se que os queratócitos
se diferenciam em miofibroblastos (Netto et al, 2005). A transformação dos
queratócitos em miofibroblastos deve-se principalmente à presença de factores
de crescimento, como TGF-β e também ocorre secundariamente a uma
diminuição na densidade celular (Jester et al, 2002; Folger et al, 2001). A
identificação directa dos miofibroblastos é possível através da utilização de
anticorpos específicos contra α-actina, abundantemente encontrada nessas
células.
Diferenciação
miofibroblástica
foi
igualmente
evidenciada
por
Microscopia Electrónica de Transmissão e imuno-histoquímica num caso de
Mixoma odontogénico, onde se observou ultra-estruturalmente miofilamentos
na periferia do miofibroblasto, estas alterações são sugestivas de proporcionar
alterações na matriz extracelular que podem contribuir para a invasão deste
tipo de tumor (Martínez-Mata G et al, 2008).
A trans-diferenciação fenotípica dos queratócitos secundária ao trauma
cirúrgico resulta em importantes alterações fisiológicas, incluindo uma
exacerbação na contractilidade e uma produção anómala de componentes da
matriz extracelular (Dohlman et al, 1968; Campos et al, 1994).
Ross et al, (1970), na década de setenta, propuseram, através dos seus
estudos, que os miofibroblastos eram originados pelo recrutamento local de
fibroblastos presentes no tecido circundante dérmico e subcutâneo.
No entanto, foi descrita outra fonte possível do aparecimento dos
miofibroblastos, nomeadamente, através dos pericitos, designados como
células musculares lisas vasculares envolvendo vasos no tecido de granulação
(Desmoulière et al, 2004). A presença dos miofibroblastos tem sido relatada em
praticamente todas as situações fibróticas caracterizadas por retracção de
tecido e remodelação (Desmoulière et al, 2003).
81
Fundamentos Teóricos
Por microscopia electrónica alguns autores, sugeriram que estas células
especializadas derivariam de pelo menos três tipos celulares diferentes, as
quais incluiriam os pericitos de pequenos vasos, células musculares lisas e
fibroblastos indiferenciados (Sappino et al, 1990; Gabbiani , 1996). No entanto,
fibroblastos provenientes da medula óssea não expressam α-actina, e são
resistentes à conversão fibroblasto-miofibroblasto por TGF-β1 (Willis et al,
2006).
A expressão de α-actina em fibras de tensão confere ao miofibroblasto
diferenciado uma dupla e forte actividade contráctil em comparação com αactina negativa em culturas de fibroblastos (Liu et al, 2006). É ainda uma
incógnita como α-actina gera maior contracção em comparação com outras
isoformas de actina, mas α-actina –N – terminal, aminoácido específico cuja
sequência AcEEED (Chaponnier et al , 1995) desempenha um papel
importante neste mecanismo.
Buccala et al, (1994) identificaram uma nova subpopulação de leucócitos
que apresentavam propriedades do tipo fibroblasto, designadas por fibrócitos.
Muito recentemente, foi sugerido que os fibrócitos circulantes possam
representar uma importante fonte de fibroblastos durante a cicatrização de
queimaduras exteriores, onde deverá ser difícil para os mesmos migrarem das
bordas da lesão. Em estudos clínicos actuais, de pacientes com cicatrizes
hipertróficas e outras desordens fibrosantes, existem evidências de que têm
fibrócitos nas suas lesões (Desmoulière et al, 2005).
Estudos recentes têm demonstrado que os miofibroblastos podem não
derivar de um tecido fibroblástico, como foi antes referido, mas sim, originaremse a partir de um precursor da medula óssea. O fenótipo deste precursor ainda
é desconhecido, mas tem sido colocada a hipótese de que essa célula se
possa desenvolver a partir de fibrócitos circulantes (Direzke et al, 2003).
Conforme foi referido anteriormente, a actina, a maior proteína das
células eucarióticas, é expressa como isoforma de seis células tipo específicas.
Estas isoformas apresentam diferentes sequências conservadas, ainda que
82
Fundamentos Teóricos
pequenas (Vandekerckhove and Weber, 1978). A isoforma actina difere,
essencialmente, no seu terminal NH2 (Vandekerckhove and Weber, 1978);
portanto, este domínio representa-se como um candidato na mediação de
funções específicas através de uma ligação específica. A sequência NH2terminal Ac-EEED (o epítopo de anticorpo monoclonal directamente contra a αactina) (Skalli et al, 1986; Chaponnier et al, 1995) surge devido à sua
importância na polimerização do α-actina e incorporação em fibras de stress
(Chaponnier et al, 1995). Quando microinjectado em cultura de fibroblastos, a
Ac-EEED promove o desaparecimento da imunodetecção α-actina específica
(Chaponnier et al, 1995), sugerindo que a mesma interfira na função desta
isoforma. Para verificar qual dos efeitos da entrega do péptido incluir mudanças
funcionais na actividade miofibroblástica, os autores Hinz et al, (2002)
construíram uma fusão peptídica (FP; SMA-FP) incluindo Ac-EEED e a
sequência da terceira hélice ―Antennapedia‖ (pAntp-Pro50) (Derossi et al, 1994)
que permite a penetração celular, dado que a sequência N-terminal da α-actina
não penetra, espontaneamente nas células, devido à sua forte acidez. Foi
demonstrado que o SMA-FP se localiza rapidamente nas fibras de stress
depois da sua entrega; inibindo então a contractibilidade dos miofibroblastos ―in
vitro‖ e a contracção do tecido de granulação ―in vivo‖, suportando o facto de
que a α-actina apresenta um importante papel na contracção da lesão.
O mecanismo de expressão mRNA colagénio diminuído em células
tratadas SMA-FP não está bem esclarecido. É concebível que a redução da
tensão, depois da aplicação do SMA-FP, se torna responsável pela diminuição
do colagénio e da expressão mRNA α-actina, iniciada ao terceiro dia após a
aplicação do SMA-FP. A expressão da α-actina, em miofibroblastos, tem-se
mostrado diminuída com a redução da tensão no substrato de colagénio em
cultura (Arora et al, 1999) e no tecido de granulação do rato (Hinz et al, 2001a).
Com base nestas descobertas, Gabbiani, (2003) e Hinz et al, (2002), sugeriram
que a SMA-FP pode exercer efeitos benéficos em casos de excesso de
contracção de feridas e em patologias fibrocontrácteis, para as quais não
existe, actualmente, terapias farmacológicas eficientes.
83
Fundamentos Teóricos
O importante papel dos miofibroblastos no desenvolvimento e promoção
de doenças sugere que a modulação destas células e, consequentemente, da
reacção do estroma possa representar um alvo terapêutico inexplorado.
Contudo, um melhor entendimento dos mecanismos associados à participação
dos miofibroblastos é necessário para a criação de estratégias terapêuticas.
3.2. FACTORES DE CRESCIMENTO
3.2.1. Diferenciação miofibroblástica
Entre os numerosos factores de crescimento, o TGF-β1 (factor de
transformação do crescimento) é considerado o principal estimulador da
cicatrização
da
lesão,
contribuindo
para
a
migração,
proliferação
e
diferenciação de uma multiplicidade de células (Roberts et al, 1992)
Dos factores de crescimento que desempenham importantes acções no
processo de cicatrização da lesão, a TGF-β1, induz uma alta expressão da
proteína α-actina em fibroblastos palatinos normais (Yokozeki et al, 1997). De
uma forma similar, a estimulação da expressão da α-actina pela TGF-β1 tem
sido também descrita noutros tipos de células. Estudos feitos em fibroblastos
dérmicos de rato (Desmoulière et al, 1993) e em fibroblastos da glândula
mamária (Ronnov and Petersen, 1993) confirmam a afirmação anterior. O TGFβ1 é um peptídeo multifuncional que regula várias actividades celulares,
incluindo crescimento e diferenciação celular e expressão e metabolismo de
macromoléculas da matriz extracelular (Huang & Lee, 2003). Os efeitos de
TGF-β1 na homeostasia do tecido conjuntivo parecem ser mediados pela
activação dos receptores citoplasmáticos e do factor de crescimento de tecido
conjuntivo (CTGF) (Tabibzadeh, 2002). TGF-β1 é secretado na matriz
extracelular como um complexo latente e sua activação é regulada por
proteases, incluindo plasmina, catepsina, entre outras (Annes et al, 2003). Este
peptídeo desempenha um papel fundamental na transdiferenciação dos
fibroblastos para miofibroblastos, como revelado pela sua capacidade de
84
Fundamentos Teóricos
super-regular a expressão de colágenio e α-actina em modelos in vivo e in vitro
(Lewis et al, 2004). Tuxhorn et al, (2002) demonstraram in vivo e in vitro a
participação de TGF-β1 na conversão dos fibroblastos em miofibroblastos. No
modelo in vitro de cobaias com cancro de cólon, os autores demonstraram
através de imuno-histoquímica que as áreas que continham a presença de
miofibroblastos apresentavam uma forte expressão de TGF-β1.
Adicionalmente, em ensaios in vitro com anticorpos neutralizantes antiTGF-β1 revelaram que a inibição de TGF-β1 foi acompanha por uma inibição
na proliferação dos fibroblastos intestinais e uma significante indução na
transdiferenciação em miofibroblastos (Tuxhorn et al, 2002).
Untergasser et al. (2005) demonstraram que em fibroblastos de próstata
tratados sob acção do TGF-β1 verificou-se a transdiferenciação em
miofibroblastos, como revelado pela aquisição de densos feixes de fibras no
citoesqueleto e um aumento na expressão de α-actina, calponina, e tenascina.
Os achados in vivo de que TGF-β1 induz a transdiferenciação dos
miofibroblastos foram confirmados por modelos in vitro. Foi demonstrado In
vitro que para ocorrer à conversão dos fibroblastos em miofibroblastos dois
factores são necessários: a ausência de contacto entre as células e a presença
de TGF-β1 (Arora & McCulloch, 1994). Quando fibroblastos derivados do
intestino, mama, pele, fígado ou próstata em cultura são tratados com TGF-β1,
passam a expressar α-actina e expandem o retículo endoplasmático rugoso
adquirindo morfologia de miofibroblasto (Powell et al, 2005; Desmoulière et al,
2004; Kunz-Schughart & Knuechel, 2002).
Ainda em relação à regulação da diferenciação dos miofibroblastos,
outros grupos têm sido descritos bibliograficamente, sobretudo a heparina; GMCSF e endotelin-1, aumentam a expressão de α-actina em fibroblastos e em
células musculares lisas arteriais, enquanto o interferão-γ (IFN-y) e o factor de
crescimento plaquetário (PDGF) diminuem esta expressão nestas células
(Yokozeki et al, 1997).
85
Fundamentos Teóricos
O efeito do factor de crescimento plaquetário (PDGF) na diferenciação
do miofibroblasto (Bostrom
et al, 1996) está restrito à diferenciação do
fibroblasto em proto-miofibroblasto, uma vez que este não induz a expressão
de α-actina (Tomasek et al, 2002). No entanto, PDGF pode ser marcante para
a diferenciação de queratinócitos em miofibroblastos (Jester et al, 2002). Logo,
a tensão mecânica é um factor muito relevante para a promoção da
diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, onde o PDGF também
parece estar implicado.
Yokozeki et al, (1997) referiram nos seus estudos, alguns autores que
defendem que o TGF-β1 estimula a expressão do seu próprio gene em vários
tipos celulares (Van et al, 1988; Bascom et al, 1989; Kim et al, 1999 referidos
em Yokozeki et al, 1997).
Também Yokozeki e seus colaboradores (1997) demonstraram que o
TGF-β1 induz uma alta expressão de TGF-β1 mRNA nos fibroblastos palatinos.
Os fibroblastos de cicatriz no palato expressão TGF-β1 mRNA bem como a αactina sem o tratamento com a TGF-β1 e os anticorpos neutralizantes
específicos para o TGF-β1 inibem de forma significativa a contracção por essas
células.
O marcante papel da acção local das citoquinas e dos factores de
crescimento na reparação da lesão está bem documentado. Assim, a citoquina
TGF-β1 tem um papel crucial na evolução do tecido de granulação e
particularmente na formação de miofibroblastos possivelmente depois de
outras citoquinas ou factores de crescimento (PDGF, IL-1 e TNF-α) terem
directa ou indirectamente estimulado a proliferação fibroblástica (Desmoulière
et al, 1993). Já em relação à expressão de α-actina pelos fibroblastos, os
autores Rubbia-Brandt et al, (1991) e Desmoulière et al, (1992) defendem que
o PDGF (platelet derived growth factor) e o factor de necrose tumoral (TNF)
não a afectam directamente.
A alteração de protomiofibroblastos a miofibroblastos diferenciados é
essencialmente devida a uma acção combinada da variante ED-A da
86
Fundamentos Teóricos
fibronectina celular (Serini et al, 1998) e da TGF-β (Desmoulière et al, 1993),
particularmente da TGF-β1, a qual é primeiramente produzida por células
fagocitárias e depois, provavelmente, sob a influência de tensão mecânica. A
tensão mecânica é, por sua vez, também produzida por protomiofibroblastos e
portanto desencadeia um ciclo vicioso, levando ao aparecimento de
miofibroblastos diferenciados (Gabbiani, 2003). Uma força mecânica gerada
pela migração de fibroblastos impulsiona a organização e formação de fibras
de stress, pela qual é caracterizado o protomiofibroblasto (Tomasek et al, 2002;
Hinz and Gabbiani, 2003).
O número aumentado de fibroblastos na área da lesão leva à
segregação de novo colagénio e fibronectina. A orientação das células e fibras,
dentro desta matriz, é paralela à superfície da lesão e ao longo das linhas de
tensão (Hinz et al, 2001a). Os fibroblastos, tradicionalmente exercitam
pequenas forças na matriz recém formada, reforça os contactos célula-matriz,
desenvolve
fibras
de
stress
intracelular,
transformando-se
assim
em
protomiofibroblasto (Hinz and Gabbiani, 2003). O fenótipo protomiofibroblasto,
é mantido pela contínua interacção entre a tensão celular gerada e a reacção
de um substrato que é suficientemente duro para resistir a esta força (Hinz and
Gabbiani, 2003).
A tensão mecânica do TGF-β1 e FN, são responsáveis na diferenciação
dos protomiofibroblastos em miofibroblastos maduros (Tomasek et al, 2002;
Gabbiani, 2003; Phan, 2003). TGF-β1 estimula a expressão de FN e de αactina, e aumenta a formação e organização de fibras de stress e aderências
focais tanto ―in vitro‖ como ―in vivo‖ (Borsi et al, 1990; Desmouliere et al, 1993;
Ronnov-Jessen and Petersen 1993; Yokozeki et al, 1997; Vaughan
et al,
2000)
Segundo Liao et al, (2002) e Muro et al, (2003) os miofibroblastos ligamse preferencialmente à FN por via das integrinas α9β1 e α4β1. Na presença de
FN e de TGF-β1, o fenótipo de miofibroblasto, é perdido quando as tensões
são removidas (Hinz et al, 2001b). Assim, a diferenciação do protomiofibroblasto em miofibroblasto maduro é estimulada por uma interacção entre
87
Fundamentos Teóricos
TGF-β1 e FN, na presença de tensão mecânica (Serini et al, 1998; Vaughan et
al, 2000).
A acção do TGF-β1 depende da presença local da ED-A, domínio da
fibronectina celular (Desmoulière et al, 2005).
Como já foi referido anteriormente, é sabido que a tensão mecânica
desempenha um papel importante na modulação dos fibroblastos em
miofibroblastos em cultura, favorecendo a formação de fibras de stress e a
expressão de α-actina (Grinnell, 2000). A tensão mecânica altera a união da
fibronectina, proteína da matriz extracelular, aos miofibroblastos, bem como a
resposta fibroblástica aos factores de crescimento. Esta, pode ser também, a
responsável pela prevenção da apoptose fibroblástica (Hinz et al, 2001b).
Também foi descrito que a tensão isométrica actua na regulação dos
mecanismos de contracção fibroblástica (Grinnell et al, 1999).
Em estudos publicados, Hinz et al (2001a, b) demonstraram que a
tensão mecânica influi na diferenciação miofibroblástica ―in vivo‖. Assim foi,
também indicada uma correlação existente entre os níveis de expressão da αactina e a contractibilidade do tecido obtido durante as diferentes situações
experimentais. Verificou-se que a correlação obtida apresentava valores
elevados quando o tecido de granulação fica sujeito a tensão e, valores baixos
quando o tecido se encontra em relaxamento. Assim, como conclusão desta
investigação verificou-se que a tensão mecânica apresenta um papel relevante
quer para a modulação miofibroblástica, quer para a manutenção da sua
actividade contráctil.
