www.QuantiFERON.com QuantiFERON® -TB Gold Plus (QFT®

Transcrição

QuantiFERON®-TB Gold Plus (QFT®-Plus)
ELISA Packungsbeilage
2 x 96
Der IFN-γ-Test für Vollblut zur Messung der Reaktion
auf die Peptidantigene ESAT-6 und CFP-10
In-vitro-Diagnostikum
622120
QIAGEN GmbH
QIAGEN-Straße 1
40724 Hilden
DEUTSCHLAND
Telefon: +49-2103-29-0
1083163DE Rev. 02
www.QuantiFERON.com
www.QuantiFERON.com
Inhalt
Verwendungszweck
4
Zusammenfassung und Erklärung des Tests
4
Testprinzip
6
Zeitbedarf für den Test
7
Komponenten und Aufbewahrung
8
Vom Anwender bereitzustellende Materialien
9
Lagerung und Handhabung
9
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
10
10
Warnhinweise
10
Vorsichtsmaßnahmen
11
Probennahme und -handhabung
14
Gebrauchsanweisung
16
Berechnungen und Auswertung des Tests
21
Erstellung der Standardkurve
21
Qualitätskontrolle des Tests
22
Interpretation der Ergebnisse
22
Grenzen des Verfahrens
24
Leistungsmerkmale
25
Klinische Studien
25
Leistungsmerkmale des Tests
31
Technische Informationen
37
Unschlüssige Ergebnisse
37
Geronnene Plasmaproben
37
Hilfe zur Fehlerbehebung
38
Literatur
40
Symbole
47
Kontaktinformationen
47
Kurzanleitung
48
QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Packungsbeilage 02/2015
3
Verwendungszweck
Der Test QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ist ein In-vitro-Diagnostikum zur
Stimulation von Zellen in heparinisiertem Vollblut. Hierzu wird ein Peptid-Cocktail
verwendet, der die Proteine ESAT-6 und CFP-10 simuliert. Die In-vitro-Reaktion auf
diese Peptid-Antigene, die in Zusammenhang mit einer Infektion durch Mycobacterium
tuberculosis steht, wird durch Nachweis von Interferon-γ (IFN-γ) mittels ELISA-Test
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) festgestellt.
QFT-Plus ist ein indirekter Test auf Infektionen mit M. tuberculosis (einschließlich der
aktiven Erkrankung) und ist zur Verwendung in Zusammenhang mit der Risikoabschätzung, Röntgenuntersuchungen und anderen medizinischen und diagnostischen
Verfahren vorgesehen.
Zusammenfassung und Erklärung des Tests
Tuberkulose ist eine übertragbare Krankheit, die durch eine Infektion mit Organismen
des M.-tuberculosis-Komplexes (MTB-Komplex: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum)
verursacht wird. Die Ansteckung erfolgt in der Regel über eine Tröpfcheninfektion durch
Personen, die an Tuberkulose der Atemwege leiden. Bei neu infizierten Personen kann
Wochen oder Monate später eine Tuberkulose-Erkrankung auftreten, bei den meisten
Infizierten treten jedoch keine Beschwerden auf. Bei einigen persistiert eine latente
Tuberkulose-Infektion (LTBI), eine nicht übertragbare, asymptomatische Erkrankung, die
erst Monate oder Jahre später zum Ausbruch kommen kann. Der Hauptzweck der
Erkennung der LTBI besteht darin, eine Behandlung zur Prävention des Ausbruchs der
Tuberkulose-Erkrankung in Betracht zu ziehen. Bis vor kurzem war der TuberkulinHauttest (THT) die einzige verfügbare Methode zur Diagnose der LTBI. Die kutane
Sensitivität für Tuberkulin entsteht 2 bis 10 Wochen nach der Infektion. Jedoch reagieren
einige Infizierte nicht auf Tuberkulin, darunter z. B. Patienten mit einer gestörten
Immunreaktion infolge anderer Erkrankungen, aber auch Patienten ohne solche
Erkrankungen. Umgekehrt weisen jedoch einige Personen, bei denen eine Infektion mit
M. tuberculosis unwahrscheinlich ist, eine Tuberkulin-Sensitivität auf und erzielen ein
positives Testergebnis im Tuberkulin-Hauttest, beispielsweise nach der BCG-Impfung,
nach Infektion mit anderen, nicht dem M.-tuberculosis-Komplex zugehörigen,
Mykobakterien oder aufgrund unbekannter anderer Faktoren.
Die LTBI muss von der meldepflichtigen Tuberkulose-Erkrankung abgegrenzt werden, bei
der in der Regel die Lunge und die unteren Atemwege betroffen sind, jedoch auch
andere Organsysteme betroffen sein können. Die Diagnose der Tuberkulose-Erkrankung
erfolgt aufgrund der Ergebnisse von Anamnese und ärztlicher Untersuchung sowie
aufgrund radiologischer, histologischer und mykobakteriologischer Untersuchungsergebnisse.
Mit QFT-Plus wird die zellvermittelte Immunreaktion auf Peptidantigene, welche
Mykobakterienproteine simulieren, gemessen. Diese Proteine (ESAT-6 und CFP-10)
fehlen in allen BCG-Stämmen und den meisten nicht-tuberkulösen Mykobakterien mit
4
Ausnahme von M. kansasii, M. szulgai und M. marinum (1). Bei Personen, die mit
Organismen des MTB-Komplexes infiziert sind, liegen im Allgemeinen Lymphozyten im
Blut vor, die diese und andere mykobakterielle Antigene erkennen. Bei diesem
Erkennungsprozess wird das Zytokin IFN-γ von den Zellen produziert und sezerniert.
Der Nachweis und die anschließende Quantifizierung von IFN-γ bilden die Grundlage
dieses Tests.
Die im QFT-Plus-Test verwendeten Antigene sind ein Peptidcocktail, der die Proteine
ESAT-6 und CFP-10 simuliert. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass diese
Peptidantigene die IFN-γ-Reaktion in den T-Zellen von mit M. tuberculosis infizierten
Personen stimulieren, jedoch in der Regel nicht die T-Zellen von nicht infizierten
Personen und BCG-geimpften Personen ohne Tuberkulose-Erkrankung oder LTBI-Risiko
(1–32). Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass die IFN-γ-Reaktion durch medizinische
Behandlungen oder Erkrankungen, die die Immunfunktion beeinträchtigen, verringert
wird. Patienten mit bestimmten anderen Mykobakterieninfektionen können ebenfalls auf
ESAT-6 und CFP-10 reagieren, da die Gene, die diese Proteine kodieren, auch bei M.
kansasii, M. szulgai und M. marinum vorhanden sind (1, 23). QFT-Plus ist zum einen
zum Nachweis einer LTBI geeignet und zum anderen eine wertvolle Hilfe bei der
Diagnose einer Infektion mit dem M.-tuberculosis-Komplex bei erkrankten Patienten. Ein
positives Testergebnis unterstützt die Diagnose einer Tuberkulose-Erkrankung; jedoch
kann es auch durch Infektionen mit anderen Mykobakterien (z. B. M. kansasii)
hervorgerufen werden. Für die Bestätigung bzw. den Ausschluss einer TuberkuloseErkrankung sind weitere medizinische und diagnostische Untersuchungen erforderlich.
Bei QFT-Plus-Test kommen zwei verschiedene TB-Antigen-Röhrchen zum Einsatz: TBAntigen-Röhrchen 1 (TB1) und TB-Antigen-Röhrchen 2 (TB2). Beide Röhrchen enthalten
Peptidantigene der mit dem MTB-Komplex assoziierten Antigene ESAT-6 und CFP-10.
Das TB1-Röhrchen enthält Peptide von ESAT-6 und CFP-10, welche zellvermittelte
Immunreaktionen von CD4+ T-Helfer-Lymphozyten auslösen sollen, während das TB2Röhrchen eine zusätzliche Kombination von Peptiden enthält, welche der Induktion von
zellvermittelten Immunreaktionen von zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten dienen. Die
Ausschüttung von IFN-γ durch CD4+ T-Zellen spielt eine entscheidende Rolle bei der
natürlichen Kontrolle einer MTB-Infektion durch das Immunsystem. Neue Forschungsergebnisse weisen darauf hin, dass auch CD8+ T-Zellen eine Rolle bei der Wirtsabwehr
von MTB spielen, indem sie IFN-γ und andere lösliche Faktoren produzieren. Diese
Faktoren aktivieren Makrophagen, welche die Vermehrung der MTB unterdrücken, töten
infizierte Zellen oder lysieren direkt intrazelluläre MTB (33–35). MTB-spezifische CD8+Zellen wurden bei Patienten mit LTBI und mit aktiver TB gefunden, wo häufig IFN-γproduzierende CD8+-Zellen vorhanden sind (36–38). Zudem wurde berichtet, dass
CD8+ T-Zellen, die für ESAT-6 und CFP-10 spezifisch sind, häufiger bei Patienten mit
aktiver TB-Erkrankung als bei Patienten mit LTBI nachgewiesen werden und mit einer
kürzlich erfolgten MTB-Exposition in Zusammenhang stehen könnten (39–41). MTBspezifische CD8+ T-Zellen, die IFN-γ produzieren, wurden auch bei Probanden mit
aktiver TB und Koinfektion mit HIV (42, 43) sowie bei kleinen Kindern mit TBErkrankung (44) nachgewiesen.
5
Testprinzip
Der QFT-Plus-Test beinhaltet spezielle Blutentnahmeröhrchen, in die die Vollblutproben
entnommen werden. Die anschließende Inkubation der Blutproben im Röhrchen dauert
16 bis 24 Stunden. Danach wird das Plasma entnommen und auf das Vorliegen von
IFN-γ untersucht, das gegebenenfalls in Reaktion auf die Peptidantigene gebildet
wurde.
Der QFT-Plus-Test wird in zwei Teilen durchgeführt. Zunächst wird Vollblut in jedes der
QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen abgenommen. Dabei handelt es sich um ein
Negativkontrolle-Röhrchen (Nil), ein TB1-Röhrchen, ein TB2-Röhrchen und ein MitogenRöhrchen. Alternativ kann das Blut mit einem einzigen normalen Blutentnahmeröhrchen, welches Lithium-Heparin als Antikoagulans enthält, entnommen und
anschließend in die QFT-Plus-Röhrchen überführt werden.
