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Supporting Information Wiley-VCH 2012 69451 Weinheim, Germany A Secondary Sialic Acid Binding Site on Influenza Virus Neuraminidase: Fact or Fiction?** Jimmy C. C. Lai, Jean-Michel Garcia, Jeffrey C. Dyason, Raphael Bçhm, Paul D. Madge, Faith J. Rose, John M. Nicholls, J. S. Malik Peiris, Thomas Haselhorst,* and Mark von Itzstein* anie_201108245_sm_miscellaneous_information.pdf Supporting Information: General – All chemicals except otherwise stated, were purchased from Sigma-Aldrich with the highest purity available. The known compounds a(2,3)-sialyllactose (2) and oseltamivir carboxylate (3) were prepared in house. All NMR experiments were performed on Bruker Avance 600 MHz spectrometer, equipped with a 5-mm TXI probe with triple axis gradients. Production and purification of influenza NA-containing VLPs – Virus-like particles containing FLAG-tagged NA of influenza A/Cambodia/JP52a/2005 (H5N1), A/Gansu/Chenguan/1129/2007 (seasonal H1N1) or A/California/04/2009 (swine origin pandemic H1N1) were produced and analyzed as previously described (Lai et al. 2010). Briefly, HEK-293T cells were transfected with pcDNA-NA(H5), pcDNA-NA(H1) or pcDNA-NA(pdmH1). Culture medium were collected and filtered, followed by ultracentrifugation with a 30% sucrose-HEPES buffer (2 mM HEPES, 125 mM NaCl, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, pH 7.4) cushion and the NA-VLP pellet was resuspended in HEPES buffer and stored in -80 °C. NA content in the VLP was quantified using western blotting with Anti-FLAG monoclonal mouse antibody (Sigma). NA enzymatic activity was checked with NA-Star chemoluminescent assay (Applied Biosystems). NMR-based influenza NA-VLP assay – NA-VLP were diluted (~8 µM of NA in 250 µL of deuterated HEPES buffer) for each experiment. Sample buffer was exchanged three times using Amicon filters (100 kDa cutoff, Millipore) against 2 mM HEPES-D18, 125 mM NaCl, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, in D2O at 4 °C, with centrifugation at 13,000 rcf. The pH of the buffer was adjusted with 1 M NaOH to 5.5 to 8.5. 3’SL or 6’SL were added to the VLP samples to a concentration of 800 µM and incubated at 4 °C or 37 °C. 1H NMR spectra were measured at 298 K upon different incubation time, acquired with 32 scans with 2 s relaxation delay over a spectral width of 6000 Hz. For the inhibition experiment, oseltamivir carboxylate (3, final conc. 8 µM to 1600 µM) was added to NA-VLP prior to the addition of 2, incubated at 37 °C and 1H NMR spectra were acquired at different time intervals. Influenza virus neuraminidase pH optimum– To ensure that the influenza virus neuraminidase activity was abolished for the STD NMR experiment a fluorescent-based assay was carried out at different pH values using 4-methylumbelliferyl N-acetyl-α-Dneuraminide (MUN) as a substrate. In a standard 96-well plate format, a recombinant neuraminidase from a 2009 pandemic H1N1 strain was assayed for its activity at different pH by a modification [1] of the fluorometric method of Potier et al.