Existem indicadores de que a estimulação do TGF-β na produção de
colagénio dos fibroblastos é uma consequência da diferenciação de
miofibroblastos – isto é, a aquisição do fenótipo de miofibroblastos é necessária
para uma produção de colagénio aumentada (Petrov et al, 2002). Para além
disso, este efeito na produção de colagénio é irreversível, persistindo mesmo
após a remoção do TGF-β. Isto indica que a expressão aumentada do gene da
matriz é uma característica fenotípica do miofibroblasto que se manifesta na
diferenciação completa, ou talvez, terminal. É digno de atenção o facto de a
88
Fundamentos Teóricos
supressão da expressão da α-actina do músculo liso resultar na redução da
expressão do gene do colagénio (Hinz
et al, 2002), afirmando, assim, o
conceito de que uma expressão aumentada do gene do colagénio é
manifestada
apenas
no
fenótipo
completamente
diferenciado.
Mais
recentemente, uma supressão semelhante da expressão da α-actina do
músculo liso inibiu a actividade promotora do factor de crescimento do tecido
conjuntivo, o qual está associado a uma reduzida translocação nuclear
(Chaqour et al, 2006). Assim, a manifestação do fenótipo que expressa a αactina do músculo liso pode ser central para a aquisição de muitas das
características notáveis do miofibroblasto completamente diferenciado, o que
pode representar um acontecimento importante na indução e progressão da
fibrose. (Shi-Wen et al, 2004; Bogatkevich et al\, 2001).
A diferenciação de miofibroblastos é normalmente induzida pelo
tratamento dos fibroblastos, ou de outras células percursoras susceptíveis, com
TGF-β. Assim, a maioria dos estudos centrou-se em aspectos da sinalização
do TGF-β que dão origem ao fenótipo diferenciado, com uma atenção principal
na expressão do gene marcador, a α-actina do músculo liso. Para além de um
requerimento básico para a tensão mecânica, a presença de um estímulo
solúvel como o TGF-β, encontrado na zona inflamatória, e de outras citoquinas
resulta numa diferenciação completa (Hinz et al, 2007). Existem diversas
provas de várias vias da quinase, incluindo quinases Jun (JNK) e proteína
activada pelo mitogénio (MAP) p38, apesar de, necessariamente, não estarem
de acordo em todos os estudos (Hinz et al, 2007; Hashimoto et al, 2001). Para
além de ser um marcador importante da diferenciação de miofibroblastos, e do
seu papel na regulação do colagénio e expressão do gene do factor de
crescimento do tecido conectivo (CTGF), a α-actina do músculo liso também
tem sido implicada nas interacções com os componentes de sinalização,
incluindo factores de transcrição com diferentes genes alvo (Furukawa et al,
2003; Wang et al, 2005; Deaton et al, 2005; Chaqour et al, 2006; Matsuoka et
al, 2002).
O efeito bem conhecido do TGF-β na expressão da α-actina do músculo
liso e a diferenciação de miofibroblastos sugerem a importância da via Smad
89
Fundamentos Teóricos
associada ao TGF-β canónico. As provas in vitro indicam a importância do
Smad3 na expressão da α-actina do músculo liso nos fibroblastos do pulmão
(Hu et al, 2003) e a deficiência in vivo de Smad3 resulta numa redução
significativa da fibrose pulmonar (Adam et al, 2005). Contudo, os mecanismos
adicionais reguladores da expressão deste gene podem ser essenciais, como
evidenciado por estudos que mostram uma multiplicidade de factores que
podem regular a sua actividade promotora. Quatro áreas no promotor parecem
ser de importância predominante: um elemento de ligação a Smad (SBE), uma
região hipersensível ao TGF-β (THR), um elemento de controlo do TGF-β
(TCE) e um elemento de ligação a C/EBP, quais são activados por Smad3,
SP1/SP3, factores tipo Krüppel e C/EBPβ, respectivamente (Hinz et al, 2007).
Permanecem por identificar a totalidade dos factores que podem
interagir com estes locais no promotor, directamente e indirectamente via
interacções com factores de ligação directa. Para além disso, ambos os
factores de estimulação e inibição estão envolvidos na regulação destes locais.
Por exemplo, os efeitos inibitórios do factor tipo Krüppel (GKLF) podem ser
mediados directamente por interacção de ligação com o domínio MH2 do
Smad3, reduzindo a sua ligação ao SBE (Adam et al, 2005; Hu et al, 2007).
Relativamente ao C/EBPβ, a sua isoforma predominante, proteína activadora
enriquecida no fígado (LIP), activa a diferenciação de miofibroblastos, enquanto
que a isoforma truncada, proteína inibitória enriquecida no fígado (LIP), inibe a
diferenciação (Hu et al, 2004).
Contudo, os ratinhos com deficiência em C/EBPβ exibiram uma redução
significativa na fibrose pulmonar, associada a uma presença reduzida de
miofibroblastos (Hu et al, 2007). Os factores adicionais que podem
desempenhar um papel importante incluem a via de sinalização Notch, a qual
parece ser importante na transição mesenquimal-epitelial (Zavadil et al, 2004),
enquanto que a YB-1 (proteína-1 de ligação à caixa Y), NF- B (factor nuclear)
e PPAR
(receptor-
activado para proliferador do peroxissoma) podem ser
importantes na supressão da diferenciação (Zhang et al, 2005; Mann et al,
2007). Assim, falta da inibição, bem como da activação por factores de
90
Fundamentos Teóricos
transcrição estimuladores, podem ser essenciais na diferenciação de
miofibroblastos.
Outros factores parecem também estar envolvidos na diferenciação do
proto-miofibroblasto em miofibroblasto maduro. Factores estimuladores de
colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) parecem induzir a síntese de
α-SMA ―in vivo‖ (Rubbia-Brandt et al, 1991; Feugate et al, 2002), mas não,
quando adicionado a culturas de fibroblastos (Rubbia-Brandt et al, 1991). Isto
sugere que GM-CSF estimula o agrupamento dos macrofagos ―in vivo‖, que por
sua vez expressa TGF-β1, estimulando desta forma a expressão de α-actina
(Serini and Gabbiani, 1999). O aparecimento de miofibroblastos ― in vivo‖ é
muitas vezes precedido de uma acumulação de macrófagos. (Vyalov et al,
1993; Serini and Gabbiani, 1999).
Segundo Kwon et al, (2006) o factor de crescimento epidérmico EGF
(Factor de Crescimento Epidérmico, recombinante humano), também está
envolvido na diferenciação. Os autores, através de um estudo experimental em
ratos Sprague-Dawley divididos em dois grupos, avaliaram a cura de uma lesão
através de um tratamento com uma pomada contendo rhEGF e averiguaram
uma melhoria significativa a partir do quinto dia no grupo tratado com a
pomada, relativamente ao grupo tratado sem rhEGF. Os autores presenciaram
que rhEGF aumenta significativamente a área imunorreactiva de α-actina
(marcador do miofibroblasto). Sugerem que a contracção rápida da lesão
induzida pelo rhEGF se deve ao aumento da actividade miofibroblástica nos
estágios intermédios do processo de cura de uma lesão.
Park et al, (2000) e Babul et al, (2004), evidenciaram que rhEGF pode
regular negativamente a função de TGF-β sem que se averigúe intervenção na
cicatrização. Grotendorst et al, (2004) referem que a acção de TGF-β no
fibroblasto, proliferação fibroblástica, síntese de colagénio e a diferenciação
miofibroblastica é mediada via CTGF-dependente (Factor de Crescimento do
Tecido Conectivo), uma proteína mediadora autócrina de transformação de
TGF-β.
91
Fundamentos Teóricos
Noutro estudo (Grotendorst and Duncan, 2005), constataram que os dois
domínios de CTGF produzem efeitos diferentes consoante a presença ou não
de outros factores. O Domínio N-Terminal de CTGF induz a proliferação celular
e síntese de colagénio quando relacionado com IGF-2. O Domínio C-Terminal
de CTGF induz a proliferação celular, quando relacionado com EGF. O
bloqueio da síntese de CTGF ou da sua acção inibe efectivamente o efeito de
TGF-B no fibroblasto (Kothapalli et al, 1997; Duncan et al, 1999).
Os autores Grotendorst et al, (2004) referem que uma sinalização
combinada determina se o fibroblasto responde ao TGF-β, como mitogénico ou
factor de indução-diferenciação. Os autores verificaram que a presença ou
ausência de outros factores de crescimento como EGF ou IGF-2 (Factor de
crescimento semelhante à insulina), são fundamentais para determinar a
resposta biológica das células alvo. Quando as células são estimuladas com
TGF-β ou CTGF, na presença de EGF ou outro co-mitogénico, imediatamente,
todas as células são estimuladas à síntese de ADN e posterior proliferação. Se
as mesmas células forem estimuladas com TGF-β ou CTGF na presença de
IGF-2, expeditamente todas as células responderão através da diferenciação
em miofibroblastos e aumento da síntese de colagénio. Se EGF for adicionado
à cultura quando as células estiverem a ser activadas na presença de IGF-2,
todas as células responderão com síntese de ADN mas não com diferenciação.
Desta forma,
a
capacidade
de
estimulação
da
proliferação
e
diferenciação celular de TGF-β e do CTGF, depende de determinadas
condições em que se encontram.
No entanto, esta relação ainda permanece pouco clara. CTGF parece
ser insuficientemente potente para que sozinho consiga induzir a diferenciação
miofibroblástica (Yang et al, 2004)
Outro indutor de α-actina ―in vitro‖, parece ser a heparina (Desmouliere
et al, 1992), no entanto, ―in vivo‖ parece requerer de TNF-α (Factor de Necrose
Tumoral)
92
Fundamentos Teóricos
As integrinas, também estão envolvidas na diferenciação dos protomiofibroblastos em miofibroblastos maduros (Dugina et al, 2001). A expressão
do receptor α5β1 da fibronectina aumenta concomitantemente com o aumento
de α-actina na diferenciação dos miofibroblastos (Masur et al, 1996, 1999). De
facto, grandes aglomerações desta integrina estão presentes no fibronexus do
miofibroblastos maduros (Dugina et al, 2001; Masur et al, 1999).
A ligação das integrinas αβ1, αvβ3, e αvβ5 à vitronectina inibem a
diferenciação de miofibroblastos maduros (Scaffidi et al, 2001). A função
bloqueadora de anticorpos monoclonais contra essas integrinas induz a
expressão de α-actina e a sua organização das fibras de stress, o que aumenta
a contracção do colagénio (Scaffidi et al, 2001).
A inexistência de contactos célula-célula também induz a diferenciação
para miofibroblastos maduros. Esta ausência também causa um aumento do
número de receptores TGF-β, resultando num aumento na expressão do αactina pelo TGF-β (Rizzino et al, 1988).
Lesões tratadas com anti-TGF β1 mostraram uma resposta inflamatória
mais baixa e uma menor deposição de matriz extracelular nos estágios
precoces do processo de regeneração (Shah et al, 1999). No entanto, em
estágios tardios, TGF-B1 induz a apoptose miofibroblástica (Funato et al, 1997,
1999). Isto pode resultar no aumento da contracção da ferida e da formação
cicatricial. Dado este papel bifásico do TGF-β1 durante o processo de cura, a
sua eliminação poderá induzir problemas inesperados sendo importante aplicar
um tratamento deste tipo em tempos programados.
Outro tratamento possível poderá estar relacionado com o bloqueio da
FN, o qual é essencial para a diferenciação do proto-miofibroblasto em
miofibroblasto maduro (Balza et al, 1988; Serini et al, 1998). Um anticorpo
contra a FN bloqueia a indução TGF-β1 através da expressão de α-actina e
colagénio tipo I em culturas de fibroblastos (Serini et al, 1998). Sendo assim a
eliminação da FN demonstra ser prometedor para a melhoria do processo de
cura de uma lesão.
93
Fundamentos Teóricos
Outra vantagem da FN é a de que está presente apenas em estado
embrionário e nas lesões tecidulares, o qual atenua o risco de efeitos
secundários (Kornblihtt et al, 1996). O relaxamento da tensão no colagénio
reduz o α-actina, ED-A FN e níveis de TGF-β1 (Arora et al, 1999). Isto indica
que a FN e TGF-β1 são necessários para a expressão de α-actina, sendo no
entanto, também necessário a tensão como pré-requisito.
Já posteriormente, Lygoe et al (2004) demonstraram que a diferenciação
miofibroblástica, a deposição de matriz extra-celular (ECM) e o factor de
transformação do crescimento (TGF-β1), estão intimamente ligados. Este
conecção ocorre devido há existência da via de receptores das integrinas. As
integrinas são uma família de receptores heterodímeros transmembranares da
ECM, compostas por cadeias α e β não covalentes. Além da sua função
adesiva, as integrinas medeiam importantes sinais de passagem, regulando
diversas funções celulares incluindo a motilidade, proliferação e apoptose.
Porém, certos sinais específicos das integrinas podem afectar a composição do
tecido conectivo através da modulação da expressão de proteínas da ECM e
da degradação de enzimas da matriz e seus inibidores. Além disso, as
integrinas da família αβ podem activar a TGF-β1 latente, ligando-se ao factor
de crescimento. Portanto, poder-se-á dizer que a expressão diferencial das
integrinas pode ser uma característica da transição dos fibroblastos para
miofibroblastos. De facto, demonstrações recentes ―in vitro‖ indicaram que a
regulação diferencial de receptores integrina (particularmente as αv integrinas)
ocorre concomitantemente com a diferenciação celular em modelos de
osteoblastos,
oligodendrócitos,
queratinócitos
e
diferenciação
de
miofibroblastos (Lygoe et al, 2004). A transição de fibroblasto para
miofibroblasto pode ser modulada por uma variedade de estímulos, entre eles,
factores de crescimento (TGF-β1) e ECM, sugerindo um possível papel para os
receptores célula-matriz neste processo de diferenciação (Norman et al, 2000).
Também Lygoe et al, (2004) demonstraram, nos seus estudos, que os
receptores integrina, incluindo a subunidade αv e/ou β1, se encontravam
envolvidos na diferenciação miofibroblástica induzida pela TGF-β1. A
expressão de ambas (integrinas αv e β1) aumentava quando submetidas a um
94
Fundamentos Teóricos
tratamento com TGF-β1, no entanto, na ocorrência de um bloqueio funcional
das mesmas, estas induziam a inibição a TGF-β1. Além disso, o bloqueio das
integrinas αv específicas, as αvβ5 e αvβ3, suprimiam a diferenciação dos
fibroblastos em miofibroblastos na cavidade oral e pele. Já em relação às
células renais, a prevenção da diferenciação foi vista apenas com o bloqueio
da integrina αvβ5 e não com a αvβ3.
Quando ocorrem danos, as células epiteliais e/ou endoteliais lesadas
libertam mediadores inflamatórios que iniciam uma cascata de coagulação
antifibrinolítica (Kumar et al, 2005), que desencadeiam a formação de coágulos
de sangue e MEC (matriz extracelular) provisória. De seguida, a desgranulação
plaquetária promove a vasodilação e uma maior permeabilidade dos vasos
sanguíneos, enquanto os miofibroblastos estimulados e as células epiteliais
e/ou endoteliais produzem metaloproteinases da matriz (MMP), que rompem a
membrana basal, permitindo a mobilização eficiente de células inflamatórias
para o local da lesão.
As células epiteliais e endoteliais também segregam factores de
crescimento, citoquinas e quimioquinas, que estimulam a proliferação e o
recrutamento de leucócitos através da MEC provisória. Após a activação de
vários mecanismos, também as células T ficam activas e segregam citoquinas
profibróticas, como a IL-13 e o TGF-β (Li et al, 2006; Wynn et al, 2003), que,
por sua vez, posteriormente activam os macrófagos e os fibroblastos. Os
fibroblastos activados transformam-se em miofibroblastos de expressão de αactina à medida que migram pela rede de fibrina para a lesão.
As
células
epiteliais
também
podem
sofrer
transição
epitelio-
mesenquimatosa (EMT), providenciando uma rica fonte renovável de
miofibroblastos (Quan et al, 2006). Após a activação, os miofibroblastos
promovem a contracção da lesão. Por último, as células epiteliais e/ou
endoteliais dividem-se e migram através das camadas basais para regenerar o
tecido danificado, o que completa o processo de cicatrização normal. Todavia,
quando ocorrem lesões repetidamente, a inflamação crónica e a reparação
causam uma acumulação exagerada de componentes da ECM (tais como
95
Fundamentos Teóricos
ácido hialurónico, fibronectina, proteoglicanos e colagénios intersticiais), que
contribuem para a formação de uma cicatriz fibrótica permanente.
