mikrobiologie

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mikrobiologie

Institut für Mikrobiologie
ETH Zürich
PRAKTIKUM IN
MIKROBIOLOGIE
Ausgabe FS2013
Dr. Markus Künzler und Prof. Dr. Peter Lüthy
Assistentinnen und Assistenten des Instituts für Mikrobiologie
INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
1. GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN.................................... 3
Versuch 1: Herstellung eines flüssigen Nährmediums ................................................................. 6
Versuch 2: Herstellung von Agarplatten ..................................................................................... 7
Versuch 3: Aerobe und anaerobe Kultivierung von Bakterien in Schrägagarröhrchen ................ 7
Versuch 4: Isolierung von Einzelkolonien zur Herstellung von Reinkulturen ............................... 9
2. MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT ............................................................................ 11
2.1. MIKROORGANISMEN AUF OBERFLÄCHEN ................................................................................. 11
Versuch 1: Abklatsch mit Rodac-Schalen ................................................................................. 11
2.2. MIKROORGANISMEN IN BIOFILMEN ......................................................................................... 11
Versuch 2: Isolierung von Kariesbakterien aus der eigenen Mundschleimhaut .......................... 12
2.3. MIKROORGANISMEN IN DER LUFT ........................................................................................... 13
Versuch 3: Luftanalyse mit spontaner Keimsedimentation ........................................................ 13
3. MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER.................................. 14
Versuch 1: Bestimmung des Bakteriengehaltes in Rohwasser aus einer Kläranlage .................. 15
Versuch 2: Nachweis der Wirkung des Filters mit der Porengrösse 0,45 m ............................. 15
Versuch 3: Bestimmung des Phagentiters (Coli-Phagen) im 0,45 m Filtrat ............................. 15
4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE...................................................................................... 17
4.1. EINFÜHRUNG .......................................................................................................................... 17
4.2. KEIMZAHLBESTIMMUNG IN WASSER UND MILCH ..................................................................... 18
Versuch 1: Bestimmung aerober, mesophiler Keime in Wasser ................................................. 19
Versuch 2: Bestimmung des Keimgehaltes von Milch................................................................ 19
Versuch 3: Der Nachweis von Escherichia coli ........................................................................ 20
4.3. MIKROBIELLE KONSERVIERUNG VON LEBENSMITTELN ............................................................ 20
Versuch 4: Herstellung von Joghurt ......................................................................................... 20
Versuch 5: Herstellung von Weinessig ..................................................................................... 22
5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK .................................................................................... 25
5.1. MORPHOLOGISCHE KRITERIEN ................................................................................................ 25
5.2. EINFÜHRUNG IN DIE DIAGNOSTIK ............................................................................................ 31
Versuch 1: Makroskopische Beurteilung .................................................................................. 32
Versuch 2: Mikroskopische Beurteilung ................................................................................... 32
Versuch 3: Gramfärbung und Wachstum auf MacConkey Agar................................................. 32
Versuch 4: Der Oxidasetest...................................................................................................... 34
Versuch 5: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-positiven Bakterien ......................... 34
Versuch 6: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-negativen Bakterien ........................ 34
6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE ..................................................................................... 38
6.1. ANTIBIOTIKA UND CHEMOTHERAPEUTIKA ............................................................................... 38
Versuch 1: Pilze als Antibiotika-Produzenten ........................................................................... 41
Versuch 2: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von zwei Antibiotika ..................... 42
Versuch 3: Unterschiedliche Empfindlichkeit von gram-positiven und gram-negativen Bakterien
sowie Bäckerhefe gegenüber einer Auswahl von Antibiotika ...................................................... 44
Versuch 4: Sulfonamid-Versuch ............................................................................................... 45
6.2. ANTIMIKROBIELLE PFLANZENINHALTSSTOFFE UND BAKTERIELLE BOTENSTOFFE ...................... 48
Versuch 5: Antimikrobielle Wirkung von Senf und Knoblauch .................................................. 48
Versuch 6: Quorum Sensing von Bakterien............................................................................... 49
6.3. ANTIMIKROBIELLE ENZYME .................................................................................................... 50
Versuch 7: Nachweis von Lysozym-Aktivität ............................................................................. 51
7. MIKROBIELLE GENETIK ...................................................................................................... 53
Versuch 1: Kreuzung von Bäckerhefe ....................................................................................... 55
Versuch 2: Konjugation von Escherichia coli ........................................................................... 57
INHALTSVERZEICHNIS
2
Versuch 3: Transformation von Bacillus subtilis mit Plasmid-DNA........................................... 59
Versuch 4: Generalisierte Transduktion ................................................................................... 61
8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN ............................................................................... 65
Versuch 1: Nachweis von anti-Legionella pneumophila Antikörpern......................................... 66
9. DIE PHYLLOSPHÄRE ALS MIKROBIELLER LEBENSRAUM .......................................... 70
Versuch 1: Herstellung von Blattabdrücken ............................................................................. 72
10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: SCHÄDLINGSBEKÄMPFUNG MIT BACILLUS
THURINGIENSIS ........................................................................................................................... 75
10.1. GRUNDLAGEN ...................................................................................................................... 75
10.2 EXPERIMENTE ZU BACILLUS THURINGIENSIS ............................................................................. 78
Versuch 1: Quantitative Bestimmung der insektentoxischen Aktivität von Bacillus thuringiensis
israelensis gegenüber Stechmückenlarven................................................................................. 78
Versuch 2: Prüfung der spezifischen insektentoxischen Aktivität von zwei verschiedenen
Subspecies von Bacillus thuringiensis ....................................................................................... 82
11. MYKOLOGIE .......................................................................................................................... 84
11.1. EINFÜHRUNG UND UEBERSICHT ............................................................................................. 84
11.2. MORPHOLOGIE ..................................................................................................................... 84
Versuch 1: Bestimmung der Zellzahl einer Hefekolonie ............................................................ 88
Versuch 2: Mikroskopie pilzlicher Erscheinungsformen............................................................ 90
Versuch 3: Verbreitung durch Sporen ...................................................................................... 93
11.3. PHYSIOLOGIE........................................................................................................................ 94
Versuch 4: Bestimmung von minimalen, optimalen, und maximalen Wachstumstemperaturen ... 94
Versuch 5: Phototropismus und Lichtregulation der Sporenbildung .......................................... 95
Versuch 6: Nachweis der amylolytischen und proteolytischen Aktivität ..................................... 97
12. ANHANG .................................................................................................................................. 99
Empfohlenene Literatur
"Allgemeine Mikrobiologie" von Georg Fuchs und Hans G. Schlegel, Thieme Verlag, 8. Auflage 2007
"Taschenlehrbuch Biologie: Mikrobiologie" von Katharina Munk, Thieme Verlag, 2008
Empfohlenene Websites
http://tolweb.org/fungi
http://tolweb.org/archaea
http://tolweb.org/eubacteria
1.GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN
3
1. GRUNDLAGEN FÜR DAS ARBEITEN MIT MIKROORGANISMEN
Einführung
Herstellung von Verdünnungsreihen
Die Herstellung von Verdünnungsreihen ist zwar keine klassisch mikrobiologische Technik, kommt
aber während des Praktikums häufig vor und bereitet erfahrungsgemäss immer wieder Probleme.
Deshalb wird die Technik an dieser Stelle anhand eines Beispiels kurz erklärt:
Um aus einer Probe einer bestimmten Konzentration (hier: 1) eine Reihe von 10fach Verdünnungen
herzustellen, werden Probenröhrchen mit je 9 Volumeneinheiten (VE; hier: ml) Verdünnungsmittel
(z.B. Wasser) vorbereitet und beschriftet. Anschliessend wird 1 VE der zu verdünnenden Probe ins
erste Röhrchen pipettiert und die Flüssigkeiten durch Auf- und Abpipettieren und Vortexen gemischt.
Mit derselben oder einer neuen Pipettenspitze wird dann 1 VE der entstandenen 10fach-Verdünnung
ins zweite Röhrchen pipettiert und die so entstandene 100fach-Verdünnung ebenfalls gemischt. Für die
weiteren Verdünnungen wird analog verfahren. Am Ende der Verdünnungsreihe enthält das letzte
Röhrchen 10 VE der grössten Verdünnung, von den anderen Verdünnungen liegen nur 9 VE vor. Dies
hat aber keinen Einfluss auf die Verdünnungen bzw. die Konzentrationen der Probe in den einzelnen
Röhrchen.
Nährmedien und Züchtungsbedingungen
Die Zusammensetzung von Nährmedien muss den Nährstoffansprüchen der Mikroorganismen, die
unter Laborbedingungen zur Vermehrung gebracht werden sollen, angepasst sein. Viele Bakterien sind
anspruchslos und gedeihen in Nährmedien einfacher Zusammensetzung, während andere auf das
Vorhandensein von Spurenelementen oder Vitaminen angewiesen sind. Der Handel bietet viele
4
Standardmedien an für Mikroorganismen, die in der Medizin, in der Lebensmittelindustrie oder in
Forschungslabors routinemässig gezüchtet oder identifiziert werden müssen.
Die Züchtung erfolgt entweder auf festen oder in flüssigen Nährmedien. Für die Herstellung von festen
Medien werden der wässrigen Nährlösung 1.5 - 2 % Agar zugesetzt. Agar ist ein Polysaccharid, das aus
Meeralgen gewonnnen wird und dem Nährmedium gelartige Konsistenz verleiht. Agar schmilzt bei
100°C und festigt sich erst unterhalb einer Temperatur von 45°C. Agar selbst dient, von ganz wenigen
Ausnahmen abgesehen, den Mikroorganismen nicht als Nährstoffquelle.
Die gebräuchlichen Zuchtgefässe für Agarkulturen sind Petrischalen oder Reagenzgläser mit einer
schrägen Agarschicht. Bakterien in flüssigen Kulturen werden in Reagenzgläsern oder
Erlenmeyerkolben gezüchtet. Grössere Kulturgefässe wie Fermenter oder Bioreaktoren dienen zur
Produktion von grossen Mengen an Mikroorganismen oder deren Metaboliten.
Der Sauerstoff ist bei der Züchtung von Bakterien von grosser Bedeutung. Aerobe Bakterien benötigen
O2, während die Anaerobier nur unter Ausschluss von Sauerstoff gezüchtet werden können. Anaerobe
Bedingungen werden erreicht, indem der Sauerstoff im luftdicht abgeschlossenen Zuchtgefäss durch
ein Sauerstoffadsorptionsmittel (z.b. alkalisches Pyrogallol) gebunden wird oder die Züchtung in
Kammern oder Gefässen mit einem definierten Gasgemisch mit Stickstoff als Hauptbestandteil erfolgt.
Die Züchtungs- und Inkubationstemperatur liegt in der Regel zwischen 20°C und 37°C.
Sterilisation
Damit beim Experimentieren mit Bakterien oder Pilzen reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden,
muss mit Reinkulturen gearbeitet werden. Das Arbeiten mit Reinkulturen wiederum setzt keimfreie
Kulturgefässe, Nährlösungen und Arbeitsgeräte voraus. Im Folgenden sind daher verschiedene
Sterilisationsmethoden beschrieben.
Sterilisation durch trockene Hitze
Direktes Ausglühen: Diese Sterilisationsmethode eignet sich für Metall. Es ist eine schnelle Methode,
die vor allem bei der Entkeimung der Impfösen Anwendung findet. Das Ausglühen erfolgt durch
schräges Halten der Impföse in der Oxidationsflamme des Bunsenbrenners bis diese glüht. Bei
Impfnadeln und Impfösen ist auch der metallene Teil des Halters zu erhitzen. Dabei ist es wichtig, die
Impföse vor dem Kontakt mit Mikroorganismen abkühlen zu lassen. Die Entkeimung dieser Geräte soll
nicht nur vor, sondern auch unmittelbar nach der Verwendung durchgeführt werden, um eine unnötige
Kontamination der Umgebung zu vermeiden.
Abflammen: Das Abflammen dient vor allem der Aussensterilisation von Glas- und Metallgefässen,
um deren Ränder zu sterilisieren. Gleichzeitig verhindert die beim Erhitzen entstehende, nach oben
gerichtete Warmluftströmung das Eindringen von Keimen.
Heissluftsterilisation bei 160°C während 2 Stunden im Trockenschrank: Geeignet für leere
Glasgefässe, Pipetten und chirurgische Instrumente.
5
Sterilisation durch feuchte Hitze
Feuchte Hitze (gesättigter Wasserdampf) ist wesentlich wirksamer als trockene Hitze. Thermostabile
Flüssigkeiten (z.B. viele Nährmedien) werden auf diese Weise entkeimt.
Drucksterilisation: Im so genannten Autoklaven wird die Sterilisation durch Anwendung von
Wasserdampf bei einer Temperatur von 121°C durchgeführt. Der Druck, der benötigt wird um diese
Temperatur zu erreichen, beträgt 2 bar. Um eine reine Dampfphase zu erzielen, muss die Luft durch
Ausströmenlassen von Dampf aus dem Autoklaven verdrängt werden. Die eigentliche Sterilisation
erfolgt darauf während 20 Minuten bei 121°C.
Sterilisation durch Filtration
Flüssigkeiten, die hitzeempfindliche Substanzen enthalten, entkeimt man durch Sterilfiltration. Filter,
die Bakterien zurückhalten sollen, dürfen eine maximale Porengrösse von 0,45 m aufweisen. Sterile
Einwegfilter sind in Porengrössen von 0,2 bis 5m erhältlich. Filter mit kleiner Porengrösse verringern
die Durchflussgeschwindigkeit. Diese lässt sich durch Druck oder Vakuum erhöhen.
Sterilisation durch Gas
Hitzeempfindliche Materialien aus Kunststoff (Petrischalen, Spritzen, Filter) und Einwegmaterial aus
Glas (Pipetten) werden vor dem Einschweissen in Plastikhüllen mit Ethylenoxid sterilisiert.
Sterilisation durch Bestrahlung
Nachdem die Verwendung von ionisierenden Strahlen, insbesondere bei der Entkeimung von
Lebensmitteln an Bedeutung verloren hat, ist diese Methode im Zusammenhang mit dem
Bioterrorismus wieder aktuell geworden. Zurzeit werden Postsendungen, die an offizielle Stellen in den
USA gerichtet sind, bestrahlt, um pathogene Keime wie Bacillus anthracis, den Erreger des
Milzbrands, abzutöten.
Impftechnik
Beim Beimpfen von flüssigen oder festen Nährmedien mit Bakterien ist darauf zu achten, dass keine
Verunreinigungen oder Fremdkeime mit übertragen werden. Die Einführung in die gebräuchlichsten
Impftechniken ist Bestandteil der ersten nun folgenden Versuche.
6
Folgende Bakterien werden bei den Versuchen 2 - 4 verwendet:
Escherichia coli ist ein Gram-negatives, peritrich begeisseltes Stäbchen. Es ist ein natürlicher
Darmbewohner. E. coli überlebt aber auch eine Zeitlang ausserhalb des Darmes und lässt sich leicht
nachweisen. Es spielt daher für die Überwachung der Wasserqualität eine besondere Rolle. Das
Vorhandensein von E. coli in Wasserproben deutet auf fäkale Verunreinigungen hin. Die Coli-Zahl gibt
an, wie viele vermehrungsfähige Zellen von E. coli in einem Milliliter Probewasser enthalten sind.
Nach der Lebensmittelverordnung dürfen in 100 ml unbehandeltem Trinkwasser keine Colibakterien
und keine Coliformen nachweisbar sein. Bei der Ermittlung der Coli-Zahl werden besondere IndikatorNährböden (z.B. MacConkey-Agar oder TBX-Agar, siehe Anhang) verwendet, auf denen E. coli und
andere coliforme Keime eine charakteristische Färbung der Kolonien zeigen, so dass eine erste
Differenzierung möglich ist. Spezielle Laborstämme von E. coli bilden die Basis für genetische
Forschungsarbeiten.
Enterococcus faecalis. Kleine Kokken, die während der logarithmischen Wachstumsphase typische
Ketten bilden. Sie sind ubiquitär und kommen zum Beispiel in Milchprodukten und anderen
organischen Substanzen vor, die sich leicht abbauen lassen.
Pseudomonas fluorescens gehört zu den im Boden weit verbreiteten Bakterien der Gattung
Pseudomonas. Es handelt sich um bewegliche kurze Stäbchen, die Gram-negativ sind.
Clostridium butyricum ist ein gram-positives, sporenbildendes Stäbchen. Das Bakterium ist dank
seiner peritrichen Begeisselung beweglich. C. butyricum ist in der Natur sehr weit verbreitet. Zu seinen
Stoffwechselprodukten gehört unter anderem die Buttersäure, die der gewachsenen Kultur den
markanten abstossenden Geruch verleiht.
Serratia marcescens ist ein gram-negatives, bewegliches Stäbchen. Auffallend ist die Bildung des
tiefroten Pigments, des Prodigiosin. Das Pigment enthält als Grundgerüst drei Pyrrolringe. Früher
wurde S. marcescens auch als Hostienpilz bezeichnet, da der Organismus sich als rot gefärbte Kultur
bei genügender Feuchtigkeit auf Brot entwickeln kann.
Versuch 1: Herstellung eines flüssigen Nährmediums
Wie bereits erwähnt, setzt das Züchten von Mikroorganismen sterile flüssige oder feste Kulturmedien
voraus. Die folgenden Arbeitsschritte gehören deshalb in einem Mikrobiologie-Labor zur alltäglichen
Routine. In einem ersten Versuch sollen pro Assistentengruppe 400 ml flüssiges Luria Bertani Glucose
(LBG) Nährmedium für Versuch 6.2 hergestellt werden.
Vorgehen:
Die entsprechenden Mengen der einzelnen Bestandteile des Mediums (siehe Anhang – Agar für
flüssiges Medium weglassen!) werden auf der Waage eingewogen (wegen Staubentwicklung nicht
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Schütten, sondern Löffel benutzen!), in einen Messzylinder mit vorgelegten 100 ml deionisiertem
Wasser transferiert, mit deionisiertem Wasser auf 400 ml aufgegossen und mit Hilfe eines Rührfisches
gelöst. Das gelöste Kulturmedium wird in eine Schottflasche gegossen und verschlossen. Die Flasche
wird mit Autoklavierband versehen, mit dem Gruppennamen, der Labornummer und dem Datum
beschriftet und in den Autoklavenraum gestellt.
Versuch 2: Herstellung von Agarplatten
Agarhaltige Nährmedien werden zur Oberflächenkultivierung von Mikroorganismen benutzt. Pro 2erGruppe sollen in diesem Versuch je 2 LBG- und Malzagarplatten gegossen werden, die in Versuch 2.3
Verwendung finden werden.
Vorgehen:
Die agarhaltigen Nährmedien wurden aus Zeitgründen bereits vorbereitet und sind während 20 min bei
121°C autoklaviert worden. Sie befinden sich im Wasserbad bei 60°C, um das Festwerden des Agars
zu verhindern. Das autoklavierte Medium wird nun wie folgt in sterile Petrischalen aus Plastik
gegossen:
- Flasche mit flüssigem Nährmedium kurz schwenken
- Die Nährmedienflasche öffnen und die Öffnung kurz durch die Flamme ziehen.
- Den Deckel der Petrischale öffnen und soviel Medium (ca. 25 ml) hineingiessen, bis der Boden einige
mm bedeckt ist.
- Die Petrischale unverzüglich wieder zudecken und die Nährmedienflasche verschliessen und ins
Wasserbad zurückstellen.
- Die Platten stehenlassen bis der Agar fest wird.
Danach die Platten mit Deckel nach unten lagern und auf der Unterseite beschriften.
Versuch 3: Aerobe und anaerobe Kultivierung von Bakterien in Schrägagarröhrchen
Neben Petrischalen können auch Schrägagarröhrchen für die Oberflächenkultivierung von
Mikroorganismen verwendet werden. Diese habe den Vorteil, dass sie auf einfache Art und Weise
anaerob gemacht werden können, um das Wachstum von Mikroorganismen unter Ausschluss von
Sauerstoff zu prüfen. In diesem Versuch sollen die oben erwähnten Bakterien auf Wachstum unter
aeroben und anaeroben Bedingungen geprüft werden.
Material:
Bakterienkulturen auf Platten
4 LBG-Schrägagarröhrchen pro 2er-Gruppe
2 Gummistopfen
Soda- und Pyrogallol-Lösung
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Vorgehen:
Mit einer ausgeglühten und anschliessend abgekühlten Impföse wird aus einer Stammkultur wenig
Bakterienmaterial entnommen. Das sterile Schrägagar-Röhrchen wird beimpft, indem die
Agaroberfläche von unten her mit der Impföse bestrichen wird. Je zwei Schrägagarröhrchen (LBGAgar) werden auf diese Weise pro 2er-Gruppe mit C. butyricum und einem der anderen Bakterien
(notieren welches!) beimpft (total 4 Röhrchen).
Je ein beimpftes Schrägagar-Röhrchen wird ohne weitere Manipulation (aerob) inkubiert. Dem anderen
Schrägagar-Röhrchen wird folgendermassen der Luftsauerstoff entzogen: Der Wattestopfen wird über
dem Reagenzglas abgeschnitten und bis auf die Höhe des Agars ins Reagenzglas hineingestossen.
Darüber kommt eine etwa 2 cm hohe Schicht fettfreier Watte, die mit 4 bis 5 Tropfen Sodalösung
(Na2CO3 gesättigt in H2O) und 4 bis 5 Tropfen Pyrogallol (20 % in H2O) getränkt wird. Das
Reagenzglas wird mit einem Gummizapfen luftdicht abgeschlossen auf den Kopf gestellt und inkubiert.
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Auswertung:
Beurteile das Wachstum der Bakterien unter aeroben und anaeroben Bedingungen (+ Wachstum; - kein
Wachstum) und entscheide auf dieser Basis, ob es sich bei den oben erwähnten Bakterien um obligat
anaerobe, obligat aerobe oder fakultativ anaerobe (können unter beiden Bedingungen wachsen)
Organismen handelt:
Bakterium
mit O2
ohne O2
Typ
Clostridium butyricum
Escherichia coli
Enterococcus faecalis
Pseudomonas fluorescens
Serratia marcescens
Bemerkung:
Die Züchtung im Anaerobtopf ist eine alternative Methode, mit der Oberflächenkulturen unter
sauerstofffreien Bedingungen kultiviert werden können, sofern ein sauerstofffreies Gasgemisch zur
Verfügung steht. Der anaerob wachsende Mikroorganismus wird auf Agarmedium in Petrischalen
ausgestrichen. Die Schalen werden in einen luftdicht schliessenden Topf mit einem Ventil für die
Begasung gelegt. Die atmosphärische Luft wird durch dreimalige Spülung mit Stickstoff ersetzt. Man
lässt im Topf einen geringen Überdruck. Die Kulturen werden anschliessend bei den geeigneten
Temperaturen bebrütet.
FRAGE 1.1: Sie arbeiten in Versuch 3 mit dem obligat anaeroben Bakterium C. butyricum unter
aeroben Bedingungen. Wie kann dieser Organismus diese Bedingungen überleben? ANTWORT:
Versuch 4: Isolierung von Einzelkolonien zur Herstellung von Reinkulturen
Der Isolierung von Einzelkolonien und Herstellung von Reinkulturen ausgehend von Mischkulturen
wie z.B. Freilandproben kommt in der Mikrobiologie eine zentrale Bedeutung zu. Ein von Robert Koch
ebenso einfaches wie geniales Verfahren beruht auf der Isolation von Einzelkolonien auf festen
Nährböden. Eine Einzelkolonie (Klon) entsteht durch vielfache Teilung einer einzelnen Bakterienzelle
und stellt somit bereits eine Reinkultur dar. Um solche zu erhalten, muss eine Bakteriensuspension sehr
stark verdünnt werden. In diesem Versuch werden zwei Methoden, der Verdünnungsausstrich und das
Plattengussverfahren, vorgestellt, um ausgehend von einer Mischung Einzelkolonien und somit
Reinkulturen von Escherichia coli (weisse Kolonien) und Serratia marcescens (rote Kolonien) zu
isolieren.
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a) Verdünnungsausstrich
Vorgehen:
Auf dem Agarmedium (LBG-Agar) einer
Petrischale wird mit der Impföse ein Tropfen (30
l) der Mischkultur auf der einen Seite der Schale
2
in 2 bis 3 Parallelstrichen ausgestrichen (1). Die
Öse wird dann abgeflammt und die Petrischale
um 90° gedreht. Ausgehend vom einen Ende der
1
3
Parallelstriche wird erneut in einem 90°-Winkel
Bakterienmaterial ausgestrichen. Wird dieser
Vorgang noch ein- bis zweimal wiederholt, sollte
es möglich sein, nach Inkubation von 24-48 h bei
4
Raumtemperatur Einzelkolonien zu erhalten.
b) Plattengussverfahren
Vorgehen:
1 ml einer 1:100 und einer 1:1000 Verdünnung (in sterilem Wasser) der Mischkultur wird in leere
Petrischalen gegeben und mit 20-30 ml flüssigem und auf 60°C temperiertem LBG-Agar übergossen.
Die Bakterien werden durch Schwenken der Platten auf der Arbeitsfläche im noch flüssigen
Nährmedium verteilt. Nach Erstarren des Mediums werden die Platten für 24-48 h bei Raumtemperatur
inkubiert.
Dieses Verfahren wird auch zur Bestimmung der Anzahl kultivierbarer Mikroorganismen in
Lebensmittelproben verwendet (siehe Kap. 4.2.).
FRAGE 1.2: Warum kommt in der Mikrobiologie der Arbeit mit Reinkulturen eine so grosse
Bedeutung zu? ANTWORT:
2. MIKROORGANISMEN IN DER UMWELT
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2.1. Mikroorganismen auf Oberflächen
Versuch 1: Abklatsch mit Rodac-Schalen
Mit dieser Technik werden Bakterien auf Oberflächen nachgewiesen. Diese Methode ist in der
Lebensmittelhygiene von Bedeutung. So werden zum Beispiel Oberflächen in Küchen von Restaurants
oder in Lebensmittel verarbeitenden Betrieben auf das Vorhandensein unerwünschter
Mikroorganismen überprüft. Rodac-Schalen sind ähnlich wie Petrischalen, aber mit einem Doppelrand
versehen. Im Innern giesst man ein Agarkissen eines Kulturmediums, hier LBG.