[2] Stock solutions of neuraminidase were made in three different buffers (A. 50 mM sodium acetate pH 5.5, 6 mM CaCl2, B. 50 mM HEPES pH 7.4, 6 mM CaCl2, C. 50 mM HEPES pH 8.4, 6 mM CaCl 2). The reaction mix with a final volume of 10 µL (0.1 mM MUN, 1.83 µg/mL neuraminidase) was prepared in a 96well solid black plate on ice. All assays were done in triplicate. The reaction was started by brief centrifugation of up to 1,000 rpm for approx 10 sec. to combine all components. Immediately after centrifugation the reaction was incubated at 37 °C with 900 rpm shaking for 20 min. To stop the reaction, 250 µL 0.25 M glycine (pH 10.0) was added to each well and the fluorescence was read at an excitation of 355 nm and emission of 460 nm. It was found that the neuraminidase was inactive at pH 8.4 but showed residual activity at pH 7.4. NMR-based Influenza virus neuraminidase assay – The pH dependency on influenza virus neuraminidase was additionally investigated using an NMR-based neuraminidase assay. Neuraminidase activity from 5.5 to 8.4 showed a considerable decrease in consumption of the α(2,3)-sialyllactose (2) substrate, however, after a 60 minute incubation period under the chosen NMR conditions α(2,3)-sialyllactose (2) was completely cleaved into β-Neu5Ac (95%), α-Neu5Ac (5%) and lactose (Figure S1). To abolish cleavage of α(2,3)-sialyllactose (2) and to block the active site we decided to add the high-affinity influenza virus neuraminidase inhibitor 3 to the VLP:2–complex. Figure 1c shows the 1H NMR spectrum after 240 minute incubation of (H5)N1 influenza N1:2:3–complex at a molecular ratio of 1:100:1. It is obvious that the addition of one equivalent (N1:3) significantly inhibits cleavage of N-acetylneuraminic acid from of α(2,3)-sialyllactose (2). Only a minor H3eq signal (3%) of βNeu5Ac is visible at 2.10 ppm. A new sample containing a (H5)N1:2:3–complex at a molecular ratio of 1:100:2 was prepared and after 240 minute incubation no cleavage of Nacetylneuraminic acid (1) was observed (data not shown), demonstrating 2 equivalents of OC (3) are sufficient to completely block the active site of influenza virus NA and to prevent N-acetylneuraminic acid cleavage. Figure S1. H NMR spectra of α-(2,3)-sialyllactose (2) in complex with avian N1-VLPs before (a) and after 60 minute incubation (b), and with addition of OC (3) after 240 minute incubation (c). 1 STD NMR experiments – STD NMR spectra were performed at 600 MHz and 279 K. NA-VLP were diluted to contain ~8µM of NA (~8µM of catalytic binding site) in 250µL of HEPES buffer for each experiment. Buffer were exchanged against 2 mM HEPES-D18, 125 mM NaCl, 0.9 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl2, pH8.0 as described above. The protein was saturated onresonance at -1.0 ppm and off-resonance at 300 ppm with a cascade of 60 selective Gaussian-shaped pulses of 50 ms duration. A 100 µs delay between each pulse was applied, resulting in a total saturation time of 3 s. A relaxation delay of 4 s was used. A total of 1024 scans per STD NMR experiment were acquired and a WATERGATE sequence was used to suppress the residual HDO signal. Spin-lock filter with 5 kHz strength and duration of 10 ms was applied to suppress protein background. 3’SL or 6’SL were added to give a molecular protein:ligand ratio of 1:100. On- and off-resonance spectra were stored and processed separately, and the final STD NMR spectra were obtained by subtracting the on- and off-resonance spectra. Control STD NMR experiments were performed with an identical setup but in the absence of protein or ligand. In the competition experiment between oseltamivir carboxylate (3) and 2, the inhibitor (8 µM to 1600 µM) was added before the addition of 2. Saturation transfer double difference (STDD) NMR spectra were obtained by subtraction between STD NMR spectra in the presence of ligands with the STD NMR