Das Mitogen-Röhrchen wird im QFT-Plus-Test als Positivkontrolle verwendet. Dies kann
in Fällen wichtig sein, in denen der Immunstatus des Patienten fraglich ist. Das
Mitogen-Röhrchen dient auch als Kontrolle für den korrekten Umgang mit der
Blutprobe und die korrekte Inkubation.
Die QFT-Plus-Röhrchen sollten so schnell wie möglich, jedoch spätestens 16 Stunden
nach der Blutentnahme, bei 37 °C inkubiert werden. Nach einer Inkubationszeit von
16 bis 24 Stunden werden die Röhrchen dann zentrifugiert, das Plasma wird
abgenommen und die Menge an IFN-γ (IU/ml) wird mittels ELISA gemessen.
Ein QFT-Plus-Test gilt als positiv für die IFN-γ-Reaktion, wenn der Messwert eines der
beiden TB-Antigen-Röhrchen (IFN-γ in IU/ml) signifikant über dem Wert der Negativkontrolle (Nil) liegt. Die Plasmaprobe aus dem Mitogen-Röhrchen dient bei jeder Probe
als IFN-γ-Positivkontrolle. Wenn eine Blutprobe eine negative Reaktion auf die TBAntigene zeigt, weist eine ebenfalls nur geringe Reaktion auf das Mitogen (< 0,5 IU/ml)
auf ein unschlüssiges Ergebnis hin. Ein solches Muster kann auftreten bei ungenügender
Lymphozytenzahl, verringerter Lymphozytenaktivität infolge unsachgemäßer Probenbehandlung, unsachgemäßem Befüllen oder Mischen des Mitogen-Röhrchens oder
dann, wenn die Lymphozyten des Patienten nicht in der Lage sind, IFN-γ zu
produzieren. Das Negativkontrolle-Röhrchen dient der Hintergrundkorrektur (z. B. bei
übermäßiger IFN-γ-Konzentration in der Blutbahn oder heterophilen Antikörpern). Der
IFN-γ-Wert des Negativkontrolle-Röhrchens wird vom IFN-γ-Wert der TB-AntigenRöhrchen und des Mitogen-Röhrchens abgezogen.
6
Zeitbedarf für den Test
Nachstehend finden Sie Angaben zur geschätzten Dauer des QFT-Plus-ELISA sowie zur
erforderlichen Zeit bei der gleichzeitigen Durchführung mehrerer Tests.
Inkubation der Blutröhrchen bei 37 °C: 16 bis 24 Stunden
ELISA:
Etwa 3 Stunden für eine ELISA-Platte
(22 Patienten)
< 1 Stunde Arbeitszeit
Plus 10 bis 15 Minuten pro zusätzliche Platte
7
Komponenten und Aufbewahrung
Blood Collection Tubes*
200
Röhrchen
Single Patient Pack
(Einzelpatientenpackung)
Katalog-Nr.
622526
622222
50
10
Anzahl an Tests/Packung
QuantiFERON Nil Tube (NegativkontrolleRöhrchen, grauer Deckel, weißer Ring)
Nil
50 Röhrchen
10 Röhrchen
QuantiFERON TB1 Tube (TB1-Röhrchen, grüner
Deckel, weißer Ring)
TB1
50 Röhrchen
10 Röhrchen
QuantiFERON TB2 Tube (TB2-Röhrchen, gelber
Deckel, weißer Ring)
TB2
50 Röhrchen
10 Röhrchen
Mitogen 50 Röhrchen
10 Röhrchen
QuantiFERON Mitogen Tube (Mitogen-Röhrchen,
lila Deckel, weißer Ring)
Packungsbeilage für QFT-PlusBlutentnahmeröhrchen
1
Komponenten des ELISA†
Katalog-Nr.
1
Kit mit 2 ELISA-Platten
622120
Microplate Strips (Mikrotiterstreifen [12 x 8 Wells], beschichtet mit
murinen monoklonalen Antikörpern gegen humanes IFN-γ)
2 Sätze von je 12 8Well-Mikrotiterstreifen
IFN-γ Standard, lyophilized (IFN-γ-Standard, lyophilisiert, enthält
rekombinant hergestelltes humanes IFN-γ, Rindercasein, 0,01 % w/v
Thimerosal)
1 Fläschchen (8 IU/ml
nach Rekonstitution)
Green Diluent (grüne Verdünnungslösung, enthält Rindercasein,
normales Mausserum, 0,01 % w/v Thimerosal)
Conjugate 100x Concentrate, lyophilized (Konjugatkonzentrat,
100-fach konzentriert, lyophilisiert, murines Antikörper-HRP-Konjugat
gegen humanes IFN-γ, enthält 0,01 % w/v Thimerosal)
1 x 30 ml
1 x 0,3 ml (nach
Rekonstitution)
Wash Buffer 20x Concentrate (Waschpufferkonzentrat, 20-fach
konzentriert, pH 7,2, enthält 0,05 % v/v ProClin® 300)
1 x 100 ml
Enzyme Substrate Solution (Enzymsubstratlösung, enthält H2O2,
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin)
1 x 30 ml
Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung, enthält 0,5 M H2SO4)
1 x 15 ml
Packungsbeilage für QFT-Plus-ELISA
1
* Nicht alle Produktkonfigurationen sind in allen Ländern erhältlich. Wenden Sie sich bitte an unseren
Kundenservice QIAGEN Customer Care (Details im Internet unter www.qiagen.com), um zu erfahren,
welche Konfigurationen für Sie bestellbar sind.
†
Siehe die Sicherheits- und Gefahrenhinweise auf Seite 11.
8
Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C ± 1 °C*. CO2 nicht erforderlich
Kalibrierte Pipetten* mit variablem Volumen für Volumina von 10 µl bis 1000 µl,
mit Einwegspitzen
Kalibrierte Mehrkanalpipette* zur Abgabe von 50 µl und 100 µl, mit
Einwegspitzen
Schüttler für Mikrotiterplatten*
Entionisiertes oder destilliertes Wasser, 2 Liter
Waschgerät für Mikrotiterplatten (vorzugsweise automatisiert)
Mikrotiterplatten-Photometer* mit 450-nm-Filter und Referenzfilter bei 620 bis
650 nm
Lagerung und Handhabung
Blutentnahmeröhrchen
Blutentnahmeröhrchen bei 4 °C bis 25 °C lagern.
Reagenzien des Kits
Reagenzien des Kits bei 2 °C bis 8 °C lagern.
Die Enzymsubstratlösung stets vor direkter Sonneneinstrahlung schützen.
Rekonstituierte und nicht verbrauchte Reagenzien
Anweisungen zur Rekonstitution der Reagenzien finden Sie auf Seite 17.
Der rekonstituierte Kitstandard ist bei Lagerung bei 2 °C bis 8 °C 3 Monate lang
haltbar.
Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Kitstandards.
Das 100x Konjugatkonzentrat muss nach Rekonstitution bei 2 °C bis 8 °C gelagert
und innerhalb von drei Monaten aufgebraucht werden.
Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Konjugats.
Gebrauchsfertig verdünntes Konjugat muss innerhalb von 6 Stunden nach
Zubereitung verwendet werden.
Gebrauchsfertig verdünnter Waschpuffer ist bei Raumtemperatur bis zu 2 Wochen
lang haltbar.
* Stellen Sie sicher, dass die Geräte gemäß den Herstellerempfehlungen geprüft und kalibriert wurden.
9
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Warnhinweise
Ein negatives Ergebnis im QFT-Plus-Test schließt die Möglichkeit einer
Infektion mit M. tuberculosis und einer Tuberkulose-Erkrankung nicht aus;
falsch-negative Ergebnisse können bedingt sein durch die Infektionsphase (z. B. wenn die Blutprobe vor der Entwicklung der zellulären
Immunreaktion entnommen wurde), Störungen der Immunfunktion durch
andere Erkrankungen, unsachgemäße Handhabung der Röhrchen nach
der Blutentnahme, unrichtige Testdurchführung oder andere
immunologische Variablen.
Ein positives Ergebnis im QFT-Plus-Test sollte nicht als alleinige
Grundlage für die Diagnose einer Infektion mit M. tuberculosis dienen;
durch unrichtige Testdurchführung kann es zu falsch-positiven
Ergebnissen kommen.
Ein positives Ergebnis im QFT-Plus-Test sollte durch weitere medizinische
und diagnostische Untersuchungen abgeklärt werden, um zu bestimmen,
ob eine aktive Tuberkulose-Erkrankung vorliegt (z. B. durch Abstrich und
Kultur, Röntgen-Thorax).
Zwar kommen ESAT-6 und CFP-10 in den BCG-Stämmen und in den
meisten bekannten nicht-tuberkulösen Mykobakterien nicht vor, ein
positives Ergebnis im QFT-Plus-Test kann jedoch auch auf eine Infektion
mit M. kansasii, M. szulgai oder M. marinum zurückzuführen sein.
Werden solche Infektionen vermutet, sind alternative Testmethoden
einzusetzen.
10
Vorsichtsmaßnahmen
Nur zum diagnostischen Gebrauch in vitro.
Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, EinmalLaborhandschuhe und eine Schutzbrille. Weitere Informationen können Sie den
entsprechenden Sicherheitsdatenblättern entnehmen (safety data sheets, SDS).
In unserer Online-Sammlung der Sicherheitsdatenblätter unter
www.qiagen.com/safety finden Sie zu jedem QIAGEN-Kit und zu jeder KitKomponente das jeweilige SDS als PDF-Datei, die Sie einsehen und ausdrucken
können.
VORSICHT: Behandeln Sie Humanblut- und -plasmaproben
stets als potenziell infektiös. Beachten Sie die einschlägigen
Richtlinien zum Umgang mit Blut. Proben und Materialien,
die mit Blut oder Blutprodukten in Kontakt waren, sind
gemäß den örtlichen und nationalen Vorschriften zu
entsorgen.
