Versuchsprotokoll 1.) Versuch 1a: Chromatographie der

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Versuchsprotokoll 1a- 1c
Photosynthese
Gruppe xx
07.05.2003
Versuchsprotokoll
1.) Versuch 1a: Chromatographie der Plastidenfarbstoffe
1.1. Einleitung:
Die Chromatographie ist ein Analyseverfahren zur Auftrennung von Stoffgemischen. Die
Chromatographie hat sich im Laufe der Jahre soweit entwickelt, dass verschiedene Chromatographien
entstanden sind. So gibt es die Dünnschichtchromatographie (weiterhin nur noch als DC bezeichnet),
Papierchromatographie (PC), sowie die in modernen Labors meist angewandte HochdruckFlüssigkeits-Chromatographie (HPLC). Die beiden erstgenannten sollen uns für den weiteren
Versuchsablauf interessieren.
Die Prinzipien dieser beiden Chromatographiemethoden liegen bei der Adsorption und der Verteilung
der zu trennenden Stoffe (hier: Farbpigmente). Bei diesen Phänomenen spielt die Polarität der
Farbpigmente eine große Rolle.
Die Farbpigmente, die zur Sammlung des weißen Lichtes genutzt werden und die Energie an das
Reaktionszentrum der Lichtreaktion der Photosynthese abgeben, sind für die Photosynthese
unerlässlich. Als Photosynthese bezeichnet man „die Umwandlung von Lichtenergie in chemische
Energie, die in Glucose oder anderen organischen Verbindungen gespeichert wird“ (Campbell,
Biologie, Spektrum Verlag, 1997, Seite 1343, Stichwort „Photosynthese“).
1.2. Material und Methode:
Für den Versuch verwenden wir die Blätter der Bohne. Die Blätter werden mit Seesand, Aceton,
Kalciumcarbonat vermischt und im Mörtel zerrieben, die breiartige Substanz gefiltert und dann die
Chromatographien wie im Skript beschrieben durchgeführt.
1.3. Versuchsergebnisse:
Nach einer halben Stunde wird die Papierchromatographie beendet. Ausgehend von dem
Auftragepunkt in der Mitte des Papiers sind nacheinander folgende Farbringe zu erkennen. Zwei
grünliche Bereiche nahe am Mittelpunkt. Darauf folgend eine gelbe Bande und am äußersten Rand
(Fließmittelfront) noch eine gelbe Bande, die jedoch sehr schwach ist.
Bei der Dünnschichtchromatographie, die ebenfalls 30 Minuten gelaufen ist, sind von den drei
nebeneinander aufgetragenen Punkten nach oben hin 6 Banden zu erkennen.
Auf den Startpunkt folgend sind dies zuerst eine leicht gelbe Bande, die zweite eine schwach gelbe
Bande und danach eine hellgelbe Bande. Darauf folgen ein dunkles bräunliches grün und ein saftiges
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dunkelgrün. Als letztes und mit einem deutlichen Absatz von ca. 3 cm befindet sich zuletzt eine leicht
gelbe Bande.
Hält man nun die beiden Chromatographien unter eine UV-Lampe so fluoreszieren die grünen
Bereiche rot.
1.4. Auswertung:
Nach der Betrachtung der Chromatographien lassen sich anhand von Literatur folgende Pigmente bei
unseren Chromatographien feststellen.
Dünnschichtchromatographie:
Vom Startpunkt ausgehend findet man folgende Stoffe in den unterschiedlichen Banden:
Neoxanthin, Violaxanthin, Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a und β Carotin.
Diese Aufteilung lässt sich durch das Prinzip einer Verteilungschromatographie (NERNSTscher
Verteilungssatz) erklären.
Die Stoffe verteilen sich je nach ihrer Löslichkeit auf die polare Flüssige stationäre Phase
und die unpolare mobile Phase (lipophil).
