Funktionelle Untersuchungen zum HTLV Rex-Protein und dem
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Funktionelle Untersuchungen zum HTLV Rex-Protein und dem
Funktionelle Untersuchungen zum HTLV Rex-Protein und dem potentiellen Interaktionspartner Staufen-1 Bachelorarbeit im Bachelor-Studiengang Biotechnologie/ Biotechnology der Beuth Hochschule für Technik Berlin – University of Applied Sciences – zur Erlangung des akademischen Grades eines Bachelor of Science (B. Sc.) vorgelegt von Nadine Lehmann August 2012 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Dr. Norbert Bannert, der es mir ermöglicht hat meine Bachelorarbeit am Robert Koch-Institut im Zentrum für HIV und Retrovirologie durchzuführen. Ich möchte mich auch herzlich bei Dr. Kirsten Hanke bedanken, die mich während meiner gesamten Zeit am RKI betreut hat und mir in vielen Gesprächen hilfreich zur Seite stand. Bei Prof. Dr. A. Speer möchte ich mich für die Übernahme der Betreuung und für die Begutachtung meiner Arbeit bedanken. Für die Einarbeitung am cLSM und die Hilfe bei mikroskopischen Arbeiten bedanke ich mich herzlich bei Dr. Kazimierz Madela. Meiner Arbeitsgruppe danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die hilfreiche Unterstützung im Labor. Besonderer Dank geht dabei an Dr. Oliver Hohn für die kritische Durchsicht dieser Arbeit. Ebenso bedanke ich mich bei Veronika Lausch für die Cavidi-Messung. Von ganzem Herzen möchte ich mich bei Jörg Dittmer bedanken, der mich in jeder Hinsicht unterstützt und an mich glaubt. Zum Schluss möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir durch ihre Liebe und Unterstützung so viel Halt gegeben haben. Abkürzungsverzeichnis AD Aktivierungsdomäne APOBEC3G / A3G ATL Adulte T-Zell-Leukämie BSA Bovine Serum Albumin CIP Alkaline Phosphatase Calf Intestinal cLSM konfokales Laser Scanning Mikroskop FKS Fetales Kälberserum HERV Humane Endogene Retroviren HIV Humanes Immundefizienz-Virus HTLV-1 Humanes T-Zell-Leukämie-Virus-1 IF Immunfluoreszenz-Färbung IP Immunpräzipitation NES Kernexportsignal NLS Kernlokalisationssignal LTR Long Terminal Repeat RBD RNA-Bindedomäne Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...........................................................................................................................I 1.1 Das erste humane Retrovirus HTLV-1 .......................................................................... I 1.2 Die Regulation der HTLV-1-Replikation ...................................................................... I 1.3 Das HTLV-1 Rex-Protein ............................................................................................ II 1.4 Das humane Staufen-1-Protein ................................................................................... III 1.5 Antivirale Abwehrmechanismen ................................................................................ IV 2 Zielsetzung ....................................................................................................................... V 3 Material und Methoden ................................................................................................. VI 3.1 3.1.1 Laborgeräte und Apparaturen............................................................................... VI 3.1.2 Reagenzien, Puffer und Medien ........................................................................... VI 3.1.3 Chemikalien, Enzyme und Enzympuffer .......................................................... VIII 3.1.4 Kits ....................................................................................................................... IX 3.1.5 Größenstandards ................................................................................................... IX 3.1.6 Bakterienstämme .................................................................................................. IX 3.1.7 Eukaryotische Zelllinien ...................................................................................... IX 3.1.8 Plasmide ............................................................................................................... IX 3.1.9 Antikörper ............................................................................................................. X 3.2 4 Materialien .................................................................................................................. VI Methoden .................................................................................................................... XI 3.2.1 Übersicht der Methoden ....................................................................................... XI 3.2.2 DNA-Analytik .....................................................................................................XII 3.2.3 Zellkultur ........................................................................................................... XIV 3.2.4 Proteinanalytik ................................................................................................... XV Ergebnisse ................................................................................................................. XVIII 4.1 Nachweis der Interaktion zwischen HTLV-1 Rex und Staufen-1 ........................ XVIII 4.2 Abhängigkeit der HTLV-1 Rex-Lokalisation von Staufen-1 .................................. XXI 4.3 Bestimmung der Staufen-1 interagierenden Domäne ............................................. XXII 4.4 Einfluss von Staufen-1 auf die HTLV-1 Partikelbildung ..................................... XXIV 4.5 Staufen-abhängiger Rex-Transport in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe XXVI 5 Diskussion ................................................................................................................. XXIX 5.1 Interaktion von HTLV-1 Rex und Staufen-1 ........................................................ XXIX 5.2 Einfluss von Staufen-1 auf die Partikelbildung von HTLV-1 .............................. XXXI 5.3 Antivirale Abwehrmechanismen ......................................................................... XXXII 6 Zusammenfassung ................................................................................................. XXXIV 7 Abstract ....................................................................................................................XXXV 8 Literatur ........................................................................ Fehler! Textmarke nicht definiert. 9 Anhang .......................................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert. 1 Einleitung 1 1.1 I Einleitung Das erste humane Retrovirus HTLV-1 Seit Anfang des 20. Jahrhunderts wurde in der Krebsforschung ein besonderes Augenmerk auf Retroviren gerichtet, da zu dieser Zeit Tumor-induzierende Retroviren aus verschiedenen Tieren isoliert werden konnten [1]. Zu nennen sind hier u.a. das Hühner-Leukämievirus (Ellermann und Bang 1908) und das Maus-Mammatumor-Virus ( Bittner 1936) [2]. Diesbezügliche Untersuchungen brachten neue Erkenntnisse zu den Ursachen und Mechanismen von Krebserkrankungen. Bemühungen ein humanes Tumor-Retrovirus zu identifizieren, blieben jedoch lange Zeit erfolglos. (Voisset Weiss 2008) Erst die Entdeckung der Adulten T-Zell-Leukämie (ATL) 1977 war der Grundstein, welcher zur Erforschung humaner Retroviren führte [4]. Um 1980 wurde schließlich ein humanes Retrovirus in einer Zelllinie eines ATL-Patienten entdeckt und als Humanes T-Zell-LeukämieVirus-1 (HTLV-1) beschrieben (Poizes 1982) [5]. Der Zusammenhang zwischen HTLV-1 und der Adulten T-Zell-Leukämie konnte bestätigt werden, als in ATL-Patientenseren gegen HTLV-1 gerichtete Antikörper gefunden wurden [6,7]. Von den rund 10 bis 20 Millionen HTLV-1-Infizierten weltweit [8] erkranken allerdings nur 3-5 % an ATL, wohingegen der Rest keinerlei Symptome aufweist [1]. Des Weiteren kann das Virus HTLV-1 assoziierte Myelopathie/tropische spastische Paraparese verursachen [6]. Seit der Entdeckung der Adulten T-Zell-Leukämie und HTLV-1 ist es endlich möglich die Ursachen sowie die Entstehung von Krebs durch Retroviren und den Krankheitsverlauf direkt am Menschen zu erforschen. Die Erkenntnisse aus der HTLV-Forschung werden möglicherweise zu dem allgemeinen Verständnis von Krebs, Immunreaktionen und möglichen Behandlungstherapien beitragen [9]. 1.2 Die Regulation der HTLV-1-Replikation Nach erfolgter viraler Infektion einer Wirtszelle wird zunächst das virale RNA-Genom durch die Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben, welche im Zellkern an einer zufälligen Stelle in das Wirtsgenom integriert [10]. Das HTLV-Provirusgenom besitzt neben der für alle Retroviren typischen LTR-gag-pol-env-LTR-Sequenz eine zusätzliche px-Region. Diese px- 1 Einleitung II Region kodiert alternative Leserahmen für verschiedene Proteine wie u.a. das Tax- und RexProtein, welche maßgeblich an der Virusreplikation beteiligt sind (siehe Abbildung 1) [1]. Abbildung 1: Regulation der HTLV-1-Replikation: Das provirale HTLV-Genom besitzt eine zusätzliche pxSequenz, welche u.a. für die Proteine Tax und Rex kodiert. Tax und Rex entstehen aus doppelt gespleißter mRNA mit alternativen Leserahmen. Tax verstärkt die Transkription der viralen Gene und führt zu einem Anstieg der mRNA Menge (1). Rex verhindert das Spleißing dieser mRNA (2). Es folgt die Akkumulation ungespleißter und einfach gespleißter Transkripte, die der Translation der viralen Proteine Gag, Pol und Env dienen (3). [1] Zu Beginn der HTLV-Replikation werden die transkribierten Volllängen-mRNAs komplett gespleißt, wodurch Tax und Rex exprimiert werden. Durch Interaktion mit der 5‘-LTR verstärkt Tax erheblich die Transkription des viralen Genoms [1,6]. Ist eine ausreichende Menge an Rex vorhanden, bindet das Protein an das Rex-responsive Element viraler mRNA, verhindert deren Spleißing und transportiert sie aus dem Kern ins Cytoplasma. Die Akkumulation ungespleißter und einfach gespleißter Transkripte im Cytoplasma führt zur Translation der viralen Proteine Gag, Pol und Env [10]. Zusätzlich wird der Anteil vollständig gespleißter mRNA deutlich verringert, was in einer verminderten Tax-Expression resultiert. In der Folge wird die Transkription des viralen Genoms herunterreguliert [1]. 