Die folgenden Gefahren- und Sicherheitshinweise gelten für einzelne
Komponenten des QuantiFERON-TB Gold Plus ELISA:
Gefahrenhinweise
QuantiFERON Conjugate (Konjugat)
Enthält: Borsäure. Gefahr! Kann die Fruchtbarkeit beeinträchtigen oder das Kind
im Mutterleib schädigen. Inhalt/Behälter einer anerkannten Abfallentsorgungsanlage zuführen. BEI EXPOSITION ODER FALLS BETROFFEN: Ärztlichen Rat
einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen. Vor Gebrauch besondere Anweisungen
einholen. Unter Verschluss aufbewahren. Schutzhandschuhe / Schutzkleidung /
Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.
QuantiFERON Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung)
Enthält: Schwefelsäure. Gefahr! Verursacht schwere Verätzungen der Haut und
schwere Augenschäden. Kann gegenüber Metallen korrosiv sein. Inhalt/Behälter
einer anerkannten Abfallentsorgungsanlage zuführen. BEI KONTAKT MIT
DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell
vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen.
BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten
Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen / duschen.
Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Unter Verschluss
aufbewahren. Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz /
Gesichtsschutz tragen.
11
QuantiFERON Enzyme Substrate Solution (Enzymsubstratlösung)
Achtung! Verursacht leichte Hautreizungen. Bei Hautreizung: ärztlichen Rat
einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen.
QuantiFERON Green Diluent (Grüne Verdünnungslösung)
Enthält: Trinatrium-5-hydroxy-1-(4-sulphophenyl)-4-(4-sulphophenylazo)pyrazol-3carboxylat. Achtung! Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
Inhalt/Behälter einer anerkannten Abfallentsorgungsanlage zuführen.
Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen waschen. Bei
Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe
hinzuziehen. Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz /
Gesichtsschutz tragen.
QuantiFERON IFN-γ Standard (IFN-γ-Standard)
Enthält: Borsäure. Gefahr! Kann die Fruchtbarkeit beeinträchtigen oder das Kind
im Mutterleib schädigen. Inhalt/Behälter einer anerkannten
Abfallentsorgungsanlage zuführen. BEI EXPOSITION ODER FALLS BETROFFEN:
Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen. Vor Gebrauch besondere
Anweisungen einholen. Unter Verschluss aufbewahren. Schutzhandschuhe /
Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.
QuantiFERON Wash Buffer 20x Concentrate (Waschpufferkonzentrat, 20-fach
konzentriert)
Enthält: Gemisch aus 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-2Hisothiazol-3-on (3:1). Achtung! Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.
Sicherheitshinweise
Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Schutzhandschuhe /
Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT
DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort
ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen / duschen. BEI KONTAKT MIT DEN
AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell
vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei
Exposition oder falls betroffen: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe
hinzuziehen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Bei
Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe
hinzuziehen. Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen
waschen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter einer anerkannten
Abfallentsorgungsanlage zuführen.
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Weitere Informationen
Sicherheitsdatenblätter: www.qiagen.com/safety
Abweichungen von den Instruktionen der QuantiFERON-TB Gold Plus (QFTPlus) ELISA Packungsbeilage können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
Bitte lesen Sie die Anweisungen vor Gebrauch sorgfältig durch.
Verwenden Sie den Kit nicht, wenn Reagenzienflaschen vor Gebrauch
beschädigt oder undicht erscheinen.
Die folgenden Reagenzien und Komponenten dürfen nicht aus
unterschiedlichen Chargen des QFT-Plus-Kits verwendet oder gemischt
werden: Mikrotiterstreifen, IFN-γ-Standard, grüne Verdünnungslösung und
100x Konjugatkonzentrat. Die anderen Reagenzien (20x Waschpufferkonzentrat, Enzymsubstratlösung und Enzymstopplösung) können zwischen
verschiedenen Kits ausgetauscht werden, solange das Verfallsdatum der
einzelnen Reagenzien nicht abgelaufen ist und die Angaben zu den
jeweiligen Chargen dokumentiert werden. Nicht benötigte Reagenzien und
biologische Proben sind gemäß den örtlichen und nationalen Vorschriften
zu entsorgen.
Nach Ablauf des Verfallsdatums dürfen die QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen
und der ELISA-Kit nicht mehr verwendet werden.
Stellen Sie vor Gebrauch sicher, dass die Laborgeräte kalibriert/validiert
wurden.
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Probennahme und -handhabung
Im QFT-Plus-Test werden die folgenden Blutentnahmeröhrchen verwendet:
1. QuantiFERON Nil (Negativkontrolle-Röhrchen, grauer Deckel mit weißem Ring)
2. QuantiFERON TB1 (TB1-Röhrchen, grüner Deckel mit weißem Ring)
3. QuantiFERON TB2 (TB2-Röhrchen, gelber Deckel mit weißem Ring)
4. QuantiFERON Mitogen (Mitogen-Röhrchen, lila Deckel mit weißem Ring)
Die Anweisungen zur Verwendung von Lithium-Heparin-Röhrchen finden Sie weiter
unten.
Die Innenwand der Blutentnahmeröhrchen ist mit getrockneten Antigenen beschichtet.
Daher müssen die Blutproben sorgfältig mit dem Inhalt des Röhrchens vermischt
werden. Die QFT-Plus-Röhrchen müssen so schnell wie möglich, jedoch spätestens
16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen 37 °C-Inkubator überführt werden.
Für optimale Ergebnisse sollte das folgende Verfahren befolgt werden:
1.
Beschriften Sie die Röhrchen in geeigneter Weise.
Stellen Sie sicher, dass jedes Röhrchen (Negativkontrolle, TB1, TB2 und Mitogen)
nach dem Entfernen des Deckels anhand des Etiketts oder auf andere Weise
identifiziert werden kann.
2.
Nehmen Sie von jedem Patienten per Venenpunktion je 1 ml Blut direkt in jedes
der QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen ab. Diese Prozedur darf nur von einer
entsprechend ausgebildeten Fachkraft durchgeführt werden.
Wichtiger Hinweis: Die Röhrchen sollten bei der Befüllung mit Blut eine Temperatur
zwischen 17 °C und 25 °C aufweisen.
Die QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen können bis zu einer Höhenlage von 810 m
benutzt werden.
Da die 1-ml-Röhrchen das Blut relativ langsam aufnehmen, belassen Sie das
Röhrchen nach dem scheinbaren Erreichen des endgültigen Füllstands bitte noch
2–3 Sekunden auf der Nadel. Dies gewährleistet, dass das korrekte Volumen
entnommen wurde.
Die schwarze Markierung seitlich am Röhrchen zeigt den validierten Füllbereich
von 0,8 bis 1,2 ml an. Falls sich der Füllspiegel des Bluts außerhalb des Bereichs
der Indikatorlinie befindet, sollte eine neue Blutprobe entnommen werden.
Bei Verwendung einer Butterfly-Nadel zur Blutentnahme ist mit Hilfe eines
Leerröhrchens sicherzustellen, dass die Schlauchverbindung mit Blut gefüllt ist,
bevor die QFT-Plus-Röhrchen verwendet werden.
Bei Verwendung der QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen in Höhenlagen oberhalb von
810 m oder falls zu wenig Blut in ein Röhrchen aufgenommen wird, kann das Blut
14
beim Patienten mit einer Spritze abgenommen und sofort anschließend je 1 ml in
jedes der 4 Röhrchen überführt werden. Aus Sicherheitsgründen nimmt man
hierzu am besten unter Beachtung der einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen die
Nadel von der Spritze, nimmt dann die Deckel von den 4 QFT-Plus-Röhrchen ab
und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut (bis zur Mitte der seitlichen schwarzen
Markierung auf dem Röhrchenetikett). Anschließend werden die Röhrchen wieder
sorgfältig mit den Deckeln verschlossen und wie nachstehend beschrieben
gemischt.
Alternativ kann das Blut mit einem einzigen normalen Blutentnahmeröhrchen, das
Lithium-Heparin als Antikoagulans enthält, entnommen und anschließend in die
QFT-Plus-Röhrchen überführt werden. Verwenden Sie ausschließlich LithiumHeparin als Blut-Antikoagulans, da andere Antikoagulantien den Test
beeinträchtigen. Füllen Sie ein Blutentnahmeröhrchen (Mindestvolumen 5 ml) und
durchmischen Sie den Inhalt behutsam, indem Sie das Röhrchen mehrere Male
über Kopf schwenken, um das Heparin zu lösen. Das Blut sollte bei Raumtemperatur
gelagert werden (22 °C ± 5 °C), bis es zur Inkubation in die QFT-Plus-Röhrchen
überführt wird. Das Überführen in die QFT-Plus- Röhrchen zur Inkubation muss
innerhalb von 16 Stunden nach der Blutentnahme erfolgen. Wurde das Blut mit
Lithium-Heparin-Röhrchen entnommen, müssen die Proben vor dem Übertragen in
die QFT-Plus-Röhrchen durch behutsames Über-Kopf-Schwenken gleichmäßig
gemischt werden. Beim Übertragen in die QFT-Plus-Röhrchen sind aseptische
Techniken und die einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen anzuwenden. Man nimmt
die Deckel von den 4 QFT-Plus-Röhrchen ab und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut
(bis zur Mitte der seitlichen schwarzen Markierung auf dem Röhrchenetikett).
Anschließend werden die Röhrchen wieder sorgfältig mit den Deckeln
verschlossen und wie nachstehend beschrieben gemischt.
3.
Schütteln Sie die Röhrchen unmittelbar nach der Befüllung zehnmal (10x) gerade
so stark, dass die gesamte Innenwand des Röhrchens mit Blut bedeckt ist. Dies löst
die Antigene an der Röhrchenwand.
Wichtiger Hinweis: Die Röhrchen sollten beim Schütteln eine Temperatur
zwischen 17 °C und 25 °C aufweisen. Zu heftiges Schütteln kann das Gel
zerstören und so zu falschen Ergebnissen führen.
4.
Nach dem Beschriften, Befüllen und Schütteln müssen die Röhrchen so schnell wie
möglich, und spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen Inkubator
mit einer Temperatur von 37 °C ± 1 °C überführt werden. Lagern Sie die Röhrchen
bis zur Inkubation bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
15
Gebrauchsanweisung
Teil 1 — Inkubation der Blutproben und Entnahme des Plasmas
Im Lieferumfang enthaltene Materialien
QFT-Plus-Blutentnahmeröhrchen (siehe Kapitel 3)
Siehe Kapitel 3
Durchführung
1.
