Free Testosterone

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Free Testosterone

Free Testosterone
®
Coat-A-Count Free Testosterone
English
Intended Use: Coat-A-Count Free
125
Testosterone is a solid-phase I
radioimmunoassay designed for the
quantitative measurement of free
testosterone in serum. It is intended
strictly for in vitro diagnostic use as an aid
in the clinical diagnosis and management
of hirsutism due to hyperandrogenism.
Catalog numbers: TKTF1 (100 tubes),
TKTF2 (200 tubes)
The 100-tube kit contains less
than 4 microcuries
(148 kilobecquerels) of
125
radioactive I-labeled testosterone
analog; the 200-tube kit contains less than
8 microcuries (296 kilobecquerels).
Summary and Explanation of
the Test
Testosterone circulates almost entirely
bound to transport proteins: normally less
than one percent is free. The principal
transport protein for testosterone is known
as sex hormone binding globulin (SHBG)
or testosterone-estradiol binding globulin
(TeBG), since it binds not only to
testosterone but also to estradiol (and
dihydrotestosterone). Albumin and cortisol
binding globulin (CBG) are the other
testosterone transport proteins.
For three reasons, SHBG is the most
important of these transport proteins. It
carries, at least in females, a higher
percentage of the testosterone in
circulation than either albumin or CBG.
Furthermore, it binds to testosterone with
a much higher affinity than do the other
two transport proteins. (The testosterone
bound to albumin and CBG is collectively
known as "weakly bound" testosterone.)
Finally, SHBG has a responsiveness, not
associated with albumin, insofar as the
SHBG level is sensitive to changes in the
ratio of circulating estrogens to circulating
androgens. SHBG thus plays a greater
role in determining the level of free
testosterone in circulation.
In pregnancy, SHBG levels show a
progressive increase that mirrors the rise
2
in estradiol levels. Although the total
testosterone level also shows some
increase during pregnancy, the rise in
estradiol, and hence also in SHBG, is
more dramatic. The net result is a
decrease in free testosterone as a percent
of total testosterone. Women taking oral
contraceptives likewise have increased
SHBG levels, at least if they are taking
high dose ethinyl estradiol preparations.
Conversely, the administration of
androgens to prepubertal boys, or the
elevation of endogenous testosterone by
HCG stimulation, induces a significant
decrease in the SHBG level. Obesity is
also associated with a decrease in the
SHBG level.
Other things being equal, we expect the
concentration of free testosterone in
circulation to increase if the testosterone
level (T) increases or if the SHBG level
decreases. The T/SHBG ratio, i.e. the ratio
of total testosterone to (the concentration
or binding capacity of) SHBG, thus serves
as a rough guide to the concentration of
free testosterone in circulation. The
T/SHBG ratio is sometimes referred to as
the Testosterone Free Index (TFI).
The Testosterone Free Index is often
increased in severe acne, male
androgenic alopecia (balding), hirsutism
and other conditions. A low SHBG level,
often in combination with a normal total
testosterone level, is a common finding in
these conditions. An increase in the
testosterone production rate typically
induces a decrease in the SHBG level.
This stimulates cellular uptake and
metabolism of testosterone, by making
more available in the free form. The result
is that the total testosterone level is often
normal, because the increased production
rate is offset by an increased rate of
clearance.
Total testosterone measurements have
traditionally been used to help screen for
hirsutism. In view of the mechanism just
described, it is natural to expect free
testosterone levels, measured directly or
indexed by the T/SHBG ratio, to correlate
better with hirsutism. Some investigators,
notably Paulson, have found free
testosterone to be overwhelmingly
superior to total testosterone in screening
Coat-A-Count Free Testosterone (PITKTF-11, 2010-10-21)
for hirsutism. In his study of 32 hirsute
women, only 44 percent had elevated total
testosterone levels, while all 32 had
elevated free testosterone levels. Not all
investigators have achieved this degree of
success. On balance, however, judging
from the studies reviewed by Wu, it
appears that free testosterone is at least
marginally superior to total testosterone in
this context. (The varied outcomes could
possibly be due to differences in
methodology and differences in the
selection of patients.)
Total counts at iodination:
approximately 60,000 cpm
Principle of the Procedure
Some components supplied in this kit may
contain human source material and/or
other potentially hazardous ingredients
which necessitate certain precautions.
In Coat-A-Count Free Testosterone
125
procedure, I-labeled testosterone
analog competes for a fixed time with free
testosterone in the patient sample for sites
on testosterone-specific antibody
immobilized to the wall of a polypropylene
tube. The tube is then decanted, to isolate
the antibody-bound fraction, and counted
in a gamma counter, the counts being
inversely related to the concentration of
free testosterone in the sample.
The assay is designed to leave essentially
unchanged the original equilibrium
between free and protein-bound
testosterone in the patient sample. It
employs a tracer which does not bind to
steroid hormone transport proteins, and an
antiserum with an affinity for testosterone
slightly less than that of the principal
transport protein, sex hormone-binding
globulin (SHBG). Moreover, it operates
under physiological conditions of
temperature, pH and ionic strength.
The Coat-A-Count Free Testosterone
procedure is a direct or single-tube assay:
its results are not calculated as a function
of total testosterone and SHBG or some
other parameter, but interpolated from a
standard curve calibrated in free
testosterone concentrations. In this
respect it differs from conventional
equilibrium dialysis methods and from
so-called testosterone free index (TFI)
determinations. It is also a single-stage
assay, requiring neither a pre-incubation
step nor preliminary isolation of the free
fraction by dialysis, filtration or column
chromatography. In addition, it has the
following noteworthy features:
Total Incubation Time: 4 hours.
Reagents to Pipet: 1
Warnings and Precautions
For in vitro diagnostic use.
Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator
designated for incoming radioactive
materials. Dispose of in accordance with
applicable laws.
Do not use reagents beyond their
expiration dates.
Follow universal precautions, and handle
all components as if capable of
transmitting infectious agents. Source
materials derived from human blood were
tested and found nonreactive for syphilis;
for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis
B surface antigen; and for antibodies to
hepatitis C.
Sodium azide, at concentrations less than
0.1 g/dL, has been added as a
preservative. On disposal, flush with large
volumes of water to prevent the buildup of
potentially explosive metal azides in lead
and copper plumbing.
Water: Use distilled or deionized water.
Radioactivity
A copy of any radioisotope license
certificate (Specific or General) issued to a
US customer must be on file with Siemens
Healthcare Diagnostics before kits or
components containing radioactive
material can be shipped. These
radioactive materials may be acquired by
any customer with the appropriate Specific
license. Under a General license these
radioactive materials may be acquired
only by physicians, veterinarians in the
practice of veterinary medicine, clinical
laboratories and hospitals—and strictly for
in vitro clinical or laboratory tests not
involving external or internal
administration of the radioactive material
or its radiation to human beings or other
animals. Its acquisition, receipt, storage,
use, transfer and disposal are all subject
to the regulations and a (General or
Specific) license of the U.S. Nuclear
Regulatory Commission or a State with
3
which the NRC has entered into an
agreement for the exercise of regulatory
control.
Handle radioactive materials according to
the requirements of your General or
Specific license. To minimize exposure to
radiation, the user should adhere to
guidelines set forth in the National Bureau
of Standards publication on the Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
and in subsequent publications issued by
State and Federal authorities.
Wipe up spills promptly and
decontaminate affected surfaces. Avoid
generation of aerosols. Dispose of solid
radioactive waste according to license
requirements. General licensees (holders
of NRC Form 483) may dispose of solid
radioactive waste as nonradioactive
waste, after removing labeling. Specific
licensees (NRC Form 313) should refer to
Title 10, Code of Federal Regulations,
Part 20. Licensees in Agreement States
should refer to the appropriate regulations
of their own state. General licensees may
dispose of liquid radioactive waste of the
type contained in this product through a
laboratory sink drain. Licensees must
remove or deface labels from empty
containers of radioactive materials before
disposal of solid waste. Specific licensees
may dispose of small quantities of liquid
radioactive waste of the type used in this
product through a laboratory sink drain.
Refer to the appropriate regulations
applicable to your laboratory.
Materials Supplied:
Initial Preparation
The materials supplied in this kit are not
interchangeable with those in the Coat-ACount Total Testosterone kit, which is
designed for measuring total testosterone.
Free Testosterone Ab-Coated Tubes
(TTF1)
Polypropylene tubes coated with rabbit
antibodies to free testosterone and
packaged in zip-lock bags. Store
refrigerated and protected from moisture,
carefully resealing the bags after opening.
Stable at 2–8°C until the expiration date
marked on the bag. Color: robin's-egg
blue.
TKTF1: 100 tubes. TKTF2: 200 tubes.
4
125
I Free Testosterone (TTF2)
105 mL of iodinated testosterone analog
with sodium azide as a preservative.
Stable at 2–8°C for 30 days after opening,
or until the expiration date marked on the
vial.
TKTF1: 1 vial. TKTF2: 2 vials.
Free Testosterone Calibrators (TFC3–8)
Six vials of free testosterone calibrators,
ready-to-use, in processed human serum
with preservatives (sodium azide and
gentamicin). The zero calibrator vial A
contains 2.0 mL, while the remaining
calibrator vials B through F contain 1.0 mL
each. Stable at 2–8°C for 30 days after
opening.
TKTF1: 1 set. TKTF2: 1 set.
The calibrators have lot-specific free
testosterone values of approximately 0,
0.55, 2.5, 9.0, 25 and 50 picograms per
milliliter (pg/mL); equivalently:
approximately 0, 1.9, 8.7, 31, 87 and
173 picomoles per liter (pmol/L). Refer to
the vial labels for exact values in pg/mL.
Materials Required But Not
Provided
Gamma counter—compatible with
standard 12x75 mm tubes
Vortex mixer
Plain 12x75 mm polypropylene tubes—for
use as T and NSB tubes, available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: PPO)
Micropipets: 50 µL and 1.0 mL
Incubation bath capable of maintaining
37°C
Foam decanting rack—available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: FDR)
Logit-log graph paper
A tri-level, human serum-based
immunoassay control, containing
testosterone as one of over 25 assayed
constituents, is available from Siemens
Healthcare Diagnostics (catalog number:
CON6).
Specimen Collection
The patient need not be fasting, and no
special preparations are necessary.
29
Collect blood by venipuncture into plain
tubes (without anticoagulant), and
separate the serum from the cells.
Because EDTA would have a significant
effect on results, it should not be used as
an anticoagulant.
Grossly lipemic serum samples may yield
erroneously high free testosterone results.
The use of an ultracentrifuge is
recommended to clear lipemic samples.
necessary, to avoid repeated thawing and
freezing. Do not attempt to thaw frozen
specimens by heating them in a
waterbath.
Radioimmunoassay Procedure
All components must be at room
temperature (15–28°C) before use.
1
Hemolyzed samples may indicate
mistreatment of a specimen before receipt
by the laboratory; hence the results should
be interpreted with caution.
Blood collection tubes from different
manufacturers may yield differing values,
depending on materials and additives,
including gel or physical barriers, clot
activators and/or anticoagulants. Coat-ACount Free Testosterone has not been
tested with all possible variations of tube
types. Consult the section on Alternate
Sample Types for details on tubes that
have been tested.
Danazol Therapy: Danazol, a derivative
of the synthetic steroid ethisterone, is
used in the treatment of endometeriosis
and fibrocystic breast disease. The
androgenic side-effects have been
attributed to the increased availability of
free testosterone in patients undergoing
Danazol therapy. Thus, patients taking
Danazol will present with increased
concentrations of free testosterone.
In vitro studies with the Coat-A-Count Free
Testosterone assay also show an increase
in apparent free testosterone
concentration in samples spiked with
31
Danazol. The maximum Danazol plasma
concentrations after a 100 mg oral dose is
reported to be up to 199 ng/mL, yielding
an appreciable change in concentrations
of free testosterone despite the low cross32
reactivity reported. See the “Specificity”
section for the percent crossreactivity.
Therefore, caution must be exercised
when interpreting free testosterone levels
in patients who are undergoing Danazol
therapy.
Volume Required: 50 µL per tube.
Storage: 2 days at 2–8°C or 2 months
(aliquotted) at –20°C.
Before assay, allow the samples to come
to room temperature (15–28°C) and mix
by gentle swirling or inversion. Aliquot, if
Plain Tubes: Label four plain
(uncoated) 12x75 mm polypropylene
tubes T (total counts) and NSB
(nonspecific binding) in duplicate.
Because nonspecific binding in the
Coat-A-Count procedure is
characteristically low, the NSB tubes
may be safely omitted without
compromising accuracy or quality
control.
Coated Tubes: Label twelve Free
Testosterone Ab-Coated Tubes A
(maximum binding) and B through F in
duplicate. Label additional antibodycoated tubes, also in duplicate, for
controls and patient samples.
Calibrator
Approximate
pg/mL
Approximate
pmol/L
A (MB)
0
0
B
0.55
1.9
C
2.5
8.7
D
9.0
31
E
25
87
F
50
173
Note: The values of the calibrators are
lot-specific. Refer to the calibrator vial labels for
values in pg/mL.
2
Pipet 50 µL of the zero calibrator A
into the NSB and A tubes, and 50 µL
of each remaining calibrator, control
and patient sample into the tubes
prepared. Pipet directly to the
bottom.
Do not attempt to dilute patient
samples expected to contain high
concentrations in the zero calibrator.
(Since dilution shifts the equilibrium
between free and bound testosterone,
the assay system cannot be expected
to maintain linearity under dilution.)
It is good practice to use a disposabletip micropipet, changing the tip
between samples, in order to avoid
carryover contamination.
5
3
125
Add 1.0 mL of I Free Testosterone
to every tube. Vortex.
No more than 10 minutes should
elapse during the dispensing of the
tracer. Set the T tubes aside for
counting (at step 6); they require no
further processing.
4
Incubate for 4 hours at 37°C.
The rack should be covered with
Parafilm to prevent evaporation.
5
6
construct a graph of the calibration curve
(even if the calculations are handled by
computer) as a visual check on the
appropriateness of the transformation
used and as a way to detect deviant
calibration points. We also recommend
keeping track of these data reduction
parameters:
T = Total Counts (as counts per minute)
%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total
Counts)
Decant thoroughly.
%MB = 100 × (Net Counts / Total Counts)
Removing all visible moisture will
greatly enhance precision. Using a
foam decanting rack, decant or
aspirate the contents of all tubes
(except the T tubes) and allow them to
drain for 2 or 3 minutes. Then strike
the tubes sharply on absorbent paper
to shake off all residual droplets.
And the 20, 50 and 80 percent
"intercepts," where
Count for 1 minute in a gamma
counter.
Calculation of Results
To obtain results in terms of concentration
from a logit-log representation of the
calibration curve, first calculate for each
pair of tubes the average NSB-corrected
counts per minute:
Net Counts = Average CPM minus Average
NSB CPM
Then determine the binding of each pair of
tubes as a percent of maximum binding
(MB), with the NSB-corrected counts of
the A tubes taken as 100%:
Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts)
× 100
(The calculation can be simplified by
omitting the correction for nonspecific
binding; samples within range of the
calibrators yield virtually the same results
when Percent Bound is calculated directly
from Average CPM.)
Using logit-log graph paper, plot Percent
Bound on the vertical (probability) axis
against Concentration on the horizontal
(logarithmic) axis for each of the nonzero
calibrators, and draw a straight line
approximating the path of these points.
Results for the unknowns may then be
read from the line by interpolation.
20% = Concentration at 20 Percent Bound, etc.
Note that other approaches, e.g. a sound
implementation of the 4-parameter logistic,
are also acceptable. See Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Example Run: For illustration only, not for
calculating results from another run.
Because the calibrator values are
lot-specific, concentrations listed in the
right-most column may not match the
values of the calibrators supplied in your
shipment. (See “Example Run” table.)
Quality Control
Controls (or serum pools) with at least two
free testosterone concentration levels—
low and high—should routinely be
assayed as unknowns.
Report patient results only if the control
results for that assay meet your
laboratory's established criteria for
acceptability.
It is good laboratory practice to record for
each assay the lot numbers of the
components used, as well as the dates
when they were first reconstituted or
opened. We also recommend charting
control results from day to day—as
described, for example, in Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Note that
repeat samples can serve as a valuable
additional tool for monitoring interassay
precision, and that pairs of control tubes
can be spaced throughout the assay to
help verify the absence of significant drift.
It is good practice to inspect results for
agreement within replicates, and to
6
Expected Values
Free testosterone values for adults with no
apparent or suspected gonadal
dysfunction are summarized below by sex
and by age. The statistics show, as
expected, a gradual decline in free
testosterone levels as a function of age
during the adult years. Results for men
and women 20 to 80 years of age—a total
of 472 males and 113 females—were
used in the analysis. The reference group
consisted of healthy volunteers and also
subjects in whom gonadal disease was
not suspected or was excluded by further
laboratory tests. The data set (kindly
provided by the authors) derives from a
30
published study on reference intervals
for the Coat-A-Count Free Testosterone
assay.
Mass Units (pg/mL)
n
Median
Central
95% Range
20 – 39
154
17.2
8.8 – 27
40 – 59
210
14.4
7.2 – 23
60 – 80
108
11.7
5.6 – 19
20 – 39
47
0.87
ND – 2.57
40 – 59
39
0.68
ND – 2.03
60 – 80
27
0.51
ND – 1.55
Age (years)
Males
Females
ND: Not detectable
Molar Units (pmol/L)
n
Median
Central
95% Range
20 – 39
154
60
31 – 94
40 – 59
210
50
25 – 80
60 – 80
108
41
19 – 66
20 – 39
47
3.0
ND – 8.9
40 – 59
39
2.3
ND – 7.0
60 – 80
27
1.8
ND – 5.4
Age (years)
Males
Females
ND: Not detectable
Note that selection criteria can have a
significant impact on the determination of
reference intervals: in particular, wider
intervals were obtained in the published
30
study when the data set was expanded
to include results for patient samples
which had been submitted for free
testosterone analysis.
Consider these limits as guidelines only.
Each laboratory should establish its own
reference ranges.
Performance Data
The following sections contain data
representative of the Coat-A-Count Free
Testosterone kit's performance. Results
are expressed in pg/mL.
Conversion Factor:
pg/mL × 3.467 → pmol/L
Calibration Range:
Approximately 0.55 – 50 pg/mL
(1.9 – 173 pmol/L). The calibrators are
lot-specific.
Analytical Sensitivity: 0.15 pg/mL.
Precision: Statistics were calculated for
samples from the results of pairs of tubes
in over 160 different assays. (See
“Precision” table.)
Precision Profile: The graph shows a
precision-dose profile for the assay based
on the within-run CVs (open circles) for
twelve samples, calculated by analysis of
variance from 34 runs. The bowl-shaped
contour line, which traces the approximate
path of these points, represents the withinrun CVs to be expected for samples
assayed in duplicate. For reference, the
run-to-run CVs tabulated in the "Precision"
table are displayed as solid squares. (See
“Precision Profile” graph.)
End-of-Run Effect: None up to
approximately 200 tubes. (See "End-ofRun Effect" table.)
Effect of SHBG: To investigate the effect
of sex hormone-binding globulin levels
(SHBG levels) on the assay system, a
charcoal-absorbed human serum pool was
spiked with SHBG to a concentration of
400 micrograms per milliliter, a level which
is approximately 1,000 times normal. The
SHBG-spiked pool, when assayed by the
procedure, showed a percent bound value
of 99% B/B0.
Since charcoal absorption removes
testosterone from the pool, it should have
free (and total) testosterone
concentrations of zero—that is, percent
bound values of approximately 100%
B/B0—both before and after spiking. The
7
results show, as expected, that the assay
is not influenced by SHBG levels.
Effect of Albumin: Lyophilized samples
were reconstituted with aqueous solutions
containing 0, 1.0, 2.0 and 3.0 g/dL of
charcoal-absorbed human serum albumin,
and assayed in parallel. (See "Effect of
Albumin " table.)
Effect of Charcoal Absorption: Patient
samples were analyzed by the
procedure both before and after charcoal
absorption. The free testosterone
concentrations (in pg/mL) before charcoal
absorption, and the percent bound
(%B/B0) values following charcoal
absorption are tabulated. (See "Effect of
Charcoal Absorption" table.)
The results demonstrate that charcoal
absorption essentially reduces the
apparent free testosterone level of patient
samples, as measured by the
Coat-A-Count procedure, to zero, that is,
to percent bound values of approximately
100% B/B0. Since charcoal absorption
removes testosterone along with other
steroids and small molecules from serum
samples while leaving larger molecules
such as albumin, SHBG and other binding
proteins, this experiment helps to confirm
that the Coat-A-Count Free Testosterone
procedure is not influenced by levels of
transport proteins.
Bilirubin: Presence of bilirubin in
concentrations up to 200 mg/L has no
effect on results, within the precision of the
assay.
Hemolysis: Presence of packed red blood
cells in concentrations up to 30 µL/mL has
no effect on results, within the precision of
the assay.
Alternate Sample Type: To assess the
effect of alternate sample types, blood
was collected from 49 volunteers into
plain, heparinized and EDTA vacutainer
tubes. The absolute ranges observed for
the male and female volunteers are
tabulated below.
Absolute
Range
19 Male Lab
Volunteers
pg/mL
30 Female Lab
Volunteers
pg/mL
Serum
9 – 47
0.7 – 3.6
Heparin
8 – 45
0.9 – 3.8
EDTA
13 – 79
1.3 – 5.7
The combined results for these
49 samples – plus one additional sample
– yielded the following statistics when
subjected to linear regression analysis.
(Heparin) = 0.95 (Serum) + 0.4 pg/mL
r = 0.996
(EDTA) = 1.48 (Serum) + 1.1 pg/mL
r = 0.957
Means:
11.9 pg/mL (Heparin)
12.2 pg/mL (Serum)
19.2 pg/mL (EDTA)
The results indicate that heparinized
plasma yields virtually the same results as
serum, whereas EDTA plasma yields
higher values.
Specificity: The free testosterone
antibody is highly specific for testosterone,
with an extremely low crossreactivity to
other naturally occurring steroids or
therapeutic drugs that may be present in
patient samples. (See “Specificity” table.)
Method Comparison: The assay was
compared to a conventional equilibrium
dialysis method on 85 serum samples (43
male and 42 female). By linear regression:
Male (43)
(TKTF) = 0.42 (Dialysis) + 9.8 pg/mL
r = 0.67
Means:
26.3 pg/mL (TKTF)
39.0 pg/mL (Dialysis)
Female (42)
r = 0.75
Means:
4.3 pg/mL (TKTF)
Combined (85)
r = 0.87
Means:
15.4 pg/mL (TKTF)
8
The Coat-A-Count Free Testosterone
procedure was also compared to a total
testosterone assay—Coat-A-Count Total
Testosterone procedure—on 109 serum
samples (51 male and 58 female). By
linear regression:
Male (51)
(Free) = 4.7 (Total) + 0.7
r = 0.984
Means:
23.6 pg/mL (Free)
4.84 ng/mL (Total)
Female (58)
(Free) = 6.1 (Total) + 0.6
r = 0.978
Means:
3.9 pg/mL (Free)
0.54 ng/mL (Total)
Combined (109)
(Free) = 4.6 (Total) + 1.2
r = 0.992
Means:
13.1 pg/mL (Free)
2.6 ng/mL (Total)
References
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evaluation of hirsute females. Fertil Steril
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and its principal metabolites interfere with
binding of testosterone, cortisol and thyroxin by
9
plasma proteins. Clin Chem 1982; 28(4): 696-8.
