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Jahrbuch 2006/2007 | Martin, Jörg; Lupas, Andrei | Molekularer Mechanismus der Signalübertragung durch
Membranen
Molekularer Mechanismus der Signalübertragung durch Membranen
Mechanism of signal transduction through membranes
Martin, Jörg; Lupas, Andrei
Max-Planck-Institut für Entw icklungsbiologie, Tübingen
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
W ie gelangt Information in das Zellinnere? Die molekularen Mechanismen der Signalübertragung durch
Membranen sind w eitgehend unbekannt. Durch die Struktur einer archaealen HAMP-Domäne, w elche mittels
magnetischer Resonanzspektroskopie entschlüsselt w urde, ist es gelungen, Einsicht in diesen Vorgang zu
gew innen. HAMP verbindet als Teilbereich vieler Transmembran-Rezeptorproteine deren extrazelluläre mit der
intrazellulären Domäne und spielt daher eine entscheidende Rolle bei der Signalw eiterleitung. HAMP offenbart
die Fähigkeit, zw ei stabile, konvertierbare Konformationen mit ähnlicher Energie einzunehmen, w obei die
Bindung bzw . Dissoziation eines Liganden an den Rezeptor die Umw andlung der einen in die andere Form
begünstigt. Ein solcher Konformationsw echsel erinnert an ein Uhrw erk, das sich zw ischen zw ei definierten
Zuständen hin und herdreht und erklärt zugleich, w ie die signalabhängige Strukturänderung von Rezeptoren
auf molekularer Ebene ablaufen könnte.
Summary
Understanding how external signals are transduced across cellular membranes is a formidable challenge for
molecular biologists. Through the structure of an archaeal HAMP domain, w hich w as determined by nuclear
magnetic resonance spectroscopy, w e gained more insight into this process. The HAMP domain connects
extracellular sensory to intracellular effector domains in a large number of transmembrane receptor proteins
and hence is thought to play a crucial role in signal transduction. The structure reveals an ability to sw itch
reversibly betw een tw o conformations w ith similar energy levels, w hose balance is affected by ligand binding.
A cogw heel-like rotation of helices, triggered by ligand binding to the sensory domain, appears to underlie the
conformational change that mediates transduction of extracellular information into the cell.
Die HAMP Domäne in Membranrezeptoren
Die Beantw ortung der Frage, w ie extrazelluläre Signale durch die Membran ins Innere einer Zelle vermittelt
w erden, ist eine der zentralen Herausforderungen der modernen Biologie. Denn das Hauptproblem besteht
darin,
dass
Membranen
für
die
meisten
Substanzen
allenfalls
semipermeabel
sind
und
Transmembranrezeptoren, die ein Signal von außen aufnehmen können, keinen direkten Transport von
Signalmolekülen in die Zelle bew erkstelligen. Folglich kann das Signal nur indirekt, zum Beispiel auf
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mechanischem
Wege,
w eitergegeben
w erden.
Dazu
muss
es
zu
einer
Konformationsänderung
im
Rezeptormolekül kommen. Extra- und intrazelluläre Domänen von Rezeptorproteinen sind oft durch so
genannte HAMP-Domänen miteinander verbunden, die sich unmittelbar an die letzte Transmembranhelix im
Molekül anschließen. Das Akronym HAMP steht für das Vorkommen dieser Domäne in Histidinkinasen,
Adenylatcyclasen, methylierten Chemotaxisproteinen und Phosphatasen.
Derzeit sind über 7800 Rezeptoren mit HAMP-Domänen in der SMART-Datenbank erfasst,von denen über 97%
in Bakterien, 2% in Archaeen und w eniger als 1% in Eukaryoten vorkommen. SMART ist eine Datenbank am
European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg, w elche die Verbreitung von über 600 verschiedenen
Domänen in Proteinen dokumentiert. Mehr als 20% aller Histidinkinasen und über zw ei Drittel der
Chemotaxisrezeptoren besitzen eine HAMP-Domäne. Die Sequenzen der HAMP-Domänen zeigen ein sich
w iederholendes Muster aus sieben Aminosäuren, in dem die erste und vierte Aminosäure hydrophobe
Eigenschaften zeigt. Dieses Muster ist charakteristisch für so genannte Coiled Coil-Strukturen, Bündel von αHelices die sich umeinander w inden. Bis auf die Periodizität der hydrophoben Reste ist die Sequenz w enig
konserviert und enthält keine w eiteren invarianten Reste.