1.3 Das HTLV-1 Rex-Protein Das regulatorische Rex-Protein ist strukturell und funktionell mit dem HIV-1 Rev und dem HERV-K Rec verwandt [11]. Rex ist 27 kDa groß, setzt sich aus 189 Aminosäuren zusammen und besitzt verschiedene funktionale Domänen (siehe Abbildung 2) [10,12]. Zum einen besitzt das Protein eine RNA-Bindedomäne (RBD), welche an das Rex-responsive Element viraler mRNA bindet, um sie zu stabilisieren. Die RNA-bindende Domäne überlappt zudem teilweise mit dem Kernlokalisationssignal (NLS). Zum anderen besitzt Rex eine Aktivierungsdomäne (AD), in der sich die Kernexportsequenz (NES) befindet. Durch die Kombination aus NLS und 1 Einleitung III NES wird Rex dazu befähigt seine Funktion als mRNA-Transportprotein auszuüben, indem es zwischen Zellkern und Cytoplasma wandert [13,14]. Dies hat zur Folge, dass die Lokalisation von Rex in einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Zellkern und Cytoplasma steht. Verhältnismäßig befindet sich allerdings mehr Rex im Zellkern [10]. Des Weiteren besitzt das Protein zwei Multimerisierungsdomänen. Über diese Domänen können sich Rex-Rex-Multimere bilden, die für die Transportfunktion wichtig sind [15]. Abbildung 2: Struktur des HTLV-1 Rex-Proteins: Das Protein besteht aus 189 Aminosäuren und verschiedenen funktionalen Domänen. Es besitzt eine RNA-Bindedomäne (RBD), die zudem als Kernlokalisationssignal (NLS) agiert, und zwei Multimerisierungsdomänen. Zudem besitzt Rex eine Aktivierungsdomäne (AD), welche das Kernexportsignal (NES) beinhaltet. Verändert nach [16] Da Rex essentiell an der Replikation des Humanen T-Zell-Leukämie-Virus-1 beteiligt ist, ist es unabdingbar weitere Untersuchungen zu diesem Protein anzustellen. Dazu gehören u.a. die Identifikation sämtlicher zellulärer Interaktionspartner sowie posttranslationaler Modifikationen. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse sollten stark zu dem Verständnis über ATL und HTLV-1 assoziierter Myelopathie/tropisch spastischer Paraparese sowie deren Behandlungsmöglichkeiten beitragen [12]. 1.4 Das humane Staufen-1-Protein Staufen ist ein hochkonserviertes und ubiquitär vorkommendes RNA-bindendes Protein. Das humane Staufen-1 besteht aus vier RNA-Bindedomänen und einer Tubulin-Bindedomäne [17]. Durch die Bildung von RNA-Transport-Granula ist es entscheidend am mRNA-Transport der Zelle beteiligt [18]. Neben dieser Transport-Funktion besitzt das Protein zudem auch regulatorische Eigenschaften. Durch die Bindung an die 5‘-UTR bewirkt es die Translation reprimierter mRNAs [19]. Im Gegensatz dazu leitet es einen neu entdeckten RNA-Abbauweg ein, wenn es an die 3’UTR bindet [20]. Allerdings wird Staufen-1 auch mit dem viralen RNA-Transport in Verbindung gebracht. So wurde schon die Interaktion mit den HIV-1 Rev-Protein und dem HERV-K Rec-Protein bestätigt [2,21]. Des Weiteren ist bekannt, dass Staufen-1 in Stressgranula einwandert, sobald Zellen Stressbedingungen ausgesetzt sind [22]. 1 Einleitung 1.5 IV Antivirale Abwehrmechanismen Sogenannte Stressgranula sind die zelluläre Antwort, um durch Stress verursachte Schäden zu beheben oder um sich an veränderte Umgebungsbedingungen anzupassen [23]. Werden Zellen z.B. einem Hitzeschock unterzogen, findet man die mRNAs vieler „housekeeping“-Proteine in den induzierten Stressgranula. Hingegen sind mRNAs, die für Hitzeschock-Proteine kodieren, nicht vorzufinden. Neben mRNAs beinhalten Stressgranula zusätzlich kleine ribosomale Untereinheiten, Translationsinitiationsfaktoren und verschiedene RNA-bindende Proteine wie z.B. TIA, welche für die Hemmung der Translation sowie mRNA-Stabilisierung- und Abbau zuständig sind [24,25]. Daraus resultiert eine verminderte Translation der „housekeepingProteine“ zugunsten der Expression von Proteinen, welche den entstandenen Schaden reparieren können [23]. Des Weiteren befinden sich verschiedene miRNAs und siRNAs, die der antiviralen Abwehr dienen können, in den gebildeten Granula [2]. Durch die Bildung von Stressgranula wird demnach der mRNA-Metabolismus der Zelle an veränderte Umgebungsbedingungen wie Hitzeschock, oxidativer Stress, UV-Belastung oder auch virale Infektion angepasst [24]. Ein weiterer zellulärer Abwehrmechanismus geht von dem zur Familie der CytidinDeaminasen gehörenden APOBEC3G-Protein aus [26]. Die antivirale Eigenschaft des Proteins beruht darauf, dass es im viralen Genom und in endogenen retroviralen Elementen wie Retrotransposons Mutationen hervorruft. Dabei wird während der Reversen Transkription des viralen Genoms im Minus-Strang der neu synthetisierten DNA Cytosin zu Uracil deaminiert. Dieser Basenaustausch führt zu einer Anhäufung von G zu A-Hypermutationen im Plus-Strang, wodurch das virale Genom wahrscheinlich seine Funktionalität verliert [26]. Von APOBEC3G (A3G) sind zum einen die niedrigmolekulare (LMM A3G) und die hoch molekulare (HMM A3G) Form bekannt, die sich in ihrer Funktion unterscheiden. Einzig die LMM-Form ist enzymatisch aktiv und kann die retrovirale Replikation nach Eintritt in die Zelle beeinträchtigen [27]. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass HMM A3G die Zelle vor einer übermäßigen Retrotransposition endogener retroviraler Elemente schützt [28]. Es ist zudem bekannt, dass Staufen-RNA-Transportgranula ein Bestandteil von HMM A3G-Komplexen sind, und dass diese Komplexe unter Stressbedingungen in Stressgranula einwandern können [28]. 2 Zielsetzung 2 V Zielsetzung Im Zuge dieser Arbeit soll eine mögliche Interaktion zwischen dem regulatorischen HTLV-1 Rex-Protein und dem humanen RNA-bindenden Staufen-1-Protein untersucht werden. Für das HIV-1 Rev Protein oder das HERV K113 Rec Protein konnte eine solche Interaktion und deren Einfluss auf den Transport viraler RNA bereits gezeigt werden. Im ersten Schritt soll eine maximal exprimierte und über einen spezifischen V5-Tag nachweisbare Form von HTLV-1 Rex erzeugt werden, indem die synthetische, codon-optimierte rexSequenz in den pcDNA4/V5-HisA-Vector eingefügt wird. Im nächsten Schritt soll mithilfe von Co-Immunpräzipitationen im Western Blot überprüft werden, ob tatsächlich eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen nachzuweisen ist. Durch Immunfluoreszenzfärbungen soll das Ergebnis bestätigt und eine intrazelluläre Co-Lokalisation gezeigt werden. Durch eine Titration der Menge des Staufen-Expressionskonstrukts bei konstanter Menge des Rex-codierenden Plasmids und anschließender Zellfraktionierung soll der Einfluss von Staufen-1 auf das Verhältnis der Lokalisation von Rex zwischen Zellkern und Cytoplasma untersucht werden. Des Weiteren soll mittels C-terminal verkürzten Staufen-1Deletionsmutanten die mit Rex interagierende Staufen-1-Domäne in Co-Immunpräzipitationen identifiziert werden. Ist die Interaktion bestätigt, werden Untersuchungen zu deren physiologischen Auswirkungen in der Zelle angestellt. Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbungen und Co-Lokalisationsstudien soll überprüft werden, ob Rex und Staufen unter induzierten Stressbedingungen mit APOBEC3G-Komplexen und dem Markerprotein für Stressgranula TIA co-lokalisieren. Ebenso soll die direkte Auswirkung auf die Bildung von HTLV-Partikeln durch die Überexpression von Rex und Staufen untersucht werden, um die Bedeutung von Staufen im Falle einer HTLV Infektion näher zu charakterisieren. VI 3 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 3.1.1 Materialien Laborgeräte und Apparaturen DNA Engine Thermocycler BioRad HERAEUS Multifuge1S-R Centrifuge Thermo Scientific Mikro 200R Zentrifuge Hettich NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 Nanodrop Sterilbank Thermo HeraSafe Kendro CO2-Inkubator C 200 für eukaryotische Zellen Labotect CoulterCounter Coulter Electronics Inc. Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell BioRad Konfokales Laser Scanning Mikroskop LSM 780 Carl Zeiss Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences Optima-L100K Ultrazentrifuge Beckmann microplate reader „Sunrise“ TECAN 3.1.2 Reagenzien, Puffer und Medien Agarose-Gelelektrophorese 6 x DNA-Probenpuffer 10 mM Tris-Acetat, 50 mM EDTA, 10 % Ficoll-400 (w/v) (Serva), 0,4 % Orange-G (w/v) (Sigma) in H2O 1 x TAE 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 7,2 Bakterienanzucht SOB-Medium 20 g Bacto-Tryptone, 5 g Bacto-Yeast-Extract, 0,186 g KCl, 0,584 g NaCl ad. 970 ml H20, pH 7,0 VII 3 Material und Methoden SOC-Medium 9,7 Teile SOB, 0,1 Teil Mg-Mix, 0,2 Teile Glukose LB-Medium 1 % Bacto Hefe Extrakt; 1 % NaCl, pH 7,0 LB-Agar LB-Medium mit 20 g/l Agar Zellkultur Dulbecco’s Modified Eagle Gibco (Invitrogen Corporation) Medium (DMEM) FKS (Fetales Kälberserum) Biochrom Phosphate buffered saline 123 mM Natriumchlorid; 2,7 mM Kaliumchlorid; 10 mM Dinatriumhydrogenphosphat; 2 mM Kaliumdihydrogenphosphat;pH 7,0 (PBS) 2 x HEPES Buffer Saline 5,6 ml 5 M NaCl; 10 ml 0,5 M HEPES (pH 7,1); 1 ml 0,15 M (HBS) Na2HPO4; ad. 100 ml Aqua bidest. HEPES 0,05 M Zelllysispuffer 1 % Triton-X 100; 20 mM Tris (pH 7,7); 150 mM NaCl Trypsin/EDTA 0,05 % Trypsin (pH 7,2), 0,02 % EDTA in PBS; (TPP/Biochrom) Na-Arsenit SIGMA-Aldrich 20 % Sucrose D-Saccharose, w/v in A. bidest Proteinanalytik 4 x Western Blot-Puffer 200mM Tris, pH 6,8, 8 % (w/v) SDS, 0,2 % (w/v) Bromphenolblau, 40% (v/v) Glycerol, 400 mM DTT Acrylamid Rotiphorese R 10 x SDS-PAGE (Carl Roth GmbH TEMED BioRad APS 10 % w/v in A. bidest gelöst (Carl Roth GmbH) Trenngel-Puffer 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (BioRad) Sammelgel-Puffer 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (BioRad) Laufpuffer 2,5 mM Tris, pH 8.3, 19,2 mM glycine, 0.01 % SDS (BioRad) Transferpuffer 2,5 mM Tris, 19,2 mM glycine, pH 8.3, 20 % EtOH (BioRad) VIII 3 Material und Methoden Blockierungspuffer 2 % Milchpulver (Sucofin, TSI GmbH) in PBS/0,5 % Tween 2 % Formaldehyd w/v in PBS 0,5 % Triton X-100 w/v in PBS 1 % Milchpulver w/v in PBS Hypotonischer Puffer 10 mM HEPES, pH 7.9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, Proteaseinhibitor Kernlysispuffer I Hypotonischer Puffer + 0,1 % SDS, 100 mM Na2SO4, 400 mM (NH4)2SO4 Kernlysispuffer II 3.1.3 8 M Harnstoffpuffer, pH 4.6, 0,1 % SDS Chemikalien, Enzyme und Enzympuffer dNTP‘s Fermentas International