32) Charman WN, et al. Absorption of Danazol
after administration to different sites of the
gastrointestinal tract and the relationship to
single-and double-peack phenomena in the
plasma profiles. J Clin Pharmacol 1993;33:120713.
%MB9 = 54%
20% Intercept12 = 107 pg/mL
50% Intercept = 12.8 pg/mL
80% Intercept = 1.5 pg/mL
Precision (pg/mL)
Mean1
SD2
CV3
Technical Assistance
1
1.2
0.22
18.3%
In the United States, contact Siemens
Healthcare Diagnostics Technical
Services department. Tel: 877.229.3711.
To place an order: Tel: 800.255.3232.
Outside the United States, contact your
National Distributor.
2
8.9
0.76
8.5%
3
20
1.6
8.0%
Precision Profile
www.siemens.com/diagnostics
25
The Quality System of Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003.
20
CV%
15
Tables and Graphs
10
5
Example Run
Tube
1
T7
NSB8
Duplicate Average
CPM2
CPM3
Net
CPM4
Approx.
Free
Percent Testo.
5
Bound pg/mL6
56,991
57,059
57,127
254
292
273
C
90%
22,426
22,906 22,633
23,385
73%
0
0.5
2.7
D
17,197
17,193 16,920
17,188
55%
9.4
E
12,350
12,440 12,167
12,530
39%
24.0
F
9,262
10,208
31%
47.0
3
10
30
50
9,462
Tubes1
28–37
Tubes
87–96
Tubes
143–152
Tubes
199–208
1
10.9
12.2
11.7
10.9
2
18.3
19.2
18.6
18.3
3
19.0
17.0
18.8
19.1
4
20.6
18.3
17.9
18.4
5
49.0
52.4
48.7
47.1
Effect of Albumin (pg/mL)
Spiked with Albumin1
2
Unspiked
Unknowns10
X1
21,807
21,873 21,600
21,938
70%
4.3
X2
16,493
16,808 16,535
17,123
54%
10.9
10,249
10,356 10,083
10,462
33%
X3
1
Coat-A-Count Free Testosterone, pg/mL
End-of-Run Effect (pg/mL)
28,232
28,056 27,783
27,879
9,735
0.5
0
32,409
A
31,158 30,885 100%
(MB)9 29,906
B
0
36
1.0 g/dL 2.0 g/dL 3.0 g/dL
1
4.7
4.4
4.2
3.9
2
16.7
16.4
16.7
15.8
34.0
3
37.0
37.0
34.2
Mean3
19.5
19.3
18.4
17.9
% S/U4
—
99%
94%
92%
Quality Control Parameters:11
T7 = 57,059 cpm
%NSB8 = 0.5%
10
Effect of Charcoal Absorption
1
Specificity
2
Before (pg/mL) After (%B/B0)
Males3
21.24
96%
14.33
98%
Females
3rd Trimester
% Crossreactivity2
Aldosterone
ND
99%
5β-Androstan-3α,17β-diol
21.03
98%
Androstenedione
15.01
95%
5α-Androstan-3β,17β-diol
19.91
4
Compound1
ND
0.01%
5
0.005%
0.80
105%
∆ -Androsten-3β,17-diol
0.007%
2.32
104%
5α-Androstan-3,17-dione
0.001%
1.73
104%
Androsterone
ND
3.47
104%
Corticosterone
ND
1.93
105%
Cortisol
ND
4.75
99%
Cortisone
9.10
96%
Danazol
3.58
96%
11-Deoxycortisol
4.44
97%
Dexamethazone
3.86
96%
DHEA
ND
0.001%
ND
ND
0.003%
DHEA-sulfate
ND
Estradiol
ND
∆4-Estren-17α-methyl-17β-ol-3one
∆4-Estren-17-ol-3-one
Estrone
0.007%
0.16%
ND
Ethisterone
0.022%
∆4-Androsten-19-ol-3,17-dione
0.007%
11-Ketotestosterone
0.027%
Norethindrone
0.005%
Norethyrodrel
0.004%
Prednisone
ND
Progesterone
ND
Spironolactone
ND
11β-Hydroxytestosterone
Trianicinolone
0.004%
ND
5α-Dihydrotestosterone
0.041%
Methyltestosterone
0.10%
ND: Not detectable.
3
Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat
CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent
Bindung, 6Ca. Freies Testosteron, pg/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Unbekannte,
11
Qualitätskontrollparameter, 1220% Intercept.
Precision: 1Mittelwert, 2SD
(Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). End-of-Run Effect:
1
Röhrchen. Effect of Albumin: 1Versetzt mit
Albumin, 2Ohne Zugabe von, 3Mittelwert, 4%S/U.
11
Effect of Charcoal Absorption: 1Vor, 2Nach,
3
Männer, 4Frauen. Spezifität: 1Verbindung, 2%
Kreuzreaktivität, 3NN: Nicht nachweisbar.
1
Deutsch
2
Español. Example Run: Tubo, Duplicado
CPM, 3Media CPM, 4CPM Netas, 5Porcentaje de
unión, 6Testosterona Libre aprox., pg/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Desconocido, 11Parámetros
del control de calidad, 12Corte al 20%.
Precisión: 1Media, 2DS, 3CV. End-of-Run
Effect: 1Tubos. Effect of Albumin:
1
Sobrecargado con Albúmina, 2Sin añadir,
3
Media, 4%S/N. Effect of Charcoal Absorption:
1
Antes, 2Después, 3Hombres, 4Mujeres.
Especificidad: 1Compuesto, 2% Reacción
cruzada, 3ND: no detectable.
Français. Exemple Série : 1Tube, 2Duplicate
CPM, 3CPM moyen, CPM corrigé, 5Pourcentage
lié, 6Approx. Testosterone Libre, pg/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Patients, 11Paramètres
Contrôle de Qualité, 1220% Intercept.
Précision : 1Moyenne, 2SD, 3CV. Effet de la
position des tubes : 1Tubes. Effet de
l'Albumine : 1Chargé en Albumine, 2Non
chargés, 3Moyenne, 4%S/U. Effet de
l'Adsorption sur charbon : 1Avant, 2Après,
3
Hommes, 4Femmes. Spécificité : 1Composé,
2
Réaction croisée%. 3ND: non détectable.
Italiano. Seduta Esemplificativa: 1Provetta,
CPM in duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti,
5
Percentuale di Legato, 6Appross. Testosterone
Libero, pg/mL, 7Totale, 8%NSB, 9%MB,
10
Campioni Non Noti, 11Parametri per il Controllo
di Qualità, 12Intercetta al 20%. Precisione:
1
Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV
(Coefficiente di Variazione). Effetto fine
Seduta: 1Provette. Effetto dell'Albumina: 1Con
albumina, 2Semplice, 3Media, 4%S/U. Effetto
dovuto ad Assorbimento di Charcoal: 1Prima,
2
Dopo, 3Maschi, 4Femmine. Specificità:
1
Composto, 2Percentuale di Crossreattività, 3ND:
non determinabile.
Coat-A-Count Freies
Testosteron
Anwendung: Festphasen
Radioimmunoassay (coated tubes) zur
direkten quantitativen Bestimmung des
freien Testosterons im Serum. Dieses Invitro Diagnostikum ist ausschließlich als
Hilfsmittel zu Diagnose und Management
von Hirsutismus auf Grund von
Hyperandrogenämie gedacht.
Artikelnummern:
TKTF1 (100 Tests), TKTF2 (200 Tests)
Die Packung mit 100 Röhrchen
enthält weniger als 4 Microcurie
(148 Kilobequerel) an
125
radioaktivem I-markiertem TestosteronAnalog; die Packung mit 200 Röhrchen
enthält weniger als 8 Microcurie
(296 Kilobecquerel).
2
Português. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem
de Ligação, 6Aprox. Testosterona Livre, pg/mL,
7
Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconhecidos,
11
Parâmetros do controlo de qualidade, 1220%
Intercepção. Precisão: 1Média, 2Desvio padrão,
3
Coeficiente de variação. Efeito fim-de-série:
1
Tubos. Efeitos da Albumina: 1Adicionado com
Albumina, 2Não adicionada, 3Média, 4%S/U.
Efeitos da absorção pelo carvão: 1Antes,
2
Depois, 3Homens, 4Mulheres. Especificidade:
1
Composto, 2Percentagem de reacção cruzada,
3
ND: não detectável.
12
Klinische Relevanz
Testosteron zirkuliert im Serum an
Transportproteine gebunden, normalerweise liegt nur ca. 1% in freier Form vor.
Das wichtigste Transportprotein für
Testosteron ist das sexualhormonbindende Globulin (SHBG) oder
Testosteron-Östradiol-bindende Globulin
(TeBG), denn es bindet neben dem
Testosteron auch Dihydrotestosteron und
Östradiol. Albumin und Cortisol-bindendes
Globulin (CBG) dienen ebenfalls als
Transportproteine für Testosteron.
Aus drei Gründen ist SHBG das wichtigste
der drei genannten Transportproteine. Es
transportiert, iNSBesondere bei Frauen,
einen höheren Prozentsatz des Testosterons als Albumin und CBG. Weiterhin
bindet es Testosteron mit einer wesentlich
höheren Affinität im Vergleich zu den
anderen Transportproteinen. (Das an
Albumin und CBG gebundene Testosteron wird auch als „schwach
gebundenes“ Testosteron bezeichnet.)
Letztlich hat SHBG eine vom Albumin
unabhängige Bedeutung, insofern, dass
die SHBG Spiegel sensitiv auf Veränderungen im Verhältnis der zirkulierenden
Östrogene zu den zirkulierenden Androgenen reagieren. Deshalb spielt SHBG
eine größere Rolle in der Ausprägung der
Spiegel des freien Testosteron.
Während der Schwangerschaft zeigen die
SHBG Spiegel einen progressiven
Anstieg, der den Anstieg der Östradiol
Werte widerspiegelt. Obwohl auch die
Gesamt-Testosteron Spiegel während der
Schwangerschaft ansteigen, fällt der
Anstieg beim Östradiol und damit auch
beim SHBG wesentlich deutlicher aus.
Unter dem Strich ist ein Abfall des Freien
Testosteron als Teil vom Gesamt
Testosteron zu beobachten. Frauen, die
orale Kontrazeptiva einnehmen, insbesondere Ethinylestradiol in hohen
Dosen, haben normalerweise erhöhte
SHBG Spiegel. Umgekehrt führt die Gabe
von Androgenen bei präpubertären
Jungen oder die Erhöhung des endogenen Testosterons durch HCG-Stimulation zu einem Rückgang der SHBG
Spiegel.
Bei ansonsten gleichbleibenden Verhältnissen ist ein Anstieg der Konzentration
des Freien Testosteron zu erwarten, wenn
der Testosteronspiegel (T) ansteigt oder
die SHBG Konzentration abfällt. Das
Verhältnis T/SHBG dient zur groben
Abschätzung der Konzentration des
Freien Testosteron in der Zirkulation. Die
T/SHBG Ratio wird auch als freier
Androgenindex (FAI) bezeichnet.
Der Freie Androgenindex ist häufig erhöht
bei milder Akne, androgener Alopezie,
Hirsutismus und anderen Zuständen. Ein
erniedrigter SHBG Wert bei gleichzeitig
normalem Gesamt-Testosteron ist eine
häufig gefundene Konstellation bei diesen
Zuständen. Ein Anstieg der Testosteronproduktion induziert typischerweise einen
Abfall der SHBG-Werte. Hierdurch wird
die zelluläre Aufnahme und der Metabolismus des Testosterons stimuliert, mit dem
Ergebnis, dass mehr in der freien Form
zur Verfügung steht. Die gesteigerte
Produktion wird durch eine ebenfalls gesteigerte Clearance überlagert, was dazu
führt, dass der Testosteronspiegel normal
bleibt.
Gesamt-Testosteron Messungen wurden
traditionell als Hilfsmittel im Screening auf
Hirsutismus eingesetzt, allerdings ist im
Hinblick auf die oben beschriebenen
Mechanismen zu erwarten, dass die
direkte Messung oder die Berechnung des
Indexes T/SHBG besser mit dem KrankCoat-A-Count Free Testosterone (PITKTF-11, 2010-10-21)
heitsbild Hirsutismus korrelieren. Einige
Autoren, iNSBesondere Paulson, beschreiben die deutliche Überlegenheit des
freien Testosteron im Screening auf
Hirsutismus. In dieser Studie an 32
hirsuten Frauen hatten im Screening nur
44% einen erhöhten Gesamt Testosteron
Wert, während das Freie Testosteron in
allen 32 Fällen erhöht gefunden wurde.
Nicht alle Studien kommen zu einem so
eindeutigen Ergebnis. Wu hat mehrere
Studien in einem Review bewertet und
kommt zu dem Schluss, dass die
Bestimmung des Freien Testosteron
dennoch Vorteile gegenüber der Gesamt
Testosteron Bestimmung hat. (Die
unterschiedlichen Studienergebnisse sind
durch Unterschiede in der Methodik und in
der Auswahl des Patientenkollektivs zu
erklären.)
Methodik
Im Coat-A-Count RIA zur Bestimmung des
125
freien Testosteron konkurriert ein Imarkiertes Testosteron-Analog eine
vorgegebene Zeit mit dem freien Testosteron im Patientenserum um die Bindung
an Testosteron spezifische Antikörper, die
auf die Innenwandung von PolypropylenRöhrchen fest aufgebracht sind. Nach
Ablauf der Inkubationszeit wird der
Überstand abgegossen oder abgesaugt,
und die an die Antikörper gebundene
Fraktion in einem Gamma-Counter
gemessen. Die Counts sind zu der Konzentration umgekehrt proportional. Durch
Vergleich mit unter gleichen Bedingungen
behandelten Standards lässt sich die
Konzentration des freien Testosteron im
Serum aus der Standardkurve ablesen.
Der Test ist so aufgebaut, dass das
ursprüngliche Gleichgewicht zwischen
dem freien und dem an Bindeproteine
gebundenen Testosteron im Patientenserum nicht verändert wird. Dazu wird ein
Tracer verwendet, der nicht mit den
Transportproteinen für Steroide reagiert,
und ein Antiserum, das eine etwas
geringere Affinität für Testosteron hat, als
das hauptsächliche Trägerprotein SHBG.
Außerdem findet die Reaktion unter
physiologischen Bedingungen von
Temperatur, pH und Ionenstärke statt.
Die Konzentration des freien Testosteron
wird mit diesem Testsatz direkt in nur
einem Teströhrchen bestimmt. Es handelt
sich nicht um eine Berechnung als
13
Funktion von Testosteron und SHBG oder
anderen Parametern. Die Methode
unterscheidet sich demnach von der
Gleichgewichtsdialyse oder dem Freien
Androgen Index (FAI). Die Bestimmung
des freien Testosteron erfolgt in nur einem
Schritt ohne Vorinkubation oder vorherige
Abtrennung des freien Testosteron durch
Dialyse, Filtration oder
Säulenchromatographie. Zusätzlich sind
folgende Faktoren nennenswert:
Testdauer: 4 Stunden.
Total counts zum Zeitpunkt der
Markierung: ca. 60 000 cpm
Zu pipettierende Reagenzien: 1
Hinweise und
Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnostik.
Reagenzien: Die Packung mit den
Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem
Kühlschrank gelagert werden, der für
radioaktives Material ausgewiesen ist. Die
Entsorgung muss nach den jeweils
gültigen Gesetzen erfolgen.
Die Reagenzien dürfen nur bis zum
Verfallsdatum verwendet werden.
Einige Komponenten des Kits können
Material humanen Ursprungs und/oder in
anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe
enthalten, die es unbedingt notwendig
machen die folgenden
Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten.
Die generell geltenden
Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten
und alle Komponenten als potenziell
infektiös zu behandeln. Alle aus
menschlichem Blut gewonnenen
Materialien wurden auf Syphilis,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2,
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
Hepatitis-C-Antikörper untersucht und
negativ befundet.
Bestimmten Komponenten wurde
Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um
die Bildung von explosiven Metallaziden in
Blei- und Kupferrohren zu vermeiden,
sollten die Reagenzien nur zusammen mit
großen Wassermengen in die Kanalisation
gespült werden.
Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes
Wasser benutzen.
14
Radioaktivität
Der Umgang mit radioaktivem Material ist
in Deutschland genehmigungspflichtig.
Deshalb muss der Siemens Healthcare
Diagnostics eine Kopie der aktuellen
gültigen Umgangsgenehmigung des
Kunden vorliegen, bevor radioaktive
Reagenzien versendet werden dürfen. Die
Strahlenschutzverordnung ist zu
beachten.
Das radioaktive Material ist gemäß der
jeweiligen Umgangsgenehmigung zu
handhaben.
Die Strahlenexposition ist zu minimieren.
Spritzer sind sofort aufzuwischen und die
betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden.
Flüssiger und fester radioaktiver Abfall
sind unter Beachtung der gültigen
Richtlinien zu entsorgen.
Bestandteile der Testpackung:
Vorbereitung
Die in diesem Kit enthalten Bestandteile
sind nicht austauschbar mit denen im
Coat-A-Count Gesamt Testosteron Kit,
welcher zur Bestimmung des Gesamt
Testosteron entwickelt wurde.
Freies Testosteron Ak beschichtete
Röhrchen (TTF1)
Polypropylen-Röhrchen* beschichtet mit
Antikörpern vom Kaninchen gegen das
freie Testosteron, verpackt in wiederverschließbaren Plastikbeuteln. Kühl
lagern, vor Feuchtigkeit schützen und
nach dem Öffnen wieder sorgfältig
verschließen. Lagerung bei 2–8°C bis zum
Verfallsdatum. Farbe: Hellblau.
TKTF1: 100 Röhrchen.
TKTF2: 200 Röhrchen.
125
I Freies Testosteron (TTF2)
105 ml jodiertes Testosteron-Analog mit
Natruimazid als Konservierungsmittel.
Lagerung bei 2–8°C. Haltbar bis 30 Tage
nach dem Öffnen oder bis zum
Verfallsdatum auf der Flasche.
TKTF1: 1 Flasche. TKTF2: 2 Flaschen.
Freies Testosteron Standards (TFC3–8)
6 Flaschen mit Freiem Testosteron,
gebrauchsfertig, in behandeltem
Humanserum mit Konservierungsmitteln
(Natriumazid und Gentamicin). Der
Nullstandard (A) enthält 2,0 ml während
die Standards B – F je1,0 ml enthalten.
Bei 2–8°C bis 30 Tage nach dem Öffnen
haltbar.
TKTF1: 1 Set. TKTF2: 1 Set.
Die Standards haben chargenspezifische
Werte von ca. 0; 0,55; 2,5; 9,0; 25 und
50 pg/ml; bzw. ca. 0; 1,9; 8,7; 31; 87 und
173 pmol/l. Die exakten Konzentrationen
entnehmen Sie bitte den Etiketten der
Standardflaschen.
Erforderliche Laborgeräte und
Hilfsmittel
Gammacounter—kompatibel mit
12x75 mm Röhrchen
Wirbelmischer
Unbeschichtete 12x75 mm PolyprophylenRöhrchen—für T und NSB Röhrchen,
erhältlich bei Siemens Healthcare
Diagnostics (Artikelnummer: PPO)
Mikropipetten: 50 µl und 1,0 ml.
Wasserbad oder Heizblock für Inkubation
37°C.
Dekantierständer—erhältlich bei Siemens
Healthcare Diagnostics (Artikelnummer:
FDR).
Logit-Log-Papier
Immunoassay-Kontrolle (> 25 Parameter,
3 Konzentrationen) (Artikelnummern:
CON6).
Probengewinnung
Es ist keine besondere Vorbereitung der
Patienten nötig. Blutentnahme durch
29
Venenpunktion in Röhrchen ohne
Zusätze (ohne Antikoagulantien),
Trennung des Serums von den Blutzellen.
EDTA würde die Resultate erheblich
verfälschen und sollte daher nicht als
Antikoagulans verwerdet werden.
Stark lipämische Seren führen zu falsch
hohen Freies Testosteron Werten.
Lipämische Seren sollten durch
Ultrazentrifugieren geklärt werden.
Bei hämolysierten Proben besteht die
Möglichkeit einer unsachgemäßen
Handhabung vor Eintreffen im Labor,
daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu
interpretieren.
Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen
Herstellern können differierende Werte
verursachen. Dies hängt von den
verwendeten Materialien und Additiven
(Gel oder physische Trennbarrieren,
Gerinnungsaktivatoren und /oder
Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count Freies
Testosteron sind nicht mit allen möglichen
Röhrchenvariationen ausgetestet worden.
Details der getesteten Röhrchenarten sind
dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu
entnehmen.
Danazol Therapie: Danazol, ein Derivat
des synthetischen Steroids Ethisteron,
wird zur Behandlung der Endometriose
und fibrocystischer Brusterkrankungen
eingesetzt. Die androgenen
Nebenwirkungen bei Patienten unter
Danazol-Therapie werden der
gesteigerten Verfügbarkeit von freiem
Testosteron zugeschrieben. Dem
entsprechend werden Patienten, die
Danazol einnehmen, erhöhte
Konzentrationen an freiem Testosteron
aufweisen.
In-vitro Studien mit dem Coat-A-Count
Freies Testosteron Assay haben gezeigt,
dass in Proben, die mit Danazol versetzt
wurden, die scheinbar gemessene
Konzentration an freiem Testosteron
31
ansteigt. Die maximale Danazol PlasmaKonzentration nach oraler Gabe von 100
mg wurde mit 199 ng/ml berichtet, was zu
einer merklichen Veränderung der
Konzentration an freiem Testosteron führt,
trotz der beobachteten niedrigen
32
Kreuzreaktivität. Siehe Kapitel
„Specificity“ für die Angaben zur
prozentualen Kreuzreaktivität
Bei Patienten unter Danazol Therapie sind
deshalb die gemessenen Spiegel an
freiem Testosteron mit Vorsicht zu
interpretieren.
Erforderliche Menge: 50 µl pro
Röhrchen.
Lagerung: 2 Tage bei 2–8°C oder
2 Monate (portioniert) bei –20°C.
Die Proben vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen und
vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes
Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei
Bedarf portionieren. Gefrorene Proben
dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad
aufgetaut werden.
Testansatz und Durchführung
Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen.
15
1
Unbeschichtete Röhrchen: Jeweils
2 unbeschichtete 12x75 mm
Polypropylen-Röhrchen mit T (Total
Counts) und NSB (unspezifische
Bindung) beschriften.
Da die unspezifische Bindung im
Coat-A-Count RIA normalerweise
niedrig ist hat sie keinen signifikanten
Einfluss auf die Messwerte. Es kann
deshalb auch auf das Mitführen der
NSB-Röhrchen verzichtet werden.
Röhrchen bis zur Messung (siehe
Schritt 6) beiseite stellen; sie bedürfen
keiner weiteren Behandlung.
4
Um Verdunstung zu vermeiden,
sollten die Ständer mit Parafilm
abgedeckt werden.