Strukturaufklärung einer archaebakteriellen HAMP Domäne durch NMR
W ir konnten erstmals die Struktur einer HAMP-Domäne aus dem Rezeptor Af1503 des Archaeons Archaeoglobus
fulgidus, das in heißen Quellen bei etw a 85 °C lebt, mittels magnetischer Kernresonanzspektroskopie (NMR)
aufklären [1]. Der Vorteil: Bisherige Strukturuntersuchungen w aren w ahrscheinlich daran gescheitert, dass
HAMP-Domänen unter Laborbedingungen (Raumtemperatur) rasch zw ischen zw ei Schalterpositionen hin und
her w echseln, w ährend das Rezeptoprotein des hyperthermophilen Archaeons in einer Konformation fixiert
bleibt
und
daher
für
NMR-Untersuchungen
geeignet
ist.
Af1503
ist
vermutlich
Teil
eines
Signaltranduktionssystems, das am Transport divalenter Metallkationen w ie Ca 2+ beteiligt ist.
Die Strukturuntersuchungen ergaben, dass es sich bei der Af1503 HAMP-Domäne um ein Bündel aus zw ei mal
zw ei parallelen α-Helices handelt, w elche eine vier-helikale Coiled Coil ausbilden (Abb. 1). Die beobachtete
Konformation der im Zentrum dieser Struktur verpackten Aminosäurereste w eicht jedoch von der erw arteten
Konformation (der so genannten knobs-into-holes Geometrie) ab und ist in zw eierlei Hinsicht ungew öhnlich und
neuartig.
Struk tur de r HAMP -Dom ä ne . Die be ide n struk tura usbilde nde n
Monom e re sind je we ils ge lb und grün ge fä rbt. Se ite nk e tte n im
Struk turinne re n sind in Strichda rste llung ge ze igt: Se ite nk e tte n
von He lice s, die a ufe ina nde r zu ze ige n (x Ge om e trie ), sind in
rot und Se ite nk e tte n, die se itwä rts ze ige n (da Ge om e trie ), in
bla u da rge ste llt. Die m ittle re und re chte Da rste llung ze ige n
die link e Da rste llung je we ils um 90 Gra d se nk re cht bzw.
wa a ge re cht ge dre ht.
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Um dies zu verstehen, ist es notw endig, die erw artete, kanonische Konformation zu betrachten [2]: α-Helices
sind spiralenförmige Anordnungen der Polypeptidkette mit einer Periode von 3,63 Aminosäuren pro
Umdrehung, bei der die Seitenketten w ie Knubbel (knobs) radial abstehen. Eine energetisch besonders
günstige Lösung, um α -Helices im selben Register gegeneinander zu verpacken, ist, knobs auf der
Kontaktseite in ein Loch zu setzen, w elches von vier knobs der gegenüberliegenden Helix gebildet w ird (knobsinto-holes). Dies ist jedoch über größere Strecken nur möglich, w enn die Periode der Helices von 3,63 auf 3,5
erniedrigt w ird, sodass jew eils ein knob pro Umdrehung auf der Kontaktseite liegt und die Geometrie der
Seitenketten sich nach sieben Aminosäuren (oder zw ei Umdrehungen der Helix) w iederholt. Diese sieben
Seitenkettenpositionen w erden mit a, b, c, d, e, f und g bezeichnet. Die knobs auf der Kontaktseite sind a und d
und zeigen hydrophobe Eigenschaften. Sie sind jew eils immer an der Seite der symmetrieäquivalenten knobs
der anderen Helix verpackt, also a immer mit a’ und d immer mit d’. Die Verringerung der Periode w ird erreicht,
indem die Helices sich verdrehen und umeinander w inden w ie die Schnur eines Telefonhörers. Da die Helices
selber auch spiralenförmig gew unden sind, nennt man diese doppelt gew undene Struktur eine Coiled Coil.