Inc. Agarose Peqlab Biotechnologie GmbH Ethidiumbromid Carl Roth GmbH BigDye ABI Terminator Chemie 5x ABI-Puffer ABI Terminator Chemie Protease-Inhibitor (Tabletten) Roche Diagnostics GmbH T4-DNA-Ligase Fermentas Ligationspuffer Fermentas HindIII BioLabs XhoI BioLabs Puffer 2 BioLabs Benzonase Novagen IX 3 Material und Methoden 3.1.4 Kits QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen GmbH Endo-free Plasmid Maxi Kit Qiagen GmbH QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen GmbH Effectene Transfection Reagent Qiagen GmbH HS-Mg RT Activity Kit Cavidi 3.1.5 Größenstandards Generuler 1kb Ladder Plus Fermentas International Inc. PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas International Inc. 3.1.6 Bakterienstämme E. coli TOP10 3.1.7 Invitrogen Eukaryotische Zelllinien HEK 293T (aus humanem embryonalen Nie- LGC Standards GmbH renkarzinom) 3.1.8 Plasmide pCMV-Tag2B Stratagene pcDNA4/V5-HisA Invitrogen pBud-CE4.1 Invitrogen oricoRec-pBud im RKI kloniert Stau-Flag-pCMV im RKI kloniert X 3 Material und Methoden coRex-pcDNA4/V5-HisA im RKI kloniert Stau-cherry im RKI kloniert APOBEC3G-CFP im RKI kloniert TIA-YFP im RKI kloniert HTLV-Klon 3.1.9 Antikörper primäre Antikörper 𝛼V5 (Maus) Serotec 𝛼Flag (Kaninchen) Sigma 𝛼Staufen (Ratte) am RKI immunisiert 𝛼Histon-H3 (Kaninchen) Cell Signalin Technology 𝛼HTLV-1 (Ziege) NIH 𝛼mouse-HRP (Ziege) Sigma (Ziege) Sigma 𝛼goat-HRP (Kaninchen) Dako 𝛼mouseA647 (Ziege) Invitrogen (Ziege) Invitrogen 𝛼ratA547 (Ziege) Invitrogen 𝛼mouseA800 (Ziege) LI-COR Biosciences (Ziege) Invitrogen sekundäre HRP-Antikörper 𝛼rabbit-HRP sekundäre Fluoreszenz-Antikörper 𝛼mouseA488 sekundäre Infrarot-Antikörper 𝛼rabbitA680 3 Material und Methoden 3.2 3.2.1 Methoden Übersicht der Methoden XI XII 3 Material und Methoden 3.2.2 DNA-Analytik 3.2.2.1 Restriktion Für den Restriktionsverdau wurden Typ-2-Restriktionsendonukleasen eingesetzt. Die Zusammensetzung eines Restriktionsansatzes ist in Tabelle 1 aufgeführt. Der Ansatz wurde für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Vektoren wurden anschließend mit 1 µl CIP (BioLabs) versetzt und für zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Tabelle 1: Restriktionsansatz Komponente Eingesetztes Volumen / Menge DNA 10 µg Puffer 2 5 µl Restriktionsendonuklease 1 3 µl Unit? Restriktionsendonuklease 2 3 µl Unit? BSA 1 µl mg/ml? A. bidest ad. 50 µl 3.2.2.2 Ligation Für die Ligation wurde 10 bis 30 ng des Vektors eingesetzt. Die benötigte Menge an Insert wurde mit der folgenden Formel berechnet. 𝑛𝑔 𝐼𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 = 5 ∗ 𝑛𝑔 𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 ∗ 𝑏𝑝 𝐼𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡 𝑏𝑝 𝑉𝑒𝑘𝑡𝑜𝑟 Es wurden 1 µl T4-DNA-Ligase und 2 µl Ligationspuffer (10 x) zugefügt. Der Ansatz wurde mit A. bidest auf 20 µl aufgefüllt und für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. 3.2.2.3 DNA-Agarosegelelektrophorese Agarose wurde mit 1 x TAE-Puffer auf eine Endkonzentration von 1,5 % (w/v) gebracht und durch Erhitzen in einer Mikrowelle vollständig gelöst. Es wurden 0,5 µg/ml Ethidiumbromid zugesetzt. Die Proben wurden mit 6 x DNA-Ladepuffer versetzt und in 1 x TAE-Puffer bei einer Spannung von 90-120 V aufgetrennt. Der DNA-Marker „Generuler 1 kb Ladder Plus“ wurde als Größenstandard mitgeführt. XIII 3 Material und Methoden 3.2.2.4 Aufreinigung von DNA-Fragmenten Nach einer durchgeführten Agarosegelelektrophorese wurde das Gel auf einen UVTransilluminator gelegt. Die DNA-Banden wurden so sichtbar gemacht und konnten mit einem Skalpell ausgeschnitten werden. Die DNA-Aufreinigung wurde mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit“ nach Herstellerangaben durchgeführt. 3.2.2.5 Chemische Transformation Bei dieser Art der Transformation wurde die DNA zu dem Bakterienstamm E. coli TOP10 pipettiert. Der Ansatz wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 30 Sekunden bei 42 °C einem Hitzeschock unterzogen. Das Bakterien-DNA-Gemisch wurde mit 500 µl SOC-Medium versetzt und für eine Stunde bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Bakterien für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert und in 100 µl SOCMedium resuspendiert. Diese 100 µl Transformationsansatz wurden auf LB-Selektivplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 3.2.2.6 Plasmidisolierung Die Plasmidisolierungen erfolgten mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit“ oder dem „Endo-free Plasmid Maxi Kit“ nach Herstellerangaben. 3.2.2.7 DNA-Bestimmung DNA-Bestimmungen wurden mit dem Nanodrop ND-1000 entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. 3.2.2.8 Sequenzierungs-PCR DNA-Sequenzierungen wurden im Sequenzierungslabor nach der Kettenabruchmethode durchgeführt. Die Zusammensetzung eines Sequenzierungs-Ansatzes ist in Tabelle 2 aufgelistet. Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen 2 min 96 °C Denaturierung 10 sec 96 °C Denaturierung 5 sec 53 °C Primer-Annealing 25 x 4 min 60 °C Elongation durchgeführt. Die Sequenzanalysen wurden mithilfe des Computerprogramms BioEdit Sequence Alignment Editor ausgewertet. XIV 3 Material und Methoden Tabelle 2: Sequenzierungs-Ansatz Komponente Eingesetztes Volumen / Menge DNA 150 ng Big-Dye 2 µl 5 x ABI-Puffer 1 µl Sequenzierprimer 0,5 µl A. bidest ad. 10 µl 3.2.3 Zellkultur 3.2.3.1 Zellkultivierung Die eukaryotische Zelllinie HEK 293T wurde in 75 cm2 Zellkulturflaschen bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Das verwendete Dulbecco’s Modified Eagle Medium wurde mit 10 % FKS und 1 x Penicillin/Streptomycin komplementiert. Für das Passagieren wurde zunächst das alte Medium entfernt. Die Zellen wurden mit 5 ml PBS gewaschen, mit 1 ml Trypsin/EDTA vom Kulturflaschenboden abgelöst und in 10 ml DMEM aufgenommen. Ein Teil der Zellen wurde weiterkultiviert. Der Rest wurde entweder verworfen oder für weiterführende Experimente eingesetzt. In diesem Fall wurden die Zellen für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert und in 10 ml Medium resuspendiert. Die Zellzahl wurde mit dem Coulter Counter bestimmt und die Zellen unter Berücksichtigung ihrer Teilungsraten in verschiedenen Kultivierungsgefäßen ausgesät. 3.2.3.2 Transfektion Für die Transfektion der HEK 293T-Zellen in 100 mm Platten wurde die CalciumchloridMethode eingesetzt. Dafür wurden 1 bis 10 µg DNA mit A. bidest auf 450 µl aufgefüllt und mit 50 µl 2,5 M Calciumchlorid versetzt. Dieser Ansatz wurde zu 500 µl 2 x HBS getropft und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versehen. Anschließend wurde der Transfektionsansatz zu den Zellen getropft. Nach 10 Stunden wurde das Medium gewechselt. Die Zellen wurden bis zu einer ausreichenden Proteinexpression weiterkultiviert. Für die Transfektion von Zellen in 6 well-Platten wurde das „Effectene Transfection Reagent“ entsprechend der Herstellerangaben verwendet. 3 Material und Methoden 3.2.4 XV Proteinanalytik 3.2.4.1 Zelllyse / Proteinextraktion Für die Herstellung von Zelllysaten wurden die in 100 mm Platten transfizierten Zellen vom Plattenboden abgelöst, mit PBS gewaschen und für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 200 µl Lysispuffer resuspendiert. Der Lysispuffer wurde zuvor mit einer „complete“ Protease-Inhibitor-Tablette versetzt. Die Zelllysate wurden für 10 Minuten bei 19.000 g bei 4 °C zentrifugiert, die klaren Überstande in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und direkt für Western-Blot-Analysen verwendet oder bei -20 °C gelagert. 3.2.4.2 Immunpräzipitation (IP) Die gewonnenen Zelllysate wurden mit 20 bis 30 µl Antikörper-konjugierter Sepharose versetzt, mit Lysispuffer mit Protease-Inhibitor auf 1 ml aufgefüllt und für vier Stunden bei 4 °C über Kopf rotierend inkubiert. Das Lysat-Sepharose-Gemisch wurde im Anschluss für zwei Minuten bei 340 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Lysispuffer gewaschen und nach 10 Waschschritten in 30 µl A. bidest aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C 3.2.4.3 Ultrazentrifugation (UZ) Im Vorfeld der Ultrazentrifugation wurden Virusüberstände für 10 Minuten bei 3400 g und Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend sterilfiltriert um Zelltrümmer abzutrennen. Anschließend wurde die Virussuspension in Ultrazentrifugationsröhrchen auf ein 20 % Sucrose-Kissen geschichtet und für drei Stunden bei 66.000 g und 4 °C zentrifugiert. Für die Aufkonzentrierung der Virussuspension wurden die Optima-L100K Ultrazentrifuge und der SW32Ti-Rotors eingesetzt. Die Virus-Pellets wurden in 100 µl 0,05 M HEPES resuspendiert. 3.2.4.4 Isolation von Kern- und cytoplasmatischen Proteinfraktionen Für die Proteinfraktionierung wurden zunächst HEK 293T-Zellen in 100 mm Platten ausgesät und transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, vom Boden gelöst und für fünf Minuten bei 300 g und 4°C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml PBS gelöst und für sieben Minuten bei 300 g zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 300 µl hypotonischem Puffer resuspendiert und fünf Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 20 µl 10 % NP-40 und einem Zentrifugationsschritt von fünf Minuten bei 50 g und 4 °C konnten die klaren Überstände bzw. die cytoplasmatische Fraktion abgenommen werden. Im Anschluss wurde das Kernpellet einmal in 1 ml hypotonischem Puffer gewaschen und in 300 µl Kernlysispuffer I resuspendiert. Nachdem die Proben mit 2 µl Benzonase für ca. eine Stunde inkubiert 3 Material und Methoden XVI wurden, folgte ein Zentrifugationsschritt von 10 Minuten bei 340 g. Es konnte die Kernfraktion abgenommen werden. Das unlösliche Pellet bestehend aus Kern- und Membranproteinen wurde in 300 µl Kernlysispuffer II resuspendiert. 3.2.4.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die zu untersuchenden Protein-Proben wurden mit 4 x Western Blot-Puffer versetzt und für fünf Minuten bei 70 °C bzw. für 10 Minuten bei 90 °C denaturiert. Die Auftrennung der Proteine erfolgte mit einem 5 % Sammelgel und einem 15 % Trenngel bei einer Spannung von 120180 V. Als Größenstandard wurde die „Pageruler Prestained Protein Ladder“ mitgeführt. Im Anschluss wurden die Gele für Western Blots verwendet. 