5
ca. pg/ml
A (MB)
0
0
B
0,55
1,9
C
2,5
8,7
D
9,0
31
E
25
87
F
50
173
ca. pmol/l
Bitte beachten: Die Konzentrationen der
Standards sind chargenspezifisch. Bitte
entnehmen Sie die exakten Konzentrationen der
Beschriftung der Flaschen.
2
Jeweils 50 µl des 0-Standards A in die
NSB und A Röhrchen und jeweils 50
µl der restlichen Standards, Kontrollen
und Patientenproben in die
vorbereiteten Röhrchen pipettieren.
Direkt auf den Boden des
Röhrchens pipettieren.
Proben mit hohen zu erwartenden
Konzentrationen dürfen nicht mit 0Standard verdünnt werden. (Eine
Verdünnungslinearität kann nicht
erwartet werden, da durch die
Verdünnung sich das Gleichgewicht
verschiebt.)
Es ist gute Laborpraxis Pipetten mit
Einmalspitzen zu verwenden und die
Spitze von Probe zu Probe zu
wechseln um Verschleppung zu
vermeiden.
3
125
Jeweils 1,0 ml I Freies Testosteron
Analog hinzufügen. Mischen.
Das Verteilen des Tracers sollte nicht
länger als 10 Minuten dauern. Die T-
16
Vollständig dekantieren.
Vollständiges Entfernen der
Flüssigkeit verbessert die Präzision
deutlich. Mit Hilfe eines
Dekantierständers alle Röhrchen
(außer die T-Röhrchen) dekantieren
oder absaugen und 2-3 Minuten
umgedreht stehen lassen.
Anschließend werden die Röhrchen
kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um
alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.
Beschichtete Röhrchen: Jeweils 2
Antikörper-beschichtete Freies
Testosteron Röhrchen mit A (maximale
Bindung, 0-Standard) und von B bis F
beschriften. Jeweils 2 weitere Antikörperbeschichtete Röhrchen für Kontrollen und
Patientenproben beschriften.
Standard
Für 4 Stunden bei 37°C im
Wasserbad inkubieren.
6
Alle Röhrchen 1 Minute im GammaCounter messen.
Berechnung der Ergebnisse
Um die Konzentrationen aus der Logit-Log
Darstellung der Standardkurve abzulesen
werden zunächst der Mittelwert der zwei
Röhrchen bereinigt um den Mittelwert der
NSB Counts pro Minute (cpm) berechnet:
Netto CPM = Mittelwert CPM minus Mittelwert
NSB CPM
Anschließend wird die Bindung jedes
Röhrchenpaars als Prozent der
Maximalbindung (MB, B0) bestimmt.
Hierzu werden die mittleren CPM des AStandards korrigiert um die mittlere NSB
als 100% gesetzt:
Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB
Counts) × 100
(Die Berechnung kann durch weglassen
der Korrektur um die NSB vereinfacht
werden. Für Proben innerhalb des
Standardbereichs werden nahezu
identische Konzentrationen berechnet,
wenn B/B0 direkt aus den CPM ermittelt
wird.)
Die so ermittelten B/B0 aller Standards
außer des 0-Standards werden auf der yAchse auf Logit-Log Papier gegen die
Konzentration auf der x-Achse
(logarithmisch) aufgetragen. Die Punkte
werden mit bestmöglicher Annäherung
durch eine gerade Linie verbunden. Die
Ergebnisse der unbekannten Proben
können dann durch Interpolation an der
Kurve abgelesen werden.
Es ist gute Laborpraxis die Ergebnisse der
Doppelbestimmung auf Übereinstimmung
zu prüfen und eine Grafik der
Standardkurve darzustellen (auch wenn
die eigentliche Berechnung durch ein
Computerprogramm erfolgt) um visuell zu
überprüfen, ob für die Standardkurve die
geeignete Transformation verwendet
wurde und um eventuell abweichende
Standardkurvenpunkte zu entdecken. Es
wird weiterhin empfohlen, folgende
Parameter der Berechnung zu
protokollieren:
T = Total Counts (als Counts pro Minute)
%NSB = 100 × (Mittlere NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts)
und die 20, 50 und 80 Prozent
"intercepts," wobei
20% = Konzentration bei 20 Prozent Bindung,
etc.
Bitte beachten Sie, dass auch andere
Auswertungen z. B. nach der 4-Parameter-Logistik akzeptabel sind. Siehe:
Dudley RA, et al. Guidelines for
immunoassay data reduction. Clin Chem
1985;31:1264-71.
Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient
nur zur Veranschaulichung und ist nicht
dazu geeignet Werte aus einem anderen
Testansatz damit zu ermitteln. Aufgrund
der Chargenabhängigkeit der Standardkonzentrationen müssen die in der
rechten Spalte der Tabelle gelisteten
Konzentrationen nicht mit den Konzentrationen in Ihrer Lieferung übereinstimmen. (Siehe “Example Run” Tabelle.)
Es ist gute Laborpraxis die
Chargennummern, sowie das Datum der
ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der
verwendeten Komponenten zu
protokollieren. Die wiederholte Messung
von Proben kann bei der Beurteilung der
Interassay Präzision hilfreich sein. Der
Einsatz von Kontrollprobenpaaren an
unterschiedlichen Positionen des
Testansatzes ist hilfreich, um einen
eventuellen Drift zu erkennen.
Referenzwerte
In der u. g. Tabelle sind die Freien
Testosteron Werte für Erwachsene ohne
bestehende oder vermutete Funktionsstörung der Keimdrüsen, aufgegliedert
nach Alter und Geschlecht aufgelistet. Wie
zu erwarten zeigt die Statistik, dass die
Testosteron Spiegel mit zunehmendem
Alter niedriger werden. Es wurden die
Werte von 472 Männern und 113 Frauen
im Alter von 20 – 80 Jahren analysiert. Die
Referenzgruppe bestand aus gesunden
Freiwilligen und Personen ohne Hinweise
auf Erkrankungen der Keimdrüsen, bzw.
eine Erkrankung konnte aufgrund weiterer
Laborwerte ausgeschlossen werden. Die
Daten stammen aus einer publizierten
30
Studie über Referenzbereiche für den
Freies Testosteron Coat-A-Count RIA und
wurden von den Autoren freundlicherweise zur Verfügung gestellt.
Masseneinheit (pg/ml)
Alter
(Jahre)
N
Median
95%
Bereich
20 – 39
154
17,2
8,8 – 27
40 – 59
210
14,4
7,2 – 23
60 – 80
108
11,7
5,6 – 19
Männer
Frauen
Qualitätskontrolle
20 – 39
47
0,87
NN – 2,57
Es wird empfohlen Kontrollen mit
mindestens 2 Konzentrationen (niedrig
und hoch) an Freiem Testosteron
routinemäßig als unbekannte Proben
einzusetzen.
40 – 59
39
0,68
NN – 2,03
60 – 80
27
0,51
NN – 1,55
NN: Nicht nachweisbar
Patientenergebnisse dürfen nur dann
freigegeben werden, wenn die
laborspezifischen Akzeptanzkriterien
erfüllt sind. Hierzu sind die jeweils gültigen
Richtlinien zu berücksichtigen.
17
Molare Einheiten (pmol/l)
Alter
(Jahre)
n
Median
95%
Bereich
20 – 39
154
60
31 – 94
40 – 59
210
50
25 – 80
60 – 80
108
41
19 – 66
20 – 39
47
3,0
NN – 8,9
40 – 59
39
2,3
NN – 7,0
60 – 80
27
1,8
NN – 5,4
Männer
Frauen
NN: Nicht nachweisbar
Es ist zu beachten, dass Auswahlkriterien
einen signifikanten Einfluss auf
Referenzbereiche haben können: in der
30
publizierten Studie wurden breitere
Bereiche gefunden, wenn auch Proben
von Patienten berücksichtigt wurden.
Die genannten Bereiche sind als Richtlinie
zu interpretieren. Jedes Labor sollte seine
eigenen Referenzbereiche etablieren.
Leistungsdaten
Im folgenden Abschnitt sind Daten
gezeigt, die für die Leistung des Freies
Testosterone Assays repräsentativ sind.
Die Ergebnisse sind in pg/ml angegeben.
Umrechnungsfaktor:
pg/ml × 3,467 → pmol/l
Messbereich:
ca. 0,55 – 50 pg/ml
(1,9 – 173 pmol/l). Die Standards sind
chargenspezifisch.
Analytische Sensitivität: 0,15 pg/ml.
Präzision: Zur Überprüfung der InterAssay-Varianz des Coat-A-Count Freies
Testosteron – RIA wurden die Messwerte
von 3 Proben unterschiedlicher
Konzentration, gemessen in mehr als 160
Testansätzen in Doppelbestimmung
ausgewertet bestimmt. (Siehe Tabelle
„Präzision“.)
Präzisionsprofil:
Die Grafik zeigt die Präzision in
Abhängigkeit von der Konzentration. Die
offenen Kreise repräsentieren die IntraAssay-VK´s für Doppelbestimmungen
ermittelt an 12 Proben in 34 Testansätzen.
Die durchgezogene Linie als
Ausgleichskurve zwischen den Punkten
zeigt die zu erwartenden Intra-Assay-VK´s
18
in der Doppelbestimmung. Die
geschlossenen Quadrate repräsentieren
die o. g. Daten zur Inter-Assay-Varianz.
(Siehe Tabelle „Präzision“.)
“End of Run” Effekt: Tritt bis ca. 200
Röhrchen nicht auf. (Siehe Tabelle "End
of Run”-Effect".)
Einfluss von SHBG: Um den Einfluss von
Sexualhormonbindendem Globulin
(SHBG) auf das Testsystem zu untersuchen wurde ein mit Aktivkohle- Absorption vorbehandelter Humanserumpool mit SHBG in einer Konzentration von
400 mg/ml versetzt, einer Konzentration
die 1 000mal höher als der normale SHBG
Serumspiegel ist. Der so behandelte Pool
zeigte im Freies Testosteron
Coat-A-Count RIA eine B/B0 von 99%.
Da durch die Aktivkohle-Absorption das
gesamte Testosteron aus dem PoolSerum entfernt wurde, sollte die
Konzentration sowohl für Testosteron und
Freies Testosteron vor und nach SHBG
Zugabe 0 sein, was einer B/B0 von 100%
entspricht. Wie erwartet zeigen die
Untersuchungen, dass SHBG keinen
Einfluss auf die Ergebnisse hat.
Einfluss von Albumin: Lyophilisierte
Proben wurden mit einer wässrigen
Lösung aufgelöst, die 0; 1,0; 2,0 und
3,0 g/dl aktivkohle-absorbiertes, humanes
Serum-Albumin enthält und parallel
gemessen. (Siehe Tabelle "Effect of
Albumin ")
Einfluss von Aktivkohle-Absorption:
Patientenproben wurden vor und nach
Aktivkohle-Absorption im Freies
Testosteron Coat-A-Count RIA gemessen.
Die Konzentrationen an Freiem
Testosteron (in pg/ml) vor AktivkohleAbsorption und die Prozentbindungen
(%B/B0) nach Aktivkohle-Absorption sind
aufgelistet. (Siehe Tabelle "Effect of
Charcoal Absorption")
Die Ergebnisse zeigen, dass durch die
Aktivkohle-Absorption die Konzentrationen
an Freiem Testosteron in Patientenproben
gemessen mit dem Coat-A-Count RIA
signifikant bis auf Null und damit auf ca.
100% B/B0 reduziert werden können.
Durch die Aktivkohle-Absorption werden
Testosteron sowie andere Steroide und
kleine Moleküle aus dem Serum entfernt,
während größere Moleküle wie Albumin,
SHBG und andere Bindeproteine im
Serum verbleiben. Somit bestätigt dieses
Experiment, dass der Freies Testosteron
Coat-A-Count Assay von unterschiedlichen Konzentrationen an Transportproteinen nicht beeinflusst wird.
Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentration
von bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die
Ergebnisse, der größer als die
Unpräzision des Assays selbst ist.
Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate
haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml
keinen Einfluss auf die Ergebnisse, der
größer als die Unpräzision des Assays
selbst ist.
Alternativer Probentyp: Um die
Auswirkungen von verschiedenen
Probenarten zu untersuchen, wurde Blut
von 49 Freiwilligen in Röhrchen ohne
Additiva, in Heparin- und EDTA Rörchen
gesammelt. Die gemessenen absoluten
Bereiche für Männer und Frauen sind
nachstehend aufgeführt.
19 männliche
30 weibliche
freiwillige
freiwillige
Absoluter Labormitarbeiter Labormitarbeiter
Bereich
pg/ml
pg/ml
Serum
9 – 47
0,7 – 3,6
Heparin
8 – 45
0,9 – 3,8
EDTA
13 – 79
1,3 – 5,7
Die zusammengefassten Resultate dieser
49 Proben, plus einer zusätzlichen Probe,
führen nach linearer Regression zu
folgender Statistik:
(Heparin) = 0,95 (Serum) + 0,4 pg/ml
r = 0,996
(EDTA) = 1,48 (Serum) + 1,1 pg/ml
r = 0,957
Mittelwerte:
11,9 pg/ml (Heparin)
12,2 pg/ml (Serum)
19,2 pg/ml (EDTA)
Die Ergebnisse zeigen, dass
heparinisiertes Plasma im Wesentlichen
die gelatin Resultate aufweist we Serum,
wohingegen EDTA-Plasma höhere Were
ergot.
Spezifität: Das in diesem Testbesteck
verwendete Antiserum ist hochspezifisch
mit sehr niedrigen Kreuzreaktivitäten zu
anderen natürlich vorkommenden
Steroiden oder Medikamenten. Bei
Untersuchungen im Labor des Herstellers
wurden folgende Kreuzreaktivitäten
gemessen: (siehe Tabelle „Specificity“.)
Methodenvergleich: Der Assay wurde
mit einem konventionellen Gleichgewichtsdialyse-Verfahren an 85 Serumproben (43
Männer, 42 Frauen) verglichen. Durch
lineare Regression:
Männer (43)
(TKTF) = 0,42 (Dialyse) + 9,8 pg/ml
r = 0,67
Mittelwerte:
26,3 pg/ml (TKTF)
39,0 pg/ml (Dialyse)
Frauen (42)
r = 0,75
Mittelwerte:
4,3 pg/ml (TKTF)
4,1 pg/ml (Dialyse)
Gesamt (85)
r = 0,87
Mittelwerte:
15,4 pg/ml (TKTF)
Der Freies Testosteron Coat-A-Count RIA
wurde ebenfalls mit dem Gesamt
Testosteron Coat-A-Count RIA an 109
Serumproben (51 Männer, 58 Frauen)
verglichen. Durch lineare Regression:
Männer (51)
(Frei) = 4,7 (Gesamt) + 0,7
r = 0,984
Mittelwerte:
23,6 pg/ml (Frei)
4,84 ng/ml (Gesamt)
Frauen (58)
(Frei) = 6,1 (Gesamt) + 0,6
r = 0,978
Mittelwerte:
3,9 pg/ml (Frei)
0,54 ng/ml (Gesamt)
Gesamt (109)
(Frei) = 4,6 (Gesamt) + 1,2
r = 0,992
Mittelwerte:
13,1 pg/ml (Free)
2,6 ng/ml (Gesamt)
Anwendungsberatung
Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an
Ihre Niederlassung.
19
Das Qualitätsmanagement-System der Siemens
Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach
DIN EN ISO 13485:2003.
Español
Coat-A-Count Testosterona
libre
Utilidad del análisis : El kit Coat-A-Count
Testosterona libre es un
125
radioinmunoanálisis ( I) en fase sólida
diseñado para la determinación
cuantitativa de la testosterona libre en
suero. Su uso es estrictamente para el
diagnóstico in vitro como ayuda en el
diagnóstico clínico y en el manejo del
hirsutismo debido a hiperandrogenismo.
Referencia: TKTF1 (100 tubos),
TKTF2 (200 tubos)
El kit de 100 tubos contiene
menos de 4 microcurios
(148 kilobequerelios) del análogo
125
de testosterona marcado con I
radioactivo; El kit de 200 tubos contiene
menos de 8 microcurios
(296 kilobequerelios).
Resumen y explicación del Test
La testosterona circula casi en su totalidad
unida a proteínas transportadoras:
normalmente, menos del uno por ciento
está libre. La principal proteína
transportadora de testosterona es
conocida como globulina transportadora
de hormonas sexuales (SHBG) o
globulina transportadora de testosteronaestradiol (TeBG), ya que no sólo se une a
testosterona sino también al estradiol (y a
la dihidrotestosterona). La albúmina y la
globulina transportadora de cortisol (CBG)
son otras proteínas transportadoras de
testosterona.
Por tres razones, la SHBG es la más
importante de esas proteínas
transportadoras. Transporta, al menos en
las mujeres, un porcentaje mayor de
testosterona en la sangre que la albúmina
ó CBG. Es más, se une a la testosterona
con mayor afinidad que las otras dos
proteínas transportadoras. (La
testosterona unida a albúmina y CBG se
conoce vulgarmente como testosterone
“débilmente unida”). Finalmente, la SHBG
20
tiene una respuesta, no asociada a la
albúmina, en el sentido de que los niveles
de SHBG son sensibles a la proporción de
estrógenos circulantes con respecto a los
andrógenos circulantes. La SHBG, por
ello, juega un papel más importante en la
determinación de la testosterona libre
circulante.
En el embarazo, los niveles de SHBG
muestran un incremento progresivo
haciendo espejo con la elevación de los
niveles de Estradiol. Como los niveles de
testosterone total también muestran un
cierto incremento durante el embarazo, la
subida de Estradiol, y por ello de SHBG,
es más pronunciada. El resultado neto es
una disminución del porcentaje de
testosterona libre en función de la
testosterona total. Las mujeres que toman
anticonceptivos orales van a tener
elevados los niveles de SHBG, al menos
si toman dosis elevadas de preparaciones
de etinil-estradiol. Consecuentemente, la
administración de andrógenos a los
prepúberes, o la elevación de la
testosterone endógena por estimulación
con HCG, conllevan a una disminución
significativa del nivel de SHBG. La
obesidad también está asociada a una
disminución del nivel de SHBG.
Se puede esperar que la concentración de
testosterone libre circulante aumente si el
nivel de testosterone total (T) aumente o
diminuya el nivel de SHBG. La relación
T/SHBG sirve como una guía de la
concentración de testosterona libre
circulante. Esta relación T/SHBG, aveces,
es denominada Indice de Testosterona
Libre (TFI).
El Indice de Testosterona Libre, a veces,
se incrementa en acne severo, alopecia
masculine androgénica, hirsutismo y otras
enfermedades. En dichos casos, se
puede observar un nivel bajo de SHBG,
asociado aun nivel normal de testosterona
total. Un incremento en la velocidad de
producción de testosterona provoca la
disminución de los niveles de SHBG. Esto
provoca una estimulación celular y del
metabolismo de la testosterona, haciendo
más disponible su forma libre. El
resultadoes que el nivel de testosterona
total es normal debido a que se compensa
su velocidad de producción elevada con
un incremento de la velocidad de
eliminación.
Las mediciones de testosterona total han
sido tradicionalmente utilizadas como
cribaje del hirsutismo. En vista del
mecanismo explicado anteriormente, se
espera que los niveles de testosterona
libre, medidos directamente o mediante la
proporción T/SHBG, correlacionen mejor
con el hirsutismo. Algunos investigadores,
sobre todo Paulson, han encontrado que
la testosterona libre es extremadamente
superior a la testosterona total para el
cribaje de hirsutismo. En este estudio de
32 mujeres hirsutas, solo el 44 por ciento
tenían elevados los niveles de
testosterona total, mientras que las 32
mujeres tenían elevados los niveles de
testosterona libre. No todos los
investigadores han obtenido este grado
de éxito. No obstante, a juzgar por los
estudios revisados por Wu, parece ser
que la testosterona libre es al menos
marginalmente superior a la testosterona
total en este contexto. (Los diferentes
resultados pueden deberse a diferencias
en la metodología y a la selección de los
pacientes).
Principio del análisis
En el procedimiento de Coat-A-Count
Free Testosterone, el análogo de
125
testosterona marcado con I compite por
un periodo de tiempo determinado con la
testosterona libre de la muestra del
paciente por los sitios de unión de los
anticuerpos específicos de testosterona
inmovilizados en las paredes del tubo de
polipropileno. Al decantarse los tubos, se
aisla la fracción unida al anticuerpo y se
cuenta en un contador gamma, siendo las
cuenatas inversamente proporcional a la
concentración de testosterona libre en la
muestra.
El ensayo está diseñado para mantener
esencialmente inalterado el equilibrio
original entre la testosterone libre y la
unida a proteínas en la muestra del
paciente. Se utiliza un trazador que no se
une a las proteínas transportadoras de
esteroides y un antisuero con una afinidad
menor que la de la principal proteína
transportadora de testosterona, la
globulina transportadora de hormonas
sexuales (SHBG). Además, se trabaja
bajo condiciones fisiológicas de
temperatura, pH y fuerza iónica.
único-tubo : su resultado no se calcula en
función de la testosterona total y SHBG o
algún otro parámetro, sino por
interpolación en una curva estándar de
concentraciones de testosterona libre. Por
ello, difiere de los métodos tradicionales
de diálisis al equilibrio y de los llamados
índices de testosterona libre (TFI).
También, es un ensayo monopaso, sin
necesidad de un paso previo de
incubación o aislamiento preliminar por
diálisis de la fracción libre, filtración o
cromatografía en columna. Además, el
ensayo presenta las siguientes
características:
Tiempo total de incubación: 4 horas.
Cuentas totales en la iodización:
aproximadamente 60 000 cpm
Reactivos a pipetear: 1
Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro.
Reactivos: Almacenar de 2–8°C en una
cámara preparada para almacenar
material radioactivo. Desechar de acuerdo
a la legislación en vigor.
No usar los reactivos después de su fecha
de caducidad.
Algunos componentes suministrados en el
kit pueden contener material de origen
humano y/o otros componentes
potencialmente peligrosos que necesiten
ciertas precauciones.
Siga las precauciones universales y
manipule todos los componentes como si
fueran capaces de transmitir agentes
infecciosos. Los materiales derivados de
sangre humana han sido analizados y son
negativos para sífilis; para anticuerpos
frente al HIV 1 y 2; para el antígeno de
superficie de hepatitis B y para los
anticuerpos de hepatitis C.
Se ha usado Azida sódica, en
concentraciones menores de 0,1 g/dl,
como conservante. Para su eliminación,
lavar con grandes cantidades de agua
para evitar la constitución de residuos de
azidas metálicas, potencialmente
explosivas, en las cañerías de cobre y
plomo.
Agua: Usar agua destilada o desionizada.
El procedimiento Coat-A-Count Free
Testosterona es un ensayo directo o
21
Radioactividad
Una copia de cualquier certificado de
licencia de radioisótopos (específico o
general) emitido a la aduana de los EEUU
se registrará en los ficheros de Siemens
Healthcare Diagnostics antes de que se
puedan enviar kits o componentes
conteniendo material radioactivo. Estos
materiales radioactivos pueden adquirirse
por cualquier cliente con la licencia
específica apropiada. Con una licencia
general, estos materiales radioactivos
pueden adquirirse solo por medicos,
veterinarios en la prácrica de la medicina
veterinaria, laboratorios clínicos y
hospitales—y estrictamente para la clínica
in vitro o test de laboratorio que no
conlleven la administración interna o
externa de material radioactivo o su
radiación a humanos u otros animales. Su
adquisición, recepción, almacenaje, uso,
trasferencia y desecho están regulados y
se expenderá una licencia (general o
específica) de la Comisión Nuclear de
EEUU o de un Estado con el NRC para su
consiguiente control.
