Screening-Strategie für TKs

Transcrição

Transfusionsvermittelte bakterielle Infektionen
in Deutschland
KOLT, Langen
12. November 2009
Neue Schnellmethoden
zur Detektion
bakterieller Kontaminationen
in Thrombozytenkonzentraten
Tanja Vollmer
Klebsiella pneumoniae (2 Fälle), Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis und Streptococcus pyogenes
Institut für Laboratoriums- und Transfusionsmedizin
HDZ NRW , UniBlutspendedienst OWL
Probleme
•
Erhöhter Produktverfall
•
Logistische Probleme bei der Bereitstellung von Konserven, besonders an
Wochenenden/Feiertagen
•
Ethischer Aspekt gegenüber dem Spender durch Verwerfen eines
transfusionstauglichen Produktes
MÖGLICHE ALTERNATIVEN:
Einführung der Pathogenreduktion-Methodik
oder
Testung auf bakterielle Kontamination
strategy
early testing
BacT/Alert culture
„negative to date“
Sample volume:
Result:
Detection limit:
1 st strategy
2 x >5 mL
>3 - 7d
>1 CFU/mL
Real-time RT-PCR
Sample volume:
Result:
Detection limit:
quarantine
> 24h
2.4 mL
28 h
>10 - 30 CFUs/mL
2 nd strategy
release after testing
maximum
durability
Donation
0
1
2
3
4
5
Dreier et al., Vox Sang (2008)
1
Alter der ausgegebenen TKs
im Herz- und Diabeteszentrum NRW
Detektionszeit und Transfusionszeitpunkt
von TKs
35
maximum storage
life of PCs
1.92
APC-2
30
APC-4
APC-5
APC-6
APC-7
APC-8
APC-9
APC-10
APC-11
APC-12
APC-13
5.46
5.71
7.63
6.00
6.50
5.83
6.17
25
durchschn. Zeitpunkt
der kulturellen Detektion
20
15
10
5.92
4.92
5
5.33
7.38
PPC-1
2
3
4
5
Storage time [d]
0
1
2
6
7
3
4
5
6
Alter bei Ausgabe (Tage)
Detection time BactAlert
5.33
1
0
Time of transfusion
4.58
PPC-2
0
Anteil der TKs (%)
5.21
APC-3
Propionibacterium acnes
8
ca. 50% der Tks
Dreier et al., Vox Sang. (2008)
Platelet PGD® Test
(Verax Biomedical – Fenwal)
Sample volume:
Result:
Detection limit:
strategy
early testing
BacT/Alert culture
2 x >5 mL
>3 - 7d
>1 CFU/mL
1 st strategy
„negative to date“
Sample volume:
Result:
Detection limit:
2.4 mL
28 h
>10 - 30 CFUs/mL
2 nd strategy
release after testing
strategy
• spezifisch für den Nachweis gram-positiver
(GP) und gram-negativer(GN) Bakterien
maximum
durability
Donation
0
• Pan Genera Detection® (PGD) Technologie
• qualitativer Lateralfluss-Einwegtest
(immunochromatographischer Test)
Real-time RT-PCR
quarantine
> 24h
late testing
Bacterial Isolate in PC
APC-1
2
1
3
5
4
FACS, NAT, PGD
Sample volume:
Result:
Detection limit:
variable
prior to transfusion
>10 - 30 CFUs/mL (NAT)
>104 CFUs/mL (FACS)
10 4 - 10 5 CFUs/mL (PGD)
• Antikörper gegen Lipopolysaccharid (LPS –
GN) und Lipoteichonsäuren (GP)
3 rd strategy
release after
Point of issue testing
(Bedside-like)
• FDA-Zulassung + IVD-CE (2008,
Deutschland)
untere Nachweisgrenze
PGD:Pan Genera® Detection, Verax Biomedical Inc.
8,2 x 103 bis 8,6 x105 CFU/ml
Dreier et al., Vox Sang. (2008, subm.)