Diese Phasen lassen sich kaum miteinander mischen. Die Stoffe, die sich in der Stationären Phase
gelöst haben bewegen sich so gut wie gar nicht (allenfalls sehr langsam) fort. Stoffe die in der mobilen
Phase gelöst sind wandern wesentlich weiter und schneller.
Die Trägerschicht ist demnach am eigentlichen Trennungsvorgang nicht beteiligt. Sie dient hier nur
dazu, die stationäre flüssige Phase aufzunehmen und der Diffusion entgegenzuwirken.
Papierchromatographie:
Vom Startpunkt ausgehend findet man folgende Stoffe in den unterschiedlichen Banden:
Chlorophyll b, Chlorophyll a, Violaxanthin, Lutein, Phaeophytin a und β Carotin.
Diese Aufteilung ist folgendermaßen zu erklären: Stoffe (z.B.: Chlorophyll a, b, die einen
hydrophoben Schwanz und ein hydrophiles Köpfchen besitzen), die in der polaren stationären Phase
löslich sind, wandern langsamer als eher unpolare Stoffe, die im unpolaren Laufmittel (also der
mobilen Phase) löslich sind. Daher wandert z.B. β Carotin wesentlich rascher als z.B. die Chlorophylle.
Carotinoide bestehen aus konjugierten Isopren Untereinheiten, die unpolar sind. Daher haben
Carotinoide auch die Eigenschaften von Lipiden.
Xanthophylle (z.B. Violaxanthin) sind Derivate der Carotinoide die zusätzliche OH-Gruppen besitzen.
Daher sind diese Stoffe etwas polarer als die Carotinoide und wandern daher langsamer.
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Bei der Betrachtung unter der UV-Lampe leuchtet Chlorophyll a dunkelrot, Chlorophyll b hellrot
(und Phaeophytin b rot).
Das Phaeophytin befindet sich höchst wahrscheinlich unter dem Chlorophyll und ist somit kaum
sichtbar. In Abhängigkeit von der Konzentration könnte kein Unterschied in der Fluoreszenzintensität
festgestellt werden.
1.6. Zusammenfassung
Die Blätter der Pflanzen besitzen nicht ausschließlich Chlorophyll, sondern auch noch weitere
Farbpigmente, die sich in ihren chemischen Eigenschaften unterscheiden. Sie sind für die
Photosynthese sehr wichtig.
2.) Versuch 1b: Absorption von Chloroplastenpigmenten
2.1. Einleitung:
Absorption im Bezug auf die Photosynthese bezieht sich auf die Aufnahme der Energie des weißen
(sichtbaren) Lichtes. Jedes Pigment kann Licht einer bestimmten Wellenlänge am besten absorbieren.
Das Chlorophyll nimmt eine ganz besondere Stellung bei der Photosynthese ein. Es ist das Pigment,
das das so genannte Reaktionszentrum bildet. Erst durch das Chlorophyll kann die Energie auf NADP
übertragen werden.
Auch die Carotinoide sind wichtige Bestandteile des Blattes. Sie dienen zwar auch als
Lichtsammelpigment und füllen die sog. Grünlücke etwas aus, jedoch kommt ihnen noch eine weitere
wichtige Funktion zu. Die Carotionoide dienen als Quencher und machen so Singulettsauerstoff sowie
Sauerstoffradikale funktionslos. Sie schützen also den photochemischen Apparat vor photooxidativer
Zerstörung. Die Absorptionseigenschaften der Carotinoide sowie einer Rohchlorophyllösung sollen
anhand dieses Versuches untersucht werden.
2.2. Material und Methode:
Die Herstellung der Pigmentlösungen und die Vorgehensweise bei der Absorptionsmessung sind im
Skript ausführlich beschrieben.
2.3. Versuchsergebnisse:
Die Versuchsergebnisse sind auf dem beiliegenden Zettel durch das Spektralphotometer festgehalten
worden. In der Auswertung wird auf die dort abgebildeten Graphiken sowie Tabellen Bezug
genommen.