Vorgehen:
Das Agarkissen der Rodac-Schale wird während 10 Sekunden leicht auf die Untersuchungsfläche
aufgedrückt und während 3 Tagen bei 30°C inkubiert. So erhält man einen "Fingerabdruck" der
untersuchten Fläche. Zur Untersuchung kommen in Frage: Hände (gewaschen und ungewaschen),
Körperfläche, Handtücher etc.
Auswertung:
Oberfläche
Anzahl
Anzahl
Sonstige Beobachtungen (Form,
Bakterienkolonien
Pilzkolonien
Farbe, Geruch der Kolonien)
2.2. Mikroorganismen in Biofilmen
Der Begriff Biofilm beschreibt eine Gemeinschaft derselben Art oder von unterschiedlichen Arten von
Mikroorganismen, welche von einer dünnen selbstproduzierten Schleimschicht umhüllt sind.
Ein Biofilm entsteht, wenn Mikroorganismen eine feste oder flüssige Oberfläche besiedeln.
Vorausgesetzt die Umgebung ist feucht und es sind genügend Nährstoffe vorhanden, scheiden die
Mikroorganismen bestimmte Zucker und andere Stoffe aus, die sich zu einer schleimigen Schicht
verbinden. Diese Schleimschicht wird als extrazelluläre polymere Substanz (EPS) bezeichnet. Dabei
handelt es sich um Polysaccharide, Proteine, Glykoproteine und andere stark wasserbindende,
polymere Substanzen. Beispiele von Biofilmen sind der Zahnbelag oder die glitschigen
Schleimschichten in Blumenvasen, auf Flusskieseln oder in Wasserleitungen.
Viele Bakterien besitzen die Fähigkeit, Biofilme zu bilden. Bakterien leben auf diese Weise in einer
Art organisierten Lebensgemeinschaft, in der sie miteinander kommunizieren (siehe Kapitel 6, Versuch
6) und besser geschützt sind vor Umwelteinflüssen wie extremen Temperaturen oder pH-Werten. Eine
besondere Bedeutung haben Biofilme in der Medizin: In Biofilmen organisierte Bakterien sind sehr gut
vor unserem Immunsystem und vor Antibiotika geschützt. Viele sind so tausendmal resistenter gegen
Antibiotika als freilebende Bakterien des gleichen Stammes. In diesem Kurs werden zwei Beispiele
von bakteriellen Biofilmen angeschaut. Eines davon ist der Zahnbelag (Plaque), der sich bildet, wenn
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das Zähneputzen einmal ausgelassen wird. Das zweite Beispiel ist ein Biofilm (Essigmutter), der sich
bildet, wenn aus Wein Essig entsteht (Kapitel 4, Versuch 5).
Versuch 2: Isolierung von Kariesbakterien aus der eigenen Mundschleimhaut
Streptococcus salivarius ist ein gram-positives Milchsäurebakterium, welches Kohlenhydrate
(Glucose) vergärt und dabei Milchsäure produziert. Es ist verantwortlich für die Entstehung von Karies
und kommt natürlicherweise in unserer Mundhöhle vor. S. salivarius bildet in der Mundhöhle kleine
Kolonien aus, die an der Oberfläche von Zähnen relativ fest anhaften und einen Biofilm ausbilden.
Insbesondere bei mangelnder Mundhygiene und einer guten Versorgung der Bakterien mit Saccharose
(Haushaltszucker) ist die Schleimbildung besonders stark. Diese Biofilme bilden viel Milchsäure,
welche den Zahnschmelz angreift und zu Karies führen kann.
Material:
Sterile Wattestäbchen, Saccharose-Agarplatten, Platten mit Reinkulturen von E. coli (auf LBG-Agar)
und S. salivarius (auf Saccharoseagar).
Vorgehen:
Mittels sterilen Wattestäbchen werden Proben von der Mundschleimhaut flächig auf eine SaccharoseAgarplatte ausgestrichen. Die Platten werden mit Parafilm verschlossen und 2-3 Wochen bei
Raumtemperatur inkubiert, um Bakterienkolonien mit charakeristischer Schleimbildung aus der
Mundschleimhaut zu isolieren. Als Kontrollen für die Schleimbildung auf Saccharose-Agar dienen
Reinkulturen von E. coli (Negativkontrolle) und S. salivarius (Positivkontrolle), die nebeneinander auf
eine Saccharose-Agarplatte überstrichen werden.
Auswertung:
Wie unterscheiden sich die Einzelkolonien der verschiedenen Bakterien (Eigenisolate, Kontrollen) auf
den Saccharose-Agarplatten? Bei welchen Proben sind schleimbildende Kolonien erkennbar?
FRAGE 2.1: Was ist die hauptsächliche Einschränkung der im Praktikum gezeigten Methoden zum
Nachweis von Mikroorganismen in Umweltproben im Vergleich zu modernen Ansätzen wie DNASequenzierung (Metagenomik)?
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2.3. Mikroorganismen in der Luft
Mikrobiologische Luftanalysen sind sehr aufwendig, da die Mikroorganismenzahl in der Luft grossen
Schwankungen unterworfen ist, wie dies die nachstehende Tabelle veranschaulicht.
Beispiele von Luftkeimzahlen an verschiedenen Standorten:
Anzahl
Keime/m3
Keime/m3
Probenahmen
Durchschnitt
Extremwerte
Arosa (freies Feld)
12
130
24/220
Klotener Ried
18
218
64/343
Arosa (Dorfrand)
12
244
83/458
Kloten
24
398
134/1236
Messorte
(freies Feld)
(Strassenkreuzung)
Zur Erfassung der Mikroorganismen in der Luft gibt es verschiedene Methoden. Die einfachste ist das
Auslegen von offenen Agarplatten, wobei man Bakterien und Pilze, die sich in der Luft befinden, über
eine bestimmte Zeit sedimentieren lässt. Die Platten werden anschliessend bebrütet und die sich
entwickelnden Kolonien nach 24 bis 48 h ausgezählt.
Eine zuverlässigere Methode ist die Verwendung von automatischen Luftkeimsammlern. Dabei wird
eine bestimmte Menge Luft angesogen und auf ein Nährmedium geschleudert, auf dem die Keime
kleben bleiben.
Bei der Erfassung der Mikroorganismen in der Luft ist die Wahl des Mediums wichtig (siehe Anhang
für die Zusammensetzung einiger Medien). Für Bakterien eignen sich Plate-Count (PC) oder Luria
Broth Glucose (LBG) Agar, für die selektive Erfassung von Pilzen wählt man Malzager (MA), Potato
Dextrose Agar (PDA) oder Sabouraud-Dextrose-Agar (SD). Es stehen im Kurs Platten mit LBG-Agar
und mit Malzagar zur Verfügung.
Versuch 3: Luftanalyse mit spontaner Keimsedimentation
Durchführung:
Die Luftanalyse mit Sedimentationsplatten wird wie folgt durchgeführt: Die in Versuch 1.1 selber
hergestellten Agarplatten werden an bestimmten Standorten offen während zum Beispiel 1-2 h
exponiert. Anschliessend werden die Platten bei 30°C bebrütet und nach 24 bis 48 h ausgewertet.
Jeder Teilnehmer legt je eine Platte mit LBG-Agar und mit Malzagar (aus Experiment 1.2) aus. Wie
erwähnt vermehren sich auf dem LBG-Agar insbesondere Bakterien, auf dem Malzagar Pilze.
Auswertung:
Medium/Standort
LBG/
MA/
Anzahl
Anzahl
Sonstige Beobachtungen (Form,
Bakterienkolonien
Pilzkolonien
Farbe, Geruch der Kolonien)
3. MIKROORGANISMEN UND BAKTERIOPHAGEN IM ABWASSER
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Bakteriophagen
Twort (1915) und d`Hérelle (1917) entdeckten ein infektiöses Agens, das Bakterienfilter passieren und
einen Bakterienrasen lysieren konnte. Sie nannten dieses Agens Bakteriophagen.
Heute weiss man, dass es sich bei diesen filtrierbaren und lichtmikroskopisch nicht sichtbaren
Bakteriophagen um Viren handelt, die nur Bakterien infizieren können.
Wie die Viren bestehen die Bakteriophagen (kurz auch Phagen genannt) aus Proteinen und
Nukleinsäure. Die Phagen enthalten entweder DNA oder RNA, nie jedoch beides zusammen. Die
Nukleinsäure wird bei der Infektion ins Bakterium eingespritzt und liefert dann die Information für die
Synthese neuer Phagenpartikel. Die Energie, Bausteine (Nukleotide, Aminosäuren) und die
„Produktionsstrukturen“ (Ribosomen, Membranstrukturen) werden vom Wirtsorganismus
bereitgestellt.
Fast von allen Bakterienarten sind heute Bakteriophagen isoliert und beschrieben worden. Dabei fand
man, dass der Wirtskreis eines Bakteriophagen sehr beschränkt ist, d.h. dass eine bestimmte Phagenart
nur eine oder wenige Bakterienarten befallen kann.
Die Erkennung und Isolierung von Phagen ist nur dann einfach, wenn der Phage virulent ist, d.h. wenn
er sich nach der Infektion im Bakterium sofort vermehrt und dieses schliesslich unter Freisetzung
genetisch identischer Phagen lysiert.
Daneben gibt es auch temperente Phagen, die zwar ihre Nukleinsäuren einspritzen, sich dann aber im
Wirtsbakterium nicht sofort vermehren. Die Phagennukleinsäure wird dabei ins Wirtschromosom
eingegliedert und in den normalen Wachstumszyklus des Bakteriums einbezogen. Erst unter speziellen
Bedingungen (z.B. Induktion durch UV-Strahlen oder chemische Mittel) beginnt sich die Phagen-DNA
wieder selbstständig zu machen und zu vermehren: der temperente Phage wird lytisch.
Um die Anzahl der Phagen (den Phagentiter) zu bestimmen wird die Plaque-Test-Methode verwendet.
Bei dieser Methode werden wenige Phagen mit einem Überschuss an sensitiven Bakterien
zusammengegeben, mit Weichagar vermischt und auf der Oberfläche einer Agarplatte verteilt. Wo sich
ein Phagenpartikel befindet, werden die Bakterien in einem gewissen Umkreis lysiert. So entstehen im
dichten Bakterienrasen "Löcher" - in der Fachsprache Plaques genannt. Aus statistischen Gründen
nimmt man an, dass jedes Plaque aus der Infektion eines einzelnen Phagen entsteht, d.h. dass man
durch Auszählen der Plaques ein Mass für die Anzahl infektiöser Partikel (Phagentiter) in einem Lysat
erhält.
Versuche
Für diesen Versuch wird Rohwasser aus einer Kläranlage verwendet. Das Fäkalwasser enthält unter
vielen Mikroorganismen auch Escherichia coli, begleitet von den entsprechenden Bakteriophagen. Da
Bakterien generell einen Durchmesser von 0,8 m bis 3 m haben und Bakteriophagen einen solchen
von 10 bis 100 nm, können sie durch Filtration voneinander getrennt werden.
15
Versuch 1: Bestimmung des Bakteriengehaltes in Rohwasser aus einer Kläranlage
Es wird versucht, die in Rohwasser vorhandene Menge an Mikroorganismen zu schätzen. Gleichzeitig
soll die Wirkung des Bakterienfilters mit Porengrösse 0,45 m geprüft werden (Versuch 2).
Vorgehen:
Je 1 ml des unfiltrierten Rohwassers werden in sterilem Wasser in 10er Schritten bis zu einem Faktor
von 105 verdünnt. 1 ml der Verdünnungen 103, 104 und 105 werden in je eine Petrischale pipettiert und
mit ca. 20 ml LBG-Agar (60°C) übergossen (Plattengussverfahren, siehe Kap. 1, Versuch 1.4). Das
Mischen von Bakterien und Agar erfolgt durch vorsichtige kreisförmige Bewegung der Schale auf der
Tischplatte. Nach 24 bis 48 Stunden Inkubation bei 37°C wachsen die Einzelzellen zu Kolonien aus
und können ausgezählt und auf die Anfangskonzentration zurückberechnet werden.
Versuch 2: Nachweis der Wirkung des Filters mit der Porengrösse 0,45 m
Es soll gezeigt werden, dass ein Filter mit der Porengrösse 0,45 m sämtliche Mikroorganismen
zurückbehält.
Vorgehen:
5 ml Rohwasser werden durch einen Filter mit der Porengrösse 0,45 m in ein steriles Röhrchen
filtriert. Anschliessend wird 1 ml des unverdünnten Filtrats mit dem Plattengussverfahren in LBG-Agar
ausplattiert. Filtrat nicht wegwerfen – wird noch für Versuch 3.3 gebraucht!
Versuch 3: Bestimmung des Phagentiters (Coli-Phagen) im 0,45 m Filtrat
Bei der Bestimmung wird die Weichagarschicht-Methode (ein modifiziertes Plattengussverfahren)
angewendet. Die Phagen werden dabei in einen Weichagar eingebettet, der zugleich auch mit den
Wirtsbakterien beimpft wird. Der Weichagar begünstigt die Diffusion der Phagen, so dass sie leichter
auf eine Wirtszelle treffen und die Bakterien infizieren können. Nach etwa 20 Minuten, in deren
Verlauf in jeder infizierten Zelle 20 bis 200 neue Phagen synthetisiert werden, lysieren die befallenen
Bakterien und setzen Phagen frei. Diese freigesetzten Phagen infizieren die noch intakten
Nachbarzellen. So entsteht bei Bebrütung im dichten Bakterienrasen eine bakterienfreie Zone, auch als
Lysehof oder Plaque bezeichnet.
Vorgehen:
7 ml H-Topagar (in einem Reagenzglas) werden im siedenden Wasserbad geschmolzen und
anschliessend auf ca. 60°C abgekühlt. Dann mischt man sehr schnell 0.5 ml des 0,45m Filtrates bzw.
der 1:10 Verdünnung des Filtrats (in sterilem Wasser) und 100 l E. coli BL21 Kultur mit dem
Weichagar, giesst die Mischung des Reagenzglases unverzüglich (bevor der Weichagar wieder erstarrt)
auf eine (warme) H-Agar Platte und verteilt diese gleichmässig durch kreisförmiges Bewegen der
16
Platte. Nach 12 bis 24 Stunden Inkubation kann der Phagentiter (pfu/ml = plaque forming units per ml)
bestimmt werden.
Auswertung der Versuche 1 - 3:
Auszählung der auf den verschiedenen Platten gewachsenen Bakterienkolonien und Bestimmung der
cfu/ml (colony forming units per ml) (siehe auch Kap. 4) bzw. pfu (plaque forming units)/ml:
Vorbehandlung der
Abwasserprobe
cfu/ml bzw. pfu/ml
Beschreibung der aufgetretenen Kolonie bzw
Plaques
unfiltriert
0.45 m
Phagentiter unverd.
Phagentiter 1:10 verd.
FRAGE 3.1: Wie erklären Sie sich die verschiedenen Grössen und Klarheiten der erhaltenen Plaques?
ANTWORT:
Persönliche Notizen:
4. LEBENSMITTELMIKROBIOLOGIE
17
4.1. Einführung
Das Gebiet der Lebensmittelmikrobiologie hat während der letzten Jahre stark an Bedeutung
gewonnen. Lebensmittel, eingeschlossen Wasser und andere Getränke, haben bestimmten hygienischen
Anforderungen zu genügen. Diese sind den veränderten Lebensgewohnheiten anzupassen.
Lebensmittel werden heute länger und in grösseren Mengen gelagert; sie werden über weitere Strecken
transportiert; sie werden durch die Einrichtung von Fast Food Ketten und Gemeinschaftsverpflegungen
in grossen Mengen zubereitet. In tropischen Drittweltländern nimmt der Stand der Hygiene immer noch
ab, was sich besonders auf die Qualität von Trinkwasser auswirkt. Die Folgen davon sind Ausbrüche
von Epidemien wie Cholera (Erreger Vibrio cholerae) oder Salmonellosen.
Haltbarmachung von Lebensmitteln durch Mikroorganismen:
Der Einsatz von Mikroorganismen zur Haltbarmachung von Lebensmitteln hat zum Ziel, das
Nahrungsmittel so zu verändern, dass es gegen den Angriff von Fremdkeimen weitgehend geschützt
ist. Als Beispiele seien die Ansäuerung durch Milch- oder Propionsäurebakterien (Molkereiprodukte,
Wurstwaren, Sauerkraut) oder die Produktion von Alkohol durch Hefen bei zuckerhaltigen Getränken
genannt.
Verderb und Verunreinigung von Lebensmitteln durch Mikroorganismen
Ungeschützte Nahrungsmittel sind dem mikrobiellen Angriff ausgesetzt. In der Regel werden die
Lebensmittel bei unsachgemässer Aufbewahrung durch mikrobiellen Abbau ungeniessbar. Viele
Mikroorganismen produzieren Exoenzyme wie Proteasen oder Lipasen, die in der Lage sind, Proteine
und Fette in Lebensmitteln abzubauen und die Spaltprodukte als Energiequelle und für den Aufbau
mikrobieller Zellsubstanz zu nutzen. Meist sind diese Mikroorganismen apathogen. Einige wenige
Arten sind aber pathogen, indem sie Toxine bilden (z.B. Clostridium botulinum) oder zu
Darminfektionen (Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Salmonellen) führen. Bei mikrobiellen
Kontaminationen von Lebensmitteln mit pathogenen Keimen ist in der Regel eine Quelle vorhanden,
aus der die Mikroorganismen ins Nahrungsmittel abgegeben werden, wie Verunreinigung von Eiern
oder Geflügelfleisch mit Salmonellen oder Kontamination von Wasser und Lebensmittel durch
Ausscheider von Cholerabakterien. Im Schweizerischen Lebensmittelbuch sind Grenzwerte festgelegt,
welche für die Belastung von Lebensmitteln durch Mikroorganismen gelten.
In unserem Kurs wollen wir an bekannten Beispielen die mikrobielle Haltbarmachung von
Lebensmitteln zeigen und eine bakteriologische Trinkwasseruntersuchung durchführen.
18
4.2. Keimzahlbestimmung in Wasser und Milch
Einleitung
In den meisten Flüssigkeiten sind naturgemäss mikrobielle Keime enthalten. Die Wasserqualitäten
unterliegen einer strengen Überwachung und in den verschiedenen Verordnungen sind Höchstwerte
festgelegt. Für Getränke sind diese zusammen mit den Prüfmethoden im Schweizerischen
Lebensmittelbuch enthalten. Im Folgenden sind einige Verfahren zur Bestimmung von Höchstwerten
im Rahmen der Lebensmittelüberwachung beschrieben. Zum einem wird die totale Anzahl Keime
bestimmt. Zum anderen wird auf einzelne Mikroorganismen zurückgegriffen, welche als Indikatoren
für Kontaminationen benutzt werden. Eine solche Spezies ist Escherichia coli. Sie deutet auf
Verunreinigung durch tierische Fäkalien hin. Daher darf abgefülltes Trinkwasser wohl eine gewisse
Anzahl aerober, mesophiler Keime, aber keine E. coli Bakterien enthalten. Die entsprechenden
gesetzlichen Toleranzwerte für Trinkwasser sind laut Hygieneverordnung des EDI (SR817.024.1):
Trinkwasser
Untersuchungskriterien
Toleranzwerte (cfu)
An der Fassung
Aerobe, mesophile Keime - E. coli
100/ml - nn/100ml
Im Verteilnetz
300/ml - nn/100ml
Abgefüllt in Behältnisse
nn/100ml - nn/100ml
nn = nicht nachweisbar
Verfahren
Es gibt verschiedene Verfahren Keime nachzuweisen. Will man nur die Gesamtmenge der
vorhandenen Keime bestimmen, wird ein allgemeines Verfahren mit nicht-selektiven Medium gewählt.
Benutzt man ein selektives Medium kann man die Vermehrung einer speziellen Art gezielt steuern und
dadurch die Grenzwerte überprüfen. Je nach Probengrösse oder festgelegtem Höchstwert werden
Plattengussverfahren oder Membranfiltertechnik gewählt.
Plattengussverfahren: Die Bezeichnung Gussverfahren leitet sich davon ab, dass der noch nicht
erstarrte Nährboden in die Petrischale gegossen wird, in der sich bereits die Probe (1 ml) befindet.
Probe und Nährboden werden durch sorgfältige Kreisbewegung der Petrischale miteinander vermischt.
Im erstarrten Nährboden entwickelt sich jede Einzelzelle zu einer Kolonie, die nach einer bestimmten
Inkubationszeit visuell ausgezählt werden kann. Da die Kolonienbildung nicht notwendigerweise von
Einzelzellen ausgeht, benutzt man häufig anstelle von „Keimzahl“ auch den Ausdruck
„Koloniebildende Einheiten“ (KBE) oder englisch „colony forming unit“ (cfu). Dieses Verfahren wird
für die Bestimmung von Keimzahlen in kleinen Probenvolumina gewählt.
Membranfiltertechnik: Bei dieser Technik werden bereits gegossene Platten verwendet. Eine
bekannte Menge der Probe (100ml) wird durch einen Membranfilter der Porengrösse 0.45 m filtriert,
auf dem die Mikroorganismen zurückbehalten werden. Der Filter wird auf die Agar-Platten gelegt und
saugt sich mit Nährmedium voll. Auf dem Filter wachsen die Keime zu Kolonien aus, die wie beim
Gussverfahren visuell ausgezählt werden können. Bei dieser Technik lassen sich grössere
19
Probevolumina verwenden. Diese Methode eignet sich für die Überprüfung des E. coli Gehalts in
Trinkwasser.
Es werden immer neue Verfahren entwickelt, um einzelne Arten von Mikroorganismen gezielt und
einfach auf ihre Anwesenheit zu testen. So gibt es für bakteriologische Wasseruntersuchungen Kapseln,
deren Inhalt in einem sterilen Gefäss mit der Probe suspendiert wird. Nach Inkubation kann lässt sich
anhand der auftretenden Farbänderung qualitativ auf die Anwesenheit von E. coli schliessen.
Versuch 1: Bestimmung aerober, mesophiler Keime in Wasser
Jede Assistentengruppe bestimmt nach der oben beschriebenen Plattengusstechnik den
Gesamtkeimgehalt in 1 ml Stadtwasser, Mineralwasser (mit und ohne Kohlensäure), Seewasser,
Flusswasser und Quellwasser. Es wird LBG-Agar verwendet. Die Platten werden vor dem Auszählen 3
Tage bei 30°C inkubiert. Um eine korrekte Auswertung zu gewährleisten, sollten auf einer Platte nicht
mehr als 300 Kolonien wachsen.
Resultate:
Wasserprobe
Anzahl Bakterienkolonien pro ml
Versuch 2: Bestimmung des Keimgehaltes von Milch
Jede Assistentengruppe bestimmt den Keimgehalt von Roh-, Past- und UHT-Milch. Die Proben werden
dazu in 10er Schritten bis zu einem Faktor von 104 in sterilem Wasser verdünnt. 1 ml der
Verdünnungen 102, 103 und 104 sind im Plattengussverfahren auf LBG-Agar auszuplattieren.
Resultate:
Milchprobe
Rohmilch
Pastmilch
UHT-Milch
Ausgezählte
Anzahl Bakterienkolonien
Anzahl Bakterienkolonien
Verdünnung
pro ml verdünnt
pro ml unverdünnt
20
Versuch 3: Der Nachweis von Escherichia coli
Mit dem spezifischen TBX-Agar werden 100 ml obiger Wasserproben (NICHT Rohwasser!) mittels
Membranfiltrationstechnik auf das Vorhandensein von E. coli geprüft. Als Positivkontrolle für den
TBX-Agar wird ein Tropfen (30 l) Rohwasser mittels Verdünnungsausstrich auf einer TBX-Agar
ausgebracht. Die ermittelten Keimzahlen werden im Kurs zusammen mit den zulässigen Höchstwerten
verglichen und besprochen.
Resultate:
Wasserprobe
Anzahl E. coli-Kolonien pro 100 ml
4.3. Mikrobielle Konservierung von Lebensmitteln
Versuch 4: Herstellung von Joghurt
Einleitung:
Joghurt als Lebensmittel muss so alt sein wie der Konsum von Milch durch die . Milchsäurebakterien
sind in Rohmilch in grosser Zahl vorhanden (>104 /ml), sodass es oft spontan zur Entstehung von
Joghurt kommt. In Europa wird Bulgarien als Ursprungsland der Joghurtherstellung betrachtet. Das
klassische Joghurt wird mit Stämmen der beiden Bakterienarten Streptococcus thermophilus und
Lactobacillus bulgaricus hergestellt. Das Disaccharide Lactose, das in Kuh-, Schaf-, und Ziegenmilch
mit etwa 4.5% vorhanden ist, wird zu Milchsäure fermentiert. Man unterscheidet zwischen
homofermentativer und heterofermentativer Milchsäuregärung.
Die von den Mikroorganismen produzierte Milchsäure senkt den pH-Wert von etwas über pH 6 in den
Bereich von pH 3, wobei die Milchproteine koagulieren. Stichfestes Joghurt wird durch Zugabe von
Milchpulver erreicht. Durch die Senkung des pH-Wertes wird Joghurt über Tage, ja Wochen, haltbar.
Joghurt ist sehr bekömmlich und hat als Probiotika grosse Bedeutung erlangt. Auf dem Markt werden
Produkte mit speziellen Milchsäurebakterien angeboten, die sich auf das Verdauungssystem besonders
positiv auswirken sollen.
Die homofermentative Milchsäuregärung:
Lactose
21
Glucose + Galactose
Material:
-
Bio-Joghurt nature (z.B. Coop®, Migros®), Pastmilch, pro zwei Praktikumsteilnehmer ein
Joghurtglas, pH-Indikatorpapier, Esslöffel.
-
Milchsäure-Agar (MS-Agar) flüssig im Wasserbad bei 550C. Pro Assistentengruppe 600 ml
(2x500 ml Flaschen mit 300 ml Medium).
Durchführung:
Pro 2er-Gruppe
Vorgehen:
-
wird ein Joghurtglas mit 180 ml UHT Milch mit einem Teelöffel Joghurt beimpft und
anschliessend und bei 430C für 5 h inkubiert.
-
Der pH-Wert vom frischen Joghurt wird bestimmt und pro 2er-Gruppe wird eine
Verdünnungsreihe von 101 bis 105 in 1ml Eppendorf-Röhrchen hergestellt. Von jeder
Verdünnung werden 0.1 ml in eine Petrischale pipettiert, mit 20-25 ml MS-Agar (550C)
übergossen und sorgfältig aber gründlich gemischt. Anschliessend erfolgt eine Inkubation für
4 Tage bei 370C und dann Aufbewahrung bei RT.
-
Als Kontrolle wird pro Assistentengruppe vom ursprüglichen Joghurt (Starterkultur) eine
Verdünnungsreihe zwischen 101 und 108 hergestellt. Die Verdünnungen 104 bis 108 werden
wie oben ausplattiert.