spectra in the absence of ligands AutoDock Vina calculations – In order to study the possible binding conformations of oseltamivir carboxylate (3) with the secondary sialic acid binding site of several neuraminidases we used AutoDock Vina 1.1.2 [3] Protein and ligands files for input to Vina were prepared using AutoDock Tools 1.5.4. [4] The docking box was a cube of 15 Å each side centred on the secondary sialic acid binding site. For Vina nine docked poses were generated with the exhaustiveness set to 25. Results were visualised using AstexViewer.[5] References NMR-basierender Influenza NA-IVP Aktivitätstest – NA-IVPs wurden für jedes Experiment verdünnt (~8 µM NA in 250 µL deuteriertem HEPES Puffer). Probenpuffer wurde dreimal gegen 2 mM HEPES-D18 pH 8,0, 125 mM NaCl, 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl2 in D2O bei 4 ° durch Zentrifugation bei 13,000 rcf in Amiconfiltern (100 kDa Ausschlussgrenze, Millipore) ausgetauscht. Der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH zwischen pH 5,5 und 8,5 eingestellt. 3´-SL oder 6`-SL wurde zu den IVP Proben in einer Konzentration von 800 µM gegeben und bei 4 °C bzw. 37 °C inkubiert. 1H NMR Spektra wurden bei 298 K und verschiedenen Inkubationszeiten gemessen, aufgenommen mit 32 Scans und einer um 2 Sekunden verzögerten Relaxation über eine spektrale Breite von 6000 Hz. Für das Inhibitionsexperiment wurde Oseltamivir Carboxylat (3, Endkonzentration 8 bis 1600 µM) vor Zugabe von 3´-SL zu den NA-IVPs gegeben. Es wurde bei 37 °C inkubiert und 1H NMR Spektra zu verschiedenen Zeitintervallen aufgenommen. [1] Chong, A. K. J., Pegg, M. S., von Itzstein, M., Influenza virus neuraminidase: effect of calcium on steady-state kinetic parameters, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1077:65-71. [2] Potier, M., Mameli, L., Belisle, M., Dallaire, L., Melançon, S. B., Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl α-D-Nacetylneuraminate) substrate, (1979) Anal. Biochem. 94:287-296 [3] Trott, O., Olson, A. J., AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading, (2010) J. Comput. Chem. 31: 455-461 [4] Sanner, M. F., Python: a programming language for software integration and development, (1999) J. Mol. Graph. Model 17: 57-61 [5] Hartshorn, M. J., AstexViewer: a visualisation aid for structure-based drug design, (2002) J. Comput. Aided Mol. Des. 16: 871-881 Anhang: Allgemein – Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich mit der höchstmöglichen verfügbaren Reinheit erworben, wenn nicht anders vermerkt. Die bekannten Verbindungen a(2,3)Sialyllaktose (2, 3´SL) und Oseltamivir Carboxylat (3) wurden hausintern synthetisiert. Alle NMR Experimente wurden mit dem Bruker Avance 600 MHz Spektrometer durchgeführt, dass mit einer 5-mm TXI-Probe mit dreifachem Achsengradienten ausgestattet ist. Produktion und Aufreinigung von Influenza NA-enthaltenen IVPs – Virusähnliche Partikel mit FLAG-markierten NA von Influenzavirusstämmen A/Cambodia/JP52a/2005 (H5N1), A/Gansu/Chenguan/1129/2007 (saisonale H1N1) oder A/California/04/2009 (pandemischer H1N1) wurden wie zuvor beschrieben produziert und analysiert (Lai et al. 2010). In Kürze, HEK-293T Zellen wurden mit pcDNA-NA(H5), pcDNANA(H1) oder pcDNA-NA(pdm-H1) transfiziert. Kulturmedien wurden gesammelt und gefiltert, gefolgt von Ultrazentrifugation über ein 30 % Sucrose-HEPES Puffer (2 mM HEPES, 125 mM NaCl, 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, pH 7,4) Kissen. Das NAIVP Pellet wurde