3.2.4.6 Western Blot Der Proteintransfer vom SDS-Gel auf eine geeignete Membran erfolgte nach der Semi-DryMethode. PVDF-Membranen wurden für drei Minuten in 96 % Ethanol aktiviert und anschließend in Transferpuffer äquilibriert. Nitrocellulose-Membranen wurden lediglich in Transferpuffer äquilibriert. Das SDS-Gel wurde nach 10 Minuten Äquilibrierung in Transferpuffer zwischen zwei Filterpapieren auf die Membran gelegt. Die Filterpapiere wurden zuvor mit Transferpuffer getränkt. Das Blotting erfolgte für 35 Minuten bei 20 V. Danach wurde die Membran für eine Stunde in Blockierungspuffer geschwenkt. Anschließend wurde die Membran mit einem in Blockierungspuffer verdünnten primären Antikörper über Nacht bei 4 °C rotierend inkubiert. Als nächstes wurde die Membran 3 Mal für 10 Minuten mit PBS/Tween 0,1 % gewaschen. Es folgte eine einstündige Inkubation mit einem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur. PVDF-Membranen wurden mit einem mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten sekundären Antikörper inkubiert und anschließend 3 Mal für 10 Minuten mit PBS/Tween 0,1 % gewaschen. Die Detektion erfolgte mit dem „Super-Signal West Dura Extended Duration Substrate“ (Thermo Scientific) durch die Schwärzung eines Röntgenfilms. NitrocelluloseMembranen wurden mit einem sekundären Infrarot-Antikörper inkubiert. Der letzte Waschschritt erfolgte hier mit PBS ohne Tween. Für die Detektion wurde der Odyssey Imager eingesetzt. 3.2.4.7 Immunfluoreszenz-Färbung (IF) Als Vorbereitung wurden HEK 293T-Zellen in 6 well-Platten ausgesät und transfiziert. Nach 24 bis 48 Stunden wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 1 ml 2 % Formaldehyd für 30 Minuten bei 37 °C fixiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wurden die Zellen mit 1 ml 0,5 % Triton X-100 für 15 Minuten permeabilisiert. Nach weiteren drei Wasch- 3 Material und Methoden XVII schritten wurden unspezifische Bindungen mit 1 ml 1 % Milchpulver für 30 Minuten abgesättigt. Im Anschluss wurden die Zellen mit dem primären Antikörper für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen wieder 3 Mal gewaschen um danach mit dem sekundären Fluoreszenz-markierten Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert zu werden. Ab diesem Arbeitsschritt wurde lichtgeschützt gearbeitet. Nachdem die Zellen erneut gewaschen und die Kerne mit DAPI angefärbt wurden, wurden sie mit Mowiol luftblasenfrei mit Deckgläschen eingebettet. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C im Dunkeln. Ausgewertet wurden die Präparate am konfokalen Laser Scanning Mikroskop cLSM 780. 3.2.4.8 RT-assay (Cavidi) Für die Bestimmung und Quantifizierung der Virusexpression wurde der „HS-Mg RT Activity Kit“ nach Herstellerangaben verwendet. 4 Ergebnisse 4 XVIII Ergebnisse Für die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten retroviraler Erkrankungen müssen deren genaue Ursachen und Mechanismen bekannt sein. Dafür ist es unabdingbar zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren, um zu verstehen an welchen Stellen das Virus in den Wirtsstoffwechsel eingreift. Für das HIV-1 Rev-Protein und das HERV-K Rec-Protein konnte das humane RNA-bindende Staufen-1-Protein bereits als Interaktionspartner identifiziert werden (Quelle). Da diese beiden viralen RNA-Transportproteine strukturell und funktionell mit dem HTLV-1 Rex-Protein verwandt sind, kann eine mögliche Interaktion zwischen Rex und Staufen vermutet werden. Die Interaktion mit Staufen-1 wäre somit ein verbreiteter Mechanismus unter komplexen Retroviren. Um dieser Frage nachzugehen, wurde zunächst die für maximale Expression codon-optimierte HTLV-1 rex-Sequenz in den pcDNA4/V5-HisA-Vector kloniert. Dadurch konnte das RexProtein in folgenden Versuchen effektiv über den C-terminal eingefügten V5-Tag nachgewiesen werden. Für die Klonierung wurden HTLV-1 rex und pcDNA4/V5-HisA mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und XhoI für zwei Stunden bei 37 °C verdaut. Als nächstes folgte die Ligation von rex-Insert und pcDNA4/V5-HisA-Vector für eine Stunde bei 37 °C. Nach chemischer Transformation in den E. coli-Stamm TOP10 folgte die Plasmidisolierung. Anhand von Sequenzierungen mit den Primern T7 und BGH konnte die Intaktheit der Sequenz bestätigt werden Die Sequenz des Plasmids befindet sich im Anhang 9.1. Das Protein Rex-V5 konnte somit für die nachfolgenden Interaktionsstudien eingesetzt werden. 4.1 Nachweis der Interaktion zwischen HTLV-1 Rex und Staufen-1 Der Nachweis einer möglichen Interaktion zwischen Rex und Staufen sollte mittels Co-Immunpräzipitation erfolgen. Dafür wurden Rex-V5 und Staufen-Flag in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Als Positivkontrolle wurde das 17 kDa große HERV-K Rec-V5 mit StaufenFlag und als Negativkontrolle pcDNA4 mit Staufen-Flag co-transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die hergestellten Zelllysate mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert. Nur in den Ansätzen, in de- nen Staufen-Flag mit dem V5-markierten Protein interagiert, kann es später im Western Blot mit einem 𝛼Flag-Antikörper nachgewiesen werden. Rec-V5 und Rex-V5 wurden mit einem 𝛼V5-Antikörper detektiert. Unbehandeltes Lysat wurde als Kontrolle für die StaufenExpression mitgeführt. Dem Western Blot in Abbildung 3 ist zu entnehmen, dass Staufen in 4 Ergebnisse XIX allen Ansätzen exprimiert und im Lysat bei 55 kDa nachgewiesen wurde. Nach der Immunpräzipitation sind dagegen nur noch deutliche Staufen-Banden in der Positivkontrolle mit HERVK Rec und dem Rex-Ansatz zu erkennen. In der Negativkontrolle wurde kein Staufen nachgewiesen. Das Ergebnis des Blots deutet stark daraufhin, dass Staufen-1 ein zellulärer Interaktionspartner des HTLV-1 Rex-Proteins ist. Abbildung 3: Nachweis der Interaktion zwischen HTLV-1 Rex und Staufen-1 mittels Co-Immunpräzipitation: Für den Nachweis wurde Rex-V5 mit Stau-Flag in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Als Positivkontrolle diente RecV5 mit Stau-Flag und als Negativkontrolle pcDNA4 mit Stau-Flag. Die Zelllysate wurden mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert. Das unbehandelte Lysat wurde als Expressionskontrolle mitgeführt. In den Immunpräzipitationsproben (IP) wurden Rec und Rex mittels 𝛼V5- und 𝛼mouse-HRP-Antikörper nachgewiesen. Staufen wurde mit einem 𝛼Flag- und 𝛼rabbit-HRP-Antikörper detektiert. Mithilfe von Co-Lokalisationsstudien sollte das Ergebnis der Co-Immunpräzipitation bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden Rex-V5 und das Fluoreszenz-markierte Staufen-cherry zunächst einzeln in HEK 293T-Zellen transfiziert, um die Lokalisation der Proteine in Abwesenheit des anderen zu ermitteln. Zwei Tage nach der Transfektion erfolgte die Immunfluoreszenzfärbung von Rex mit dem Antikörpern 𝛼V5. Die Proben wurden mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop (cLSM780) ausgewertet. In der Abbildung 4 ist erkennbar, dass der Großteil von Rex diffus im Zellkern verteilt ist (Pfeil A). Allerdings ist ein geringer Anteil des Proteins auch im Cytoplasma vorhanden (Pfeil B). Obwohl Staufen-cherry dagegen überwiegend im Cytoplasma lokalisiert ist (Pfeil D), war das Protein in seltenen Fällen ebenfalls im Zellkern nachzuweisen (Pfeil C). 4 Ergebnisse XX Abbildung 4: zelluläre Lokalisation von HTLV-1 Rex und Staufen-1: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 (links) bzw. Staufen-cherry (rechts) transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert. Rex wurde mit einem 𝛼V5- und einem 𝛼mouseA647-Antikörper angefärbt. Der Zellkern wurde mittels DAPI (Blau) gefärbt. Die Auswertung erfolgte an einem cLSM780. A: Rex im Kern lokalisiert. B: Rex im Cytoplasma lokalisiert. C: Staufen im Kern lokalisiert. D: Staufen im Cytoplasma lokalisiert. Im nächsten Schritt wurden Rex-V5 und Staufen-cherry in HEK-293T-Zellen co-transfiziert, um eine Co-Lokalisation der beiden Proteine, die der Interaktion zugrunde liegen müsste, nachzuweisen. Aus der Abbildung 5 geht hervor, dass Rex in Gegenwart von Staufen eine stark veränderte Lokalisation aufweist. Der Großteil des Proteins befindet sich nun im Cytoplasma wo eine starke Co-Lokalisation mit Staufen stattfindet Des Weiteren konnte vereinzelt die CoLokalisation von Rex und Staufen im Zellkern beobachtet werden (durch Pfeile markiert). Abbildung 5: Co-Lokalisation von HTLV-1 Rex und Staufen-1: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 und Staufen-cherry co-transfiziert. Nach zwei Tagen folgte die Immunfluoreszenzfärbung von Rex mit einem 𝛼V5- und einem 𝛼mouseA488-Antikörper. Die Auswertung erfolgte an einem cLSM780. Oben: Cytoplasmatische CoLokalisation. Unten: Co-Lokalisation in Kern und Cytoplasma. 4 Ergebnisse XXI Mit diesen Immunfluoreszenzfärbungen konnte bestätigt werden, dass eine Interaktion der beiden Proteine möglich ist, da in Co-Transfektionsversuchen eine deutliche Co-Lokalisation in Zellkern und Cytoplasma festgestellt werden konnte. Zudem konnte beobachtet werden, dass die Anwesenheit von Staufen einen Einfluss auf die Lokalisation von Rex ausübt. 