In HAMP zeigen die knobs von diagonal entgegengesetzten Helices entw eder direkt aufeinander zu, eine
Position,
die x genannt w ird, oder sie
zeigen seitlich w eg, w as
als da bezeichnet w ird (Abb. 2).
Verpackungskonflikten w ird dadurch aus dem Weg gegangen, dass Helices diagonal abw echselnd einmal die x
und einmal die da Geometrie zeigen. W ir haben diese Verpackungsform, die bisher nur in ganz w enigen Coiled
Coils beobachtet w orden ist, complementary x-da genannt. HAMP ist das einzige Protein, w elches diese
Verpackungsform mit allen Helices in paralleler Ausrichtung zeigt, in allen anderen verlaufen die Helices
antiparallel. Zudem ist es die einzige bekannte Struktur mit asymmetrischer Verpackung: Zw ei diagonal
gegenüberliegende Helices benutzen nämlich die kanonische Position a, um die x Geometrie auszubilden, und
die anderen beiden Helices benützen d. W ie w ir sogleich sehen w erden, ist dies essenziell für einen
Zahnradmechanismus, w elchen w ir vorschlagen.
Sche m a tische Da rste llung de r be oba chte te n x -da Ve rpa ck ungsge om e trie (link s) und de r k a nonische n C oile d
C oil-Ge om e trie (re chts). Die be ide n Form e n k önne n durch
a x ia le Dre hung de r He lice s um 26 Gra d ine ina nde r
übe rge führt we rde n, wie in de r Da rste llung de r He lice s a ls
Za hnrä de r ge ze igt. Da die Za hnrä de r ine ina nde r gre ife n,
m üsse n sich be na chba rte He lice s in e ntge ge nge se tzte
R ichtung dre he n. Fa rble ge nde de r Se ite nk e tte n wie in Abb. 1.
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Diese Struktur entsprach nicht unseren Erw artungen aus der Sequenzanalyse. Aufgrund des hydrophoben
Musters vermuteten w ir nämlich eine kanonische knobs-into-holes Strukturkonformation - die w ir allerdings
rechnerisch modellieren konnten, indem w ir jede der vier Helices 26 Grad um die eigene Helixachse drehten.
Da die Helices durch ihre Seitenketten miteinander verzahnt sind, mussten dazu benachbarte Helices in
entgegengesetzter Richtung gedreht w erden. W ie in Abbildung 2 gezeigt, ist dies w egen der asymmetrischen
Form der complementary x-da Verpackung möglich.
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Signalzustände werden durch die jeweilige HAMP Konformation festgelegt
Da die HAMP-Domäne Teil eines Signaltransduktionsproteins ist, stellten w ir die Hypothese auf, dass HAMP
zw ischen den beiden Konformationen complementary x-da und knobs-into-holes w echselt und jede dieser
Konformationen einem definierten Signalzustand entspricht. Um dieses Modell zu erhärten, führten w ir
Mutationen in die HAMP-Domäne ein, w elche die kanonische knobs-into-holes Konformation stabilisieren
sollten.
Ansatzpunkt
w ar
die
zw eite x-Position
der
ersten
Helix, in
der
aus
sterischen
Gründen
Aminosäurereste mit kleinen Seitenketten bevorzugt sind. Die Vergrößerung der Seitenkette an dieser Position
sollte die beobachtete Verpackungsgeometrie destabilisieren und dadurch die kanonische knobs-into-holes
Konformation favorisieren. Unter mehreren Mutanten, die in vitro in der Tat Einfluss auf die Struktur der HAMPDomäne zeigten, w ählten w ir die Mutante Af1503 A291V aus, um die Funktion der HAMP-Domäne bei der
Signaltransduktion auch in vivo, also in dem Kontext eines gesamten Rezeptors, zu studieren. Verw endet
w urden Chemotaxis-Assays in dem Bakterium Escherichia coli. Bakterien haben eine Vielzahl sensorischer
Systeme entw ickelt, um ihre Umw elt w ahrzunehmen und darauf zu reagieren - sie spüren so günstigere, zum
Beispiel nährstoffreichere Umgebungen auf und bew egen sich aktiv darauf zu. Das gezielte Wandern entlang
eines chemischen Konzentrationsgradienten bezeichnet man als Chemotaxis (Abb. 3. Dabei löst ein Reiz aus
der Umgebung eine vorprogrammierte Verhaltensw eise aus.