Na fase de remodelação, a síntese de colagénio novo pelos fibroblastos
excede a velocidade a que é degradado, de forma que a quantidade total de
colagénio continua a aumentar. Embora a inflamação normalmente preceda a
fibrose, os resultados de modelos experimentais deste processo demonstraram
que a fibrose não é sempre necessariamente conduzida pela inflamação,
sugerindo que os mecanismos que regulam a fibrogénese são, em certa
medida, diferentes dos que regulam a inflamação (Pardo et al, 2006). Isto
poderia explicar a falta geral de eficácia dos mediadores anti-inflamatórios no
tratamento da doença fibrótica e a necessidade de identificar as terapias
antifibróticas alvo.
3.2.2. Sistemas de adesão dos Miofibroblastos
Os miofibroblastos, após estimulação pela TGF-β (Desmoulière et al,
1993), expressam α-actina, formando estruturas especializadas de adesão com
a matriz extra-celular (ECM) (Hinz et al, 2003).
Segundo Hinz et al, (2004) os miofibroblastos do tecido de granulação
de uma lesão, em contraste com os fibroblastos da derme, juntam fibras de
stress em sítios de junção aderente intercelular tipo-caderina. No entanto, a
função das junções aderentes (AJs) dos miofibroblastos, a sua composição
molecular e o mecanismo da sua formação ainda é bastante desconhecida.
O envolvimento de α-actina nas fibras de stress, concede uma alta
actividade contráctil ao miofibroblasto (Hinz et al, 2001b), levando à formação
de contactos especializados com a matriz extracelular (Hinz and Gabbiani,
2003a), que são chamados de adesões focais supermaduras (FAs) (Dugina et
al, 2001) e fibronexus (um complexo transmembranar de microfilamentos
contrácteis) ―in vivo‖. Contudo, uma correlação directa entre as fibras de tensão
dentro da célula e a fibronectina fora dela é aparentemente evidente nos
96
Fundamentos Teóricos
chamados fibronexus. Ao contrário dos contactos focais, estabelecidos entre as
células e o substrato, o fibronexus parece estar envolvido na ligação das
células com as matrizes extracelulares e com outras células. (Singer et al,
1984)
A formação e transformação das adesões focais supermaduras (FAs),
dá-se
como
consequência
da
diferenciação
dos
fibroblastos
em
miofibroblastos, as quais diferem das adesões focais supermaduras (FAs)
clássicas pelos níveis significativos de tensina e pelo comprimento que atinge,
cerca de 6-30µ comparativamente com 2-5µ das adesões focais supermaduras
(FAs) clássicas que contêm na sua composição típica αvβ3 com integrina,
vinculina, paxilina ou talina. Assim, transformando-se em adesões focais
supermaduras (FAs). Dugina et al, (2001).
A acção das FAs supermaduras é relevante, uma vez que, na interface
entre as proteínas da ECM e das fibras de stress intracelulares, estas
contribuem para a transmissão da força e tensão local, o que origina a
comunicação indirecta célula-célula através dos campos de stress da matriz
circundante (Hinz and Gabbiani, 2003). As fibras de stress dos miofibroblastos
em contacto estão conectadas directamente aos sítios das junções aderentes
(AJs) célula-célula tipo caderina. Esta relação tipo caderina foi descrita
ultrastruturalmente como placa electrodensa que une microfilamentos que
estão subjacentes à membrana plasmática dos miofibroblastos. Estes últimos
encontram-se em contacto no tecido de granulação da lesão e em tecidos
fibróticos. As junções aderentes estão ausentes em tecidos fibroblásticos
normais que não desenvolvem fibras de stress (Gabbiani and Rungger-Brondle,
1981; Welch et al, 1990). Portanto, em contraste com os fibroblastos caderinanegativos da derme normal, os fibroblastos do tecido de granulação,
expressam caderinas das quais OB-, N- e T-caderinas estão presentes em
quantidades
consideráveis.
Os
protomiofibroblastos
expressam,
predominantemente, a clássica caderina (tipo I), trivialmente designada por Ncaderina. A sua expressão está associada, frequentemente, ao crescimento da
migração celular. No entanto, também pode ser expressa nos fibroblastos
durante a passagem da reacção estromal a tumor epitelial estando relacionado
97
Fundamentos Teóricos
com a invasão das células epiteliais cancerígenas que exprimem a N-caderina
(De Weber and Marcel, 2003).
Hinz et al, (2004), mencionam que uma possível função para as junções
aderentes (AJs) dos miofibroblastos é a transmissão intercelular de α-actina
mediado por forças contrácteis, que requer contactos mecânicos resistentes.
Estes autores, evidenciaram que a formação de junções aderentes e o nível de
expressão de proteínas junções aderentes (AJs) aumenta nos fibroblastos do
tecido de granulação durante a cura de uma lesão, e que a expressão muda de
N- para OB-caderina com a diferenciação do fibroblasto, ―in Vitro‖ e ―in Vivo‖. A
expressão de uma caderina específica pode servir como marcador e/ou como
modulador do estado de diferenciação dos fibroblastos e as junções aderentes
(AJs) representam um potencial meio terapêutico para o tratamento das
patologias fibrocontracteis. A caderina anti-OB, mas não os péptidos anticaderina-N, reduzem a contracção dos miofibroblastos dos géis de colagénio, o
que sugere que as junções aderentes (AJs) são um instrumento para a
actividade contráctil dos miofibroblastos. A especificidade de AJ do
miofibroblasto conduz a um reconhecimento celular homotípico e a um
aumento significativo da resistência mecânica dos contactos célula-célula.
Documentam ainda que uma grande actividade contráctil de α-actina induz
reforços de AJs.
Segundo Hinz e Gabbiani (2003b), a interface entre a matriz extracelular
e as fibras de stress intracelulares, contribuem para a transmissão da força e
tensão local, o que origina a comunicação indirecta célula-célula, através dos
campos de stress da matriz circundante. (Simonneau et al, 1995)
Como
já
foi
referido
anteriormente,
os
miofibroblastos
exibem
proeminentes microfilamentos de actina citoplasmática (fibras de stress), e
estão conectados entre eles através de junções aderentes e gap junctions.
Estas células estão também em contacto com a matriz extra-celular (ECM) por
contactos focais conhecidos por fibronexus (um complexo transmembranar de
microfilamentos contrácteis) e pela proteína fibronectina da ECM (Powell et al,
1999). O fibronexus foi descoberto e caracterizado por Singer em 1979 e,
98
Fundamentos Teóricos
posteriormente, relembrado por Eyden (1993). Esta estrutura de adesão facilita
a ligação dos miofibroblastos à matriz extra-celular através de um complexo
transmembranar αβ- integrina que, por sua vez, une as fibras de stress da
actina dos miofibroblastos à fibronectina da ECM (Racine-Samson et al, 1997).
Em suma, poder-se-á dizer então, que a capacidade dos miofibroblastos em
realizar estes processos depende das mudanças no citosqueleto celular bem
como no fibronexus regulado pela Rho e da expressão das integrinas que
permite a ligação dos miofibroblastos à matriz extra celular (Racine-Samson et
al, 1997).
Lygoe et al, (2004), sugerem que os receptores célula-matriz têm um
papel na diferenciação de fibroblasto a miofibroblasto.
Já posteriormente, Lygoe e colaboradores (2004) demonstraram que a
diferenciação miofibroblástica, a deposição de ECM e a TGF-β1, estão
intimamente conectados. Esta ligação ocorre devido há existência da via de
receptores
integrinas.
As
integrinas
são
uma
família
de
receptores
heterodímeros transmembranares da ECM, compostas por cadeias α e β não
covalentes. Além da sua função adesiva, as integrinas medeiam importantes
sinais de passagem, regulando diversas funções celulares incluindo a
motilidade, proliferação e apoptose. Porém, certos sinais específicos das
integrinas podem afectar a composição do tecido conectivo através da
modulação da expressão de proteínas da ECM e da degradação de enzimas
da matriz e seus inibidores. Além disso, as integrinas da família αβ podem
activar a TGF-β1 latente, ligando-se ao factor de crescimento. Portanto, poderse-á dizer que a expressão diferencial das integrinas pode ser uma
característica da transição dos fibroblastos a miofibroblastos. De facto,
demonstrações recentes ―in vitro‖ indicaram que a regulação diferencial de
receptores
integrina
(particularmente
as
αv
integrinas)
ocorre
concomitantemente com a diferenciação celular em modelos de osteoblastos,
oligodendrócitos, queratinócitos e diferenciação de miofibroblastos (Lygoe et al,
2004). A transição de fibroblasto a miofibroblasto pode ser modulada por uma
variedade de estímulos, entre eles, factores de crescimento (TGF-β1) e ECM,
sugerindo um possível papel para os receptores célula-matriz neste processo
99
Fundamentos Teóricos
de diferenciação (Norman et al, 2000). Também Lygoe et al, (2004)
demonstraram, nos seus estudos, que os receptores integrina, incluindo a
subunidade αv e/ou β1, encontravam-se envolvidas na diferenciação
miofibroblástica induzida pela TGF-β1. A expressão de ambas (integrinas αv e
β1) aumentava quando submetidas a um tratamento com TGF-β1, no entanto,
na ocorrência de um bloqueio funcional das mesmas, estas induziam a inibição
a TGF-β1. Além disso, o bloqueio das integrinas αv específicas, as αvβ5 e
αvβ3, suprimiam a diferenciação dos miofibroblastos em fibroblastos a partir da
boca e pele. Já em relação às células renais, a prevenção da diferenciação foi
vista apenas com o bloqueio da integrina αvβ5 e não com a αvβ3.
Em suma, poder-se-á dizer então, que a capacidade dos miofibroblastos
realizarem estes processos depende das mudanças no citosqueleto celular
bem como no fibronexus e da expressão das integrinas que permite a ligação
dos miofibroblastos à matriz extra celular (Racine-Samson et al, 1997).
Os futuros estudos sobre estas várias áreas são essenciais para
fornecer novos conceitos que podem ajudar a fornecer a via para abordagens
translacionais inovadoras.
Para desenvolver estratégias modernas que contrariam o mau
funcionamento dos miofibroblastos em fibrose e podendo controlar a acção
fisiológica e benéfica do miofibroblasto para a reparação do tecido, é
necessário entender os mecanismos moleculares que regulam a formação e
actividade do miofibroblasto. Durante os últimos quinze anos, a citoquina prófibrótica de transformação do crescimento β1 (TGFβ1) foi estabelecido como o
mais potente indutor da diferenciação de miofibroblastos (Desmouliere et al,
1993; Ronnov-Jessen e Petersen, 1993). Porém, durante a reparação do
tecido, os fibroblastos reparadores não só entram em contacto com um
ambiente químico alterado mas enfrentam dramaticamente uma alteração
mecânica. Na realidade, a expressão de α-actina exige, um ambiente
mecanicamente contido e a acção de TGFβ1. Actualmente, podemos verificar
que a tensão mecânica e TGFβ1 são de facto dois lados da diferenciação do
miofibroblasto (Wipff e Hinz, 2008).
100
Fundamentos Teóricos
É aceite que células dos fibroblastos percebem sinais mecânicos do
ECM utilizando integrinas, isto é, as mesmas proteínas transmembranares que
fazem de âncora para as fibras de tensão e o substrato através de um
complexo de proteínas do citoplasma (Bershadsky et al, 2006; Chen et al,
2004; Giannone e Sheetz, 2006).
O papel de sinalização das integrinas baseada nas adesões da ECM fica
claro devido à sua maturação em resposta ao desafio mecânico.
O reforço de locais de adesão sob tensão começa com integrinas que
agrupa adesões que mais adiante se desenvolvem em complexos focais ao se
associar com filamentos de actina. O aumento da tensão intracelular necessita
ser equilibrado por um substrato mecanicamente resistente que conduza à
amplificação do complexo focal em adesões focais clássicas (FAs) (Bershadsky
et al, 2006).
A análise ao Microscópio Electrónico dos miofibroblastos em tecido
fibrótico e tecido de granulação de lesão revelou contactos de células –ECM
que não são formados por tecido conjuntivo normal de fibroblastos (Eyden,
2005). Análogos a este fibronexus, culturas de miofibroblastos desenvolvem
especializadas adesões focais supermaduras (FAs), uma designação que
responde ao aparecimento do mais longo (8.30 mm.) (Dugina et al, 2001)
comparado com os FAs (2.6 mm.) de α-actina negativo (Geiger et al, 2001) Os
miofibroblastos reduzem FAs de supermaduras para pequeno FAs clássicos
depois da inibição de α-actina, ou seja, depois desta mediar a contracção (Hinz
et al, 2003). Estes estudos sugerem que os fibroblastos ganham informação
sobre o estado mecânico da ECM avaliando o nível de tensão das fibras das
quais estão limitadas pelo tamanho das âncoras de ECM. Acredita-se que
proteínas específicas nas adesões citoplasmáticas servem como sensores
mecânicos e agem como interruptores moleculares que mudam o estado de
conformação/activação quando força é aplicada. (Giannone e Sheetz, 2006).
101
Fundamentos Teóricos
Porém, adesão mediada por interruptores mecânicos e sensores
mecânicos não são necessariamente localizados dentro da célula. A primeira
proteína da ECM identificada como uma proteína mecânico-sensível foi a
fibronectina que revelou locais secretos para auto-fibrinogênese quando foi
desdobrada (Zhong et al, 1998).
As
proteínas
desdobradas
podem
revelar
locais
específicos
semelhantemente ao das integrinas e assim a mudança dependente da célula
de adesão e obter respostas como migração da célula, proliferação,
sobrevivência e diferenciação assim como a organização e remodelação da
ECM (Vogel e Sheetz, 2006).
A activação dos factores de crescimento pelas integrinas faz-se por dois
mecanismos distintos discutidos actualmente que parecem co-existir. No
primeiro mecanismo que é sensível a inibidores de protease, as integrinas
servem como um ponto de ancoragem comum para TGFb1 e activam as
proteases. (Jenkins, 2007; Sheppard, 2005). O segundo mecanismo é
independente de qualquer acção proteolítica e envolve forças de tracção que
são directamente transmitidas ao LLC (large latent complex) por via das
integrinas. O resultado configuracional muda o LLC o que é sugerido para
liberar TGFb1 e/ou apresentar isto ao seu receptor. O que sugere quatro
condições que precisam ser pelo menos satisfeitas para que este mude: (1)
específica integrina que liga ao LLC, (2) a presença de actina contráctil para
gerar força e/ou promover resistência mecânica, (3) incorporação de TGFb1 na
ECM como LLC e (4) uma ECM que mecanicamente resistente a forças de
tracção celulares exercidas pelo LLC (Wipff e Hinz, 2008).
A primeira evidência que as integrinas podem directamente activar
TGFβ1 independentemente de qualquer actividade proteolítica surgiu de
estudos epiteliais de integrina ανβ6 (Annes et al, 2004; Jenkins et al, 2006;
Munger et al, 1999). Muito recentemente, foi visto que a integrina ανβ5 e
possivelmente a integrina ανβ3 podem activar directamente o TGF-β1 (Wipff et
al, 2007). Verificou-se ainda em vários estudos que todas as integrinas
contribuem para a activação de TGFβ1, embora interaja fisicamente com LAP
102
Fundamentos Teóricos
(latency associated protein) (Sheppard, 2005). A primeira evidência directa
para a contribuição da activação da tensão mecânica de TGFβ1 foi provida
recentemente através de experiências com miofibroblastos que são activados
pelo TGFβ1 na sua actividade contráctil. (Wipff et al, 2007). Induzindo a
contracção dos miofibroblastos com trombina, angiotensina-II e endotelina-1
aumentam a activação de TGFβ1; este efeito depende de ligação de integrina a
LAP (latency associated protein) (Wipff et al, 2007).
O terceiro elemento obrigatório para a activação de TGFβ1 através de
integrinas é a incorporação do LLC no ECM (matriz extracelular). A relevância
fisiológica da relação entre a ligação de LLC ao ECM e activação de TGFβ1 é
compreensível
no
contexto
de
reparação
de
tecido
conjuntivo
e
desenvolvimento progressivo da fibrose. Nestas situações, a resistência de
ECM gradualmente aumenta com remodelação contínua da actividade de
fibroblastos (Hinz e Gabbiani, 2003).
3.2.3. Inibição miofibroblástica
Os pericitos, assim como os miofibroblastos, expressam α-actina.
(Gabbiani, 2003). Ambos expressam também ED-A FN (variante especifica da
fibronectina) e Thy-1 (Glicoproteina membranar) em DcSSc (Difuse Cutaneous
Systemic Sclerosis) na pele (Rajkumar et al, 2005).
ED-A FN, inclui o segmento ED-A, que se encontra expresso apenas
durante a embriogénese (Ffrench-Constant , 1995; Xia and Culp , 1995; Serini
et al, 1998) e durante a cicatrização de uma lesão (Tomasek et al, 2002).