4.2 Abhängigkeit der HTLV-1 Rex-Lokalisation von Staufen-1 Um den Effekt von Staufen auf eine verstärkte cytoplasmatische Lokalisation von Rex zu überprüfen, wurde eine Staufen-Titration mit anschließender Zell-Fraktionierung durchgeführt. Dafür wurden Co-Transfektionen mit einer konstanten Rex-V5-Menge und variierenden StaufenFlag-Mengen angesetzt. In dem Ansatz ohne Staufen wurden Rex-V5 und der Leervektor pCMV co-transfiziert. Aus den Zelllysaten wurden die Proteinfraktionen aus Cytoplasma, Zellkern und unlöslichen Bestandteilen gewonnen und im Western Blot miteinander verglichen. Rex wurde mit einem 𝛼V5- und Staufen mit einem 𝛼Flag-Antikörper detektiert. Histon wurde als Kontrolle für die Sauberkeit der Fraktionen mit einem 𝛼Histon-Antikörper nachgewiesen und ist nur in der Kern- und Pelletfraktion enthalten. Der Western Blot wurde mit dem „Odyssey Infrared Imaging System“ ausgewertet. Für die Auswertung wurden die Intensitäten der Rex-Banden gemessen. Von jedem Ansatz wurde die Intensität der Zellkern-Bande auf 100 % gesetzt. Bezogen auf diesen 100 %-Wert wurde der prozentuale Anteil von Rex im Cytoplasma und der unlöslichen Fraktion in jedem Ansatz berechnet (siehe Abbildung 6). In dem Ansatz ohne transfiziertes Staufen beträgt der Anteil von Rex im Cytoplasma 40 %. Bei der Zugabe von 1 µg Staufen ist Rex zu gleichen Teilen im Kern und Cytoplasma lokalisiert. In den Ansätzen mit 2 und 8 µg Staufen ist der Anteil von Rex im Cytoplasma mit ca. 160 % viermal höher als ohne Staufen. Der Ansatz mit 4 µg Staufen passt nicht zu den anderen Werten, da hier Rex wieder zu gleichen Teilen im Kern und Cytoplasma zu finden ist. Grundsätzlich bestätigt dieses Ergebnis jedoch die Beobachtungen aus den Immunfluoreszenzuntersuchungen. Rex allein ist überwiegend im Zellkern und nur zu einem geringen Anteil im Cytoplasma lokalisiert. Wird Staufen mit Rex co-transfiziert, hat dies durch die Interaktion der beiden Proteine eine verstärkte cytoplasmatische Rex-Lokalisation zur Folge. Betrachtet man die Staufen-Blots fällt auf, dass das Protein bei einer Menge von 1 µg nur im Cytoplasma nachgewiesen wurde. Mit steigender Proteinmenge konnte Staufen auch im Kern und im unlöslichen Pellet detektiert werden. Die Veränderung der Staufen-Lokalisation resultiert jedoch wahrscheinlich aus der Überexpression des Proteins. XXII 4 Ergebnisse Abbildung 6: Abhängigkeit der HTLV-1 Rex-Lokalisation von Staufen-1: 8 µg Rex-V5 wurden jeweils mit 0, 1, 2, 4 und 8 µg Staufen-Flag in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. In dem Ansatz ohne Staufen wurde stattdessen pCMV-Leervektor eingesetzt. Nach der Herstellung der Zelllysate wurde eine Protein-Fraktionierung durchgeführt. Für den Nachweis von Rex bzw. Staufen wurde der 𝛼V5- und 𝛼mouseA800-Antikörper bzw. der 𝛼Flag- und 𝛼rabbitA680 eingesetzt. Histon wurde als Kontrolle der Proteintrennung mitgeführt und mit dem 𝛼Histon-H3- und dem 𝛼rabbitA680 detektiert. Unten: Darstellung der Rex,- Staufen- und Histon-Banden der Proteinfraktionen im Western Blot. Oben: Quantitative Auswertung der gemessenen Banden-Intensitäten. 4.3 Bestimmung der Staufen-1 interagierenden Domäne Um die an der Interaktion beteiligte Staufen-Domäne zu identifizieren, wurden im Vorfeld dieser Arbeit hergestellte Flag-markierte Deletionsmutanten des Proteins in Co- Transfektionsversuchen eingesetzt. Die Deletionsmutanten wurden durch Einfügen von Stoppcodons in die Sequenz unterschiedlich stark C-terminal verkürzt (siehe Abbildung 7). Abbildung 7: Flag-markierte Staufen-1-Deletionsmutanten: Durch das Einfügen von Stoppcodons in die StaufenSequenz wurde das Protein C-terminal verkürzt. Abbildung verändert nach [2] 4 Ergebnisse XXIII Für diesen Versuch wurde Rex-V5 mit Staufen-Flag und den Deletionsmutanten co-transfiziert. Ein Ansatz mit HERV-K Rec-V5 und Staufen-Flag wurde als Positivkontrolle mitgeführt. Ein weiterer Ansatz mit pcDNA4 und Staufen-Flag diente als Negativkontrolle. Die Lysate wurden mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert. Im Western Blot können die Staufen-Deletionsmutanten nur dann nachgewiesen werden, wenn sie die für die Interaktion benötigte Domäne besitzen. Der Nachweis von Staufen und den Protein-Mutanten erfolgte mit dem 𝛼Flag-Antikörper. Rec-V5 und Rex-V5 wurden mit dem 𝛼V5-Antikörper nachgewiesen. Unbehandeltes Lysat diente als Kontrolle der Staufen-Expression. In der Abbildung 8 ist zu erkennen, dass Staufen bzw. die Mutanten 2, 3 und 4 exprimiert und im Lysat detektiert wurden. Es fand jedoch keine Expression der Staufen-Mutante 1 statt. Nach der Immunpräzipitation kann das Volllängen-Staufen aufgrund der stattfindenden Interaktion in den Ansätzen mit Rec und Rex nachgewiesen werden. Von den restlichen IP-Proben ist nur bei Mutante 3 eine deutliche Bande bei ca. 36 kDa zu erkennen. Dies könnte darauf hinweisen, dass am C-Terminus von Mutante 3, d.h. im hinteren Teil der RBD4, die interagierende Domäne beginnt. Allerdings besitzt die Mutante 4 ebenfalls diese Domäne. Da Mutante 4 jedoch nicht detektiert werden konnte, bleibt das Ergebnis uneindeutig. Abbildung 8: Die mit Rex interagierende Staufen-1-Domäne: In HEK 293T-Zellen wurde Rex-V5 mit C-terminal verkürzten Staufen-Flag-Deletionsmutanten co-transfiziert. Als Positivkontrolle diente Rec-V5 mit Staufen-Flag. Als Negativkontrolle wurde pcDNA4 mit Staufen-Flag mitgeführt. Die Lysate wurde mit 𝛼V5-Sepharose inkubiert und anschließend gewaschen. In den Immunpräzipitations-Proben wurde Staufen mit einem 𝛼Flag- und 𝛼rabbitHRP-Antikörper nachgewiesen. Der Nachweis von Rec-V5 und Rex-V5 erfolgte mit einem 𝛼V5- und 𝛼mouseHRP-Antikörper. Für die Expressionskontrolle wurde Staufen im Lysat nachgewiesen. XXIV 4 Ergebnisse 4.4 Einfluss von Staufen-1 auf die HTLV-1 Partikelbildung Nachdem die Interaktion zwischen dem HTLV-1 Rex-Protein und dem humanen Staufen-1Protein bestätigt werden konnte, stellte sich die Frage ob dies physiologische Auswirkungen zur Folge hat. Von besonderem Interesse war der Einfluss der Staufen-1-Interaktion auf die Viruspartikelbildung von HTLV-1. Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden Co-Transfektionsversuche mit einem HTLV-1-Molekularklon durchgeführt. Der Molekularklon wurde mit Rex-V5, Staufen-Flag sowie Rex-V5 und Staufen-Flag in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Ein Ansatz mit dem HTLV-1-Klon und dem Leervektor pCMV wurde als Referenz mitgeführt. Untransfizierte Zellen dienten als Negativkontrolle. Nach erfolgter Ultrazentrifugation der Viruspartikel enthaltenden Kulturüberstände wurden die Proben im Western Blot eingesetzt und mit einem 𝛼HTLV-1 polyklonalem Ziegenserum angefärbt (siehe Abbildung 9). Abbildung 9: Nachweis erhöhter HTLV-1-Partikelbildung durch Staufen-1 mittels Ultrazentrifugation: Der HTLV-1-Molekularklon wurde zusammen mit Rex, Staufen sowie Rex und Staufen in HEK 293T-Zellen cotransfiziert. Ein Ansatz mit HTLV-1 und pCMV-Leervektor wurde als Referenz mitgeführt. Als Negativkontrolle dienten untransfizierte Zellen. Fünf Tage nach Transfektion wurden die Viruspartikel enthaltenden Kulturüberstände ultrazentrifugiert. Die Viruspellets wurden im Western Blot eingesetzt und mit einem 𝛼HTLV-1polyklonalem Serum und 𝛼goat-HRP-Antikörper angefärbt. Die Masse an Proteinbanden ist womöglich damit zu erklären, dass das gegen das HTLV-1- Vollvirus gerichtete Ziegenserum zudem unspezifisch einige zelluläre Proteine anfärbt. Bei genauer Betrachtung sind allerdings die beiden Gag-Banden des Virus-Capsids und der VirusMatrix deutlich bei ca. 24 und 19 kDa zu erkennen. In dem Ansatz mit HTLV-1 und Rex sind diese beiden Banden in etwa doppelt so breit wie jene in der Referenzprobe. Im Vergleich zu der Probe mit Rex sind die Intensitäten der p24- und p19 Gag-Banden der Ansätze mit Staufen bzw. Rex und Staufen sogar noch höher. Diese beobachtete Intensitätssteigerung der Capsid- XXV 4 Ergebnisse und Matrix-Banden ist ein Hinweis auf verstärkte Produktion viraler Partikel in dem Kulturüberstand der transfizierten Zellen. Um die im Western Blot eingesetzten Proben quantitativ besser auswerten zu können, wurden die Proben zusätzlich mit einem Assay zur Quantifizierung der Reversen-TranskriptaseAktivität analysiert. Mithilfe dieses RT-Assays war es möglich die Konzentration der Reversen Transkriptase in den einzelnen Transfektionsansätzen zu berechnen. Die Höhe der RTKonzentration gibt ebenfalls Aufschluss über die Menge der produzierten Viruspartikel. Die Konzentration des Enzyms in der Referenzprobe mit HTLV-1 und pCMV wurde auf 100 % bzw. 1 gesetzt. Bezogen auf diesen Wert wurde die Faktorsteigerung der Enzymkonzentration berechnet. Der Abbildung 10 ist zu entnehmen, dass die Konzentration in dem Ansatz mit HTLV und Rex 3-mal höher ist als in der Referenz. Eine deutliche Steigerung ist jedoch erst durch die Zugabe von Staufen zu beobachten. Verglichen mit der Referenz ist die Konzentration der Reversen Transkriptase in dem Ansatz mit Staufen bzw. Rex und Staufen um den Faktor 29 bzw. 23 höher. Die ermittelte Steigerung der Reversen Transkriptase-Konzentration korreliert mit dem Ergebnis des Western Blots. Die geringste Partikelproduktion wies die Referenzprobe mit HTLV allein auf. Eine Steigerung der Partikelbildung um den Faktor 3 konnte durch die Transfektion mit Rex erreicht werden. Durch die Co-Transfektion des HTLV-Klons mit Staufen wurde eine Steigerung um das 28-fache erzielt. Bei Co-Transfektion mit Rex sowie Staufen wurde die Produktion viraler Partikel um das 23-fache gesteigert. Dieses Ergebnis lässt die Vermutung zu, dass die Interaktion zwischen Rex und Staufen einen positiven Effekt auf die HTLV-1-Partikelproduktion ausübt, solange Rex nicht im Überschuss vorliegt. Faktorsteigerung der RTKonzentration 35 28,66 30 23,18 25 20 15 10 5 0 0 1,00 3,16 Abbildung 10: Nachweis erhöhter HTLV-1-Partikelbildung durch Staufen-1 mittels RT-Assay: Für das Assay wurden die Proben der resuspendierten Viruspellets aus der zuvor durchgeführten Ultrazentrifugation verwendet. Dargestellt ist die Steigerung der Reversen Transkriptase-Konzentration bezogen auf die Referenzprobe mit HTLV und pCMV-Leervektor. 4 Ergebnisse 4.5 XXVI Staufen-abhängiger Rex-Transport in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe Es ist bekannt, dass Staufen-1 in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe einwandert. Daher stellte sich die Frage ob Rex durch die Interaktion mit Staufen in diese Strukturen transportiert wird. Um diese Vermutung zu überprüfen wurden HEK 293T-Zellen mit Rex-V5 und Staufencherry co-transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen durch die Zugabe von Na-Arsenit zum Kulturmedium oxidativem Stress ausgesetzt. Anschließend wurde Rex mit einem 𝛼V5-Antikörper angefärbt. Als Referenz wurden ungestresste Zellen mitgeführt, in denen Rex und Staufen diffus im Cytoplasma co-lokalisieren (siehe Abbildung 11, oben). In den gestressten Zellen können die beiden Proteine zudem in granulären Strukturen im Cytoplasma detektiert werden (siehe Abbildung 11, unten). Abbildung 11: Nachweis des Staufen-abhängigen Rex-Transports in granuläre Strukturen unter induzierten Stressbedingungen: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 und Staufen-cherry transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Na-Arsenit (0,5 mmol/L) für eine Stunde gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA488-Antikörper eingesetzt. Oben: Ungestresste Zellen als Referenz. Rex und Staufen co-lokalisieren im Cytoplasma. Unten: Gestresste Zellen. Rex und Staufen sind im Cytoplasma in granulären Strukturen vorzufinden. Um sicher zu gehen, dass dieser Effekt nicht auf die Überexpression des transfizierten Staufens zurückzuführen ist, wurde der Versuch mit zellulärem Staufen wiederholt. Hierfür wurden HEK 293T-Zellen ausschließlich mit Rex-V5 transfiziert und erneut mit Na-Arsenit gestresst. Für die Färbung von Rex wurde der 𝛼V5-Antikörper eingesetzt. Das endogene Staufen wurde mit einem 𝛼Staufen-Rattenserum angefärbt. In Abbildung 12 ist erkennbar, dass Rex und Staufen auch unter diesen Bedingungen in granulären Strukturen im Cytoplasma nachgewiesen werden können. Es konnte damit bestätigt werden, dass Rex unter Stressbedingungen durch die Interaktion mit Staufen in cytoplasmatische Granula einwandert. 