Auswertung:
1. Messen der pH-Werte von Milch und Joghurt (nach 5h und nach 7 Tagen).
2. Vom Joghurt, das als Starterkultur diente und vom frischen Joghurt werden im Mikroskop
(Objektiv 40x) Lactobacillus spp. und Streptococcus spp. nachgewiesen.
22
3. Bestimmung der CFU’s pro ml Joghurt nach Inkubation von 5 h und 7 Tagen. und Rückberechnung
der Keimzahlen des Ausgangssubstrates. Bem.: Milchsäurebakterien lösen den Kalk um die Kolonien
auf und ihre Anzahl lässt sich so bestimmen. Lactobacillen und Streptococcen lassen sich voneinander
aufgrund ihrer Kolonieform unterscheiden. Die Lactobacillen bilden im MS-Agar runde Kolonien,
während diejenigen der Streptococcen spindelförmig sind.
4. Durchführung von Gram-Färbungen von Lactobacillus spp. und Streptococcus spp. Kolonien
während Experiment 5.3.
pH-Wert
Milch
CFU’s/ml
CFU’s/ml
Lactobacillen
Streptococcen
-
-
Starterkultur Yoghurt
Nach 5 h Inkubation bei 430C
Nach 7 Tagen bei RT
Versuch 5: Herstellung von Weinessig
In diesem Versuch soll mit Hilfe von Essigsäurebakterien (Acetobacter aceti) aus Wein Weinessig
hergestellt werden. Dabei soll die Zunahme der Konzentration von Essigsäure anhand der pHAbnahme und des charakteristischen Geruchs über die Zeit verfolgt werden.
Wein bildet natürlicherweise mit der Zeit Essig, da die Essigsäurebakterien bereits im Wein vorhanden
sind oder aus der Luft in den Wein gelangen. Vielleicht haben Sie schon zu Hause einen Wein zu lange
stehen gelassen und nachher Essig gehabt. Damit dies allerdings nicht geschieht, werden die Weine oft
mit Schwefel versetzt.
Damit aus Wein Essig wird, muss genügend Sauerstoff vorhanden sein. Dann sind die
Essigsäurebakterien in der Lage, Ethanol mit Hilfe von Sauerstoff zu Essigsäure zu oxidieren.
In der Industrie wird heute mit einer Starterkultur von Essigsäurebakterien gearbeitet. Wenn diese zum
Wein gegeben werden, beschleunigt dies die Essigbildung. Genau dies sollen Sie in diesem Versuch
ausprobieren. Dazu wird der Wein in einem nur teilweise gefüllten Gefäss gelagert, bis der Wein zu
Essig geworden ist. An der Grenzfläche Wein/Luft bildet sich eine Kahmhaut, weil dort die
Bedingungen für die Ethanol-Oxidation günstig sind. Diese Kahmhaut ist ein Biofilm aus
Essigsäurebakterien und wird auch als Essigmutter bezeichnet.
Material:
-
Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 6 Vertiefungen (wells)
-
Verdünnter Rot- oder Weisswein (6% Alkoholgehalt, möglichst schwefelfrei und pH-neutral)
-
Starterkultur von Essigsäurebakterien (Acetobacter aceti) auf YPM-Agar
-
pH-Indikatorpapier
-
10 ml Pipette
23
Vorgehen:
1.
Jede Vertiefung (well) wird mit 5 ml verdünntem Wein gefüllt.
2.
Acetobacter aceti-Zellen werden mit einer sterilen Pipettenspitze von der Platte entnommen
und in 0.5 ml sterilem Wasser resuspendiert. Von dieser Zellsuspension werden je 100 µl in 4
Wells pipettiert. Die anderen 2 Wells dienen als Nullkontrolle (K). Anschliessend wird mit
Hilfe des pH-Indikatorpapiers der pH-Wert aller Ansätze bestimmt (Wert in untenstehende
Tabelle eintragen).
3.
Die Platte wird mit einem Deckel geschlossen und für 3 Wochen bei Raumtemperatur stehen
gelassen.
Auswertung:
Nach einer, zwei und drei Wochen werden die Entstehung und das Wachstum der Kahmhaut und der
Geruch beobachtet und dokumentiert. Mit einer Pipette kann vorsichtig am Rand etwas Probe
entnommen werden um den pH-Wert der Ansätze zu bestimmen.
Dokumentieren Sie die Entwicklung der Kahmhaut und der Flüssigkeit in untenstehender Tabelle.
Woche
0
+Aa
1
K
+Aa
2
K
+Aa
3
K
+Aa
Kahmhaut
(Aussehen
beschreiben)
pH-Wert
Geruch
Beantworten sie folgende Fragen:
1) Worauf ist die beobachtete Veränderung des pH-Wertes zurückzuführen? Notieren Sie die
Reaktionsgleichung mit den entsprechenden Strukturformeln.
K
2) Wo in der Flüssigkeit wird der Biofilm gebildet und warum?
3) Warum soll mit ungeschwefeltem Wein gearbeitet werden?
FRAGE 4.1: Kennen Sie andere Beispiele von Lebensmitteln für deren Herstellung und
Konservierung die Anreicherung von spezifischen Mikroorganismen essentiell ist? Welche
Mikroorganismen werden angereichert? ANTWORT:
24
5. MORPHOLOGIE UND DIAGNOSTIK
25
5.1. Morphologische Kriterien
Aufbau der Zellen
Grösse, Teilung
Prokaryontische Zellen lassen sich im Lichtmikroskop gerade noch erkennen. Der Durchmesser einer
Zelle mag je nach Art im Durchschnitt 1 - 2 m betragen. Die Längen sind sehr unterschiedlich. Für
die Untersuchung von Feinstrukturen benötigt man das Elektronenmikroskop. Eukaryontische Zellen
von Pilzen sind 5 -10x grösser (5-8 x 5-15 m).
Die Zellen vermehren sich in der Regel durch Querteilung. Unter idealen Wachstumsbedingungen kann
die Querteilung mit einer gewissen Verzögerung stattfinden, sodass sich charakteristische Zellverbände
(Ketten, Trauben, kubische Pakete, Tafeln, Tetraden) bilden. Sowohl bei den Bakterien als auch bei
den Pilzen gibt es mehrzellige Formen, deren Zellverbände Filamente ausbilden und die sich durch
Sporen vermehren. Bei filamentösen Pilzen ist die Zellteilung auf die Zelle an der Filamentspitze
beschränkt (polares Wachstum, siehe Kap. 11).
Zellwand
Nach aussen hin sind die Zellen von Mikroorganismen von einer Zellwand umgeben, die der Zelle die
notwendige Stabilität verleiht. Bei Bakterien besteht das Grundgerüst der Zellwand aus Murein, einem
Netzwerk aus Heteropolysaccharid-Strängen und Peptidbrücken. Bei Archaeen ist die Zellwand aus
Eiweiss und/oder Polysacchariden aufgebaut und bei Pilzen aus Polysacchariden.
Aufgrund des Zellwandaufbaus lassen sich die Bakterien in zwei wichtige Gruppen unterteilen, die
Gram-positiven und die Gram-negativen. Die Gram-positiven Bakterien besitzen eine dicke Zellwand,
während diejenige von Gram-negativen Organismen relativ dünn ist, aber zusätzlich von einer äusseren
Membran aus Lipopolysacchariden und Lipoproteinen umgeben ist. Differenziert zwischen Gramnegativen und Gram-positiven Bakterien wird mit Hilfe einer Färbemethode, der so genannten
Gramfärbung (vgl. Versuch 5). Gram-positive Organismen bleiben nach Färbung mit Kristallviolett
und anschliessendem Beizen mit Kaliumjodid-Lösung angefärbt, während bei Gram-negativen
Bakterien der Farbstoff mit Äthanol wieder entfernt werden kann.
Kapsel oder Schleimschicht
Die Zellwände können zusätzlich von einer Kapsel oder Schleimschicht umgeben sein. Es handelt sich
dabei um Polysaccharidausscheidungen, die für die Zellen eine zusätzliche Schutzfunktion erfüllen.
Von einer Kapsel spricht man, wenn die Polysaccharide relativ kompakt sind und an den Zellen haften.
Im Gegensatz dazu lässt sich der wässerige Schleim relativ leicht von den Zellen lösen.
Cytoplasmamembran
Zwischen der Zellwand und dem Cytoplasma finden wir die Cytoplasmamembran. Es handelt sich um
eine doppelte Schicht von Lipiden, in welche Proteine eingelagert sind. Die Cytoplasmamembran
erfüllt in erster Linie Transportfunktionen für Nährstoffe und Metaboliten. In ihr sind aber auch für den
Metabolismus der Zelle wichtige Enzyme lokalisiert.
26
Cytoplasma
Im Cytoplasma findet sich das Chromosom, Ribosomen, Proteine, Reservestoffe sowie alle weiteren
für die Zellvermehrung und den Aufbau von Zellsubstanz notwendigen Verbindungen. Das Cytoplasma
von eukaryontischen Pilzzellen enthält zahlreiche Kompartimente (Mitochondrien, Vakuolen,
Zellkern).
Beweglichkeit
Viele Bakterienarten sind befähigt, sich aktiv fortzubewegen. Sie sind mit Geisseln ausgerüstet. Die
Verankerung der Geisseln reicht durch die Zellwand hindurch bis in die Cytoplasmamembran hinein.
Aufbau und Funktion der Geisseln ist kompliziert. Die Anordnung der Geisseln an der Oberfläche ist
ein charakteristisches, taxonomisch wichtiges Merkmal. So gibt es zum Beispiel Bakterien, welche nur
an einem Ende eine einzige Geissel besitzen (monopolar monotrich begeisselt) oder , als anderes
Extrem, solche, die rundherum Geisseln tragen (peritrich begeisselt). Zellen von Archaeen und Pilzen
sind in der Regel nicht beweglich.
Sporenbildung
Die Familie der Bacillaceae umfasst Bakterien, die hitzeresistente Dauersporen bilden. Sie ist in die
Gattungen Bacillus und Clostridium unterteilt. Die Gattung Bacillus umfasst die aeroben, die Gattung
Clostridium die anaeroben Sporenbildner. Sporenbildner sind in der Natur weit verbreitet und
schliessen z.B. auch die filamentösen Actinomyceten und sämtliche Pilze ein. Die Bildung der Sporen
setzt ein, sobald die vegetative Zellvermehrung durch Nährstoffmangel zum Stillstand kommt. Die
Sporen können jahrelang an ihrem Standort verharren und erst wieder zu vegetativen Zellen auskeimen,
wenn die Bedingungen für vegetatives Wachstum gegeben sind.
Das Mikroskop und seine Anwendung in der Mikrobiologie
Mikroorganismen können von blossem Auge nur dann wahrgenommen werden, wenn sie in sehr
grosser Zahl auftreten. Klare Kulturflüssigkeiten zeigen erst bei einer Keimzahl grösser als etwa 10 6/ml
eine Trübung. Eine Kolonie auf einer Agarplatte, die gerade noch von blossem Auge sichtbar ist, dürfte
etwa aus 105 - 106 Zellen bestehen; d.h. eine einzelne Zelle auf der Agarplatte wird etwa nach 15
Teilungszyklen als Kolonie sichtbar.
Lichtmikroskopie ermöglicht das Beobachten einzelner Mikroorganismen. Sehr leicht lassen sich
verschiedene Zellformen erkennen, ebenso lassen sich die Dimensionen der betrachteten
Mikroorganismen abschätzen. Strukturelle Einzelheiten sind hingegen im Lichtmikroskop kaum
sichtbar. Auf das Vorhandensein von Geisseln kann zum Beispiel nur indirekt geschlossen werden:
begeisselte Bakterien zeigen in der Regel gut sichtbare aktive Bewegung (vgl. Kap. 7; Versuch 4).
Die zur Verfügung stehenden Lichtmikroskope sind mit Phasenkontrast ausgerüstet. Der
Phasenkontrast ermöglicht das Betrachten von Mikroorganismen in ihrem Nativzustand. Auf früher
übliche Methoden der Kontrastvergrösserung etwa durch Anfärben der Präparate kann somit heute
weitgehend verzichtet werden.
27
Zellformen eukaryontischer Mikroorganismen (vgl. auch Kap. 11)
Einzellige Pilze (Hefen):
- bedeutend grösser als Bakterien
- kugelige, elliptische oder längliche Formen
- unbeweglich
- Zellkerne und Vakuolen im Lichtmikroskop erkennbar
- Asexuelle Vermehrung durch Sprossung, selten Querteilung (Schizosaccharomyces-Arten)
Sprossung (z.B. Gattungen: Saccharomyces, Candida,
Torulopsis)
Querteilung: (Gattung: Schizosaccharomyces)
Mehrzellige (filamentöse, myzelbildende) Pilze:
- Die Differenzierung der Myzelbildner im Mikroskop ist schwierig
(Myzelien sehen alle gleich aus)
- Zellkerne und Vakuolen in Mycelfäden (Hyphen) meist sichtbar
Achtung! Es gibt auch mycelbildende Prokaryonten, z.B. die
Actinomyceten, die sich aber in den Dimensionen und in der fehlenden
Zellkompartimente von den filamentösen Pilzen unterscheiden.
Zellformen prokaryontischer Mikroorganismen
Kokken:
- kugelige Zellen, Durchmesser < 2 m
- unbeweglich
- Unterscheidung nach Zahl der Teilungsebenen
Mikrokokken: meist einzelne Zellen, selten grössere Zellagglomerate.
Diplokokken: meist 2er-Pakete, selten einzelne Zellen oder
grössere Agglomerate.
28
Sarcinen: rhombisch angeordnete 4er-Pakete,
selten andere Zellagglomerate.
Streptokokken: häufig längere, kettenförmige Zellverbände.
Es treten immer viele kurze Ketten zusammen mit einzelnen
Zellen auf.
Staphylokokken: häufig grössere Zellhaufen, es treten daneben aber
immer Einzelzellen und kleine Zellhäufchen auf.
Stäbchen:
- grosse Variabilität des Längen/Breiten-Verhältnisses, Abmessungen: (0.2 - 1) x (1 - 5) m
- gerade oder krumme Stäbchen (im Lichtmikroskop häufig nicht zu unterscheiden)
- beweglich oder unbeweglich
- Vermehrung durch Querteilung
Kurze Stäbchen: neben Einzelzellen meist auch
solche, welche sich gerade teilen
Lange Stäbchen: neben Einzelzellen findet man häufig
solche, welche noch zusammenhängen und so längere
Ketten bilden.
29
Sporulierte Zellen
Beispiele: Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis
- charakteristische Lichtbrechung im
Phasenkontrastmikroskop, erscheinen leuchtend hell.
- kugelige oder längliche Form der Sporen, welche sich
entweder noch in den Mutterzellen befinden oder diese
teilweise oder ganz abgestossen haben.
Seltenere Zellformen
Bakterien zeigen eine grosse Formenvielfalt. Stäbchen und Kokken sind Grundformen, welche man
sehr häufig antrifft. Es gibt daneben aber eine ganze Reihe Bakteriengattungen, deren Vertreter von
sehr charakteristischer Form sind:
Spirochaeten
Gattungen:
Treponema: Erreger von Syphilis
Borrelia: Erreger von Lyme Disease
Vibrionen
Gattung: Vibrio
z.B. Vibrio cholerae: Erreger der Cholera
Keulenförmige Bakterien
Gattung: Corynebacterium
z.B. Corynebacterium diphteriae: Erreger der
Diphterie (Keuchhusten)
Gestielte Bakterien
Gattung: Caulobacter
Filamentöse, mehrzellige Bakterien
Gattung: Streptomyces
Bem.: Diese Bakterien vermehren sich wie die
filamentösen Pilze durch Sporen.
30
Leitfaden zur Lichtmikroskopie
Aufbau des Lichtmikroskops
Okular
Objektiv
Objekttisch, Kreuztisch
Kondensor mit Blende
Grob- und Feintrieb
Leuchtfeldblende
Bedienung des Lichtmikroskops
Mikroskope sind teure und empfindliche Geräte. Sie sind für die sorgfältige Behandlung des
Kursmikroskops verantwortlich. Vermeiden Sie bitte bei der Handhabung starke Erschütterungen. Für
die Arbeit orientieren Sie sich am folgenden Ablauf:
1. Mikroskopiebeleuchtung einschalten.
2. Objektiv mit kleinster Vergrösserung auswählen.
3. Präparat auf den Objekttisch einklemmen und ausrichten.
4. Das Objektiv durch Drehen des Grobtriebs unter Sichtkontrolle von der Seite unmittelbar über das
Objekt bringen.
5. Durch das Okular schauen und langsam mit dem Grobtrieb den Abstand vergrössern (richtige
Drehrichtung beachten!) bis das Objekt scharf wird. Am besten am Deckglasrand orientieren.
6. Zu Beginn werden gelegentlich Staubpartikel im Strahlengang des Mikroskopes mit dem Objekt
verwechselt. Test: Wenn das Objekt auf dem Objekttisch bewegt wird, muss das auch im Mikroskop zu
sehen sein. Bewegen sich die Partikel nicht, arbeitet man in der falschen Ebene.
7. Feintrieb zum genauen Scharfstellen benutzen.
8. Wenn das Objekt klar zu sehen ist, kann ohne Veränderung des Abstandes zum nächst stärkeren
Objektiv gewechselt werden. Mikroskope sind so gebaut, dass die Fokussierung nahezu erhalten bleibt.
9. Die Oelimmersion wird zum Mikroskopieren fixierter Objekte verwendet. In diesem Fall geben Sie
einen kleinen Tropfen Immersionsöl unmittelbar auf das Objekt und tauchen Sie das
Immersionsobjektiv (und nur das!) vorsichtig ein. Den Abstand beim Drehen von der Seite
kontrollieren. Das Objektiv darf nicht auf dem Objektträger aufsitzen, sondern sollte gerade nur in die
Oelschicht eintauchen. Dann erst fokussieren Sie mit dem Feintrieb nach. Das Immersionsobjektiv
muss nach Gebrauch mit Kleenex-Papier gereinigt werden.
10. Achten Sie strikt darauf, dass andere Objektive nie mit Immersionsöl in Berührung kommen. Das
Oel löst den Kitt der Frontlinsen auf und beschädigt dadurch die Objektive irreversibel.
11. Linsen und Okulare mit eventuell leicht angefeuchtetem Kleenex-Papier reinigen. Vor allem
eventuell an die Frontlinse gekommene Kulturreste oder Flüssigkeit bitte sofort und sorgfältig
entfernen.
31
Lichtmikroskopie von Mikroorganismen
a) Mikroorganismen in Flüssigkultur gewachsen:
- Kultur mit Wasser so stark verdünnen, bis eine leicht trübe Suspension erhalten wird.
- Einen kleinen Tropfen davon mit Pasteurpipette auf einen sauberen Objektträger geben.
- Deckglas auflegen, sodass möglichst keine Luftblasen eingeschlossen werden.
- Mit Kleenex-Tüchlein falls notwendig überschüssige Flüssigkeit absaugen (zwischen
Objektträger und Deckglas soll lediglich ein dünner Wasserfilm liegen).
- Das Präparat sofort im Phasenkontrastmikroskop untersuchen.
b) Mikroorganismen auf Agarmedium gewachsen:
- Einen kleinen Tropfen Wasser auf einen sauberen Objektträger geben.
- Wenig Zellmaterial mit Zahnstocher oder Öse von der Platte wegkratzen und im
Wassertropfen verreiben, bis eine leicht trübe, möglichst homogene Suspension entstanden ist.
- Deckglas auflegen, sodass möglichst keine Luftblasen eingeschlossen werden.
- Mit Kleenex-Tüchlein falls notwendig überschüssige Flüssigkeit absaugen.
- Das Präparat sofort im Phasenkontrastmikroskop untersuchen.
Frage 5.1: Wie kann man die gesamte Vergrösserung eines Mikroskops ausrechnen? ANTWORT:
ANTWORT:
5.2. Einführung in die Diagnostik
Die Bestimmung eines unbekannten Mikroorganismus ist aufwendig und nimmt viel Zeit in Anspruch,
da man nicht, wie zum Beispiel bei Pflanzen, allein auf morphologische Kriterien abstellen kann.
Aufgrund morphologischer Kriterien lässt sich allerdings meistens bereits beurteilen, ob es sich beim
vorliegenden Mikroorganismus um einen Pilz oder um ein Bakterium handelt. Unter den Bakterien
lässt sich im Lichtmikroskop zwischen Kokken, Stäbchen und Spirillen unterscheiden oder, sofern man
ein geeignetes Nährmedium verwendet, sagen, ob der vorliegende Organismus zu den Sporenbildnern
gehört. Ein sehr wichtiges taxonomisches Merkmal für Bakterien ist ihre Gram-Reaktion. Mit Hilfe der
Gram-Färbung teilt man sämtliche Bakterien entweder in die Gruppe der Gram-negativen oder der
Gram-positiven ein. Die nächsten Schritte in der Bestimmung umfassen das Prüfen von
verschiedensten physiologischen und biochemischen Eigenschaften; z.B. Verwertung von Zuckern,
Aminosäuren sowie diverser anderer Stoffe als C- oder N-Quellen, Gas- oder Säurebildung unter
definierten Wachstumsbedingungen, die Fähigkeit anaerob zu wachsen, die Resistenz oder
Empfindlichkeit gegenüber antibakteriellen Stoffen.
Für Mikroorganismen, die in der Lebensmittelmikrobiologie oder vor allem in der Medizin eine
wichtige Rolle spielen, werden von verschiedenen Firmen Testsysteme angeboten. Diese Systeme
umfassen Wachstumstests auf verschiedensten Selektivnährböden, Enzym- und Antikörpertests.
32
In unserem Kurs wird mit einem solchen Testsystem, den Diagnostik-Tubes von Roche, gearbeitet. Die
in den Testsystemen integrierten Agarmedien sind so konzipiert, dass mit minimalem Aufwand an
Material und Zeit grössere Serien zeitgerecht durchgetestet werden können. Der Gebrauch dieser
Diagnostik-Tubes garantiert allerdings nur dann korrekte Ergebnisse, wenn die folgenden
Voraussetzungen erfüllt sind:
- nur Reinkulturen testen
- nur mit frischen Kulturen arbeiten
- einen unbekannten Mikroorganismus erst dann auf Diagnostik-Tubes impfen, wenn alle
vorgeschriebenen Vortests (z.B. Gramfärbung, Oxidasetest) durchgeführt wurden
Diagnostikversuche
Es werden mit Mikroorganismen bewachsene Agarplatten ausgeteilt, die mit Buchstaben
gekennzeichnet sind. Auf jeder Platte soll der Mikroorganismus bestimmt werden.
Wir gehen bei der Bestimmung nach der in den Tabellen 1 und 2 (am Ende dieses Kapitels)
aufgeführten Reihenfolge vor. Die Resultate der Beobachtungen und der verschiedenen Tests sollen
laufend in die Tabelle 3 (am Ende dieses Kapitels) eingetragen werden.
Versuch 1: Makroskopische Beurteilung
Von Auge werden die auf den Agarplatten gewachsenen Kolonien beurteilt. Man beachte vor allem
eventuell vorhandene Mycelbildung sowie Farbe und Morphologie der Kolonien. Die Aussagekraft ist
in der Regel gering.
Versuch 2: Mikroskopische Beurteilung
Von jeder Kultur wird ein Nativpräparat hergestellt. Zellform, Zellgrösse und das Vorhandensein von
Zellkernen bzw. von Vakuolen wird beurteilt.
Versuch 3: Gramfärbung und Wachstum auf MacConkey Agar
Bekanntlich lassen sich Bakterien aufgrund der Beschaffenheit ihrer Zellwand in Gram-positive und
Gram-negative einteilen. Die Gram-Färbung liefert in der Praxis nicht immer eindeutige Resultate,
denn die Übergänge von rot zu violett sind häufig recht fliessend. Es ist daher unerlässlich,
Referenzstämme mitzuführen. Die Gramfärbung muss immer mit jungen Kulturen, welche auf
Vollmedium angezogen wurden, durchgeführt werden. Es ist wichtig, nicht zuviel Zellmaterial auf den
Objektträger zu streichen, denn grössere Zellklumpen halten trotz gutem Waschen soviel Kristallviolett
zurück, dass eine Kultur fälschlicherweise leicht als Gram-positiv klassiert wird.
In der medizinischen Mikroorganismen-Diagnostik nimmt die Gramfärbung noch immer eine zentrale
Stellung ein. Vielfach wird jedoch durch geeignete Isolationsverfahren direkt für Gram-negative
Bakterien selektioniert. Diese Verfahren beinhalten einen Schritt, bei welchem auf MacConkey Agar
No. 3 plattiert wird. Dieser Agar ist streng selektiv für Gram-negative Organismen, d.h. alle Bakterien,
welche auf diesem Agar wachsen können sind Gram-negativ. Es müssen jedoch nicht alle Bakterien,
33
welche auf dem MacConkey Agar No. 3 nicht wachsen, unbedingt Gram-positiv sein. Einige Arten der
Gram-negativen Gattungen Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium und Pasteurella wachsen nicht
auf MacConkey Agar.
Lösungen und Material:
Kristallviolett
Lugol’sche Lösung
A: 2.0 g Kristallviolett in 20 ml Ethanol
1.0 g Iod
B: 0.8 g Ammoniumoxalat in 80 ml H20 dest.
2.0 g Kaliumjodid
A + B zusammengeben
100 ml H2O dest.
Safraninlösung
2.5 g Safranin, gelöst in 100 ml Ethanol 95%ig, (Stocklösung).
Von der Stocklösung 10ml in 100 ml H20 dest. aufnehmen.
1 MacConkey No. 3 Agarplatte
Vorgehen:
Mit jenen Organismen, welche im Mikroskop als Bakterien erkannt wurden, wird die Gramfärbung
durchgeführt:
1. Zellmaterial aus einer frischen Bakterienkultur wird mit der Öse oder mit einem
Zahnstocher auf einem sauberen Objektträger mit wenig Wasser verstrichen.
2. Der Ausstrich wird luftgetrocknet.
3. 1 Minute mit Kristallviolett färben.