Manejar los materiales radioactivos de
acuerdo a los requerimientos de su
licencia general o específica. Para
minimizar la exposición a la radiación, el
usuario debe adherirse al cuarto conjunto
de guías publicadas por el National
Bureau of Standards con el nombre Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
y en las consiguientes publicaciones de
las autoridades Federales o Estatales.
Limpiar y decontaminar rápidamente las
superficies afectadas. Evitar la generación
de aerosols. Eliminar los residuos sólidos
radioactivos de acuerdo con los
requerimientos de su licencia. Licencias
generales (NRC Form 483) pueden
eliminar sus residuos sólidos radioactivos
como residuos no radioactivos, después
de retirar las etiquetas. Licencias
específicas (NRC Form 313) se deben
referir al Título 10, Código de
Regulaciones Federales, Parte 20. Las
licencias en Estados Asociados deben
referirse a las normativas de su
correspondiente Estado. Licencias
generales pueden eliminar sus residuos
líquidos radioactivos contenidos en este
tipo de productos como cualquier otro
material líquido, quitando las etiquetas de
los contenedores y procesándolos como
22
residuos sólidos. Licencias específicas
pueden eliminar pequeñas cantidades de
residuos líquidos radioactivos contenidos
en este tipo de productos como cualquier
otro material líquido. Refiérase a la
normativa aplicable a su laboratorio.
Materiales Suministrados:
Preparación Inicial
Los materiales suministrados en este kit
no son intercambiables con aquellos
incluidos en el kit Coat-A-Count Total
Testosterone, que está diseñado para la
medición de la testosterona total.
Tubos recubiertos de anticuerpo frente
a la testosterona libre (TTF1)
Tubos de Polipropileno recubiertos con
anticuerpos de conejo frente a la
testosterona libre embalados en bolsas de
cierre hermético. Almacenar refrigerados y
protegidos de la condensación, cerrando
cuidadosamente las bolsas después de su
uso. Estable a 2–8°C hasta la fecha de
caducidad impresa en la bolsa. Color:
azul.
TKTF1: 100 tubos. TKTF2: 200 tubos.
125
I testosterona libre (TTF2)
105 ml de un análogo de testosterona
radioactivo con azida sódica como
conservante. Estable a 2–8°C durante 30
días después de su apertura, o hasta la
fecha de caducidad impresa en el vial.
TKTF1: 1 vial. TKTF2: 2 viales.
Calibradores de testosterona libre
(TFC3–8)
Seis viales de calibradores de
testosterona libre, listos para su uso, en
suero humano procesado con
conservantes (azida sódica y
gentamicina). El vial A ó calibrador cero
contiene 2,0 ml, mientras que el resto de
calibradores, viales B – F, contienen cada
uno 1,0 ml. Estable a 2–8°C durante 30
días después de su apertura.
TKTF1: 1 juego. TKTF2: 1 juego.
Los calibradores tienen valores lote
específicos de testosterona libre,
aproximadamente: 0, 0,55, 2,5, 9,0, 25 y
50 picogramos por mililitro (pg/ml);
equivalentemente: 0, 1,9, 8,7, 31, 87 y
173 picomoles por litro (pmol/l). Ver las
etiquetas de los viales para conocer los
valores exactos en pg/ml.
Materiales Requeridos pero no
suministrados
Contador Gamma compatible con los
tubos de 12x75 mm.
Vortex
Tubos de ensayo de polipropileno de
12×75 mm para su uso como tubos T y
NSB, disponibles en Siemens Healthcare
Diagnostics (Referencia: PPO)
Micropipetas: 50 µl y 1,0 ml.
Baño de incubación capaz de mantener
37°C
Rack de decantación – disponible en
Siemens Healthcare Diagnostics
(Referencia: FDR)
Papel gráfico Logit-log
Un control de inumoanálisis, a tres
niveles, basado en suero humano, que
contiene testosterona como uno de sus 25
constituyentes, disponible en Siemens
Healthcare Diagnostics (Referencia:
CON6).
Recogida de la muestra
El paciente no necesita estar en ayunas
así como tampoco cualquier otro tipo de
preparación. Recoger la sangre por
29
venopunción en tubos sin
anticoagulante, y separar el suero de las
células sanguíneas.
Como EDTA tendría un efecto significativo
en los resultados, no debe usarse como
anticoagulante.
Las muestras altamente lipémicas pueden
dar lugar a resultados de testosterona
libre erróneamente elevados. Se
recomienda el uso de una ultracentrífuga
para limpiar las muestras lipémicas.
Las muestras hemolizadas podrían indicar
una mala manipulación de la muestra
antes de ser recibida por el laboratorio; en
este caso, los resultados deben
interpretarse con precaución.
Los tubos para recoger sangre de
distintos fabricantes pueden producir
valores diferentes, dependiendo del
material del tubo y de los aditivos,
incluyendo barreras de gel o barreras
físicas, activadores de la coagulación y/o
anticoagulantes. El testosterona libre
Coat-A-Count no ha sido analizado con
todos los distintos tipos de tubos. Para
obtener detalles sobre los tipos tubos que
se han analizado, consulte la sección de
Tipos de Muestras Alternativos.
Tratamiento con danazol: El danazol, un
derivado sintético de la etisterona, se
utiliza en el tratamiento de la
endometriosis y la enfermedad
fibroquística de las mamas. Los efectos
secundarios androgénicos se han
atribuido a un aumento en la
disponibilidad de testosterona libre en
pacientes sometidos a tratamiento con
danazol. Por lo tanto, los pacientes que
tomen danazol presentarán un aumento
en las concentraciones de testosterona
libre.
Los estudios in vitro con el ensayo CoatA-Count testosterona libre también
muestran un incremento en la
concentración aparente de la testosterona
libre, en muestras cargadas con
31
danazol. Después de una dosis oral de
100 mg, las concentraciones más altas de
danazol en plasma informadas son de
hasta 199 ng/ml, resultando en un cambio
apreciable en las concentraciones de
testosterona libre, a pesar de la baja
32
reactividad cruzada informada. Consulte
el porcentaje de reactividad cruzada en la
Sección de “Especificidad”.
Debido a esto se deberán interpretar las
concentraciones de testosterona libre con
precaución en pacientes sometidos a
tratamiento con danazol.
Volumen requerido: 50 µl por tubo.
Conservación: 2 días a 2–8°C o 2 meses
(alicuotados) a –20°C.
Antes del ensayo, llevar todas las
muestras a temperatura ambiente (15–
28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si
es necesario, para evitar la repetición de
congelación y descongelación. No intentar
la descongelación de muestras
congeladas calentándolas en un baño de
agua.
Procedimiento del
Radioinmunoanálisis
Todos los componentes deben llevarse a
temperatura ambiente (15–28°C) antes de
su uso.
1
Tubos de ensayo: Marcar cuatro
tubos de ensayo de polipropileno (sin
recubrir) 12x75 mm. Tubos T (cuentas
23
totales) y NSB (unión no específica)
en duplicado.
Al ser característicamente bajo la
unión no específica en el ensayo
Coat-A-Count, los tubos NSB pueden
ser omitidos sin comprometer la
precisión y control de calidad del
ensayo.
Tubos recubiertos: Marcar doce tubos
recubiertos de anticuerpo frente a la
testosterona libre: A (máxima unión) y B
hasta F por duplicado. Marcar tubos
recubiertos de anticuerpo adicionales,
también en duplicado, para controles y
muestras de pacientes.
Calibrador
Aproximado
pg/ml
Aproximado
pmol/l
A (MB)
0
0
B
0,55
1,9
C
2,5
8,7
D
9,0
31
E
25
87
F
50
173
Nota: Los valores de los calibradores son lote
específicos. Ver las etiquetas de cada vial de
calibrador para conocer el valor en pg/ml.
2
Pipetear 50 µl del calibrador cero A en
los tubos NSB y A, y 50 µl del resto
de los calibradores, controles y
muestras de los pacientes en sus
correspondientes tubos. Pipetear
directamente en el fondo del tubo.
No intentar diluir las muestras que se
prevén con alta concentración en el
calibrador cero. (Como la dilución
rompe el equilibrio entre la
testosterona libre y unida, el sistema
de ensayo puede no mantener la
linealidad después de la dilución).
Es una buena práctica el uso de
micropipetas con punta desechables,
cambiando las puntas entre las
muestras, para evitar la
contaminación por arrastre.
3
125
Añadir 1,0 ml de I Testosterona
libre a todos los tubos. Mezclar en el
Vortex.
No se debe tardar más de 10 minutos
durante la dispensación del trazador.
Dejar los tubos T a un lado para su
contaje (paso 6); no requieren más
procesamiento posterior.
24
4
Incubar durante 4 horas a 37°C.
El rack debe cubrirse con Parafilm
para evitar la evaporación.
5
Decantar.
Eliminar toda la humedad visible para
mejorar la precisión. Decantar o
aspirar el contenido de todos los
tubos (excepto los tubos T) y dejar
escurrir durante 2 o 3 minutos.
Golpear los tubos contra papel
absorbente para eliminar las gotas
residuales.
6
Contar durante 1 minuto en un
contador gamma.
Cálculo de resultados
Para obtener resultados en términos de
concentración a partir de una
representación logit-log de la curva de
calibración, primero hay que calcular para
cada pareja de tubos las cuentas medias
por minuto corregidas con el NSB:
Cuentas netas = Media CPM menos Media NSB
CPM
Entonces, determinar la unión de cada
pareja de tubos como un porcentaje de la
unión máxima (MB), tomando las cuentas
corregidas con el NSB de los tubos A
como 100%:
Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas
MB netas) × 100
(El cálculo puede simplificarse omitiendo
la corrección de las uniones no
específicas; las muestras dentro del rango
de calibración van a dar virtualmente el
mismo resultado cuando el porcentaje de
unión es calculado directamente a partir
de la media de las CPM).
Usando papel gráfico logit-log, representar
el porcentaje de unión en el eje vertical
frente a la concentración en el eje
horizontal (logarítmico) para cada
calibrador no cero y dibujar la línea que
pase por esos puntos aproximadamente.
Los resultados de las muestras pueden
ser leídos en la curva por interpolación.
Es una buena práctica inspeccionar los
resultados para comprobar la
concordancia entre los replicados, y
realizar una gráfica de la curva de
calibración (aunque los cálculos se
realicen por ordenador) para ver la
transformación más apropiada a usar y las
posibles desviaciones en los puntos de
calibración. También, recomendamos
mantener un registro de los siguientes
parámetros de la reducción de datos:
T = Cuentas totales (como CPM)
%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / Cuentas
totales)
%MB = 100 × (Cuentas netas / Cuentas totales)
Y los cortes 20, 50 y 80 por ciento, donde
20% = Concentración al 20 Porciento de unión,
etc.
Otras aproximaciones, por ejemplo,
logística 4-parámetros, también son
acep`tables. Ver Dudley RA, et al.
“Guidelines for immunoassay data
reduction”. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Ejemplo: Sólo como ilustración, no se
puede utilizar para calcular resultados. Al
ser los valores de los calibradores loteespecíficos, las concentraciones
expresadas en la columna derecha no
pueden coincidir con los valores de los
calibradores suministrados en su envío.
(Ver tabla “Example Run”)
Control de Calidad
Se deben procesar de manera rutinaria al
menos dos niveles de controles (o pool de
sueros) con diferente concentración de
testosterona libre—baja y alta —.
Informar de los resultados de los
pacientes sólo si los resultados de los
controles para este ensayo están dentro
de los criterios de aceptabilidad
establecidos por su laboratorio.
Es una buena práctica de laboratorio
registrar para cada ensayo los números
de lote de los componentes usados, así
como las fechas en las que fueron
abiertos por primera vez y reconstituidos.
También recomendamos el uso de
gráficos diarios de los controles—como se
describe, por ejemplo, en Westgard JO, et
al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Las
muestras repetidas pueden servircomo
una herramienta de valor adicional para
monitorizar la precision interensayo, y que
las parejas de los tubos del control
pueden espaciarse a lo largo de la tanda
de ensayo para verificar la ausencia de
deriva significativa.
Valores esperados
Los valores de testosterona libre para
adultos sin disfunción gonadal aparente
están recogidos tabulados abajo por sexo
y edad. Las estadísticas muestras, como
era de esperar, un decaimiento gradual en
los niveles de testosterona libre en
función de la edad en los adultos. Se han
usado en este análisis resultados de
hombres y mujeres entre 20 y 80 años—
un total de 472 hombres y 113 mujeres —.
El grupo de referencia consistía en
voluntarios sanos en los que no se
sospechaba enfermedad gonadal o que
fue excluida por otros test de laboratorio.
Los datos (cedidos desinterasadamente
por los autores) provienen de su estudio
30
publicado sobre los valores de
referencia del ensayo Coat-A-Count Free
Testosterona assay.
Unidades de masa (pg/ml)
n
Media
Rango
central 95%
20 – 39
154
17,2
8,8 – 27
40 – 59
210
14,4
7,2 – 23
60 – 80
108
11,7
5,6 – 19
20 – 39
47
0,87
ND – 2,57
40 – 59
39
0,68
ND – 2,03
60 – 80
27
0,51
ND – 1,55
Edad (años)
Hombres
Mujeres
ND: no detectable
Unidades molares (pmol/l)
n
Media
Rango
central 95%
20 – 39
154
60
31 – 94
40 – 59
210
50
25 – 80
60 – 80
108
41
19 – 66
20 – 39
47
3,0
ND – 8,9
40 – 59
39
2,3
ND – 7,0
60 – 80
27
1,8
ND – 5,4
Edad (años)
Hombres
Mujeres
ND: no detectable
Obsérvese que los criterios de selección
pueden tener un impacto significativo en
la determinación de los rangos de
normalidad: en particular, se obtuvieron
30
rangos más amplios en dicho estudio
25
cuando se incluyeron en los datos
resultados de pacientes sometidos a
análisis de testosterona libre.
Considerar estos límites solo como una
guía. Cada laboratorio deberá establecer
sus propios intervalos de referencia.
Características analíticas
Las siguientes secciones contienen datos
representatives de las características del
kit Coat-A-Count Free Testosterone. Los
resultados se expresan en pg/ml.
Factor de Conversión:
Intervalo de calibración:
Approximadamente 0,55 – 50 pg/ml
(1,9 – 173 pmol/l). Los calibradores son
lote-específicos.
Sensibilidad analítica: 0,15 pg/ml.
Precisión: Las estadísticas fueron
calculadas en muestras procesadas por
duplicado en más de 160 ensayos
diferentes. (Véase la tabla "Precisión".)
Perfil de Precisión: La gráfica muestra el
perfil de precision con respecto a la dosis
en base a los CVs intraensayo (círculos
blancos) para doce muestras, calculado
por análisis de varianza de 34 tandas. La
línea que pasa aproximadamente por
estos puntos representa los CVs
intraensayo esperados par alas muestras
que se procesen por duplicado. Para más
información, los CVs interensayo
mostrados en la tabla "Precision" se
muestran como cuadrados negros (Ver
tabla “Precision Profile”)
Efecto deriva: Ninguno hasta
aproximadamente 200 tubos. (Véase la
tabla "End-of-Run Effect")
Efecto de la SHBG: Para investigar el
efecto de los niveles de la globulina
transportadora de hormonas sexuales
(niveles de SHBG) en el ensayo, un pool
de suero humano absorbido en charcoal
fue sobrecargado con SHBG hasta una
concentración de 400 microgramos por
mililitro, un nivel aproximadamente 1 000
veces superior a la normalidad. El suero
sobrecargado de SHBG al ser ensayado
con el kit Coat-A-Count Free
Testosterona, mostró un valor de
porcentaje de unión del 99% B/B0.
Como la absroción con charcoal elimina
testosterona del pool, debe tener
26
concentraciones cero de testosterone libre
(y total)—esto es, los valores del
porcentaje de unión serán cercanos al
100% B/B0—tanto antes como depués de
la sobrecarga. Los resultados muestran,
como se esperaba, que elensayo no está
influenciado con los niveles de SHBG.
Efecto de la Albúmina: Muestras
liofilizadas fueron reconstituidas con
soluciones acuosas que contenían 0, 1,0,
2,0 and 3,0 g/dl de albúmina sérica
humana absorbida en charcoal, y se
procesaron en paralelo. (Ver tabla "Effect
of Albumin")
Efecto de la absorción del Charcoal: Se
analizaron muestras de pacientes con el
kit Coat-A-Count Free Testosterona antes
y depués de abosroción con charcoal. Se
muestran las concentraciones de
testosterona libre (en pg/ml) antes de la
absorción con charcoal, y los valores del
porcentaje de unión (%B/B0) siguientes a
la absorción con charcoal. (Ver tabla
"Effect of Charcoal Absorption")
Los resultados demuestran que la
absorción con charcoal esencialmente
reduce el nivel aparente de testosterona
libre en las muestras de los pacientes,
analizadas con el kit Coat-A-Count, a
cero, esto es a un valor de porcentaje de
unión aproximado al 100% B/B0. Como la
absroción con charcoal elimina
testosterona conjuntamente con otros
esteroides y moléculas pequeñas del
suero de los pacientes, mientras que deja
moléculas más grandes como la
albúmina, SHBG y otras proteínas
transportadoras, el experimento confirma
que el kit Coat-A-Count Free Testosterona
no está influenciado por los niveles de
proteínas transportadoras.
Bilirrubina: La presencia de bilirrubina en
concentraciones hasta 200 mg/l no afecta
a los resultados, en lo concerniente a
precisión del ensayo.
Hemólisis: La presencia de eritrocitos
hasta concentraciones de 30 µl/ml no
tiene efecto en los resultados, en lo
concerniente a la precisión del ensayo.
Tipo de Muestra Alternativa: para
evaluar el efecto de los diferentes tipos de
muestras alternativos, se recogió sangre
de 49 voluntarios en tubos normales,
tubos con Heparina y tubos con EDTA.
Los rangos absolutos observados para
voluntarios masculinos y femeninos están
recogidos en la siguiente tabla.
Intervalo
absoluto
19 Voluntarios
Masculinos
pg/ml
30 Voluntarios
Femeninos
pg/ml
Suero
9 – 47
0,7 – 3,6
Heparina
8 – 45
0,9 – 3,8
EDTA
13 – 79
1,3 – 5,7
Los resultados combinados de estas 49
muestras – añadiendo una muestra
adicional – cuando se sometieron a
análisis de regresión lineal dieron lugar
a las siguientes estad´siticas.
(Heparina) = 0,95 (Suero) + 0,4 pg/ml
r = 0,996
(EDTA) = 1,48 (Suero) + 1,1 pg/ml
r = 0,957
Medias:
11,9 pg/ml (Heparina)
12,2 pg/ml (Suero)
19,2 pg/ml (EDTA)
Los resultados indican que el plasma
heparinizado genera prácticamente los
mismos resultados que el suero, mientras
que el plasma con EDTA genera valores
más elevados.
Combinado (85)
(TKTF) = 0,55 (Diálisis) + 3,4 pg/ml
r = 0,87
Medias:
15,4 pg/ml (TKTF)
21,8 pg/ml (Diálisis)
El ensayo Coat-A-Count Free
Testosterone también se compare con el
ensayo Coat-A-Count Total Testosterone
en 109 muestras séricas (51 hombres y
58 mujeres). Por regresión lineal:
Hombres (51)
(Libre) = 4,7 (Total) + 0,7
r = 0,984
Medias:
23,6 pg/ml (Libre)
4,84 ng/ml (Total)
Mujeres (58)
(Libre) = 6,1 (Total) + 0,6
r = 0,978
Medias:
3,9 pg/ml (Libre)
0,54 ng/ml (Total)
Combinado (109)
(Libre) = 4,6 (Total) + 1,2
r = 0,992
Especificidad: El anticuerpo frente a la
testosterona libre es altamente específico
para la testosterona, con una reactividad
cruzada extremadamente baja con otros
esteroides naturales o medicamentos que
puedan estar presentes en el suero del
paciente. (Véase la tabla "Especificidad".)
Medias:
13,1 pg/ml (Libre)
2,6 ng/ml (Total)
Comparación de los métodos: El
ensayo fué comparado con el método
convencional de diálisis de equilibrio en
85 muestras séricas (43 hombres y 42
mujeres). Por regresión lineal:
Asistencia técnica
Póngase en contacto con el distribuidor
nacional.
El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está certificado por la ISO
13485:2003.
Hombres (43)
r = 0,67
Medias:
26,3 pg/ml (TKTF)
Mujeres (42)
r = 0,75
Medias:
4,3 pg/ml (TKTF)
Français
Testostérone Libre Coat-ACount
Domaine d'utilisation : Testostérone
libre Coat-A-Count est un
radioimmunodosage à l'iode 125 en phase
solide destiné à la mesure quantitative de
la testostérone libre dans le sérum. Il est
strictement réservé à un usage diagnostic
in vitro et constitue une aide au diagnostic
27
clinique et au suivi de l'hirsutisme dû à
une hypersécrétion d'androgènes.
Référence catalogue : TKTF1 (100 tubes),
TKTF2 (200 tubes)
Le coffret de 100 tubes contient
moins de 4 microcuries
(148 kilobecquerels) de
testostérone analogue réactive marquée à
l'iode 125. Le coffret de 200 tubes contient
moins de 8 microcuries
(296 kilobecquerels).
Introduction
La testostérone ne circule que presque
entièrement liée à des protéines de
transport: normalement, moins de 1% est
libre. La principale protéine de transport
de la testostérone est connue pour être la
SHBG (sex hormone binding globulin) ou
la TEBG (testosterone-estradiol binding
globulin), puisque cette dernière se lie non
seulement à la testostérone mais
également à l'estradiol (et à la
dihydrotestostérone). Albumine et cortisol
binding globulin (CBG) sont les autres
protéines de transport de la testostérone.
Pour 3 raisons, la SHBG est la protéine de
transport la plus importante: elle
transporte, au moins chez les femmes, un
pourcentage plus élevé de testostérone
en circulation que l'albumine ou la CBG.
De plus, elle se lie à la testostérone avec
une affinité beaucoup plus élevée que ne
le font les deux autres protéines de
transport (La testostérone liée à
l' albumine et à la CBG est reconnue
comme une testostérone « faiblement
liée »). Finalement, la SHBG a une
réaction non liée à l'albumine, dans la
mesure où le taux de SHBG est sensible
aux modifications du rapport entre les
estrogènes et les androgènes circulants.
La SHBG joue ainsi un rôle plus important
dans la détermination du taux de
testostérone libre en circulation.