4 Ergebnisse XXVII Abbildung 12: Nachweis des Rex-Tranports in Stress-induzierte granuläre Strukturen durch zelleigenes Staufen: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5 transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Na-Arsenit (0,5 mmol/L) für zwei Stunden gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA488-Antikörper eingesetzt. Das endogene Staufen wurde mit einem 𝛼Staufen-Rattenserum und 𝛼ratA547-Antikörper nachgewiesen. Neben der cytoplasmatischen CoLokalisation können deutliche granuläre Strukturen beobachtet werden. In diesen Strukturen können Rex und Staufen nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob es sich bei diesen granulären Strukturen um Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe handelt. Für die Beantwortung dieser Frage wurde Rex-V5 zusammen mit Staufen-cherry und TIA-YFP in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Bei dem RNA-bindenden Protein TIA handelt es sich um ein Markerprotein für Stressgranula. Die Zellen wurden gestresst und mit 𝛼V5 auf Rex gefärbt. In den ungestressten Zellen ist TIA dif- fus im Zellkern verteilt und es findet keine Co-Lokalisation mit Rex und Staufen statt (siehe Abbildung 13, oben). Erst unter Stressbedingungen wandert das Protein aus dem Zellkern ins Cytoplasma und trägt dort zur Bildung von Stressgranula bei (siehe Abbildung 13, unten). In den Stressgranula kann eine deutliche Co-Lokalisation mit Rex und Staufen beobachtet werden (durch Pfeile markiert). Abbildung 13: Nachweis des Staufen-abhängigen Rex-Transports in induzierte Stressgranula: HEK 293T-Zellen wurden mit Rex-V5, Staufen-cherry und TIA-YFP transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit NaArsenit (0,5 mmol/L) für zwei Stunden gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA647-Antikörper eingesetzt. Oben: Ungestresste Zellen als Referenz. Während Rex und Staufen im Cytoplasma co-lokalisieren, ist TIA diffus im Cytoplasma verteilt. Unten: Gestresste Zellen. TIA ist aus dem Zellkern in cytoplasmatische Stressgranula eingewandert und colokalisiert dort mit Rex und Staufen. 4 Ergebnisse XXVIII Des Weiteren sollte überprüft werden, ob Rex und Staufen ebenfalls mit APOBEC3GKomplexen co-lokalisieren. Zu diesem Zweck wurden Rex-V5, Staufen-cherry und A3G-CFP in HEK 293T-Zellen co-transfiziert. Nachdem die Zellen gestresst wurden, wurde Rex mittels 𝛼V5 angefärbt. Als Referenz wurden ungestresste Zellen mitgeführt, in denen A3G diffus im Cytoplasma vorliegt und dort mit Rex und Staufen co-lokalisiert (siehe Abbildung 14, oben). Durch die Zugabe von Na-Arsenit bilden sich deutliche A3G-Komplexe in den Zellen aus (siehe Abbildung 14, unten). Rex und Staufen können eindeutig in diesen Komplexen nachgewiesen werden (durch Pfeile markiert). Abbildung 14: Nachweis der Co-Lokalisation von Staufen-gebundenem Rex und A3G-Komplexen: HEK 293TZellen wurden mit Rex-V5, Staufen-cherry und A3G-CFP transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Na-Arsenit (0,5 mmol/L) für eine Stunde gestresst. Anschließend erfolgte die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung. Für die Detektion von Rex-V5 wurde ein 𝛼V5- und 𝛼mouseA647-Antikörper eingesetzt. Oben: Ungestresste Zellen als Referenz. Es findet eine diffuse Co-Lokalisation von Rex, Staufen und A3G statt. Unten: Gestresste Zellen. Rex und Staufen sind im Cytoplasma in A3G-Granula vorzufinden. Die durchgeführten Co-Lokalisationsstudien weisen stark darauf hin, dass Staufen-1gebundenes HTLV-1 Rex-Protein unter Stressbedingungen in granuläre Strukturen im Cytoplasma transportiert wird. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass Rex durch die Interaktion mit Staufen-1 in Stressgranula und APOBEC3G-Komplexe einwandert. 5 Diskussion 5 XXIX Diskussion Der Transport von messenger RNA aus dem Zellkern ins Cytoplasma unterliegt strenger Regulation. Um die Translation fehlerhafter Proteine zu verhindern, gelangen ausschließlich korrekt gespleißte mRNAs zu den Ribosomen, dem Ort der Proteinbiosynthese [16]. Virale Strukturproteine werden allerdings von ungespleißten bzw. nur teilweise gespleißten VolllängenmRNAs kodiert. Zudem darf das virale Genom, bestehend aus Volllängen-RNA, welches in Viruspartikel eingebaut wird, nicht durch Spleißen zerstört werden. Diese Intron enthaltenen mRNAs würden im Zellkern zurückgehalten werden bis sie schließlich gepleißt oder abgebaut werden [15,16]. Retroviren haben jedoch Möglichkeiten entwickelt diesen Mechanismus zu umgehen. Komplexe Retroviren kodieren neben den Strukturproteinen für sogenannte akzessorische Proteine. Durch die Bindung Intron enthaltener mRNAs verhindern akzessorische Proteine deren Spleißing und ermöglichen zusätzlich den Transport ins Cytoplasma [15,16]. Zu solchen Proteinen, die den cytoplasmatischen Export ungespleißter viraler mRNAs ermöglichen, gehören das HERV-K Rec-, HIV Rev- und das HTLV Rex-Protein. Für die Ausführung ihrer Funktion müssen sie mit zellulären Wirtsproteinen wie dem Kern-Exportfaktor Crm-1 interagieren [16]. Für die beiden Proteine Rec und Rev konnte zudem die Interaktion mit dem RNAbindenden Staufen-1 nachgewiesen werden [2,21]. Staufen ist einerseits an dem Transport zellulärer mRNAs zu den Ribosomen beteiligt [18]. Andererseits kann es die Translation reprimierter mRNAs oder deren Abbau bewirken [19,20]. Da die Proteine Rev und Rec strukturell und funktionell verwandt mit Rex sind, beschäftigt sich diese Arbeit mit der Prüfung der Vermutung, dass Staufen-1 ein zellulärer Interaktionspartner von HTLV-1 Rex ist. 5.1 Interaktion von HTLV-1 Rex und Staufen-1 Um den Nachweis einer Interaktion zwischen Rex und Staufen zu erbringen, wurden die beiden Proteine in Co-Immunpräzipitationen mit 𝛼V5-Sepharose eingesetzt. Rex-V5 wurde über den C-terminal eingefügten V5-Tag an die Sepharose gebunden. Staufen-Flag hingegen konnte im anschließenden Western Blot nur nachgewiesen werden, wenn es durch die Interaktion mit Rex indirekt an das Trägermaterial gebunden wurde. Durch diesen Versuch konnte festgestellt werden, dass eine Interaktion zwischen Rex und Staufen stattfindet. Um dies mit Sicherheit sagen zu können, bedarf es aber weiterer Immunpräzipitationsversuche mit reproduzierbaren Ergebnissen. Angesichts der Tatsache, dass die Interaktion mit Staufen bereits für HIV-1 sowie 5 Diskussion XXX HERV-K bestätigt werden konnte [2,21], könnte es sich hierbei um einen verbreiteten Mechanismus unter komplexen Retroviren handeln. In weiterführenden Experimenten könnte die Interaktion von HTLV-1 Rex und Staufen-1 mit weiteren Methoden wie z.B. der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestätigt werden. Des Weiteren sollte durch Co-Lokalisationsstudien die Möglichkeit einer Interaktion zwischen Rex und Staufen bekräftigt werden. In durchgeführten Immunfluoreszenzfärbungen des HTLV-1 Rex-Proteins konnte zunächst festgestellt werden, dass sich der Großteil des Proteins im Zellkern befindet. Ein weitaus geringerer Rex-Anteil ist zudem im Cytoplasma vorzufinden. Diese Beobachtungen decken sich mit bereits publizierten Ergebnissen [16]. Die cytoplasmatische Lokalisation kann damit erklärt werden, dass das Protein im Cytoplasma translatiert und erst anschließend durch das Kernlokalisationssignal (NLS) in den Zellkern geschleust wird. Obwohl Staufen ebenfalls ein funktionales Kernlokalisationssignal besitzt, war das Protein überwiegend im Cytoplasma und nur in seltenen Fällen im Zellkern vorzufinden. Dieser Umstand ist wahrscheinlich auf einen schnellen cytoplasmatischen Export zurückzuführen [21]. In anschließenden Co-Transfektionsversuchen und Immunfluoreszenzfärbungen mit Rex und Staufen konnte die mittels Co-Immunpräzipitation festgestellte Interaktion bekräftigt werden. Es konnte eine deutliche Co-Lokalisation der beiden Proteine im Cytoplasma sowie im Zellkern beobachtet werden. Dieses Ergebnis deckt sich mit Co-Lokalisationsstudien zu Rec bzw. Rev und Staufen-1 [2,21]. Außerdem wies Rex in Gegenwart von Staufen eine stark veränderte Lokalisation auf. Rex war überwiegend im Cytoplasma und nur noch zu einem geringen Anteil im Zellkern lokalisiert. Diese Beobachtung konnte durch eine Staufen-Titration und anschließender Zellfraktionierung bestätigt werden. Mit steigender Staufen-Menge stieg der Anteil von Rex im Cytoplasma. Dieser Umstand ist womöglich damit zu erklären, dass Staufen einem schnellen cytoplasmatischen Export unterliegt [21]. Ist Rex an Staufen gebunden, wird es wahrscheinlich ebenfalls schneller ins Cytoplasma ausgeschleust. Im nächsten Schritt sollte die an der Interaktion mit Rex beteiligte Staufen-1-Domäne identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurden vier Staufen-Deletionsmutanten zusammen mit Rex in Co-Immunpräzipitationen (IP) eingesetzt. Die Deletionsmutanten waren durch das Einfügen von Stoppcodons in die Sequenz unterschiedlich weit C-terminal verkürzt worden. Allerdings wurde die Mutante 1 bestehend aus den RNA-Bindedomänen (RBD) 2 und 3 nicht exprimiert. Im Gegensatz zu Mutante 2, die aus RBD2 und 3 sowie dem vorderen Teil der RBD4 besteht, konnte die Mutante 3 in der IP-Probe detektiert werden. Da Mutante 3 nur um den hinteren Teil der RBD4 länger ist, könnte hier die interagierende Domäne vermutet werden. Die Staufen- 5 Diskussion XXXI Region, welche mit dem HERV-K Rec-Protein interagiert befindet sich ebenfalls im hinteren Teil der RBD4 [2,21]. Sollte diese Region der RBD4 auch für die Interaktion mit Rex verantwortlich sein, hätte allerdings auch die Interaktion zwischen Rex und Mutante 4 stattfinden müssen. Diese Mutante besteht aus den RNA-Bindedomänen 2, 3 und 4 sowie aus der TubulinBindedomäne, wurde aber nicht in der IP-Probe nachgewiesen. Eine mögliche Erklärung wären Faltungsprobleme der Deletionsmutante 4, wodurch die Interaktion mit Rex beeinträchtigt wurde. Der Versuch liefert somit nur einen Hinweis auf die beteiligte Domäne. Um die mit Rex interagierende Staufen-1-Domäne exakt bestimmen zu können, müssen weitere Wiederholungen dieses Versuchs folgen. 