laboratory science Stress-strain measurements of human and
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laboratory science Stress-strain measurements of human and
laboratory science Stress-strain measurements of human and porcine corneas after riboflavin–ultraviolet-A-induced cross-linking Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Theo Seiler, MD Purpose: To evaluate the biomechanical effect of combined riboflavin–ultraviolet A (UVA) treatment on porcine and human corneas. Setting: Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden, Dresden, Germany. Methods: Corneal strips from 5 human enucleated eyes and 20 porcine cadaver corneas were treated with the photosensitizer riboflavin and irradiated with 2 double UVA diodes (370 nm, irradiance ⴝ 3 mW/cm2) for 30 minutes. After crosslinking, static stress-strain measurements of the treated and untreated corneas were performed using a microcomputer-controlled biomaterial tester with a prestress of 5 ⫻ 103 Pa. Results: There was a significant increase in corneal rigidity after cross-linking, indicated by a rise in stress in treated porcine corneas (by 71.9%) and human corneas (by 328.9%) and in Young’s modulus by the factor 1.8 in porcine corneas and 4.5 in human corneas. The mean central corneal thickness was 850 m ⫾ 70 (SD) in porcine corneas and 550 ⫾ 40 m in human corneas. Conclusions: Riboflavin⫺UVA-induced collagen cross-linking led to an increase in mechanical rigidity in porcine corneas and an even greater increase in human corneas. As collagen cross-linking is maximal in the anterior 300 m of the cornea, the greater stiffening effect in human corneas can be explained by the relatively larger portion of the cornea being cross-linked in the overall thinner human cornea. J Cataract Refract Surg 2003; 29:1780 –1785 © 2003 ASCRS and ESCRS T he biomechanical properties of the cornea are primarily determined by the collagen fibers comprising 15 000 km and the degree of interfibrillar linkage.1 Therefore, collagen cross-linking induced by combined Accepted for publication March 17, 2003. From the Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden (Wollnesak, Spoerl), Dresden, Germany, and the Department of Ophthalmology, University of Zurich (Seiler), Zurich, Switzerland. None of the authors has a financial interest in any product mentioned. Reprint requests to Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Wollensak, University Eye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany. E-mail: [email protected]. © 2003 ASCRS and ESCRS Published by Elsevier Inc. riboflavin–ultraviolet A (UVA) treatment has been used successfully to mechanically stabilize the cornea in keratoconus (thereby stopping the progression of keratectasia2) and in corneal melting processes.3 No adverse effects have been observed clinically.2 However, biomechanical experimental measurements of the effect of combined riboflavin–UVA treatment on human corneas have not been done.4,5 This study measured the biomechanical effect of riboflavin–UVA-induced collagen cross-linking in human corneas and compared it to the effect in cross-linked porcine corneas having comparable biomechanical properties.6,7 0886-3350/03/$–see front matter doi:10.1016/S0886-3350(03)00407-3 LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING Materials and Methods Specimen Preparation Five freshly enucleated human eyes with intact and clear corneas that had been removed because of endophthalmitis (1 patient), choroidal melanoma (3 patients), and a nonhealing retinal detachment (1 patient) were used within 1 to 2 hours of enucleation. Before treatment, the corneal epithelium was completely scraped using a blunt hockey knife. The 12 o’clock position was marked with a nylon thread for orientation of the superior–inferior cut. The corneoscleral ring was then removed. With a self-constructed triple-blade scalpel, the cornea was cut into 2 equal strips of 4.0 mm width, 550 m central corneal thickness, and 14.0 mm length including 1.0 mm sclera on both ends. Human cadaver eyes had been measured but were not included in the study as the variances in the stress-strain measurements were too great because of different postmortem times and degrees of autolysis. Twenty fresh porcine cadaver eyes with intact epithelia and clear corneas were retrieved from the local slaughterhouse within 2 to 5 hours post-mortem. The eyes were deepithelialized mechanically, and the corneoscleral ring was removed using a scissors. With a self-constructed double-blade scalpel, 1 corneal strip of 5.0 mm width, 850 m central corneal thickness, and 14.0 mm length including 1.0 mm sclera on both ends was cut in a superior–inferior fashion from the 12 o’clock position of the cornea, which was easily identified by its oval shape. Because of the natural thickness of the porcine cornea, only 1 corneal strip with clearly cut perpendicular edges could be prepared properly from each eye. There were shear artifacts in the deeper layers otherwise. Ten corneas were treated with riboflavin–UVA irradiation, and 10 were used as untreated controls. Pachymetry Using ultrasound pachymetry (Pachette, Technomed), the central corneal thickness was determined in the human and porcine eyes. Figure 1. (Wollensak) Irradiation of riboflavin-treated human corneal strip using 2 double-UVA diodes (irradiance 3 mW/cm2 , exposure time 30 min) at 1.0 cm distance. 2000) at a distance of 1.0 cm and, if necessary, regulated with a potentiometer. Static Stress-Strain Measurements The human and porcine corneal strips were clamped horizontally at a distance of 8.0 mm between the jaws of a commercially available microcomputer-controlled biomaterial tester (Minimat, Rheometric Scientific GmbH (Figure 2). To include the physiological stress range, a prestress of 5 ⫻ 103 Pa (1 Pa ⫽ 1 N/m2) was used, which required a force of 10 mN in human corneas and 20 mN in porcine corneas because of the different thicknesses. The strain was then increased linearly with a velocity of 1.5 mm min–1, and the stress was measured up to 2 ⫻105 Pa.4,5 The stress-strain values were fitted by an exponential function ⫽ A exp (B ⫻ ε) using the SPSS-calculation program (SPSS GmbH Software, Munich). Young’s modulus (E) was calculated for 4%, 6%, and 8% strain as the gradient of the stress-strain graph (E ⫽ d/dε ⫽ A ⫻ B exp (B ⫻ ε). Treatment Starting 5 minutes before the treatment, 0.1% riboflavin (vitamin B2) photosensitizer solution (10 mg riboflavin-5phosphate in 10 mL 20% dextran-T-500) was dropped on the treated strips and 20% dextran solution on the control strips at 5-minute intervals. Ultraviolet A irradiation (370 nm) was applied using 2 double UVA diodes (Roithner Lasertechnik) with an irradiance of 3 mW/cm2 at a distance of 1.0 cm from the cornea for 30 minutes (Figure 1). This is equal to a dose of 5.4 J/cm2. The parameters of exposure were chosen according to the treatment procedure used in keratoconus patients.2 Three 1.3 V accumulators were used as a power generator. Before treatment, the desired irradiance of 3 mW/cm2 was controlled with a calibrated UVA meter (LaserMate-Q, Laser Figure 