Durchführung der PGD-Testung von TKs
Platelet PGD® Test
Lyse von 500 µL TK durch Zugabe
von 8 Tropfen Lösung 1
Zentrifugation 5 min, Dekantieren
des Überstandes
Zugabe von 8 Tropfen Lösung 2
Zugabe 4 Tropfen Lösung 3,
Resuspension
Dekantieren auf Test-Device
Inkubation 15-75 min, alle 10 min
ablesen des Teststreifens
2
Platelet PGD® Test
TK: negativ
?
TK: positiv
Gram-positive
TK: positiv
Gram-negative
Time-to-result:
1,5 h
?
Hands-on-time:
5 min
Bakteriennachweis in TK mittels
Durchflußzytometrie (FACS)
Durchführung:
- Bakterienfärbung erfolgt
während der
Thrombozyten-Lyse
- 50 µl TK + 450 µl Puffer
- 5 min Inkubation
- Reagenz Thiazol-orange
(TO; BD Biosciences)
- FACS-Messung
Durchführung:
- Bakterienfärbung erfolgt
nach der
Thrombozyten-Lyse
Platelet control
PGD-Testung Gram-negativer Stämme
- 50 µl TK + 50 µl ZelllysePufer
- 5 min Inkubation
- 400 µl TO-Färbepuffer
- 10 min Inkubation
- FACS-Messung
K. pneumoniae:
2.0 x 104 CFU/mL
*Addition der Einzelergebnisse (eindeutig positiv: 1 Punkt, fraglich positiv: 0.5 Punkte, negativ: 0 Punkte)
Æ Gesamtauswertung: score 0-1: negativ, 1.5-2.5 fraglich, 3-5 positiv
Vorteil:
- Einfache, schnelle
Durchführung
K. pneumoniae
E. coli:
2.8 x 104 CFU/mL
Vorteil:
- Reduktion des
Hintergrunds durch
TK-Debris bzw.
bessere Trennung
der Bakterien- von
TK-Population
- Implementierung von
Validation beads
→ Erhöhung der Sensitivität durch Präinkubation in Satellitenbeutel oder Medium bei 37°C
Karo et al. Clin Chem Lab Med 2008
Bakterien-Screening in TKs mittels
BactiFlow Durchflusszytometrie
PRINZIP:
• nicht-fluoreszentes Substrat wird der
Probe zugesetzt
• bei lebenden Zellen mit Enzymaktivität
und Membranintegrität passiert das
Färbesubstrat passiv die Zellen und
wird im Zellinnern durch zytoplastische
Enzyme (Esterase) gespalten.
BactiFlow-Technologie (AES-Chemunex)
• fluoreszierendes Material bleibt in der
Zelle
• Intensität der daraus resultierenden intrazellulären zytoplasmischen Fluoreszenz
ist verbunden mit der Stoffwechsel-Aktivität der Zelle, wobei tote Zellen unmarkiert
bleiben.
Durchführung der BactiFlow-Testung von TKs
Herstellung des Enzymgemisches
1 mL Thrombozytenkonzentrat +
432 µL Enzymgemisch
Inkubation 15 min, 37 °C
Zugabe von 6 mL ChemSol A7
Kontrollen für
Testvalidität:
Zentri-Filtration über
ChemFilter 25
Interne Beads
Positivkontrolle
Zugabe von 3 mL Färbelösung
Inkubation Labeling-Station 12 min
Time-to-result:
0,75 – 1 h
Zugabe von:
140 µL CS26A (enthält Val.Beads)
1 Spatelspitze CSR-Pulver
Hands-on-time:
5-10 min
PBS + Tensid zur Solubilisierung
Abtrennung der Thrombozyten-Zellreste
Analyse im Durchflusszytometer
(Bactiflow)
3
BactiFlow zur Sterilitätstestung von TKs
Platelet control
BactiFlow zur Sterilitätstestung von TKs
Bestimmung des „Grundrauschens“
K. pneumoniae
reaktiv
Validation
beads
Cut-off (300 C/mL)
TK Debris
negativ
Sterile PLTs of different ages were tested with the BactiFlow assay. The solid horizontal line represents the mean
values for each age of PLT, the dotted horizontal lines defined the cut-off values for negative, and positive.