Wenn die Inkubation der Blutproben nicht sofort anschließend an die Blutentnahme durchgeführt wird, müssen die Röhrchen unmittelbar vor der Inkubation
erneut durch 10-maliges Über-Kopf-Schwenken gemischt werden.
2.
Röhrchen STEHEND 16 bis 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C inkubieren. CO2 und
Befeuchtung sind im Inkubator nicht erforderlich.
3.
Nach der Inkubation bei 37 °C können die Blutentnahmeröhrchen bis zur
Zentrifugation bis zu 3 Tage lang bei 4 °C bis 27 °C aufbewahrt werden.
4.
Nach der Inkubation der Röhrchen bei 37 °C werden diese zur leichteren
Entnahme des Plasmas für 15 Minuten bei 2000 bis 3000 x g (RZB, engl. RCF)
zentrifugiert. Die Gelbarriere trennt dabei die Zellen vom Plasma. Geschieht dies
nicht, sollten die Röhrchen erneut zentrifugiert werden.
Das Plasma kann auch ohne Zentrifugieren entnommen werden, jedoch muss
hierbei sehr vorsichtig vorgegangen werden, um keine Zellen aufzuwirbeln.
5.
Die Plasmaproben sollten nur mit einer Pipette entnommen werden.
Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie nach der Zentrifugation jegliches Auf- und Abpipettieren
oder Mischen vor Abnahme des Plasmas. Achten Sie stets darauf, dass das Material an der
Oberfläche des Gels nicht aufgewirbelt wird.
Die Plasmaproben können direkt aus den zentrifugierten Blutentnahmeröhrchen in
die QFT-Plus-ELISA-Platte pipettiert werden, auch bei Verwendung eines ELISAAutomaten.
Die Plasmaproben können bei 2 °C bis 8 °C bis zu 28 Tage lang gelagert
werden. Nach Entnahme des Plasmas kann dieses bei unter –20 °C auch für
längere Zeit gelagert werden.
Für eine einwandfreie Testdurchführung sollten mindestens 150 µl Plasma
entnommen werden.
16
Teil 2 — IFN-γγ-ELISA
Im Lieferumfang enthaltene Materialien
QFT-Plus-ELISA-Kit (siehe Kapitel 3).
Siehe Kapitel 3.
Durchführung
1.
Alle Plasmaproben und Reagenzien, mit Ausnahme des 100x Konjugatkonzentrats,
müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C) gebracht werden.
Planen Sie für die Temperaturäquilibrierung mindestens 60 Minuten ein.
2.
Nehmen Sie nicht benötigte Streifen aus dem Rahmen, geben Sie sie in die
Folienverpackung zurück und lagern Sie sie bis zum Gebrauch im Kühlschrank.
Sehen Sie mindestens einen Streifen für die QFT-Plus-Standards und eine
ausreichende Anzahl von Streifen für die zu testenden Patienten vor (siehe
Abbildung 2). Bewahren Sie nach Gebrauch den Rahmen und den Deckel für die
verbleibenden Streifen auf.
3.
Rekonstituieren Sie den IFN-γ-Standard mit der auf dem Etikett des Fläschchens
angegebenen Menge an entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie
vorsichtig, um die Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass
der Inhalt vollständig aufgelöst wurde. Durch Rekonstitution des Standards auf
das angegebene Volumen erhält man eine Lösung mit einer Konzentration von
8,0 IU/ml.
Wichtiger Hinweis: Das Rekonstitutionsvolumen des Kitstandards ist je nach
Charge unterschiedlich.
Verwenden Sie den rekonstituierten Kitstandard zur Herstellung einer 1:2Verdünnung von IFN-γ in grüner Verdünnungslösung (Green Diluent, GD), gefolgt
von einer 1:4-Verdünnungsreihe (siehe Abbildung 1). S1 (Standard 1) enthält
4,0 IU/ml, S2 (Standard 2) enthält 1,0 IU/ml, S3 (Standard 3) enthält 0,25 IU/ml
und S4 (Standard 4) enthält 0 IU/ml (nur GD). Die Standards müssen mindestens
als Doppelbestimmung getestet werden. Stellen Sie die Verdünnungen des
Kitstandards für jeden ELISA-Durchgang frisch her.
17
Empfohlenes Verfahren für Doppelbestimmung der Standards
a. 4 Röhrchen mit „S1“, „S2“, „S3“ bzw. „S4“ beschriften.
b. Je 150 µl GD in S1, S2, S3 und S4 geben.
c. 150 µl des Kitstandards in S1 geben und gründlich mischen.
d. 50 µl von S1 in S2 überführen und gründlich mischen.
e. 50 µl von S2 in S3 überführen und gründlich mischen.
f.
GD allein dient als Nullstandard (S4).
Rekonstituierter
Kitstandard
Standard 1
4,0
IU/ml
Standard 2
1,0
IU/ml
Standard 3
0,25
IU/ml
Standard 4
0
IU/ml (Grüne
Verdünnungslösung)
Abbildung 1. Herstellung der Standardkurve.
4.
Rekonstituieren Sie das lyophilisierte 100x Konjugatkonzentrat mit 0,3 ml
entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie vorsichtig, um die
Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass das Konjugat
vollständig gelöst wurde.
Das gebrauchsfertig verdünnte Konjugat wird hergestellt, indem Sie die
erforderliche Menge des rekonstituierten 100x Konjugatkonzentrats in grüner
Verdünnungslösung verdünnen (Tabelle 1. Vorbereitung des Konjugats). Nicht
verbrauchtes 100x Konjugatkonzentrat sofort nach Gebrauch wieder bei 2 °C
bis 8 °C lagern. Nur die grüne Verdünnungslösung verwenden.
18
Tabelle 1. Vorbereitung des Konjugats
Anzahl der
Streifen
Menge an 100x
Konjugatkonzentrat
Menge an grüner
Verdünnungslösung
2
10 µl
1,0 ml
3
15 µl
1,5 ml
4
20 µl
2,0 ml
5
25 µl
2,5 ml
6
30 µl
3,0 ml
7
35 µl
3,5 ml
8
40 µl
4,0 ml
9
45 µl
4,5 ml
10
50 µl
5,0 ml
11
55 µl
5,5 ml
12
60 µl
6,0 ml
5.
Plasmaproben, die den Blutentnahmeröhrchen entnommen und vor dem Test
gelagert oder tiefgekühlt wurden, müssen vor dem Einbringen in die ELISA-Wells
sorgfältig gemischt werden.
Wichtiger Hinweis: Wenn die Plasmaproben direkt aus den zentrifugierten QFTPlus-Röhrchen zugegeben werden, ist jedes Mischen des Plasmas zu vermeiden.
Achten Sie stets darauf, dass das Material an der Oberfläche des Gels nicht
aufgewirbelt wird.
6.
Geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette je 50 µl des frisch zubereiteten
gebrauchsfertig verdünnten Konjugats in alle benötigten Wells der ELISA-Platte.
7.
Geben Sie je 50 µl der Plasmaproben mit einer Mehrkanalpipette in die
entsprechenden Wells (siehe empfohlenen Plattenbelegungsplan in Abbildung 2).
Geben Sie schließlich je 50 µl der Standards 1 bis 4 in die entsprechenden Wells.
19
1
A 1N
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
3N
5N
7N
9N
S1
S1
13 N
15 N
17 N
19 N
21 N
B
1 TB1 3 TB1 5 TB1 7 TB1 9 TB1
S2
S2
13 TB1
15 TB1
17 TB1
19 TB1
21 TB1
C
1 TB2 3 TB2 5 TB2 7 TB2 9 TB2
S3
S3
13 TB2
15 TB2
17 TB2
19 TB2
21 TB2
D
1M
3M
5M
7M
9M
S4
S4
13 M
15 M
17 M
19 M
21 M
E
2N
4N
6N
8N
10 N
11 N
12 N
14 N
16 N
18 N
20 N
22 N
F
2 TB2 4 TB1 6 TB1 8 TB1 10 TB1 11 TB1
12 TB1
14 TB1
16 TB1
18 TB1
20 TB1
22 TB1
G 2 TB2 4 TB2 6 TB2 8 TB2 10 TB2 11 TB2
12 TB2
14 TB2
16 TB2
18 TB2
20 TB2
22 TB2
H 2M
12 M
14 M
16 M
18 M
20 M
22 M
4M
6M
8M
10 M
11 M
Abbildung 2. Empfohlene Plattenbelegung (22 Tests pro Platte).
S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4)
1 N (Probe 1, Negativkontrolle-Plasma), 1 TB1 (Probe 1, TB1-Plasma), 1
TB2 (Probe 1, TB2-Plasma), 1 M (Probe 1, Mitogen-Plasma)
8.
Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und mischen Sie Konjugat und
Plasmaproben/Standards 1 Minute lang gründlich, aber unter Vermeidung von
Spritzern, auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten.
9.
Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten
120 ± 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt
sein.
10. Verdünnen Sie während der Inkubationszeit 1 Teil 20x Waschpufferkonzentrat
mit 19 Teilen entionisiertem oder destilliertem Wasser und mischen Sie sorgfältig.
Im Lieferumfang ist ausreichend 20x Waschpufferkonzentrat zur Herstellung von
2 Litern gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer vorhanden.
Waschen Sie die Wells mindestens 6-mal mit je 400 µl gebrauchsfertig
verdünntem Waschpuffer. Wir empfehlen die Verwendung eines Waschautomaten für Mikrotiterplatten.
Sorgfältiges Waschen ist für die Leistung des Tests sehr wichtig. Achten Sie bei
jedem Waschzyklus darauf, dass alle Wells vollständig bis oben mit Waschpuffer
gefüllt sind. Es empfiehlt sich, den Waschpuffer bei jedem Zyklus mindestens 5
Sekunden einwirken zu lassen.
In den Auffangbehälter für Abfallflüssigkeit sollte ein laborübliches Desinfektionsmittel gegeben werden. Befolgen Sie zudem die in Ihrem Labor geltenden
Anweisungen zur Dekontamination potenziell infektiösen Materials.