2. (Wollensak) Human corneal strip between the clamps of the stress-strain biomaterial tester (Minimat). J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 1781 LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING Statistical Evaluation The stress data necessary for a strain of 4%, 6%, and 8% in treated and untreated corneas (separately for human and porcine eyes) and in human and porcine corneas were compared using the Student t test. Results Stress-Strain Curves The stress-strain curves showed the typical exponential increase of a bioviscoelastic solid (Figure 3). In porcine corneas, the stress using 6% strain was 98.5 ⫾ 29.77 ⫻ 103 Pa in the treated corneas and 57.3 ⫾ 17.3 ⫻ 103 Pa in the untreated corneas, corresponding to a 71.9% increase (Table 1). The difference was statistically significant (P ⫽ .014). In human corneas, the stress using 6% strain was 227.3 ⫾ 95.7 ⫻ 103 Pa in the treated corneas and 53.0 ⫾ 11.5 ⫻ 103 Pa in the untreated corneas, corre- sponding to a 328.9% increase (Table 1). The difference was statistically significant (P ⫽ .012). In untreated corneas in porcine and human eyes, the difference in the stress-strain values was not statistically significant (P ⫽ .87). In treated corneas in porcine and human eyes, the difference was statistically significant (P ⫽ .01). The increased biomechanical stiffness was also reflected in the different bending behaviors (Figure 4). Young’s Modulus To calculate Young’s modulus, the stress-strain values were fitted with an exponential function ⫽ A exp (B ⫻ ε). The first derivation of this function in a definite strain is Young’s modulus E ⫽ d/dε ⫽ A ⫻ B exp (B ⫻ ε). In porcine corneas at 6% strain, Young’s modulus was 1.5 ⫻ 106 Pa in the untreated eyes and 2.7 ⫻ 106 Pa in the treated eyes (increase factor 1.8). In human cor- Figure 3. (Wollensak) Top: Stress-strain measurements of human corneas (n ⫽ 5) treated with riboflavin–UVA (irradiance ⫽ 3 mW/cm2). Bottom: Stress-strain measurements of porcine corneas (n ⫽ 20) treated with riboflavin–UVA (irradiance ⫽ 3 mW/cm2). 1782 J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING Table 1. Stress values for 4%, 6%, and 8% strain and calculated Young’s modulus in brackets. Stress at 4% (103 Pa) Stress at 6% (103 Pa) Stress at 8% (103 Pa) Untreated 33.7 ⫾ 9.3 (E ⫽ 0.8 ⫻ 106 Pa) 57.3 ⫾ 17.3 (E ⫽ 1.5 ⫻ 106 Pa) 86.5 ⫾ 29.9 (E ⫽ 2.6 ⫻ 106 Pa) Treated 55.8 ⫾ 17.6 (E ⫽ 1.4 ⫻ 106 Pa) 98.5 ⫾ 29.7 (E ⫽ 2.7 ⫻ 106 Pa) 151.8 ⫾ 44.7 (E ⫽ 5.3 ⫻ 106 Pa) 34.3 ⫾ 5.5 (E ⫽ 0.8 ⫻ 106 Pa) 53.0 ⫾ 11.5 (E ⫽ 1.3 ⫻ 106 Pa) 79.3 ⫾ 21.2 (E ⫽ 2.2 ⫻ 106 Pa) 135.7 ⫾ 61.4 (E ⫽ 3.0 ⫻ 106 Pa) 227.3 ⫾ 95.7 (E ⫽ 5.9 ⫻ 106 Pa) 344.7 ⫾ 141.9 (E ⫽ 11.8 ⫻ 106 Pa) Type of Cornea Porcine Human Untreated Treated Figure 4. (Wollensak) Treated (below) and untreated (above) porcine corneal strips with preservation of the corneal curvature in the treated cornea due to the increase in bending stiffness by collagen cross-linking. neas at 6% strain, Young’s modulus was 1.3 ⫻ 106 Pa in the untreated eyes and 5.9 ⫻ 106 Pa in the treated eyes (increase factor 4.5). Pachymetry The mean central corneal thickness was 850 ⫾ 70 m in porcine eyes and 550 ⫾ 40 m in human eyes. Discussion We found a significant increase in biomechanical rigidity by a factor of 4.5 in human corneas, as indicated by Young’s modulus, following riboflavin–UVA-induced collagen cross-linking. The increase in biomechanical stiffness in porcine eyes was also significant, but only by a factor of 1.8. The increase in biomechanical stiffness in the human corneas was surprisingly high. From previous mea- surements of porcine eyes, using slightly different treatment conditions (ie, treatment time [45 minutes], UVA irradiation source [mercury lamp with 365 nm UV filter], UVA irradiance [2 mW/cm2 ]), we expected an increase in the range of a factor of 2, as found in porcine eyes in the present study.4 From other experiments on the diameter of corneal collagen fibers,8 resistance to enzymatic digestion,9 and keratocyte loss after riboflavin–UVA treatment,9,10 we know that the cross-linking and cytotoxic effects are significantly higher in the anterior portion of the cornea. This is caused by the significant increase in UVA absorption by riboflavin, leading to a rapid reduction of UVA irradiance and collagen cross-linking across the cornea.11 Given the uneven distribution of collagen crosslinking, with the maximum cross-linking effect in the anterior 300 m of the corneal stroma, the treated corneas can be regarded as 2-layer structures. The anterior portion amounts to 35% cross-linking volume in the porcine cornea (300 m/850 m) and to 54% cross-linking volume in the human cornea (300 m/ 550 m), resulting in higher rigidity of the total cornea in human eyes, as reflected in the stress-strain measurements (Figures 3 and 5). In normal eyes, the more rigid anterior stroma also accounts for maintenance of the corneal curvature.12,13 The anterior localization of the main cross-linking effect has the advantage of allowing us to achieve a relatively high increase in corneal rigidity in human eyes because of the relatively small thickness of the human cornea and to spare the endothelium and the lens from cytotoxic damage provided the corneal stroma is normally thick. To avoid additional cross-linking inhomogeneities in the horizontal dimensions, the irradiation was performed over the entire length of the corneal strips using 2 double J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 1783 LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING Figure 5. (Wollensak) Two-layer model of cross-linked cornea with the anterior cross-linked and posterior non-cross-linked corneal stroma. In porcine corneas, the relative portion of the cross-linked cornea (t1/t) is less than in human corneas due to the greater corneal thickness in pig eyes (850 m versus 550 m), resulting in less rigidity for the total porcine cornea (as indicated by a lower total) ( ⫽ total stress of the cornea, 1 ⫽ partial stress of the cross-linked cornea layer, 2 ⫽ partial stress of the noncross-linked cornea layer, t ⫽ total thickness of the cornea, t1 ⫽ partial thickness of the cross-linked cornea layer, t2 ⫽ partial thickness of the noncross-linked cornea layer; ⫽ 1 ⫻ t1/t ⫹ 2 ⫻ t2/t). UVA diodes, whereas in clinical applications, we irradiate only the central cornea using 1 double UVA diode.2 The rise in biomechanical rigidity after collagen cross-linking in human and porcine corneas is probably caused by an increase in the collagen fiber diameter due to intrafibril cross-links.8 Other cross-linking methods that have been tested successfully in vitro have a biomechanical effect on the cornea comparable to riboflavin–UVA treatment but cannot be used clinically because of the development of corneal haze and scarring, as after glutaraldehyde treatment (W.J. Dupps, ARVO abstract 147, 2002),14 or application problems and prolonged treatment time, as with glyceraldehyde (F.J. Tessier, ARVO abstract 3234, 2002).14 In keratoconus, a 50% decrease in the stress necessary for a defined strain has been found.15 Accordingly, we have used the cross-linking treatment mainly in