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2.4. Auswertung:
Rohchlorophylllösung:
Bei 428,5 nm und 661 nm weist die Absorptionskurve zwei Maxima auf. Diese Maxima werden
hauptsächlich durch das Chlorophyll a hervorgerufen. Die Schultern bei 450,5 nm und 650nm beruhen
auf der Absorption des Chlorophyll b, die ja vom Chlorophyll a überlagert ist. Zwischen 500 nm und
600nm befindet sich die sog. Grünlücke. Der Unterschied zu den Lehrbuchabbildungen lieg hier in der
Überlagerung der beiden Spektren. Es gibt hier also kein reines Chlorophyll a oder b Spektrum
sondern eine Mischform aus beiden.
Carotinoide:
Bei 451 nm und 478 nm liegen die Maxima der Kurve. Außerdem ist bei 669,5 nm noch eine kleine
Schwankung zu erkennen. Sie beruht auf einer Verunreinigung der Lösung mit Chlorophyll.
3.) Versuch 1 c: Eigenschaften des Chlorophylls
3.1. Einleitung:
Das sichtbare Licht, auch weißes Licht genannt, setzt sich aus verschiedenen
Farben (Spektralfarben) zusammen. Wird das Licht durch ein Prisma geschickt, so werden die
einzelnen Farben sichtbar.
Wird das Licht dagegen vorher durch eine Lösung geschickt, die Strahlung einer bestimmten
Wellenlänge absorbiert, so ist diese Farbe nicht mehr sichtbar.
In diesem Versuch sollen die Eigenschaften des Chlorophylls durch verschiedene Versuche aufgezeigt
werden.
3.2. Material und Methode:
Zur Durchführung der Versuche benötigt man wieder eine Rohchlorophylllösung. Die weiteren
Vorgehensweisen sind im Skript näher beschrieben.
3.3. Versuchsergebnisse:
Wenn das Licht von einem Diaprojektor (Lichtquelle) durch die Rohchlorophylllösung fällt und dann
über das Prisma in die einzelnen Spektralfarben aufgespaltet wird, ist zu erkennen, dass bei den
Spektralfarben die Farben rot und blau fehlen. Es ist nur noch ein kleiner roter und ein grüner Streifen
zu erkennen.
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Hält man ein quaderförmiges Gefäß mit Chlorophylllösung in weißes Licht und betrachtet die Lösung
so, dass man durch die dünne Seite (also eine dünne Schicht der Lösung) hindurchschaut, dann kann
man feststellen, dass die Lösung grün ist. Durchschaut man aber die Lösung in der langen Richtung
(dicke Chlorophyllschicht) so scheint die Lösung rot.
Gibt man zu der Chlorophylllösung destilliertes Wasser hinzu und betrachtet die Lösung
währenddessen unter einer UV-Lampe dann verschwindet die Fluoreszenz. Außerdem ist die Lösung
trüb geworden. Auch die Temperatur der Lösung hat sich spürbar erhöht. Gibt man jedoch Methanol
hinzu, bleibt die Lösung klar und auch die Fluoreszenz bleibt erhalten. Es ist keine Wärmeentwicklung
festzustellen.
Beim nächsten Teilversuch werden vier Reagenzgläser mit Rohchlorophylllösung befüllt. Eines dient
als Vergleichsprobe. Nach Zugabe von 12 % iger HCl Lösung verändert sich die Farbe von grün zu
oliv-gelb bis braun.
In zwei Reagenzgläser wird nun zur Neutralisation NaOH gegeben. Die Farbe der Lösungen verändert
sich jedoch nicht.
In eines der beiden Reagenzgläser gibt man nun Fehling-I-Reagenz hinzu. Die Farbe verändert sich
von dem beschriebenen oliv-gelb zu einem grünlichen Ton, der sich aber von der ersten
Vergleichsprobe unterscheidet.