4. Waschen mit Wasser.
5. Ausstrich 1 Minute mit Lugol'scher Lösung beizen.
6. Präparat vorsichtig mit Alkohol-Aceton (1 : 1) Lösung waschen.
7. Sofort mit indirektem Wasserstrahl waschen.
8. 30 Sekunden mit Safranin gegenfärben.
9. Waschen mit indirektem Wasserstrahl.
10. Ausstrich lufttrocknen.
11. Im Mikroskop unter Hellfeld-Einstellung, 100xObjektiv (Immersionsöl) betrachten.
12. Gram-negative erscheinen rötlich, Gram-positive sind blau-violett.
Es können Gram-positive und Gram-negative Organismen auf dem gleichen Objekträger und sogar als
Mischsuspension gefärbt werden.
Die ausgeteilte MacConkey Agarplatte wird in Zonen eingeteilt. Jede dieser Zonen wird mit wenig
Zellmaterial einer Bakterienkultur beimpft. Nach 24-48 h Inkubation bei 37°C kann die Auswertung
erfolgen. MacConkey Agar, der unter anderem Gallensalze enthält, erlaubt nur Wachstum von Gramnegativen Keimen.
34
Versuch 4: Der Oxidasetest
Wie aus Tabelle 5.2 hervorgeht, nimmt der Oxidasetest bei der Differenzierung der Gram-negativen
Bakterien eine zentrale Stellung ein. Mit diesem recht einfachen Test wird geprüft, ob das zu
untersuchende Bakterium Cytochrom vom c-Typus besitzt oder nicht.
Die Energiegewinnung durch Atmung ist für Eukaryonten, wo sich dieser Vorgang in den
Mitochondrien abspielt, sehr gut untersucht worden. In den Mitochondrien findet man immer
gleichzeitig Cytochrom vom a-, b- und c-Typus. Prokaryotische Zellen besitzen keine Mitochondrien.
Das Funktionieren der Atmungskette gewährleisten hier unter anderem Enzyme und Elektronenträger,
die sich von jenen der Eukaryonten unterscheiden.
Der Cytochrom c-Nachweis im Oxidasetest wird mit N,N,N’,N’-Tetramethyl-p-phenylendiamin
durchgeführt. Das Redoxpotential dieses leicht oxidierbaren Reagens liegt gerade so, dass es seine
Elektronen mit hoher Effizienz an Cytochrom c abgeben kann. Das so oxidierte Reagens ist im
Gegensatz zur reduzierten Ausgangsform kräftig blau.
Zur Reaktion:
1. Schritt
H3C
CH3
N
H3C
N
H3C
CH3
CH3
H3C
farblos
+ 2 e-
N
N
CH3
blau
2. Schritt
Cytochrom c (oxidiert) + 2 e-
→
Cytochrom c (reduziert)
Vorgehen:
Der Oxidasetest wird mit den Gram-negativen Bakterienkulturen wie folgt durchgeführt:
Ein Filterpapier wird leicht angefeuchtet. Dann wird eine Impföse mit Bakterienmaterial auf den Filter
auftragen. Ein Tropfen Reagens wird auf die Bakterien gegeben. Tiefe Blaufärbung in 10 sec = positive
Reaktion.
Versuch 5: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-positiven Bakterien
Mit dem "Oxi/Ferm-Tube" wird der Gram-negative, Oxidase-positive Bakterienstamm beimpft (siehe
Tabelle 5.2) und bei 37°C inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach 24 Stunden.
Versuch 6: Differenzierung der Gram-negativen, Oxidase-negativen Bakterien
Im nächsten Schritt werden Enterotubes mit dem Oxidase-negativen Bakterienstamm beimpft und bei
37°C inkubiert. Die Auswertung erfolgt nach 24 Stunden.
35
Tabelle 5.1:
VORGEHEN BEI DER BESTIMMUNG EINES UNBEKANNTEN AEROBEN
MIKROORGANISMUS
Herstellen einer Reinkultur
mycelbildende Pilze
makroskopische Beurteilung:
Mycelbildung?
JA
Actinomyceten
(Strahlenpilze) = Bakterien
NEIN
mikroskopische Beurteilung:
Vermehrung durch Sprossung bzw
Teilung?
Grosse, kompartimentierte Zellen?
JA
Spross- bzw Spalthefen
NEIN
JA
Sporenbildung?
Bacillus-Arten
NEIN
JA
Gram-Färbung durchführen.
Färbung?
gram-positive Bakterien
Zellformen / verschiedene
Selektiv-Agars
NEIN
Gram-negative Bakterien
(weiteres Vorgehen: Tabelle 5.2)
2)
Bacillen, Corynebakterien,
Kokkenförmige,
Milchsäurebakterien,
Propionibakterien
36
Tabelle 5.2:
BESTIMMUNG VON GRAM-NEGATIVEN, AEROBEN BAKTERIEN
Kolonien auf Universal- (1) oder MacConkey-Agar (2)
Oxidase-Test (3)
+
-
Beimpfung von “Oxi/Ferm-Tube” (4)
Beimpfung von “Entero-Tube” (5)
Anaerobe Dextrosereaktion
Dextrosereaktion
+
Aeromonas-Spezies
Plesiomonas-Spezies
Vibrio-Spezies
Flavobacterium-Spezies
Pseudomonas-Spezies
Pseudomonas aeruginosa
Moraxella-Spezies
Alcaligenes-Spezies
Achromobacter-Spezies
Bordatella bronchiseptica
Pasteurella-Spezies
+
Enterobacteriaceae
-
Pseudomonas maltophilia
Pseudomonas mallei
Acinetobacter anitratus (Herellea)
Acinetobacter lwoffii (Mima)
(1) z.B. “Bact-Plate” ST Roche mit anschliessender Gram-Färbung.
(2) z.B. “Bact-Plate” MC Roche zur Isolierung gram-negativer Keime.
Einige Arten der Gattung Moraxella, Pseudomonas, Flavobacterium und Pasteurella
wachsen nicht auf MacConkey-Agar.
(3) Oxidasereagens “Roche”.
(4) Gebrauchsfertige „Bunte Reihe“ zur Identifizierung von gram-negativen, aeroben
Bakterien
(5) Gebrauchsfertige “Bunte Reihe” zur Identifizierung der Enterobacteriaceae.
37
Tabelle 5.3:
ZUSAMMENFASSUNG DER RESULTATE AUS DEN DIAGNOSTIK-VERSUCHEN
Stamm
A
B
C
D
E
F
G
H
Morphologie
Morphologie
Gram-
Wachstum
Oxidase- Bestimmt als:
makroskopisch:
mikroskopisch:
Färbung
auf
Test
Wachstum,
Zellform, Grösse,
MacConkey-
Kolonieform
Beweglichkeit
Agar
6. ANTIMIKROBIELLE WIRKSTOFFE
38
6.1. Antibiotika und Chemotherapeutika
Einführung
Unter den vielen Mikroorganismen gibt es eine relativ geringe Zahl, die pathogene Eigenschaften
gegenüber Mensch, Tier oder Pflanzen besitzen. Ihre Bedeutung in der medizinischen Mikrobiologie
und in der Phytomedizin nimmt einen hohen Stellenwert ein. Mit den Antibiotika und
Chemotherapeutika verfügt man über antimikrobielle Wirkstoffe, die zur Bekämpfung von
Infektionskrankheiten eingesetzt werden können. Die Basis bilden die Antibiotika, die von
Mikroorganismen produziert werden. Chemotherapeutika sind synthetische Verbindungen mit
antimikrobiellen Eigenschaften, wobei der Übergang zu den Antibiotika fliessend ist, da eine Reihe
von Antibiotika chemisch modifiziert werden, um ihre Wirkung zu erhöhen oder zu stabilisieren.
Die meisten Mikroorganismen, die Antibiotika als Sekundärmetaboliten ausscheiden, gehören zur
Gruppe der Aspergillales (Pilze), zu den Actinomyceten und zu einigen anderen Bakterien.
Tausende von antimikrobiellen Wirkstoffen sind untersucht worden. Für therapeutische Anwendungen
eigenen sich aber nur wenige Verbindungen. Trotzdem verfügt die Medizin über eine Palette von
Antibiotika und Chemotherapeutika, um durch Bakterien und Pilze verursachte Infektionen zu
bekämpfen. Dosierung und Dauer der Therapie sind so zu wählen, dass die Infektionserreger alle
abgetötet werden. Bei einer nur teilweisen Elimination des Krankheitserregers kann es zur
Resistenzbildung kommen.
Mikroorganismen, die an ihren Standorten im Ökosystem Antibiotika produzieren, haben einen
wichtigen Vorteil, indem sie andere Organismen in der Entwicklung hemmen oder gar blockieren.
Daraus resultiert eine erhöhte Verfügbarkeit von Nährstoffen. Bedingung ist allerdings, dass die
Antibiotikaproduzenten gegenüber ihren eigenen Wirkstoffen unempfindlich sind. Hier liegt der
Ursprung der Resistenz, indem die betreffenden Gene auf andere Mikroorganismen übertragen werden
können.
Die Resistenz gegenüber Antibiotika und Chemotherapeutika ist zu einem Hauptproblem der Medizin
geworden. Die Mehrzahl der Resistenzen sind plasmidcodiert und werden leicht von dem einen auf den
anderen Mikroorganismus übertragen. Die plasmidbedingten Antibiotikaresistenzen beruhen auf
chemischer Modifikation des antimikrobiellen Wirkstoffes. So wird zum Beispiel Chloramphenicol
acetyliert oder Penicillin wird durch Penicillinase gespalten. Eine Anhäufung von resistenten
Mikroorganismen ist insbesondere in Spitälern zu finden.
Im Kurs wird die Wirkung einiger Antibiotika und Chemotherapeutika untersucht. Auf den folgenden
beiden Seiten sind die Wirkstoffe, mit welchen gearbeitet wird, dargestellt. Neben den Antibiotikas und
Chemotherapeutikas gibt es eine Reihe weiterer, antimikrobieller Wirkstoffe; als Beispiel werden im
Kurs Gewürze und tierische (menschliche) Sekrete auf ihre antimikrobielle Wirkung getestet. In
letzterem Fall beruht die Wirkung auf einem Enzym, dem Lysozym, das das Murein in der Zellwand
von Bakterien spalten kann.
39
40
Kanamycin und Derivate
41
Aminoglykosid-Antibiotikum mit breitem
Wirkungsspektrum gegen Bakterien. Wird in der
Humanmedizin vor allem zur lokalen Behandlung
von bakteriellen Augeninfektionen eingesetzt.
Bindet an die 30S Untereinheit des bakteriellen
Ribosoms und hemmt so die Proteinbiosynthese.
Bestimmte Derivate wie Geneticin (G418)
hemmen auch die eukaryontische
Proteinbiosynthese. Kanamycin wird vom
Actinomyceten Streptomyces kanamyceticus
synthetisiert.
Versuch 1: Pilze als Antibiotika-Produzenten
Das erste industriell produzierte Antibiotikum, Penicillin, wurde 1928 durch Zufall von Alexander
Fleming entdeckt und läutete ein neues Zeitalter in der Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten ein. Fleming erhielt 1945 für seine Entdeckung den Nobelpreis in Medizin. Penicillin wird
nicht von Bakterien sondern vom Pinselschimmel (filamentöser Pilz, siehe Kap. 11), Penicillium
chrysogenum (notatum), produziert.
In diesem Versuch soll die Penicillin-Produktion durch Penicillium chrysogenum (notatum) anhand der
Wirkung auf das Wachstum von E. coli demonstriert werden.
Material:
- 1 LBG-Agarplatte mit Penicillium chrysogenum
- 1 Reagenzröhrchen mit 7 ml LBG-Weichagarmedium (im Wasserbad)
- Eppendorfröhrchen mit Ampicillin-Stocklösung (100 mg/ml)
- Sterile Filterrondellen
- Flüssigkultur von E. coli (gram-negativ)
Ausführung
Wie in Versuch 1 100 l Bakterien in Weichagarmedium auf die Agarplatte verteilen. 2 Filterdisks mit
20 l H2O bzw. Ampicillin bestücken und mit steriler Pinzette gemäss untenstehendem Schema auf die
Platten legen. Platte 2 Tage bei 30°C inkubieren.
Auswertung:
Zeichne in untenstehendem Schema die erhaltenen Hemmhöfe ein.
42
FRAGEN 6.1: Weshalb sind wohl gerade filamentöse Mikroorganismen (Streptomyceten, Pilze) so
bedeutende Antibiotikaproduzenten? ANTWORT:
Versuch 2: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von zwei Antibiotika
In Reagenzgläsern, die Komplexmedium enthalten, werden Verdünnungsreihen mit 2 verschiedenen
Antibiotika vorbereitet. Diese werden nun mit B. subtilis (Gram-positiv) angeimpft und bei 30°C
inkubiert. Röhrchen, bei denen die Antibiotikum-Konzentration zu gering ist, um den Organismus
abzutöten, werden nach einigen Stunden trüb, d.h. Bakterien können sich noch vermehren. Ist die
Konzentration jedoch so gross, dass der Organismus abstirbt, bleibt das Röhrchen klar. Die minimale
Hemmkonzentration ist dann bei dem Reagenzglas zu finden, das gerade keine Trübung mehr zeigt.
Material:
- 2 Antibiotika-Stammlösungen
(Konzentration)
Streptomycin
(6,25 mg/ml)
Chloramphenicol
(0,1 mg/ml)
- 11 kurze, sterile Reagenzgläser
- Flüssigkultur von B. subtilis
- Schottflaschen mit LBG-Flüssigmedium aus Versuch 1.1
Ausführung:
Sterile Reagenzgläser mit je 4 ml LBG-Flüssigmedium bestücken. 1 ml Antibiotika-Stammlösung in
Reagenzglas (RG) 1 geben, dann eine 4-Schritt-Verdünnung durchführen gemäss untenstehendem
Schema d.h. 1 ml aus RG 1 in RG 2 transferieren. Mit dem Vortex gut mischen. Dann 1 ml aus RG 2 in
RG 3 geben usw. Bei 2 Antibiotika gibt das 10 Röhrchen, die je 4 ml Flüssigkeit enthalten.
43
Wichtig: Vor dem Beginn des Versuchs sind sämtliche Röhrchen mit der notwendigen Information
(Verdünnung, Antibiotikum) zu beschriften inkl. eines Röhrchens ohne Antibiotikum als Kontrolle (K).
Verdünnungsschema
Antibiotikas tammlösung
0
1 ml
1 ml
K
1
1 ml
1 ml
1 ml
2
3
4
5
enthalten je 4 ml Medium
Verdünnung en:
Kontrolle
1:5
1:25
1:125
1:625
1:3125
Nach der Verdünnungsreihe alle Röhrchen mit 1 Tropfen (50 l) Bakterienkultur animpfen. Als
Kontrolle wird ein Röhrchen mit der entsprechenden Bakterienkultur ohne Antibiotikum beimpft. Nach
24 h Inkubation bei Raumtemperatur lassen sich die Trübungsgrenzen leicht von Auge feststellen.
Auswertung:
Mit Hilfe der nachstehenden Tabelle sind die minimalen Hemmkonzentrationen zu ermitteln.
Konzentrationstabelle (Beachten Sie die verschiedenen Konzentrationen der Stammlösungen):
Reagenzglas Nr.
0 = Stammlösung
1
2
3
4
5
Konz. und Einheiten
1:5
1:25
1:125
1:625
1:3'125
Streptomycin
6250 µg/ml
1'250
250
50
10
2
Chloramphenicol
100 µg/ml
200
40
8
0.16
0.03
Antibiotikum
Wachstum: + = Wachstum, - = kein Wachstum
44
B. subtilis (Gram-positiv)
Antibiotikum
Reagenzglas
K
1
2
3
4
5
Streptomycin
Chloramphenicol
Versuch 3: Unterschiedliche Empfindlichkeit von gram-positiven und gramnegativen Bakterien sowie Bäckerhefe gegenüber einer Auswahl von Antibiotika
Der unterschiedliche Zellaufbau von gram-positiven und gram-negativen Bakterien sowie von Hefe ist
verantwortlich für die unterschiedliche Empfindlichkeit dieser Organismen gegenüber bestimmten
Antibiotika. Dieser Unterschied soll an den Organismen B. subtilis (gram-positiv), E. coli (gramnegativ) und S. cerevisiae (Bäckerhefe) und den Antibiotikas Polymyxin B, Erythromycin und
Geneticin (G418) demonstriert werden.
Material:
- 2 LBG-Agarplatten
- 1 YPD-Agarplatte
- 2 Reagenzröhrchen mit 7 ml LBG-Weichagar
- 1 Reagenzröhrchen mit 7 ml YPD-Weichagar
- Flüssigkulturen von B. subtilis, E. coli und S. cerevisiae
- Sterile Filterrondellen
- steriles H2O
- Stocklösungen von Polymyxin B (0.15 mg/ml in H2O), Erythromycin (1 mg/ml in EtOH) und G418
(50 mg/ml in H2O)
Vorgehen:
Je 100 l Bakterien- bzw. Hefesuspension in Weichagar auf die 3 Agarplatten verteilen - für die
Bakterien LBG, für die Hefe YPD verwenden. Je 4 Filterdisks mit 20 l H2O, Polymyxin B (PB),
Erythromycin (Em) bzw. G418 bestücken und mit steriler Pinzette gemäss untenstehendem Schema auf
die Platten legen. Platten 2 Tage bei 30°C inkubieren.
Auswertung:
Zeichne in untenstehendem Schema die Hemmhöfe ein. Erkläre aufgrund der in der Einleitung
beschriebenen Wirkstoffe die erhaltenen Resultate:
45
H2O
PB
H2O
PB
H2O
PB
Em
G418
Em
G418
Em
G418
E. coli
B. subtilis
S. cerevisiae
FRAGE 6.2: Welches der drei getesteten Antibiotika kann wohl für die Behandlung von mikrobiellen
Infektionen beim Menschen nicht eingesetzt werden und warum? ANTWORT:
Versuch 4: Sulfonamid-Versuch
Bei der Behandlung von bakteriell verursachten Krankheiten spielen neben den Antibiotika die
Sulfonamide eine wichtige Rolle. Sulfonamide (eingeführt um 1935) werden im Gegensatz zu den
Antibiotika rein synthetisch hergestellt. Ihre Wirkungsweise beruht auf der Strukturähnlichkeit mit der
p-Aminobenzoesäure (PABA), die von Mikroorganismen für die Synthese von Tetrahydrofolsäure
(THF) benötigt wird. Dabei verdrängen die Sulfonamide das natürliche Substrat PABA von der aktiven
Stelle der Dihydropteroat-Synthese (kompetitive Hemmung) und verhindern so die Bildung von
Dihydropteroat. Diese Hemmung kann durch einen Überschuss von PABA aufgehoben werden
(Darstellung auf übernachster nächste Seite).
Da, wie zu erwarten, Resistenz gegen Sulfonamide auftritt, wurde ein weitere Hemmstoff der THFSynthese eingeführt, um die bakterizide Wirkung zu verstärken und die Entwicklung von resistenten
Keimen zu erschweren. Dies gelang mit Trimethoprim, einem spezifischen Hemmstoff der bakteriellen
Dihydrofolsäure-Reduktase. Beide Wirkstoffe sind im Medikament "Bactrim" (Roche) vereinigt, wobei
Sulfomethoxazol die Sulfonamidkomponente ist. Die Wirkungen der beiden Komponenten potenzieren
sich, d.h. ihr Effekt ist mehr als additiv (Synergismus).
Sulfonamide üben auf menschliche Zellen nur eine geringe Wirkung aus, da diese THF nicht
synthetisieren können, sondern auf die Zufuhr von Folsäure angewiesen sind. Bei längerer Behandlung
durch "Bactrim" kann Folsäuremangel auftreten, da ein grosser Teil der vom Menschen
aufgenommenen Folsäure von den Darmbakterien produziert wird.
Mit Hilfe des Disktests soll Folgendes geprüft werden:
- bakterizider Effekt von Sulfomethoxazol, Trimethoprim und Bactrim
- Synergismus der beiden Komponenten von Bactrim
- Antagonismus von p-Aminobenzoesäure
46
Dazu werden kleine Scheiben, imprägniert mit den Chemotherapeutika und p-Aminobenzoesäure, auf
Agar gelegt, der mit einem Bakterium beimpft wurde. Die Empfindlichkeit kann anhand der
Hemmzonen abgelesen werden.
Material:
- E. coli-Flüssigkultur (LB-Vollmedium)
- 3 Petrischalen mit Minimalmedium (MME) für E.coli
- 3 Reagenzgläser mit je 7 ml MME-Weichagar
- Filterrondellen mit Sulfomethoxazol (RL), Trimethoprim (W) und Bactrim (SXT)
- p-Aminobenzoesäure (PABA) 0.1 mg/ml (steril)
- sterile Filterrondellen
Vorgehen:
- 100 µl der Bakteriensuspension (vor Gebrauch schütteln) steril in das Röhrchen mit flüssigem
Weichagar (auf 55°C erwärmt) geben
- Weichagar auf MME-Platte giessen, Platten sofort leicht schwenken und erstarren lassen
- Sterile Filterrondellen mit 20 µl p-Aminobenzoesäure-Lösung bestücken und Rondellen mit
abgeflammter Pinzette auf Bakterienagar legen (vgl. Skizze)
- Platte bei 37°C über Nacht inkubieren
Auswertung:
Zeichne die beobachteten Hemmhöfe in der unteren Abbildung ein. Wie äussern sich der Synergismus
und der Antagonismus im Hemmhoftest?
Platte 2: Trimethoprim (W)
Platte 1: Sulfomethoxazol (RL) und
p-Aminobenzosäure (PABA)
PABA
RL
Platte 3: Bactrim (SXT)
SXT
W
47
FRAGE 6.3: Worauf beruht die Spezifität der Sulfonamide d.h. warum wirken Sulfonamide nur auf
bakterielle und nicht auch menschliche Zellen? ANTWORT:
48
6.2. Antimikrobielle Pflanzeninhaltsstoffe und bakterielle Botenstoffe
Versuch 5: Antimikrobielle Wirkung von Senf und Knoblauch
Nicht nur Antibiotika und Chemotherapeutika, sondern auch Bestandteile von Gewürzen
habenantimikrobielle Wirkung. Es ist kein Zufall, dass in Küchen von Ländern, die klimatisch (warm,
feucht) dem Wachstum von Mikroorganismen (und gewissen Gewürzen) entgegenkommen - Beispiele
sind die Türkei, Indien und Thailand - der Gebrauch von scharfen Gewürzen viel verbreiteter ist als in
der mittel und nordeuropäischen Küche. Gewürze mit nachgewiesener antimikrobieller Wirkung sind
etwa Senf, Knoblauch, Chilischoten und Gewürznelken. Es wird vermutet, dass sekundäre
Pflanzenstoffe wie Phenole, Flavonoide und Carotinoide dabei eine Rolle spielen. Die Inhaltsstoffe
greifen die mikrobielle Cytoplasmamembran an und stören so den Stoffaustausch der Zelle mit der
Umgebung.
Im folgenden Versuch soll die antimikrobielle Wirkung von Senf und Knoblauch demonstriert werden.
Material: (pro 2er Gruppe)
- leere Petrischale
- 2 LBG-Agarplatten, 1 YPD-Agarplatte
- 2 Röhrchen mit LBG-Weichagar, 1 Röhrchen mit YPD-Weichagar
- E. coli-, B. subtilis- und S. cerevisiae-Flüssigkulturen
- frischer Knoblauch
- Senf aus der Tube (scharf)
- Knoblauchpresse
- Pasteurpipetten
Vorgehen:
- Der bei 60°C flüssig gehaltene LBG- bzw. YPD-Weichagar wird mit 100 l Flüssigkultur von E. coli
oder B. subtilis bzw. S. cerevisiae (vor Entnahme auf Vortex resuspendieren) versetzt, auf Vortex gut
gemischt, auf die (temperierte) LBG- bzw. YPD-Agarplatte gegossen und durch Kreisen der Platte auf
der Arbeitsfläche gleichmässig verteilt. Die Platten werde zum Erstarren des Weichagars beiseite
gestellt.
- Die Knoblauchzehen werden mit der Knoblauchpresse in die leere Petrischale zerdrückt.
- Mit dem hinteren Ende einer Pasteurpipette (zwischen verschiedenen Platten wechseln oder kurz
abflammen) werden in jede der 3 Platten zwei Löcher gestanzt. Dieses wird mittels einer sterilisierten
Pinzette mit zerdrücktem Knoblauch bzw. Senf aus der Tube gefüllt.
- Die Platte wird über Nacht bei 30°C inkubiert.
Auswertung:
Eine klare Zone um das mit Senf oder Knoblauch gefüllte Loch auf dem ansonsten durch das
Wachstum der Mikroorganismen getrübten Weichagar zeigt die Anwesenheit von antimikrobiellen
Substanzen an. Zeichne die erhaltenen Hemmhöfe in untenstehendem Schema ein:
49
Versuch 6: Quorum Sensing von Bakterien
Gram-negative und gram-positive Bakterien der gleichen und sogar von verschiedenen Arten können
über chemische Botenstoffe miteinander kommunizieren. Man nennt diese Art der Kommunikation
"Quorum sensing", da die Antwort der Bakterien auf diese Botenstoffe von der Konzentration der
Botenstoffe im Medium und somit von der Zahl der Botenstoff-sekretierenden Zellen abhängt. Über
Quorum Sensing regulierte bakterielle Phänomene sind u.a. Bioluminiszenz, Virulenz, Konjugation,
Transfer von mobiler DNA, Antibiotika-Synthese oder Biofilmbildung. Da die Pathogenizität von
Bakterien oft mit Biofilmbildung gekoppelt ist (was die Bekämpfung mit Antibiotikas erschwert)
verspricht man sich für die Bekämpfung von Bakterien einiges von einem kombinierten Einsatz von
Antibiotika mit Substanzen (z.B. aus Knoblauch), die mit dem Quorum Sensing der pathogenen
Bakterien interferieren.
In einem einfachen Experiment demonstrieren wir die Kommunikation zwischen zwei verschiedenen
Arten von gram-negativen Bakterien, Serratia liquefaciens und Chromobacterium violaceum, die
dieselbe chemische Sprache sprechen. Die Kommunikation wird sichtbar über die Quorum Sensingabhängige Bildung eines violetten Pigments (Violacein) im verwendeten Chromobacterium violaceumStamm, der seinerseits in der Bildung des eigenen Quorum Sensing Botenstoffs (Acyl-HomoserinLacton, AHL) defekt ist.
