características das células do saco vitelino eqüino em

V Simpósio de Ciências da UNESP – Dracena
VI Encontro de Zootecnia – UNESP Dracena
Dracena, 22 a 24 de setembro de 2009.
Características das células do saco vitelino eqüino em diferentes períodos gestacionais1
André Luis Rezende Franciolli2, Adriana C. Morini3, Bruna Mascaro Cordeiro4, Phelipe Oliveira Favaron3, João
Carlos Morini Junior3, Daniele dos Santos Martins3, Carlos Eduardo Ambrosio5, Maria Angélica Miglino3
1
Parte da tese de doutorado do primeiro autor, financiada pela FAPESP
Doutorando do Programa de Pós-graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres, FMVZ-USP. Bolsista da FAPESP. email: [email protected]
3
Departamento de Cirurgia, Setor de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres, FMVZ-USP.
4
Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo.
5
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, FZEA-USP, Pirassununga.
2
Resumo: Estudos com células-tronco tem auxiliado nas possibilidades empregadas na terapia celular, com
relação aos mecanismos de proliferação e de diferenciação celular. Neste sentido, o trabalho caracterizou as
células vitelinas em diferentes períodos gestacionais entre 20, 30 e 40 dias, no intuito de estabelecer novos
métodos de cultivo celular para espécie, visando o desenvolvimento da medicina veterinária regenerativa. Os
fragmentos vitelinos foram cultivados em garrafas contendo meio e suplementos. Estas foram incubadas em
estufa conforme técnicas de rotina para cultivo. As culturas vitelinas eram compostas ambas as idades por
inúmeras células flutuantes indiferenciadas com formato circular nas primeiras 24 horas. Após 5 dias de cultura,
observamos dois tipos celulares com características fibroblast-like e epitelial, sendo o primeiro tipo de formato
alongado, fusiforme e citoplasma reduzido e, o segundo com formato arredondado e grande, com membrana
citoplasmática regular, citoplasma grande e esparso, núcleo pequeno e circular. Em seqüência, julgamos concluir
que nas 3 idades gestacionais o saco vitelino exibe dois tipos distintos de populações celulares, porém novos
conhecimentos relacionados com a capacidade de diferenciação estão sob experiência para confirmar a
pluripotencia dessas células vitelinas.
Palavras–chave: cultura de células, eqüino, morfologia, saco vitelino
Abstract: Studies on stem cells has helped the possibilities used in cell therapy, with respect to the mechanisms
of proliferation and cell differentiation. In this sense, the work has characterized the yolk cells at different
gestational periods of 20, 30 and 40 days in order to establish new cell culturing methods for the species, aiming
the development of regenerative veterinary medicine. The fragments were cultured yolk bottles containing
medium and supplements. These were incubated in accordance with routine techniques for cultivation. The
cultures were composed yolk both ages by countless floating undifferentiated cells with circular shape in the first
24 hours. After 5 days of culture, we observed two cell types with characteristics fibroblast-like and epithelial,
the first type of small format with elongated, fusiform and reduced cytoplasm, and the second with a large and
rounded, with regular cytoplasmic membrane, cytoplasm, and large sparse, small, circular core. Subsequently,
the judge concluded that 3 gestational ages, the yolk sac displays two distinct types of cell populations, but new
knowledge related to differentiation capacity are under experiment to confirm the pluripotency of yolk cells.
Keywords: cell culture, equine, morphology, yolk sac
Introdução
A capacidade de auto-renovação e diferenciação para formação de diferentes tecidos do organismo são
características que fazem das células-tronco estruturas especiais (Brugger et al., 2000). O saco vitelino é a
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primeira das membranas fetais a se desenvolver nos eutérios, o qual acompanha a parede do exoceloma e o
mesoderma extra-embrionário. A formação do saco vitelino inicia-se quando o hipoblasto (endoderma
prospectivo) sofre deslocamento e delamina-se dando origem à cavidade da blástula. O mesoderma formado no
botão embrionário primitivo migra entre o epiblasto e o hipoblasto. Isto transforma a blástula em uma estrutura
trilaminar. O epiblasto é então transformado no trofoblasto do córion. A cavidade forrada pelo endoderma é o
saco vitelino (Mossman, 1987). O objetivo deste trabalho foi caracterizar a morfologia das células do saco
vitelino eqüino com 20, 30 e 40 dias de gestação, a fim de demonstrar sua multipotencialidade celular e sua
capacidade de diferenciação visando o desenvolvimento da medicina veterinária regenerativa.