Segundo Whitby e Ferguson (1991) durante a embriogénese, ED-A FN não
induz a diferenciação de miofibroblastos maduros, porque nesta fase o TGF-β1
está ausente.
Os autores (Hinz et al, 2001a) referem que a expressão de ED-A FN,
precede o aparecimento do miofibroblasto α-actina -positivo, e é considerado
um factor crucial na promoção para a formação de miofibroblastos. Segundo
103
Fundamentos Teóricos
Serini et al, (1998) o bloqueio da interacção entre o ED-A FN e a superfície da
célula ―in vitro‖ inibe a indução de TGF-β à síntese de α-SMA e formação do
miofibroblasto. Concluíram que a síntese ―de novo‖ de ED-A FN parece ser um
pré-requisito para a expressão de α-actina e diferenciação miofibroblástica.
Em relação à função hormonal, verifica-se que as hormonas endócrinas
apresentam funções essenciais que só recentemente têm sido reconhecidas
por diferentes investigadores (Ashcroft et al, 1997; Grose et al, 2002; Ashcroft
et al, 2002). De facto, a hormona de crescimento (GH) é um exemplo de uma
dessas hormonas que influencia o processo reparativo (Thorey et al, 2004).
Thorey et al, (2004) estudaram o processo reparativo de cicatrização de
lesões em ratos transgénicos com elevados níveis de soro bovino (bGH). O
fenótipo mais notável foi o grande aumento da formação de tecido de
granulação. Uma característica notável observada no tecido de granulação dos
ratos transgénicos bGH foi o aumento do número de vasos sanguíneos, o que
promove a angiogénese. No entanto, ainda neste estudo, foi detectado uma
contracção não eficiente da lesão dos ratos transgénicos bGH, originando um
atraso no fecho da lesão, o qual é mais pronunciado nos machos. Foi então
sugerido pelos autores, que o fecho inicial da lesão foi devido às forças
tradicionais que se desenvolveram por migração fibroblástica. Este atraso na
cicatrização deveu-se a uma significante redução numérica dos miofibroblastos
locais. Usando estudos ―in vitro‖ com fibras de colagénio de stress, os mesmos
autores identificaram a hormona crescimento (GH) como um inibidor do TGF-β,
que é um indutor da diferenciação miofibroblástica, resultando na redução da
actividade contráctil do fibroblastos. Foi também a partir deste estudo, sugerido
que o tratamento sistémico com GH torna-se prejudicial para o reparo da lesão
em indivíduos saudáveis.
Já em relação a estudos efectuados ―in vitro‖, estes sugerem que o IFNgamma pode modular o fenótipo e a função dos fibroblastos durante o reparo
da lesão. O IFN-gama diminui a expressão da α-actina nos miofibroblastos e
inibe, de uma forma irreversível, a contracção dos fibroblastos aí existentes
(Desmoulière et al, 1992; Moulin et al, 1998). Tem sido reportado que a IFN104
Fundamentos Teóricos
gamma estimula a produção de colagenases pelos fibroblastos da lesão ―in
vitro‖ (Duncan and Berman, 1989) e que a mesma reduz a síntese de colagénio
dos fibroblastos de lesões do palato de ratos ―in vitro‖ (Cornelissen et al, 1999).
O IFN-gamma apresenta, também, um papel importante na formação de tecido
cicatricial, podendo ser usado como um agente terapêutico na redução da
acumulação de colagénio numa lesão mucoperiostea do palato (Cornelissen et
al, 2000).
Os TGF-β são uma superfamília de factores de crescimento peptídicos
multifuncionais (Roberts and Sporn, 1992). Embora existam muitas isoformas,
apenas 3 destas TGF-β, existentes nos mamíferos, são reguladas de forma
distinta e as suas expressões nos tecidos durante a embriogénese, fibrose e
cicatrização são diferentes, no entanto, aparentam um comportamento
semelhante na maioria das vezes (Shol et al, 1995; Frank et al, 1996). O TGFβ3, uma das isoformas referidas, apresenta funções distintas na cicatrização
(Hsu et al, 2001). Cita-se, como exemplo, a reparação microcirúrgica do lábio
leporino, medicado pela TGF-β3 com o intuito de regular a proliferação e
migração das células mesenquimais no local de reparo (Kohama et al, 2002). A
acção do TGF-β3 reduz a formação da cicatriz, alterando o balanço dinâmico
da acumulação e degradação do colagénio tipo I. Os níveis elevados de TGFβ3 reduzem a deposição de colagénio tipo I restringindo a diferenciação
miofibroblástica e portanto a síntese de colagénio. Também estas promovem a
degradação de colagénio pela MMP-9, dado que a TGF-β3 estimula
especialmente a expressão desta, bem como a sua actividade. Estes factos
apresentam particular interesse, dado que o TGF-β1 e TGF-β2 apresentam
efeitos opostos na formação da cicatriz. As metaloproteinases da matriz são
secretadas como zimogénios inactivos e podem deteriorar vários componentes
da matriz extracelular do tecido cicatricial incluindo o colagénio tipo I
(Hosokawa et al, 2003). Um nível adicional de complexidade é sugerido pelas
provas de que a regulação epigenética também poderá ser importante. Por
exemplo, a inibição da desacetilase da histona (HDAC) ou da metilação do
ADN suprime a diferenciação de miofibroblastos (Mann et al, 2007; Rombouts
et al, 2002). No último caso, apresentam-se provas de que deve ser
indirectamente mediado pela repressão de supressores da expressão da
105
-
Fundamentos Teóricos
actina do músculo liso, em vez de através de efeitos directos na metilação do
promotor do gene da actina (Mann et al, 2007). Contudo, a análise directa do
estado da metilação do gene da
-actina do músculo liso, bem como a
modificação de histonas associadas de perto a este gene, não têm sido
sistematicamente empreendidas. Assim, esta breve visão geral salientou a
complexidade dos mecanismos subjacentes a apenas um componente principal
do fenótipo diferenciado do miofibroblasto. São necessários estudos futuros
nestas áreas para lançar mais luz sobre as suas viabilidades como alvos no
controlo da fibrose.
Citocinas que inibem a diferenciação do miofibroblasto, incluem
interferão-γ (IFN-γ) (Hansson et al, 1989), bFGF (Schmitt-Graff et al, 1994;
Spyrou GE and Naylor, 2002), e prostaglandina E2 (Kolodsick et al, 2003) tanto
―in vitro‖ como ―in vivo‖, o IFN-γ diminui a expressão do α-SMA (Pittet et al.
1994; Spyrou GE and Naylor, 2002). Também bFGF inibe a diferenciação para
miofibroblasto ―in vitro‖ (Schmitt-Graff et al, 1994) e ―in vivo‖ (Spyrou and
Naylor, 2002; Kanda et al, 2003) Este, segundo Funato et al, (1997) induz a
apoptose nos miofibroblastos na mucosa palatina de ratos.
A ausência de factor de crescimento transformador (TGF-β1) em lesões,
está relacionada com a diferenciação do miofibroblasto (Nodder and Martin ,
1997). Isto conduz a uma menor contracção da lesão na formação da
cicatrização. A eliminação de TGF-β1 pode então prevenir a contracção da
lesão e cicatrização, um tema que tem sido estudado de forma intensa. Muitos
desses estudos aludem uma forte redução de α-actina e também a redução de
miofibroblastos maduros (Shah et al, 1992; Arora and McCulloch, 1999; Hinz
et al, 2003).
Neutralizando anticorpos contra TGF-β1, inibe significativamente a
contracção da rede colagenosa da cicatrização fibroblástica do palato
(Yokozeki et al. 1997). Estes anticorpos também previnem a formação de
cicatriz durante o processo de cura de uma lesão da derme (Shah et al. 1992).
106
Fundamentos Teóricos
3.3. PATOLOGIA COM ENVOLVIMENTO DE MIOFIBRO-BLASTOS
3.3.1. Miofibroblastos na cicatrização
A cicatrização é um processo que se baseia numa perfeita e coordenada
cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a
repavimentação e a reconstituição do tecido (Mandelbaum et al, 2003). Tal
facto é um processo dinâmico que envolve fenómenos bioquímicos e
fisiológicos que se comportam de forma cadenciada a fim de garantir a
restauração tecidular. Vários autores consideram que existem diferentes fases
neste processo. Para alguns autores, processa-se em três fases distintas: 1)
inflamatória; 2) proliferativa; 3) remodelação (Ortonne e Clévy, 1994). Outros
classificam de uma forma mais complexa dividindo o processo em cinco fases
principais: 1) coagulação, 2) inflamação, 3) proliferação, 4) contracção da ferida
e 5) remodelação (Fazio et al, 2000).
Clark (1993) dividiu a fase de reparação em três fases: 1) inflamação, 2)
formação de tecido de granulação com deposição de matriz extracelular e 3)
remodelação.
Independentemente da classificação utilizada para o processo de
reparação e cicatrização, os miofibroblastos, participam principalmente a partir
da penúltima fase. São de extrema importância, pois para além da sua função
na deposição de matriz extracelular (Bitu et al, 2006), são os responsáveis pela
aproximação dos bordos de uma lesão aberta, permitindo o fecho progressivo
através da sua função de contracção, a qual só é possível por possuírem αactina incorporadas nas suas fibras de tensão (Hinz et al, 2001b, 2003b;
Dugina et al, 2001; Singer et al, 1984; Arora et al,1994; Tomasek et al, 2002;
Poh et al, 2005).Perto do final do processo de cicatrização, o número de
miofibroblastos vai diminuindo como resultado da apoptose. Este é um
processo essencial para a conclusão e equilíbrio da cicatrização. Falhas neste
processo, foram identificadas e relacionadas com diversos estados patológicos
(Gabbiani, 1996; Schmitt-Graff et al,1994).
107
Fundamentos Teóricos
A falha na apoptose relativamente a uma população de miofibroblastos é
o mecanismo que conduz a uma desordem fibrótica crónica. Zhang e Phan
(1999).
Da mesma forma que o autor anterior, Dreger et al (2002), referem que
quando o ciclo de vida de um miofibroblasto não é regulada devidamente, os
miofibroblastos persistem com uma força contínua e produção contínua de
matriz extracelular, resultando numa fibrose patológica, cicatriz e doença
fibrocontráctil.
Em variações patológicas crónicas, tal como cicatrizes hipertróficas e
lesões fibróticas, uma deposição excessiva de matriz extracelular pode persistir
por vários anos (Tomasek et al, 2002). Durante a reparação normal da lesão, o
tecido de granulação começa a desaparecer quando a epitelização se
completa, através de uma massiva apoptose dos fibroblastos do tecido de
granulação, ou seja, miofibroblastos e células vasculares. No entanto, é de
referir que durante os fenómenos fibróticos este caminho apoptótico está
fechado o que não acontece em situações normais (Gabbiani, 2003).
3.3.2. Fibrose Pulmonar
A fibrose pulmonar caracteriza-se por deposição de matriz extra-celular
aumentada e celularidade, particularmente em relação aos fibroblastos no local
da fibrose activa. Os miofibroblastos, com a sua manifestação de α-actina
característica, surgem de novo na fibrose e crê-se que são a fonte principal da
expressão de matriz intensificada e de citoquina profibrogénica (Kapanci et al,
1995; Kuhn et al, 1991; Mitchell et al, 1989; Zhang et al, 1994). Os números e a
persistência destas células podem ser a base para evolução da doença em vez
da resolução. Resultando em doença em fase terminal e num resultado fatal
(Kaminski, 2003; King et al, 2001). Assim, compreender as origens, as
expansões e os possíveis destinos destes fibroblastos activados é importante
para desmascarar a patogénese fibrótica.
108
Fundamentos Teóricos
A fonte celular desta matriz é a população celular do mesenquima que
ocupa a lesão fibrótica durante o período activo da fibrose. Pode-se referir que
esta população é heterogénea no que se refere ao número de fenótipos, sendo
um desses, o miofibroblasto. Devido às propriedades inflamatórias das
citoquinas produzidas pelos miofibroblastos, estas células aparecem com
funções importantes na deposição da matriz extra-celular. Os mediadores por
eles libertados, contribuem para a mobilização de células inflamatórias e,
consequentemente, são importantes na intensificação ou prolongamento da
inflamação que está normalmente associado à fibrose. Tal ampliação da
resposta inflamatória pode resultar num feedback positivo permitindo uma
intensificação e progressão da fibrose.
Uma
outra
propriedade
adicional
dos
miofibroblastos
é
a
contractibilidade. Esta propriedade é importante para a contracção da lesão e
talvez para o contributo da alteração das características mecânicas do pulmão
fibrótico (Phan, 2002). A cinética relativa ao aparecimento ou desaparecimento
dos miofibroblastos numa cicatrização normal e em modelos da auto- limitação
da fibrose pulmonar é paralela nos dois processos, isto é, à iniciação e à sua
resolução e consequente término, da fibrose activa (Zhang, et al, 1994). A
persistência de miofibroblastos está directamente relacionada com o sucesso
da resolução da patologia em pacientes com fibrose progressiva (Kuhn et al.,
1991). Estas características são típicas do comportamento de uma célula
inflamatória num tecido patológico e devidamente inflamado, suportando a
designação
de
miofibroblastos
como
uma
célula
inflamatória.
Os
miofibroblastos, presentes no pulmão fibrótico, expressam α-actina e vimentina,
no entanto, não expressam desmina. O mesmo não acontece nos
miofibroblastos localizados na periferia e em áreas subpleurais da fibrose
(Zhang, et al, 1994).
Podemos concluir que a característica comum da fibrose pulmonar é a
presença de focos fibroblásticos, áreas ricas em células mesenquimáticas,
incluindo números aumentados de fibroblastos e miofibroblastos totalmente
diferenciados. Esta população de células é a fonte celular fundamental de
matriz extra-celular e é heterogénea relativamente a um número de fenótipos
109
Fundamentos Teóricos
chave (Phan, 2002; Selman et al, 2001) A emergência de novo ou a génese
dos miofibroblastos de expressão da α-actina está bem descrita em lesões
fibróticas do pulmão, tanto no estudo de modelo humano como no de modelo
animal. Contudo, através de uma série de critérios diferentes, incluindo a
expressão de colagénio tipo I, Thy-1 (glicoproteína membranar), α-actina do
músculo liso, ciclooxigenase (COX) -2, telomerase e caveolina-1 (Derdak et al,
1992), estas células parecem ser heterogéneas, talvez representando
subpopulações distintas (Wang et al, 2006). Outro ponto importante é que
estas características fenotípicas só aparecem no pulmão lesionado, sugerindo
que estas células surgem de novo de células percursoras ou progenitoras,
talvez por um processo de diferenciação, tendo em conta a estabilidade relativa
de alguns dos fenótipos. Mas é pouco claro se estes diferentes fenótipos são
características de subpopulações distintas com progenitores únicos ou se
representam as diferentes fases de diferenciação a partir de um progenitor
comum. Surgiram provas recentes que sugerem a existência de subtipos
distintos de fibroblastos, em diferentes locais do corpo, com base nos seus
padrões de expressão genética (Chang et al, 2002). Tal poderá argumentar
para a presença de diferentes progenitores que, potencialmente, poderão dar
origem a fenótipos diferenciados ou activados de forma diferente em resposta à
lesão do tecido. Em qualquer dos casos, os subtipos diferenciados que se
notam nos pulmões lesionados e fibróticos têm fenótipos que são consistentes
com as suas importantes funções na promoção da fibrose. Assim, o fibroblasto
que expressa a α-actina do músculo liso, conhecido como miofibroblasto, é
apresentado como sendo a fonte predominante de colagénio do tipo I e de
citoquinas inflamatórias/fibrogénicas, nas lesões fibróticas, e também como
transmitindo propriedades mecânicas alteradas para tecidos afectados (Zhang
et al, 1994; 2002).
Thy-1- e a caveolina-1- também são associados aos pulmões fibróticos,
e estes dois marcadores estão ausentes nos miofibroblastos (Hagood et al,
2005; Wang et al, 2006), indicando, desta forma, algum papel na fibrose.