Untere Nachweisgrenze und
Linearität des BactiFlow-Tests
Vergleich verschiedener Schnellteste zum
Sterilitäts-Screening von TKs
CFU/mL
Klebsiella pneumoniae PEI-B-0808
1010
30
108
25
Counts/mL
Linear regression analysis and comparison of bacterial titers in a two-fold dilution series of S. epidermidis (PEI-DSM
3269) and E. coli (PEI-B-19-03) from 1:1 to 1:32 measured by BactiFlow and colony-forming assay.
15
104
100
*
5
**
n.t.
0 6 12
24 30
48 54
72
- - - - - - -
- +
+ +
+ +
+ +
+
+
+
Vergleich verschiedener Schnellteste zum
Sterilitäts-Screening von TKs
10
BacTAlert
aerob/anaerob
102
PGD
BF
PCR
Untere Nachweisgrenze im TK: 150 CFU/ml
20
Culture [h]
10
6
+ +
+ +
0
BF: BactiFlow
Durchflußzytometrie
nach Aktivitätsfärbung (Esteraseakt.)
BactiFlow Testung Gram-negativer Stämme
Staphylococcus epidermidis DSM 3269
C/mL
30
106
25
BacTAlert
aerob/anaerob
20
104
15
102
10
PGD
BF
PCR
5
**
100
Culture [h]
CFU/mL
108
0 6 12
24 30
48 54
72
- - - - - - -
- - +
- +
+ +
+ +
- -
+
+
+
0
BF: BactiFlow
Durchflußzytometrie
nach Aktivitätsfärbung (Esteraseakt.)
4
Verlängerung der Haltbarkeit
Praktische Umsetzung HDZ-NRW:
negative BactiFlow Ergebnisse
Vorgehensweise bei der Freigabe der BactiFlow-Resultat/Verlängerung der
Haltbarkeit:
1.
2.
3.
4.
Die Freigabe der Ergebnisse durch die Sachkundige Person
EDV-gestützte Übertragung der Resultate
EDV-gestützte Prüfung der Resultate (Alter der Konserve = 4 Tage,
Datum der Ergebniserfassung entspricht dem 4. Tag nach der Spende,
Vorliegen eines BactiFlow-Ergebnisses unterhalb des Grenzwertes,
Übereinstimmung Probennummer und Konservenbezeichnung)
Bei Vorliegen aller Prüfbedingungen wird die Laufzeit der Konserve um
einen Tag verlängert und ein neues Teiletikett mit der geänderten
Haltbarkeit gedruckt und das TK beklebt
Praktische Umsetzung HDZ-NRW:
positive BactiFlow Ergebnisse
Ergebnis > 300 Counts/mL
Nachtestung nach 2 Stunden in Doppelbestimmung
Freigabe des Produktes
Ausblick
1. Durchführung eine multizentrischen Studie mit
vier Blutspendeeinrichtungen zur Analyse der
Routinetauglichkeit (Anwendbarkeit, Robustheit)
mindestens ein Testergebnis
> 300 Counts/mL
beide Testergebnisse
< 300 Counts/mL
Verwerfen des Produktes,
Weitere Abklärung der Erregerspezifität
Vielen Dank
J. Dreier
K. Kleesiek
Jürgen Diekmann
2. Sterilitätstestung von TKs mit einem Alter von
2 oder 3 Tagen um auch mit schnellwachsenden
Bakterien kontaminierte Produkte zu
identifizieren
allen Mitarbeitern/-innen des PCR-Labors
Herz- und Diabeteszentrum
Nordrhein-Westfalen
Ruhr-Universität Bochum
Georgstraße 11
32545 Bad Oeynhausen
Tel.: +49 (0) 57 31 / 97-2036
Fax: +49 (0) 57 31 / 97-1959
E-Mail: [email protected]
www.hdz-nrw.de
5

Screening-Strategie für TKs

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