5.2 Einfluss von Staufen-1 auf die Partikelbildung von HTLV-1 Ein wichtiger Teil dieser Arbeit war es die Auswirkungen der Interaktion des viralen Rex mit dem humanen Staufen-1 auf die Partikelproduktion eines HTLV-1-Molekularklons zu untersuchen. Im Western Blot konnte ein positiver Effekt der Interaktion auf die Viruspartikelproduktion festgestellt werden. Verglichen mit Zellen, die ausschließlich mit dem Molekularklon transfiziert wurden, konnte durch die Überexpression von Rex eine leicht erhöhte Partikelproduktion nachgewiesen werden. Da HTLV von sich aus Rex exprimiert, war durch die alleinige Überexpression des Proteins keine massive Erhöhung zu erwarten. Im Gegensatz dazu konnte durch die Co-Transfektion mit Staufen bzw. Rex und Staufen die Bildung von HTLV-Partikeln stark gesteigert werden. Allerdings konnte der Blot aufgrund zahlreicher unspezifischer Banden nicht optimal ausgewertet werden. Um das Ergebnis zu verbessern, könnte z.B. ein speziell gegen Gag gerichteter Antikörper anstelle des HTLV-Vollserums eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit wäre der Einsatz eines Infrarot-markierten Antikörpers, um den Blot durch die Messung der Bandenintensitäten am „Odyssey Infrared Imaging System“ besser auswerten zu können. Eine weitaus bessere Möglichkeit zur quantitativen Auswertung lieferte ein Assay zur Quantifizierung der Reversen Transkriptase-Aktivität. Es wurde bereits beschrieben, dass die Interaktion von Staufen-1 und Rec einen positiven Effekt auf die Partikelproduktion von HERV-K113 ausübt. Durch die Co-Transfektion eines HERV-K113-Provirus mit Staufen-1 konnte die Partikelproduktion um ein 20-faches gesteigert werden [2,21]. Mit dem durchgeführten RT-Assay konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Aus der Überexpression von Rex resultierte eine 3-mal höhere Produktion von HTLV-Partikeln, wohingegen die Co-Transfektion mit Stau- 5 Diskussion XXXII fen eine Steigerung um das 28-fache erzielte. Eine 23-mal höhere Produktion viraler Partikel wurde durch die Überexpression beider Proteine erzielt. Mittels weiterer Wiederholungen des Versuchs muss geklärt werden, ob das Ergebnis reproduzierbar ist. Eine mögliche Erklärung für die verminderte Partikelproduktion durch Überexpression von Rex und Staufen im Gegensatz zu Staufen allein könnte in der regulatorischen Funktion des p13-Proteins zu suchen sein. p13 ist ein weiteres akzessorisches HTLV-Protein, welches aus einfach gespleißter mRNA entsteht [p30,116]. Durch die zusätzliche Überexpression von Rex steigt der Anteil an ungespleißter und einfach gepleißter mRNA an, wodurch p13 verstärkt exprimiert werden kann. In Zellen, die Tax exprimieren, ist p13 teilweise im Zellkern lokalisiert und bindet dort an das regulatorische Tax-Protein. Die Tax-abhängige Aktivierung der viralen Transkription wird durch die Bindung an p13 vermindert. In der Folge werden die Expression viraler Strukturproteine und die Produktion von Viruspartikeln herunterreguliert [p30,116]. Es wird vermutet, dass diese Strategie dazu beiträgt die Detektion des Virus durch das Immunsystem zu verhindern. Die Ergebnisse des Western Blots und des RT-Assays weisen darauf hin, dass durch eine alleinige Überexpression von Staufen verstärkt HTLV-Partikel gebildet werden. Es könnte vermutet werden, dass an Rex gebundene virale mRNAs unter diesen Bedingungen verstärkt ins Cytoplasma transportiert werden. Das Resultat wäre eine erhöhte Expression viraler Strukturproteine, womit die beobachtete Steigerung der Partikelproduktion zu erklären wäre. Mithilfe von RNA-Reporterkonstrukten, die u.a. für das Protein Luciferase kodieren, könnte z.B. ein verstärkter cytoplasmatischer Export viraler mRNAs überprüft werden. 5.3 Antivirale Abwehrmechanismen Werden eukaryotische Zellen Stress ausgesetzt, tragen RNA-bindende Proteine wie TIA durch Aggregation zu Bildung von sogenannten Stressgranula bei. Diese Granula beinhalten zudem kleine ribosomale Untereinheiten, Transkriptionsinitiationsfaktoren und regulatorische Faktoren, die der antiviralen Abwehr dienen können [24,25]. Unter Stressbedingungen wird die Translation der mRNAs vieler „housekeeping“-Proteine durch den Transport in Stressgranula unterbrochen, um den RNA-Metabolismus verstärkt auf die Expression von Schutz- und Reparaturproteinen umzustellen [23]. Es ist bekannt, dass das RNA-bindende Staufen-1 in gebildete Stressgranula einwandert [22]. Mittels Immunfluoreszenzfärbungen konnte festgestellt werden, dass HTLV-1 Rex, genau wie HERV-K Rec und HIV-1 Rev [2,21], mit Staufen und dem Stressprotein TIA co-lokalisiert. Demnach wird gebundenes Rex und womöglich virale mRNA 5 Diskussion XXXIII durch die Interaktion mit Staufen in Stressgranula transportiert. Allerdings konnte für HTLVinfizierte Zellen gezeigt werden, dass das regulatorische Tax-Protein unter Stressbedingungen ins Cytoplasma wandert und dort die Bildung von Stressgranula verhindert [30]. Dieser Effekt beruht auf der Bindung der Histon-Deacetylase 6, welche ebenfalls an der Bildung der Granula beteiligt ist. Es wird vermutet, dass diese von HTLV entwickelte Methode zelluläre Stressbedingte Prozesse zu regulieren zum Überleben infizierter Zellen beitragen könnte [30]. In weiteren Immunfluoreszenzfärbungen konnte beobachtet werden, dass Rex zusammen mit Staufen und APOBEC3G unter Stressbedingungen in granulären Strukturen co-lokalisiert. Für bestimmte Staufen enthaltene HMMA3G-Subtypen wurde bereits beschrieben, dass sie unter Stressbedingungen in Stressgranula einwandern können [28]. Es ist daher gut möglich, dass die Co-Lokalisation von Rex und Staufen in Stressgranula stattfindet. Um dies zu prüfen, müssten Co-Transfektionen und Immunfluoreszenzfärbungen von Rex und Staufen zusammen mit A3G sowie TIA erfolgen. HMM-A3G-Komplexe sind zwar enzymatisch inaktiv, aber besitzen die Fähigkeit die Retrotransposition retroviraler Elemente zu verhindern [28]. In wie fern die CoLokalisation von Rex mit diesem antiviralen Protein Auswirkungen auf die HTLV-Replikation ausübt, muss in Zukunft geklärt werden. 6 Zusammenfassung 6 XXXIV Zusammenfassung Es besteht großes Interesse zelluläre Interaktionspartner von humanen Retroviren zu identifizieren. Das humane RNA-bindende Protein Staufen-1 wurde bereits als Interaktionspartner des pathogenen HIV-1 Rev- und des endogenen HERV-K Rec-Proteins beschrieben. Basierend auf der Vermutung, dass es sich bei der Interaktion mit Staufen-1 um einen verbreiteten Mechanismus unter komplexen Retroviren handelt, sollte in dieser Arbeit die Interaktion von HTLV-1 Rex mit dem humanen Staufen untersucht werden. Für Interaktionsstudien zwischen dem humanen Staufen-1 und dem HTLV-1 Rex-Protein wurde die für maximale Expression codon-optimierte rex-Sequenz in den pcDNA4/V5-HisAVector kloniert, um einen C-terminalen V5-Tag einzufügen. Mittels Co-Transfektion und CoImmunpräzipitation von Rex-V5 und Staufen-Flag an 𝛼V5-Sepharose konnte im Western Blot festgestellt werden, dass Staufen-1 mit dem Rex-Protein interagiert. Dies wurde durch Immunfluoreszenzfärbungen von Rex-V5 sowie Staufen-cherry exprimierender Zellen weiter bekräftigt. Rex und Staufen zeigten eine deutliche Co-Lokalisation in Zellkern und Cytoplasma. Verglichen mit Zellen, welche ausschließlich mit Rex-V5 transfiziert wurden, wies Rex zudem eine erhöht cytoplasmatische Lokalisation auf. Diese Beobachtung lässt die Vermutung zu, dass Rex durch die Interaktion mit Staufen verstärkt ins Cytoplasma geschleust wird. Die Bestimmung der interagierenden Staufen-1-Domäne erfolgte durch Co-Immunpräzipitation von Staufen-1-Deletionsmutanten mit Rex-V5. Es konnte gezeigt werden, dass die RBD4-Region wahrscheinlich an der Interaktion beteiligt ist. Um den Einfluss auf die Partikelproduktion zu prüfen, wurden Rex-V5 und Staufen-Flag mit einem HTLV-1-Molekularklon co-transfiziert. Die Virus-haltigen Kulturüberstände wurden durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und mittels Western Blot und RT-Assay analysiert. Durch die Überexpression von Staufen wurde eine Steigerung der Partikelproduktion um das 28-fache erzielt. In Co-Lokalisationsstudien mit TIA und APOBEC3G sollten die Folgen der Interaktion für HTLV-1 in gestressten Zellen untersucht werden. Die Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass an Staufen gebundenes Rex unter Stressbedingungen in Stressgranula transportiert wird. Es konnten Co-Lokalisationen von Rex-V5 und Staufen-cherry mit TIA-YFP sowie A3G-CFP in Arsenit-induzierten Stressgranula beobachtet werden. Die Auswirkungen auf die Translation viraler mRNA in den Stressgranula müssen in weiterführenden Experimenten geklärt werden. 