Lors d'une grossesse, les taux de SHBG
montrent une augmentation progressive
qui reflète l'augmentation des taux
d'estradiol. Bien que le taux de
testostérone totale montre également une
certaine augmentation durant la
grossesse, l'augmentation en estradiol, et
par conséquent celle en SHBG, sont
beaucoup plus impressionnantes. Le
résultat net est une diminution de la
testostérone libre qui est un pourcentage
28
de la testostérone totale. Les femmes
sous contraceptifs oraux ont des taux de
SHBG augmentés, au moins si elles
prennent des fortes doses de préparations
d'éthinyl estradiol. A l'inverse,
l'administration d'androgènes chez les
garçons prépubères, ou l'élévation de la
testostérone endogène par une
stimulation par l'HCG, induisent une
diminution significative du taux de SHBG.
L'obésité est également associée à une
baisse du taux de SHBG.
Toutes choses étant égales par ailleurs, la
concentration de testostérone libre dans la
circulation augmente si la testostérone (T)
augmente ou si le taux de SHBG diminue.
Le rapport T/SHBG, c'est à dire
testostérone totale sur la concentration ou
la capacité de liaison de SHBG, est utilisé
comme une approche de la concentration
de testostérone libre dans la circulation.
Le rapport T/SHBG est parfois appelé
Index de Testostérone libre (TFI).
L'Index de Testostérone libre est souvent
augmenté dans l'acné sévère, l'alopécie
mâle androgénique, l'hirsutisme et
d'autres situations. Un taux bas de SHBG,
souvent associé avec un taux normal de
testostérone totale, est un profil habituel
dans ces conditions. Une augmentation
de la production de testostérone est
typiquement due à une diminution du taux
de SHBG. Ceci stimule le passage
cellulaire et le métabolisme de la
testostérone, en augmentant la
disponibilité de la forme libre. Le résultat
est que le taux de testostérone totale est
souvent normal, car le taux de production
augmente et est compensé par une
augmentation de la clairance.
Les dosages de testostérone totale sont
traditionnellement utilisés pour le
dépistage de l'hirsutisme. Selon le
mécanisme décrit ci-dessus, il est logique
d'observer des taux de testostérone libre,
mesurés directement ou approchés par le
rapport T/SHBG, mieux corrélés à
l' hirsutisme. Quelques experts, dont
Paulson, ont observé que la testostérone
libre a une supériorité accablante sur la
testostérone totale dans le dépistage de
l'hirsutisme. Dans cette étude sur 32
femmes hirsutes, seulement 44 % ont des
taux de testostérone totale élevés, alors
que les 32 ont des taux de testostérone
libre élevés. Toutes les études n'ont pas
confirmé ce succès. Cependant sur la
base d'une revue d'études faite par Wu, il
apparaît que la testostérone libre peut être
parfois supérieure à la testostérone totale
dans ce contexte. (Les diverses
conclusions pourraient être dues à des
différences de méthodologie et de
sélection des patients.)
Principe du test
Le dosage Coat-A-Count Testostérone
libre est une méthode
radioimmunologique qui repose sur la
compétition au cours d'une incubation
donnée entre l'analogue de la
Testostérone marquée à l'Iode 125 et la
Testostérone libre contenue dans
l'échantillon du patient, vis-à-vis des sites
de l'anticorps spécifique de la testostérone
immobilisé sur la paroi des tubes en
polypropylène. On élimine le surnageant
et on sépare ainsi la fraction radioactive
liée à l'anticorps. On compte le tube dans
un compteur gamma, la radioactivité étant
inversement proportionnelle à la
concentration de Testostérone libre dans
l'échantillon.
La méthode ne modifie pas l'équilibre
entre la Testostérone libre et celle liée aux
protéines dans l'échantillon du patient.
Elle utilise un traceur, qui ne se lie pas
aux protéines de transport des hormones
stéroïdes, et un antisérum possédant,
pour la Testostérone, une affinité
légèrement plus faible que pour la
protéine de transport la plus importante :
la SHBG (Sex Hormone Binding Globulin).
De plus, le dosage est réalisé dans des
conditions de température, de pH et de
force ionique physiologiques.
La technique Coat-A-Count Testostérone
libre est une méthode directe. Les
résultats ne sont pas déterminés à partir
de la concentration totale de
Testostérone, de SHBG ou d'autres
paramètres mais ils sont calculés à partir
d'une courbe standard établie à l'aide de
concentrations en Testostérone libre.
Cette méthode diffère donc des méthodes
conventionnelles de dialyse à l'équilibre et
de celles fondées sur la détermination de
l'index de Testostérone libre (TFI). C'est
une méthode en une seule étape, ne
nécessitant ni pré-incubation ni isolement
préalable de la fraction libre par dialyse,
filtration ou chromatographie sur colonne.
Elle présente également les
caractéristiques suivantes :
Temps total d'incubation : 4 heures.
Activité totale en début de marquage :
environ 60 000 cpm
Réactifs à distribuer : 1
Précautions d'emploi
Réservé à un usage diagnostique in vitro.
Réactifs : Conserver à +2–8°C dans un
réfrigérateur autorisé à recevoir du
matériel radioactif. Éliminer les déchets
conformément aux lois en vigueur.
Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur
date d'expiration.
Certains composants fournis avec ce
coffret peuvent contenir des agents
humains et/ou d'autres éléments
potentiellement infectieux qui nécessitent
certaines précautions.
Respecter les précautions d'emploi et
manipuler tous les composants du coffret
comme des produits potentiellement
infectieux. Les réactifs dérivés de produits
humains et utilisés dans ce coffret ont subi
un test sérologique pour la Syphilis et des
tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-VHC et pour l'antigène de
surface de l'hépatite B, qui se sont tous
avérés négatifs.
De l'azide de sodium à des concentrations
inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme
conservateur ; lors de l'élimination,
l'évacuer avec de grandes quantités d'eau
pour éviter une accumulation d'azides
métalliques explosifs dans les
canalisations.
Eau : utiliser de l'eau distillée ou
désionisée.
Radioactivité
Ce coffret de réactif est reservé à l'usage
in vitro (Autorisation DGSNR).
Règles de base de protection contre les
rayonnements ionisants et précautions
d'emploi.
Ce produit radioactif ne peut être reçu,
acheté, détenu ou utilisé que par des
personnes autorisées à cette fin et dans
des laboratoires dotés de cette
autorisation. Cette solution ne peut en
aucun cas être administrée à l'homme ou
aux animaux. Respecter impérativement
les dates de péremption indiquées sur
l'emballage extérieur et sur les étiquettes
29
des différents réactifs du coffret. Tous les
réactifs, dont les tubes revêtus
d'anticorps, doivent être conservés à
+ 4/+ 8° C dans leur conditionnement
d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la
possession, l'utilisation et l'échange de
matières radioactives sont soumis aux
réglementations en vigueur dans le pays
de l'utilisateur. Les règles de base de
protection contre les rayonnements
ionisants doivent être respectées selon
des procédures en vigueur. Ne pas
pipeter des solutions radioactives avec la
bouche. Eviter le contact direct avec la
peau ou les muqueuses de tout produit
radioactif en utilisant des blouses et gants
de protection. Toute manipulation de
matières radioactives se fera dans un
local ad hoc éloigné de tout passage. Les
produits radioactifs seront stockés dans
leur conditionnement d'origine dans un
local approprié. Un cahier de réception et
de stockage de produits radioactifs sera
tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la
verrerie qui ont été contaminés doivent
être éliminés au fur et à mesure afin
d'éviter une contamination croisée de
plusieurs isotopes. Chaque contamination
ou perte de substance radioactive devra
être réglée selon les procédures établies.
Toute mise aux déchets de matière
radioactive se fera en accord avec les
réglementations en vigueur. Ne pas
manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer
des cosmétiques dans les laboratoires où
des produits radioactifs sont utilisés. Les
réactifs radioactifs ne peuvent être vendus
qu'à des personnes habilitées à manipuler
des substances radioactives.
Materiel Fourni : Préparation
Initiale
Les composants fournis avec ce coffret ne
sont pas interchangeables avec ceux du
coffret Testostérone Totale Coat-A-Count
qui n'est dédié qu'à la mesure de la
testostérone totale.
Tubes revêtus d'anticorps anti
Testostérone libre (TTF1)
Tubes en polypropylène revêtus
d'anticorps de lapin anti testostérone libre,
conditionnés dans des sacs hermétiques.
Les conserver réfrigérés et protégés de
l'humidité, bien refermer les sachets après
utilisation. Stable à +2–8°C jusqu'à la date
d'expiration notée sur le sachet. Couleur:
30
bleu vert.
TKTF1 : 100 tubes. TKTF2 : 200 tubes.
125
Traceur I Testostérone libre (TTF2)
105 ml de testostérone analogue marquée
125
à l'I avec de l'azide de sodium comme
conservateur. Stable à +2–8°C pendant
30 jours après ouverture, ou jusqu'à la
date d'expiration notée sur le flacon.
TKTF1 : 1 flacon. TKTF2 : 2 flacons.
Standards Testostérone libre
(TFC3–8)
Six flacons de standards Testostérone
libre, prêts à l'emploi, dans du sérum
humain prétraité avec conservateurs
(azide de sodium et gentamicine). Le
flacon A de standard zéro contient 2 ml,
alors que les autres flacons de standards,
de B à F, contiennent 1 ml chacun. Stable
à +2–8°C pendant 30 jours après
ouverture.
TKTF1 : 1 jeu. TKTF2 : 1 jeu.
Les standards Testostérone libre ont des
valeurs propres à leur lot,
approximativement 0, 0.55, 2.5, 9, 25 et
50 picogrammes par millilitres (pg/ml);
équivalant à environ 0, 1.9, 8.7, 31, 87 et
173 picomoles par litre (pmol/l). Se
reporter à l'étiquette du flacon pour les
valeurs exactes en pg/ml.
Matériel requis mais non fourni
Compteur Gamma—permettant l'utilisation
de tubes standards 12x75 mm
Agitateur de type Vortex
Tubes secs en polypropylène 12x75
mm—à utiliser comme les tubes T et NSB,
disponibles chez Siemens Healthcare
Diagnostics (Référence catalogue : PPO)
Micropipettes : 50 µl et 1 ml.
Bain-marie pouvant maintenir une
température d'incubation de 37°C
Un portoir de décantation—disponible
chez Siemens Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : FDR)
Papier graphe Logit-log
Un contrôle, à base de sérum humain, à
trois niveaux de concentration, contenant
de la testostérone (parmi l'un des plus de
25 constituants dosés), est disponible
chez Siemens Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : CON6).
Recueil des échantillons
Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et
aucune préparation spéciale n'est requise.
29
Prélever le sang par ponction veineuse
sur tubes secs (sans anticoagulant), et
séparer le sérum des cellules.
L'EDTA étant susceptible d'avoir un
impact significatif sur les résultats, il ne
devrait pas être utilisé comme anticoagulant.
Les échantillons de sérum lipémiques
peuvent entraîner des résultats de
testostérone libre faussement élevés.
L'utilisation d'une ultracentrifugeuse est
recommandé pour la clarification des
échantillons lipémiques
Des échantillons hémolysés peuvent être
révélateurs d'une préparation inadéquate
du prélèvement avant son envoi au
laboratoire ; il faudra donc interpréter les
résultats avec prudence.
Des tubes pour prélèvements sanguins
provenant de fabricants différents peuvent
donner des résultats différents, selon les
matériaux et additifs utilisés, y compris
gels ou barrières physiques, activateurs
de la coagulation et/ou anticoagulants. Le
coffret Testostérone libre Coat-A-Count
n'a pas été testé sur tous les types de
tubes possibles. Veuillez consulter le
chapitre intitulé Autres Types
d'Échantillons pour plus de
renseignements sur les tubes qui ont été
évalués.
Traitement par Danazol : Le Danazol,
dérivé d'un stéroïde de synthèse
l'éthistérone, est utilisé pour le traitement
de l'endométriose et dans les maladies
fibrokystiques du sein. Les effets
secondaires androgéniques ont été
attribués à la présence augmentée de
testostérone libre chez les patients sous
traitement par Danazol. Ainsi, les patients
prenant du Danazol auront des
concentrations augmentées de
testostérone libre.
Des études in vitro avec le dosage CoatA-Count Testostérone Libre montre
également une augmentation apparente
des concentrations de testostérone libre
dans les échantillons surchargés en
31
Danazol. La concentration plasmatique
maximale en Danazol après absorption
orale d'une dose de 100 mg est reportée
comme étant supérieure à 199 ng/ml,
conduisant à une modification nette des
concentrations de testostérone libre
malgré la faible réaction croisée
32
rapportée. Se reporter au chapitre
Spécificité pour les pourcentages de
réactions-croisées.
Il est donc recommandé une grande
attention lors de l'interprétation des taux
de testostérone libre chez les patients
sous traitement par Danazol.
Volume nécessaire : 50 µl par tube.
Conservation : 2 jours à +2–8°C ou
2 mois (aliquotés) à –20°C.
Avant le dosage, laisser les échantillons
revenir à température ambiante (15–
28°C), mélanger doucement par rotations
ou retournement. Aliquoter, si nécessaire,
afin d'éviter de répéter les cycles
congélation / décongélation. Ne pas tenter
de décongeler les spécimens congelés à
l'aide d'un bain marie.
Protocole de dosage
Tous les composants doivent être à
température ambiante avant leur utilisation
(15–28°C).
1
Tubes secs : Etiqueter deux séries
de tubes (non revêtus) en
polypropylène 12x75 mm tubes T et
NSB (Non Specific Binding) en
duplicate.
La valeur du NSB dans la technique
Coat-A-Count étant très faible, elle
peut être négligée sans que la
précision ou le contrôle de qualité ne
soient modifiés.
Tubes revêtus d'anticorps : Etiqueter 12
tubes revêtus d'anticorps anti
Testostérone libre de A (liaison maximale)
et B jusqu'à F en duplicate. Etiqueter une
série de tubes en double pour les
échantillons de patients et les contrôles.
Standard
Environ
pg/ml
Environ
pmol/l
A (B0)
0
0
B
0,55
1,9
C
2,5
8,7
D
9,0
31
E
25
87
F
50
173
Note: Les concentrations des standards sont
spécifiques d'un lot. Se reporter à l'étiquette du
31
flacon pour les valeurs exactes en pg/ml.
2
Pipeter 50 µl de standard zéro A dans
les tubes du LNS, dans les tubes A, et
50 µl de chacun des autres standards,
contrôles et échantillons de patient
dans les tubes correspondants.
Pipeter directement au fond du
tube.
Ne pas diluer avec le standard zéro
les échantillons de patients suspectés
de contenir de fortes concentrations.
(Puisque la dilution déplace l'équilibre
entre la testostérone libre et la
testostérone liée, le système de
dosage ne reste pas linéaire au cours
de la dilution.)
Il est bon d'utiliser des embouts
jetables de micropipettes, de changer
d'embout entre les échantillons de
manière à éviter toute contamination.
3
Ajouter 1 ml de Testostérone libre
marquée à l'Iode 125 dans chaque
tube. Agiter au Vortex.
Le temps d'addition du traceur ne doit
pas dépasser 10 minutes. Les tubes T
peuvent être mis de côté jusqu'au
comptage (étape 6); ils n'ont pas
d'autre traitement.
4
Laisser incuber pendant 4 heures à
37°C.
Le portoir doit être recouvert d'un film
protecteur afin d'éviter toute
évaporation.
5
Décanter complétement.
Eliminer toute trace d'humidité pour
améliorer la précision du dosage. A
l'aide d'un portoir de décantation,
décanter ou aspirer le contenu de tous
les tubes (excepté les tubes T) et
laisser les tubes retournés pendant 2
ou 3 minutes. Puis appliquer les
fortement sur du papier absorbant afin
d'éliminer les gouttelettes résiduelles.
6
Compter 1 minute dans un compteur
gamma.
Calcul des Résultats
Afin d'obtenir des résultats en
concentrations à partir d'une
représentation logit-log de la courbe de
calibration, calculer pour chaque doublet
de tubes les coups corrigés: moyenne
cpm-moyenne des cpm du LNS :
32
Coups corrigés = Moyenne CPM moins
Moyenne LNS CPM
Puis déterminer pour chaque doublet la
capacité de liaison en pourcentage de
liaison maximale (MB), corrigée des cpm
dus au NSB des tubes A tubes considérés
à 100%:
% liaison = (Cpm corrigés / Cpm corrigés B0)
× 100
(Le calcul peut être simplifié en négligeant
la correction due au LNS. Les échantillons
dans la gamme de calibration donnent des
résultats pratiquement identiques quand la
capacité de liaison est calculée
directement à partir de la moyenne des
CPM.)
En utilisant un papier logit-log, on porte en
ordonnée les pourcentages de liaison en
fonction des concentrations des standards
qui ne sont pas à zero, en abscisse. On
trace une ligne droite passant
approximativement par ces points. Les
concentrations en Testostérone libre des
échantillons inconnus sont déterminées
par interpolation sur la courbe standard.
Il est bon de vérifier les doublets et de
construire une représentation graphique
de la courbe de calibration (même si celleci est faite par ordinateur) avec les
différentes valeurs de façon à visualiser le
meilleur tracé et c'est une façon de
détecter les points deviants. Nous
recommandons aussi de suivre les
paramètres suivants :
T = Activité totale (cpm)
%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS / pm
Totaux)
%B0 = 100 × (cpm corrigés / cpm totaux)
Et les intercepts à 20, 50 et 80 % avec
20% = Concentration à 20 % de liaison, etc.
Note : d'autres approches sont possibles
comme l'intégration de paramètres 4-p
logistique. Se rapporter à Dudley RA, et
al. Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Exemple de série: A titre d'exemple
uniquement, et non pour calculer des
résultats provenant d'une autre série.
Comme les valeurs des standards sont
lot-dépendantes, les concentrations
indiquées peuvent être différentes de
celles de vos livraisons. (Se rapporter au
tableau « Example Run ».)
Contrôle de Qualité
Unités (pg/ml)
n
Médiane
Domaine
Centré à
95%
20 – 39
154
17,2
8,8 – 27
40 – 59
210
14,4
7,2 – 23
60 – 80
108
11,7
5,6 – 19
20 – 39
47
0,87
ND – 2,57
40 – 59
39
0,68
ND – 2,03
60 – 80
27
0,51
ND – 1,55
Age
(années)
Les contrôles (ou pools de sérums) avec
au moins deux taux de concentration de
testostérone libre – haut et bas - doivent
être dosés en routine comme des
échantillons inconnus.
Hommes
Les résultats de patient ne doivent être
validés que si les résultats des contrôles
correspondent aux critères d'acceptation
établis par votre laboratoire.
Femmes
Il est bon d'enregistrer pour chaque
dosage les numéros de lots des
composants utilisés ainsi que la date à
laquelle ils ont été reconstitués ou ouverts.
Nous recommandons également de noter
jour après jour les résultats des
contrôles—comme décrit par exemple
dans Westgard JO, et al. A multi-rule chart
for quality control. Clin Chem
1981;27:493-501. Noter qu'un redosage
d'échantillon peut être précieux pour
suivre la précision inter essai, et que les
doublets de tubes contrôle peuvent être
espacés de façon à vérifier l'absence de
dérive significative.
Valeurs de référence
Les valeurs de testostérone libre chez les
adultes sans dysfonctionnement
gonadique apparent ou suspecté sont
résumés ci-dessous par sexe et âge. Les
statistiques montrent, de façon attendue,
une diminution progressive des taux de
testostérone libre en fonction de l'âge
chez les adultes. Des résultats d'hommes
et femmes de 20 à 80 ans—au total 472
hommes et 113 femmes—ont été utilisés.
Le groupe de référence comprend des
volontaires sains et des sujets chez qui
une atteinte gonadique n'était pas
suspectée ou avait été écartée par des
examens de laboratoire. Cet ensemble
donné (communiqué par les auteurs) vient
30
d'une étude publiée sur les valeurs de
référence pour le Coat-A-Count
Testostérone libre.
ND: non détectable
Unités (pmol/l)
n
Médiane
Domaine
Centré à
95%
20 – 39
154
60
31 – 94
40 – 59
210
50
25 – 80
60 – 80
108
41
19 – 66
20 – 39
47
3,0
ND – 8,9
40 – 59
39
2,3
ND – 7,0
60 – 80
27
1,8
ND – 5,4
Age
(années)
Hommes
Femmes
ND: non détectable
Noter que les critères de sélection
peuvent avoir un impact significatif sur la
détermination des intervalles de référence:
en particulier, des intervalles plus larges
ont été obtenus dans les études
30
publiées lorsque le recrutement était
étendu afin d'inclure des patients ayant
été soumis à un dosage de testostérone
libre.
Utiliser ces valeurs à titre indicatif
uniquement. Chaque laboratoire devrait
établir ses propres valeurs de référence.
Performances du test
Le chapitre suivant contient des données
représentatives des performances du
coffret Coat-A-Count Testostérone libre.
Les résultats sont donnés en pg/ml.
Facteur de conversion :
Domaine de mesure :
Approximativement 0,55 – 50 pg/ml
33
(1,9 – 173 pmol/l). Les calibrateurs sont
lot-dépendants.
Sensibilité analytique : 0,15 pg/ml.
Précision : Les valeurs ont été calculées
pour des échantillons à partir de résultats
de doublets sur plus de 160 dosages
différents. (Voir le tableau « Précision ».)
Profil de Précision : Le graphe montre
un profil de précision pour le test basé sur
les CVs intra série (cercles) pour 12
échantillons, chaque point a été calculaté
par analyse de variance à partir de 34
séries. La courbe, qui passe
approximativement par tous ces points,
représente le CV intra série attendu pour
des échantillons testés en double. Pour
information les CVs inter série indiqués
dans le tableau « Précision » sont
représentés par des carrés pleins. (Se
reporter au graphe « Precision Profile ».)
Effet de la position des tubes : Aucun
jusqu'à 200 tubes. (Se reporter au tableau
« End-of-Run Effect ».)
Effet de la SHBG : Afin de déterminer
l'effet sur le dosage de la SHBG, on a
ajouté à un pool de sérum humain
adsorbé sur du charbon, une solution à
400 µg/ml de SHBG (concentration 1 000
fois supérieure à la normale). Le pool ainsi
traité, dosé par la technique Coat-A-Count
Testostérone libre a donné la valeur de
99 % pour B/Bo.
Le but de l'adsorption sur le charbon étant
de soustraire la Testostérone du pool de
sérums, les concentrations de
testostérone libre (et totale) doivent être
nulles et les valeurs du pourcentage B/Bo
avant et après addition de la SHBG
doivent être proches de 100 %. C'est ce
que démontrent les résultats : il n'y a
aucune influence du taux de la SHBG sur
le dosage.
Albumine : Des échantillons lyophilisés
ont éte reconstitués avec des solutions
aqueuses contenant 0, 1, 2 et 3 g/dl de
sérum albumine humaine adsorbée sur du
charbon et dosés en parallèle. (Se
rapporter au tableau « Effect of Albumin
».)
Effet de l'adsorption sur charbon : Des
échantillons de patients ont été dosés par
la méthode Coat-A-Count Testostérone
libre avant et après adsorption sur
charbon. La concentration en
Testostérone libre (en pg/ml) avant
34
adsorption sur charbon, et les valeurs du
pourcentage de liaison (%B/Bo) après
adsorption sur charbon sont indiquées
dans le tableau. (Se rapporter au tableau
« Effect of Charcoal Absorption ».)