Material pro 2er-Gruppe:
- 1 LBG Agar Platte
- Platte mit Serratia liquefaciens
- Platte mit Chromobacterium violaceum
Vorgehen:
C. violaceum Zellen werden entsprechend dem untenstehenden Schema auf einer LBG Platte dicht
beieinander liegend ausgestrichen. S. liquefaciens wird anschliessend im 90° Winkel bis zum C.
50
violaceum Ausstrich aufgetragen, so dass sich die beiden Ausstriche beinahe berühren. Die Zellen
S. liquefaciens
C. violaceum
werden mehrere Tage bei RT inkubiert.
Auswertung:
Zeichne die beobachtete Region der Verfärbung von C. violaceum in obigem Schema ein.
FRAGE 6.4: Warum ist es wichtig, dass im Experiment ein C. violaceum Stamm verwendet wird, der
in der AHL-Bildung defekt ist? ANTWORT:
6.3. Antimikrobielle Enzyme
Einführung
Lysozym (Muramidase) ist ein weit verbreitetes Enzym, welches das in Bakterienzellwänden
enthaltene Murein auflöst. Lysozym lässt sich auch in Geweben und Sekreten des menschlichen
Körpers nachweisen (Tränen, Nasenschleimhaut, Speichel, Urin, Muttermilch). Lysozym kommt in
Pflanzen vor, und kann auch von Bakterien z.B. nach Infektion mit Phagen produziert werden.
Besonders reichlich ist Lysozym in Hühnereiweiss vorhanden. Sequenz und dreidimensionale Struktur
des Enzyms, das aus 129 Aminosäuren besteht, sind bekannt.
Das Mucopolysaccarid Murein ist das Stützskelett der Bakterienzellwand. Viele Gram-positive
Bakterien, bei welchen das Mureinnetz mehrschichtig vorliegt und den Hauptbestandteil der Zellwand
bildet, werden in hypotonischen Medien durch Lysozym allein aufgelöst. Nach Lysozymeinwirkung,
die den Abbau der Zellwand zur Folge hat, schwellen die nackten Zellen (Protoplasten) an, bis sie
platzen. Nur in iso- und hypertonischer Umgebung sind die kugeligen Protoplasten stabil.
51
Bei Gram-negativen Bakterien macht das Murein bekanntlich nur einen geringen Teil der Zellwand
aus, wobei Lipoproteine und Lipopolysaccharide die äusseren Schichten bilden. Lyse ist bei Gramnegativen Bakterien, z.B. Escherichia coli, somit nur bedingt möglich.
N-Acetyl-Glucosamin (NAG) wirkt als Inhibitor von Lysozym. Es handelt sich um eine kompetitive
Hemmung. NAG wird an derselben Stelle gebunden wie das Substrat Murein, hat jedoch keine
hydrolysierbare Bindung.
Versuch 7: Nachweis von Lysozym-Aktivität
Material:
– Tränenflüssigkeit, Speichel, Hühnereiweiss
– 6 kurze RG mit 0.9 ml Pufferlösung (Natriumphosphatpuffer, 0.1 M, pH 6.0)
– Micrococcus luteus (Gram-positiv)-Suspension als Indikatorbakterium (2.0 mg/ml)
Vorgehen:
- Tränenflüssigkeit, Speichel oder Hühnereiweiss nach untenstehendem Schema verdünnen (1
Röhrchen als Nullkontrolle ohne Lysozymquelle). Tränen durch Zerhacken von Zwiebeln erzeugen. 3
Tropfen Tränen entsprechen ca. 0.1 ml. Eiweiss nach Aufbrechen des Eis in Petrischale geben und mit
Pipette, die eine genügend grosse Öffnung aufweist, 0.1 ml aufnehmen. Die Öffnung von
Pipettenspitzen lässt sich durch Abschneiden mit einer Schere vergrössern.
- Zu allen 6 Röhrchen 0.1 ml Micrococcus luteus (Gram-positiv)-Suspension geben
- Nach 60 min auf Raumtemperatur bestimmen, bei welchen Verdünnungen das Röhrchen klar wird,
d.h. eine Lyse stattfindet.
Arbeitsschema:
RG1
RG2
RG3
RG4
RG5
+ RG0 (Nullkontrolle ohne Antibiotikum)
52
Auswertung:
Schätze aufgrund der Resultate in der Grossgruppe den relativen Lysozymgehalt der 3 Quellen:
Quelle
Lysozymgehalt (+++ / ++ / +)
Tränenflüssigkeit
Speichel
Hühnereiweiss
Frage 6.5: Warum wirkt Lysozym auch auf stationäre Zellen und Penicillin nur auf wachsende Zellen?
ANTWORT:
7. MIKROBIELLE GENETIK
53
Einführung
Die Weitergabe von genetischer Information an die Nachkommen im Rahmen der Vermehrung eines
Organismus bezeichnet man als vertikalen Gentransfer („Vererbung“). Eukaryontische Organismen –
wie z.B. die zu den Mikroorganismen gehörenden Pilze (siehe Kap. 10) - rekombinieren im Rahmen
der sexuellen Vermehrung ihr ganzes Genom und die Individuen zeichnen sich deshalb durch eine
grosse genetische Variabilität aus. Bei den sich durch mitotische Zellteilung (asexuelle Vermehrung)
vermehrenden Prokaryonten wird die Erbinformation in der Regel unverändert an die nächste
Generation weitergegeben. Zusätzlich zum vertikalen Gentransfer kann genetische Information auch
zwischen Individuen derselben Generation einer bestimmten Art oder sogar zwischen Individuen
unterschiedlicher Arten ausgetauscht werden (horizontaler Gentransfer). Bei Bakterien lassen sich
dabei drei verschiedene Übertragungsmechanismen unterscheiden: Konjugation, Transformation und
Transduktion. Bei all diesen Mechanismen ist es für die Vererbung an die nächste Generation
entscheidend, dass die transferierte DNA in der Empfängerzelle repliziert wird z.B. indem die DNA als
episomales genetisches Element (Plasmid) mit eigenem Replikationsursprung vorliegt oder durch
Rekombination ins Wirtschromosom integriert wird.
Konjugation, R- und F-Plasmide
Der zunehmende Einsatz von Antibiotika seit den 50er Jahren zog eine fast ebenso rasche Verbreitung
von bakteriellen Resistenzen nach sich. Als Resistenz-Transfer-Faktoren wurden so genannte Resistenz
(R)-Plasmide (z.B. RP4, welches Resistenzen gegenüber Ampicillin, Tetrazyklin und Kanamycin
vermittelt) identifiziert. Solche Plasmide, deren Wirtsspektrum oft sehr breit ist, werden mittels
direktem Zell/Zell-Kontakt (bakterielle Paarung oder Konjugation) von einem Bakterium an ein
nächstes weitergegeben. Die genetische Information, welche die Wirtszelle benötigt, um sich mit einer
Empfängerzelle zu paaren und das Plasmid zu übertragen, wird von R-Plasmiden kodiert. Da lediglich
eine Kopie des Plasmids auf die Empfängerzelle übertragen wird und das Original in der Spenderzelle
verbleibt, kann auf diese Weise eine rasche Verbreitung der genetischen Information erfolgen. Die
homologen Fertilitäts (F)-Plasmide tragen in der Regel Plasmidtransfer- aber keine Antibiotikaresistenzgene.
Transformation, Kompetenz
Die Übertragung von freier DNS auf eine Empfängerzelle wird als Transformation bezeichnet. Falls die
aufgenommene DNS der Empfängerzelle einen Selektionsvorteil verschafft, wird die genetische
Information entweder in Form eines Plasmids (nach einer Plasmid-Transformation) an die
nachfolgende Generation weitergegeben oder durch Rekombination in das Genom der Empfängerzelle
eingebaut. Die Entstehung stabiler Rekombinanten hängt von verschiedenen Faktoren ab. Einerseits
muss die Empfängerzelle die Fähigkeit zur Aufnahme und Integration von DNS besitzen (Kompetenz).
Andererseits müssen die transformierenden DNS-Stücke als Doppelstrang vorliegen, da denaturierte
(einzelsträngige) DNS von den Zellen nicht aufgenommen wird. Zudem muss die aufgenommene DNS
gegen Restriktionsenzyme geschützt sein. Diese Enzyme bauen “fremde”, nicht spezifisch methylierte
54
und damit ungeschützte DNS ab. Die Methylierung der DNS ist in allen Bakteriengattungen
verschieden, weshalb die Transformation nur zwischen genetisch verwandten Stämmen überhaupt
möglich ist. Im Labor werden für die in vitro DNS-Transformation Bedingungen so optimiert, dass eine
möglichst hohe Transformationsfrequenz erreicht wird.
Restriktion, Rekombination
Dringt fremde DNS in eine Bakterienzelle ein, werden zwei antagonistische Zellsysteme aktiviert:
Restriktion und Rekombination. Um die eigene DNS von fremder DNS unterscheiden zu können,
modifiziert das Restriktionssystem die zelleigene DNS durch Methylierung nach einem spezifischen
Muster. DNS mit einem anderen Methylierungsmuster wird vom Restriktionsapparat als fremd erkannt
und durch Restriktionsenzyme zerschnitten. Andererseits kann fremde DNS der Zelle möglicherweise
einen Selektionsvorteil verschaffen. In einem solchen Fall kann durch das Rekombinationssystem der
Zelle fremde DNS ins eigene Genom eingebaut werden. Bevorzugt wird dabei DNS, die der eigenen
möglichst ähnlich in Bezug auf Sequenz und Methylierungsmuster aussieht.
Transduktion, Phagen
Die Übertragung von DNS aus einer Spender- in eine Empfängerzelle durch Bakteriophagen
(Bakterien-Viren) wird als Transduktion bezeichnet. Vermehrt ein infiziertes Bakterium A einen
Phagen, so kann versehentlich bakterielle statt Phagen-DNS in die Proteinhülle eines neuen PhagenPartikels verpackt werden. Solche Phagen sind nach wie vor infektiös, da die Infektiosität durch die
Phagen-Proteine bestimmt wird. Die Infektion eines Bakteriums B führt aber nicht zu dessen Lyse, da
die dazu notwendige genetische Information von den Phagen nicht mitgeführt wird. Stattdessen findet
ein horizontaler Transfer von DNS von Bakterium A ins Bakterium B statt.
Verschiedene Typen der Transduktion werden unterschieden. Bei generalisierter Transduktion wird
jedes bakterielle DNS-Stück mit derselben (wenn auch geringen) Häufigkeit übertragen. In einem
System mit spezifischer Transduktion hingegen überträgt ein Phage nur bakterielle Gene, welche sich
unmittelbar neben der Integrationsstelle der Phagen-DNS im Wirtschromosom befinden. Wird die
Phagen-DNS beim Übergang vom temperenten in den virulenten Zustand nicht korrekt aus dem
bakteriellen Chromosom ausgeschnitten, gelangt dann ein Stück chromosomale DNS des
Wirtsbakteriums zusammen mit einem Teil der Phagen-DNS in die Proteinhülle der neuen
Phagenpartikel. Erfolgt bei der Transduktion die Übertragung von mehr als einem Gen, spricht man
von Cotransduktion. Weil durch die vorgegebene Grösse der Proteinhülle eines funktionellen Phagen
nur relativ kleine DNS-Stücke verpackt werden können, gibt die Frequenz der Cotransduktion zweier
Gene Aufschluss über deren Abstand auf dem bakteriellen Chromosom.
IS-Elemente, Transposons
IS-Elemente (insertion sequences) sind kurze DNS-Stücke, die im Erbmaterial “herumhüpfen” können.
Sie bestehen im wesentlichen aus der genetischen Information, die es diesen Elementen erlaubt, sich
selbst auszuschneiden oder zu kopieren und sich an einer anderen Stelle des Genoms (oder in ein
Plasmid) wieder einzubauen. Häufig bilden zwei IS-Elemente zusammen mit einem
dazwischenliegenden Strukturgen ein so genanntes Transposon. Solche mobile genetische Elemente
55
erleichtern somit den Genaustausch zwischen Chromosom und Plasmiden. Vermittelt ein Transposon
eine nützliche Eigenschaft, z.B. eine Antibiotika- oder Schwermetall-Resistenz, kann es sich über einen
der oben vorgestellten Mechanismen schnell verbreiten.
Versuche
Versuch 1: Kreuzung von Bäckerhefe
Einleitung:
Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, auch Bier- oder Weinhefe genannt, hat sich in der
Grundlagenforschung vor allem aufgrund ihrer Genetik als eukaryontischer Modellorganismus mit
Pioniercharakter etabliert. So wurde zum Beispiel 1996 das Hefegenom als erstes eukaryontisches
Genom vollständig sequenziert. Eine sehr praktische genetische Eigenschaft von S. cerevisiae ist ihr
haplo-diploider Lebenszyklus, d.h. ihre Fähigkeit, sich sowohl im haploiden als auch im diploiden
Zustand asexuell (durch Sprossung) zu vermehren (siehe Abb. 7.1). Die stabile Diplophase ist vor
allem bei der Charakterisierung von Mutanten (Komplementationsanalyse) von Vorteil. Hefe besitzt
zwei Paarungstypen („MATing types“), a und alpha, und Paarung (Plasmo- und Karyogamie) findet
nur zwischen Individuen mit unterschiedlichem Paarungstyp statt.
Abb. 7.1: Haplo-diploider Lebenszyklus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).
56
Ziel:
Demonstration der Komplementation von Gendefekten durch entsprechende Wildtyp-Gene des
Paarungspartners im diploiden Zustand sowie die Abhängigkeit der Kreuzung vom Paarungstyp der
Bäckerhefe.
Zum besseren Verständnis einige Bemerkungen zur Nomenklatur des Hefegenoms:
Hefegene werden mit einem Code aus 3 Buchstaben und einer Zahl bezeichnet. Dabei wurde folgendes
vereinbart:
ABC1 = Wildtyp(aktives)-Gen
abc1 = mutiertes(inaktives) Gen
Beispiele sind:
HIS1, HIS3 = Gene für zwei unterschiedliche Enzyme der Histidinbiosynthese
LEU2 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Leucinbiosynthese
URA3 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Uracilbiosynthese
MET15 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Methioninbiosynthese
LYS2 = Gen für ein bestimmtes Enzym der Lysinbiosynthese
Material:
Pro Zweiergruppe:
- 1 YPD-Platte (Hefe-Komplettmedium) mit den folgenden 4 Hefestämmen:
14 (DC14):
MATa
his1 HIS3 LEU2 URA3 MET15 LYS2
17 (DC17):
MATalpha
his1 HIS3 LEU2 URA3 MET15 LYS2
41 (BY4741):
MATa
HIS1 his3 leu2 ura3 met15 LYS2
42 (BY4742):
MATalpha
HIS1 his3 leu2 ura3 MET15 lys2
- 1 leere YPD-Platte
- 2 leere Hefe-Minimalmedium-Platten (MV-Platten)
Vorgehen:
1. Auf der leeren YPD-Platte werden mit der Oese oder sterilen Zahnstochern alle 6 möglichen
Kreuzungen der 4 Hefestämme angesetzt (Kreuzungen K1 bis K6; siehe Schema).
2. Nach 1-2h Kreuzung unter dem Mikroskop durch Suche nach fusionierten Hefezellen überprüfen.
3. Inkubation der Platte für insgesamt 5 Stunden bei Raumtemperatur.
4. Die 6 Kreuzungen sowie die 4 Ausgangsstämme in Sektoren auf den zwei MV-Platten ausstreichen.
Wenig Material auf ganzer Fläche des Sektors ausstreichen!
5. Inkubation der Platten für 2 Tage bei 30°C.
Auswertung:
- Für welche beiden Kombinationen beobachten Sie klares Wachstum auf MV?
- Werden bei gewissen Kombinationen unerwarteterweise einzelne Kolonien beobachtet? Wie könnten
diese Kolonien zustandekommen?
57
Versuch 2: Konjugation von Escherichia coli
Einleitung:
Die Genübertragung durch Konjugation ist bei Escherichia coli entdeckt worden und unter
Enterobakterien sehr häufig. Die Fähigkeit zur Genübertragung in E. coli ist abhängig vom einem
extrachromosomalen Element (Plasmid), dem sogenannten Fertilitäts (F)-Plasmid. Das F-Plasmid
enthält die für den Konjugationsvorgang nötige Gene z.B. die Gene für die sogenannten F-Pili - die
Oberflächenstrukturen, über die die DNA-Uebertragung stattfindet (vgl. Abb. 7.2 links).
Normalerweise wird nur das F-Plasmid selber und keine chromosomale DNA übertragen. Zur
Uebertragung chromosomaler DNA kommt es nach Integration des F-Plasmides ins
Bakterienchromosom. Bei der Konjugation solcher „high frequency of recombination“(Hfr)-Zellen
kommt es mit grosser Häufigkeit zur Rekombination der übertragenen chromosomalen DNA der
Donorzelle mit der chromosomalen DNA der Empfängerzelle. Die Uebertragung der chromosomalen
DNA erfolgt dabei als „rolling circle“ und wird bestimmt durch den Integrationsort und die
Orientierung des integrierten F-Plasmides im Chromosom (H, P801, P4X etc. in Abb. 7.2 rechts). Die
Uebertragung beginnt am Ort des integrierten F-Plasmides entgegengesetzt zu dessen Orientierung d.h.
im Falle von Hfr H werden zuerst die thr- und leu-Biosynthesegene übertragen. Da die
Geschwindigkeit der Uebertragung konstant ist, lassen sich Genloci über die Zeit für den Eintritt in die
Empfängerzelle kartieren. Die Uebertragung des ganzen Chromosoms dauert ca. 100 min. (vgl. Abb.
58
7.2 rechts). Die thr- und leu-Biosynthesegene in Hfr H werden somit innerhalb der ersten 10 min.
übertragen.
Ziel:
Die Uebertragung chromosomaler DNA durch Konjugation soll mittels Rekombination von
chromosomalen Markern der E. coli -Stämme CGSC#259 (HfrH thi-1) und CGSC#7541 (F- leuB6 thr1 StrR thi-1) demonstriert werden.
BEMERKUNG: thi-1, leuB6 und thr-1 zeigen Auxotrophien der entsprechenden Stämme für Thiamin,
Leucin bzw. Threonin an; StrR zeigt eine Resistenz des entsprechenden Stammes gegen Streptomycin
an.
Material:
Pro Grossgruppe:
- Frische Uebernachtkulturen der beiden E. coli-Stämme in Vollmedium (LBG)
Pro 2er-Gruppe:
- 2 Reagenzglasröhrchen mit je 5 ml LBG-Flüssigmedium
- 4 Agarplatten E. coli-Minimalmedium (MME) mit 50 mg/l Streptomycin (und 1mM Thiamin, da
beide Stämme Thiamin-auxotroph sind)
- Petrischalen mit Ethanol und Drigalsky-Spatel zum Plattieren
Vorgehen:
1. 100 l der Übernachtkultur wird in 5 ml LBG-Medium (50x) verdünnt und 2 h 30 min. bei 37°C
geschüttelt.
2. In einem Eppendorfgefässen werden je 50 l des Hfr-Stamms wird mit 950 l des F--Stammes
gemischt und 30 min bei 37°C ohne zu Schütteln inkubiert.
3. Je 100 l des Gemisches und der beiden Paarungspartner werden in sterilen Eppendorfgefässen
abzentrifugiert (5 min. max. Drehzahl).
4. Die Zellen werden in 250 l sterilem Wasser auf dem Vortex resuspendiert.
5. Von dem Gemisch wird eine 1:10 Verdünnung in 250 μl sterilem Wasser hergestellt und diese sowie
die 3 unverdünnten Bakteriensuspensionen (Donor, Rezipient und Konjugationsanatz) mittels
Drigalsky-Spatel auf je eine MME Str Thi-Agarplatte verteilt.
6. Die Platten werden übers Wochenende bei 30°C inkubiert.
Auswertung:
Stamm
CGSC#259
CGSC#7541
CGSC#259 x 7541
Koloniezahl per 100 l
59
Abb. 7.2: Konjugation in E. coli (aus Schlegel, Allg. Mikrobiologie) Links: Elektronenmikroskopische
Aufnahme von konjugierenden E. coli-Zellen mit F-Pili. Rechts: Genkarte des zirkulären E. coliChromosoms (Einheit: min.) mit Integrationsort und Orientierung des F-Plasmides in unterschiedlichen
Hfr-Stämmen (beschriftete Pfeile innerhalb des Kreises). Man beachte die relative Lage des FPlasmides in HfrH (H) zu den thr und leu-Genen um 0 min.
Versuch 3: Transformation von Bacillus subtilis mit Plasmid-DNA
Bacillus subtilis ist ein Gram-positives Bodenbakterium, welches die Fähigkeit hat sich als Endospore
vor extremen Umweltbedingungen zu schützen. B. subtilis wurde bis vor kurzem als obligat aerober
Organismus betrachtet, neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass es auch unter anaeroben
Bedingungen leben kann.
Kompetenz ist die Fähigkeit einer Zelle DNS aus der Umgebung aufzunehmen. Dabei wird zwischen
natürlicher und induzierter Kompetenz unterschieden. Induzierte Kompetenz wird zum Beispiel
benutzt, um E. coli Zellen zur Aufnahme von DNS zu zwingen. Dies wird erreicht, in dem die
Zellmembran so behandelt wird, dass sie kurzzeitig für DNS permeabel ist. Natürliche Kompetenz wird
in ca. 40 Bakterienarten beobachtet, die durch alle taxonomischen Gruppen verteilt sind. In den meisten
Spezies ist die natürliche Kompetenz ein transienter Zustand, der durch verschiedene Signale induziert
werden kann, z. B. Nährstoffmangel oder Quorum sensing. Unter Laborbedingungen kann die
natürliche Kompetenz durch Nährstofflimitierungen oder unwirtliche Wachstumsbedingungen
induziert werden. Die spezifischen Signale, sowohl als auch die regulierenden Mechanismen sind noch
weitgehend unbekannt. Beobachtungen deuten jedoch darauf hin, dass unter Bedingungen, welche die
Bildung von Endosporen fördern, häufig auch Kompetenz beobachtet wird.
60
Ziel des Experimentes
In diesem Experiment benutzen wir einen B. subtilis Stamm, um seine natürliche Kompetenz zu testen.
Dazu benützen wir ein selbstreplizierendes Plasmid, welches eine Chloramphenicol Resistenz
beinhaltet. Um zu verifizieren, dass die verwendete DNS das transformierende Prinzip ist, führen wir
verschiedene Kontrollen durch. Die DNS wird z.B. in ansteigenden Mengen angeboten, was zu einer
Zunahme der Transformationseffizienz führen sollte.
Vorgehen:
Neben der eigentlichen Transformation des Bakteriums mit Plasmid-DNS in unterschiedlichen Mengen
(Ansätze P10, P1 und P0) werden folgende Kontrollen durchgeführt:
Ansatz D: DNase-Verdau
Bei diesem Ansatz wird deshalb die Plasmid-DNS mittels des Enzyms DNase I in ihre Bausteine, die
Nukleotide, zerlegt. Dadurch wird die genetische Information des Plasmids zerstört.
Ansatz K: Kontrolle der Sterilität der Plasmid-DNS-Lösung
Die Plasmid-DNS-Präparation wird ohne Bakterienzugabe ausgestrichen. Damit wird überprüft, dass
die Plasmid-DNS-Lösung frei von Bakterien ist, welche auf LB-Agar Platten mit Chloramphenicol
wachsen und somit das Resultat des Transformationsexperiments beeinflussen würden.
Material:
Pro Zweiergruppe:
- 5 LBG-Agarplatten supplementiert mit 5 mg/l Chloramphenicol
- 1 Eppendorf-Tube mit dem replikativen Plasmid pHPS9 (100 ng/μl, auf Eis)
- 1 Eppendorf-Tube mit sterilem ddH2O (auf Eis)
- Drigalsky-Spatel, Wanne mit 70%-igem Ethanol
Pro grosse Gruppe:
- 1 Eppendorf-Tube mit DNase I-Lösung (10 U/ml in Puffer, auf Eis)
- 1 Flüssigkultur (LB-Vollmedium) B. subtilis
- Schottflasche mit Medium I (viel Stickstoff)
- Schottflasche mit Medium II (wenig Stickstoff)
- Heizblock, eingestellt auf 37°C
Durchführung:
Der Versuch soll in Zweiergruppen durchgeführt werden.
Vorgehen:
1. Inokulation von 2 ml Medium I mit 200 μl Vorkultur (durch Assistenten)
2. Inkubation für 5 Stunden bei 200 rpm, 37°C
61
3. Ansätze gemäss folgendem Pipettierschema vorbereiten. Für jeden einzelnen Pipettierschritt eine
neue sterile Pipettenspitze verwenden!
Replikatives Plasmid pHPS9
P 10
P1
P0
D
K
DNA
10 μl
1 μl
0
10 μl
10 μl
H20
0
9 μl
10 μl
0
500 μl
DNase
0
0
0
10 μl
0
4. Ansatz D: 15 Minuten bei Raumtemperatur stehenlassen
5. 1 ml Vorkultur zu 4 ml Medium II (in Falconröhrchen) zugeben, mischen.
6. Bei allen Ansätzen ausser K 500 μl der verdünnten Kultur zugeben.
7. Zellen bei 37°C und 100 rpm für 90 Minuten inkubieren.
8. Zellen der Ansätze durch kurzes Zentrifugieren pelletieren (max. rpm für 2 Minuten), 350 ul
des Überstands abnehmen und Pellets in den verbleibenden 150 ul Flüssigkeit resuspendieren.
Anschliessend die 5 Ansätze auf die entsprechend beschrifteten Platten mit Drigalsky-Spatel
ausplattieren; die Platten für mind. 2 Tage bei 37°C in der Feuchtkammer inkubieren.
Auswertung:
P 10
P1
P0
D
K
Anzahl
Kolonien
Versuch 4: Generalisierte Transduktion
Transduktion einer Transposoninsertion in den Genen fliGHI von Salmonella typhimurium
Salmonellen sind Gram-negative, motile Stäbchen der Gattung Enterobacteriaceae. Sie gehören zu den
häufigsten Erregern von gastrointestinalen Erkrankungen weltweit. Salmonella typhimurium besitzt
eine Reihe von Virulenzfaktoren. Zu den wichtigsten zählen zwei spezialisierte ProteinSekretionssysteme (Typ III Sekretionssysteme), die zur Invasion in Epithelzellen und für das
Überleben in Phagozyten dienen. Daneben besitzen Salmonellen Flagellen, die ebenfalls zu ihrer
Virulenz beitragen (Penetration der intestialen Schleimschicht, Invasion in Epithelzellen, Adhäsion).