Consistente com tal papel está a observação de que a deficiência em
caveolina-1 está associada ao desenvolvimento de lesões fibróticos nos
pulmões, enquanto que a sua sobreexpressão induzida proporciona alguma
110
Fundamentos Teóricos
protecção contra a fibrose (Wang et al, 2006). A importância da expressão da
telomerase numa certa subpopulação, que é distinta dos miofibroblastos,
continua por esclarecer (Nozaki et al, 2000; Liu et al, 2002; 2006), e é
especialmente intrigante tendo em conta artigos recentes sobre mutações da
telomerase em certas famílias com fibrose pulmonar idiopática (Tsakiri et al,
2007). Também não é claro se alguns dos fenótipos diferenciados, tais como a
expressão deficiente de ciclooxigenase (COX-2), estão de qualquer maneira
relacionados com os distintos miofibroblastos, os quais estão virtualmente
presentes em todas as lesões fibróticas. Contudo, este tipo de análise dos
fenótipos dos fibroblastos tem realçado o potencial papel patofisiológico e de
aparecimento de novo destas diferentes subpopulações de fibroblastos na
fibrose pulmonar, bem como tem sugerido a sua potencial interacção. Neste
momento, é pouco claro se estes diferentes fenótipos representam várias fases
de diferenciação que, em última instância, poderão conduzir ao miofibroblasto
ou, em alternativa, se representam subpopulações independentes que surgem
de progenitores distintos. Por conseguinte, uma análise rigorosa e uma boa
compreensão destes subtipos ou subpopulações de fibroblastos diferenciados,
e as suas potenciais inter-relações e/ou origens, deverão permitir conhecer a
patogénese da fibrose progressiva em resposta a certos tipos de lesões
pulmonares. (Armanios et al, 2007)
A origem dos miofibroblastos é controversa, porém, estudos cinéticos
sugerem que os miofibroblastos existentes em fibrose pulmonar derivam de
fibroblastos peribranquiais e perivasculares (Zhang et al, 1994). Esta
observação foi suportada por evidências bioquímicas e morfológicas ―in vitro‖
efectuadas por Phan (2002). A persistência de miofibroblastos em lesões
fibróticas leva a uma cicatrização excessiva com alteração funcional do órgão
afectado.
Quando tecidos estão lesados, localmente existem fibroblastos do tecido
conectivo e células recrutadas de outras fontes que adquirem características do
músculo liso formando fibras de tensão contrácteis e através de sobrexpressão
de actina do músculo liso (α-actina) (Hinz, 2007). A alta actividade contráctil
gerada por α-actina em fibras de tensão é um papel fundamental para a
111
Fundamentos Teóricos
remodelação de tecido lesado como durante a sua recuperação. (Hinz et al,
2001a). De alta relevância clínica são os fenómenos retrácteis, causados por
excesso de contracção dos miofibroblastos e da matriz extracelular (ECM) que
segregam a actividade que caracteriza a grande maioria das doenças
fibrocontrácteis. Isto inclui fibrose que afecta órgãos vitais, como coração (Virag
e Murry, 2003), fígado (Desmouliere et al, 2003), rim (Lan, 2003) e pulmão
(Phan, 2002) e fibrose que reduz a qualidade de vida em escleroderma
(Rajkumar et al, 2005), cicatrizes hipertróficas (Desmouliere et al, 2003;
Gabbiani, 2003), vias respiratórias e a doença de Dupuytren (Tomasek et al,
1999).
Cisneros-Lira et al, (2003) observaram que a exposição ao fumo do
tabaco, aumentou o número de miofibroblastos no septo alveolar, exacerbando
uma resposta fibrótica pulmonar. Tanto em tecido pulmonar de pacientes, como
em modelos animais, Kuhn et al, (1991) and Pache et al, (1998), confirmaram a
presença de miofibroblastos, em pacientes com fibrose pulmonar. Estes
miofibroblastos, parecem ser algo específicos de acordo com as suas
características imuno-histoquímicas. Estes miofibroblastos seriam classificados
de VA, uma vez que expressam α-actina e Vimentina.). Zhang et al, (1994), por
outro lado, considera que a presença de miofibroblastos é responsável pela
iniciação, resolução e consequente término, da fibrose pulmonar. A presença
destas células especializadas, é proporcional ao sucesso da resolução da
patologia (Kuhn and McDonald, 1991). Esta característica suporta a
capacidade inflamatória do miofibroblasto, uma função, já referida.
No que respeita ao Tumor Inflamatório Miofibroblástico Pulmonar,
Hannah et al, (2007) concluem que este termo é falso em cerca de 50% de
casos. Sugerem que estas lesões sejam separadas em dois subconjuntos
principais, um para as lesões, mostrando diferenciação de miofibroblastos, e o
outro para as linhas celulares da diferenciação do macrófago.
112
Fundamentos Teóricos
3.3.3. Miofibroblastos Nas Neoplasias
Os miofibroblastos, são responsáveis na reacção desmoplástica
observada em muitos tipos de neoplasias, ou seja, a proliferação do tecido
fibrogénico dentro de ou adjacente ao próprio tumor, e tem sido observado em
carcinomas da glândula mamária, tumores do tipo carcinoide, na doença de
Hodgkin, em melanomas malignos, entre outros (Frazier and Grotendorst,
1997). Uma acumulação local de células do tecido conjuntivo e de material
extracelular é conhecida como reacção estromal, em tumores epiteliais. O
miofibroblasto parece ser um dos componentes dessa reacção, sendo para
Desmoulière et al, (2004), o tipo celular predominante, responsável pela
deposição de colagénio bem como a remodelação, em tumores epiteliais
primários e metastáticos. Com esta base, os miofibroblastos podem
representar
um
novo
alvo
importante
da
terapia
anti-tumoral.
Os
miofibroblastos têm um papel importante na promoção e regulação da
transformação epitelial maligna e na manutenção da progressão do cancro,
sugerindo que a modulação destas células, e consequentemente a reacção
estromal, possam representar um alvo terapêutico até agora inexplorado para
vários tipos de cancro.
A proteína de activação fibroblástica (FAP) é uma proteína membranar tipo II
expressa no tumor estromal fibroblástico em mais de 90% de todos os
carcinomas. A FAP serve como marcador de diagnóstico e representa um
potencial alvo terapêutico no tratamento de um vasto leque de carcinomas.
Têm sido desenvolvidos anticorpos contra a FAP, o que poderá vir a ser uma
ferramenta valiosa na análise do papel funcional da FAP face ao tumor, como
também na avaliação da conveniência da FAP como marcador tumoral.
Só recentemente se tornou possível demonstrar que a α-actina é um
instrumento na produção de força pelos miofibroblastos‖ in vivo‖ e ―in vitro‖
(Tomasek, 2002). Isto resultou na sugestão de que a modificação da α-actina
poderia influenciar a capacidade de remodelação do tecido de granulação na
cicatrização de lesão normal e patológica (Desmoulière et al, 2005).
113
Fundamentos Teóricos
Os miofibroblastos podem também estimular a angiogênese e
linfangiogênese através da expressão de factores pró-angiogênicos (Orlandini
& Oliveiro, 2001).
Adicionalmente, os miofibroblastos possuem a capacidade de proteger
as células malignas da resposta imune do hospedeiro (Wever & Mareel, 2003).
Lieubeau et al, (1999) demonstraram que as propriedades de contracção
e síntese de matriz extracelular (MEC) pelos miofibroblastos dificultam a
infiltração das células do sistema imune e inflamatório para dentro do tumor.
Então, os miofibroblastos podem prevenir o contacto físico entre as células
malignas e as células do sistema imune, um fenómeno essencial para a
destruição das células tumorais (Wever & Mareel, 2003). Achados histológicos
de diferentes tipos de neoplasias malignas demonstraram que os tumores que
estão associados a uma baixa presença de miofibroblastos apresentaram uma
maior reacção inflamatória, ao contrário de tumores associados a uma alta
presença de miofibroblastos, em que as reacções imunes e inflamatórias foram
escassas ou ausentes (Opdenakker et al., 1992).
No tecido tumoral, o TGF- β1 pode ser derivado de células epiteliais,
células inflamatórias ou dos próprios miofibroblastos (Galliher et al, 2006).
O tratamento com interferon α ou γ reduz a expressão de α-actina pelos
miofibroblastos (Gu et al, 2004). As culturas de fibroblastos e células tumorais
de diferentes órgãos demonstraram induzir a proliferação celular e a
emergência de miofibroblastos (Chen et al, 2005). Em geral, os miofibroblastos
adjacentes às células neoplásicas expressam grandes quantidades de α-actina
como observado nos carcinomas de mama (Sappino et al, 1988), melanoma
metastático (Tsukamoto et al, 1992) e CEC oral (Lewiet al, 2004).
O papel dos miofibroblastos na evolução do cancro não está
completamente compreendido. Inúmeros eventos relacionados à oncogênese,
incluindo proliferação, adesão, invasão e migração celular, podem ser
regulados pelos produtos da síntese dos miofibroblastos (Baglole et al, 2006;
Orimo et al, 2005; Wever et al, 2004; Lewis et al, 2004).
114
Fundamentos Teóricos
Orimo et al, (2005) demonstraram que miofibroblastos são capazes de
estimular a proliferação das células tumorais em carcinomas invasivos de
mama via produção de níveis elevados do factor de crescimento derivado do
estroma 1 (SDF-1). Em adição, o fator SDF-1 estimula a angiogênese nos
carcinomas de mama, através do recrutamento de células progenitoras
endoteliais. A libertação de PDGF e do factor de crescimento de queratinócitos
(KGF) por miofibroblastos também foram demonstrados estarem associados a
uma indução na proliferação das células tumorais (Mass-Szabowski et al,
2001). Indirectamente, a secreção de HGF/SF pelos miofibroblastos pode
promover a invasão neoplásica através da inibição de E caderinas (Trusolino et
al, 2002).
3.3.4. Miofibroblastos Na Fibrose Hepática
A fibrose hepática e a cirrose terminal são as principais características
patológicas de muitas doenças hepáticas crónicas (Albanis et al, 2006; Bataller
et al, 2005). A fibrose hepática pode conduzir a hipertensão portal e
insuficiência hepática, e está associada a um risco aumentado de cancro
hepático (Llovet et al, 2006). Embora a fibrose hepática tenha sido considerada
uma doença progressiva e irreversível, os dados provenientes de modelos
animais e de estudos em humanos começaram a desafiar o dogma de que a
fibrose é irreversível (Fallowfield et al, 2006). Existem provas experimentais
substanciais de que se a cirrose estiver suficientemente avançada, já não é
possível revertê-la. Estudos recentes demonstraram que a diminuição de
macrófagos no início da resolução da fibrose pode retardar a degradação da
matriz extracelular (MEC) (Duffield et al, 2005). Isto sugere que os macrófagos
poderão ser essenciais para iniciar a degradação da MEC.
Desmoulière et al, (2005) referiu estudos em que a cirrose hepática é
caracterizada pela secreção excessiva de proteínas da matriz devida há
existência de miofibroblastos no fígado. A cirrose hepática, previamente
considerada irreversível, pode ser remodelada com diminuição da expressão
115
Fundamentos Teóricos
de colagénio tipo I e tecido inibidor de metaloproteinases (TIMP) mRNA,
activação
das
metaloproteinases
da
matriz
(MMPs)
e
apoptose
miofibroblástica.
3.3.5. Miofibroblasto Na Patologia Cardíaca
Na paragem cardíaca, o excesso de fibrose intersticial é produzido pela
activação de miofibroblastos, em resposta a sinais reguladores como a
angiotensina II, aldosterona, ou relacionada com a libertação de TGF-β1 via
parácrina (Gabbiani, 1998; Sou and Weber, 1996). Segundo o autor Jones
(2005), no coração, a fibrose cardíaca está associada à proliferação
fibroblástica, à transdiferenciação para miofibroblasto e ao aumento da
deposição de colagénio.
Soini et al. (2001), Rabkin et al. (2001), Otto et al. (1994), Olsson et al.
(1994) referem que o aparecimento e localização de miofibroblastos no tecido
valvular, está fortemente correlacionado com a desorganização da matriz,
lesões degenerativas, aumento de MMP (metaloprotease de matriz), aumento
dos níveis de mRNA e fibrose, implicando o seu papel na doença valvular.
Berk e colegas observaram as alterações estruturais na ECM e
concluíram que embora todos os principais componentes do sistema renina –
angiotensina – aldosterona possam apresentar actividade profibrótica, a ANG II
parece ser a hormona dominante responsável pela fibrose cardíaca na doença
cardíaca hipertensiva.
A ANG II exerce os seus efeitos directamente através da estimulação da
produção do TGF-β1 e desencadeando a proliferação e a diferenciação de
fibroblastos em miofibroblastos secretores de colagénio (Rosenkranz, 2004).
Para além dos seus efeitos sobre a secreção e activação do TGF-β1, a ANG II
intensifica directamente a sua sinalização. Por sua vez, posteriormente, o TGFβ1 pode aumentar mais a produção de colagénios intersticiais, fibronectina e
proteoglicanos através dos miofibroblastos cardíacos (Gabbiani et al, 2002).
116
Fundamentos Teóricos
O TGF-β1 também desencadeia a sua própria produção através de
miofibroblastos, estabelecendo assim um ciclo autócrino de diferenciação e
activação de miofibroblastos. A sobreexpressão do TGF-β1, em ratinhos
transgénicos, resulta em hipertrofia cardíaca caracterizada por fibrose
intersticial e crescimento hipertrófico dos miócitos cardíacos (Rosenkranz et al,
2002). Os doentes que sofrem de cardiomiopatia hipertrófica idiopática e de
cardiomiopatia dilatada também têm níveis aumentados do TGF-β1, no
miocárdio do ventrículo esquerdo (Li et al, 2002) Membros da família TGF-β,
factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento
semelhante à insulina II (IGF-II) e IL-4 demonstraram ser os principais factores
envolvidos na transdiferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos (Powell et
al, 2005; Desmoulière et al, 2004).
3.4. MIOFIBROBLASTOS E A CAVIDADE ORAL
Durante a cicatrização da lesão gengival, uma subpopulação específica
de células diferenciadas são designadas por miofibroblastos (Hakkinen et al,
1996).
A diferenciação de miofibroblastos é um evento importante na reparação de
uma lesão gengival e na inflamação crónica.
Os miofibroblastos gengivais têm uma capacidade aumentada de
remodelar a matriz extracelular e esta característica foi associada a mudanças
na distribuição da F-actina e na expressão do marcador dos miofibroblastos a
α-actina.
Entre os factores de crescimento que se manifestam na gengiva, o TGFβ1 é produzido de forma abundante quando este tecido é sujeito à inflamação
ou cicatrização da lesão (Smith et al, 2006). Este factor de crescimento está
igualmente incluído na indução do fenótipo miofibroblastico (Desmoulière
1993).
117
Fundamentos Teóricos
Smith e seus colaboradores (2006) no estudo que realizaram mostraram
que TGF-β1 activou GTPase RhoA, sendo esta a chave reguladora da actina
do citoesqueleto. Em consequência deste evento, o factor de crescimento
estimula as fibras de tensão e reforça as adesões focais de vinculinaenriquecidas. Estas respostas foram bloqueadas após a inibição de ROCK, o
alvo principal da activação de RhoA.
Considerando RhoA e sua quinase alvo principal Rho (ROCK) foram
apontados por serem essenciais para a formação de complexos focais e de
actina (Hotchin and Hall, 1995; Riento and Ridley , 2003).
Smith et al, 2006, investigaram como se inicia a activação de RhoA uma
vez que esta é controlada por TGF-β1 em fibroblasto gengivais.
Estes estudos sugerem que a RhoA-ROCK activada por TGF-β1, seja o
componente principal da família de Rho GTPase envolvida nas mudanças do
citoesqueleto observadas durante a diferenciação dos miofibroblastos.
Finalmente, concluiu-se que TGF- β1 promove a indução do fenótipo dos
miofibroblastos com a activação da RhoA-ROCK em fibroblastos gengivais
humanos.
3.5. MIOFIBRIBLASTOS E PATOLOGIAS CAVIDADE ORAL
3.5.1. Fibromatose gengival hereditária
A expressão excessiva de TGF-β1, pode resultar em situações fibróticas
(Akagi et al, 1996; Roberts et al, 1996). Esta foi considerada uma citocina
indutora responsável do fenótipo miofibroblástico, na Fibromatose Gengival
(Bitu et al, 2006), na qual a manifestação mais proeminente, é uma excessiva
acumulação de matriz extracelular, predominantemente colagénio tipo I (Araujo
et al, 2003).
118
Fundamentos Teóricos
A fibromatose gengival hereditária (FGH) é caracterizada por um
aumento gengival fibroso e de crescimento lento, onde fibroblastos expressam
níveis elevados de colagénio e factor de crescimento transformante β1 (TGFβ1). (Bozz et al, 1994).
Os resultados do estudo realizados por Bitu e seus colaboradores (2006)
sugerem que a presença de miofibroblastos em FGH é dependente dos níveis
de expressão de factor de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), e que
mais de um mecanismo biológico está provavelmente envolvido no aumento
gengival dos pacientes afectados por esta doença.
3.5.2. Cicatrização de lesão do palato
A maioria dos estudos sobre miofibroblastos foram feitos na pele,
embora as diferenças e as similaridades entre a cicatrização na derme e na
cavidade oral sejam discutíveis. As mais notáveis diferenças são que lesões na
mucosa oral sofrem reparação mais rapidamente e com menos cicatrizes do
que as lesões cutâneas. Apesar disto, as características específicas do mucoperiosteo palatino causam a contracção extensiva da ferida e formação de
tecidos de cicatrização. Este conhecimento deve ser tido em consideração para
o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para melhorar o resultado da
cirurgia de fissura congénita do palato (Van Beurden et al, 2005).