Les résultats montrent que l'adsorption sur
charbon abaisse le taux de Testostérone
libre des échantillons de patients, mesurés
par Coat-A-Count Testostérone libre
jusqu'à zéro, soit des pourcentages B/Bo
proches de 100 %. L'adsorption par le
charbon a pour but d'éliminer des
échantillons sériques la Testostérone ainsi
que d'autres stéroïdes et petites
molécules, en conservant les grosses
molécules telles que l'albumine, la SHBG
et autres protéines de liaison. Cette
expérience confirme donc que la
concentration des protéines de
« transport » de la Testostérone libre n'a
aucune influence sur le dosage.
Bilirubine : La présence de bilirubine à
des concentration allant jusqu'à 200 mg/l
n'a aucun effet sur les résultats ni sur la
précision du dosage.
Hémolyse : La présence d'hémoglobine
jusqu'à une concentration de 30 µl/ml, n'a
aucun effet sur les résultats de précision
du dosage.
Autres types d'échantillons : pour
estimer l'effet de l'utilisation de différents
type d'échantillons, 49 volontaires ont été
prélevés sur tubes secs, héparinés et sur
tubes EDTA. Les valeurs absolues
observées chez les hommes et les
femmes volontaires sont reportées dans le
tableau ci-dessous.
Domaine
absolu
19 Hommes
volontaires
pg/ml
30 Femmes
volontaires
pg/ml
Sérum
9 – 47
0,7 – 3,6
Hépariné
8 – 45
0,9 – 3,8
EDTA
13 – 79
1,3 – 5,7
Les résultats combinés de ces 49
échantillons—plus un supplémentaire—
ont donné les statistiques suivantes lors
d'un traitement par test de régression
linéaire.
(Hépariné) = 0,95 (Sérum) + 0,4 pg/ml
r = 0,996
(EDTA) = 1,48 (Sérum) + 1,1 pg/ml
r = 0,957
Moyennes :
11,9 pg/ml (Hépariné)
12,2 pg/ml (Sérum)
19,2 pg/ml (EDTA)
Les résultats démontrent que le plasma
hépariné donne pratiquement les mêmes
résultats que le sérum alors que le plasma
EDTA donne des valeurs plus élevées.
Spécificité : L'anticorps anti testostérone
libre est hautement spécifique de la
testostérone et a une réaction croisée très
faible avec les autres stéroïdes courants
ou médicaments qui peuvent être présents
dans l'échantillon du patient. (se reporter
au tableau « Specificity ».)
Comparaison de méthodes : Le dosage
a été comparé à une méthode de dialyse
à l'équilibre sur 85 échantillons de sérum
(43 hommes et 42 femmes). Par
régression linéaire :
Hommes (43)
Moyennes :
3,9 pg/ml (Libre)
0,54 ng/ml (Total)
Ensemble (109)
(Libre) = 4,6 (Total) + 1,2
r = 0,992
Moyennes :
13,1 pg/ml (Libre)
2,6 ng/ml (Total)
Assistance technique
Contacter votre distributeur national.
Le Système Qualité de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.
Italiano
r = 0,67
Moyennes :
26,3 pg/ml (TKTF)
Femmes (42)
r = 0,75
Moyennes :
4,3 pg/ml (TKTF)
4,1 pg/ml (Dialysis)
Ensemble (85)
r = 0,87
Moyennes :
15,4 pg/ml (TKTF)
La procédure Coat-A-Count Testostérone
libre a été également comparée à un
dosage de la Testostérone totale —
Coat-A-Count Testostérone Totale—sur
109 échantillons de sérum (51 hommes et
58 femmes). Par régression linéaire :
Hommes (51)
(Libre) = 4,7 (Total) + 0,7
r = 0,984
Moyennes :
23,6 pg/ml (Libre)
4,84 ng/ml (Total)
Femmes (58)
(Libre) = 6,1 (Total) + 0,6
r = 0,978
Coat-A-Count Testosterone
Libero
Uso: Il dosaggio Coat-A-Count
Testosterone Libero è un dosaggio
125
radioimmunologico marcato con I in
fase solida per la determinazione
quantitativa del testosterone libero nel
siero. A solo uso diagnostico in vitro quale
ausilio nella diagnosi clinica e nella
gestione dell'irsutismo dovuto ad
iperandrogenismo.
Codice:TKTF1 (100 provette), TKTF2
(200 provette)
Il kit a 100 determinazioni
contiene meno di 4 microcurie
(148 kilobecquerel) di analogo del
125
testosterone marcato con I ; il kit da 200
determinazioni contiene meno di 8
microcurie (296 kilobecquerel).
Riassunto e Spiegazione del
Test
Il Testosterone circola quasi interamente
legato alle proteine di trasporto:
normalmente meno dell'1% è libero. La
proteina principale di trasporto per il
testosterone è nota come globulina
legante gli ormoni sessuali (SHBG) o
globulina legante il testosterone-estradiolo
(TeBG), poiché si lega non solo al
testosterone, ma anche all'estradiolo (ed
al diidrotestosterone). Le globuline leganti
35
l'albumina ed il cortisolo (CBG) sono le
altre proteina di trasporto del testosterone.
Per tre ragioni, l'SHBG è la più importante
di queste proteine di trasporto. Porta,
almeno nelle donne, una percentuale più
elevata di testosterone in circolo di quanto
non facciano sia l'albumina che la CBG.
Inoltre, si lega al testosterone con
un'affinità molto più elevata di quanto non
facciano le altre due proteine di trasporto.
(Il testosterone legato all'albumina ed alla
CBG è noto come testosterone a “legame
debole”). Infine, l'SHBG ha una
rispondenza, non associata all'albumina,
dal momento che il livello di SHBG è
sensibile ai cambiamenti in rapporto agli
estrogeni circolanti verso gli androgeni
circolanti. L'SHBG gioca un ruolo
preponderante nella determinazione del
livello di testosterone libero in circolo.
In gravidanza, i livelli di SHBG presentano
un innalzamento progressivo che
rispecchia l'incremento dei livelli di
estradiolo. Benchè il livello di testosterone
totale presenti anche degli incrementi
durante la gravidanza, l'aumento
dell'estradiolo, e quindi dell'SHBG è più
drammatico. Il risultato netto è un
decremento del testosterone libero sulla
percentuale di testosterone totale. Donne
che assumono contraccettivi orali
presentano in maniera analoga un
incremento dei livelli di SHBG, almeno nei
casi in cui assumano dosi elevate di
preparati a base di etinil estradiolo.
Diversamente, la somministrazione di
androgeni a fanciulli prepubertà, o
l'aumento di testosterone endogeno
attraverso stimolazione con HCG, provoca
un decremento significativo nei livelli di
SHBG. L'obesità è anch'essa associata ad
un decremento del livello di SHBG.
Se le altre condizioni rimangono immutate,
ci si attende che la concentrazione di
testosterone libero in circolo aumenti se i
livelli di testosterone (T) aumentano o se il
livello di SHBG diminuisce. Il rapporto
T/SHBG, cioé il rapporto tra testosterone
totale a (la concentrazione o la capacità
legante dell') SHBG, serve come linee
guida sommarie per la concentrazione di
testosterone libero in circolo. Il rapporto
T/SHBG viene anche indicato come Indice
di Testosterone Libero (TFI).
L'Indice di Testosterone Libero spesso
subisce un aumento nelle forme gravi di
36
acne, nell'alopecia androgenica maschile
(calvizie), nell'irsutismo ed in altre
patologie. In questi casi è tipicamente
riscontrabile un livello basso di SHBG,
spesso in combinazione con un livello
normale di testosterone. Un aumento nella
produzione di testosterone induce
tipicamente un decremento nel livello di
SHBG. Ciò stimola l'uptake cellulare ed il
metabolismo del testosterone, rendendolo
più disponibile nella forma libera. Il
risultato è che il livello di testosterone
totale è spesso normale, poiché l'aumento
nella produzione viene equilibrato da un
aumento nel tasso della clearance.
Le misurazioni di testosterone totale sono
state da sempre di grande aiuto nello
screening dell'irsutismo. In vista del
meccanismo appena descritto, è naturale
attenderci livelli di testosterone libero,
misurati direttamente o indicizzati
attraverso il rapporto T/SHBG, per
correlare meglio con l'irsutismo. Alcuni
studiosi, in maniera particolare Paulson,
hanno riscontrato che il testosterone libero
è di molto superiore al testosterone totale
nello screening dell'irsutismo. Nel suo
studio sulle 32 donne con irsutismo, solo il
44% presentava livelli elevati di
testosterone totale, mentre tutte e 32
avevano livelli elevati di testosterone
libero. Non tutti gli studiosi hanno
raggiunto questi successi. D'altra parte,
tuttavia, a giudicare dagli studi rivisti da
Wu, sembra che il testosterone libero sia
almeno marginalmente superiore al
testosterone totale in questo contesto. (I
diversi risultati potrebbero essere dovuti
alle differenze nel metodo ed alle
differenze nella selezione dei pazienti).
Principio della Procedura
Nel dosaggio Coat-A-Count Testosterone
Libero, l'analogo del testosterone marcato
125
con I compete per un tempo fisso con il
testosterone libero contenuto nel
campione del paziente per i siti
sull'anticorpo testosterone-specifico adeso
alle pareti della provetta di polipropilene.
La provetta viene quindi decantata, per
isolare la frazione legata all'anticorpo, e
contata in un gamma counter, le conte
sono inversamente legate alla
concentrazione di testosterone libero
presente nel campione.
Il dosaggio è strutturato in maniera tale da
lasciare essenzialmente inalterato
l'equilibrio originario tra il testosterone
libero e quello legato alle proteine nel
campione del paziente. Utilizza un
tracciante che non si lega alle proteine di
trasporto degli steroidi ed un antisiero con
un'affinità per il testosterone leggermente
inferiore a quella della proteina di
trasporto principale, la globulina legante
l'ormone sessuale (SHBG). Inoltre, opera
a condizioni fisiologiche di temperatura,
pH e potenza ionica.
Il dosaggio Coat-A-Count Testosterone
Libero è un dosaggio diretto o a provettasingola: i risultati non vengono calcolati in
funzione del testosterone totale e
dell'SHBG o di altri parametri, ma
interpolati da una curva standard calibrata
in concentrazioni di testosterone libero. A
questo proposito, differisce dai metodi
convenzionali di dialisi di equilibrio e dalle
così dette determinazioni dell'indice di
testosterone libero (TFI). Si tratta anche di
un dosaggio a stadio-unico, che non
richiede né pre-incubazione né isolamento
preliminare della frazione libera attraverso
dialisi, filtrazione o cromatografia a
colonna. Inoltre, presenta le seguenti
caratteristiche di rilievo:
Tempo Totale di Incubazione: 4 ore.
Conte Totali alla iodinazione:
circa 60 000 cpm
Reagenti da Dispensare: 1
Avvertenze e Precauzioni
Ad uso diagnostico in vitro.
Reagenti: Conservare a 2–8°C in un
frigorifero appositamente destinato al
materiale radioattivo. Eliminare secondo le
normative di legge vigenti.
Non utilizzare reagenti oltre la data di
scadenza.
Alcuni componenti forniti in questo kit
possono contenere materiale di origine
umana e/o altri ingredienti potenzialmente
pericolosi che necessitano di precauzioni
di utilizzo.
Seguire le precauzioni universali, e
manipolare tutti i componenti come se
potessero trasmettere agenti infettivi.
Sono stati analizzati i materiali di origine
umana e sono stati trovati non reattivi per
la Sifilide; per gli Anticorpi Anti-HIV 1 e 2;
per l'Antigene di Superficiale dell'Epatite
B; e per gli Anticorpi Anti-Epatite C.
E' stata aggiunta Sodio Azide a
concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come
conservante. Al momento
dell'eliminazione, irrorare con molta acqua
per evitare la formazione di azidi
metalliche potenzialmente esplosive nelle
tubature di piombo e di rame.
Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o
deionizzata.
Radioattività
Una copia di tutti i certificati di
Autorizzazione per radioisotopi (Specifica
o Generica) rilasciata ad un cliente
americano deve essere conservata in file
presso la Siemens Healthcare Diagnostics
prima che i kit o i componenti contenenti
materiale radioattivo possano essere
spediti. Questi materiali radioattivi
possono essere acquisiti da qualsivoglia
cliente in possesso dell'Autorizzazione
Specifica. Con l'Autorizzazione Generica
questi materiali radioattivi possono essere
acquistati solo da medici, veterinari che
esercitino la professione, laboratori clinici
ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di
test clinici o di laboratorio in vitro che non
implichino somministrazione interna o
esterna del materiale radioattivo o delle
sue radiazioni alle persone o animali. La
sua acquisizione, ricevimento,
conservazione, utilizzo, trasferimento ed
eliminazione sono soggette a
regolamentazioni e ad Autorizzazione
(Generica o Specifica) della Commissione
Statunitense per il Nucleare o dello Stato
con il quale l'NRC abbia stipulato un
accordo per l'esercizio del controllo
regolatorio.
Manipolare i materiali radioattivi secondo
quanto previsto dall'Autorizzazione
Generica o Specifica. Per minimizzare
l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore
deve attenersi alle linee guida stabilite dal
National Bureau of Standards publication
su “Safe Handling of Radioactive
Materials” “Norme per una corretta
manipolazione dei Materiali
Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9
Marzo 1964) e successive edizioni
pubblicate dallo Stato e dalle Autorità
Federali.
Assorbire immediatamente le fuoriuscite e
decontaminare le superfici contaminate.
Evitare la formazione di aerosol. Eliminare
i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto
previsto dall'Autorizzazione. Le licenze
37
generiche (possessori di NRC Form 483)
possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi
come non radioattivi, dopo aver rimosso
l'etichetta. I detentori di autorizzazioni
specifiche (NRC Form 313) devono fare
riferimento al Titolo 10, Codice delle
Regolamentazioni Federali Parte 20. I
detentori di Autorizzazioni negli Stati che
hanno stipulato un accordo con l'NRC
dovrebbero far riferimento alle
regolamentazioni idonee dei loro stati. I
detentori di Autorizzazioni Generali
possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi
del tipo contenuto in questo prodotto
attraverso il lavello del laboratorio. I
detentori di autorizzazione devono
eliminare o rendere illeggibili le etichette
dei contenitori vuoti di materiali radioattivi
prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori
di autorizzazioni specifiche possono
eliminare piccoli quantitativi di rifiuti
radioattivi liquidi del tipo utilizzato in
questo prodotto attraverso il lavello del
laboratorio. Fare riferimento alle
regolamentazioni appropriate applicabili al
Vostro laboratorio.
Materiali Forniti:
Preparazione Iniziale
I materiali forniti in questo kit non sono
interscambiabili con quelli contenuti nel kit
Coat-A-Count Testosterone Totale, che è
stato predisposto per la determinazione
del Testosterone Totale.
Provette Testosterone Libero coattate
con anticorpo (TTF1)
Provette di polipropilene coattate con
anticorpi di coniglio anti-testosterone
libero confezionate in buste chiuse.
Conservare refrigerate al riparo
dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo.
Stabili a 2–8°C fino alla data di scadenza
indicata sulla confezione. Colore: Blu.
TKTF1: 100 provette.
TKTF2: 200 provette.
125
Testosterone Libero Marcato con I
(TTF2)
105 mL di analogo iodinato del
testosterone con sodio azide come
conservante. Stabile a 2–8°C per 30 giorni
dopo l'apertura, o fino alla data di
scadenza indicata sulla provetta.
TKTF1: 1 provetta TKTF2: 2 provette.
38
Calibratori Testosterone Libero
(TFC3–8)
Sei flaconi contenenti i calibratori
testosterone libero, pronti all'uso, in siero
umano processato con conservanti (sodio
azide e gentamicina). Il calibratore zero,
flacone A, contiene 2,0 mL, mentre gli altri
calibratori dal flacone B al flacone F
contengono 1,0 mL ciascuno. Stabili a
2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura.
TKTF1: 1 set. TKTF2: 1 set.
I calibratori hanno valori di testosterone
libero lotto-specifici di circa 0, 0,55, 2,5,
9,0, 25 e 50 picogrammi per millilitro
(pg/mL); equivalenti a circa 0, 1,9, 8,7, 31,
87 e 173 picomoli per litro (pmol/L). Fare
riferimento alle etichette delle provette per
i valori esatti in pg/mL.
Materiali Richiesti Ma Non
Forniti
Gamma counter—compatibile con le
provette standard 12x75 mm
Vortex mixer
Provette semplici 12x75 mm di
polipropilene—da utilizzarsi come provette
T ed NSB, disponibili presso la Siemens
Healthcare Diagnostics (Codice: PPO).
Micropipette: 50 µL e 1,0 mL.
Bagnetto termostatato che mantenga la
temperatura a 37°C
Foam per la decantazione delle provette—
disponibile presso la Siemens Healthcare
Diagnostics (Codice: FDR)
Carta millimetrata per grafici Logit-log
Un controllo per immunodosaggi a tre
livelli su base sierica, contenente
testosterone oltre agli altri 25 costituenti
dosati, disponibile presso la Siemens
Healthcare Diagnostics. (Codice: CON6).
Prelievo dei Campioni
Non è necessario che il paziente sia a
digiuno, non sono necessarie preparazioni
29
particolari. Prelevare il sangue in
provette semplici (senza anticoagulanti) e
separare il siero dalle cellule.
Perchè l'EDTA avrebbe un effetto
significativo sui risultati, non dovrebbe
essere utilizzato come un anticoagulante.
Campioni di siero molto lipemici possono
produrre risultati di testosterone libero
falsamente elevati. Si consiglia l'utilizzo di
un'ultracentrifuga per schiarire i campioni
lipemici.
I campioni emolizzati posson indicare il
trattamento non idoneo del campione
prima dell'arrivo al laboratorio; per questo
motivo, i risultati devono essere
interpretati con prudenza.
Provette per il prelievo di sangue di
produttori diversi possono dare valori
differenti, a seconda dei materiali e degli
additivi usati, incluso gel o barriere fisiche,
attivatori di coaguli e/o anticoagulanti.
L'Coat-A-Count Testosterone Libero non é
stato verificato con tutte le possibili
variazioni di tipi di provette. Consultare la
sezione riguardante Campioni Alternativi
per dettagli sulle provette testate.
Terapia con Danazolo: il Danazolo, un
derivato dello steroide etisterone sintetico,
viene usato nel trattamento
dell'endometriosi e della mastopatia
fibrocistica. Gli effetti collaterali
androgenici sono da attribuirsi
all'aumentata disponibilità di testosterone
libero nei pazienti che si sottopongono alla
terapia con Danazolo. Di conseguenza, i
pazienti che assumono Danazolo
mostreranno elevate concentrazioni di
testosterone libero.
Studi condotti in vitro con il dosaggio
Coat-A-Count Free Testosterone hanno
inoltre dimostrato un aumento evidente
della concentrazione di testosterone libero
31
in campioni addizionati con Danazolo.
Dopo somministrazione per via orale di
100 mg le concentrazioni massime di
Danazolo possono arrivare a 199 ng/mL,
inducendo una variazione apprezzabile
nelle concentrazioni di testosterone libero
nonostante la bassa cross-reattività
32
riportata. Vedere la sessione
"Specificità" per le percentuali di crossreattività.
Quindi, deve essere usata cautela
nell'interpretazione dei livelli di
testosterone libero nei pazienti che si
sottopongono a terapia con Danazolo.
Volume Richiesto: 50 µL per provetta.
Conservazione: 2 giorni a 2–8°C o
2 mesi (aliquotato) a –20°C.
Prima del dosaggio, consentire ai
campioni di raggiungere temperatura
ambiente (15–28°C) e mescolare
scuotendo leggermente o capovolgendo la
provetta. Aliquotare, se necessario per
evitare cicli ripetuti di congelamento e
scongelamento. Non tentare di scongelare
i campioni congelati riscaldandoli in un
bagnetto termostatato.
Dosaggio Radioimmunologico
Tutti i componenti devono essere a
temperatura ambiente (15–28°C) prima
dell'utilizzo.
1
Provette Semplici: Etichettare
quattro provette 12x75 mm di
polipropilene semplici (non coattate) T
(conte totali) ed NSB (legame non
specifico) in duplicato.
Poiché il legame non specifico nel
dosaggio Coat-A-Count è
caratteristicamente basso, le provette
NSB possono essere anche omesse
senza compromettere l'accuratezza o
il controllo di qualità.
Provette Coattate: Etichettare dodici
provette coattate con anticorpo (A)
(legame massimo) e dalla B alla F in
duplicato. Etichettare altre provette
coattate con anticorpo, anch'esse in
duplicato, per i controlli ed i campioni dei
pazienti.
Calibratore
Circa
pg/mL
Circa
pmol/L
A (MB)
0
0
B
0,55
1,9
C
2,5
8,7
D
9,0
31
E
25
87
F
50
173
Nota: I valori dei calibratori sono lotto-specifici.
Fare riferimento alle etichette dei calibratori per i
valori in pg/mL.
2
Dispensare 50 µL del calibratore zero
A nelle provette NSB ed A, e 50 µL di
ciascun calibratore, controllo e
campione rimanenti nelle provette
preparate. Pipettare direttamente al
fondo.
Non tentare di diluire i campioni dei
pazienti che presentino concentrazioni
elevate nel calibratore zero. (poiché le
diluizioni spostano l'equilibrio tra
testosterone libero e legato, non ci si
può attendere che il dosaggio
mantenga la linearità se vengono
effettuate diluizioni).
39
Si consiglia di utilizzare un puntale
monouso, cambiando il puntale tra un
campione e l'altro, per evitare la
contaminazione da carryover.
3
Aggiungere 1,0 mL di Testosterone
125
Libero marcato con I in ogni
provetta. Vortexare.
Non devono passare più di 10 minuti
nella dispensazione del tracciante.
Mettere da parte le provette T per la
conta (al punto 6); non sono necessari
ulteriori passaggi.
4
Incubare per 4 ore a 37°C.
Il rack deve essere coperto con una
pellicola per evitare l'evaporazione.
5
6
Decantare, rimuovendo l'umidità
visibile ed aumentando così la
precisione. Utilizzare un foam per la
decantazione, decantare o aspirare i
contenuti di tutte le provette (ad
eccezione delle provette T) e fare in
modo che si asciughino per 2 o 3
minuti. Tamponarle su carta
assorbente per eliminare
completamente i liquidi.
Contare per 1 minuto in un gamma
counter.
Calcolo dei Risultati
Per ottenere i risultati in termini di
concentrazione da una rappresentazione
logit-log della curva di calibrazione,
calcolare inizialmente per ogni coppia di
provette le conte medie al minuto corrette
con NSB:
Conte Nette = Media dei CPM Meno Media CPM
NSB
Quindi determinare il legame di ogni
coppia di provette come percentuale del
legame massimo (MB), con le conte
corrette-NSB delle provette A prese al
100%:
Percentuale di Legato = (Counte Nette / Conte
Nette MB) × 100
(Il calcolo può essere semplificato
omettendo la correzione per il legame non
specifico; i campioni entro il range dei
calibratori danno virtualmente gli stessi
risultati quando la Percentuale di Legato
viene calcolata direttamente dai CPM
Medi).