Die etwa 25 Flagellenkomponenten sind in mehreren Operons kodiert, die über das Salmonellengenom
verteilt sind. Die Biosynthese wird durch einen komplexen Regulationsmechanismus gesteuert. Die
Flagellen bestehen aus 3 Abschnitten:
1. Dem Basalkörper, der das Flagellum in der Cytoplasmamembran und in der Zellwand
verankert.
2. Dem Haken, der den Basalkörper mit dem Flagellum verbindet.
62
3. Dem Flagellum.
Die Mutation nur eines Flagellengens führt in den meisten Fällen zum vollständigen Verlust der
Motilität.
Abb. 7.3: Struktur eines Flagellums von Salmonella.
In diesem Experiment soll durch generalisierte Transduktion mittels des Salmonella spezifischen
Phagen P22 eine Mutation der Flagellengene fliGHI transduziert werden und der Verlust der
Beweglichkeit der Transduktanten nachgewiesen werden. Die Mutation der Flagellengene fliGHI liegt
in einem Stamm als Transposoninsertion (mit Tetracyclinresistenz als Marker) vor.
Abb.7. 4: Genregion, in die das Tn10 Transposon integriert wurde und welche durch
Phagentransduktion mutiert werden soll (Massstab in bp).
P22 ist ein lysogener, lambdoider Phage, dessen Integrase deletiert wurde, so dass er die Bakterien
lytisch infiziert. Zudem trägt er eine Mutation, durch die er in erhöhtem Masse bakterielle genomische
DNA bei der Lyse des Bakteriums verpackt („generelle Transduktion“). In der Salmonellen-Genetik
dient P22 als Werkzeug, um Mutationen, die mit genetischen Markern (Antibiotikaresistenzen)
gekoppelt sind, sehr effizient von Stamm zu Stamm zu übertragen.
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Material:
Pro Zweiergruppe:
- P22 Phagenlysat, das auf dem Salmonellenstamm SB245 gezogen wurde, welcher die Mutation in den
Flagellengenen trägt (fliGHI::Tn10).
- Flüssigkultur (LB-Vollmedium) mit dem Empfängerstamm M557: Salmonellen mit intaktem
Flagellenapparat
- 3 LBG-Tet-Platten mit Tetrazyklin (LBG-Agar, supplemetiert mit Tetrazyklin [12 g/ml])
- Drigalsky-Spatel
- Motility-Agar Platte
- Platte mit Salmonellenstamm M557 (am Auswertungstag)
Durchführung:
Der Versuch soll in Zweiergruppen durchgeführt werden.
Vorgehen:
1. 10 l des bereitgestellten P22-Phagenlysats (fliGHI::Tn10) werden mit 100 l der Übernachtkultur
des Empfängerstamms (S. typhimurium M557) in einem Eppendorfgefäss gemischt.
2. Inkubation bei 37°C, 15 min (ohne Schütteln!)
3. Von dem Transduktionsansatz wird eine 1:10 und eine 1:100 Verdünnung hergestellt. Hierzu werden
in 2 Eppendorfgefässen jeweils 90 l H2O vorgelegt. Dann gibt man in das erste Eppendorfgefäss
10 l des Transduktionsansatzes, vortext diesen kurz und gibt 10 l der 1:10 Verdünnung in das 2.
Eppendorfgefäss.
4. Von dem Transduktionsansatz und den 1:10 und 1:1 00 Verdünnungen werden jeweils 50 l auf
LBG-Tet-Platten ausplattiert und bei 37° über Nacht inkubiert.
Auswertung:
Die erhaltenen Transduktanten werden auf ihre Beweglichkeit getestet:
Mittels Motility-Agar:
Bei Motility-Agar-Platten handelt es sich um LBG-Platten, die sich von gewöhnlichen LBG-Platten
dadurch unterscheiden, dass sie weniger Agar enthalten (0.3 % statt normal 1.5 %). Aufgrund der
verringerten Menge Agar können sich motile Bakterien im Agar fortbewegen („Schwimmen“). Die
Bewegung ist durch Hofbildung leicht erkennbar.
Je eine Kolonie des Empfängerstamms und des transduzierten Stamms werden mittels einer gelben
Spitze von der Platte genommen und in einem Eppendorfröhrchen mit 10 l sterilem Wasser
resuspendiert. Je 5 μl der Zellsuspension werden auf eine Motility-Agar aufgetropft. Die Platten
werden bei 37°C inkubiert und nach mindestens 4 – 6 h auf Hofbildung überprüft.
Wichtig: Da die Motility-Agar-Platten sehr wenig Agar enthalten, dürfen sie zum Inkubieren nicht auf
den Kopf gedreht werden!
64
FRAGE 7.1: Welche Mechanismen, neben Sexualität und horizontalem Gentransfer, tragen ebenfalls
zur genetischen Variabiliät bei? Sind diese Mechanismen bei Mikroorganismen relevant? ANTWORT:
FRAGE 7.2: Kennen Sie aus der Vorlesung ein System, das den horizontalen Gentransfer bei
Bakterien einschränkt? Was könnte der Sinn eines solchen Systems sein? ANTWORT:
8. IMMUNABWEHR GEGEN BAKTERIEN
65
Einführung
Infektionen von Säugetieren mit Mikroben (Bakterien, Pilze, Viren, Parasiten) lösen eine adaptive
Immunantwort („erworbene Immunität“) aus, die grob in zwei Äste aufgeteilt werden kann: i) Die
zelluläre Immunantwort für die T Zellen verantwortlich sind und ii) die humorale Immunantwort,
welche durch B Zellen vermittelt wird. Die humorale Immunantwort beinhaltet die Produktion von
Mikroben-spezifischen Antikörpern (auch Immunoglobuline genannt, Ig) welche an die Mikroben
binden und im optimalen Fall diese mit der Hilfe von anderen Komponenten des Immunsystems
neutralisieren. Es existieren verschiedene Ig Isotypen: IgM ist der dominante Isotyp während der
frühen Immunantwort. IgG ist der prominenteste Isotyp im Blut. IgA ist besonders in der Mukosa
wichtig und IgE ist massgeblich involviert an der Immunantwort gegen Parasiten und in Allergien.
Naive B Zellen erkennen Mikroben mittels dem B Zell Rezeptor. Diese Bindung führt zur Aktivierung
der B Zellen und der Internalisierung von mikrobiellen Antigenen. Die B Zellen prozessieren daraufhin
die aufgenommenen Antigene und präsentieren sie auf MHC class II Molekülen den CD4 + T Helfer
Zellen. Falls die T Zellen spezifisch für das gleiche Antigen sind - ein Prozess der als „linked
recognition“ bezeichnet wird - können sie wiederum die B Zellen stimulieren und deren weitere
Differenzierung auslösen. Nach mehreren Zellteilungen können die B Zellen schliesslich zu
Antikörper-produzierenden Plasmazellen oder langlebigen „memory“ B Zellen differenzieren (Abb. 1).
Abb. 1: Auslösung einer anti-mikrobiellen humoralen Immunantwort (aus: Janeway, Travers, Walport,
and Shlomchik. 2005. Immunobiology. 6th edition. Garland Science Publishing, New York)
Naive B Zellen exprimieren IgM (und IgD) auf der Zelloberfläche und IgM ist der erste Isotyp der bei
der Aktivierung von naiven B Zellen sekretiert wird. Das erste Auftreten von messbaren Pathogenspezifischen Antikörpern wird als Serokonversion bezeichnet. Bei zahlreichen Infektionskrankheiten
wird die Serokonversion als definitiver diagnostischer Nachweis benutzt. Wir werden in diesem
Kapitel die Serokonversion bzw. die Produktion von Pathogen-spezifischem IgG in Mäusen
nachweisen, welche mit Legionella pneumophila (Lpn) infiziert wurden.
IgM wird als Pentamer aus 5 IgM Monomeren sekretiert, welche durch eine J Kette zusammengehalten
werden. Diese Pentamere sind sehr gross und können daher nicht in Gewebe eindringen. Andere
Immunoglobulin Isotypen sind kleiner und können daher leichter in die mit Blut versorgten Gewebe
eindringen. IgM tritt kurz nach dem ersten Kontakt mit Antigen auf und dominiert die initiale Antwort,
66
wird jedoch danach bald schwächer. Um andere Isotypen als IgM zu produzieren müssen B Zellen den
Prozess des „isotype class switching“ durchlaufen. Um class switching machen zu können, müssen die
B Zellen mit T Helfer Zellen interagieren, welche das gleiche Antigen erkennen. IgG (und teilweise
IgA) ist der dominante Isotype in späteren Phasen und bei „memory“ Antworten.
Die Mehrzahl der anti-mikrobiellen Antikörper sind gegen repetitive Strukturen und zahlreich
vorhanden Makromoleküle auf der Oberfläche von Mikroben gerichtet. So sind zum Beispiel
Antikörper welche bei Infektion mit gram-negativen Bakterien wie Legionellen induziert werden
grösstenteils spezifisch für Lipopolysaccharide. Mikrobenstämme die antigenisch eng verwandt sind
bilden sogenannte Serogruppen, und die zugehörigen Stämme sind generell vom gleichen Serotypen
(oder Serovar). Polyklonale Antikörper (z.B. im Serum) welche spezifisch für einen bestimmten
Serotyp einer Mikrobenspezies sind erkennen auch andere Stämme vom gleichen Serotyp dieser
Spezie, jedoch nicht andere Serotypen (auch wenn die Mikroben der gleichen Spezies angehören).
Experimente
Versuch 1: Nachweis von anti-Legionella pneumophila Antikörpern
Einführung:
Infektion mit Legionella pneumophila (Lpn) ist die Ursache einer potenziell tödlichen Form der
Lungenentzündung welche als Legionärskrankheit bezeichnet wird. Durch Inhalation von
kontaminierten Aerosolen gelangen die Bakterien in die Lunge und können dort alveoläre
Makrophagen infizieren und darin replizieren. Die massive intrazelluläre Vermehrung der Bakterien,
die Entzündung und die resultierende Einwanderung einer grossen Zahl von Immunzellen in die Lunge
kann im betroffenen Wirten zu einer schweren Lungenentzündung führen.
Primäre Legionellen-Infektionen werden durch die Abwehrmechanismen des angeborene
Immunsystems kontrolliert und beseitigt. Die Infektion löst jedoch auch eine „erworbene“ (adaptive)
Immunantwort aus, so zum Beispiel CD4+ T Helfer Zellen und Antikörper. Diese erworbene Immunität
schützt mittels spezifischer Antikörper in der Zirkulation und einer schnellen sekundären
Immunantwort („memory“) unmittelbar vor einer erneuten Infektion mit Legionellen.
Ziel:
Wir werden einen indirekten ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) durchführen um Lpnspezifische Antikörper zu detektieren und den Serotypen von Lpn JR32 zu bestimmen. Mäuse wurden
zwei Mal mit 5×106 cfu Lpn intravenös immunisiert und nach 30 Tagen Serumproben genommen. Um
Lpn-spezifische Antikörper in diesen Seren nachzuweisen werden ELISA-Platten benutzt, die mit
Gentamicin-getöteten Lpn Serotypen 1 und 6, und Salmonella typhimurium (Sm) beschichtet wurden
(Die Immunisierungen, Abnahme der Seren und das Beschichten & Blockieren der ELISA-Platten
werden von den Praktikums-Assistenten vorgängig durchgeführt). Die in den Seren enthaltenen antiLpn Antikörper binden daraufhin an die Bakterien, mit denen die ELISA-Platten beschichtet wurden.
Ungebundene (unspezifische) Antikörper werden anschliessend weggewaschen und die gebundenen
67
Antikörper mit einem sekundären, horseradish peroxidase (HRPO)-markierten Antikörper detektiert.
Nach einem erneuten Waschschritt wird schliesslich das chromogene HRPO-Substrat ABTS (2,2'azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) und H2O2 zu den Wells gegeben. HRPO katalysiert die
Reaktion von ABTS mit H2O2 in ein grünes Produkt (Abb. 2). Wells, die mit Lpn vom gleichen
Serotypen wie Lpn JR32 beschichtet sind (d.h. dem Stamm, der für die Immunisierung benutzt wurde)
und zu denen Immun-Serum geben wurde können danach einfach an der grünen Farbe erkannt werden.
Sm-beschichtete Wells und Wells zu denen naives Serum gegeben wurde, dienen als Kontrollen.
2 ABTS + H2O2 + 2H+  2 ABTS++2 H2O
Abb. 2: Reaktion von 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonsäure) (ABTS) mit H2O2. Die
Reaktion wird durch HRPO katalysiert.
Material:
Pro 2 Studenten:
-
1 ELISA-Platte; geblockt, beschichtet mit Gentamicin-getöteten Lpn Serotyp 1 und 6, und Sm
-
ELISA Wash Buffer (1 Spritzflasche, 0.5 l): 0.05% Tween 20 in PBS
-
ELISA Blocking Buffer (1 Falcon Röhrchen): 1% bovines Serumalbumin in PBS
-
1 snap cap Röhrchen (5 ml, Polystyren)
-
Serum von Lpn JR32-immunisierten Mäusen (1 Eppendorf Röhrchen); 1:250 verwenden
-
Serum von naiven Mäusen (1 Eppendorf Röhrchen); 1:250 verwenden
-
Ziege anti-Maus Antikörper, HRPO-markiert (1 Eppendorf Röhrchen); 1:250 verwenden
-
ABTS Lösung (4 ml in snap cap Röhrchen): 0.02% (w/v) 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonsäure
-
H2O2, 30% Lösung (1 Eppendorf Röhrchen)
Vorgehen:
1.
Platten waschen: Der Überstand aus der beschichteten und blockierten ELISA-Platte in den
Abguss abschütten. Dann mit der Spritzflasche vorsichtig alle beschichteten Wells (A7-H9,
siehe Abb. 3) mit Wash Buffer füllen. Den Wash Buffer wieder abschütten und den
Waschvorgang zwei Mal wiederholen. Bevor mit dem nächsten Schritt weitergefahren wird,
sollten alle Wells (A7-H9) mit Wash Buffer gefüllt werden.
2.
Die beiden Seren (naiv und Lpn JR32-immun) in zwei separaten Eppendorf Röhrchen 1:250 in
Blocking Buffer verdünnen und gut mischen. Es werden 100 µl/Well der verdünnten Seren für
68
12 Wells benötigt. Um genügend Volumen zu haben (inkl. Reserve), sollte genügend
verdünntes Serum für 14 Wells vorbereitet werden.
3.
Wash Buffer abschütten (in Abguss) und die umgekehrte ELISA-Platte auf Haushaltspapier
blotten. Danach 100 µl des verdünnten Serums von naiven Mäusen in Wells A7-9, C7-9, E7-9,
und G7-9 pipettieren, und 100 µl des verdünnten Serums von Lpn JR32-immunisierten
Mäusen in Wells B7-9, D7-9, F7-9, und H7-9 pipettieren (siehe Abb. 3). Danach bei
Raumtemperatur mindestens 1 Stunde inkubieren.
4.
Platten wie in Schritt 1 waschen (über Abguss): Den Waschvorgang drei Mal wiederholen.
Bevor mit dem nächsten Schritt weitergefahren wird, sollten alle Wells (A7-H9) mit Wash
Buffer gefüllt werden.
5.
Der HRPO-markierte sekundäre Antikörper (Ziege anti-Maus) wird 1:250 in Blocking Buffer
verdünnt (5 ml snap cap Röhrchen verwenden) und gut gemischt. Es werden 100 µl/Well des
verdünnten Antikörpers für 24 Wells benötigt. Um genügend Volumen zu haben (inkl.
Reserve), sollte genügend verdünnter Antikörper für 28 Wells vorbereitet werden.
6.
Wash Buffer abschütten (in Abguss) und die umgekehrte ELISA-Platte auf Haushaltspapier
blotten. Danach 100 µl des verdünnten Antikörpers in jedes Well pipettieren (A7-H9). Danach
bei Raumtemperatur mindestens 1 Stunde inkubieren.
7.
Platten wie in Schritt 1 waschen (über Abguss): Den Waschvorgang 5 Mal wiederholen.
Bevor mit dem nächsten Schritt weitergefahren wird, sollten alle Wells (A7-H9) mit Wash
Buffer gefüllt werden.
8.
2 µl H2O2 zu 4 ml ABTS geben und gut mischen. Wash Buffer abschütten (in Abguss) und die
umgekehrte ELISA-Platte auf Haushaltspapier blotten. Danach 100 µl ABTS/H2O2 in jedes
Well pipettieren (A7-H9). Bei Raumtemperatur für ~30 Minuten inkubieren und
Farbumschlag beobachten (neutral zu grün).
Abb 3: Ladeschema der ELISA-Platte.
Auswertung:
Zeichne in Abb. 3 ein, in welchen Wells eine Färbung beobachtet wird und beantworte folgende
Fragen:
- Welches ist der Serotyp des für die Immunisierung verwendeten L. pneumophila (Lpn) Stammes
JR32?
- Ist eine Kreuzreaktion des Serums mit Salmonella typhimurium (Sm) erkennbar?
69
9. MIKROBIELLER LEBENSRAUM PHYLLOSPÄRE
70
9. DIE PHYLLOSPHÄRE ALS MIKROBIELLER LEBENSRAUM
Einführung
Bei Landpflanzen wird im Hinblick auf die Besiedelung durch Mikroorganismen oft zwischen dem
unterirdischen Teil der Pflanze, der Rhizosphäre, und dem oberirdischen Teil, der Phyllosphäre,
unterschieden. Die von Mikroorganismen besiedelte Blattoberfläche stellt mit 6.4 x 108 km2 einen
enormen Lebensraum für Mikroorganismen dar. Zum Vergleich: das Festland nimmt auf der
Erdoberfläche 1.5 x 108 km2 ein. Die Blattoberflächen der Pflanzen werden von etwa 106 – 107
Bakterienzellen/cm2 besiedelt. Das Blatt wird aber nicht nur auf seiner Oberfläche von diesen
epiphytisch lebenden Mirkoorganismen besiedelt, sondern auch von Endophyten, welche im Inneren
des Blattes, dem Apoplasten, leben oder sogar bis ins Xylem vordringen können.
Zu den häufigen Kolonisierern der Phyllosphäre zählen zahlreiche Vertreter der Gram-negativen
Proteobakterien, so die Gattungen Pseudomonas und Methylobacterium. Aber auch Gram-positive
Bakterien wie Bacillus wurden häufig nachgewiesen. Darüber hinaus werden Blätter von filamentösen
Pilzen, Hefen, Algen und manchmal von Protozoen und Nematoden besiedelt, allerdings in geringerem
Ausmass.
Die Gattung Methylobacterium
Die Gattung Methylobacterium zeichnet sich durch pinkfarbige Pigmentierung (Carotinoide) und einen
fakultativ methylotrophen Stoffwechsel aus. Der Begriff methylotroph umschreibt die Fähigkeit, auf
Substraten ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindung zu wachsen. Methylotrophe Mikroorganismen
können ihre Zellbestandteile aus C1-Verbindungen aufbauen und gewinnen die nötige Energie durch
die Oxidation dieser reduzierten C1-Verbindungen. Zu den verwertbaren C1-Verbindungen zählen
Methanol (CH3OH), Formaldehyd (CH2O) und Ameisensäure (HCOOH); auch Methylamine (z. B.
CH3-NH2), methylierte Schwefelverbindungen (z. B. CH3-SH) oder halogenierte Methanverbindungen
(z. B. CH3-Cl) können von Vertretern der Gattung Methylobacterium verwertet werden. Die Fähigkeit,
auf C1-Verbindungen zu wachsen, bedarf eines besonderen Stoffwechsels. Die zum Überleben und
Wachstum nötige Energie wird aus der schrittweisen Oxidation des reduzierten Substrates bis hin zum
CO2 gewonnen (siehe Abb. 9.1). Dabei entstehen Reduktionsäquivalente, welche über die
Atmungskette in ATP verwandelt werden können. Der Aufbau der Zellbestandteile erfolgt bei
methylotropher Lebensweise ausschliesslich ausgehend von C1-Bausteinen. Die Vertreter der Gattung
Methylobacterium nutzen dazu das toxische Formaldehyd sowie CO2, welche über den Serinweg
assimiliert werden (Abb. 9.1). Die fakultative Methylotrophie erlaubt es den Methylobakterien, neben
den C1-Verbindungen auch komplexere Substrate wie Succinat oder Pyruvat als Kohlenstoff- und
Energiequelle zu nutzen, sofern diese Substrate zur Verfügung stehen.
71
methylierte
Schwefelverbindungen
methylierte
Amine
H2O
1
CH3OH
3
2
HCOOH
HCHO
2H
2H
CO2
2H
Serinweg
Acetyl-CoA
Biomasse
Abb. 9.1: C1-Metabolismus in Methylobacterium. 1. Methanol Dehydrogenase, 2. Formaldehyd
Oxidationssystem, 3. Formiat Dehydrogenase (modifiziert nach Lidstrom, The Prokaryotes, 2006)
Neben der Gattung Methylobacterium gibt es weitere methylotrophe Mikroorganismen, die zum Teil
obligat methylotroph leben, wie z. B. die Gattungen Methylobacillus und Methylophilus; des weiteren
die Untergruppe der Methan-verwertenden Bakterien, die sogenannten methanotrophen Bakterien,
wozu z. B. Methylococcus gehört. Weitere fakultativ methylotrophe Organismen sind zu finden
innerhalb der Gattungen Hyphomicrobium, Paracoccus und Bacillus. Es sollte nicht unerwähnt
bleiben, dass es neben den methylotrophen Bakterien auch methylotrophe Hefen gibt, z. B. innerhalb
der Gattungen Hansenula, Pichia oder Candida.
Verbreitung der Gattung Methylobacterium
Methylotrophe Bakterien sind in der Natur weit verbreitet. Man findet sie in diversen aquatischen und
terrestrischen Habitaten. Aber auch im Staub und in der Luft wurden sie nachgewiesen. Da verwundert
es nicht, dass Vertreter der Gattung Methylobacterium als Kontamination in einer Weltraumfähre
nachgewiesen wurden und dass es sich beim rosa schimmernden Schleim am Duschvorhang ebenfalls
um Methylobacterium handelt. Beschrieben ist das Vorkommen von Methylobacterium auch im Mund
und auf der Haut des Menschen.
Bemerkenswert ist die konsistente Besiedelung von Pflanzen durch Vertreter der Gattung
Methylobacterium. Auf fast jeder Pflanze, auf der man versucht hat, diese Mikroorganismen-Gattung
nachzuweisen, ist dieses auch gelungen. Methylobacterium besiedelt insbesondere die Phyllosphäre.
Man findet diese Bakterien auf der Blattoberfläche und in den Blättern, im Apoplasten. Man weiss
inzwischen, dass die Methylobakterien vom Methanol profitieren können, welches von den Pflanzen
produziert und emittiert wird. Die Pflanze produziert das Methanol als Abfallprodukt bei der
Zellwandsynthese. Die fakultative Methylotrophie erlaubt es den Methylobakterien jedoch, auch andere
72
C-Quellen zu nutzen, die auf der Blattoberfläche verfügbar sind. Die Fähigkeit der Methanolverwertung ist jedoch bei starker Konkurrenz um C-Quellen durch andere Blatt-Kolonisierer von
Vorteil für die Methylobakterien.
Die Gattung Pseudomonas
Ähnlich wie die Vertreter der Gattung Methylobacterium, so kommen auch die Vertreter der Gattung
Pseudomonas in den verschiedensten Habitaten vor. Im Gegensatz zu den Methylobakterien sind sie
jedoch in der Lage eine grosse Vielfalt an organischen und anorganischen Substraten zu verwerten,
ermöglicht durch die vielfältigen Stoffwechselwege, die die verschiedenen Vertreter dieser Gattung
besitzen. Derzeit sind etwa 175 verschiedene Arten von Pseudomonaden beschrieben, während etwa 25
beschriebene Methylobacterium Arten existieren.
Anders als die Vertreter der Gattung Methylobacterium findet man Pseudomonas auch häufig in der
Rhizosphäre. Weiterhin gibt es unter den Pflanzen-assoziierten Pseudomonas Arten diverse
phytopathogene Stämme. Diese lösen häufig Blattkrankheiten aus und/oder führen zum Welken der
Pflanzen.
Die sogenannten fluoreszierenden Pseudomonaden sind dazu in der Lage Siderophore zu produzieren.
Das sind wasserlösliche, fluoreszierende Substanzen, die in die Umgebung abgegeben werden. Diese
sind bei Tageslicht grünlichgelb gefärbt und zeigen unter der UV-Lampe bei 366 nm eine
grünlichgelbe bis bläuliche Fluoreszenz. Siderophore dienen dem Eisentransport in die Zelle. Sie
werden unter Eisenmangelbedingungen produziert und ausgeschieden.
.
Versuch 1: Herstellung von Blattabdrücken
Durch die Herstellung von Blattabdrücken auf Nährmedien lassen sich Mikroorganismen auf Blättern
einfach und schnell nachweisen. Ziel dieses Versuches ist es, Methylobacterium und fluoreszierende
Pseudomonaden auf Weissklee (Trifolium repens) nachzuweisen.
Für den eindeutigen Nachweis von Methylobacterium werden zwei Eigenschaften dieser
Bakteriengattung ausgenutzt. Das Wachstum erfolgt auf einem Minimalmedium mit Methanol als
einziger C-Quelle. Um das Wachstum von methylotrophen Eukaryonten zu verhindern, wird das
Antibiotikum Cycloheximid zugegeben. Da auf diesem Medium die meisten methylotrophen Bakterien
wachsen können, muss zur eindeutigen Bestimmung ein weiteres Charakteristikum der Gattung
Methylobakterium herangezogen werden. In diesem Fall ist das die pinkfarbige Pigmentierung.
Das zweite Medium, das in diesem Versuch eingesetzt wird, ist King B. Dieses Medium ist nicht sehr
selektiv, d. h. neben den Pseudomonaden können auch einige andere Bakteriengattungen auf diesem
Medium wachsen. Das King B Medium stimuliert jedoch bei den fluoreszierenden Pseudomonaden die
Bildung der Siderophore, so dass man relativ sicher sein kann, dass es sich bei den fluoreszierenden
Kolonien um Pseudomonaden handelt.