11. Klopfen Sie die Platten umgekehrt auf einem fusselarmen Papierhandtuch aus,
um noch vorhandenen Waschpuffer zu entfernen. Geben Sie 100 µl der Enzymsubstratlösung in jedes Well, decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und
mischen Sie gründlich auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten.
20
12. Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten
30 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt
sein.
13. Geben Sie nach der 30-minütigen Inkubation 50 µl Enzymstopplösung in jedes
Well und mischen Sie anschließend.
Die Enzymstopplösung sollte in der gleichen Reihenfolge und etwa im gleichen
Tempo in die Wells gegeben werden wie das Substrat in Schritt 11.
14. Messen Sie innerhalb von 5 Minuten nach Stoppen der Reaktion die optische
Dichte (OD) jedes Wells mit einem Mikrotiterplatten-Photometer unter Verwendung
eines 450-nm-Filters und eines Referenzfilters zwischen 620 und 650 nm. Die ODWerte werden für die Berechnung der Ergebnisse benötigt.
Berechnungen und Auswertung des Tests
Für die Analyse der Rohdaten und die Berechnung der Ergebnisse kann die QFT-PlusAnalysesoftware verwendet werden, die im Internet unter www.QuantiFERON.com
heruntergeladen werden kann. Bitte achten Sie darauf, immer mit der neuesten
Version der QFT-Plus-Analysesoftware zu arbeiten.
Die Software führt eine Qualitätskontrolle des Tests durch, erstellt eine Standardkurve
und liefert für jeden Patienten ein Testergebnis nach der im Abschnitt „Interpretation
der Ergebnisse“ beschriebenen Methode.
Alternativ zur Verwendung der QFT-Plus-Analysesoftware können die Ergebnisse auch
wie im Folgenden beschrieben ermittelt werden.
Erstellung der Standardkurve
(Bei Nichtverwendung der QFT-Plus-Analysesoftware)
Ermitteln Sie für jede Platte die Mittelwerte der OD-Werte der KitstandardDoppelbestimmungen.
Erstellen Sie eine log(e)-log(e)-Standardkurve durch Auftragen des log(e) des ODMittelwerts (y-Achse) gegen den log(e) der IFN-γ-Konzentration der Standards in IU/ml
(x-Achse), unter Nichtberücksichtigung des Nullstandards. Berechnen Sie dann die
Regressionsgerade für diese Punkte.
Ermitteln Sie anhand der Standardkurve die IFN-γ-Konzentration (IU/ml) der einzelnen
Plasmaproben anhand ihrer OD-Werte.
Für diese Berechnungen können Software-Pakete für Mikrotiterplatten-Photometer
verwendet werden oder gängige Tabellenkalkulations- und Statistik-Programme (wie
beispielsweise Microsoft® Excel®). Wir empfehlen die Verwendung solcher Software-
21
Pakete zur Durchführung der Regressionsanalyse und zur Berechnung des
Variationskoeffizienten (%CV) der Standards sowie des Korrelationskoeffizienten (r)
der Standardkurve.
Qualitätskontrolle des Tests
Die Genauigkeit der Testergebnisse hängt von der Erstellung einer korrekten
Standardkurve ab. Daher müssen vor Auswertung der Testergebnisse die Ergebnisse
der Standards geprüft werden.
Der ELISA liefert gültige Ergebnisse, wenn alle nachstehenden Kriterien erfüllt sind:
Der Mittelwert der OD von Standard 1 muss ≥ 0,600 sein.
Der prozentuale Variationskoeffizient (%CV) der OD-Werte der
Mehrfachbestimmungen von Standard 1 und Standard 2 muss ≤ 15 % sein.
Die OD-Werte der Mehrfachbestimmungen von Standard 3 und Standard 4
dürfen höchstens um 0,040 OD-Einheiten vom jeweiligen Mittelwert abweichen.
Der aus den mittleren Absorptionswerten der Standards berechnete
Korrelationskoeffizient (r) muss ≥ 0,98 sein.
Diese Qualitätskontrollparameter werden von der QFT-Plus-Analysesoftware berechnet
und ausgegeben.
Werden die obigen Kriterien nicht erfüllt, ist der Test ungültig und muss wiederholt
werden.
Der Mittelwert der OD des Nullstandards (grüne Verdünnungslösung) sollte ≤ 0,150
sein. Wenn der Mittelwert der OD > 0,150 ist, sollte das Verfahren zum Waschen
der Platten überprüft werden.
Interpretation der Ergebnisse
Die Ergebnisse des QFT-Plus-Tests werden gemäß den folgenden Kriterien interpretiert:
Wichtiger Hinweis: Die Diagnose bzw. der Ausschluss einer Tuberkulose-Erkrankung
sowie die Beurteilung der Wahrscheinlichkeit einer LTBI erfordern eine Kombination
von epidemiologischen, anamnestischen, medizinischen und diagnostischen
Ergebnissen; diese müssen bei der Interpretation der QFT-Plus-Testergebnisse
(Tabelle 2) in Betracht gezogen werden.
22
Tabelle 2. Interpretation QFT-Plus-Testergebnisse
Negativkontrolle
(IU/ml)
≤ 8,0
TB1 minus
Negativkontrolle
(IU/ml)
TB2 minus
Negativkontrolle
(IU/ml)
≥0,35 und
≥ 25% der
Negativkontrolle
Beliebig
Beliebig
≥ 0,35 und
≥ 25% der
Negativkontrolle
Mitogen
minus
Negativkontrolle
(IU/ml)*
Beliebig
<0,35
≥ 0,5
ODER
≥0,35 und < 25% der
Negativkontrolle
> 8,0§
QFT-Plus
Testergebnis
Positiv†
Infektion mit
M. tuberculosis
wahrscheinlich
Negativ
Infektion mit
M. tuberculosis
NICHT wahrscheinlich
Unschlüssig‡
Wahrscheinlichkeit
einer Infektion mit
M. tuberculosis kann
nicht ermittelt werden
< 0,5
Beliebig
Bericht/Interpretation
∗ Die Werte der Mitogen-Positivkontrolle (und gelegentlich auch die TB-Antigen-Werte) liegen häufig
außerhalb des Messbereichs des Mikrotiterplatten-Photometers. Dies hat für die Testergebnisse keine
Konsequenzen.
†
In Fällen, in denen eine Infektion mit M. tuberculosis nicht vermutet wird, können anfänglich positive
Ergebnisse durch erneutes Testen der Original-Plasmaproben in Doppelbestimmung im QFT-Plus-ELISA
bestätigt werden. Ergibt die Testwiederholung bei mindestens einer der zwei Probenmessungen ein
positives Ergebnis, so ist das Testergebnis als positiv zu bewerten.
‡
Mögliche Ursachen siehe Abschnitt „Hilfe zur Fehlersuche“.
§
In klinischen Studien wiesen weniger als 0,25 % der Teilnehmer eine IFN-γ Konzentration von
> 8,0 IU/ml bei der Negativkontrolle auf.
Aus der Höhe der gemessenen IFN-γ-Konzentration lassen sich keine Rückschlüsse auf
das Stadium oder den Grad der Infektion, das Ausmaß der Immunreaktivität oder die
Wahrscheinlichkeit einer Progression zu einer aktiven Erkrankung ziehen. Eine positive
TB-Reaktion bei Personen mit negativer Mitogen-Reaktion ist selten, wurde aber bei
Personen mit TB-Erkrankung beobachtet. Ein solches Ergebnis zeigt an, dass die IFN-γReaktion auf das TB-Antigen stärker ist als die auf das Mitogen. Dies ist grundsätzlich
möglich, da die Menge an Mitogen die IFN-γ-Produktion der Lymphozyten nicht
maximal stimuliert.
23
Nein
TB1 - Negativk. und/oder
TB2 - Negativk. ≥ 0,35 IU/ml
Interpretation
Ja
Nein
TB1 - Negativk. und/oder
TB2 - Negativk. ≥ 25% der
Negativkontrolle in IU/ml*
Ja
Validierung
Mitogen - Negativk.
< 0,50 IU/ml
und/oder Negativk. > 8,0 IU/ml
Ja
Unschlüssig
Nein
Negativkontrolle ≤ 8,0 IU/ml
Nein
Ja
Negativ
Positiv
* Die Werte für TB1 minus Negativkontrolle und TB2 minus Negativkontrolle sind nur dann gültig, wenn der ≥ 25 %
der Negativkontrolle betragende Wert von dem gleichen Röhrchen stammt wie der ≥ 0,35 IU/ml betragende Wert.
Abbildung 3. Flussdiagramm zur Interpretation des QFT-Plus-Tests.
Grenzen des Verfahrens
Die Ergebnisse des QFT-Plus-Tests müssen im Zusammenhang mit der epidemiologischen
Anamnese jedes einzelnen Patienten, seinem derzeitigen Gesundheitszustand und
sonstigen diagnostischen Untersuchungen betrachtet werden.
Ergebnisse mit einem Negativkontrolle-Wert über 8,0 IU/ml werden als „unschlüssig“
bewertet, da eine um 25 % höhere Reaktion auf die TB-Antigene außerhalb des
Messbereichs des Tests liegen kann.
Unzuverlässige oder unschlüssige Ergebnisse können folgende Ursachen haben:
Abweichungen von dem in dieser Packungsbeilage beschriebenen Verfahren
Übermäßig hohe IFN-γ-Konzentration in der Blutbahn oder Vorliegen von
heterophilen Antikörpern
Überschreitung der Frist von 16 Stunden zwischen Blutabnahme und Inkubation
bei 37 °C
24
Leistungsmerkmale
Klinische Studien
Da kein definitiver Standardtest für LTBI existiert, kann eine Abschätzung der Werte
für Empfindlichkeit und Spezifität des QFT-Plus-Tests nicht direkt vorgenommen
werden. Die Spezifität des QFT-Plus-Tests wurde annähernd abgeschätzt durch
Ermittlung der Falsch-positiv-Rate bei Personen mit geringem Risiko für eine
Tuberkuloseinfektion (keine Risikofaktoren bekannt). Die Empfindlichkeit wurde
annähernd abgeschätzt durch Auswertung von Patientengruppen mit durch Kultur
bestätigter aktiver Tuberkulose.