progressive keratoconus and less frequently in corneal melting processes. Further applications lie in the field of refractive surgery and are being explored in conditions such as after iatrogenic laser in situ keratomileusis (LASIK) induced keratectasia16,17 or for preventive treatment before LASIK for high myopia to avoid or reduce possible postoperative myopic regression or keratectasia. Collagen cross-linking might also help to 1784 avoid so-called central islands in broad-beam laser surgery (W.J. Dupps, ARVO abstract 147, 2002), often caused by differential corneal hydration,18 which is markedly reduced after cross-linking (E. Spoerl, ARVO abstract 2339, 1997). In conclusion, the present study showed a stronger increase in the biomechanical rigidity of the human cornea after riboflavin–UVA treatment than in the porcine cornea because of the relatively larger portion of crosslinking in the thinner human cornea. Practical applications of the new method are for progressive keratoconus, corneal-melting processes, and LASIK in high myopia. References 1. Maurice DM. Mechanics of the cornea. In: Cavanagh HD, ed, The Cornea; Transactions of the World Congress on the Cornea III. New York, NY, Raven, 1988; 187–193 2. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Riboflavin/ultravioletA-induced crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol 2003; 135:620 –627 3. Schnitzler E, Spörl E, Seiler T. Bestrahlung der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen, erste Ergebnisse bei vier Patienten. Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217:190 –193 4. Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res 1998; 66:97–103 5. Spörl E, Huhle M, Kasper M, Seiler T. Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut durch Vernetzung. Ophthalmologe 1997; 94:902–906 6. Zeng Y, Yang J, Huang K, et al. A comparison of biomechanical properties between human and porcine cornea. J Biomech 2001; 34:533–537 7. Kampmeier J, Radt B, Birngruber R, Brinkmann R. Thermal and biomechanical parameters of porcine cornea. Cornea 2000; 19:355–363 8. Wollensak G, Seiler T, Wilsch M, Spörl E. Collagen fiber— diameter after riboflavin/UVA induced collagencrosslinking in the rabbit cornea. In press, Cornea. 9. Spoerl E, Wollensak G, Seiler T. Increased resistance of riboflavin/UVA-treated cornea against enzymatic digestion. In press, Curr Eye Res 10. Wollensak G, Spoerl E, Wilsch M, Seiler T. Endothelial cell damage after riboflavin– ultraviolet-A treatment in the rabbit. J Cataract Refract Surg 2003; 29:1786 –1790 11. Spoerl E, Schreiber J, Hellmund K, et al. Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen. Ophthalmologe 2000; 97:203–206 12. Müller LJ, Pels E, Vrensen GFJM. The specific architecture of the anterior stroma accounts for maintenance J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING of corneal curvature. Br J Ophthalmol 2001; 85:437– 443 13. Bron AJ. The architecture of the corneal stroma [editorial]. Br J Ophthalmol 2001; 85:379 –381 14. Spoerl E, Seiler T. Techniques for stiffening the cornea. J Refract Surg 1999; 15:711–713 15. Andreassen TT, Simonsen AH, Oxlund H. Biomechanical properties of keratoconus and normal corneas. Exp Eye Res 1980; 31:435–441 16. Seiler T. Iatrogenic keratectasia: academic anxiety or serious risk? [editorial] J Cataract Refract Surg 1999; 25: 1307–1308 17. Argento C, Cosentino MJ, Tytium A, et al. Corneal ectasia after laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg 2001; 27:1440 –1448 18. Kim W-S, Jo J-M. Corneal hydration affects ablation during laser in situ keratomileusis surgery. Cornea 2001; 20:394 –397 J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 1785 Eye (2004), 1–5 & 2004 Nature Publishing Group All rights reserved 0950-222X/04 $25.00 www.nature.com/eye G Wollensak1 , E Spoerl1 , F Reber2 and T Seiler3 Abstract collagen crosslinking in the cornea using ultraviolet A (UVA) and the photosensitizer riboflavin. Collagen crosslinking leads to an increase in intra- and interfibrillar covalent bonds by photosensitized oxidation and causes a biomechanical stabilization of the cornea. In a prospective clinical pilot study including 22 patients with moderate or advanced progressive keratoconus and with a follow-up time of up to 4 years, the progression of keratoconus could thus be stopped in all treated eyes. Regression with a reduction of the maximal keratometry readings by 2 diopters was achieved in 70% of patients.1 In stress–strain measurements of the human,2 porcine,2,3 and rabbit4 cornea, a significant increase of mechanical rigidity was found. An increased resistance to collagenases could be demonstrated.5 Besides keratoconus and corneal ulcers, the new treatment can be used in corneal melting processes6 and in the field of refractive surgery to reduce the risk for iatrogenic keratectasia after LASIK (laser assisted in situ keratomileusis).7 The impact of various treatment modalities like corneal abrasion, PRK (photorefractive keratectomacy),8 LASIK,8,9 and epithelial injury10–12 on keratocytes has gained considerable interest in recent years having a possible influence on scarring or corneal thinning.10 Therefore, as part of a comprehensive safety evaluation, we have undertaken the following experimental study to assess the possible damage to corneal keratocytes after combined riboflavin/UVAtreatment and to compare it to the effect of UVA-irradiation alone. Purpose Collagen crosslinking using ultraviolet- A (UVA) -irradiation combined with the photosensitizer riboflavin is a new technique for treating progressive keratoconus. It has been shown to increase effectively the biomechanical strength of the cornea and to stop or even reverse the progression of keratoconus. As part of a safety evaluation, the present study was undertaken to investigate in vitro the possible cytotoxic effect of combined riboflavin/UVA-treatment on corneal keratocytes and to compare it to UVA-irradiation alone. Methods Cell cultures established from porcine keratocytes were treated with 0.025% riboflavin solution and various UVA (370 nm)irradiances ranging from 0.4 to 1.0 mW/cm2 and with UVA alone between 2 and 9 mW/cm2 for 30 min. The cell cultures were evaluated for cell death 24 h after irradiation using trypanblue and Yopro-fluorescence staining. Results An abrupt cytotoxic irradiance level was found at 0.5 mW/cm2 for keratocytes after UVA-irradiation combined with the photosensitizer riboflavin, which is 10-fold lower than the cytotoxic irradiance of 5 mW/ cm2 after UVA-irradiation alone. Conclusions A cytotoxic effect of combined riboflavin/UVA-treatment on keratocytes is to be expected at 0.5 mW/cm2, which is reached in the clinical setting in human corneas down to a depth of 300 mm using the standard surface UVA-irradiance of 3 mW/cm2. Eye advance online publication, 23 January 2004; doi:10.1038/sj.eye.6700751 Keywords: keratocytes; UVA; riboflavin; necrosis; cell culture; crosslinking Introduction We have recently developed a new method for the treatment of keratoconus by inducing LABORATORY STUDY Keratocyte cytotoxicity of riboflavin/UVAtreatment in vitro 1 Department