73
Medien:
Minimalmedium zur Kultivierung methylotropher Bakterien (MMM)
Spurenelementlösung
(NH4)2SO4
2.0 g/l
EDTA
1.50 g/l
MgSO4  7 H2O
0.2 g/l
ZnSO4  7 H2O
4.40 g/l
NaH2PO4  2 H2O
1.7 g/l
CaCl2  2 H2O
1.47 g/l
K2HPO4
1.7 g/l
MnSO4  4 H2O
0.10 g/l
Spurenelementlösung
1 ml/l
FeSO4  7 H2O
1.00 g/l
Agar
15 g/l
(NH4)Mo7O24  4 H2O
0.22 g/l
CuSO4  5 H2O
0.30 g/l
CoCl2  6 H2O
0.30 g/l
pH 7.0
Nach dem Autoklavieren werden dem Medium 5 ml/l sterilfiltriertes Methanol und 50 mg/l
Cycloheximid (im Methanol gelöst) zugesetzt.
King B Medium
Proteose Pepton
20.0 g/l
Glycerin
10.0 ml/l
K2HPO4
1.5 g/l
MgSO4 × 7 H2O
1.5 g/l
Agar
15.0 g/l
pH 7.2
Material: (pro Student)
-
LBG-Agarplatte mit E. coli
-
1 Agarplatte MMM
-
1 Agarplatte King B Medium
-
2 Trifoliate vom Weissklee
-
sterile Petrischale zum Transport der Kleeblätter
Vorgehen:
Die Kleeblätter werden unter möglichst sterilen Bedingungen gepflückt, d. h. zum Pflücken sollten
Handschuhe getragen werden, und die Blätter sollten am Stängel gefasst werden. In einer sterilen
Petrischale werden die Blätter ins Labor gebracht.
Die Blattabdrücke werden von der Blattunterseite erstellt, da diese häufig stärker von Mikroorganismen
besiedelt ist. Das hängt damit zusammen, dass die Lebensbedingungen auf der Blattunterseite weniger
hart sind als auf der Oberseite (UV-Strahlung, Austrocknung). Zur Erstellung der Blattabdrücke wird
ein Kleeblatt vorsichtig auf die Mitte der Agarplatte gelegt. Mit dem Finger drückt man jedes einzelne
Blättchen des Trifoliates auf den Agar, um sicherzustellen, dass die gesamte Blattunterseite mit der
Agaroberfläche in Berührung kommt. Es ist darauf zu achten, dass die einzelnen Blättchen dabei nach
74
Möglichkeit nicht verrutschen und die Finger den Agar nicht berühren. Nachdem alle Teile des Blattes
auf die Agar-Oberfläche gedrückt wurden, wird das Blatt entfernt.
Ein Blatt wird für einen Abdruck auf MMM verwendet und das zweite für einen Abdruck auf King B
Medium. Die Platten werden bei 30°C inkubiert. Die Inkubation erfolgt für die King B-Platte für 1 – 2
Tage, für die MMM-Platte für 5 – 7 Tage. Als Selektivitätskontrolle wird E. coli auf beiden Platten
neben den Blattabdrücken ausgestrichen.
Auswertung:
a) Selektivität der Platten: Wie viele verschiedene Kolonietypen sind auf den beiden verschiedenen
Platten zu erkennen?
b) Abundanz der Mikroorganismen / Methylobakterien: Auf welcher der beiden Platten sind mehr
Kolonien erkennbar?
c) Lokalisation der Mikroorganismen: Können anhand der Blattabdrücke Rückschlüsse darüber
gezogen werden, welche Stellen des Blattes bevorzugt von Mikroorganismen kolonisiert werden?
d) Welche charakteristischen Eigenschaften der Gattung Methylobacterium werden ausgenutzt, um
diese Organismengruppe anzureichern und zu identifizieren?
10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: BACILLUS THURINGIENSIS
75
10. ANGEWANDTE MIKROBIOLOGIE: SCHÄDLINGSBEKÄMPFUNG MIT
BACILLUS THURINGIENSIS
10.1. Grundlagen
Einführung
Die insektenpathogene Bakterienart, Bacillus thuringiensis (Bt), gehört als aerober Sporenbildner zur
Gattung Bacillus (Familie: Bacillaceae). Charakteristisch ist für die Vertreter der Bacillaceae, dass die
Bildung hitzeresistenter und gegenüber Umwelteinflüssen widerstandsfähiger Sporen einsetzt, sobald
ein für die Zellvermehrung unentbehrlicher Nährstoff aufgebraucht ist.
Erstmals wurde B. thuringiensis vor rund 100 Jahren aus einer Seidenraupenzucht in Japan isoliert und
wurde Bacillus sotto genannt. Da das Bakterium in Seidenraupenzuchten unerwünscht war, schenkte
man ihm keine besondere Beachtung. Im Jahr 1911 wurde ein Stamm von B. thuringiensis in toten
Mehlmotten gefunden, die aus einer Mühle in Thüringen stammten.
B. thuringiensis ist ein Bodenbakterium und geographisch weit verbreitet. Am besten lassen sich neue
B. thuringiensis Stämme aus nährstoffreichen Quellen, Insektenkolonien und auch humusreichen
Böden isolieren. In Sammlungen finden sich hunderte von B. thuringiensis Stämmen.
Bacillus thuringiensis Stämme als Produzenten von Insektentoxinen.
Gleichzeitig mit der Spore bildet B. thuringiensis innerhalb der Bakterienzelle einen Zelleinschluss, der
aus Protein besteht und auch als Parasporalkörper bezeichnet wird. Die Parasporalkörper mit einem
Durchmesser von 0.5 – 2 µm sind etwas kleiner als die Spore, aber im Lichtmikroskop noch gut
erkennbar. Es gibt auch B. thuringiensis Stämme, die mehr als einen Parasporalkörper ausbilden.
Elektronenmikroskopisch lässt sich zeigen, dass die Parasporalkörper in vielen Fällen in kristalliner
Form als Bipyramiden oder auch als Kuben vorliegen. Die Feinstruktur der Parasporalkörper wird von
der Subspezies bestimmt, zu welcher der betreffende B. thuringiensis Stamm gehört.
Die Parasporalkörper sind Träger insektizider Aktivitäten gegenüber zahlreichen Larvenstadien von
Insektenarten, die den Ordnungen der Lepidopteren, Dipteren und Coleopteren angehören. Die Toxine
werden als delta-Endotoxine bezeichnet.
Die ersten Bt-Isolate waren alle gegenüber Larven von Lepidopteren aktiv, bis 1976 in einem
austrocknenden Tümpel in der Negev Wüste aus toten Mückenlarven ein B. thuringiensis Stamm
isoliert wurde, dessen Toxin gegenüber Larvenstadien von Stechmücken eine sehr starke Wirkung
zeigte. Es handelte sich um eine neue Subspezies, die den Namen B. thuringiensis israelensis (Bti)
erhielt.
1983 wurde dann eine Bt-Subspezies isoliert, B. thuringiensis tenebrionis, die auf Coleopteren, zum
Beispiel auf Kartoffelkäfer, wirkt.
Zum Wirkungsmechanismus der delta-Endotoxine
Die Wirkung der delta-Endotoxine ist hochspezifisch und beschränkt sich jeweils auf die Larvenstadien
weniger Gattungen innerhalb einer Insektenordnung. Die in den Parasporalkörpern vorhandenen
Proteine, die als Protoxine bezeichnet werden und selbst keine Aktivität besitzen, müssen eine Reihe
von Aktivierungsschritten durchlaufen: Die Parasporalkörper, vom Insekt mit der Nahrung
76
aufgenommen, lösen sich im alkalischen Darmsaft auf. Darmsaftproteasen des Serintyps spalten die
etwa 130 kDa Polypetide in Einheiten von 60 kDa, wobei vom C-Terminus her etwa die Hälfte des
Moleküls entfernt wird. Am N-Terminus werden knapp 30 Aminosäuren abgespalten. Diese nun
aktivierten Polypeptide binden an spezifische Rezeptoren, die sich im Epithel der Darmzellen befinden,
und sehr wahrscheinlich Glykoproteine sind. Nach der Rezeptorbindung kommt es zur Porenbildung.
Das Darmeptihel verliert damit seine Funktionsfähigkeit, und es kommt zum ungehinderten Austausch
zwischen Blutflüssigkeit und Darmsaft. Dies hat schliesslich den Tod der Insektenlarve zur Folge.
Die Vielfalt von Bacillus thuringiensis
Einerseits hat man eine grosse Anzahl von B. thuringiensis Stämmen isoliert und beschrieben. Diese
lassen sich mit biochemischen, serologischen und morphologischen Eigenschaften voneinander
unterscheiden. Andererseits werden oft stammunabhängige unterschiedliche delta-Endotoxine gebildet,
die sich in ihren insektiziden Aktivitäten unterscheiden. Die delta-Endotoxine sind plasmidkodiert.
Dies ist eine Erklärung für die teilweise geringe Übereinstimmung zwischen den Eigenschaften von
Bakterium und delta-Endotoxinen.
Die delta-Endotoxine werden als Cry-Proteine bezeichnet und nach Spezifität ihrer insektiziden
Aktivitäten unterteilt:
Cry-Typ
Hauptzielinsekten
Cry I
Lepidopteren
Cry II
Lepidopteren und Dipteren
(keine grosse Bedeutung)
Cry III
Coleopteren
Cry IV
Dipteren
Cry V
Coleopteren und Lepidopteren
(keine grosse Bedeutung)
Cry VI
Nematoden
Die Cry-Proteine werden aufgrund von Aktivitätsunterschieden innerhalb der Hauptzielinsekten weiter
unterteilt: CryI
CryIA
CryIAa
CryIAa1. Diese Einteilung der Cry-Proteine basiert nicht
nur auf Unterschiede in den spezifischen Aktivitäten sondern auch in den Aminosäurensequenzen, bzw.
den DNA-Sequenzen. Die Gene, die den Aminosäuresequenzen zugrunde liegen werden als cry-Gene
bezeichnet. Zurzeit gibt es rund einhundert verschiedene Cry-Proteine,
(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt).
Die Sicherheit der delta-Endotoxine von Bacillus thuringiensis
Für ein Insektizid ist die Sicherheit der delta-Endotoxine ausserordentlich hoch. Die delta-Endotoxine
sind sehr spezifisch. So wirkt ein Bt-Stamm nur gegenüber wenigen Insektenarten innerhalb einer
Familie oder Gattung. Gegenüber nicht-Zielinsekten, Wirbeltieren, Warmblütern und Pflanzen wurden
keine Nebenwirkungen gefunden. Die Sicherheit ist in vielen Versuchen mit Standardmethoden auch
77
an Wirbeltieren bestätigt worden. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat Produkte auf der Basis
von B. thuringiensis israelensis zur Bekämpfung von Stechmückenlarven in Behältnissen, die zur
Lagerung von Trinkwasser dienen, freigegeben.
Zur Anwendung von Bacillus thuringiensis
Die Entwicklung von B. thuringiensis zum weltweit akzeptierten Bioinsektizid verlief sehr langsam,
obwohl erste Feldversuche zur Bekämpfung von Schädlingen in der Landwirtschaft schon bald nach
dessen Entdeckung durchgeführt wurden. Die Anwendungen, insbesondere im Maisanbau zum Schutz
vor dem Maiszünsler (Ostrinia nubilalis) verliefen mit unterschiedlichem Erfolg.
Erst mit den aufkommenden Problemen mit chemischen Insektiziden eroberten Bt-Produkte langsam
ihren Standplatz in Nischen, wo hochwertige Kulturen wie Gemüse zu schützen sind, oder wo der
Schutz von Umwelt und Mensch absolute Priorität hat (Einsatz in Naturschutzgebieten oder
Bekämpfung von Schädlingen in bewohnten Gebieten). Man schätzt, dass heute rund 1% des gesamten
Insektizidmarkts von B. thuringiensis Präparaten abgedeckt wird.
Die oben erwähnte B. thuringiensis Subspezies mit der Bezeichnung tenebrionis lässt sich erfolgreich
zur Bekämpfung des Kartoffelkäfers einsetzen.
Besonders wichtig sind Präparate der Subspezies B. thuringiensis israelensis zur Bekämpfung von
Larvenstadien von Stechmücken und Kribbelmücken, deren Adultstadien nicht nur extrem belästigend
sein können, sondern auch Überträger von tropischen Krankheiten wie Malaria, Elephantiasis oder
Flussblindheit sind.
Die WHO hat mit grossem Erfolg ein Bekämpfungsprogramm finanziert, um in Westafrika die
Flussblindheit unter Kontrolle zu bringen. Dabei gelangten grosse Mengen von B. thuringiensis
israelensis Produkten zum Einsatz. Der Überträger der Flussblindheit ist die Kribbelmücke, Simulium
damnosum, deren Larven sich im fliessenden Wasser entwickeln. Mit Hilfe von Helikoptern wurden
Flussläufe mit Bti (B. thuringiensis israelensis) behandelt. Die Larven nehmen das delta-Endotoxin
auf, werden gelähmt, verlieren die Haftung an den Steinen und werden weggespült. Zusammen mit
chemischen Insektiziden, die während der Regenzeit eingesetzt wurden und dem Chemotherapeutikum
Ivermectin hat die WHO zu Beginn 2003 die Flussblindheit in Westafrika als eliminiert erklärt. Die
Bekämpfungsmassnahmen konnten durch Überwachungsprogramme abgelöst werden.
Es bleibt noch zu erwähnen, dass B. thuringiensis sich grosstechnisch leicht züchten lässt. Viele
Nährmedien, ausgewogen an Kohlehydraten und Stickstoff mit Spurenelementen eignen sich für die
Vermehrung und Sporulation mit gleichzeitiger Parasporalkörperbildung. Die Fermentation erfolgt in
Bioreaktoren von mindestens 100 m3 Volumen. Das fermentierte Produkt mit Sporen und
Parasporalkörpern wird konzentriert und zu verschiedenen Produkten formuliert. Diese kommen als
konzentrierte Flüssigkeiten, als Pulver, als Granulate oder sogar als Tabletten auf den Markt.
Insbesondere die Stabilität von Trockenformulierungen ist gut, und verfügen über eine Haltbarkeit von
mehreren Jahren.
78
Zur Transformation von Kulturpflanzen mit Genen, die für delta-Endotoxin codieren
Da die delta-Endotoxingene auf Plasmiden liegen, war deren Transformation in die Genome von
Kulturpflanzen nur eine Frage der Zeit. Interessant war insbesondere die Bekämpfung von
Schädlingen, welche bei den wichtigen Kulturpflanzen Mais und Baumwolle innere Organe befallen,
und wo die klassische Anwendung von Bt-Produkten versagt. So hatte man nur wenig Erfolg, den
Maisstengelbohrer (Ostrinia nubilalis) durch äussere Bt-Applikationen zu bekämpfen. Die
Entwicklung dieser Lepidoptere kann nur durch delta-Endotoxin blockiert werden, das von den
Pflanzen in ihrem Innern exprimiert wird.
Bekanntlich hat der Anbau von Bt-Kulturpflanzen grosse Kontroversen ausgelöst. In Ländern wie den
USA, Brasilien und Argentinien, China sind Bt-Pflanzen kaum ein Thema mehr. Auf Millionen von
Hektaren werden Bt-Pflanzen angebaut. Auch in der EU ist der Anbau von Bt-Mais gestattet.
Bisher haben Bt-Pflanzen keine negativen Auswirkungen auf die Umwelt gezeigt. Ebenso hatte bisher
der Konsum durch Mensch und Tiere keine negativen Folgen. Das grösste Problem ist die Gefahr der
Entwicklung von Resistenz. Um Resistenz zu verhindern oder wenigstens hinauszuzögern ist den USFarmern vorgeschrieben auf 20% der Maisanbaufläche nicht genetisch veränderte Sorten anzubauen,
damit die Maiszünsler ein Refugium zur Erhaltung des ursprünglichen Genpools vorfinden. In einer
kürzlichen Veröffentlichung haben chinesische Wissenschafter gezeigt, dass Pflanzenschutz unter
Verwendung von Bt-Kulturpflanen sich positiv auf die Kontrolle anderer Insektenschädlinge auswirkt.
Räuber- und Parasiten werden geschont, da man auf den Einsatz chemischer Insektzide verzichten
kann. So können Räuber und Parasiten gegenüber Schädlingen ihre volle Wirkung entfalten.
10.2 Experimente zu Bacillus thuringiensis
Die durchzuführenden Versuche verfolgen drei Ziele. Einmal soll die starke insektentoxische Aktivität
des delta-Endotoxins gegenüber ihren Zielinsekten gezeigt werden. Zweitens soll die Spezifität der
delta-Endotoxine der Subspezies israelensis (Produzent von CryIV) uns kurstaki (Cry1) gezeigt
werden.
Als Testinsekten stehen Larven der Stechmücke Aedes aegypti und Larven des Kohlweisslings (Pieris
brassicae) zu Verfügung. Das Schwergewicht liegt bei Versuchen mit Mückenlarven, da diese uns in
grosser Zahl zur Verfügung stehen.
Versuch 1: Quantitative Bestimmung der insektentoxischen Aktivität von Bacillus
thuringiensis israelensis gegenüber Stechmückenlarven
Herstellung einer Kultur von Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) Stamm 4444. Eine Kultur
von Bti-Sporen wird auf Agarplatten ausgestrichen und bei 30°C während 48 h inkubiert. Bis zu
diesem Zeitpunkt sollten Sporulation und Toxinbildung beendet sein. Die sporulierte Kultur wird von
den Agarplatten abgeschwemmt. Die so erhaltene Stammsuspension enthält etwa 108 Sporen/
Parasporalkörper pro ml. Die Zusammensetzung des Sporulationsmediums ist im Anhang aufgeführt.
Diese Stammsuspension wird den Studierenden zur Verfügung gestellt.
79
Insekten: Eigelege der Stechmücke Aedes aegypti wurden von Dr. Pie Müller, Schweizerisches Tropen
und Public-Health Institut in Basel, auf Filterrondellen erhalten und bis zur Verwendung bei
Raumtemperatur gelagert. Das Filterpapier mit den Eiern wird in eine Glasschale, die mit etwa 5 cm
hoch mit Wasser gefüllt wird, gelegt. Innerhalb weniger Stunden sollten die von blossem Auge kaum
sichtbaren Larven schlüpfen. Als Nahrung wird fein gemahlenes Fischfutter eingestreut. Die Larven
durchlaufen je nach Temperatur (23 - 30°C) innerhalb von 7-10 Tagen die vier Stadien, bevor sie sich
verpuppen und dann als adulte Stechmücken schlüpfen würden.
Den Studierenden erhalten vorgezüchtete Mückenlarven im 3. oder frühen 4. Stadium.
Ausführung: Als Versuchsgefässe dienen Schottflaschen in die je 100 ml Hahnenwasser abzufüllen
sind. Die Ausgangssuspension mit der oben erwähnten Sporenonzentration von rund 108/ml ist nun so
zu verdünnen, dass Endkonzentrationen zum Testen der Mückenlarven zwischen 105/ml und 101/ml
erreicht werden. Dabei sind alle in der unten stehenden Tabelle aufgeführten Zwischenstufen zu testen.
Jede 2er-Gruppe prüft 4 Konzentration sowie eine toxinfreie Wasserkontrolle gemäss nachstehender
Tabelle. Hinzu kommt eine Bti-freie Kontrolle.
Sind die verschiedenen Sporenkonzentrationen hergestellt, so werden jeder Schottflasche mit 100 ml
Suspension 10 Larven von Aedes aegypti zugefügt. Dazu wird das Ende einer blauen Pipettenspitze mit
einer Schere so abgeschnitten, dass die Larven mit der Gilson-Pipette ohne Schaden zu nehmen mit
etwas Wasser aufgesogen und in die Schottflaschen übertragen werden können. Um Kontaminationen
zur vermeiden, werden die Larven zuerst der Kontrolle zugesetzt; und dann ist mit der höchsten
Verdünnung fortzufahren.
Auswertung: Der Versuch wird nach 4 Stunden ausgewertet. Es ist hier anzufügen, dass normalerweise
die Mortalität erst nach einer Expositionsdauer von 24 h bei 30°C bestimmt wird. Die von jeder 2erGruppe erhaltenen Resultate werden gesammelt und zur Bestimmung der Mittelwerte in eine
gemeinsame Tabelle eingetragen.
Auswertung Bti-Versuch: Larvenstadium: % Mortalität nach 4 Stunden
Konzentration
(Sporen/ ml)
1.0 x 105
7.5 x 104
5.0 x 104
2.5 x 104
7.5 x 103
5.0 x 103
2.5 x 103
1.0 x 103
7.5 x 102
5.0 x 102
2.5 x 102
1.0 x 102
Mortalität
Mortalität
Mortalität
Mortalität
Mortalität
Durchschnitt
80
Entscheidend ist diejenige Dosis (Anzahl Sporen/Toxinkristalle pro ml), die benötigt wird um 50 % der
Mückenlarven abzutöten (LD50). Werden die Mortaliäten auf der nachstehenden Probitdarstellung
eingetragen, so sollte eine Gerade resultieren.
Wie die folgende Darstellung zeigt, basiert die Probitdarstellung auf dem Integral der Gausschen
Normalverteilung. Die probit-Transformation dient zur graphischen Linearisierung und Prüfung auf
Normalverteilung experimenteller Daten sowie zur Schätzung der Parameter. Bei der Prüfung von
Insektiziden steigt die konzentrationsabhängige Mortalität sehr langsam an. Sie erreicht einen Peak bei
50%. Die Mortalitätsraten von Überlebenden bei höheren Konzentrationen nehmen langsam ab.
Theoretisch werden 100% Mortalität nie erreicht.
Treten in den Kontrollen Mortalität auf, sind die Resultate mit Abbott’s Formula (nach SchneiderOrelli) zu korrigieren (http://www.ehabsoft.com/ldpline/onlinecontrol.htm#SchneiderOrelli)
Die Beziehung zwischen Gausscher Normalverteilung und Probit:
Normalverteilung und Integral der Normalverteilung sowie Probit-Transformation
81
Probit Darstellung (Wahrscheinlichkeitsnetz mit linearer x-Achse: Beziehung
zwischen Mortalität und Wirkstoffkonzentration.
82
Probit Darstellung (Wahrscheinlichkeitsnetz mit logarithmischer x-Achse:
Beziehung (Beispiel) zwischen Mortalität und Wirkstoffkonzentration.
Versuch 2: Prüfung der spezifischen insektentoxischen Aktivität von zwei
verschiedenen Subspecies von Bacillus thuringiensis
Die Aktivität der delta-Endotoxine von B. thuringiensis kurstaki und B. thuringiensis israelensis wird
an Larven des Kohlweisslings, Pieris brassicae, geprüft.
Dieser Versuch wird von jeder Assistentengruppe durchgeführt.
83
Vorgehen:
Suspensionen der beiden Bacillus thuringiensis Subspezies kurstaki und israelensis werden auf
Rondellen von Kohlblättern mit 2 cm Durchmesser aufgesprüht. Als Kontrolle dienen Rondellen, die
mit der entsprechenden Menge Wasser benetzt wurden.
Die Rondellen werden in Petrischalen gelegt. Jeder Schale werden 1- 3 Larven von Pieris brassicae
zugesetzt. Man lässt die Insekten ad libitum fressen.
Auswertung:
Nach 4 Stunden soll bestimmt werden wie viel Kotpartikel von den Larven ausgeschieden wurde.
B. thuringiensis subspecies
Anzahl Kotpartikel
kurstaki
israelensis
FRAGE 10.1: Was könnte die molekulare Grundlage der beobachteten Spezifität der getesteten B.
thuringiensis-Toxine sein? ANTWORT:
FRAGE 10.2: Ist die beobachtete Spezifität der Bt-Toxine eher ein Vor- oder ein Nachteil bezüglich
ihres Einsatzes als Bioinsektizide? ANTWORT:
11. MYKOLOGIE
84
11. MYKOLOGIE
11.1. Einführung und Uebersicht
Pilze sind eukaryontische Mikroorganismen, die phylogenetisch neben Pflanzen, Tieren, Bakterien und
Archaeen ein eigenes Reich („The fifth kingdom“) bilden. Es handelt sich dabei um heterotrophe
Organismen, die ökologisch eine wichtige Rolle als Destruenten von totem organischem Material
(Saprophyten) sowie als Symbionten (Mycorrhiza) und Parasiten (Mycosen) von Pflanzen (und Tieren)
spielen. Die mit dieser Ernährungsweise einhergehende, effiziente Sekretion von Eiweissen (Enzymen)
wird in der Biotechnologie ausgenutzt. Weitere wichtige Merkmale der Pilze sind ihre chitinhaltige
Zellwand und die Verbreitung durch Sporen. Als Eukaryonten sind die Pilze als einzige
Mikroorganismen neben der asexuellen zur sexuellen Vermehrung fähig. Deshalb zeichnen sich Pilze
durch eine extreme und oft verwirrende Vielfalt von Lebenszyklen und -formen aus (siehe auch Kap. 7
Versuch 1: Kreuzung von Bäckerhefe). Die Klassifikation erfolgt dabei nach den Formen der sexuellen
Sporenbildung (siehe unten).
In der Lebensmittelmikrobiologie spielen Pilze eine wichtige Rolle bei der Erschliessung (leichtere
Verdaubarkeit) und Haltbarmachung von Lebensmitteln (Bier, Wein, Käse, Sojaprodukte). Andererseits werden jährlich riesige Mengen von Lebensmitteln durch Pilze zerstört (Früchte, Getreide).
Zudem gibt es Pilze die Toxine produzieren (z.B. Aflatoxin), die beim Menschen und Nutztieren
nachhaltige Schäden verursachen können.
Dieser Kurs hat zum Ziel, einige Pilze mit ihren Strukturen im Mikroskop kennenzulernen und sich mit
ihrer speziellen Lebensweise vertraut zu machen.
11.2. Morphologie
Vegetatives Wachstum
Pilze wachsen entweder mehrzellig als Hyphen oder durch Sprossung oder Teilung von einzelnen
Zellen.
Filamentöse (mehrzellige) Pilze
Bei den Hyphen handelt es sich um Zellfäden mit einer Dicke von 1 - 20 µm, die von einer Zellwand
umgeben sind. Meist sind die Hyphen durch Querwände (Septum, Mz.: Septa) unterteilt. Eine
Hyphenzelle kann einen einzigen oder mehrere Kerne enthalten, die im Mikroskop jedoch nur mit
speziellen Färbungen sichtbar werden. (Abb. 11.1A). Hyphen verzweigen sich und bilden ein Geflecht,
das man als Myzel bezeichnet wird und von Auge meist sichtbar ist (Abb. 11.1B). Myzelwachstum
findet ausschliesslich an der Spitze der Hyphen statt (Spitzenwachstum). Als Thallus bezeichnet man
den ganzen Pilzkörper, der aus dem vegetativen Myzel mit differenzierten Vermehrungsorganen
besteht.