Spezifität
An einer Studie zur Bewertung der Spezifität des QFT-Plus-Tests nahmen 409 Probanden teil. Die demographischen Angaben und Tuberkulose-Risikofaktoren wurden
mit Hilfe eines standardisierten Fragebogens zum Zeitpunkt des Tests ermittelt.
Bei Zusammenfassung der Ergebnisse der 2 Patientengruppen mit geringem Risiko für
eine Tuberkuloseinfektion (keine Risikofaktoren bekannt) betrug die Spezifität des QFTPlus-Tests insgesamt 97,6 % (399/409) (Tabellen 3 und 4).
Tabelle 3. Ergebnisse der Studie zur Spezifität des QFT-Plus-Tests nach
Studienzentrum
Studie
Positiv
Negativ
Unschlüssig
Spezifität (95%-KI)
Japan
4
203
0
98 % (95–100)
Australien
6
196
0
97 % (94–99)
Tabelle 4. Ergebnisse der Studie zur Spezifität des QFT-Plus-Tests nach TB-AntigenRöhrchen
Positiv
Negativ
Unschlüssig
Spezifität
(95%-KI)
TB1
TB2
QFT-Plus
5
10
10
404
399
399
0
0
0
98,8 %
(97,2–99,6)
97,6 %
(95,6–98,8)
97,6 %
(95,6–98,8)
25
Empfindlichkeit für aktive Tuberkulose
Für LTBI existiert kein definitiver Standardtest; zur Ermittlung der Empfindlichkeit
ist aber eine mikrobiologische Kultur von M. tuberculosis ein geeigneter Ersatz,
da erkrankte Personen per Definition infiziert sind. Zur Ermittlung der
Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests wurden Personen mit Verdacht auf Tuberkulose,
deren M.-tuberculosis–Infektion anschließend durch Kultur bestätigt worden war,
aus 4 Prüfzentren in Australien und Japan getestet (Tabellen 5 und 6). Die
Patienten waren vor der Blutentnahme für den QFT-Plus-Test weniger als 14 Tage
lang behandelt worden.
Bei Zusammenfassung der Ergebnisse der 4 Patientengruppen von M.-tuberculosiskulturpositiven Patienten betrug die Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests insgesamt
95,3 % (164/172). In den 4 Gruppen waren 159 Patienten positiv aufgrund von
sowohl TB1- als auch TB2-Röhrchen, 1 Patient war nur positiv aufgrund von TB1
und 4 waren nur positiv aufgrund von TB2. Insgesamt war bei 1,1 % (2/174)
der Tests das Ergebnis unschlüssig. Durch das TB2-Ergebnis wurde 1 durch Kultur
bestätigter Patient korrekt identifiziert, der anhand des TB1-Ergebnisses allein als
unschlüssig (niedriger Mitogen-Wert) eingestuft worden wäre (siehe Tabellen 5
und 6).
Tabelle 5. Ergebnisse der Studie zur Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests
nach Studienzentrum
Positiv
Negativ
Unschlüssig
Empfindlichkeit* QFTPlus (95%-KI)
Zentrum Japan 1
36
7
0
84 % (69–93)
Zentrum Japan 2
53
1
2
98 % (90–100)
Zentrum Japan 3
54
0
0
100 % (93–100)
Zentrum Australien
21
0
0
100 % (84–100)
Studienzentren
* Die Empfindlichkeit wird auf Grundlage der Gesamtzahl an gültigen Tests, ohne unschlüssige Ergebnisse,
berechnet.
26
Tabelle 6. Ergebnisse der Studie zur Empfindlichkeit des QFT-Plus-Tests nach TBAntigen-Röhrchen
Positiv
Negativ
Unschlüssig
Empfindlichkeit†
(95%-KI)
†
TB1
TB2
QFT-Plus
160
163
164
11
9
8
3
2
2
93,6 %
(88,8–96,7)
94,8 %
(90,3–97,6)
95,3 %
(90,9–97,9)
Die Empfindlichkeit wird auf Grundlage der Gesamtzahl an gültigen Tests, ohne unschlüssige Ergebnisse,
berechnet.
Beobachtete Verteilung der Werte – stratifiziert nach Risiko
Die in klinischen Studien beobachteten Werte der IFN-γ-Reaktion in TB1-, TB2- und
Kontrollröhrchen wurden nach dem Risiko für eine M.-tuberculosis-Infektion stratifiziert
(Abbildungen 4–7). Die Zusammensetzung der Gruppe mit uneinheitlichem Risiko
entspricht der einer allgemeinen Testpopulation aus Probanden mit und ohne
Risikofaktoren für TB-Exposition, bei der eine aktive Tuberkulose unwahrscheinlich ist
(also ein positives Ergebnis in der Regel auf LTBI zurückzuführen ist).
27
A
Anzahl der Probanden
B
C
Abbildung 4. Verteilung für die Negativkontrolle. A. Verteilung der Werte der
Negativkontrolle in einer Population mit geringem Risiko (n = 409). B. Verteilung der
Werte der Negativkontrolle in einer Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 194).
C. Verteilung der Werte der Negativkontrolle in einer Population mit durch Kultur
bestätigter M.-tuberculosis-Infektion (n = 174).
28
A
B
C
Abbildung 5. Verteilung für TB1 und TB2 (minus Negativkontrolle). A. Verteilung
der TB1- und TB2-Werte (minus Negativkontrolle) in einer Population mit
geringem Risiko (n = 409). B. Verteilung der TB1- und TB2-Werte (minus
Negativkontrolle) in einer Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 194).
C. Verteilung der TB1- und TB2-Werte (minus Negativkontrolle) in einer
Population mit durch Kultur bestätigter M.-tuberculosis-Infektion (n = 174).
29
A
B
C
Abbildung 6. Verteilung für Mitogen (minus Negativkontrolle). A. Verteilung der
Mitogenwerte (minus Negativkontrolle) in einer Population mit geringem Risiko
(n = 409). B. Verteilung der Mitogenwerte (minus Negativkontrolle) in einer
Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 194). C. Verteilung der Mitogenwerte (minus Negativkontrolle) in einer Population mit durch Kultur bestätigter
M.-tuberculosis-Infektion (n = 169).
30
Geringes Risiko Uneinheitliches Risiko
Risiko einer MTB-Infektion
Aktive TB
Abbildung 7. Beobachtete Differenzen der TB1- und TB2-Werte (minus
Negativkontrolle), stratifiziert nach Risiko. Population mit geringem Risiko
(n = 409), Population mit uneinheitlichem Risiko (n = 189) und Population mit
durch Kultur bestätigter M.-tuberculosis-Infektion (n = 141). Die TB1-Werte
wurden von den TB2-Werten abgezogen. Probanden mit Werten für TB1 oder
TB2 > 10,0 IU/ml wurden von der Auswertung ausgeschlossen, da die Werte
außerhalb des linearen Bereichs des Tests liegen.
Leistungsmerkmale des Tests
Die Linearität des QFT-Plus-ELISA wurde gezeigt in einem Experiment, in dem
11 Plasmapools mit bekannten IFN-γ-Konzentrationen jeweils als Fünffachbestimmungen in zufälliger Anordnung auf der ELISA-Platte verteilt wurden.
Die Regressionsgerade hat eine Steigung von 1,002 ± 0,011 und einen
Korrelationskoeffizienten von 0,99 (Abbildung 8).
Die Nachweisgrenze des QFT-Plus-ELISA liegt bei 0,05 IU/ml und es gibt keine
Anzeichen für einen High-Dose-Hook-Effekt (Prozonenphänomen) bei IFN-γKonzentrationen bis zu 10.000 IU/ml.
31
Bestimmter IFN-γ-Wert (IU/ml)
Erwarteter IFN-γ-Wert (IU/ml)
Abbildung 8. Linearitätsprofil des QFT-Plus-ELISA.
Die Intra- und Inter-Assay-Unpräzision (% CV) des QFT-Plus-ELISA wurden
bestimmt durch Untersuchung von 20 Plasmaproben mit verschiedenen IFN-γKonzentrationen als Dreifachbestimmungen, in 3 Laboren, an 3 nicht
aufeinander folgenden Tagen und durch 3 verschiedene Mitarbeiter. Jede
Probe wurde also 27-mal getestet, in 9 unabhängigen Testdurchläufen. Eine
Probe war die Negativkontrolle, ihre IFN-γ-Konzentration wurde mit 0,08 (95%KI 0,07–0,09) IU/ml bestimmt. Die übrigen 19 Plasmaproben umspannten
einen Konzentrationsbereich von 0,33 (95%-KI 0,31–0,34) bis 7,7 IU/ml
(95%-KI 7,48–7,92).
Die Unpräzision innerhalb eines Testdurchlaufs („Intra-Assay“) wurde
abgeschätzt durch Bildung des Mittelwerts der prozentualen Variationskoeffizienten (%CV) jeder IFN-γ enthaltenden Plasmaprobe für die einzelnen
Testplatten (n = 9). Die Unpräzision lag zwischen 4,1 und 9,1 %CV. Im Mittel
betrug die Kovarianz (± 95%-KI) innerhalb eines Testdurchlaufs 6,6 % ± 0,6 %.
Für die Plasmaprobe ohne IFN-γ betrug der prozentuale Variationskoeffizient im
Mittel 14,1 %.
Die Gesamtunpräzision („Inter-Assay“) wurde bestimmt durch Vergleich der 27
berechneten IFN-γ-Konzentrationswerte jeder Plasmaprobe. Die Inter-AssayUnpräzision lag zwischen 6,6 und 12,3 %CV. Im Mittel betrug der prozentuale
Variationskoeffizient (%CV ± 95%-KI) insgesamt 8,7 % ± 0,7 %. Für die
Plasmaprobe ohne IFN-γ betrug der Wert 26,1 % (%CV). Diese Größenordnung ist zu erwarten, da die berechnete IFN-γ-Konzentration sehr niedrig ist
und die Variation um einen niedrigen Konzentrationswert stärker ist als bei
höheren Konzentrationen.
Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit des QFT-Plus-Tests wurden Blutproben
von 102 Probanden mit uneinheitlichen Risikofaktoren für eine M.-tuberculosis-
32
Infektion untersucht. Dabei wurden drei verschiedene Labormitarbeiter und
Laborbedingungen geprüft.