of Ophthalmology Technical University of Dresden Dresden, Germany 2 Department of Anatomy Technical University of Dresden Dresden, Germany 3 Institut für Refraktive und Ophthalmo-Chirurgie (IROC) Zurich Switzerland Materials Correspondence: G Wollensak Wildentensteig 4 Berlin D-14195, Germany Tel: þ 49 351 458 3763 Fax: þ 49 351 458 4335 E-mail: gwollens@ hotmail.com All primary cultures and serial passaging were carried out in growth media consisting of Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Received: 3 February 2003 Accepted in revised form: 22 October 2003 Material and methods Keratocyte cytotoxicity G Wollensak et al 2 supplemented with 10% foetal calf serum (FCS, from Sigma, Deisenhofen, FRG), phenol red, and antibiotics (penicillin–streptomycin). Trypan-blue solution13 (Biochrome AG, Berlin, FRG) and Yopro (Molecular probes, Eugene, OR, USA)-fluorescent stain were used for the viability assay.14 Explant culture conditions Explant cultures13 were established from porcine eyes, which were obtained from a local slaughterhouse within 3–5 h postmortem. The epithelium was removed mechanically using a blunt hockey knife. Pieces 6 6 mm of mid-stromal lamellae were dissected by a pair of scissors, and transferred into a 25 cm2 cell culture flask (Nunc, Wiesbaden, FRG). The flask was filled with 2 ml DMEM plus 10% foetal calf serum and placed into an incubator gassed with carbon dioxide 6% at 371C. Cell outgrowth from the stromal explants started after 10–12 days, and confluence with about 2.5 106 cells per flask was reached after 21 days. The media were exchanged every week. The confluent stock cultures were passaged every 3 weeks with a split ratio of 1 : 3. For dissociation and detachment, the cultures were treated with 0.05% trypsin–EDTA solution. The free cells were centrifuged at 230 g, transferred into new culture flasks and resuspended. The cell growth was evaluated regularly using an inverted phase-contrast microscope at 100 magnification (Zeiss Axiovert L5). Before the irradiation, 5 104 cells were plated per well in eight-well tissue plates, where they reached confluence after 8–10 days. After another week, the UVA-irradiation was performed. was chosen and calculated as follows. In humans, 0.1% riboflavin solution is applied. Using the so-called diffusion equation and the diffusion coefficient (D ¼ 6.5 107 cm2/s) of the related dye fluorescein, we calculated the average riboflavin concentration over 30 min in the stroma as 0.024% riboflavin solution. Therefore, we used 0.025% riboflavin solution ( ¼ 500 mM) by adding 57 ml of 0.2% riboflavin stock solution to 400 ml colourless culture medium without phenol red. No riboflavin was added to the cultures with UVA-treatment alone. The riboflavin solution for the UVA-irradiation was added to the wells 5 min before the irradiation and was replaced by the cell medium after the irradiation. To avoid UVA-absorption by riboflavin solution overlying the monolayer of keratocytes attached to the floor of the wells, we irradiated the wells from underneath fixating the UVA-double diode (370 nm) 1 cm under the respective wells (Figure 1) with the help of a stand. The UVA-absorption by the 100 mm thin floor of the wells made of borsilicone was measured to be only 2% and was negligible. Before the treatment, the required UVA-irradiances ranging from 0.4 to 9 mW/cm2 were controlled with a UVA-meter (LaserMate-Q, LASER 2000, Wessling, Germany) at a 1 cm distance and if necessary regulated with a potentiometer in series. The irradiation itself lasted 30 min, which is conform to the clinical setting. Five wells were tested for each irradiance level. The irradiation doses (J/cm2) were calculated from the UVA-irradiances (mW/cm2) by multiplying the value with the irradiation time in seconds ( ¼ 30 60). Treatment groups The cells were exposed to three different treatments: 1. Riboflavin alone: The cells were exposed to 25, 50, 100, and 500 mM riboflavin solution. 2. Riboflavin plus UVA: The cells were exposed to 0.025% ( ¼ 500 mM) riboflavin solution plus UVA-irradiances ranging from 0.4 to 1 mW/cm2 (Table 1). 3. UVA alone: The cells were exposed to UVAirradiances ranging from 2 to 9 mW/cm2 (Table 1). Except for the varying UVA-irradiances, the other parameters like riboflavin concentration or the UVAwavelength of 370 nm were kept identical to the clinical treatment in the second treatment group. Irradiation procedure A riboflavin concentration as close as possible to the conditions of the clinical treatment of human corneas Eye Table 1 Cytotoxicity for porcine keratocytes after combined riboflavin/UVA-treatment and after UVA alone Irradiance level (mW/cm2) 9 8 7 6 5 4.5 4 3 2 0.8 0.7 0.6 0.55 0.5 0.45 0.4 ( þ ) Necrosis, () no cell damage. Riboflavin þ UVA UVA þ þ þ þ þ þ þ þ þ þ Keratocyte cytotoxicity G Wollensak et al 3 Figure 1 Irradiation procedure with double UVA-diode under the wells of the culture plate. Figure 2 Representative morphology of the cultured porcine keratocytes at confluence (phase-contrast, 100). Supravital staining To determine possible cell damage after treatment, 100 ml of 0.25% trypan-blue solution dissolved in colourless culture medium was applied per well for 15 min followed by twofold rinsing with culture medium. After microscopic evaluation of the trypan-blue staining,13 the cells were subsequently stained with Yopro adding 1 ml per well followed by one rinse with culture medium.14 For trypan blue (Figures 2 and 3), cultures were examined in an inverse microscope (Leica DMIR) at 100–400-fold magnification using differential interference contrast and for Yopro (Figure 4) using fluorescence at 488 nm (N2.1 filter). Photos were taken with a digital camera attached to the microscope (Nikon coolpix 950). Only the nuclei of damaged cells were labelled with the stains. Figure 3 Peripherial sector of the circular treatment area (riboflavin plus 0.5 mW/cm2 UVA) with trypan-blue-positive keratocytes and loss of cells (trypan blue, 400). Figure 4 Peripherial sector of the circular treatment area (5 mW/cm2 UVA) with Yopro-stained keratocyte nuclei (Yopro, 400). Results Cellular characteristics Before confluence, the scattered cells appeared dendritic, whereas they assumed a spindle-shaped appearance when confluence was reached (Figure 2). About 10% of the cells contained some brown-coloured, autofluorescent granules as is typical for lipofuscein deposits. After cytotoxic doses, the damaged cell nuclei stained positively with trypan blue (Figure 3) and the green-fluorescent Yopro (Figure 4). The cell damage detected by the two stains was always observed in the same cells and at the same irradiance level. In addition, dead cells became more globular in shape and about 5–10% of the damaged dead cells lost adhesion floating off the bottom of the wells. The area of the damaged cells Eye Keratocyte cytotoxicity G Wollensak et al 4 was shaped like a circle quasi like an imprint of the UVAbeam with surviving cells only in the nonirradiated periphery (Figures 3 and 4). Cytotoxicity The cytotoxic irradiance level was found to be 10-fold lower at 0.5 mW/cm2. ( ¼ 0.9 J/cm2) for keratocytes after riboflavin combined with UVA-irradiation compared to 5 mW/cm2 ( ¼ 9 J/cm2) for cells with UVA-irradiation alone (Table 1). The cytotoxic effect occurred in a threshold-like manner with a sharp and abrupt transition from damaging to nontoxic irradiance levels. There was no variability in the five different wells per irradiance level and always all cells irradiated with the toxic dose were damaged. There was no cytotoxicity for the cells treated with riboflavin alone without UVA-irradiation. Discussion The present study has shown an abrupt threshold-like cytotoxic irradiance level of combined riboflavin/UVAtreatment at 0. 