11. MYKOLOGIE
85
Abb. 11.1. Filamentöses Pilzwachstum (mehrzellig). A: Hyphenstück mit Septen und Zellkernen
(punktiert); B: Myzel gebildet aus verzweigten Hyphen.
Hefeartige (einzellige) Pilze
Ein Beispiel dafür sind Hefen. Ausserdem wachsen einige filamentöse Pilze (z.B. Rhizopus sp., Mucor
sp.) in bestimmten Entwicklungsstadien oder unter besonderen ökologischen Bedingungen als
Einzelzeller ("hefeartig") (Hefe-Myzel-Dimorphismus).
Einzellige Pilze vermehren sich durch Sprossung oder Teilung. Bei der Sprossung (Saccharomyces
cerevisiae) entwickeln sich aus der Mutterzelle Tochterzellen, die dann unter Hinterlassen von Narben
abgetrennt werden. (Abb. 11.2A, 2B). Bei der Spalthefe (Schizosaccharomyces pombe) verläuft die
Zellteilung ähnlich wie bei Bakterien durch Teilung (Abb. 11.2C).
Abb. 11.2. Hefeartiges Pilzwachstum (einzellig). a: Multipolare Sprossung (Saccharomyces);
b: bipolare Sprossung (Saccharomycodes); c: Zellteilung (Schizosaccharomyces).
1: Mutterzelle, 2: Tochterzelle, 3,4: Sprossnarben.
11. MYKOLOGIE
86
Sporenbildung
Pilze sichern sich das langfristige Überleben und die räumliche Verbreitung durch Sporen. Der
komplizierte Differenzierungsprozess führt entweder zu asexuellen oder sexuellen Sporen. Bei der
Bildung der asexuellen Sporen findet kein Wechsel der Kernphase statt. Die sexuelle (geschlechtliche)
Sporenbildung geht mit einem Wechsel der Kernphase einher. Der Kernphasenwechsel basiert auf
Befruchtung und schliesst eine Meiose mit ein.
Je nach Pilzart kennt man nur die asexuelle oder sexuelle oder dann beide Vermehrungsarten. Daher ist
ein Pilz oft unter zwei Namen bekannt: ein Name wird für die asexuelle Form (Anamorph), der andere
für die sexuelle (Teleomorph) verwendet. Beide Formen charakterisieren eine Pilzart (Holomorph).
Beispiel: Fusarium graminearum und Gibberella zeae bezeichnen den gleichen Pilz. Allerdings wird
der Name Fusarium verwendet, um die asexuelle Sporulationsform zu bezeichnen, während mit
Gibberella die sexuelle Form bezeichnet wird. Man sagt in diesem Falle, dass Fusarium die anamorphe
Form von Gibberella ist.
Formen der asexuellen Sporenbildung
Endogene Sporenbildung: Diese basiert auf Sporangien in deren Innern sich die Sporangiosporen
bilden (z. B. bei Rhizomucor miehei, Rhizopus sp. = Zygomycota). Sporangien entstehen am Ende von
zu Sporangienträgern (Sporangiophoren) differenzierten Hyphen. Oft ragt eine blasenförmige
Ausstülpung (Kolumella) in das Sporangium (Abb. 11.3A). Der deutsche Name „Köpfchenschimmel“
leitet sich von dieser speziellen Morphologie der Sporangiophoren ab.
Abb. 11.3: Formen der asexuellen Sporenbildung. A. Sporangium mit endogener Sporenbildung
(Rhizopus nigricans). 1: Sporangienträger; 2: Sporangium mit Sporangiosporen (3); 4: Kolumella. B.
Konidienträger mit exogener Sporenentwicklung (Penicillium sp.). 5: Konidienträger; 6: Metulae
(Verzweigung 1.Grades); 7: konidiogene Zelle (in diesem Falle Phialide genannt, Verzweigung 2.
Grades); 8: Konidien (in Ketten); die sich aus der Phialidenspitze (9) bilden.
Exogene Sporenbildung: An Konidienträgern bilden sich Konidiosporen. Die Morphogenese der
Konidien kann verschiedenartig erfolgen. Hier sei das Beispiel von Penicillium (anamorphe Form z.B.
11. MYKOLOGIE
87
von Talaromyces) erwähnt. Bei Penicillium verzweigen sich die Konidienträger in der Scheitelregion
zu einem dichten Pinsel (daher der deutsche Name „Pinselschimmel“); an den Enden entwickeln sich
Ketten von Konidien (Abb. 11.3B).
Formen der sexuellen Sporenbildung
Wir unterscheiden im Wesentlichen drei Formen der sexuellen Sporenbildung:
Zygosporen (Rhizomucor miehei). Die Zygosporenbildung erfolgt endogen in einem
Zygosporangium (Abb. 11.4A).
Ascosporen (Sordaria macrospora). Die Ascosporenbildung endogen in einem Ascus (Abb.
11.4B).
Basidiosporen (Coprinus cinereus). Die Basidiosporenbildung erfolgt exogen an einer Basidie
(Abb. 11.4C).
In den letzten beiden Fällen kommt es nach der Befruchtung nicht direkt zur Kernverschmelzung. Die
beiden verschieden-geschlechtlichen Zellkerne bleiben getrennt und vermehren sich mitotisch. Man
nennt diesen Zustand (Karyophase) dikaryotisch. Bei Ascomyceten ist diese Phase auf die ascogenen
Hyphen innerhalb des Fruchtkörpers (Ascom mit Asci) beschränkt, deren Bildung unmittelbar an die
Plasmogamie anknüpft. Basidiomyceten können sich in diesem Zustand als dikaryotisches Myzel
vegetativ vermehren und es kommt erst unter bestimmten Umweltbedingungen zur Bildung des
sexuellen Fruchtkörpers (Basidiom mit Basidien). Die zweite Phase der Befruchtung erfolgt im Ascus
resp. in der Basidie, wo es zur Verschmelzung der beiden Zellkerne kommt. Der entstandene diploide
Kern teilt sich anschliessend meiotisch. Je nachdem, ob anschliessend eine Mitose folgt, resultieren 4
(bei Basidiomycota) oder 8 (bei Ascomycota) haploide Kerne.
Abb. 11.4: Formen der sexuellen Sporenbildung. A. Ascus mit 8 endogenen Ascosporen (Sordaria
macrospora); B. Basidie mit vier exogen an Sterigmen entstehenden Basidiosporen (Coprinus
cinereus). C. Zygospore mit endogener Bildung einer Meiospore, die dann mitotisch zu einem
Sporangium (Zygosporangium) auskeimt (Rhizomucor miehei).
11. MYKOLOGIE
88
Versuch 1: Bestimmung der Zellzahl einer Hefekolonie
Ziel:
Um sich eine bessere Vorstellung der Grösse von Mikroorganismen und der Koloniegrössen einzelliger
Mikroorganismen zu machen, soll die Zellzahl einer Kolonie von Hefezellen mittels einer sogenannten
Neubauer-Zählkammer (improved) sowie durch Ausplattieren von entsprechenden Verdünnungen
ermittelt werden.
Material:
Pro Zweiergruppe:
- Hefekolonie (Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae) auf YPD-Agarplatte (Hefe-Vollmedium)
- Neubauer(improved)-Zählkammer mit speziellem Deckglas (BITTE KAMMER UND DECKGLAS
NACH GEBRAUCH WASCHEN UND WIEDER IN PLASTIKSCHACHTEL VERRÄUMEN!)
- 3 unbeimpfte YPD-Agarplatten
Vorgehen Zählkammer:
1. Die Zellen einer einzelnen Hefekolonie werden in einem sterilen Eppendorfgefäss in 500 l sterilem
Wasser resuspendiert und eine 1:10 Verdünnung dieser Suspension hergestellt.
2. Ein Deckglas wird auf die auf den äusseren Stegen mit Wasser befeuchtete Zählkammer aufgebracht,
so dass sich Interferenzlinien (Newtonsche Ringe) bilden.
3. ca. 10 l der verdünnten Zellsuspension werden mittels Kapillarwirkung zwischen Deckglas und
Zählkammer pipettiert.
4. Die Zellen von 5 Gruppenquadraten innerhalb des zentralen Zählquadrates (vgl. Abb. 5.1) werden
ausgezählt (Zellen auf linken und oberen Rändern der Gruppenquadrate werden mitgezählt) der
Mittelwert ermittelt. Diese Zahl mal 250 ergibt die Zellzahl pro l. Errechnen Sie daraus die Zahl der
Zellen für die ganze Kolonie.
11. MYKOLOGIE
89
Abb. 11.5: Neubauer (improved) Zählkammer mit Aufbau des Zählfeldes. Man beachte die
Grössenangaben – die Seitenlänge des kleinsten Quadrates beträgt 20 µm!
Vorgehen Ausplattieren:
1. Es werden in 10er Schritten eine 1:100, eine 1:1000 und eine 10’000 Verdünnung obiger
Zellsuspension in 500 l sterilem Wasser hergestellt und jeweils 250 ul jeder Verdünnung mittels
Drigalsky-Spatel auf eine YPD-Agarplatte verteilt.
2. Die Agarplatten werden übers Wochenende bei 30°C inkubiert.
3. Die errechnete Gesamtzahl der gewachsenen Kolonien entspricht der Zahl der (lebenden) Zellen in
der Kolonie.
Resultate:
Zählkammer: ______Hefezellen pro Kolonie
Ausplattieren: ______Hefezellen pro Kolonie
FRAGE 11.1: Liefern beide Methoden notwendigerweise dasselbe Ergebnis? ANTWORT:
FRAGE 11.2: Wie gross schätzen sie entsprechend die Zellzahl einer Bakterienkolonie derselben
Grösse? Begründen sie ihre Schätzung. ANTWORT:
11. MYKOLOGIE
90
Versuch 2: Mikroskopie pilzlicher Erscheinungsformen
Ziel: Erkennen der in den Abb. 11.1 bis 11. 4 dargestellten Erscheinungsformen.
Zu mikroskopierende Pilze (Reich: EUMYCOTA) und deren Merkmale:
Abteilung: ASCOMYCOTA (SCHLAUCHPILZE)
1. Saccharomyces cerevisiae (Sc) (Bäcker-, Bier- oder Weinhefe)
Material: 2 verschiedene Agarplatten (YPD und HSpo) mit Trockenhefe von der Migros
Präparation: Zellsuspension in Wasser unter Mikroskop mit Phasenkontrast und 400x Vergrösserung
Merkmale: asexuelle Vermehrung durch Sprossung (YPD), sexuelle Vermehrung durch 4 Ascosporen
in „nacktem“ Ascus (Spo)
2. Sordaria macrospora (Sm)
Material: Agarplatte mit Myzel und schwarzen, stecknadelkopfgrossen Fruchtkörpern
Präparation: Ernten von Fruchtkörpern unter Binokular, gequetschte Fruchtkörper in Wasser unter
Mikroskop mit Phasenkontrast und 100x bis 400x Vergrösserung
Merkmale: keine Vermehrung durch asexuelle Sporen bekannt, sexuelle Vermehrung durch 8
Ascosporen in in Fruchtkörper (Perithezium) eingebettetem Ascus
11. MYKOLOGIE
91
3. Aspergillus oryzae (Ao) (Grünschimmel)
Material: Agarplatte und Agarobjektträger
Präparation: Agarplatte unter Binokular, Agarobjektträger unter Mikroskop mit Phasenkontrast und
400x Vergrösserung
Merkmale: unterteiltes (septiertes) Myzel, asexuelle Vermehrung durch Konidiosporen
Abteilung: ZYGOMYCOTA (JOCHPILZE)
4. Mucor rouxii (Mr)
Material: Agarplatte und Agarobjektträger
Präparation: Agarplatte unter Binokular, Agarobjektträger unter Mikroskop mit Phasenkontrast und
400x Vergrösserung
Merkmale: unseptiertes Myzel, asexuelle Vermehrung durch Sporangiosporen
11. MYKOLOGIE
92
5. Phycomyces blakesleeanus (Pb) (Oelpilz)
Material: Agarplatte mit 2 Kreuzungspartnern (AxB)
Präparation: Agarplatte unter Binokular
Merkmale: asexuelle Vermehrung durch Sporangiosporen, sexuelle Vermehrung durch Zygosporen
Abteilung: BASIDIOMYCOTA (HUT- ODER STÄNDERPILZE)
6. Sarcodon imbricatus (Habichtspilz)
Material: getrocknete Fruchtkörper
Präparation: einzelner, rehydrierter und gequetschter Stachel in 3% KOH unter Mikroskop mit
Phasenkontrast und 400x Vergrösserung
Merkmale: Schnallenbildung an Septen, keine Vermehrung durch asexuelle Sporen bekannt, sexuelle
Vermehrung durch 4sporige Basidien an stachelförmiger Fruchtschicht (Hymenium) von hutförmigem
Fruchtkörper
11. MYKOLOGIE
93
7. Agaricus bisporus (Champignon)
Material: Agarplatte, frische reife Fruchtkörper (nach Verfügbarkeit)
Präparation: Sporenabdruck und Mikroskopie (Phasenkontrast und 400x Vergrösserung) der
Basidiosporen durch Resuspension eines Stücks Lamelle in sterilem Wasser.
Merkmale: keine Vermehrung durch asexuelle Sporen bekannt, sexuelle Vermehrung durch
zweisporige Basidien an blättriger (lamellenartiger) Fruchtschicht (Hymenium) von hutförmigem
Fruchtkörper
Hinweise zur Präparation:
3% KOH wird benutzt zur Rehydrierung von getrockneten Proben (siehe No. 6)
Versuch 3: Verbreitung durch Sporen
Ziel: Die Verbreitung von Pilzen durch asexuelle Sporen soll durch Ausplattieren von
Sporensuspensionen auf Nährmedien demonstriert werden.
Material:
- sporulierte Schrägagarkulturen von Aspergillus oryzae (asexuelle Konidiosporen) und Phycomyces
blakesleeanus (B) (asexuelle Sporangiosporen)
- pro Pilz 3 unbeimpfte CMA (Corn Meal Agar)-Platten
Vorgehen:
1. Herstellung der Sporensuspensionen: Schrägagarkulturen mit 1 ml sterilem Wasser überschichten
und kräftig schütteln.
2. Sporensuspension in steriles Eppendorfgefäss dekantieren.
11. MYKOLOGIE
94
3. Von den beiden Sporensuspension je eine 1:100, eine 1:1000 und eine 1:10000 Verdünnung in
sterilem Wasser herstellen. Die konzentrierten Suspensionen nicht verwerfen, werden für Versuch 5
bzw. Versuch 6 benötigt.
4. Je 100 l der Verdünnungen mittels Drigalsky-Spatel auf CMA-Platten plattieren.
5. Platten während 3 Tagen bei Raumtemperatur (Aspergillus) bzw. 18°C (Phycomyces) inkubieren.
Auswertung: Berechnen Sie anhand der Zahl von Pilzkolonien die Zahl der asexuellen Sporen pro ml
Sporensuspension:
Aspergillus oryzae: ________ Sporen / ml
Phycomyces blakesleeanus: ________ Sporen / ml
11.3. Physiologie
Temperatur, Feuchtigkeit und Licht sind wichtige Faktoren, die das Wachstum und die Entwicklung
von Pilzen beeinflussen.
Temperatur
Man unterscheidet zwischen psychrophilen (kälteliebenden) Arten, die noch bei Temperaturen unter
0°C wachsen, mesophilen, die bei mittleren Temperaturen, und thermophilen Pilzen, die noch oberhalb
von 40°C wachsen.
Versuch 4: Bestimmung von minimalen, optimalen, und maximalen
Wachstumstemperaturen
Ziel: Die optimalen Wachstumstemperaturen von drei verschiedenen Pilzen sollen bestimmt werden.
Material:
- Platten mit den entsprechenden Pilzkulturen (siehe untenstehenden Tabelle) - Rondellen wurden mit
einem Korkbohrer auf den Platten vorgestanzt.
- Unbeimpfte CMA-Platten
Ausführung:
Je eine Pilzrondelle wird auf die Mitte einer frischen Maisagar (CMA) Platte übertragen. Pro Pilz wird
eine Petrischale bei Temperaturen von 10, 25 und 37°C während einer Woche inkubiert.
Auswertung:
Die Durchmesser der Pilzkolonien werden nach 4 Tagen gemessen. Die gemessenen Werte werden in
die beiliegende Tabelle eingetragen. Sind genügend Daten vorhanden, lässt sich das
temperaturabhängige Wachstumsverhalten der einzelnen Pilze graphisch darstellen.
11. MYKOLOGIE
95
Durchmesser (cm) der Pilzkolonie
Pilz
Code
Coprinus
Cp
10°C
25°C
37°C
psychromorbidus
(Basidiomyzet)
Gibberella zeae
Gz
(Ascomyzet)
Rhizomucor miehei
Rm
(Zygomyzet)
FRAGE: Wo in der Natur würden sie erwarten, den Pilz Rhizomucor miehei anzutreffen?
Substratfeuchtigkeit/Luftfeuchtigkeit
Pilze benötigen für ihr Wachstum genügend Feuchtigkeit. Wassermangel führt zur Reduktion des
Metabolismus und damit zur Verlangsamung der Substratbesiedlung. Wasser liegt in manchen
Lebensmitteln (Substraten) in gebundener Form vor und steht den Pilzen nicht zur Verfügung. Deshalb
kommt der Luftfeuchtigkeit eine entscheidende Bedeutung zu. Pilze, die noch sehr niedrige
Feuchtigkeitswerte tolerieren, werden als xerotolerant bezeichnet, solche, die solche bevorzugen, als
xerophil.
Licht und Schwerkraft
Obwohl Pilze chemoorganotroph sind und keine Photosynthese betreiben, besitzen sie Lichtrezeptoren,
die z.B. die Entwicklung der Sporenbildung regulieren. Pilze „fühlen“ auch die Schwerkraft und
richten ihre sporenbildenden Strukturen entsprechend aus. Der Zygomyzet Phycomyces blakesleeanus
ist ein bekanntes Modell für die physiologischen Auswirkungen von Licht und Schwerkraft bei Pilzen.
Versuch 5: Phototropismus und Lichtregulation der Sporenbildung
Material:
- Sporensuspension von Phycomyces blakesleeanus (B) aus Versuch 2
- 3 Reagenzgläser mit je 3 ml CMA-Agar (pro 2er-Gruppe)
- Alufolie
11. MYKOLOGIE
96
Vorgehen:
- Jedes Reagenzglas wird 0.1 ml Sporensuspension beimpft. Ein Reagenzglas wird mit Alufolie
eingepackt bis oben nur noch ein ca. 5 mm breiter Streifen freibleibt. Die anderen RG werden ganz
(inkl. Deckel) mit Alufolie eingepackt. Bei einem der beiden RG wird auf einer Seite auf halber Höhe
ein rundes Loch (Durchmesser 5 mm) aus der Alufolie herausgeschnitten. Die Reagenzgläser werden
bei konstantem Licht bei 23°C senkrecht (um Einflüsse der Schwerkraft auszuschliessen) inkubiert.
Auswertung:
Vergleichen Sie die bei unterschiedlichen Bedingungen inkubierten Reagenzgläser miteinander.
Zeichnen sie die beobachtete Morphologie des Pilzes in das untenstehende Schema (Mond steht für
Dunkelheit, Sonne für Licht). Wie äussert sich der Phototropismus bzw. die lichtabhängige
Entwicklung des Pilzes?
FRAGE 11.3: Weshalb ist wohl die Sporenproduktion von Pilzen Licht- und Schwerkraft-reguliert?
ANTWORT:
Gasaustausch
Nicht nur die asexuelle, sondern auch die sexuelle Sporenbildung von Pilzen ist von Umwelteinflüssen
abhängig. Neben dem Licht spielt die CO2-Konzentration bei der Bildung von Fruchtkörpern durch
Asco- und Basidiomyzeten eine grosse Rolle.
11. MYKOLOGIE
97
Aufschluss von Substraten durch Exoenzyme
Pilze können fast alle natürlich vorkommenden C-Verbindungen, auch komplexe und unlösliche
Substrate wie Zellulose und Lignin (Hauptbestandteile von pflanzlichen Zellwänden), mit Hilfe von
Exoenzymen abbauen und nehmen deshalb eine herausragende Rolle beim C-Kreislauf ein. Gewisse CVerbindungen wie Stärke, Lipide und Proteine können auch durch Bakterien abgebaut werden. Die
löslichen Abbauprodukte werden von den Hyphen als Nährstoff- und Energiequellen aufgenommen.
Die verschiedenen Pilzarten produzieren verschiedene Exoenzyme und unterscheiden sich daher in
ihren Fähigkeiten Naturstoffe abzubauen. Das folgende Experiment soll dies demonstrieren.
Versuch 6: Nachweis der amylolytischen und proteolytischen Aktivität
Material:
- pro 2er-Gruppe je 1 Stärkeagar- und Milchagar-Platte
- Petrischalenkulturen von Aspergillus oryzae (Ascomyzet), Agaricus bisporus (Basidiomyzet),
Phycomyces blakesleeanus (Zygomyzet) mit vorgestanzten Rondellen
- Kaliumjodid-Lösung (1g kristallines Jod, 2g KJ, 300 ml destilliertes Wasser)
Ausführung:
Die Rondellen, die als Impfmaterial verwendet werden, sind bereits mit einem Korkbohrer vorgestanzt
worden. Die Stärkeagar- und Milchagar-Platten werden mit je einem Impfstück, das mit dem Pilzrasen
nach unten in die Mitte der Schale gelegt wird, gemäss untenstehendem Schema beimpft (Platten vor
Beimpfen auf Unterseite beschriften - nach Beimpfen NICHT mehr drehen, da sonst das Impfstück
abfallen könnte!). Die Platten werden während 6 Tagen bei 4°C inkubiert, um ein zu starkes Wachstum
der Pilze, das die Auswertung des Experimentes stören kann (Höfe wegen Ueberlagerung mit
Pilzkolonie nicht sichtbar), zu vermeiden.
Auswertung:
Stärkeagar: Die Agarschicht der inkubierten Platte wird sorgfältig vom Boden der Petrischale gelöst
und mit der Pilzschicht nach unten in den Deckel der Schale gekippt. Der Agar wird mit KaliumjodidLösung übergossen. Die Stärke verfärbt sich blau. Wo Stärke bis zur Glucose hydrolysiert wurde,
bleibt der Agar farblos. Rotbraune Zonen zeigen einen teilweisen Abbau der Stärke bis zu
Erythrodextrin an.
Milchagar: Das Milcheiweiss in den Milchplatten ist als Trübung erkennbar. Eine Klärung um die
Pilzkolonie zeigt einen Abbau des Milcheiweisses an.
Zeichne die beobachteten Höfe auf untenschehendem Schema ein:
11. MYKOLOGIE
Welche Schlüsse ziehen sie bezüglich der bevorzugten Substrate der jeweiligen Pilze?
FRAGE 11.4: Welches sind die Vorteile einer filamentösen, multizellulären gegenüber einer
unizellulären Wachstumsform? ANTWORT:
98
12. ANHANG
99
12. ANHANG
Medienrezepte (beispielhafte Auswahl)
H-Agar
Luria Bertani Glucose (LBG) Medium
Trypton
10
g/l
Trypton
10
g/l
NaCl
5
g/l
Hefeextrakt
5
g/l
Agar-Agar
15
g/l
NaCl
5
g/l
Dextrose
5
g/l
Agar-Agar
15
g/l
Weichagar (H-Top Agar)
Trypton
10
g/l
NaCl
5
g/l
Tryptone Bile Glucuronid Agar (TBX)
Agar-Agar
6.5
g/l
Gallensalze, gereinigt
1.5
g/l
5-Brom-4-chlor-3-indolyl--D-
0.075
g/l
Hefe-Komplettmedium (YPD)
glucuronsäure Cyclohexyl-
Hefeextrakt
10
g/l
ammoniumsalz
Pepton
20
g/l
Pepton
20
g/l
Dextrose
20
g/l
Agar-Agar
15
g/l
Agar-Agar
15
g/l
6.7
g/l
Hefe-Minimalmedium (MV)
Hefe-Sporulationsmedium (HSpo)
Yeast Nitrogen Base w/o
Kaliumacetat
10
g/l
amino acids
Hefextrakt
1
g/l
Dextrose
20
g/l
Dextrose
0.5
g/l
Agar-Agar
15
g/l
Agar-Agar
15
g/l
pH 6.0
Milch-Agar (LA)
Maismehlagar (CMA)
Magermilchpulver
20
g/l
Maismehl-Agar (Difco)
8.5
g/l
Pepton
5
g/l
Malzextrakt
5
g/l
MgSO4
0.25
g/l
10% KOH
2
ml/l
KH2PO4
0.5
g/l
Agar-Agar
7.5
g/l
Agar-Agar
15
g/l
Malzextrakt
30
g/l
Agar-Agar
15
g/l
Malzagar (MA)
Stärke-Agar (für Pilze)
Lösliche Kartoffelstärke
2
g/l
Pepton
10
g/l
MgSO4
0.25
g/l
KH2PO4
0.5
g/l
Agar-Agar
15
g/l
12. ANHANG
100
Sporulationsmedium für Bacillus (BSpo)
Minimalmedium (MME) für E.coli
Dextrose
3.0
g/l
MgSO4.7H2O
0.2
g/l
Hefeextrakt
2.0
g/l
NaCitrat.2H2O
2.5
g/l
(NH4)2SO4
2.0
g/l
K2HPO4
10.5
g/l
K2HPO4 . 3H2O
0.5
g/l
NaNH4HPO4.4H2O
3.5
g/l
MgSO4 . 7H2O
0.2
g/l
Dextrose
5
g/l
MnSO4 . 4H2O
0.05
g/l
Agar-Agar
15
g/l
CaCl2 . 2H2O
0.08
g/l
pH 7.5
Trypton
10
g/l
Hefeextrakt
5
g/l
Dextrose
10
g/l
K2HPO4
2
g/l
CaCO3-
3
g/l
Agar-Agar
15
g/l
pH 7,3
Milchsäure(MS)-Agar:

mikrobiologie

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