40
Utilizzando la carta logit-log, tracciare la
Percentuale di Legato sull'asse verticale
(probabilità) verso la Concentrazione
sull'asse orizzontale (logaritmica) per
ciascuno dei calibratori non zero e
tracciare una linea retta
approssimativamente lungo il tracciato di
questi punti. I risultati per i campioni
sconosciuti possono essere letti dalla retta
attraverso interpolazione.
Si consiglia di visionare i risultati per
stabilire la correlazione entro i replicati e
tracciare un grafico della curva di
calibrazione (anche se i calcoli vengono
effettuati dal computer) per visualizzare
l'appropriatezza della trasformazione
utilizzata e per individuare i punti devianti
all'interno della calibrazione. Consigliamo
anche di mantenere una rintracciabilità dei
parametri utilizzati per la riduzione dei
dati:
T = Conte Totali (conte al minuto)
%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte
Totali)
%MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali)
E le “intercette” al 20, 50 ed 80%, dove
20% = Concentrazione al 20% di Legato ecc.
Nota: sono accettabili anche altri tipi di
approccio, quali: l'implementazione della
logistica a 4 parametri. Vedi Dudley Ra et
al. Guidelines for immunoassay data
Reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Seduta Esemplificativa: a solo scopo
illustrativo e non per calcolare i risultati di
un'altra seduta. I valori dei calibratori sono
lotto-specifici, le concentrazioni elencate
nella colonna più a destra possono non
essere in linea con i valori dei calibratori
forniti nel kit (vedi tabella “Example Run”).
Controllo di Qualità
Dovrebbero essere dosati di routine come
campioni non noti i Controlli (o pool di
sieri) con alMeno due livelli di
concentrazione di testosterone libero,
basso ed alto.
Riportare i risultati dei pazienti solo se i
risultati dei controlli sono conformi ai criteri
di accettabilità del Vostro laboratorio.
Si consiglia per ogni dosaggio di annotare
i numeri di lotto dei componenti utilizzati,
quali le date di ricostituzione o di apertura.
Si consiglia anche di tracciare i grafici dei
risultati dei controlli giorno dopo giorno—
come descritto, ad esempio, in Westgard
JO, et al. A multi-rule chart for quality
control. Clin Chem 1981;27:493-501.
Campioni ripetuti possono servire come
ulteriore strumento per monitorare la
precisione inter-dosaggio; coppie di
campioni intervallate lungo tutto il
dosaggio possono essere d'aiuto nel
verificare l'assenza di deviazioni
significative.
Valori Attesi
Di seguito sono riportati i valori di
testosterone libero in adulti che non
presentano apparenti o sospette
disfunzioni alle gonadi ripartiti secondo il
sesso e l'età. Le statistiche mostrano,
come atteso, un declino graduale nei livelli
di testosterone libero, durante la maturità,
in funzione dell'età. Nell'analisi sono stati
utilizzati i risultati ottenuti da uomini e
donne di età compresa tra 20 ed 80
anni—un totale di 472 maschi e 113
femmine. Il gruppo di riferimento era
formato da volontari sani ed anche
soggetti nei quali non si sospettavano
patologie gonadiche o le stesse erano già
state escluse da test di laboratorio
effettuati. Il set di dati (gentilmente fornito
30
dagli autori) deriva da uno studio
pubblicato sugli intervalli di riferimento per
il dosaggio Coat-A-Count Testosterone
Libero.
Unità di Massa (pg/mL)
Unità Molari (pmol/L)
n
Mediana
Range
Centrale
95%
20 – 39
154
60
31 – 94
40 – 59
210
50
25 – 80
60 – 80
108
41
19 – 66
20 – 39
47
3,0
ND – 8,9
40 – 59
39
2,3
ND – 7,0
60 – 80
27
1,8
ND – 5,4
Età (anni)
Maschi
Femmine
ND: non determinabile
Fare attenzione che i criteri di selezione
possono avere un impatto significativo
sulla determinazione degli intervalli di
riferimento: in particolare, sono stati
ottenuti intervalli più ampi nello studio
30
pubblicato che ha incluso risultati per
campioni di pazienti sottoposti ad analisi
per il testosterone libero.
Considerare questi limiti solo come linee
guida. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i
propri range di riferimento.
Prestazioni del Dosaggio
Le sezioni di seguito riportate contengono
i dati rappresentativi delle prestazioni del
dosaggio Coat-A-Count Testosterone
Libero. I risultati sono espressi in pg/mL.
Fattore di Conversione:
pg/mL × 3,467 → pmol/L
n
Mediana
Range
Centrale
95%
20 – 39
154
17,2
8,8 – 27
Range di Calibrazione:
Circa da 0,55 – 50 pg/mL
(1,9 – 173 pmol/L). Questi calibratori sono
lotto-specifici.
40 – 59
210
14,4
7,2 – 23
Sensibilità Analitica: 0,15 pg/mL.
60 – 80
108
11,7
5,6 – 19
20 – 39
47
0,87
ND – 2,57
40 – 59
39
0,68
ND – 2,03
Precisione: Sono state calcolate
statistiche per i campioni dai risultati di
coppie di provette in più di 160 dosaggi
differenti. (Vedi tabella “Precision”.)
60 – 80
27
0,51
ND – 1,55
Età (anni)
Maschi
Femmine
ND: non determinabile
Profilo di Precisione: Il grafico mostra un
profilo di precisione basato sulla dose per i
CV intra-dosaggio (cerchi aperti) per
dodici campioni, calcolati attraverso
l'analisi della varianza da 34 sedute. La
curva, che traccia il percorso
approssimativo di questi punti rappresenta
i CV intra-dosaggio che ci si attendono dai
campioni dosati in duplicato. I CV da
seduta a seduta tabulati nella tabella
41
“Precision” vengono visualizzati
sottoforma di quadratini (vedi grafico
“Precision Profile”).
Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa
200 provette. (Vedi tabella "End-of-Run
Effect".)
Effetto dell'SHBG: per studiare gli effetti
dei livelli di globulina legante gli ormoni
sessuali (livelli di SHBG) sul dosaggio, ad
un pool di sieri umani assorbiti con
charcoal è stato aggiunto SHBG ad una
concentrazione di 400 microgrammi per
millilitro, un livello che risulta
approssimativamente 1 000 volte il livello
normale. Il pool cui è stato aggiunto
l'SHBG, è stato dosato con il kit
Coat-A-Count Testosterone Libero ed ha
prodotto una percentuale di ormone legato
del 99% B/B0.
Poiché l'assorbimento con charcoal
elimina il testosterone dal pool, dovrebbe
presentare concentrazioni zero di
testosterone libero (e totale)—cioè i valori
percentuali del legato erano di circa il
100% B/B0—sia prima che dopo l'aggiunta
di SHBG. I risultati mostrano, come atteso,
che il dosaggio non è influenzato dai livelli
di SHBG.
l'SHBG ed altre proteine leganti, questo
esperimento è di aiuto nella conferma che
il dosaggio Coat-A-Count Testosterone
Libero non è influenzato dai livelli delle
proteine di trasporto.
Bilirubina: La presenza di bilirubina in
concentrazioni fino a 200 mg/L non ha
nessun effetto, entro il range di precisione
del dosaggio.
Emolisi: La presenza di globuli rossi
impaccati in concentrazioni fino a
30 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il
range di precisione del dosaggio.
Tipo di Campione Alternativo: Per
determinare l'effetto di campioni
alternativi, è stato prelevato del sangue da
49 volontari in provette semplici,
eparinizzate e EDTA. I range assoluti
osservati per i volontari Maschi e femmine
sono tabulati di seguito.
Gamma
assoluta
19 Volontari
maschi
pg/mL
30 Volontari
femmine
pg/mL
Siero
9 – 47
0,7 – 3,6
Eparina
8 – 45
0,9 – 3,8
EDTA
13 – 79
1,3 – 5,7
Effetto dell'Albumina: I campioni liofili
sono stati ricostituiti con soluzioni acquose
contenenti 0, 1,0, 2,0 e 3,0 g/dL di
albumina sierica umana assorbita con
charcoal e dosati in parallelo. (Vedi tabella
"Effect of Albumin”).
I risultati combinati per questi 49 campioni
– più un campione aggiuntivo – hanno
prodotto le seguenti statistiche con analisi
della regressione lineare.
Effetto dell'Assorbimento con
Charcoal: I campioni dei pazienti sono
stati dosati utilizzando il kit Coat-A-Count
Testosterone Libero sia prima che dopo
assorbimento con charcoal. Di seguito
sono tabulate le concentrazioni di
testosterone libero (in pg/mL) prima
dell'assorbimento con charcoal ed i valori
della percentuale di legato (%B/B0) dopo
assorbimento (Vedi tabella “ Effect of
Charcoal Absorption”).
(EDTA) = 1,48 (Siero) + 1,1 pg/mL
r = 0,957
I risultati dimostrano che l'assorbimento
con charcoal riduce il livello di
testosterone libero apparente a zero,
cosiccome misurato dal kit Coat-A-Count,
cioè a valori percentuali di legato
approssimativamente del 100% B/B0.
Poiché l'assorbimento con charcoal
rimuove il testosterone insieme ad altri
steroidi e piccole molecole provenienti dai
campioni di siero mentre lascia intatte le
molecole più grandi quali l'albumina,
42
(Eparina) = 0,95 (Siero) + 0,4 pg/mL
r = 0,996
Valore medio:
11,9 pg/mL (Eparina)
12,2 pg/mL (Siero)
19,2 pg/mL (EDTA)
I risultati indicano che il plasma
eparinizzato produce virtualmente gli
Stessi risultati del siero, mentre il plasma
EDTA produce valori più elevati.
Specificità: L'anticorpo anti-testosterone
libero è altamente specifico con una
crossreattività estremamente bassa verso
altri steroidi esistenti in natura o farmici
somministrati a livello terapeutico e
presenti nei campioni dei pazienti. (Vedi
tabella "Specificity".)
Comparazione di Metodi: Il dosaggio è
stato comparato ad un metodo
convenzionale basato sulla dialisi di
equilibrio su 85 campioni di siero (43
maschi e 42 femmine). Mediante
regressione lineare:
Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.
Maschi (43)
(TKTF) = 0,42 (Dialisi) + 9,8 pg/mL
r = 0,67
Valore Medio:
26,3 pg/mL (TKTF)
39,0 pg/mL (Dialisi)
Femmine (42)
r = 0,75
Valore Medio:
4,3 pg/mL (TKTF)
4,1 pg/mL (Dialisi)
Combinati (85)
r = 0,87
Valore Medio:
15,4 pg/mL (TKTF)
21,8 pg/mL (Dialisi)
Il dosaggio Coat-A-Count Testosterone
Libero è stato anche comparato ad un
dosaggio del testosterone totale—
Coat-A-Count Testosterone Totale— su
109 campioni di siero (51 maschi e 58
femmine). Mediante regressione lineare:
Maschi (51)
(Libero) = 4,7 (Totale) + 0,7
r = 0,984
Valore Medio:
23,6 pg/mL (Libero)
4,84 ng/mL (Totale)
Femmine (58)
r = 0,978
Valore Medio:
3,9 pg/mL (Libero)
0,54 ng/mL (Totale)
Combinati (109)
r = 0,992
Valore medio:
13,1 pg/mL (Libero)
2,6 ng/mL (Totale)
Assistenza Tecnica
All'estero: Si prega di contattare il proprio
Distributore Nazionale.
Português
Coat-A-Count Free
Testosterone
Utilização: Coat-A-Count Free
Testosterone é um rádioimunoensaio de
125
fase sólida marcado com I para o
doseamento quantitativo da testosterona
livre no soro. Destina-se exclusivamente
ao diagnóstico in vitro como auxiliar do
diagnóstico e tratamento do hirsutismo
devido ao hiperandrogenismo.
Números de catálogo:
TKTF1 (100 tubos), TKTF2 (200 tubos)
O Kit com 100 tubos contem
Menos que 4 microcuries
125
(148 kilobecquerels) de I
radioactivo ligado ao analogo da
testosterona; o Kit com 200 tubos contem
Menos que 8 microcuries
(296 kilobecquerels).
Sumário e Explicação do Teste
A testosterona circula quase inteiramente
ligada às proteínas de transporte:
normalmente Menos de um porcento está
livre. A principal proteína de transporte da
testosterona é conhecida como globulina
de ligação das hormonas sexuais (SHBG)
ou globulina de ligação da testosteronaestradiol (TeBG), uma vez que não se liga
apenas à testosterona mas também ao
estradiol (e dihidrotestosterona). A
proteina de ligação da albumina e cortisol
(CBG) são as outras proteinas de
transporte da testosterona.
Por três razões, SHBG é a mais
importante destas proteinas de transporte.
Transporta, nas mulheres, em circulação
uma percentagem de testosterona mais
alta que albumina ou CBG. Por outro lado,
liga-se à testosterona com muito maior
afinidade que as outras duas proteinas de
transporte. (A testosterona ligada à
albumina e CBG é conhecida por
testosterona de “fraca ligação”.)
Finalmente, a SHBG tem uma reacção,
não associada com a albumina, mas é
sensivel ás alterações na razão entre os
estrogénios e androgénios circulantes. A
43
SHBG tem um papel muito importante na
determinação dos niveis de testosterona
livre em circulação.
Na gravidez, os niveis de SHBG mostram
um aumento progressivo que espelha o
crescimento dos niveis de estradiol.
Embora os niveis de testosterona total
mostrem algum aumento durante a
gravidez, o crescimento no estradiol, e por
isso também em SHBG, é mais dramático.
O resultado é um decréscimo na
testosterona livre como percentagem da
testosterona total. As mulheres a tomarem
contraceptivos orais tem niveis de SHBG
aumentados, pelo Menos se estão a
tomar doses altas de etinil estradiol.
Reciprocamente, a administração de
androgénios a rapazes na pré-puberdade,
ou a elevação da testosterona endógena
pela estimulação da HCG, induz um
decréscimo significativo nos niveis de
SHBG. A obesidade está também
associada com o decréscimo dos niveis
de SHBG.
Outras entidades permanecem iguais,
espera-se que a concentração de
testosterona livre em circulação aumente
se os niveis de de testosterona (T)
aumentarem ou se os niveis de SHBG
diminuirem. A razão T/SHBG, isto é, a
razão da testosterona total por (a
concentração ou capacidade de ligação)
SHBG, servindo como guia grosseiro para
a concentração de testosterona livre em
circulação. A razãoT/SHBG é algumas
vezes referida como Index da
Testosterona Livre (TFI).
O Index da Testosterona Livre está com
frequência aumentado em casos de acne
severo, alopécia androgénica masculina
(calvice), hirsutismo e outras situações.
Um nivel baixo de SHBG, geralmente em
combinação. Nestas condições, niveis
baixos de SHBG, geralmente em
combinação com niveis normais de
testosterona, são encontrados com
frequência. Um aumento nas taxas de
produção da testosterona tipicamente
induz o decréscimo nos niveis de SHBG.
Isto estimula a libertação celular e o
metabolismo da testosterona, por tela
mais disponivel na forma livre. O resultado
é que os niveis de testosterona total são
geralmente normais, porque o aumento
na taxa de produção é compensado por
um aumento na taxa de eliminação.
44
Os doseamentos de testosterona total tem
sido tradicionalmente usados como ajuda
no painel do hirsutismo. Em função dos
mecanismos descritos, é natural esperar
que niveis de testosterona livre, doseados
directamente ou indexados pela razão
T/SHBG, se correlacionem melhor com o
hirsutismo. Alguns investigadores,
particularmente Paulson, tem encontrado
niveis de testosterona livre
esmagadoramente superiores aos da
testosterona total no quadro do
hirsutismo. No seu estudo de 32 mulheres
hirsutas, apenas 44 por cento tem niveis
elevados de testosterona total, enquanto
todas as 32 tiveram niveis elevados de
testosterona livre. Nem todos os
investigadores atingiram este nivel de
sucesso. Em conclusão, contudo, da
apreciação dos estudos revistos por Wu,
parece que a testosterona livre é no
minimo marginalmente superior à
testosterona total neste contexto. (a
variação nos resultados pode
possilvelmente ser devida às diferenças
nas metodologias e na selecção dos
doentes.)
Princípio do Procedimento
No procedimento do Coat-A-Count Free
Testosterone, um análogo da testosterona
125
marcado com I compete durante um
tempo fixado com a testosterona livre da
amostra do paciente para os anticorpos
especificos da testosterona imobilizados
nas paredes dos tubos de polipropileno. O
tubo é decantado, para isolar a fracção
ligada ao anticorpo, e lidos num contador
gama, sendo as contagens inversamente
proporcionais à concentração de
testosterona livre na amostra.
O ensaio está desenhado para deixar o
equilibrio entre testosterona da amostra
do doente livre e ligada essencialmente
inalterado. Emprega um marcador que
não se liga a proteinas de transporte de
hormonas esteroides, e um antisoro com
uma afinidade para a testosterona
ligeiramente Menor que a principal
proteina de transporte, globulina de
ligação à hormona sexual (SHBG). Além
disso, opera-se sobre condições
fisiológicas de temperatura, pH e força
iónica.
O procedimento do Coat-A-Count Free
Testosterone é um ensaio directo ou de
tubo-simples:os seus resultados não são
calculados em função da testosterona
total e SHBG ou algum outro parametro,
mas interpolados numa curva padrão
calibrada com várias concentrações de
testosterona livre. Neste contexto difere
dos métodos convencionais de diálise e
das determinações chamadas de indexe
da testosterona livre (TFI). È também um
ensaio de ciclo-ùnico, não requerendo o
passo de pré-incubação nem o passo
preliminar de isolamento da fracção livre
por diálise, filtração ou cromatografia de
coluna. Adicionalmente, apresenta as
seguintes caracteristicas dignas de
atenção:
Tempo de Incubação Total: 4 horas.
Contagens Totais na Marcação com o
Iodo: aproximadamente 60 000 cpm
Reagentes para Pipetar: 1
Precauções
Para uso de diagnóstico in vitro.
Reagentes: Conservar a 2–8°C num
frigorífico destinado para materiais
radioactivos. Eliminar de acordo com as
leis aplicáveis.
Não utilize reagentes com prazo de
validade expirado.
Alguns componentes fornecidos com este
dispositivo podem conter matéria de
origem humana e/ou outros ingredientes
potencialmente perigosos que necessitem
de algumas precauções.
Manipule com as devidas precauções
todos os materiais capazes de transmitir
doenças infecciosas. As matérias primas,
obtidas de soro humano, foram testadas,
revelando resultados negativos para a
sífilis, para os anticorpos do vírus da
imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2;
para o antigénio de superfície da hepatite
B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus
da hepatite C.
Azida de sódio foi adicionada como
conservante; para evitar acumulações de
azidas metálicas explosivas em
canalizações de cobre e alumínio, os
reagentes devem ser rejeitados no esgoto
apenas se estiverem diluídos e forem
lavados com grandes volumes de água.
Água: Utilize água destilada ou
desionizada.
Radioactividade
Uma cópia da licença de uso de produtos
radioactivos (especifico ou geral) enviada
pelo cliente, deve estar em poder da
Siemens Healthcare Diagnostics antes do
envio dos kits ou componentes contendo
material radioactivo. Estes materiais
radioactivos podem ser adquiridos por
qualquer cliente que possua a necessária
licença especifica. Com uma licença
generalista estes produtos radioactivos só
podem ser adquiridos por médicos,
veterinários na prática de medicina
veterinária, laboratórios clinicos e
hospitais. E somente para uso clinico in
vitro ou testes laboratoriais não
envolvendo administração externa ou
interna do material radioactivo ou da sua
radiação para o ser humano ou outros
animais. A sua aquisição, receita,
armazenamento uso, transporte e
eliminação estão sujeitas aos
regulamentos e à licenciada Comissão de
Regulação Nuclear ou do Estado
respectivo de acordo com a lei em vigor.
Tratar os materiais radioactivos de acordo
com a regulamentação da sua licença,
específica ou generalista. De modo a
minimizar a exposição à radiação deve o
utilizador seguir as instruções da
publicação do Departamento Nacional de
Padrões (Utilização segura de materiais
radioactivos-Livro No. 92, publicado em
Março de 1964) e publicações seguintes
do Estado e Autoridades Federais.
Limpar os derrames prontamente e
descontamine as superficies afectadas.
Evitar os aerossois. Elimine os lixos
radioactivos de acordo com a
regulamentação da licença. As licenças
generalistas (portadores da licença NRC
483) podem eliminar os lixos sólidos
radioactivos como lixo não radioactivo
depois de remover os rótulos. Licenças
Especificas (Licença NRC 313) devem ter
em conta o Capitulo 10 do artigo 20, do
Código de Regulamentações Federais.
Cada Estado deve referir a legislação em
vigor aprovada para o seu território. As
licenças generalistas podem eliminar os
lixos radioactivos liquidos do tipo deste
produto para um esgoto de laboratório. Os
licenciados devem remover os rótulos dos
frascos vazios de materiais radioactivos
antes de os colocar no esgoto sólido. As
licenças especificas podem eliminar
pequenas quantidades de lixo radioactivo
45
deste tipo de produto para o esgoto
normal do laboratório. Ter em atenção as
regulamentações em vigor para o seu
laboratório.
Materiais necessários mas não
fornecidos
Materiais fornecidos:
Preparação inicial
Agitador Vortex
Os materiais fornecidos com este
dispositivo não podem ser trocados pelos
do dispositivo da Testosterona Total CoatA-Count, o qual é desenhado para o
doseamento da Testosterona Total.
Tubos revestidos com Anticorpos de
Testosterona Livre (TTF1)
Tubos de polipropileno revestidos com
anticorpos de coelho para a testosterona
livre e embalados em sacos com fecho de
segurança. Conservar refrigerado e
protegido da humidade, selar os sacos
cuidadosamente após cada abertura.
Estável a 2–8°C até à data de validade
inscrita na embalagem. Cor: Tom azulado
TKTF1: 100 tubos. TKTF2: 200 tubos.
125
I Testosterona Livre (TTF2)
125
105 mL de testosterona marcada com I,
com azida de sódio como conservante.
Estável a 2–8°C durante 30 dias depois
de aberto, ou até à data de validade
inscrita no frasco.
TKTF1: 1 frasco. TKTF2: 2 frascos.
Calibradores de Testosterona Livre
(TFC3–8)
6 frascos de calibradores de testosterona
livre pronto-a-usar, em soro humano
processado com conservante (azida de
sódio e gentamicina). O calibrador zero
frasco A contém 2,0 mL, enquanto que os
calibradores frasco B até ao F contém
1,0 mL cada. Estável a 2–8°C durante 30
dias depois de aberto.
TKTF1: 1 conjunto. TKTF2: 1 conjunto.
Os calibradores têm valores de
testosterona livre lote-específico de
aproximadamente 0, 0,55, 2,5, 9,0, 25 e
50 picogramas por mililitro (pg/mL);
equivalente: aproximado: 0, 1,9, 8,7, 31,
87 e 173 picomoles por litro (pmol/L). Ver
as etiquetas dos frascos para valores
exactos em pg/mL.
46
Contador Gama—compatível com os
tubos normais (12x75 mm).
Tubos não revestidos de polipropileno
(12x75 mm)—para uso com os tubos T e
NSB, disponíveis na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: PPO).
Micropipetas: 50 µL e 1,0 mL.