5 mW/cm2. Using the standard surface irradiance of 3 mW/cm2 and the absorption coefficient of 53 cm1, it can be calculated according to the Lambert–Beer equation Idepth ¼ Isurfacee(dm) that in human corneas the cytotoxic keratocyte UVA-irradiance of 0.5 mW/cm2 is reached down to a stromal depth of 300 mm.4,15 These data fit well to our in vivo results in riboflavin/UVA-treated rabbit corneas, where we found exactly the same cytotoxic irradiance of 0.5 mW/cm2 with a keratocyte loss down to a depth of 300 mm after 3 mW/cm2 surface irradiance.16 UV-induced damage of keratocytes has also been reported by others and depends on the ultraviolet wavelength and dose. While ultraviolet C (UVC) (100–290 nm) is completely absorbed at the corneal surface and 80% of ultraviolet B (UVB) (290–315 nm) in the corneal epithelium, 25–34% of UVA (315–400 nm) is absorbed in the stroma.17 Accordingly, massive keratocyte damage was observed especially in the anterior portion of the rabbit cornea following exposure to UVA-irradiation at 350 nm.18,19 In the present in vitro study, the cytotoxic irradiance level after combined riboflavin/UVA-treatment was about 10-fold lower than that after treatment with UVA alone because the cytotoxic effect, which is due to the oxidant effect of UVA-light, is multiplied by the photosensitizer riboflavin due to increased UVAabsorption. Concurrent with this observation, UVA-absorption was shown by us to be increased to 95%4 in the cornea after riboflavin treatment compared to 25–35% without riboflavin.17 Eye Riboflavin (vitamin B2) alone produced no cell damage as is also known from other experiments20 and is not surprising because riboflavin is also present in the retina, liver, and heart, being an essential element in normal nutrition.21 In terms of the clinical problems of keratocyte loss, only long-term imbalances of the keratocyte reconstitution bear a risk for corneal thinning.8,10 However, this is not to be expected because the keratocyte loss can be repaired rapidly by repopulation from migrating keratocytes of the adjacent cornea.8,22 Loss of keratocytes has been observed already in other corneal procedures without having dramatic consequences. So after PRK,8 LASIK,8,9 or epithelial injury10–12 keratocyte apoptosis of variable degree was described. However, treatment-related keratocyte apoptosis might be an issue because of the presumptive role of keratocyte apoptosis in the pathogenesis of keratoconus.8 The state of the keratocytes was assessed 24 h following UVA-irradiation because then there is the maximum degree of cell damage as has been shown previously.16 To determine possible cell death, we first conducted trypan-blue staining followed by Yopro staining.14 Both stains are positive in the nuclei of damaged cells without interfering with cell viability, whereas undamaged endothelial cells are impervious to these dyes. The DNA-intercalant dye Yopro is also able to detect minor damage like in apoptotic cells due to its relatively low molecular weight (MW 629 vs 961).14 Yet, as the threshold for both Yopro and trypan blue was congruent, and at the same dose level, the cellular damage in the present in vitro experiment is obviously mainly due to necrosis because otherwise the Yopro stain should have been positive already at lower irradiance levels than the one found by trypan blue. In conclusion, we have shown that combined riboflavin/UVA-treatment leads to a 10-fold lower threshold for keratocyte cytotoxicity at 0.5 mW/cm2 compared to 5 mW/cm2 after UVA-irradiation alone. Using riboflavin/UVA in human corneas, keratocyte damage can be expected down to a depth of 300 mm using 3 mW/cm2 surface irradiance. Although no corneal thinning or scarring due to keratocyte loss has been observed so far in a 4-year-clinical trial,1 a long-term study including confocal in vivo microscopy in humans after riboflavin/UVA-treatment is currently underway to evaluate the depth of the keratocyte loss, the repopulation process, and to exclude reliably the development of treatment-related stromal scarring, haze, or thinning in humans. Keratocyte cytotoxicity G Wollensak et al 5 References 1 Wollensak G, Spoerl E, Seller T. Riboflavin/ultravioletA-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol 2003; 135: 620–627. 2 Wollensak G, Spoerl E, Seller T. Stress–strain measurements of human and porcine corneas after riboflavin-ultraviolet-Ainduced cross-linking. J Cataract Refract Surg 2003; 29: 1780– 1785. 3 Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res 1998; 66: 97–103. 4 Spoerl E, Schreiber J, Hellmund K, Seiler T, Knuschke P. Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen. Ophthalmologe 2000; 97: 203–206. 5 Spoerl E, Wollensak G, Seiler T. Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Curr Eye Res 2003, accepted for publication. 6 Schnitzler E, Spoerl E, Seiler T. Bestrahlung der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen, erste Ergebnisse bei vier Patienten. Klin Mbl Augenheilkd 2000; 217: 190–193. 7 Seiler T. Iatrogenic keratectasia: academic anxiety or serious risk? (Editorial). J Cataract Refract Surg 1999; 25: 1307–1308. 8 Wilson SE. Keratocyte apoptosis in refractive surgery. CLAO J 1998; 24: 181–185. 9 Mitooka K, Ramirez M, Maguire LJ, Erie JC, Patel SV, McLaren JW et al . Keratocyte density of central human cornea after laser in situ keratomileusis. Am J Ophthalmol 2002; 133: 307–314. 10 Kim W-J, Helena MC, Mohan RR, Wilson SE. Changes in corneal morphology associated with chronic epithelial injury. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 35–42. 11 Campos M, Szerenyi K, Lee M, McDonnell JM, Lopez PF, McDonnell PJ. Keratocyte loss after corneal 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 deepithelialization in primates and rabbits. Arch Ophthalmol 1994; 112: 254–260. Gurelik BG, Bilkgihan K, Sezer C, Akyol G, Hasanreisoglu B. Effect of mechanical vs dilute ethanol epithelial removal on keratocyte apoptosis and polymorpho-nuclear leukocyte migration. Eye 2002; 16: 136–139. Borderie VN, Lopez M, Lombet A, Carvajal-Gonzalez S, Cywiner C, Laroche L. Cryopreservation and culture of human corneal keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998; 40: 1511–1519. Idziorek T, Estaquier J, De Bels F, Ameisen J-C. YOPRO-1 permits cytofluorometric analysis of programmed cell death (apoptosis) without interfering with cell viability. J Immunol Meth 1995; 185: 249–258. Kolozsvári L, Nógrádi A, Hopp B, Bor Z. UV absorbance of the human cornea in the 240- to 400-nm range. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43: 2165–2168. Wollensak G, Spoerl E, Wilsch M, Seiler T. Keratocyte apoptosis after corneal collagen-crosslinking using riboflavin-UVA treatment. Cornea 2003, accepted for publication. Tsubai T, Matsuo M. Ultraviolet light-induced changes in the glucose-6-phosphate dehydrogenase activity of porcine corneas. Cornea 2002; 21: 495–500. Ringvold A, Davanger M. Changes in the rabbit corneal stroma caused by UV-radiation. Acta Ophthalmol 1985; 63: 601–606. Pitts DG, Cullen AP, Hacker PD. Ocular effects of ultraviolet radiation from 295-365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977; 16: 932–939. Cho K-S, Lee EH, Choi J-S, Joo C-K. Reactive oxygen species-induced apoptosis and necrosis on bovine corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 911–919. Dollery C Therapeutic Drugs, Vol. 2. Churchill Livingstone: Edinburgh, 1991, pp 24–25. Podskochy A, Fagerholm P. Cellular response and reactive hyaluronan production in UV-exposed rabbit corneas. Cornea 1998; 17: 640–645. Eye Basic Investigations CORNEA 43 Volume 23, Number 1 January 2004 Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking Using Riboflavin/UVA Treatment Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Michaela Wilsch, PhD, and Theo Seiler MD, PhD Abstract Purpose: Combined riboflavin/UVA treatment inducing collagen cross-links in the cornea has been shown to increase the biomechanical rigidity of the cornea and has been used successfully in the treatment of progressive keratoconus. The current study was undertaken to investigate the possible cytotoxic effect of combined riboflavin/UVA treatment on corneal keratocytes in vivo. Methods: Thirty-four New Zealand white rabbits were treated with 0.1% riboflavin solution and surface UVA irradiances ranging from 0.75 to 4 mW/cm2 (1.35– 7.2 J/cm2) for 30 minutes. The animals were euthanized either 4 (n = 6) or 24 (n = 28) hours postoperatively. Four additional control eyes underwent epithelial debridement alone. The corneas of the enucleated eyes were evaluated in routine histologic sections. In addition, the TUNEL technique and transmission electron microscopy were used for the detection of keratocyte apoptosis. Results: In the control eyes with corneal epithelial debridement only, apoptotic keratocytes were found in the anterior 50 µm of the corneal stroma 4 hours postoperatively. However, riboflavin/UVA-induced apoptosis was only visible in the rabbit eyes enucleated 24 hours postoperatively. In these eyes, we found apoptosis of keratocytes down to a variable stromal depth depending on the applied UVA irradiance. A cytotoxic UVA irradiance for keratocytes in the range of 0.5–0.7 mW/cm2 could be deduced. Conclusions: Riboflavin/UVA treatment leads to a dosedependent keratocyte damage that can be expected in human corneas down to a depth of 300 µm using a surface UVA dose of 5.4 J/cm2. Future studies should be done to examine the keratocyte repopulation and exclude possible adverse sequelae of keratocyte loss like stromal scarring or thinning. Key Words: UVA radiation, cross-linking, keratocytes, riboflavin, cornea, apoptosis (Cornea 2004;23:43–49) C ollagen cross-linking in the cornea using UVA and the photosensitizer riboflavin was developed by us recently for biomechanically strengthening the cornea. In a prospective clinical pilot study including 22 patients with progressive keratoconus and a follow-up of up to 4 years, the progression of keratoconus could be stopped in all treated eyes. Even regression with a reduction of the maximal keratometry readings by 2 diopters was achieved in 70% of patients. Corneal and lens transparency as well as endothelial cell density remained unchanged.1 In stress-strain measurements of human, rabbit, and porcine cornea,2–4 we could show a significantly increased biomechanical rigidity. After exposure to collagenases that play a role in both keratoconus and corneal ulceration, a significant delay in enzymatically induced tissue dissolution by 8 days was found in cross-linked corneas indicating an increased resistance to enzymatic digestion.5 Other applications of the new cross-linking method lie in the treatment of corneal melting processes6 and in the field of refractive surgery like prevention of postoperative keratectasia after LASIK for high myopes or regression of the refractive effect.7 As part of an extensive safety evaluation of the new treatment, we have undertaken the following experimental study to assess the possible damage to the keratocytes after combined riboflavin/UVA treatment. Received for publication February 6, 2003; revision received July 9, 2003; accepted August 15, 2003. From the Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden, Dresden, Germany (Drs. Wollensak and Spoerl); Max-Planck-Institute for Cell Biology and Genetics, Dresden, Germany (Dr. Wilsch); and the Department of Ophthalmology, University of Zurich, Zurich, Switzerland (Dr. Seiler). Reprints: Gregor Wollensak, MD, Wildentensteig 4, D-14195 Berlin, Germany (e-mail: [email protected]). Copyright © 2003 by Lippincott Williams & Wilkins 44 CORNEA Wollensak et al Volume 23, Number 1 January 2004 MATERIAL AND METHODS Thirty-eight eyes of 38 female New Zealand white rabbits weighing 2–2.5 kg were used. Thirty-four eyes of 34 rabbits were treated with central epithelial abrasion, riboflavin, and varying UVA irradiances (see below). Four control eyes in 4 rabbits were treated with corneal abrasion alone. The animals were divided into 2 subsets depending on the postoperative time interval of either 4 or 24 hours, respectively: 1. Six rabbits were irradiated with a surface UVA irradiance ranging from 0.75 to 4 mW/cm2 (0.75, 1.5, 3, and 4 mW/cm2) (Table 1). These animals were all euthanized 4 hours postoperatively. Two additional rabbits underwent corneal epithelial debridement alone and were euthanized 4 hours postoperatively as well (n = 8). 2. Twenty-eight rabbits treated with riboflavin and irradiated with a surface UVA irradiance ranging from 0.75 to 4 mW/cm2 (0.75, 1.5, 1.88, 2.25, 2.62, 3, and 4 mW/cm2) (Table 1) were euthanized 24 hours postoperatively. Two additional rabbits underwent corneal epithelial debridement alone and were euthanized 24 hours postoperatively as well (n = 30). mg/kg) and 0.5 mL xylazine hydrochloride (5 mg/kg) were used. In each rabbit, only the right eye was exposed to UV radiant energy. A lid speculum was placed. After removal of the central 5-mm portion of the epithelium using a blunt crescent knife, riboflavin (vitamin B2) photosensitizer solution containing 0.1% riboflavin-5-phosphate and 20% dextran T-500 was dropped onto the cornea 5 minutes before the irradiation to achieve good corneal penetration of the solution and every 5 minutes during the irradiation. The eyes were irradiated with UVA (370 nm) for 30 minutes using a double UVA diode (Roithner Lasertechnik, Vienna, Austria) at a distance of 1 cm from the cornea. Three 1.3-V accumulators were used as a power generator. Before the treatment, the desired surface irradiance in the range from 0.75 to 4 mW/cm2 (Table 