3.5.3. Mixoma Odontogénico
Os mixomas são originários de células mesenquimais primitivas que
possuem características de fibroblastos modificados que perderam a
capacidade de produzir colágeno maduro e secretar fibras de colágeno
imaturas, assim como ácido hialurônico em excesso (Guilllermo et al, 2008).
Microscopicamente o mixoma de tecidos moles está constituído por uma
proliferação de células fusiformes, estroma mucóide abundante e espaços
vasculares finos. Tem sido comprovado que as células neoplásicas são
119
Fundamentos Teóricos
fibroblastos modificados, negativos para a proteína S-100 e desmina, e
positivos para vimentina (Martinez-Mata et al, 2008).
O Mixoma odontogénico é uma neoplasia benigna localmente infiltrativa,
constituída por células fusiformes, angulares e arredondadas dispersas num
abundante estroma mucóide. É definido classicamente como uma lesão
tumoral desenvolvida a partir de estruturas dentárias, no entanto a sua
etiopatogênese ainda é motivo de discussão. (Reichart and Phillipsen 2004).
A maioria dos autores concorda com uma origem mesenquimal do MO,
principalmente derivada de fibroblastos modificados ou miofibroblastos
(Gundlanch and Schulz 1977, Hasleton et al, 1978).
O achado mais significativo nos fibroblastos modificados (mixoblastos)
foi a presença de um conglomerado de filamentos no citoplasma dispostos de
forma desorganizada e presente em maior quantidade quando comparado aos
fibroblastos presentes na mesma lesão.
Também Martinez-Mata et al, (2008) concluíram que MO é uma lesão de
origem mesenquimal e que possivelmente tenha sua etiologia a partir de
células fibroblásticas ou miofibroblásticas modificadas e de seus produtos
secretados.
3.5.4. Carcinoma Espino Celular (CEC)
Os mecanismos de indução do estroma tumoral pelas células
neoplásicas e o seu papel no controle da carcinogênese não estão
completamente compreendidos. Existem fortes evidências de que ocorra uma
estimulação recíproca entre as células tumorais e os componentes do estroma
através da secreção de fatores de crescimento, citocinas, proteases e
proteínas da MEC, promovendo a proliferação, sobrevivência e invasão das
células tumorais (Baglole et al, 2006; Orimo et al, 2001; 2005; De Wever et al,
2004; Lewis et al, 2004). Uma das características mais evidentes durante o
120
Fundamentos Teóricos
desenvolvimento do estroma tumoral é a presença de miofibroblastos. Existem
inúmeros estudos que demonstraram a presença de miofibroblastos no
estroma tumoral, incluindo aqueles que utilizaram cancro de mama (RonnovJessen et al, 2002; Sieuwerts et al, 1998), próstata (Untergasser et al, 2005;
Olumi et al, 1999), pulmão (Cekanova et al, 2006), bexig (Kuroda et al, 2006) ,
colo rectal (Kuroda et al, 2005) e fígado (Mikula et al, 2006). Miofibroblastos
também foram encontrados em carcinomas espinocelulares de cavidade oral,
faringe e laringe (Kojc et al, 2005; Barth et al, 2004; Lewis et al, 2004).
Estudos realizados com cancro de mama, rins, uretra e cólon também
demonstraram a ausência de miofibroblastos no estroma de tecidos normais
além do frente invasiva do tumor (Kuroda et al, 2006; Cimpean et al, 2005;
Kuroda et al, 2005). Por outro lado, carcinoma ductal in situ altamente
pleomórfico da mama e carcinoma urotelial de bexiga não-invasivo induziram o
aparecimento de miofibroblastos no estroma subjacente às células neoplásicas,
demonstrando que factores derivados das células tumorais agressivas são
capazes de se difundir através da membrana basal, estimulando a
transdiferenciação dos miofibroblastos (Shimasaki et al, 2006; Chauhan et al,
2003).
Yazhou et al, (2004), analisando parâmetros prognósticos para os
carcinomas ductais de mama, encontraram uma marcante correlação entre a
presença dos miofibroblastos e presença de metástases linfonodais, graduação
histológica e alta densidade microvascular do tumor, sugerindo que a presença
dos miofibroblastos é associada a um pior prognóstico para o paciente. Galie et
al, (2005), utilizando células epiteliais de cancro de mama e células do estroma
da mesma lesão, concluiram que as células tumorais induzem um estroma
altamente
vascular
Adicionalmente,
a
e
invasivo
presença
com
presença
de
dos
miofibroblastos
miofibroblastos.
correlacionou
significantemente com o desenvolvimento de metástases, visto que a infiltração
destas
células
precede
o
recrutamento
de
células
endoteliais
em
micrometástases avasculares, gerando um estroma específico para a
angiogênese do tipo sinusoidal e portal (Olaso et al, 2003).
121
Fundamentos Teóricos
Estes resultados reforçam nossos resultados clínicos da importância da
presença dos miofibroblastos para o comportamento tumoral.
Citocinas secretadas pelas células tumorais ou pelas próprias células do
estroma tumoral são os mais prováveis candidatos para induzir a emergência
dos miofibroblastos no estroma tumoral (Desmouliere et al, 2004). Estudos in
vivo e in vitro têm demonstrado que células derivadas de CECs orais produzem
elevadas quantidades de citocinas e factores de crescimento, incluindo TGFβ1, TGF-α, IGF e ILs (Jackson-Bernitsas et al, 2006).
Krtolica et al, (2001) demonstraram que os componentes da MEC
secretados pelos miofibroblastos são responsáveis pela proliferação das
células tumorais. Por outro lado, Tokunou et al, (2001) demonstraram que a
síntese de HGF/SF por miofibroblastos induz a proliferação das linhagens
celulares de adenocarcinoma de pulmão. Mais recentemente, Shao et al,
(2006) demonstraram que miofibroblastos estimulam a proliferação das células
epiteliais intestinais via secreção do factor de crescimento epidérmico
anfiregulina. É nítido que outros estudos são necessários para determinar se os
efeitos dos miofibroblastos na indução da proliferação das células tumorais são
dependentes da síntese de fatores de crescimento, da secreção de
componentes da MEC ou ambos.
A migração das células tumorais pelo tecido conjuntivo é um fenómeno
essencial para a invasão e metástase tumoral. Este evento é acompanhado por
alterações nas interacções entre as células e a MEC e pela secreção de
enzimas proteolíticas capazes de degradar os componentes da matriz. As
principais enzimas proteolíticas associadas à degradação da MEC são as
pertencentes à família das MMPs (Vansaun and Matrisian, 2006).
122
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra estudada abrange 90 indivíduos, da consulta de Medicina
Dentária do Hospital Senhora da Oliveira – Guimarães, a Norte de Portugal,
entre os anos de 2003 e 2008.
A todos os indivíduos foi aplicado um protocolo de trabalho, previamente
definido, onde se registaram os principais elementos da sua identificação,
história clínica e localização exacta da colheita. Nos indivíduos dos grupos I e II
foram ainda registados os elementos relativos às patologias diagnosticadas.
4.2. AVALIAÇÃO CLÍNICA
A avaliação clínica foi feita através de uma anamnese e de um exame
objectivo. Na anamnese, foi elaborado um questionário sobre as principais
patologias locais e sistémicas, presentes ou passadas, hábitos e terapêuticas.
No exame objectivo foi efectuada uma observação clínica intra e extra-oral. No
exame extraoral, foram despistadas as principais alterações esqueléticas, de
pele e mucosas. No exame intraoral, foram avaliadas as mucosas de
revestimento, mastigatória e especializada. Foram ainda observadas as
125
Material e Métodos
principais inserções de freios, tumefações, pigmentações endógenas e
exógenas dos tecidos moles e duros. Procedeu-se ao preenchimento de uma
ficha clínica periodontal para os respectivos registos.
O diagnóstico de periodontite teve por base o índice de extensão e
severidade (Carlos et al, 1986)
Os diagnósticos das diferentes patologias da cavidade oral tiveram por
base avaliações com critérios anátomo-patológicos.
Após a avaliação clínica e histopatológica, os indivíduos foram
distribuídos pelos respectivos grupos de estudo da seguinte forma:
 Grupo I: foram aqui colocados todos os indivíduos que não
apresentaram qualquer patologia sistémica ou localizada. Foram
classificados como clinicamente saudáveis e serviram como grupo de
controlo.
 Grupo II: foram aqui colocados todos os indivíduos que não
apresentaram qualquer patologia sistémica mas evidenciaram perda de
inserção clínica de leve a moderada. Clinicamente foram classificados
como indivíduos com periodontite leve a moderada e sendo classificados
como grupo de periodontite.
A classificação leve a moderada foi baseada na classificação de
Armitage, 1999.

Grupo III: foram aqui colocados todos os indivíduos que apresentaram
outras patologias da cavidade oral, previamente diagnosticadas.
Clinicamente foram classificados de acordo com as diferentes patologias
e serviram como base de referência para o estudo comparativo com
outros dois grupos. As patologias estudadas foram: leucoplasia,
carcinoma espinocelular, líquen plano, fibroma, hiperplasia fibro-epitelial,
epúlide fibrosa e epúlide granulomatosa.
126
Material e Métodos
4.3. TÉCNICA DE COLHEITA
Os tecidos foram colhidos em ambiente asséptico, pela técnica de
biópsia convencional, ao nível da região vestibular dos 3º e 4º quadrantes, na
transição entre a gengiva livre e gengiva aderida com tamanhos que oscilaram
entre os 2x2mm e os 10x5mm.Todas as biópsias foram efectuadas com
anestesia loco-regional à base de lidocaína a 2%, após consentimento prévio
do paciente obtido por escrito de forma esclarecida e voluntária, em modelo
próprio, aprovado pela comissão de ética do Hospital Senhora da Oliveira –
Guimarães.
4.4. FIXAÇÃO
Todos os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados com
formaldeído tamponado a 10%, numa quantidade de correspondeu a pelo
menos dez vezes o volume do tecido fixado.
Os tecidos estudados em microscopia óptica foram fixados em tampão
cacodilato de sódio a 0,1 M (pH 7,4). Em alguns casos foi feito o
processamento directo a partir da fixação para microscopia óptica.
4.5. PROCESSAMENTO
4.5.1.Processamento dos tecidos para microscopia electrónica
A partir das amostras incluídas em blocos de parafina, efectuou-se uma
selecção da área de maior interesse, a qual foi removida, cuidadosamente,
com ajuda de um bisturi. O fragmento foi cortado em pequenos pedaços e
colocados em xilol durante 24 horas de modo a remover toda a parafina.
Seguiu-se uma hidratação numa série decrescente de álcool com passagens
de 1 hora em etanol a 100% e de 30 minutos em etanol a 90% e 70%, sempre
127
Material e Métodos
com duas mudanças para cada álcool. De seguida, os fragmentos foram
mergulhados em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (pH 7,4) durante 1 hora e
30 minutos, fazendo mudanças do tampão a cada 30 minutos. Seguiu-se a
etapa de pós-fixação durante 1 hora (a 4ºC) com tetróxido de ósmio a 1%, em
tampão cacodilato de sódio a 0,1 M (pH 7,4). Posteriormente, efectuou-se uma
desidratação numa série ascendente de álcool, com passagens de 10 minutos
por soluções de etanol a 50%, 75%, 90% e 95%, sempre à temperatura de 4ºC,
seguidas de três passagens, também de 10 minutos cada, em etanol absoluto.
Na última mudança de etanol absoluto o processamento passou a ser à
temperatura ambiente. Seguiram-se mais duas passagens, de 10 minutos
cada, mas agora por óxido de propileno. A impregnação das amostras na
resina de inclusão consistiu em submeter os fragmentos em misturas de óxido
de propileno e uma resina tipo Epoxy (Epon) nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:3,
respectivamente, com a duração de 1 hora em cada mistura. Finalmente os
fragmentos foram mergulhados em Epon puro, no qual ficaram durante 1 hora
à temperatura ambiente e durante 30 minutos a 50ºC. Seguiu-se a inclusão,
realizada em moldes de borracha os quais, depois de preenchidos com um
fragmento em cada extremidade e cheios com Epon, foram colocados na
estufa à temperatura de 60ºC durante 2 dias para polimerização da resina. Os
cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de diamante, num ultramicrótomo
(Leica Ultracut R), e recolhidos em grelhas de cobre com 200 mesh. Uma dupla
contrastação dos cortes foi efectuada manualmente, tendo-se emergido,
primeiramente, as grelhas com os cortes numa solução salinada de acetato de
uranilo durante 20 minutos e posteriormente, numa solução de citrato de
chumbo durante 10 minutos (Reynolds, 1963). A observação foi feita num
microscópio electrónico de transmissão JEOL 100CXII, no qual foram
efectuados registos de algumas imagens sob a forma de microfotografias.
128
Material e Métodos
4.5.2. Processamento dos tecidos em histoquímica
4.5.2.1. Coloração de Hematoxilina – Eosina
A coloração de Hematoxilina-Eosina foi usada em todos os tecidos
estudados como primeira coloração. É o principal método histoquímico
efectuado
na
rotina
histopatológica,
acompanhando
sempre
técnicas
complementares de diagnóstico como a imuno-histoquímica. É utilizada por ser
aquela que nos oferece uma relação núcleo-citoplasma mais fidedigna e por
ser a que melhor demonstra a arquitectura tecidular, sendo uma técnica capaz
de demonstrar os principais elementos tecidulares: o núcleo, o citoplasma e o
colagénio.
Princípio:
Esta técnica tem por base a conjugação de dois corantes com
propriedades químicas diferentes, agem sucessivamente um corante nuclear
básico (hemateína) e um corante citoplasmático ácido (eosina).
A Hematoxilina é um corante aquoso e de carácter básico, com afinidade para
estruturas basófilas como o núcleo. A eosina é um corante aquoso de carácter
ácido, com afinidade para estruturas acidófilas como o citoplasma
Nesta coloração os núcleos coram de azul-escuro/ preto, o citoplasma e
fibras conjuntivas de rosa / vermelho
Procedimento técnico:
Os tecidos foram preparados tendo por base o protocolo aferido pelo
laboratório de Anatomia Patológica e seguiu os passos que a seguir se
descrevem:
Os tecidos foram submetidos a três banhos sucessivos em xilol, estando
precisamente 10 minutos em cada banho. Em seguida, os tecidos foram
hidratados passando para tal por uma série descrescente de álcoois,
respectivamente a 100%, 95%, 80%, 50% e finalmente colocados em água.
129
Material e Métodos
Depois de lavados, foram corados pela hematoxilina durante 3 minutos,
e novamente lavados em água para serem de seguida colocados no Ácido
Clorídrico para diferenciação. Seguidamente foram lavados em água corrente
durante 10 minutos e posteriormente corados pela eosina durante 3 minutos.
Depois de corados pela eosina, os cortes foram lavados, removidos os
excessos de corante e depois secos em estufa durante 10 minutos.
Depois de secos os cortes, procedeu-se à montagem em meio resinoso
(Entellan®).
4.5.2.2. Tricrómio de Masson Especial
Esta coloração especial foi particularmente importante na identificação
das fibras de colagénio e sua localização, para a compreensão de processos
patológicos associados aos miofibroblastos, como a expressão do tecido
conjuntivo no processo de reparação, e padronização das alterações
histológicas em resposta a agressões físicas ou químicas.
Princípio:
A coloração foi efectuada inicialmente com um corante ácido, a solução
de Ponceau-Fucsina ou Fucsina Ácida, a qual corou todas as estruturas
acidófilas (citoplasma, músculo, colagénio).
O corante foi retirado das fibras de colagénio por diferenciação com
ácido fosfomolíbdico, permanecendo ligado ao citoplasma e músculo.
O ácido fosfomolíbdico actua também como mordente para o azul de anilina.
Para a coloração nuclear, foi utilizado o azul-celeste, seguido de uma
hematoxilina de hemalúmen, pois desta forma obtivemos uma forte coloração
nuclear, que é resistente à acção do ácido utilizado.
130
Material e Métodos
Procedimento:
Foi feita inicialmente uma desparafinação a que se seguiu a hidratação e
lavagem. Os tecidos foram passados por água destilada e corados com azulceleste durante 5 minutos.
De seguida, os cortes foram escorridos e corados os núcleos com
Hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Cobriram-se com álcool-pícrico durante
5 muinutos e depois foram abundantemente lavados com água corrente.
Depois de bem lavados, foram corados durante 5 minutos pela solução
Ponceau-Fucsina. Lavaram-se de seguida com água destilada e colocaram-se
a morder com Ácido Fosfomolíbdico 1% durante 5 minutos. Foram novamente
lavados com água destilada e corados pelo azul de anilina num tempo que
variou entre 2 e 5 minutos.