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Die HAMP -Dom ä ne ist e in Te il m odula r a ufge ba ute r
R e ze ptorprote ine , die unte r a nde re m in Ze llm e m bra ne n von
Ba k te rie n vork om m e n. In de r Abbildung ist de r P rototyp e ine s
C he m ota x isre ze ptors ge ze igt, de r da s Be we gungsve rha lte n
de r Ba k te rie n be e influsst (die e inze lne n Module sind in grün,
gra u, rot und bla u da rge ste llt). Die HAMP -Dom ä ne (rot) k a nn
durch R ota tion de r vie r He lice s ihre Konform a tion ä nde rn.
Die se Be we gung, e inhe rge he nd m it de m Ine ina nde rgre ife n
de r Se ite nk e tte n im Inne re n de s He lix bünde ls, e rinne rt a n die
pe riodische R ota tion von vie r Za hnrä de rn in e ine m Uhrwe rk .
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Molekularer Mechanismus der Chemotaxis
W ie kann man sich Chemotaxis als Reaktion auf einen solchen chemischen Stimulus vorstellen? In
Abw esenheit von Nährstoffgradienten führen die Zellen einen random walk aus, der aus alternierenden
Schw imm- und Taumelbew egungen besteht. Bei Anw esenheit eines chemischen Gradienten (Zucker oder
Aminosäuren) w ird der Schalter umgelegt: Es kommt zum biased walk, bei dem die Schw imm- gegenüber der
Taumelbew egung erhöht w ird, um schneller günstigere Areale zu erreichen. Die Taumelbew egung dient stets
der räumlichen Neuausrichtung der Zelle. Entsprechende Schalter befinden sich in der Zellmembran
hauptsächlich an den Zellpolen. Diese Chemotaxisrezeptoren interagieren mit den chemischen Stimuli, sie
bestehen aus verschiedenen Modulen, sodass eine Vielzahl externer Stimuli mit einer Vielzahl von internen
Antw ortmöglichkeiten kombiniert w erden kann. Im Fall der Chemotaxis führt die Bindung eines Signalmoleküls
an
den
extrazellulären
Teil
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eines
dimeren
Rezeptors
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zur
Auslösung
einer
intrazellulären
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Phosporylierungskaskade, an deren Ende Flagellen-Motorproteine das Bew egungsverhalten der Zellen durch
ihre Drehrichtung beeinflussen.
Funktionelle HAMP-Hybride
Als w ir die HAMP-Domäne des Aspartat-Chemorezeptors Tar mit der Af1503 HAMP Domäne substituierten,
verloren die Bakterien w eitgehend die Fähigkeit zum Schw immen. Der gegenteilige Effekt w ar aber mit der
Af1503 A291V Mutante zu beobachten: Die Bakterien konnten kaum noch taumeln. In beiden Fällen verschob
die archaeale HAMP-Domäne also das Gleichgew icht der beiden Rezeptorkonformationen stark auf eine Seite
und erhöhte so die Reaktionsschw elle. Aus diesen Beobachtungen resultieren w eitere Fragen: Durch w elche
Sequenz- und Struktureigenschaften w erden die jew eiligen Schalterstellungen in authentischen Rezeptoren
stabilisiert? Lässt sich die Leichtigkeit des Umschaltens modulieren und inw iew eit gibt es synergistische
Effekte bei den Rezeptormodulen? Das hier vorgestellte Chemotaxissystem erlaubt es uns, diese Fragen in
Zukunft anzugehen.