in HEPES Puffer resuspendiert und bei -80 °C aufbewahrt. Der NA-Gehalt in den IVPs wurde durch Western Blot mit monoklonalem Anti-FLAG Mausantikörper quantifiziert. Die enzymatische Aktivität wurde mit dem NA-Star chemolumineszenten Test (Applied Biosystems) bestimmt. pH Optimum von Influenzavirus Neuraminidase – Um sicher zu gehen, dass die Influenzavirus Neuraminidaseaktivität für die STD NMR Experimente vollständig inhibitiert ist, wurde ein auf Fluoreszenz basierender Aktivitätstest bei verschiedenen pH Werten und 4-Methylumbelifferyl-N-Acetyl-a-D-neuraminide (MUN) als Substrat durchgeführt. In einer 96-well Platte wurde die Aktivität einer rekombinanten Neuraminidase eines pandemischen humanen 2009 Virusstammes nach einer fluoremetrischen Methode von Potier gemessen[1,2]. Neuraminidase wurde in drei verschiedenen Stammlösungen aufgesetzt (A. 50 mM Natriumacetat pH 5,5 und 6 mM CaCl 2, B. 50 mM HEPES pH 7,4 und 6 mM CaCl2, C. 50 mM HEPES pH 8,4 und 6 mM CaCl2). Der Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 10 µL (0,1 mM MUN, 1,83 µg/mL Neuraminidase) wurde auf Eis in schwarze 96-well Platten pipettiert. Alle Messungen wurden in Dreifachansätzen durchgeführt. Um die Reaktion zu starten, wurden alle Komponenten durch Zentrifugation bei bis zu 1,000 rpm für 10 s vereinigt. Sofort danach wurde die Platte bei 37 °C für 20 min unter Schütteln bei 900 rpm inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von 250 µL 0,25 M Glycin (pH 10) abgestoppt wurde. Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer Emission von 460 nm gemessen. Es zeigte sich, dass die Neuraminidase bei pH 8,4 inaktiv ist und eine Restaktivität bei pH 7,4 besitzt. NMR-basierender Influenzavirus Neuraminidase Aktivitätstest – Die pH-Wert Abhängigkeit der Influenzavirus Neuraminidase wurde zusätzlich duch einen auf NMR basierenden Aktivitätstest untersucht. Der Verbrauch vom a(2,3)-Sialyllaktose (2) Substrat nahm beträchtlich mit ansteigendem pH-Wert von pH 5,5 bis 8,4 ab. Dennoch wurde durch die Neuraminidase Aktivität unter den gegebenen NMR Bedingungen a(2,3)-Sialyllaktose (2) nach 60 minütiger Inkubationszeit vollständig in die Produkte ß-Neu5Ac (95%), a-Neu5Ac (5%) und Laktose gespalten (Abbildung S1). Um die Spaltung von a(2,3)-Sialyllaktose (2) zu verhindern und um das aktive Zentrum zu blockieren, gaben wir den hochaffinen Influenzavirus Neuraminidase Inhibitor 3 zum IVP:2Komplex dazu. Abbildung 1c zeigt das 1H NMR Spektrum nach 240-minütiger Inkubationszeit vom (H5)N1 Influenza N1:2:3Komplex für ein molekulares Verhältnis von 1:100:1. Es ist klar ersichtlich, dass die Zugabe von einem Äquivalent (N1:3) die Abspaltung von N-Acetylneuraminsäure von der a(2,3)Sialyllaktose (2) erheblich inhibiert. Nur ein geringes H3eqSignal (3%) vom ß-Neu5Ac erscheint bei 2,10 ppm. Eine neue Probe, die den (H5)N1 Influenza N1:2:3-Komplex in einem molekularen Verhältnis von 1:100:2 enthielt, zeigte nach 240- minütiger Inkubationszeit keine Abspaltung von NAcetylneuraminsäure (1) (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt, dass 2 Äquivalente des Oseltamivir Carboxylats (3) ausreichend sind, um das aktive Zentrum der Influenzavirus Neuraminidase vollständig zu blockieren und damit die Abspaltung von NAcetylneuraminsäure zu verhindern. Abbildung S1. 