1) was controlled with a calibrated UVA meter (LaserMate-Q, LASER 2000, Wessling, Germany) at a 1-cm distance and if necessary regulated with a potentiometer. The animals were euthanized 4 or 24 hours postoperatively with general anesthesia using an overdose of intravenous sodium phenobarbital. All animal procedures were approved by the ethics committee and conformed to the ARVO Resolution on the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Cross-linking Treatment Tissue Preparation General anesthesia was performed with a subcutaneous injection of a mixture of diazepam and atropine (1 mg). For premedication, 1.5 mL ketamine hydrochloride 10% (35 The rabbit eyes enucleated 4 or 24 hours postoperatively were bisected. One half was fixed in 4% neutral-buffered formalin for light microscopy and the other half was Study Design TABLE 1. Depth of Keratocyte Loss in Relation to UVA Irradiance Group n Surface UVA Irradiance (mW/cm2) Depth of Keratocyte Loss (µm) Calculated Cytotoxic UVAIrradiance (mW/cm2) 1 2 3 4 5 6 7 3 6 5 3 3 5 3 4 3 2.62 2.25 1.88 1.5 0.75 350 300 260 200 170 130 80 0.63 0.61 0.66 0.77 0.76 0.75 0.49 © 2003 Lippincott Williams & Wilkins Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking CORNEA Volume 23, Number 1 January 2004 immersed in 2% glutaraldehyde for transmission electron microscopy (TEM). For light microscopy, 4-µm thin paraffin sections were stained with hematoxylin-eosin and periodic acid–Schiff (PAS). The specimens were evaluated using a Zeiss light microscope (Axioskop) at 40- to 1000- fold magnification. The depth of the damaged zone with loss of keratocytes, and few remaining apoptotic keratocytes was measured using a special morphometry reticule For transmission electron microscopy, small pieces of the central cornea were postfixed in 4% osmium tetroxide, dehydrated, and embedded in Epon resin. After observation of the semithin sections stained with toluidine blue, 50–70-nm ultrathin sections were prepared, mounted on copper grids, contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and assessed using the Morgagni 268D electron microscope (Philips) at 3500– 34,000× magnification. TUNEL Assay To detect apoptosis with DNA strand breaks in situ, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) was performed essentially as described previously.8 In brief, after the quenching of endogenous peroxidase, sections were incubated with TdT buffer (30 mN Tris, 140 mmol/L sodium cacodylate, 1 mmol/L cobalt chloride) at pH 7.2 and incubated with 0.3 u/mL TdT (Sigma, München, Germany) and biotinylated-dUTP (1:200; Boehringer, Mannheim, Germany) in TdT buffer for 60 minutes at 37°C. Labeled nuclei were detected with Vectastain ABC (Vector Labs, Burlingame, CA) and peroxidase activity was visualized by 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) to yield a reddish brown reaction product. The sections were lightly counterstained with hematoxylin. As a positive control, tissue sections of follicular hyperplasia of the appendix were used and gave the expected positive staining of tingible bodies in the germinal centers. Calculation of Cytotoxic UVA Irradiances and Doses The cytotoxic UVA irradiance was determined by correlating the depth of the keratocyte loss with the corresponding UVA irradiances reached at the specific stromal depth that were calculated according to the equation Idepth = I surface · e(−dµ) (Lambert-Beer law) using the absorption coefficient µ of 53 cm−1 that was found by us in earlier UVA transmission measurements following riboflavin treatment (Table 1).4,9 Irradiation doses (J/cm2) were calculated from the UVA irradiances (mW/cm2) by multiplying the value with the irradiation time in seconds (30 × 60). RESULTS Light Microscopy and TUNEL Assay In the 6 cross-linked corneas, all euthanized 4 hours postoperatively and the 4 control eyes with corneal abrasion alone, euthanized 4 or 24 hours postoperatively, only scattered apoptotic keratocytes were present down to a depth of 50 µm in the anterior stroma as shown by light microscopy in the TUNEL-stained sections and on transmission electron microscopy. In the 28 cross-linked corneas, all euthanized 24 hours postoperatively, a massive loss of keratocytes with an almost acellular zone and some remaining apoptotic, TUNELpositive, or completely destroyed necrotic cells were observed in variable depths of the corneal stroma correlating with an increasing surface UVA irradiance (Figs. 1, 2A–C, 3A; Table 1). All these changes were only present in the treated area with a sharp transition zone toward the normal-appearing adjacent tissue without treatment (Fig. 2C). Some regenerating thinned epithelium was present over the edges of the lesion as some epithelial migration had already taken place in the deepithelialized treatment zone within 24 hours (Fig. 2C). Transmission Electron Microscopy Irradiated apoptotic keratocytes revealed apoptotic changes like formation of 45 46 CORNEA Wollensak et al Volume 23, Number 1 January 2004 FIGURE 1. Scheme illustrates the depth of keratocyte loss depending on surface UVA irradiance. apoptotic bodies, chromatin condensation, and cell shrinkage (Figs. 3B,C). Cytotoxicity The cytotoxicity level for keratocytes was calculated for the various stromal depths according to the Lambert-Beer law (see above) and found to be in the range of 0.49– 0.77 mW/cm2 irradiance corresponding to UVA doses of 0.86–1.39 J/cm2 (Table 1). DISCUSSION The current study has shown significant keratocyte damage after combined riboflavin/UVA cross-linking treatment correlating closely with the level of UVA irradiance (Figs. 1 and 2; Table 1). Using the LambertBeer law and the absorption coefficient of 53 cm−1 for the UVA irradiation in riboflavintreated cornea,4,9 we were able to deduce a cytotoxic irradiance threshold for keratocytes in the range of 0.5–0.7 mW/cm2 from the depth of the keratocyte loss and the corresponding irradiance levels. In the eyes of the irradiated animals that had been euthanized 4 hours postoperatively and in the deepithelialized control eyes, keratocyte apoptosis was located only in the anterior 50 µm, whereas in the irradiated ani© 2003 Lippincott Williams & Wilkins mals euthanized 24 hours postoperatively, extended and deep keratocyte loss and apoptosis was found. Obviously, in the cases euthanized 4 hours postoperatively, keratocyte apoptosis was of the immediate type10,11 and only due to epithelial scraping, as has been described by others after corneal deepithelialization. 