W ir untersuchten die Funktionalität von HAMP-Hybriden auch in vitro am Beispiel der mycobakteriellen
Adenylatcyclase
Rv3645. Mit
der
Af1503
HAMP-Domäne
w ies
diese
eine
im Vergleich
zur
nativen
Adenylatcyclase gesteigerte, in der A291V mutanten Form jedoch eine deutlich erniedrigte Aktivität auf. Mit
Adenylatcyclase-Hybriden
Schalterstellung
von
konnten
HAMP
w ir
auch
beeinflusst:
eine
Die
erste
Aktivität
Sequenzeigenschaft
der
Hybride
ermitteln,
korrelierte
w elche
die
mit
dem
direkt
Seitenkettenvolumen an Position 291, also an der zw eiten x-Position der ersten HAMP Helix.
Die Austauschbarkeit von HAMP-Domänen lässt auf einen konservierten Signaltransduktionsmechanismus
schließen. Meistens w erden Signale in cis w eitergegeben, das heißt innerhalb einer Polypeptidkette von der Nterminalen Rezeptordomäne zur C-terminalen Effektordomäne. Diese sind zum Beispiel im Chemorezeptor Tar
ebenfalls Coiled Coil Strukturen. Da es jedoch Rezeptoren w ie Af1503 gibt, die intrazellulär lediglich die HAMPDomäne besitzen, w ird angenommen, dass ebenso ein trans Mechanismus möglich ist. Es ist vorstellbar, dass
die Rotation neue Interaktionsoberflächen bietet, über die Wechselw irkungen mit Adapterproteinen ermöglicht
oder aber entfernt w erden. Die Aneinanderreihung mehrerer HAMP-Domänen in bestimmten Rezeptoren
w iederum könnte dann einen zusätzlichen Titrationseffekt einführen. Proteine mit multiplen HAMP-Domänen
finden sich beispielsw eise in Pilzen, Pflanzen und Protisten. Ihr Ursprung ist w ahrscheinlich durch lateralen
Gentransfer aus endosymbiontischen Vorfahren zu erklären.
Transmembranrezeptoren ohne HAMP Domäne
Wenn Rezeptoren mit HAMP-Domänen Konformationsänderungen durchlaufen, die
auf Helixrotationen
basieren, w ie funktionieren dann Rezeptoren, die kein derartiges Modul aufw eisen? Ein interessantes
Experiment der Gruppe um Daniel Koshland w eist darauf hin, dass auch hier eine Rotation von Helices die
Ursache für resultierende Konformationsänderungen in Effektordomänen sein könnte [3]. Ein HybridrezeptorKonstrukt, bestehend aus der cytosolischen Effektordomäne des Insulinrezeptors sow ie der extrazellulären
Domäne des Aspartat Chemorezeptors Tar zeigte durch Asparat stimulierbare Aktivität. Da Tar die
Signalaktivität durch die Rotation seiner cytosolischen Domänen auslöst,und dies offensichtlich auch im
Hybridrezeptor tun kann, legt dies den Schluss nahe, dass die Aktivität des nativen Insulinrezeptors ebenfalls
durch
Rotation
reguliert
w ird.
Das
Rotationsprinzip
könnte
somit
universelle
Bedeutung
auch
für
eukaryontische Rezeptoren und Signaltransduktionssysteme haben, die mit gänzlich anderen Modulen
operieren. Unsere zukünftigen Arbeiten w erden diesen Aspekt besonders beachten.
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[1] Hulko, M.; Berndt, F.; Gruber, M.; Linder, J.U.; Truffault, V.; Schultz, A.; Martin, J.; Schultz, J.E.; Lupas,
A.N;Coles, M.:
The HAMP domain structure implies helix rotation in transmembrane signaling.
Cell 126, 929-940 (2006)
[2] Lupas, A.N.; Gruber, M.:
The structure of alpha-helical coiled coils.
Advances in Protein Chemistry 70, 37-78 (2005)
[3] Moe, G.R; Bollag, G.E.; Koshland, D.E.Jr.:
Transmembrane signaling by a chimera of the Escherichia coli aspartate receptor and the human insulin
receptor.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, 5683-5687 (1989)
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