Beim letzten Teilversuch werden nun die chlorophyllhaltigen Pflanzenteile einer säurehaltigen Pflanze
(Sauerklee) in kochendes Wasser gegeben. Die Blätter färben sich sofort braun.
3.4. Auswertung:
Wenn das Licht durch eine farbige Chlorophylllösung fällt, werden bestimmte Wellenbereiche
absorbiert und damit aus dem projezierten Spektrum gelöscht. Aufgrund der oben erwähnten
Absorptionsmaxima der Chlorophylle werden die hellrote und die blaue Strahlung sehr stark, die
grüne jedoch gar nicht absorbiert.
Wenn man jetzt die Chlorophyllkonzentration durch Änderung der dicke der Lösung variiert ändert
sich auch das beobachtete Spektrum. Wenn die Chlorophyllschicht dicker wird, wird auch immer
mehr grüne Strahlung absorbiert (im Spektrum ist im Bereich der „Grünlücke“ die Absorption ja nicht
ganz null). Demnach ist jetzt nur noch der dunkelrote Anteil zu beobachten (über 700 nm und
normalerweise von der Intensität der grünen Strahlung überdeckt und daher nicht sichtbar).
Gibt man zu der fluoreszierenden Rohchlorophylllösung Wasser, dann wird die Fluoreszenz
ausgelöscht. Das Chlorophyll geht aus der echten Lösung in die kolloidale Verteilungsform über.
Da die Chlorophyllmoleküle ja einen hydrophilen Kopf und einen hydrophoben Schwanz haben,
können sie sich in wässriger Lösung zu so genannten Micellen zusammenlagern, wobei der hydrophile
Anteil nach außen zeigt (Hydrathülle).
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Durch diese Aggregatbildung und die damit einhergehende enge Zusammenlagerung der Moleküle
wird die Energieübertragung auf die Nachbarmoleküle wesentlich vereinfacht.
Dadurch wird die Abgabe der Energie in Form von Wärme ebenfalls vereinfacht und die Fluoreszenz
erlischt.
Durch die vielen in der Lösung vorhandenen Chlorophyllaggregate wird das einfallende Licht auch
stärker gebrochen und die Lösung erscheint trüb.
Bei Zugabe von Methanol kommt es zu keiner Löschung der Fluoreszenz, da sich hier keine Micellen
bilden können, bzw. können sich die Moleküle nicht so nah zusammenlagern.
Bei Zugabe von HCl die Magnesiumatome, die sich als Zentralatom im Porphyrinring des
Chlorophylls befinden, herausgelöst und durch zwei Wasserstoffatome ersetzt. Dadurch verliert das
„Chlorophyll“ seine typischen Absorptionseigenschaften und die Lösung wird oliv-gelb bis braun. Es
hat sich Phaeophytin gebildet. Die NaOH-Lösung dient zur Neutralisation der Säure.
Gibt man nun Fehling-I-Lösung hinzu, welche Kupfer besitzt, werden die Wasserstoffatome durch
Kupfer ersetzt. Somit entsteht Kupferchlorophyllin, das auch eine grüne Färbung aufweist.
Durch das Kochen werden die chlorophyllhaltigen Zellen zerstört und der saure Vakuoleninhalt
vermischt sich mit dem Cytoplasma. Durch die Säure kommt es wie oben beschrieben wieder zu einer
Phaeophytinbildung und die Blätter braun.
4. Literatur:
CAMPELL, Biologie, 5. Auflage, 1997, Spektrum Verlag, Stichwort „Photosynthese“
RICHTER, Biochemie der Pflanzen, 1996, Thieme Verlag
BUSCHMANN + KRUMMBACH, Physiologie der Photosynthese, 1985, Springer Verlag
LICHTENTHALER + PFISTER, Praktikum der Photosynthese, 1978, Quelle & Meyer
HELDT, Pflanzenbiochemie, 2003, Spektrum Verlag
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