Für jeden Probanden wurden insgesamt 3 diagnostische Bestimmungen durchgeführt, insgesamt 306 für alle Probanden. Insgesamt betrug die diagnostische
Reproduzierbarkeit 99 % (95%-KI 97,2–99,7) mit übereinstimmenden
Ergebnissen bei 303 der 306 Bestimmungen. Für die Abweichungen waren
allein die Ergebnisse von 3 Probanden, die nahe am Grenzwert lagen,
verantwortlich.
Diagnosestellung einer LTBI
Es wurde eine Reihe von Studien veröffentlicht, die die Leistung des QFT-Tests –
des Vorläufers des QFT-Plus-Tests – bei verschiedenen Populationen mit dem
Risiko einer MTB-Infektion belegen. Die wichtigsten Daten einiger ausgewählter
Studien sind in Tabelle 7 dargestellt.
33
Tabelle 7. Ausgewählte veröffentlichte Studien zum Einsatz des QFT-Tests.
Population/
Medizinischer
Zustand
Kinder
Ergebnisse
Nachweis der Leistung bei Kindern, einschließlich
Kindern unter 5 Jahren (45–46), mit höherer Genauigkeit
als der ELISpot-basierte IGRA (8). Die bislang größte
Studie verglich QFT und THT bei Kindern aus Vietnam,
den Philippinen und Mexiko und unterstützt die
Bevorzugung des QFT gegenüber dem THT bei der LTBITestung von im Ausland geborenen Kindern (46). Eine
eingeschränkt durchgeführte Umgebungsuntersuchung
zeigte für Kinder einen besseren Vorhersagewert als der
THT (47) und ein 8-fach höheres Risiko für eine
Progression zur TB-Erkrankung für Probanden mit QFTKonversion verglichen mit Probanden ohne Konversion
(48). Bei BCG-geimpften Kindern treten häufig QFTnegative Ergebnisse bei THT-positiven Ergebnissen auf
(46, 49), es gab aber keinen Einfluss auf die MitogenReaktion bei Kindern unter 5 Jahren (49) und beim
Routine-Screening von Einwandererkindern gab es nur
eine geringe Häufigkeit von unschlüssigen Ergebnissen
(46).
Schwangerschaft In einer Situation mit geringer TB-Belastung ist die
Leistung des QFT-Tests in jedem Schwangerschaftsdrittel
gleich gut, mit vergleichbaren Ergebnissen zu nicht
Schwangeren, ist verglichen mit dem THT spezifischer,
mindestens so empfindlich und eventuell ein besserer
Prädiktor für das Fortschreiten der Erkrankung (50). In
einer Situation mit hoher TB-Belastung war der QFT-Test
verglichen mit dem THT während der Schwangerschaft
stabiler und erbrachte Ergebnisse, die eher der
Hintergrund-LTBI-Prävalenz entsprachen. Die Autoren
zogen allerdings den Schluss, dass sowohl QFT-Test als
auch THT in der Schwangerschaft beeinträchtigt sind (51).
HIV/AIDS
34
Bei HIV-Infektion sind sowohl IGRAs als auch THT
beeinträchtigt. Die Datenlage weist darauf hin, dass bei
der Interpretation von Ergebnissen von Patienten mit einer
CD4+-Zellzahl von < 200 Vorsicht geboten ist (52). Der
QFT-Test zeigte weniger Beeinflussung als der ELISpotbasierte IGRA und der THT (53–55). Da bei IGRAs nur
ein Arztbesuch notwendig ist, wird das Problem des THT
mit oft nicht zum zweiten Termin erscheinenden Patienten
in dieser Population gelöst (53).
Gesamtzahl
veröffentlichter
Studien
152
6
101
Population/
Medizinischer
Zustand
Ergebnisse
Gesamtzahl
veröffentlichter
Studien
Immunsuppressive Der QFT-Test wird von immunsuppressiven Behandlungen
Behandlungen
weniger stark beeinträchtigt als der THT und die
Ergebnisse korrelieren besser mit TB-Risikofaktoren (23,
27). Der QFT-Test zeigt bei Patienten mit rheumatischen
Erkrankungen eine hohe Empfindlichkeit (23, 56, 57) und
eine höhere Spezifität als der THT, was die Anzahl
falsch-positiver Ergebnisse und unnötiger Behandlungen,
die bei Anwendung des THT durchgeführt würden,
verringert (23, 57, 58).
112
Medizinisches
Personal
Nachgewiesenermaßen spezifischer mit weniger falschpositiven Ergebnissen als der THT sowie wirtschaftlicher
als der THT (59–62). Variabilität im Bereich des
Schwellenwerts ist bei Reihenuntersuchungen aufgrund
des einfachen Grenzwerts und der bei biologischen Tests
natürlichen Variabilität zu erwarten (63). In Studien mit
Reihenuntersuchungen von medizinischem Personal mit
geringem Risiko wurden im Vergleich zum THT höhere
Konversions-/Reversionsraten gefunden (64, 65). Die USCDC merken an, dass das sanftere Kriterium zur
Definition einer IGRA-Konversion zu mehr Konversionen
führen könnte, als sie mit den strengeren quantitativen
Kriterien des THT beobachtet werden; erneute Testungen
sind eine effektive Strategie zur Handhabung des
Konversions-/Reversions-Phänomens (65–68).
111
Umgebungsuntersuchungen
Höhere PPV- und NPV-Werte als beim THT (47); nur ein
Besuch besonders bei unwahrscheinlicher Rückkehr
günstig (63); bessere Korrelation mit Exposition (69),
besonders deutlich bei BCG-geimpften Personen und
Populationen aus Ländern mit BCG-Impfung (70, 71).
89
Transplantation
Mindestens so effektiv wie der THT, aber weniger
beeinträchtigt bei terminaler Organinsuffizienz (22).
23
35
Population/
Medizinischer
Zustand
Diabetes
Ergebnisse
Widersprüchliche Ergebnisse aus nur wenigen
Veröffentlichungen mit begrenzter Probandenzahl. Eine
Studie aus einem wenig belasteten Gebiet ergab, dass
die Empfindlichkeit des QFT-Tests bei TB-Patienten nicht
durch Diabetes beeinträchtigt wird (72). In einer Studie
aus Tansania, einem Gebiet mit hoher Belastung, die
einen negativen Einfluss von Diabetes auf die IFN-γProduktion nahelegte, wurden Störgrößen wie HIV und
Wurminfektionen nicht berücksichtigt (73). In einer
vietnamesischen Studie mit 838 laut Selbstauskunft an
Diabetes erkrankten Patienten mit TB-Verdacht aufgrund
eines pathologischen Röntgen-Thorax oder durch Kultur
bestätigter aktiver TB (n = 128) war der Anteil QFTpositiver Ergebnisse größer oder gleich dem Anteil
positiver THT-Ergebnisse mit den Grenzwerten 10 und
15 mm (74).
Gesamtzahl
veröffentlichter
Studien
9
Terminale
QFT-positive Ergebnisse korrelieren besser mit
Niereninsuffizienz Tuberkulose-Risikofaktoren und sind weniger assoziiert
mit BCG als THT-Ergebnisse (75).
45
Migranten
29
36
Studien zeigen, dass der QFT-Test im Gegensatz zum
THT nicht von BCG oder vom Alter beeinflusst wird (74).
Es wurde gezeigt, dass der QFT-Test das wirtschaftlichste
Verfahren ist (76). In Szenarien mit geringer Belastung
betrifft der größte Teil der TB-Erkrankungen im Ausland
geborene Personen und erfolgt durch Reaktivierung einer
latenten TB nach der Einreise (77). Die bislang größte
Studie zum Vergleich von QFT und THT bei Einwandererkindern unterstützt die Bevorzugung des QFT gegenüber
dem THT bei der Testung von im Ausland geborenen
Kindern auf latente TB (46).
Technische Informationen
Unschlüssige Ergebnisse
Unschlüssige Ergebnisse treten nur selten auf. Sie können mit dem Immunstatus
des untersuchten Patienten zusammenhängen, sie können aber auch durch
verschiedene technische Faktoren bedingt sein, wenn die vorstehenden
Anweisungen nicht befolgt werden.
Falls technische Probleme bei der Lagerung der Reagenzien, der Blutabnahme
oder der Handhabung der Blutproben vermutet werden, sollte der gesamte QFTPlus-Test mit neuen Blutproben wiederholt werden. Falls unzureichendes
Waschen oder andere Verfahrensabweichungen bei der Durchführung des
ELISA-Tests vermutet werden, kann der ELISA-Test mit den stimulierten
Plasmaproben wiederholt werden. Bei unschlüssigen Ergebnissen aufgrund
niedriger Mitogen-Werte oder hoher Negativkontrolle-Werte wird auch bei
einer Wiederholung kein anderes Ergebnis erwartet, sofern beim ELISA-Test
kein Fehler gemacht wurde. Unschlüssige Ergebnisse sollten als solche weitergegeben werden. Der Arzt kann dann gegebenenfalls eine neue Blutprobe
entnehmen oder je nach Bedarf sonstige Untersuchungen in Betracht ziehen.
Geronnene Plasmaproben
Falls bei längerer Lagerung der Plasmaproben Fibringerinnsel auftreten, sind
die Proben bis zur Sedimentbildung zu zentrifugieren, um ein Pipettieren des
Plasmas zu ermöglichen.
37
Hilfe zur Fehlerbehebung
In diesem Abschnitt finden Sie nützliche Hinweise, die Ihnen bei der Lösung
eventuell auftretender Probleme helfen können. Weitere Informationen finden
Sie auch im Internet unter www.QuantiFERON.com. Kontaktmöglichkeiten
finden Sie auf der hinteren Umschlagseite.