Finalmente e após nova lavagem em água destilada foram desidratados
os tecidos, diafenizados e posteriormente montados em meio resinoso.
Os resultados encontrados nos diferentes cortes foram de acordo com a
técnica clássica, ou seja, os núcleos coraram de azul escuro, o colagénio de
azul, as fibras musculares de vermelho, os eritrócitos de amarelo a laranja, os
citoplasmas de vermelho, as estruturas nervosas de azul e o fibrinogénio de
vermelho escuro.
Preparação de soluções:
As diferentes soluções usadas para o tricrómio foram preparadas de
acordo com os protocolos clássicos, nas proporções que a seguir se
descrevem:
131
Material e Métodos
Fucsina ácida:
Fucsina ácida
0,5 g
Ácido Acético glacial
0,5 ml
Água destilada
99,5 ml
Ácido Fosfomolíbdico a 1%:
Ácido Fosfomolíbdico
1g
Água destilada
100 ml
Azul de Anilina:
Azul de Anilina
2g
Ácido Acético glacial
2,5 ml
Água destilada
97,5 ml
4.5.2.3. Van Gieson
Princípio:
A técnica de Van Gieson foi usada por ser uma coloração simples,
rápida e específica para as fibras de colágenio.
É uma coloração tricrómica composta por um corante nuclear e uma
solução constituída por uma mistura de dois corantes ácidos (ácido picríco e
fucsina ácida). O ácido pícrico actua como diferenciador do azul-celeste e
como corante para estruturas como, músculo, fibrina e eritrócitos, que possuem
a capacidade de reter pequenas moléculas. A Fucsina-Ácida cora as estruturas
mais laxas, como o colagénio por ser constituído por moléculas maiores e
menos difusas.
132
Material e Métodos
Procedimento:
Os tecidos foram inicialmente desparafinados e hidratados. Depois, de
forma sequencial foram corados os núcleos pela solução de azul-celeste. De
seguida, as lâminas foram escorridas e coradas pela Hematoxilina de Gill
durante 5 minutos. Foi feita de seguida a lavagem em água corrente e a
diferenciação em álcool-ácido. Depois de bem diferenciados os tecidos foram
lavados abundantemente durante 10 minutos e corados em seguida pela
solução de picro-fucsina de Van Gieson durante 3 a 5 minutos.
Para finalizar, os cortes foram escorridos, lavados em água abundante,
seguindo-se as fases de desidratação, diafenização e montagem.
Resultados:
Os resultados foram de acordo com os protocolos estabelecidos, ou seja
os núcleos coraram de azul/preto, o citoplasma, músculo e glóbulos vermelhos
de amarelo e o colagénio de vermelho.
Preparação de soluções:
As diferentes soluções usadas para o Van Gieson foram preparadas de
acordo com os protocolos clássicos, nas proporções que a seguir se
descrevem:
Azul Celeste
Azul Celeste B
2,5 g
Sulfato de Ferro Amónio
25 g
Glicerina
70 ml
Água destilada
500 ml
Dissolver o Sulfato de Ferro Amónio em água destilada fria com
agitação, de seguida adicionar o Azul Celeste e ferver esta solução durante
poucos minutos. Depois de a solução arrefecer, filtrar e adicionar a glicerina.
133
Material e Métodos
Picrofucsina de Van Gieson:
Solução saturada de ácido pícrico
100 ml
Solução aquosa de fucsina ácida 1%
10 ml
4.6.TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA
Os tecidos estudados foram submetidos a uma técnica imunohistoquímica para avaliação da presença de actina, vimentina, desmina e p63
utilizando os anticorpos NCL–SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESM-DERII e NCLp63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle
upon Tyne, UK), respectivamente.
Para
este
efeito,
as
lâminas
com
cortes
histológicos
foram
desparafinadas durante 20 minutos em xilol e hidratadas numa série
decrescente de álcoois até à água (álcool 100 % 5 minutos, álcool 100% 5
minutos, álcool 70% 5 minutos, álcool 50% 5 minutos e água corrente 5
minutos).
As amostras utilizadas foram fixadas com formaldeído tamponado a 10%
e incluídas em parafina. O processo de fixação de tecidos em formaldeído
proporciona a formação de ligações cruzadas que mascaram os epítopos
antigénicos. Assim sendo, alguns anticorpos requerem recuperção antigénica
para detectar o seu epitopo antigénico específico. Nesta série, com os
anticorpos anti-vimentina e anti-actina não foi necessário proceder à
recuperação antigénica visto que estes anticorpos detectam os seus epitodos
antigénios específicos sem que seja necessário quebrar as ligações cruzadas
provocadas pela fixação em folmaldeído. No entanto, para a detecção dos
epitopos antigénicos p63 e desmina, foi necessário realizar a recuperação
antigénica utilizando altas temperaturas. Neste trabalho, a recuperação
antigénica foi efectuada com uma solução comercial (RA Epitope Retrieval
Solution pH6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK)
134
Material e Métodos
semelhante à solução de tampão citrato original (10mM, pH=6,0), em banhomaria a 98ºC durante 30 minutos.
O sistema de detecção utilizado para a reacção de imuno-histoquímica
foi um kit de detecção com polímero de peroxidase (Novolink Polymer
Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK),
sendo que a detecção dos diferentes tipos de anticorpos foi efectuada seguindo
as instruções do fabricante deste sistema de detecção: Bloqueio da Peroxidase
endógena com a Peroxidase Block, durante 5 minutos; Inibição das reacções
inespecíficas com Protein Block, durante 5 minutos; incubação dos anticorpos
primários (anti-actina, diluição 1/200 e incubação durante 15 minutos à
temperatua ambiente; anti-desmina, diluição 1/50 e incubação à temperatura
ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, diluição de 1/200 e incubação à
temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63, diluição 1/10 e incubação
à temperatura ambiente durante 60 minutos); incubação do reagente Post
Primary Block, durante 30 minutos; Incubação com Polymer, durante 30
minutos; Revelação com DAB, durante 5 minutos. Após a marcação imunohistoquímica, os cortes histológicos foram contrastados com Hematoxilina,
durante 2 minutos, desidratados numa se série crescente de álcoois (álcool 50
% durante 2 minuto, álcool 80% durante 2 minutos, álcool 95% durante 2
minutos, duas vezes álcool 100% durante 2 minutos), diafanizados em xilol e
montados.
A precisão da técnica de imuno-histoquímica depende da obtenção de
uma marcação altamente específica prevenindo a reaccções inespecífica do
anticorpo primário no tecido. Na imuno-histoquímica é necessário assegurar
que cada anticorpo é utilizado na diluição apropriada, não evapore durante a
incubação e que seja removido completamente, se não estiver ligado, antes
que o próximo reagente seja adicionado. Por esta razão em cada ensaio
realizado foram incluídos lâminas com cortes histológicos de tecidos com
presença dos epitopos antigénicos em questão e, antes da realização da
técnica, procedeu-se à padronização das condições mais adequadas,
adaptando-se para cada anticorpo primário, a utilização de recuperação
antigénica e o tempo de incubação, temperatura e diluição do anticorpo
135
Material e Métodos
primário. A técnica foi realizada em câmara húmida e cada corte foi isolado
com caneta hidrofóbica. Em cada reacção, foram incluídos cortes histológicos
de apêncide ileo-cecal como controlo positivo para o anticorpo anti-actina, antidesmina e anti-vimentina, e cortes histológicos de próstata como controlo
positivo para o anticorpo anti-p63.
Após a marcação imuno-histoquimica de todos os casos com os quatro
anticorpos procedeu-se à avaliação das lâminas ao microscópio óptico.
4.7. OBSERVAÇÃO E FOTOGRAFIA
A observação e fotografia das imagens obtidas por microscopia óptica foi
feita no microscópio marca Olympus Zeiss® Axio A1, com ampliações de x5,
x10, x20, x40 e x100.
A observação e fotografia das imagens obtidas por microscopia
electrónica óptica foi feita no microscópio electrónico de transmissão JEOL
100CXII® com ampliações entre as x2000 e as x50000.
A leitura imuno-histoquímica dos marcadores alfa-actina, desmina,
vimentina e P63, foi feita a partir da observação em microscopia óptica, de
forma qualitativa e quantitativa, através de screening, numa escala de 0 a 3,
tendo por base os seguintes critérios:
Zero: ausência de qualquer marcação.
Um: marcação positiva até 1/3 do corte histológico.
Dois: marcação positiva em 2/3 do corte histológico.
Três: marcação positiva na totalidade do corte histológico.
136
Material e Métodos
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados utilizados para análise estatística foram obtidos a partir do
estudo de indivíduos atendidos no Serviço de Estomatologia e Medicina
Dentária do Hospital Senhora da Oliveira – Guimarães.
A colheita de dados foi efectuada pelo investigador, não tendo sido
efectuado qualquer estudo prévio de amostragem pelo que a análise estatística
se limita à avaliação dos casos em estudo.
A análise estatística descritiva dos dados foi feita utilizando a versão
15.0 do SPSS.
Dada a natureza das variáveis envolvidas na sua maior parte nominais e
categóricas, optou-se pelo uso de ferramentas estatísticas baseadas neste tipo
de dados. (Braga, 1995)
Para tornar mais perceptível quais as variáveis em estudo, apresenta-se nas
tabelas I, II e III, um resumo que contém a designação adoptada no tratamento
estatístico.
M/F
Idade
P63
Desmina
Actina
Vimentina
F
25
0
1
1
1
F
30
0
1
1
1
F
48
0
1
2
1
M
45
0
1
2
1
M
18
0
0
1
1
F
22
0
0
1
1
F
21
0
0
1
1
M
27
0
1
0
1
M
35
0
0
0
1
M
47
0
1
1
1
137
Material e Métodos
M/F
Idade
P63
Desmina
Actina
Vimentina
M
56
0
0
0
1
F
54
0
0
1
1
M
25
0
0
1
1
M
58
0
0
1
1
F
57
0
0
1
1
F
26
0
0
1
1
F
35
0
0
1
1
F
34
0
1
1
1
F
37
0
1
1
0
F
41
0
1
1
0
M
35
0
1
1
0
F
48
0
1
1
0
F
60
0
1
1
0
M
23
0
1
1
0
M
39
0
1
1
0
M
38
0
1
1
1
F
41
0
0
1
1
F
21
0
0
1
0
M
54
0
0
1
0
F
28
0
0
1
0
Tabela 1 - Caracterização imuno-histoquímica do Grupo I
M/F
Idade
P63
Desmina
Actina
Vimentina
M
25
2
1
2
2
M
20
0
1
2
1
F
16
1
0
1
2
F
18
0
1
0
2
F
14
0
1
1
1
M
18
0
0
1
1
F
50
0
1
2
1
F
51
0
1
2
0
138
Material e Métodos
M/F
Idade
P63
Desmina
Actina
Vimentina
M
50
0
0
0
0
M
45
2
1
3
3
M
55
1
1
3
3
M
58
1
1
3
2
F
65
0
1
1
1
F
69
0
0
3
3
M
50
2
1
3
3
M
22
0
1
2
3
M
62
2
1
3
3
F
51
1
2
3
3
F
45
1
2
3
3
M
35
1
2
2
1
M
21
1
2
2
1
M
58
0
1
2
1
F
45
0
1
2
1
F
44
0
1
2
1
M
23
0
1
2
1
F
65
0
1
2
1
F
55
1
1
2
2
M
38
1
1
2
2
M
21
1
2
2
2
F
22
1
2
2
2
M
48
1
2
2
2
M
14
1
2
2
2
M
39
2
2
2
2
F
28
2
2
2
2
F
28
1
2
2
2
Tabela 2 - Caracterização imuno-histoquímica do Grupo II
139
Material e Métodos
M/F
Idade
P63
Desmina
Actina
Vimentina
F
43
1
2
3
2
M
84
1
2
3
2
F
32
1
2
3
2
F
43
2
2
3
2
F
64
2
3
3
2
F
38
2
1
3
2
M
54
2
1
3
2
F
88
2
2
3
2
M
43
3
1
3
3
F
36
1
1
1
3
F
53
2
1
3
3
M
61
2
3
3
3
F
36
2
2
3
3
M
53
2
1
2
2
M
55
2
1
2
3
F
56
2
3
3
3
F
42
3
2
3
1
F
17
2
2
3
1
M
54
1
2
3
1
M
60
1
2
3
1
F
49
1
1
3
1
M
44
3
1
3
2
M
59
3
2
3
2
F
45
1
2
3
2
F
54
3
1
2
2
Tabela 3 - Caracterização imuno-histoquímica do Grupo III
140
RESULTADOS
Resultados
5. RESULTADOS
5.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA
Dos 90 indivíduos estudados, 44 são do género feminino e 46 são do
género masculino, apresentando idades compreendidas entre os 16 e os 88
anos, com uma média de idades de 41,8 anos (Gráficos 1, 2 e 3)
Género
F
M
46,67%
53,33%
Gráfico 1 - Distribuíção por géneros da amostra estudada (N=90)
143
Resultados
A amostra compreende três grupos de indivíduos, separados em grupos
I (clinicamente saudáveis), II (Periodontite) e III (Patologias orais). Destes, 30
indivíduos
não
apresentavam
qualquer
patologia,
35
apresentavam
parodontites suaves a moderadas e 25 tinham como diagnóstico outras
patologias da cavidade oral. (Gráfico 5 e Tabela 4)
A média de idades para os grupos I, II e III é respectivamente de 37,6 anos,
39,1 anos e 51 anos. (Gráfico 4)
25
Frequência
20
15
Mean =41,77
Std. Dev. =15,957
N =90
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Idade
Gráfico 2 - Descrição da frequência dependendo da idade do
paciente
144
Resultados
100
3
80
Grupo
60
2
40
20
1
0
0
20
40
60
80
Idade
Gráfico 3 - Distribuição por idades nos diferentes grupos
Grupo
Designação
Frequencia
Percentagem
I
Clínicamente saudáveis
30
33,3
II
Periodontite
35
38,9
II
Patologias Orais
25
27,8
Total
90
100
Tabela 4 - Caracterização dos indivíduos dos Grupos I, II e III
Grupo
Clínicamente saudáveis
Periodontite
Patologias Orais
27,8%
33,3%
38,9%
Gráfico 4 - Distribuição dos grupos de estudo
145
100
Resultados
Distribuição dos Grupos em função da Idade
Clínicamente
saudáveis
6
4
2
Periodontite
Frequência
0
6
4
2
Grupos
0
Patologias
Orais
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
Gráfico 5 - Distribuição etária
DIstribuição dos Grupos em função do Género
F
M
Bars show percents
10%
Percentagem
24 %
20%
30%
35 %
33 %
31 %
31 %
45 %
40%
50%
Clínicament e saudáveis
Pat ologias O rais
Periodont it e
Clínicament e saudáveis
Pat ologias O rais
Periodont it e
Gráfico 6 - Distribuição dos grupos em função do género
146
Resultados
Marcação positiva até 1/3 corte …
Ausência Marcação
33,3%
16,7%
15,6%
8,9%
Marcação positiva até 2/3 corte …
Marcação total corte histológico
13,3%
6,7%
Clínicamente
saudáveis
5,6%
Periodontite
Patologias
Orais
Clínicamente
saudáveis
Periodontite
Patologias
Orais
P63
Gráfico 7 - Caracterização do marcador P63 nos Grupos I, II e III
Marcação positiva até 1/3 …
Ausência Marcação
22,22%
16,67%
16,67%
11,11%
4,44%
Marcação positiva até 2/ co…
12,22%
Marcação total corte …
13,33%
3,33%
Clínicamente saudáveis
Patologias Orais
Clínicamente saudáveis
Patologias Orais
Desmina
Gráfico 8 - Caracterização do marcador Desmina nos Grupos I, II e III
147
Resultados
Marcação positiva até 1/3 cort…
Ausência Marcação
27,8%
3,3%
4,4%
2,2%
1,1%
Marcação positiva até 2/3 cort…
Marcação total corte histológico
23,3%
23,3%
8,9%
2,2%
3,3%
Clínicamente saudáveis
Patologias Orais
Clínicamente saudáveis
Patologias Orais
Actina
Gráfico 9 - Caracterização do marcador Actina nos Grupos I, II e III
Marcação positiva até 1/3 …
Ausência Marcação
22,2%
13,3%
11,1%
5,6%
2,2%
Marcação positiva até 2/3 …
14,4%
Marcação total corte …
14,4%
8,9%
Clínicamente saudáveis
Patologias Orais
Clínicamente saudáveis
7,8%
Patologias Orais
Vimentina
Gráfico 10 - Caracterização do marcador Vimentina nos Grupos I, II e III
148
Resultados
47 49
3
P63
48 45
Desmina
Actina
Vimentina
4
2
80 79
3
33 36
1
75
35
0
11 9
39
8
34
Clínicamente Saudáveis
Periodontite
Patologias Orais
Gráfico 11- Imunomarcação em função dos três grupos estudados
5.2. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO I
Os resultados obtidos a partir do grupo I, onde os indivíduos não
apresentam lesão clínica, evidenciam um padrão de células fusiformes, com
núcleos
alongados
e
citoplasma
finamente
reticulado,
de
contornos
citoplasmáticos rendilhados. Estas células são abundantes e fortemente
envolvidas por um estroma conjuntivo, em larga medida ocupado por fibras de
colagénio essencialmente de tipo I, algumas fibras elásticas num estroma
denso e fibrilar. A relação entre as células fusiformes e o seu estroma é intima,
traduzindo um padrão regular de normalidade. Obervam-se ainda algumas
células indiferenciadas com uma elevada relação núcleo-citoplasmática. As
149
Resultados
células epiteliais são em número considerável e bem diferenciadas (figuras 1, 2
e 12).