Material e Métodos
Os fragmentos vitelinos eqüinos com 20, 30 e 40 dias de gestação foram cultivados em garrafas de
cultivo de 25 cm2, contendo meio DMEM-H (Eagle Dulbeco modificado-high), suplementados com 20% de soro
fetal bovino (SFB) Hyclone, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de glutamina e 1% de antibiótico. As
garrafas contendo o material de cultivo foram incubadas a uma temperatura de 37,0oC, com umidade relativa
próxima de 100% e atmosfera gasosa de 5% de CO2. Após a expansão, as células foram analisadas
morfologicamente através do microscópio invertido (Nikon Eclipse, TS100).
Resultados e Discussão
As culturas de saco vitelino eqüino com 20, 30 e 40 dias de gestação eram compostas por inúmeras células
flutuantes indiferenciadas com formato circular nas primeiras 24 horas (Figura 1A). Seguido os cinco primeiros
dias de cultura, o meio de cultivo foi desprezado juntamente com as células flutuantes, restando somente células
que possuíam capacidade de adesão ao substrato. Dentre os diferentes tipos celulares liberados em cultura pelos
fragmentos vitelinos em ambas as idades, encontramos células com características fibroblast-like e com
característica epitelial, e com menor freqüência células ovóides (Figura 1B, 1C, 1D e 1E). Conforme elucidado
por Banks (1992) estes achados morfológicos são semelhantes com as características morfológicas das células de
origem mesenquimal no organismo in vivo. O mesmo autor ressalta que a célula mesenquimal, é uma célula
precursora da maioria das células do tecido conjuntivo, a qual exibe uma forma estrelada ou fusiforme, com alta
proporção de núcleo e citoplasma. Estas células são chamadas de células residentes, as quais incluem as células
mesenquimais indiferenciadas, células reticulares, fibroblastos, macrófagos, pericitos, células adiposas e
mastócitos. Morfologicamente as células com aparência fibroblast-like ou fibroblastóide eram pequenas com
formato alongado, fusiforme e citoplasma reduzido, visto nos trabalhos realizados por fato compatível com as
descrições de Colter et al. (2001) para humanos. As células com aparência epitelial eram grandes e arredondadas,
com membrana citoplasmática regular, citoplasma grande e esparso, núcleo pequeno e circular, segundo descrito
por Bydlowski et al. (2009) em humanos e Marcus et al. (2008) em ratos.
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B
A
D
C
E
Figura 1. Fotomicrografias de células do saco vitelino eqüino. Em A, células de 20 dias de gestação notar as células
flutuantes (setas) indiferenciadas, 40x. Em B, células vitelinas de 30 dias de gestação, observar o fragmento vitelino
liberando os dois tipos celulares: células com formato epitelial (circulo pontilhado) e células com formato fibroblastlike (setas), 4x. Em C e D, células vitelinas de 20 e 40 dias de gestação respectivamente, detalhe das células epiteliais,
10x. Em E, cultura vitelina com 40 dias de gestação, células com formato fibroblastóide, 4x.
Conclusões
Como conclusões, julgamos que nas três idades gestacionais (20, 30 e 40) o saco vitelino exibe dois tipos
distintos de populações celulares, porém novos conhecimentos relacionados com a capacidade de diferenciação
estão sob experiência para confirmar a pluripotencia dessas células vitelinas.
Referências
BANKS, W. J. Histologia Veterinária Aplicada. São Paulo: Manole, 1991. 629p
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