7 Abstract 7 XXXV Abstract Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) is the causative agent of adult T-cell leukemia as well as HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis and was first discovered in 1980. Understanding the exact mechanisms of such retroviral infections is important for the development of new strategies for medical treatment. In order to replicate successfully, it is necessary for retroviruses to interfere with their host cell metabolism. Identifying cellular proteins that play an important role during the life cycle of retroviruses is an important first step towards gaining new insights into virus-host interactions. Human Staufen-1 has recently been identified as an HIV-1 Rev and HERV-K Rec interacting protein and might contribute to the transport of HTLV-1 RNA by binding to the accessory Rex protein. This work focuses on the possible interaction between HTLV-1 Rex and human Staufen-1. First, the HTLV-1 codon-optimized rex-sequence was cloned into the pcDNA4/V5-HisA vector adding a C-terminal V5-tag to Rex. The interaction between Rex and Staufen was confirmed by co-transfection and co-immunoprecipitation of Rex-V5 and Staufen-Flag. This was confirmed by subsequent immunofluorescence experiments. Rex-V5 and Staufen-cherry were observed to mainly co-localize in the cytoplasm and occasionally in the nucleus. In addition, Rex-V5 showed an enhanced cytoplasmic localization compared to HEK 293T cells that were transfected with Rex-V5 alone. These findings suggest that binding to Staufen results in an enhanced nuclear export of Rex. The results of a further co-transfection and coimmunoprecipitation experiment using four Flag-tagged Staufen-1 truncation mutants and RexV5 indicated that the Staufen-1 interacting region was located within the RBD 4. In order to investigate the impact of Rex-Staufen interaction on HTLV-1 particle production, Rex-V5 and Staufen-Flag were co-transfected with an HTLV-1 molecular clone. The supernatants of transfected cells were ultracentrifuged and analyzed by means of immunoblot and RTassay. In comparison to HTLV-1 transfected cells, a surplus of Staufen increased the production of viral particles by a factor of 28. Furthermore, immunofluorescence microscopy revealed the co-localization of Rex-V5 and Staufen-cherry with TIA-YFP and APOBEC3G in arsenide stressed cells, suggesting that Rex is transported into stress granules. Future experiments should investigate whether HTLV-1 RNA accumulates in such stress granules and the possible implications for virus replication. 8 Literaturverzeichnis XXXVI 8 Literaturverzeichnis 1 Yoshida, M. (2005) Discovery of HTLV-1, the first human retrovirus, its unique regulatory mechanisms, and insights into pathogenesis. Oncogene 24, 5931–5937 Hanke, K. (2010) Funktionelle Charakterisierung der HERV-K Proteine Env und Rec, Berlin O'Brien, S. J., Troyer, J. L., Brown, M. A., Johnson, W. E., Antunes, A., Roelke, M. E. and Pecon-Slattery, J. (2012) Emerging viruses in the Felidae: shifting paradigms. Viruses 4, 236–257 Takatsuki, K. (2005) Discovery of adult T-cell leukemia. Retrovirology 2, 16 Gallo, R. C. (2005) The discovery of the first human retrovirus: HTLV-1 and HTLV-2. Retrovirology 2, 17 Matsuoka, M. (2005) Human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) infection and the onset of adult T-cell leukemia (ATL). Retrovirology 2, 27 Hinuma, Y., Nagata, K., Hanaoka, M., Nakai, M., Matsumoto, T., Kinoshita, K. I., Shirakawa, S. and Miyoshi, I. (1981) Adult T-cell leukemia: antigen in an ATL cell line and detection of antibodies to the antigen in human sera. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6476–6480 Katri, P. and Ruan, S. (2004) Dynamics of human T-cell lymphotropic virus I (HTLV-I) infection of CD4+ T-cells. C. R. Biol. 327, 1009–1016 Yoshida, M. (2010) Molecular approach to human leukemia: isolation and characterization of the first human retrovirus HTLV-1 and its impact on tumorigenesis in adult T-cell leukemia. Proc. Jpn. Acad., Ser. B, Phys. Biol. Sci. 86, 117–130 Younis, I. and Green, P. L. (2005) The human T-cell leukemia virus Rex protein. Front. Biosci. 10, 431–445 Boese, A., Sauter, M., Galli, U., Best, B., Herbst, H., Mayer, J., Kremmer, E., Roemer, K. and Mueller-Lantzsch, N. (2000) Human endogenous retrovirus protein cORF supports cell transformation and associates with the promyelocytic leukemia zinc finger protein. Oncogene 19, 4328–4336 Kashanchi, F. and Brady, J. N. (2005) Transcriptional and post-transcriptional gene regulation of HTLV-1. Oncogene 24, 5938–5951 Kesic, M., Doueiri, R., Ward, M., Semmes, O. J. and Green, P. L. (2009) Phosphorylation regulates human T-cell leukemia virus type 1 Rex function. Retrovirology 6, 105 Ye, J., Silverman, L., Lairmore, M. D. and Green, P. L. (2003) HTLV-1 Rex is required for viral spread and persistence in vivo but is dispensable for cellular immortalization in vitro. Blood 102, 3963–3969 Baydoun, H. H., Bellon, M. and Nicot, C. (2008) HTLV-1 Yin and Yang: Rex and p30 master regulators of viral mRNA trafficking. AIDS Rev 10, 195–204 Shida, H. (2012) Role of Nucleocytoplasmic RNA Transport during the Life Cycle of Retroviruses. Frontiers in microbiology 3, 179 Furic, L., Maher-Laporte, M. and DesGroseillers, L. (2008) A genome-wide approach identifies distinct but overlapping subsets of cellular mRNAs associated with Staufen1and Staufen2-containing ribonucleoprotein complexes. RNA 14, 324–335 Miki, T., Takano, K. and Yoneda, Y. (2005) The role of mammalian Staufen on mRNA traffic: a view from its nucleocytoplasmic shuttling function. Cell Struct. Funct. 30, 51–56 Kim, Y. K., Furic, L., Parisien, M., Major, F., DesGroseillers, L. and Maquat, L. E. (2007) Staufen1 regulates diverse classes of mammalian transcripts. EMBO J. 26, 2670–2681 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 8 Literaturverzeichnis XXXVII 20 Thomas, M. G., Martinez Tosar, L. J., Loschi, M., Pasquini, J. M., Correale, J., Kindler, S. and Boccaccio, G. L. (2005) Staufen recruitment into stress granules does not affect early mRNA transport in oligodendrocytes. Mol. Biol. Cell 16, 405–420 21 Hanke, K., Liedgens, L., Hohn, O., Kurth, R. and Bannert, N. ((eingereicht)) Staufen-1 interacts with HERV-K Rec and HIV-1 Rev to assist in nucleocytoplasmic RNA transport and association with stress granules containing APOBEC3G 22 Thomas, M. G., Martinez Tosar, L. J., Desbats, M. A., Leishman, C. C. and Boccaccio, G. L. (2009) Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. J. Cell. Sci. 122, 563–573 23 Anderson, P. and Kedersha, N. (2006) RNA granules. J. Cell Biol. 172, 803–808 24 Mokas, S., Mills, J. R., Garreau, C., Fournier, M.-J., Robert, F., Arya, P., Kaufman, R. J., Pelletier, J. and Mazroui, R. (2009) Uncoupling stress granule assembly and translation initiation inhibition. Mol. Biol. Cell 20, 2673–2683 25 Beckham, C. J. and Parker, R. (2008) P bodies, stress granules, and viral life cycles. Cell Host Microbe 3, 206–212 26 Imahashi, M., Nakashima, M. and Iwatani, Y. (2012) Antiviral Mechanism and Biochemical Basis of the Human APOBEC3 Family. Frontiers in microbiology 3, 250 27 Goila-Gaur, R. and Strebel, K. (2008) HIV-1 Vif, APOBEC, and intrinsic immunity. Retrovirology 5, 51 28 Chiu, Y.-L., Witkowska, H. E., Hall, S. C., Santiago, M., Soros, V. B., Esnault, C., Heidmann, T. and Greene, W. C. (2006) High-molecular-mass APOBEC3G complexes restrict Alu retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15588–15593 29 Sinha-Datta, U., Datta, A., Ghorbel, S., Dodon, M. D. and Nicot, C. (2007) Human T-cell lymphotrophic virus type I rex and p30 interactions govern the switch between virus latency and replication. J. Biol. Chem. 282, 14608–14615 30 Legros, S., Boxus, M., Gatot, J. S., van Lint, C., Kruys, V., Kettmann, R., Twizere, J. C. and Dequiedt, F. (2011) The HTLV-1 Tax protein inhibits formation of stress granules by interacting with histone deacetylase 6. Oncogene 30, 4050–4062 XXXVIII 9 Anhang 9 9.1 Anhang HTLV-1 corex-Sequenz HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 10 20 30 40 50 60 70 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AAGCTTGCCA CCATGCCCAA GACCAGAAGA AGGCCCAGAC GGTCCCAGAG CAAGAGGCCT CCTACCCCTT AAGCTTGCCA CCATGCCCAA GACCAGAAGA AGGCCCAGAC GGTCCCAGAG CAAGAGGCCT CCTACCCCTT ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 80 90 100 110 120 130 140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| GGCCTACAAG CCAGGGCCTG GACCGGGTGT TCTTCAGCGA CACCCAGAGC ACCTGTCTGG AAACCGTGTA GGCCTACAAG CCAGGGCCTG GACCGGGTGT TCTTCAGCGA CACCCAGAGC ACCTGTCTGG AAACCGTGTA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 150 160 170 180 190 200 210 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| CAAGGCCACA GGCGCCCCTA GCCTGGGCGA TTATGTGCGG CCTGCCTACA TCGTGACCCC CTACTGGCCT CAAGGCCACA GGCGCCCCTA GCCTGGGCGA TTATGTGCGG CCTGCCTACA TCGTGACCCC CTACTGGCCT ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 220 230 240 250 260 270 280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| CCCGTGCAGA GCATCAGAAG CCCTGGCACC CCTAGCATGG ATGCCCTGAG CGCCCAGCTG TACTCCAGCC CCCGTGCAGA GCATCAGAAG CCCTGGCACC CCTAGCATGG ATGCCCTGAG CGCCCAGCTG TACTCCAGCC ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 290 300 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| TGTCTCTGGA CAGCCCCCCC AGCCCTCCTA GAGAACCTCT GAGGCCTAGC AGAAGCCTGC CCCGGCAGTC TGTCTCTGGA CAGCCCCCCC AGCCCTCCTA GAGAACCTCT GAGGCCTAGC AGAAGCCTGC CCCGGCAGTC ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 360 370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| TCTGATCCAG CCCCCTACCT TTCACCCCCC TAGCAGCAGA CCCTGCGCCA ACACACCTCC CAGCGAGATG TCTGATCCAG CCCCCTACCT TTCACCCCCC TAGCAGCAGA CCCTGCGCCA ACACACCTCC CAGCGAGATG ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 430 440 450 460 470 480 490 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| GACACCTGGA ACCCTCCACT GGGCAGCACC AGCCAGCCTT GCCTGTTCCA GACACCCGAC AGCGGCCCTA GACACCTGGA ACCCTCCACT GGGCAGCACC AGCCAGCCTT GCCTGTTCCA GACACCCGAC AGCGGCCCTA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 500 510 520 530 540 550 560 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AGACCTGTAC ACCTTCTGGC GAGGCCCCTC TGAGCGCCTG TACAAGCACC AGCTTCCCAC CACCTAGCCC AGACCTGTAC ACCTTCTGGC GAGGCCCCTC TGAGCGCCTG TACAAGCACC AGCTTCCCAC CACCTAGCCC ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 570 580 590 600 610 620 630 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AGGCCCTAGC TGTCCTACAC TCGAG~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ AGGCCCTAGC TGTCCTACAC TCGAGTCTAG AGGGCCCTTC GAAGGTAAGC CTATCCCTAA CCCTCTCCTC ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~GGTAAGC CTATCCCTAA CCCTCTCCTC HTLV_coRex coRex in pcDNA4A V5-Tag 640 650 660 670 680 690 700 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ GGTCTCGATT CTACGCGTAC CGGTCATCAT CACCATCACC ATTGAGTTTA AACCCGCTGA TCAGCCTCGA GGTCTCGATT CTACG~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ XXXIX 9 Anhang 9.2 Sequenzierungprimer Tabelle 3: Sequenzierungsprimer Primer T7_Promtor BGH_rev 5‘ 3‘ Sequenz TAATACGACTCACTATAGGGA TAGAAGGCACAGTCGAGG