Problembehebung beim ELISA
Unspezifische Farbentwicklung
Mögliche Ursache
Lösung
a) Platte unzureichend gewaschen
Waschen Sie die Platte mindestens 6-mal mit
400 µl Waschpuffer pro Well. Je nach
verwendetem Waschgerät können mehr als 6
Waschzyklen erforderlich sein. Der Waschpuffer
sollte bei jedem Zyklus mindestens 5 Sekunden
einwirken können.
b) Kreuzkontamination der ELISAWells
Sorgfältiges Pipettieren und Mischen der Proben
minimiert dieses Risiko.
c) Kit/Komponenten abgelaufen
Vergewissern Sie sich, dass der Kit vor Ablauf des
Verfallsdatums eingesetzt wird. Achten Sie darauf,
dass Standard und 100x Konjugatkonzentrat nur
innerhalb von drei Monaten nach ihrer
Rekonstitution verwendet werden.
d) Enzymsubstratlösung ist
verunreinigt
Verwerfen Sie die Substratlösung, wenn sie blau
gefärbt ist. Stellen Sie sicher, dass die
verwendeten Reagenzienbehälter sauber sind.
e) Mischen des Plasmas in den QFTPlus-Röhrchen vor Abnahme des
Plasmas
Vermeiden Sie nach der Zentrifugation jegliches
Auf- und Abpipettieren oder Mischen vor Abnahme
des Plasmas. Achten Sie stets darauf, dass das
Material an der Oberfläche des Gels nicht
aufgewirbelt wird.
Niedrige OD-Werte bei den Standards
Mögliche Ursache
Lösung
a) Fehler beim Verdünnen der
Standardlösung
Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen des
Kitstandards wie in dieser Packungsbeilage
angegeben hergestellt werden.
b) Pipettierfehler
Stellen Sie sicher, dass die Pipetten gemäß den
Herstellerempfehlungen kalibriert und verwendet
werden.
38
c) Inkubationstemperatur zu niedrig
Die Inkubation des ELISA sollte bei
Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C) durchgeführt
werden.
d) Inkubationszeit zu kurz
Die Inkubation der Platte mit Konjugat, Standards
und Proben sollte für 120 ± 5 Minuten erfolgen.
Die Enzymsubstratlösung wird für 30 Minuten auf
der Platte inkubiert.
e) Falscher Filter im Plattenphotometer
verwendet
Die Platte sollte bei 450 nm gemessen werden, mit
einem Referenzfilter zwischen 620 und 650 nm.
f)
Alle Reagenzien, mit Ausnahme des 100x
Konjugatkonzentrats, müssen vor Durchführung des
Tests auf Raumtemperatur gebracht werden. Dies
dauert etwa eine Stunde.
Reagenzien sind zu kalt
g) Kit/Komponenten abgelaufen
innerhalb von 3 Monaten nach ihrer Rekonstitution
verwendet werden.
Hohe Hintergrundwerte
Mögliche Ursache
Lösung
verwendetem Waschgerät können mehr als 6
Waschzyklen erforderlich sein. Der Waschpuffer
einwirken können.
b) Inkubationstemperatur zu hoch
Die Inkubation des ELISA sollte bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C) durchgeführt werden.
c) Kit/Komponenten abgelaufen
innerhalb von 3 Monaten nach ihrer Rekonstitution
verwendet werden.
d) Enzymsubstratlösung ist
verunreinigt
Verwerfen Sie die Substratlösung, wenn sie blau
gefärbt ist. Stellen Sie sicher, dass die
verwendeten Reagenzienbehälter sauber sind.
39
Standardkurve nicht linear, Variabilität
der Mehrfachbestimmung
Mögliche Ursache
Lösung
verwendetem Waschgerät können mehr als
6 Waschzyklen erforderlich sein. Der Waschpuffer
einwirken können.
b) Fehler beim Verdünnen der
Standardlösung
Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen
des Standards wie in dieser Packungsbeilage
angegeben hergestellt werden.
c) Unzureichendes Mischen
Mischen Sie die Reagenzien sorgfältig durch
mehrmaliges Über-Kopf-Schwenken oder leichtes
Mischen auf einem Vortex-Mischer, bevor Sie sie
in die Platte geben.
d) Ungleichmäßige Pipettiertechnik
oder Unterbrechung beim Ansetzen
des Tests
Das Dispensieren der Proben und der Standards
sollte kontinuierlich erfolgen. Alle Reagenzien
sollten vor Testbeginn gebrauchsfertig zubereitet
werden.
Produktinformationen und technische Anleitungen erhalten Sie kostenlos
von QIAGEN, von Ihrem Händler oder im Internet unter
www.QuantiFERON.com.
Literatur
Eine umfassende Literaturliste zu QFT-Plus und QFT finden Sie in Gnowee, der
QFT-Referenzbibliothek unter www.gnowee.net.
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46
Symbole
2 x 96
Ausreichend für die Bearbeitung von 2 x 96 Proben
Hersteller
CE-IVD-Kennzeichnung
IVD
LOT
Chargennummer
REF
Katalognummer
GTIN
Global Trade Item Number (Globale Artikelnummer)
Zur Verwendung bis
Zulässiger Temperaturbereich für die Lagerung
Die Gebrauchsanweisung beachten
Nicht wiederverwenden
Von direkter Sonneneinstrahlung fernhalten
Kontaktinformationen
Technische Hinweise und zusätzliche nützliche Informationen erhalten Sie unter
der gebührenfreien Rufnummer 00800-22-44-6000 und in unserem Technischen
Support Center unter www.qiagen.com/contact. Darüber hinaus ist Ihnen das
Team vom Technischen Service gerne behilflich, falls Sie Rat oder weitere
Informationen zu QIAGEN-Produkten benötigen (Kontaktinformationen siehe
hintere Umschlagseite oder unter www.qiagen.com).
47
Kurzanleitung
Teil 1 – Inkubation der Blutproben
1. Blut des Patienten in Blutentnahmeröhrchen abnehmen und
die Röhrchen dann zehnmal (10x) gerade so stark schütteln,
dass die gesamte Innenwand des Röhrchens mit Blut bedeckt
ist. Dies löst die Antigene an der Röhrchenwand.
2. Röhrchen stehend 16 bis 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C
inkubieren.
3. Nach der Inkubation die Röhrchen für 15 Minuten bei 2000
bis 3000 x g (RZB) zentrifugieren, um das Plasma von den
roten Blutkörperchen zu trennen.
4. Nach der Zentrifugation jegliches Auf- und Abpipettieren
oder Mischen vor Abnahme des Plasmas vermeiden. Stets
darauf achten, dass das Material an der Oberfläche des
Gels nicht aufgewirbelt wird.
Teil 2 – IFN-γ-ELISA
1. Alle Komponenten des ELISA, mit Ausnahme des 100x
Konjugatkonzentrats, mindestens 60 Minuten lang auf
Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C) äquilibrieren lassen.
2. Den Kitstandard mit destilliertem oder deionisiertem
Wasser auf 8,0 IU/ml rekonstituieren. Vier (4)
Standardverdünnungen herstellen.
3. Das gefriergetrocknete 100x Konjugatkonzentrat mit
entionisiertem oder destilliertem Wasser rekonstituieren.
4. Gebrauchsfertig verdünntes Konjugat mit Hilfe von grüner
Verdünnungslösung herstellen und 50 µl in jedes Well
geben.
5. 50 µl der zu testenden Plasmaproben bzw. der Standards
in die entsprechenden Wells geben. Auf Schüttler mischen.
48
6. 120 ± 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Die Wells mindestens 6-mal mit 400 µl Waschpuffer
pro Well waschen.
8. Je 100 µl Enzymsubstratlösung in die Wells geben.
Auf Schüttler mischen.
9. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10. 50 µl Enzymstopplösung in jedes Well geben.
Auf Schüttler mischen.
11. Ergebnisse bei 450 nm mit Referenzfilter zwischen
620 und 650 nm erfassen.
12. Ergebnisse auswerten.
49
Frei bleibende Seite
50
Warenzeichen/Markennamen: QIAGEN®, QFT®, QuantiFERON® (QIAGEN-Gruppe); Microsoft®, Excel® (Microsoft); ProClin® (Rohm and Haas Co.).
Eingeschränkte Nutzungsvereinbarung für den QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA
Mit der Nutzung dieses Produkts erkennen Käufer und Anwender des Produkts die folgenden Bedingungen an:
1.
Das Produkt darf nur gemäß den mit dem Produkt zur Verfügung gestellten Protokollen und dieser Packungsbeilage und mit den Komponenten,
die im Kit geliefert werden, verwendet werden. QIAGEN gewährt im Rahmen seiner Eigentumsrechte keinerlei Lizenz, die zum Kit gehörenden
Komponenten mit anderen Komponenten, die nicht zum Kit gehören, zu verwenden oder zu kombinieren, mit Ausnahme der in mit dem Produkt
zur Verfügung gestellten Protokollen und in dieser Packungsbeilage beschriebenen Anwendungen.
2.
Über die ausdrücklich erwähnten Lizenzanwendungen hinaus übernimmt QIAGEN keinerlei Garantie dafür, dass dieser Kit und/oder die mit
ihm durchgeführte(n) Anwendung(en) die Rechte Dritter nicht verletzen.
3.
Dieser Kit und seine Komponenten sind für die einmalige Verwendung lizenziert und dürfen, sofern von QIAGEN nicht anders angegeben,
nicht wiederverwendet, wiederaufgearbeitet oder weiterverkauft werden.
4.
QIAGEN lehnt außer der ausdrücklich gewährten Lizenzgewährung jede weitere Lizenzgewährung ab, sowohl ausdrücklich als auch konkludent.
5.
Käufer und Anwender des Kits stimmen zu, keinerlei Schritte zu unternehmen oder anderen die Einleitung von Schritten zu gestatten, die zu
unerlaubten Handlungen im obigen Sinne führen könnten oder solche erleichtern könnten. QIAGEN kann die Verbote dieser eingeschränkten
Nutzungsvereinbarung an jedem Ort gerichtlich geltend machen und wird sämtliche Ermittlungs- und Gerichtskosten, inklusive Anwaltsgebühren,
zurückfordern, die ihm bei der Geltendmachung dieser eingeschränkten Nutzungsvereinbarung oder irgendeines seiner geistigen Eigentumsrechte
im Zusammenhang mit dem Kit und/oder dessen Komponenten entstehen.
Aktualisierte Nutzungs- und Lizenzbedingungen können im Internet unter www.qiagen.com nachgelesen werden.
© 2014–2015 QIAGEN, alle Rechte vorbehalten.
www.QuantiFERON.com
Asia Pacific | [email protected]
Europe | [email protected]
Middle East/Africa | [email protected]
Latin America (not including Brazil or Mexico) | [email protected]
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www.QuantiFERON.com QuantiFERON® -TB Gold Plus (QFT®

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