Em alguns cortes, torna-se evidente a estreita relação epitélio-conjuntiva, onde
as cristas epiteliais e as papilas conjuntivas formam interdigitações regulares e
abundantes. (Figuras 9, 10, 11, 13 e 14)
Os vasos são em número regular, de contornos sinuosos e fortemente
envolvidos por células de tipo mioepitelial e tecido conjuntivo. (figura 4)
O tecido conujuntivo que rodeia os fibroblastos gengivais de forma abrangente
e em particular os miofibroblastos é abundante, denso e rico em colagénio.
Quando colocado em evidência, demonstra um padrão sinuoso e alongado,
com agrupamentos em feixes. (Figura 3 e 5)
A coloração de Van Gieson permite confirmar o padrão de tecido conjuntivo
rico em colagénio, de contornos irregulares e sinusoidais. (Figuras 6, 7 e 8)
Figura 1 - Fibroblastos gengivais. HE x20 (setas)
150
Resultados
Figura 2 - Fibroblastos gengivais. HE x40 (seta)
Figura 3 - Fibroblastos gengivais. Tricrómio de Masson 20x
151
Resultados
Figura 4 - Transição epitélio-conjuntivo. HE x 20. Vasos (setas)
Fibroblastos e colagénio (rectângulos)
Figura 5 - Tecido conjuntivo gengival. Tricrómio de Masson x 20.
Fibroblasto (seta)
152
Resultados
Figura 6 - Tecido conjuntivo gengival. Van Gieson x 40.
Figura 7 - Tecido conjuntivo gengival. Região vestibular. Van Gieson x20
153
Resultados
Figura 8 - Tecido conjuntivo gengival. Van Gieson x20
Figura 9 - Transição epitélio-conjuntiva. HE x20
154
Resultados
Figura 10 - Transição epitélio-conjuntiva.
Região vestibular. Tricrómio de Masson x20.
Figura 11 - Gengiva aderida. Região vestibular. HE x20
155
Resultados
Figura 12- Gengiva aderida. Região vestibular. HE x40
Figura 13 - Interdigitações epitélio-conjuntivas.
Gengiva aderida da região vestibular do dente 46. HE x40
156
Resultados
Figura 14 - Interdigitações epitélio-conjuntivas.
Gengiva aderida da região vestibular do dente 46.
Tricrómio de Masson x20
5.3. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO II
Pelo
estudo
detalhado
dos
cortes
submetidos
ao
estudo
imunohistoquímico torna-se evidente a marcação dos miofibroblastos nos
indivíduos do grupo II com periodontites leves a moderadas. A marcação pela
alfa-actina é positiva em praticamente todos os casos embora com diferentes
intensidades de marcação.
Em baixa ampliação pode ver-se um fundo celularmente rico, com
elevada marcação para a alfa-actina, onde se evidenciam os miofibroblastos
como células positivamente evidentes na patologia periodontal, numa
expressão fisiopatológica de resposta à agressão.
157
Resultados
Na figura 15 pode observar-se uma célula alongada, de núcleo poligonal
e fusiforme, com projecções citoplasmáticas e núcleos vesiculosos, num
estroma rico e denso, compatível com o fibronexus que envolve os
miofibroblastos. Na seta, pode observar-se uma marcação positiva para a alfaactina característica de um miofibroblasto.
De entre os marcadores citoplasmáticos (alfa-actina, desmina e
vimentina) a marcação pela alfa-actina é a que mais caracteriza o
miofibroblasto. Mesmo assim, no tecido conjuntivo é bastante exuberante a
marcação positiva
para
a desmina
e vimentina. Esta marcação, é
particularmente evidente nas formas moderadas de periodontites. (Figuras 16,
17, 22, 24 e 27)
Num estudo realizado por Bello I. et al (2009) verificou-se que a
expressão imuno-histoquímica de alfa-actina nas ilhotas de células epiteliais de
carcinomas ameloblásticos, é um factor preditivo para esta variante
metastizante. O mesmo tipo de imunomarcação não ocorreu em casos de
ameloblastoma sólido ou multicístico.
A expressão de vimentina está particularmente associada às formas de
lesão crónicas, ao processo inflamatório envolvente e também à maior
proliferação dos miofibroblastos. (Figuras 20, 21 e 26)
Nos indivíduos com periodontites estudados observa-se a marcação
positiva para a proteína P63, caractrística da linhagem mioepitelial. A marcação
positiva aparece de forma esporádica em células isoladas ou de forma extensa.
Nos cortes onde é possível observar o epitélio, verifica-se uma extensa
marcação em bordadura nas células da camada basal. (Figuras 19, 23 e 25)
A marcação do citoesqueleto celular para os filamentos de desmina e vimentina
é evidente nas imagens 20, 21 e 26. Esta marcação, apresenta uma expressão
leve a moderada e é manifestamente inferior à observada na amostra
corrspondente aos indivíduos do grupo III.
158
Resultados
Figura 15 - Miofibroblastos da região vestibular. Actina x40(seta)
Figura 16 - Miofibroblastos da região vestibular. Actina x20
159
Resultados
Figura 17- Miofibroblastos da cavidade oral. Actina x20
Figura 18 - Miofibroblastos da cavidade oral. P63 x20
160
Resultados
Figura 19 - Miofibroblastos da cavidade oral. P63 x40
Figura 20 - Miofibroblastos da cavidade oral. Vimentina x20
161
Resultados
Figura 21 - Miofibroblastos fortemente positivos para vimentina x20
Figura 22 - Biópsia de gengiva aderida. Actina x20
162
Resultados
Figura 23 - Biópsia de gengiva aderida. P63 x20
Figura 24 - Miofibroblastos da cavidade oral. Actina x20
163
Resultados
Figura 25 - Miofibroblastos de gengiva aderida. P63 x40
Figura 26 - Miofibroblastos de gengiva aderida. Vimentina x20
164
Resultados
Figura 27 - Miofibroblastos da cavidade oral. Actina x40
5.4. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR DO GRUPO III
Pelo
estudo
detalhado
dos
cortes
submetidos
ao
estudo
imunohistoquímico torna-se evidente a marcação dos miofibroblastos nos
indivíduos do grupo III com lesões desmoplásicas. A marcação pela alfa-actina
é positiva em praticamente todos os casos de forma exuberante. (Figura 29)
Em baixa ampliação pode ver-se um fundo celularmente rico, com elevada
marcação para a alfa-actina e desmina, onde se evidenciam os miofibroblastos
como células positivamente evidentes na principais patologias da cavidade
oral.
Os miofibromas da cavidade oral, como neoplasia benigna com
diferenciação miofibroblástica são marcadamente imunoreactivos para a
vimentina e alfa-actina (Azevedo R. et al, 2008). Foi igualmente reportado por
165
Resultados
Demarosi F. e tal (2009) que sarcomas miofibroblásticos de baixo grau (LGMS)
da cavidade oral são imuno-histoquimicamente positivos para pelo menos um
marcador miogénico, tal como a desmina ou a alfa-actina, no entanto negativos
para S-100 e desmina.
De entre os marcadores citoplasmáticos (alfa-actina, desmina e
vimentina) a marcação pela alfa-actina é a que mais caracteriza o
miofibroblasto. Mesmo assim, no tecido conjuntivo é bastante exuberante a
marcação positiva
para
a desmina
e vimentina. Esta marcação, é
particularmente evidente nas formas severas de patologia. (Figura 28 e 30)
Figura 28 - Leucoplasia da cavidade oral. Vimentina x20
166
Resultados
Figura 29 - Carcinoma pavimentoso da cavidade oral.
Actina x20
Figura 30 - Carcinoma pavimentoso da cavidade oral.
Desmina x20
167
Resultados
Em microscopia electrónica, o miofibroblasto revela-se como uma célula
tipicamente alongada, pese embora o facto de não raras vezes assumir
aspectos incaracterísticos e bizarros.
Os
aspectos
observados
em
microscopia
electrónica,
ilustram
configurações específicas do estado metabólico celular, particularmente no que
diz respeito à sua dinâmica celular.
Em ultrastrutura, a vesiculação é abundante, os perfis mitocondriais
apresentam aspectos por vezes de sofrimento celular, traduzido pelo
apagamento das cristas mitocondriais e distorção da membrana interna.
(Figuras 33 e 35)
A ultra-estrutura do fibroblasto activo, apresenta uma distribuição de
organélos citoplasmáticos abundantes. Vários complexos de Golgi, abundante
retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias e vesículas de secreção. (Figura
36)
Frequentemente observamos a célula envolvida num estroma fibroso –
designado por fibronexus, deixando transparecer quadros preciosos da sua
biologia. As principais fibras encontradas são sem dúvida as fibras de
colagénio, embora nos miofibroblastos se evidenciam também as fibras
actínicas de expressão citoplasmática e orientadas segundo o maior eixo da
célula. (Figuras 34, 35)
As fibras de colagénio, extracelulares, agrupam-se em diversas
orientações numa estreita relação com os fibroblastos, em particular no caso
específico dos miofibroblastos (Figuras 31, 37 e 38). Este compromentimento
celular é particularmente evidente nas patologias de tipo proliferativo como as
leucoplasis ou as hiperplasias.
O
citoesqueleto,
permite
a
observação
de
microtúbulos
e
microfilamentos. Os sistemas filamentosos nos fibroblastos possuem um
importante papel na estruturação da sua forma bem como na sua fisiopatologia.
168
Resultados
O sistema microtubular, controla a organização morfológica do fibroblasto e
não apenas o seu citoesqueleto. (Figura 32)
De forma repetida observam-se mitocôndrias de perfis arredondados ou
ovalizados, mas mantendo uma boa preservação das cristas.
A nível nuclear, por vezes, observam-se condensações periféricas de
cromatina, em núcleos activos e alongados segundo o maior eixo da célula.
(Figuras 34 e 36)
O
miofibroblasto
constitui
um
elemento
central
no
âmbito
da
heterogeneidade celular. É sem dúvida um fibroblasto muito especial, com
marcadas características contrácteis das células musculares lisas e com uma
fisiologia
definida,
evidenciada
anteriormente apresentadas.
Figura 31 - Colagénio (x 30.000)
169
pelas
características
ultraestruturais
Resultados
Figura 32 - Fibroblasto gengival (25.000x)
Figura 33 - Miofibroblasto (12.000x)
170
Resultados
Figura 34 - Miofibroblasto (10.000x)
Figura 35 - Fibroblasto gengival (x 12.000)
171
Resultados
Figura 36 - Fibroblasto gengival (x 28.800)
Figura 37 - Colagénio (50.000x)
172
Resultados
Figura 38 - Colagénio (20.000x)
173
DISCUSSÃO
Discussão
6. DISCUSSÃO
O fenótipo do músculo liso que apresenta as células mioepiteliais, é
demonstrado pela marcação positiva para a actina da célula muscular lisa.
Estes marcadores, em especial a alfa-actina são determinantes para a
identificação dos miofibroblastos num estroma complexo e por vezes
desmoplásico. (Desmoulière et al., 2004)
No contexto da doença periodontal é frequente a expressão fenotípica
da alfa-actina por parte dos miofibroblastos, particularmente ao nível da
gengiva aderida. A marcação do citoesqueleto é igualmente positiva para os
filamentos de vimentina e desmina. A sua expressão é evidente, no entanto,
inferior à observada para os indivíduos que apresentam patologias de tipo
desmoplásico ou mesmo neoplásico (grupo III).
Os fibroblastos observados apresentam uma matriz extracelular densa e
complexa (o fibronexus) com uma membrana que envolve os filamentos
intracelulares em continuidade com as proteínas extracelulares.
Os miofibroblastos observados apresentam um retículo endoplasmático
rugoso bem desenvolvido, expressando dessa forma uma elevada taxa de
síntese de proteínas extracelulares, como o colagénio dos tipos I e III.
177
Discussão
No estudo efectuado foi possível a identificação por via imunohistoquímica de vários marcadores citoplasmáticos de referência e do
marcador nuclear P63. Estes marcadores celulares revelaram-se elementos
decisívos no diagnóstico e prognóstico da doença periodontal.
A imunomarcação ao nível dos miofibroblasto da cavidade oral,
particularmente no estadiamento da sua severidade, tem sido abordada em
trabalhos anteriores de forma diversa, frequentemente associada a outras
patologias não periodontais. (Smith et al., 2006)
São inúmeros os trabalhos no âmbito da carcinogénese e das patologias
desmoplásicas como a fibrose pulmonar, o carcinoma da mama, ou a cirrose
hepática, entre outras. Contudo, quando centramos a nossa atenção nos
marcadores estudados em periodontopatias a produção ciêntífica cai de forma
abrupta, particularmente no que diz respeito à sua aplicabilidade clínica e
diagnóstica. Neste trabalho, sugere-se uma escala de severidade aplicada à
doença de forma objectiva, como elemento clínico central. Entre os diversos
marcadores
estudados,
revelam-se
sensibilidades
diferentes,
embora
complementares. (Lewis et al., 2004; Tsukamoto et al., 1992)
Ao contrário das restantes marcações efectuadas, a marcação pelo P63
é uma marcação nuclear. A proteína P63 é um factor de transcrição (membro
da família P53) que marca positivamente células da camada basal de vários
tecidos e também células mioepiteliais. A imunomarcação pelo P63 é uma
marcação nuclear que deve ser valorizada quando associada a outros
marcadores
citoplasmáticos,
particularmente
a
alfa-actina,
desmina
e
vimentina.
A avaliação da expressão da vimentina e dos miofibroblastos pode ser
utilizada como uma ferramenta auxiliar de avaliação e prognóstico da patologia
periodontal. Se a estes factores, acrescentarmos a expressão de outros
imunomarcadores como a alfa-actina e a desmina obtemos uma valioso quadro
clínico de expressão de doença, na cavidade oral em termos gerais e nas
periodontites de forma mais particular.
178
Discussão
Estes marcadores podem agora agrupar-se em forma de escala,
correlacionando-se com diversas patologias.
Desta forma, poderemos observar que a intensidade da marcação é
proporcional à severidade da lesão. As marcações identificadas nos indivíduos
do grupo I são práticamente inexistentes, vão aumentando de significado nos
indivíduos do grupo II e são extensas e exuberantes nos indivíduos do grupo
III.
Ao nível clínico, a baixa positividade pelos marcadores estudados, nos
doentes com periodontites é um factor de bom prognóstico. Permite prever uma
boa resposta à terapêutica instituída e um menor tempo de recuperação. A
imunomarcação discreta ou suave (níveis 0, 1 e 2) está directamente
relacionada com lesões menos complexas e mais suaves na sua expressão
fenotípica. Pelo contrário, a marcação mais intensa (níveis 2 e 3) está
associada a lesões moderadas no caso das periodontites ou agressivas no
caso das restantes patologias da cavidade oral, particularmente ao nível das
lesões neoplásicas e pré-neoplásicas.
179
CONCLUSÃO
Conclusão
7. CONCLUSÕES
Do estudo efectuado podem retirar-se as seguintes conclusões:
As principais patologias da cavidade oral podem ser acompanhadas de
forma directa e proporcional pela expressão fenotípica dos miofibroblastos.
A intensidade da imunomarcação pela alfa-actina, desmina, vimentina e
P63 é directamente proporcional à severidade das principais lesões da
cavidade oral.
A intensidade da imunomarcação pela alfa-actina, desmina, vimentina e
P63 é um importante factor de diagnóstico e prognóstico das principais lesões
da cavidade oral.
A imunomarcação pela alfa-actina, desmina, vimentina e P63 é
tendencialmente negativa na ausencia de fenómenos proliferativos.
A imunomarcação pela alfa-actina parece ser a mais relevante no
acompanhamento da severidade da doença periodontal.
183
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