1H NMR Spektrum von a(2,3)-Sialyllaktose (2) im Komplex mit aviaren N1-IVPs vor (a) und nach 60-minütiger Inkubation (b), und im Beisein von OC (3) nach 240-minütiger Inkubation (c). AutoDock Vina Berechnungen – Um die möglichen Bindungskonformationen von Oseltamivir Carboxylat (3) mit der sekundären Sialinsäure-Bindungsstelle von verschiedenen Neuraminidasen zu studieren, wurde AutoDock Vina 1.1.2[3] verwendet. Protein- und Ligandendateien für Vina wurden durch AutoDock Tools 1.5.4[4]. gewonnen. Für das Docking wurde ein Würfel mit einer Kantenlänge von 15 Å um die sekundäre Sialinsäure-Bindungsstelle zentriert angenommen. Für die Vina Simulation wurden 9 Start-Strukturen genommen und der Erschöpfungsfaktor auf 25 gesetzt. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe vom AstexViewer visualisiert [5]. References [1] Chong, A. K. J., Pegg, M. S., von Itzstein, M., Influenzavirus neuraminidase: effect of calcium on steady-state kinetic parameters, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1077:65-71. [2] Potier, M., Mameli, L., Belisle, M., Dallaire, L., Melançon, S. B., Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl α-D-Nacetylneuraminate) substrate, (1979) Anal. Biochem. 94:287-296 [3] Trott, O., Olson, A. J., AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking 1 Abbildung S1. H NMR Spektrum von a(2,3)-Sialyllaktose (2) im Komplex mit aviaren N1-IVPs vor (a) und nach 60-minütiger Inkubation (b), und im Beisein von OC (3) nach 240-minütiger Inkubation (c). with a new scoring function, efficient and [4] Sanner, M. F., Python: a programming language for software integration and development, (1999) J. Mol. Graph. Model 17: 57-61 [5] Hartshorn, M. J., AstexViewer: a visualisation aid for structure-based drug design, (2002) J. Comput. Aided Mol. Des. 16: 871-881 STD NMR Experimente – STD NMR Spektren wurden bei 600 MHz und 279 K aufgenommen. NA-IVPs wurden für jedes Experiment verdünnt, so dass ~8 µM NA (~8µM katalytische Bindungsstelle) in 250 µL HEPES Puffer vorlagen. Der Puffer wurde wie zuvor beschrieben gegen 2 mM HEPES-D18 pH 8,0, 125 mM NaCl, 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2 in D2O ausgetauscht. Das Protein wurde -1,00 ppm gesättigt (on-resonance) und die off-resonance Frequenz wurde auf 300 ppm gesetzt. Das Protein wurde dann mit einer Kaskade von 60 selektiven Gauss-Pulsen mit einer jeweiligen 50 ms Dauer gefolgt von einer Verzögerung von 100 µs zwischen jedem Puls angeregt, das in eine totale Sättigungszeit von 3 s resultierte. Eine Relaxationsverzögerung von 4 s wurde verwendet. Insgesamt wurden 1024 Scans pro STD NMR Experiment aufgenommen und eine WATERGATE Sequenz wurde benutzt, um restliche HDO-Signale zu unterdrücken. Ein Spin-lock Filter mit einer Stärke von 5 kHz und einer Länge von 10 ms unterdrückte den Proteinhintergrund. 3´SL und 6´-SL wurden so hinzugegeben, dass sich ein molares Verhältnis von Protein zu Ligand von 1 zu 100 ergab. On- und Off-Resonanzspektren wurden gespeichert und separat prozessiert. Das entgültige STD NMR Spektrum wurde durch Subtraktion der On- und Off-Resonanzspektren voneinander gewonnen. STD NMR Experimente zur Kontrolle wurden durchgeführt unter identischen Einstellungen allerdings in Abwesenheit von Protein oder Ligand. Im Konkurrenzexperiment zwischen Oseltamivir Carboxylat (3) und 3´-SL wurde der Inhibitor (8 µM bis 1600 µM) vorgelegt vor der Zugabe von 3´-SL. Sättigungstransfer-Doppeldifferenz (STDD) NMR Spektren wurden durch Subtraktion des STD NMR Spektrums in Gegenwart vom Ligand vom STD NMR Spektrum in Abwesenheit des Liganden gewonnen. optimization, multithreading, (2010) J. Comput. Chem. 31: 455-461