Incubar num banho-maria a 37°C
Espuma de decantação—disponível na
Siemens Healthcare Diagnostics
(Números de catálogo: FDR)
Papel logaritmico
Controlo com três níveis baseado em soro
humano, contendo testosterona como um
dos mais de 25 constituintes ensaiados;
disponíveis na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo:
CON6).
Colheita
O paciente não necessita dieta. Não são
necessárias preparações especiais.
29
Colher o sangue por punção venosa em
tubos lisos (sem anticoagulante), e
separar o soro das celulas.
Como EDTA teria um efeito significativo
nos resultados, não deve ser usado como
anticoagulante.
Soros altamente lipémicos podem dar
origem a resultados falsamente elevados
de testosterona livre. O uso de uma
ultracentrifuga é recomendado para
clarificar as amostras lipémicas.
Amostras hemolisadas podem indicar
tratamento incorrecto de uma amostra
antes do envio para o laboratório; portanto
os resultados devem ser interpretados
com cuidado.
Os tubos para colheita sanguínea de
diferentes fabricantes, podem originar
diferentes valores, dependendo dos
materiais e aditivos, incluíndo gel ou
barreiras fisicas, activadores do coágulo
e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count
Testosterona Livre não foram ainda
testados com todas as possiveis
variações originadas pelos tipos de tubos.
Consultar a secção Tipos de Amostras
Alternativas para obter detalhes sobre os
tubos que foram testados.
Terapia por Danazol: O danazol é um
derivado do esteróide sintético:
ethisterona, usado no tratamento de
endometriose e doença fibrocistíca da
mama. Os efeitos colaterais do
androgênico têm sido atribuídos ao
aumento da disponibilidade da
testosterona livre em pacientes sob
terapia do Danazol. Assim, pacientes
tomando Danazol irão apresentar um
aumento nas concentrações de
testosterona livre.
Estudos In Vitro com o ensaio de
Testosterona Livre Coat-A-Count também
mostraram um aumento na concentração
aparente em amostras adicionadas de
31
Danazol. A concentração máxima de
Danazol plasmático, após uma dose oral
de 100 mg está relatada como sendo até
199 ng/mL, gerando uma variação
apreciável nas concentrações de
testosterona plasmática, apesar da baixa
32
reação cruzada reportada. Ver seção de
"Especificidade" para a porcentagem de
reação cruzada.
Tubos revestidos: Rotular doze tubos
revestidos com anticorpos de testosterona
livre, A (máxima ligação) e B a F em
duplicado. Rotular outros tubos revestidos
em duplicado para controlos e amostras.
2
Armazenamento : 2 dias a 2–8°C ou
2 meses (aliquotado) a –20°C.
Tubos lisos: Rotular quatro tubos de
polipropileno (não revestidos) de
12x75 mm—T (contagens totais) e
NSB (ligações não especificas) em
duplicado.
Devido ao facto das ligações não
especificas no método de
Coat-A-Count serem geralmente
baixas os valores de NSB podem ser
omitidos sem comprometer a precisão
ou controle de qualidade.
0
B
0,55
1,9
C
2,5
8,7
D
9,0
31
E
25
87
F
50
173
Pipetar 50 µL do calibrador zero(A)
nos tubos NSB e A, e 50 µL dos
outros calibradores, controlos e
amostras nos respectivos tubos.
Pipetar directamente para a base dos
tubos.
É boa prática usar uma pipeta de
pontas descartáveis, mudando a
ponta entre as amostras de modo a
evitar contaminação.
3
125
Adicionar 1,0 mL de I Testosterona
livre para cada tubo. Homogeneizar.
125
Adicionar o marcador I no espaço
de 10 minutos após pipetar os
calibradores, controlos e amostras.
Deixar os tubos T para as contagens
(nº 6); não necessitam mais
processamento.
Técnica de Radioimunoensaio
1
+/- pmol/L
0
Não é tecnicamente aceitável a
diluição das amostras com o
calibrador zero. (A linearidade do
sistema não é fiável após diluição
pela perda de equilibrio entre a
testosterona livre e ligada).
Volume de Amostra: 50 µL por tubo.
Todos os componentes devem estar à
temperatura ambiente(15–28°C) antes de
usar.
+/- pg/mL
A (MB)
Nota: Os valores dos calibradores são
lote-especificos. Têr em atenção os valores nos
frascos em pg/mL.
Entretanto, deve-se ter cautela para a
interpretação dos níveis de testosterona
livre em pacientes sob terapia de Danazol.
Deixar as amostras atingir a temperatura
ambiente (15–28°C) e agitar suavemente
ou por inversão. Aliquotar se necessário
para evitar repetidos congelamentos /
descongelamentos. Não descongelar as
amostras por aquecimento em banhomaria.
Calibrador
4
Incubar 4 horas a 37°C.
As amostras devem ser cobertas com
Parafilme para prevenir a evaporação.
5
Decantar vigorosamente.
Removendo todo o líquido
remanescente melhora-se bastante a
precisão. Usar uma espuma de
decantação, decante ou aspire o
conteúdo de todos os tubos (excepto
os T) e deixar invertidos durante 2 ou
3 minutos. Eliminar todas as gotas
residuais com papel absorvente.
47
6
Contar 1 minuto em contador gama.
Cálculo dos Resultados
Para obter resultados de concentrações
duma representação logit-log da curva de
calibração, deve em primeiro lugar
calcular-se para cada par de tubos a
média de NSB-contagens por minuto
corrigidas:
Contagens reais = Média CPM minutos Média
NSB CPM
Determine a ligação de cada par de tubos
como percentagem do máximo de ligação
(MB), com o NSB-contagens por minuto
corrigidas dos tubos A tidas como 100%:
Percentagem de Ligação = (Contagens reais /
Contagens MB reais) × 100
(O cálculo pode ser simplificado omitindo
a correcção para a ligação não especifica;
amostras dentro da gama de calibração
originam virtualmente os mesmos
resultados quando a Percentagem de
Ligação é calculada directamente da
Média de CPM.)
Usando um papel milimétrico logit-log,
represente a Percentagem de Ligação no
eixo vertical (probabilidade) contra a
Concentração no eixo horizontal
(logaritmico) para cada um dos
calibradores diferentes de zero, e
representar uma linha recta em função da
trajectória destes pontos. Resultados de
amostras desconhecidas podem então ser
lidas nessa recta por interpolação.
È boa prática verificar os resultados pela
concordância entre as réplicas, e construir
um gráfico da curva de calibração (mesmo
que os cálculos sejam efectuados por
computador) para verificação visual da
aplicabilidade da transformação usada e
como forma para detectar pontos de
calibração que se afastem. Também se
recomenda guardar estas curvas:
T = Contagens totais (contagens por minuto)
%NSB = 100 × (Média Contagens NSB /
Contagens Totais)
%MB = 100 × (Contagens Reais / Contagens
Totais)
E os 20, 50 e 80 porcento "intercepa,"
onde
20% = Concentração a 20 Porcento de Ligação,
etc.
48
Note que para outras perspectivas, como
a implementação de uma logística de 4
parâmetros, também é aceitável. Ver
Dudley RA, et al. Guidelines for
immunoassay data reduction. Clin Chem
1985;31:1264-71.
Exemplo de Ensaio: Apenas para
ilustração, não para calcular resultados de
outro ensaio. Porque os valores dos
calibradores são lote-especifico, as
concentrações listadas na coluna mais à
direita podem não corresponder aos
valores dos calibradores fornecidos com o
dispositivo fornecido na sua encomenda.
(Ver tabela “Example Run”.)
Controlo de Qualidade
Controlos (ou misturas de soros) com o
minimo de duas concentrações de
testosterona livre—baixa e alta—devem
ser ensaiados rotineiramente como
amostras desconhecidas.
Os resultados dos pacientes devem
apenas ser reportados se os resultados
dos controlos para este ensaio estiverem
dentro dos critérios de aceitação
estabelecidos pelo laboratório.
È boa prática laboratorial registar para
cada ensaio o número do lote dos
componentes usados, bem como as datas
de quando foram primeiro reconstituidas
ou abertas. Recomenda-se registar os
valores diários em gráfico—como descrito,
por exemplo, in Westgard JO, et al. A
multi-rule chart for quality control. Clin
Chem 1981;27:493-501. Note que
amostras repetidas podem servir como
ferramenta adicional para monitorizar a
precisão inter-ensaio, e que pares de
controlos podem ser colocados ao longo
do ensaio para ajudar a verificar a
ausência de variação significativa.
Valores de Referência
Os valores de referência para adultos sem
suspeita de disfunção gonadal estão
referidos em baixo por sexo e idade. A
estatistica mostra, como esperado, um
declinio gradual nos valores de
testosterona livre em função da idade na
idade adulta. Os resultados para homens
e mulheres dos 20 aos 80 anos-no total
de 472 homens e 113 mulheres—foram
usados no estudo.Tomou-se como grupo
de referência voluntários saudáveis e
pacientes nos quais não se tivesse
suspeita de doença gonadal, ou fosse
excluida por testes laboratoriais.Os dados
(gentilmente cedidos pelos autores) foram
30
obtidos através de um estudo publicado
em intervalos de referência para o ensaio
de Testosterona livre Coat-A-Count.
Unidades de massa (pg/mL)
Idade
(anos)
n
Media
Central
95%
20 – 39
154
17,2
8,8 – 27
40 – 59
210
14,4
7,2 – 23
60 – 80
108
11,7
5,6 – 19
20 – 39
47
0,87
ND – 2,57
40 – 59
39
0,68
ND – 2,03
60 – 80
27
0,51
ND – 1,55
Homens
Mulheres
ND: não detectável
Unidades molar (pmol/L)
Idade
(anos)
n
Media
Central
95%
20 – 39
154
60
31 – 94
40 – 59
210
50
25 – 80
60 – 80
108
41
19 – 66
20 – 39
47
3,0
ND – 8,9
40 – 59
39
2,3
ND – 7,0
60 – 80
27
1,8
ND – 5,4
Homens
Mulheres
ND: não detectável
Notar que o critério de selecção pode ter
um impacto significativo na determinação
dos intervalos de referência: intervalos
30
maiores foram obtidos quando os
valores foram expandidos de modo a
incluir resultados de amostras que tinham
sido submetidos a análise de testosterona
livre.
Factor de conversão:
pg/mL × 3,467 → pmol/L
Calibração:
Aproximadamente 0,55 – 50 pg/mL
(1,9 – 173 pmol/L). Os calibradores são
lote-especifico.
Sensibilidade Analítica: 0,15 pg/mL.
Precisão: Foram feitos cálculos
estatísticos com os resultados de
amostras de pares de tubos em mais de
160 diferentes ensaios. (Consulte a tabela
“Precisão”.)
Perfil de precisão: o gráfico mostra um
perfil de dose-precisão para o ensaio
baseado nos CVs intra ensaio (circulos
abertos) para doze amostras, calculadas
pela análise da variância em 34 ensaios.
A linha em forma de concavidade ao
longo destes pontos representa os CVs
intra ensaio esperados para amostras
ensaiadas em duplicado. Como referência
os CVs inter ensaio referidos na tabela de
Precisão são apresentados como
quadrados sólidos. (ver o gráfico de perfil
de precisão.)
Efeito fim-de-série: Nenhum até
aproximadamente 200 tubos. (Ver tabela
"Efeito fim-de-série".)
Efeitos da SHBG: Para investigar os
efeitos dos níveis da globulina de ligação
das hormonas sexuais (níveis de SHBG)
no sistema do ensaio, uma mistura de
soros foi adicionada com SHBG para uma
concentração de 400 microgramas por ml,
um nível que é aproximadamente 1 000
vezes o normal. A mistura adicionada com
SHBG, quando ensaiada pelo método
Testosterona Livre Coat-A-Count, mostrou
um valor de percentagem de ligação de
99% (B/B0).
Características do Ensaio
Uma vez que a absorção do carvão
elimina a testosterona da “mistura”, não
deverá existir nenhuma concentração de
testosterona livre (e total)—isto é, valores
de percentagem de ligação de
aproximadamente 100% B/B0—ambos
antes e depois da adição. Os resultados
mostram, conforme esperado, que o
ensaio não é influenciado pelos níveis de
SHBG.
A seguinte informação contem dados
representativos do desempenho do
ensaio da Testosterona Livre
Coat-A-Count. Os resultados são
apresentados em pg/mL.
Efeitos da Albumina: Amostras
liofilizadas foram reconstituidas com
soluções aquosas contendo 0, 1,0, 2,0 e
3,0 g/dL absorvida pelo carvão de
albumina sérica humana, e ensaiadas em
Considerar estes limites sómente como
indicativo. Cada laboratório deve
estabelecer os seus próprios valores de
referência.
49
paralelo. (Ver tabela "Efeitos da
Albumina".)
forneceram as seguintes estatísticas
quando sujeitas a regressão linear.
Efeitos da absorção do carvão:
Amostras de pacientes foram testadas
pelo procedimento da Testosterona Livre
Coat-A-Count ambos antes e depois da
absorção pelo carvão. As concentrações
de testosterona livre (em pg/mL) antes da
absorção, e os valores de percentagem
de ligação (%B/B0) seguidos da absorção
do carvão estão referidos. (Ver tabela
"Effect of Charcoal Absorption")
(Heparina) = 0,95 (Soro) + 0,4 pg/mL
r = 0,996
Os resultados demonstram que a
absorção pelo carvão reduz o nível de
testosterona livre das amostras de
pacientes, doseado pelo método Coat-ACount, para zero, isto é, os valores de
percentagem de ligação de
aproximadamente 100% B/B0
Uma vez que a absorção do carvão retira
a testosterona bem como outros
esteroides e pequenas moléculas das
amostras de soro enquanto que mantém
as moléculas maiores como a albumina,
SHBG e outras proteínas de ligação, este
procedimento ajuda a confirmar que o
método testosterona livre Coat-A-Count
não é influenciado por níveis de proteínas
de transporte.
Bilirrubina: A presença de bilirrubina em
concentrações acima de 200 mg/L não
tem interferência nos resultados, dentro
da precisão do ensaio.
Hemólise: A Presença de eritrocitos em
concentrações até 30 µL/mL não tem
efeito no resultado, dentro da precisão do
ensaio.
Tipo de amostra alternativa: Para
determinar o efeito de amostras
alternatives, foi colhido sangue de 49
voluntários em tubos secos, heparinizados
e tubos de EDTA. Os valores absolutos
obtidos para homens e mulheres
voluntários estão tabelados em baixo.
Faixa
absoluta
19 Voluntários
de laboratório
masculinos
pg/mL
30 Voluntários
de laboratório
femininos
pg/mL
Soro
9 – 47
0,7 – 3,6
Heparina
8 – 45
0,9 – 3,8
EDTA
13 – 79
1,3 – 5,7
Os resultados combinados destas 49
amostras – adicionada de mais uma –
50
(EDTA) = 1,48 (Soro) + 1,1 pg/mL
r = 0,957
Médias:
11,9 pg/mL (Heparina)
12,2 pg/mL (Soro)
19,2 pg/mL (EDTA)
Os resultados obtidos indicam que se
obtem resultados semelhantes para o
soro e plasma heparinizado, obtendo-se
valores mais elevados com o plasma com
EDTA.
Especificidade: O anticorpo da
testosterona livre é altamente específico
para a testosterona, com uma reacção
cruzada extremamente baixa a outros
esteroides existentes ou drogas
terapêuticas que podem estar presentes
nas amostras dos pacientes. (Ver tabela
de "Specificity".)
Comparação de Métodos: O ensaio foi
comparado a um método convencional de
diálise em 85 amostras de soro (43
masculinas e 42 femininas). Regressão
linear:
Homens (43)
(TKTF) = 0,42 (Diálise) + 9,8 pg/mL
r = 0,67
Médias:
26,3 pg/mL (TKTF)
39,0 pg/mL (Diálise)
Mulheres (42)
r = 0,75
Médias:
4,3 pg/mL (TKTF)
Combinadas (85)
r = 0,87
Médias:
15,4 pg/mL (TKTF)
O procedimento da Testosterona livre
Coat-A-Count foi também comparado ao
procedimento da Testosterona Total—
Testosterona Total Coat-A-Count—em
109 amostras de soro (51 masculinas e 58
femininas). Regressão linear:
Homens (51)
(Livre) = 4,7 (Total) + 0,7
r = 0,984
Médias:
23,6 pg/mL (Livre)
4,84 ng/mL (Total)
Understanding the Symbols
Understanding the Symbols
En English
Erklärung der Symbole
De Deutsch
Descripción de los símbolos
Es Español
Explication des symboles
Fr Français
Mulheres (58)
Comprensione dei simboli
It
(Livre) = 6,1 (Total) + 0,6
r = 0,978
Descrição dos símbolos
Pt Português
Médias:
3,9 pg/mL (Livre)
0,54 ng/mL (Total)
The following symbols may appear on the
product labeling: / Die folgenden Symbole
können auf dem Produktetikett verwendet
werden: / Los siguientes símbolos pueden
aparecer en la etiqueta del producto: / Les
symboles suivants peuvent apparaître sur les
étiquettes des produits : / Sull'etichetta del
prodotto possono essere presenti i seguenti
simboli: / Os seguintes símbolos podem
aparecer no rótulo dos produtos:
Combinadas (109)
(Livre) = 4,6 (Total) + 1,2
r = 0,992
Médias:
13,1 pg/mL (Livre)
2,6 ng/mL (Total)
Assistência Técnica
Por favor contacte o seu Distribuidor
Nacional.
O Sistema da Qualidade da Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está registado sob a norma ISO
13485:2003.
Coat-A-Count® is a trademark of Siemens
Healthcare Diagnostics.
Italiano
Symbol Definition
En: In vitro diagnostic medical
device
De: Medizinisches Gerät zur
In-vitro Diagnose
Es: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Fr: Dispositif médical de
diagnostic in vitro
It: Dispositivo medico per
diagnostica in vitro
Pt: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Siemens Healthcare Diagnostics Inc.
Los Angeles, CA 90045 USA
En: Catalog Number
De: Katalog-Nummer
Es: Número de referencia
Fr: Numéro de référence
catalogue
It: Numero catalogo
Pt: Número de catálogo
Siemens Healthcare Diagnostics Ltd.
Sir William Siemens Sq.
Frimley, Camberley, UK GU16 8QD
En: Manufacturer
De: Hersteller
Es: Fabricante
Fr: Fabricant
It: Produttore
Pt: Fabricante
©2010 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. All
rights reserved.
Origin: US
2010-10-21
PITKTF – 11
Changes in this Edition:
cc#19759: In Materials Required But Not
Provided section, added FDR catalog number
for foam decanting rack and PPO catalog
number for polypropylene tubes; removed
“available from Siemens” claim for graph paper
ZP797.
En: Authorized Representative in
the European Community
De: Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Union
Es: Representante autorizado en
la Unión Europea
Fr: Représentant agréé pour
l’Union européenne
It: Rappresentante autorizzato
nella Comunità europea
Pt: Representante Autorizado na
Comunidade Europeia
51
Symbol Definition
En: CE Mark
De: CE-Kennzeichen
Es: Símbolo de la CE
Fr: Marque CE
It: Marchio CE
Pt: Marca CE
Symbol Definition
En: Temperature limitation
(2–8°C)
De: Temperaturgrenze (2–8°C)
Es: Limitación de la temperatura
(2–8°C)
Fr: Limites de température
(2–8°C)
It: Limiti di temperatura (2–8°C)
Pt: Limites de temperatura
(2–8°C)
En: CE Mark with identification
number of notified body
De: CE-Kennzeichen
Identifikationsnummer der
benannten Stelle
Es: Marca de la CE con número
de identificación del organismo
notificado
Fr: Marque CE avec numéro
d’identification du corps notifié
It: Marchio CE con numero
identificativo dell'ente notificato
Pt: Marca CE, com número de
identificação do órgão notificado
En: Upper limit of temperature
(≤ -20°C)
De: Obere Temperaturgrenze
(≤ -20°C)
Es: Limitación superior de la
temperatura (≤ -20°C)
Fr: Limite supérieure de
température (≤ -20°C)
It: Limite superiore di temperatura
(≤ -20°C)
Pt: Limite máximo de temperatura
(≤ -20°C)
En: Consult instructions for use
De: Bedienungshinweise
beachten
Es: Consulte las instrucciones de
uso
Fr: Consulter le mode d’emploi
It: Consultare le istruzioni per
l'uso
Pt: Consulte as instruções de
utilização
En: Lower limit of temperature
(≥2°C)
De: Mindesttemperatur (≥2°C)
Es: Temperatura maxima (≥2°C)
Fr: Limite inférieure de
température (≥2°C)
It: Limite inferiore di temperature
(≥2°C)
Pt: Limite inferior de temperatura
(≥2°C)
En: Caution! Potential Biohazard
De: Vorsicht! Biologisches
Risikomaterial
Es: ¡Precaución! Peligro Biológico
Potencial
Fr: Avertissement ! Risque
biologique potentiel
It: Attenzione! Potenziale Pericolo
Biologico
Pt: Precaução! Potenciais Riscos
Biológicos
En: Do not freeze (> 0°C)
De: Nicht einfrieren (> 0°C)
Es: No congelar (> 0°C)
Fr: Ne pas congeler (> 0°C)
It: Non congelare (> 0°C)
Pt: Não congele (> 0°C)
En: Keep away from sunlight
De: Vor Sonneneinstrahlung
schützen
Es: Mantener protegido de la luz
solar
Fr: Maintenir hors de portée de la
lumière du soleil
It: Non esporre alla luce del sole
Pt: Manter protegido da luz solar
En: Radioactive Materials
De: Radioaktives Material
Es: Materiales radiactivos
Fr: Matériaux radioactifs
It: Materiali radioattivi
Pt: Materiais Radioactivos
En: Caution
De: Vorsicht
Es: Precaución
Fr: Avertissement
It: Attenzione
Pt: Precaução
52
LOT
En: Batch code
De: Chargenbezeichnung
Es: Código de lote
Fr: Numéro de code du lot
It: Codice lotto
Pt: Código de lote
Symbol Definition
En: Contains sufficient for (n)
tests
De: Es reicht für (n) tests
Es: Contiene material para (n)
pruebas
Fr: Suffisant pour (n) tests
It: Contiene materiale sufficiente
per (n) test
Pt: Contém o suficiente para (n)
testes
2008-01
En: Date format (year-month)
De: Datumsformat (Jahr-Monat)
Es: Formato de fecha (año-mes)
Fr: Format de la date
(année-mois)
It: Formato data (anno-mese)
Pt: Formato de data (ano-mês)
En: Use by
De: Verwendbar bis
Es: Fecha de caducidad
Fr: A utiliser avant
It: Usare entro
Pt: Use até
En: Harmful
De: Gesundheitsschädlich
Es: Nocivo
Fr: Nocif
It: Nocivo
Pt: Nocivo
En: Corrosive
De: Ätzend
Es: Corrosivo
Fr: Corrosif
It: Corrosivo
Pt: Corrosivo
En: Toxic
De: Giftig
Es: Tóxico
Fr: Toxique
It: Tossico
Pt: Tóxico
En: Dangerous for the
environment
De: Umweltgefährlich
Es: Peligroso para el medio
ambiente
Fr: Dangereux pour
l'environnement
It: Pericoloso per l'ambiente
Pt: Perigoso para o ambiente
53

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