12,13 Accordingly, in the eyes enucleated 24 hours postoperatively, a more delayed type of apoptosis was found that was due to UVA.10,11 Riboflavin by itself is not cytotoxic, but as a photosensitizer, it increases the absorption of UVA, which induces the cellular damage.14 Similar UVA-induced keratocyte damage has been reported after UVA irradiation without a photosensitizing agent. Using pigmented rabbits, Pitts et al15 found a corneal damage threshold at the surface UVA dose (365 nm) of 42.5 J/cm2. Our relatively low cytotoxic UVA surface dose in the range of 1.35–7.2 J/cm2 can be explained by the multiplying effect on the UVA absorption by riboflavin.14 UVB-induced keratocyte loss can be found already at lower dose levels because of the shorter wavelength of UVB with a correspondingly higher energy content. Histologically, keratocyte damage was observed, especially in the anterior onefourth of the albino rabbit cornea after expo- Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking CORNEA Volume 23, Number 1 January 2004 FIGURE 2. Light micrograph (A) and schematic diagram (B) of keratocyte loss and apoptosis down to 100 µm 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 0.75 mW/cm2 (hematoxylin and eosin, ⳯200). Light micrograph (C) and schematic diagram (D) of keratocyte loss and apoptosis down to 170 µm 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 1.88 mW/cm2 (hematoxylin and eosin, ⳯200). Light micrograph (E) and schematic diagram (F) of transition from the irradiated area with a total keratocyte loss across the entire stroma 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 4 mW/cm2 (hematoxylin and eosin, ⳯200) to the adjacent normal cornea. Thinned healing epithelium migrating from the right side. 47 48 CORNEA Wollensak et al Volume 23, Number 1 January 2004 FIGURE 3. A: TUNEL-positive apoptotic keratocytes (arrowheads) in the posterior half of the cornea 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 4 mW/cm2 (oil immersion, ⳯1000). B: Apoptotic cell bodies, chromatin condensation, and cell shrinkage in the central keratocyte 24 hours after irradiation surface UVA irradiance of 4 mW/cm2 (TEM, uranyl acetate and lead citrate, ⳯3500). The frame delineates the portion that is shown magnified in C. C: Higher magnification of the apoptotic keratocyte illustrates apoptotic cell bodies (TEM, uranyl acetate and lead citrate, ⳯34,000). sure to 290–350 nm UVB irradiation over 15 minutes.16 After UVB irradiation of 0.12 J/cm2 at 280 nm and 0.47 J/cm2 at 310 nm, other authors have reported extended UVinduced keratocyte apoptosis through the en© 2003 Lippincott Williams & Wilkins tire thickness of the cornea 24 hours after the treatment.17,18 The clinical importance of massive keratocyte loss is not quite clear because the keratocyte loss can usually be repaired by repopulation from migrating keratocytes of the adjacent cornea.12,19 In other treatment modalities like corneal abrasion,20–22 PRK,12,19 LASIK,12,19,23 and epikeratophakia24 or diseases like keratoconus25 and herpes,26 keratocyte loss of variable extension has been reported in recent years having a possible influence on scarring, haze, 27 or corneal thinning.20,25 However, in our clinical study, we have not observed any change in transparency or corneal thickness after the crosslinking treatment.1 Application of the apoptosis inhibitor zinc chloride is not helpful28 because then the wanted cross-linking effect would also be weakened.14 In conclusion, we have shown that combined riboflavin/UVA cross-linking treatment leads to a dose-dependent keratocyte apoptosis at 0.86–1.39 J/cm2 and can be expected in human corneas of 500-µm thickness down to a depth of 300 µm using the usual 3 mW/cm 2 surface irradiance (5.4 J/cm2 surface dose). A clinical long-term study using confocal in vivo microscopy29 after riboflavin/UVA treatment is currently underway to evaluate the depth of the keratocyte loss and the repopulation process and to exclude the development of treatmentrelated stromal scarring, haze, and thinning in humans. REFERENCES 1. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Riboflavin/ultravioletA-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 2003;135:620–627. 2. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Stress-strain measurements of human and porcine cornea after riboflavin/UVA-induced crosslinking. J Cataract Refract Surg. 2003;29:1780–1785. 3. Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res. 1998;66:97–103. 4. Spoerl E, Schreiber J, Hellmund K, et al. Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen. Ophthalmologe. 2000;97:203–206. 5. Spoerl E, Wollensak G, Seiler T. Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Curr Eye Res 2003 (submitted). 6. Schnitzler E, Spoerl E, Seiler T. Bestrahlung der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking CORNEA Volume 23, Number 1 January 2004 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen, erste Ergebnisse bei vier Patienten. Klin Mbl Augenheilkd. 2000;217:190–193. Seiler T, Koufala K, Richter G. Iatrogenic ectasia after laser in situ keratomileusis. J Refract Surg. 1998; 14:312–317. Ihling C, Szombathy T, Nampoothiri K, et al. Cystic medial degeneration of the aorta is associated with p53 accumulation, Bax upregulation, apoptotic cell death, and cell proliferation. Heart. 1999;82:286– 293. Kolozsvári L, Nógrádi A, Hopp B, et al. UV absorbance of the human cornea in the 240- to 400-nm range. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:2165– 2168. Michael R, Vrensen GFJM, van Marle J, et al. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;39:2681–2687. Pourzand C, Tyrrell RM. Apoptosis, the role of oxidative stress and the example of solar UV radiation. Photochem Photobiol. 1999;70:380–390. Helena MC, Baerveldft F, Kim W-J, et al. Keratocyte apoptosis after corneal surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;39:276–283. Kim W-J, Helena MC, Mohan RR, et al. Changes in corneal morphology associated with chronic epithelial injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999;40: 35–42. Cho K-S, Lee EH, Choi J-S, et al. Reactive oxygen species-induced apoptosis and necrosis in bovine corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999;40:911–919. Pitts DG, Cullen AP, Hacker PD. Ocular effects of ultraviolet radiation from 295-365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1977;16:932–939. Ringvold A, Davanger M. Changes in the rabbit corneal stroma caused by UV radiation. Acta Ophthalmol. 1985;63:601–606. Podskochy A, Gan L, Fagerholm P. Apoptosis in UVexposed rabbit corneas. Cornea. 2000;19:99–103. 18. Podskochy A, Fagerholm P. Cellular response and reactive hyaluronan production in UV-exposed rabbit corneas. Cornea. 1998;17:640–645. 19. Wilson SE. Keratocyte apoptosis in refractive surgery. CLAO J. 1998;24:181–185.</bok> 20. Wilson SE, Kim W-J. Keratocyte apoptosis: Implications on corneal wound healing, tissue organization, and disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;39: 220–226. 21. Wilson SE, He Y-G, Wenig J, et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Exp Eye Res. 1996;62:325–337. 22. Campos M, Szerenyi K, Lee M. et al. Keratocyte loss after corneal deepithelialization in primates and rabbits. Arch Ophthalmol. 1994;112:254–260. 23. Mitooka K, Ramirez M, Maguire LJ, et al. Keratocyte density of central human cornea after laser in situ keratomileusis. Am J Ophthalmol. 2002;133:307– 314. 24. Binder PS, Baumgartner SD, Fogle JA. Histopathology of a case of epikeratophakia (aphakic epikeratoplasty). Arch Ophthalmol. 1985;103:1357–1363. 25. Kim W-J, Rabinowitz YS, Meisler DM, et al. Keratocyte apoptosis associated with keratoconus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999;69:475–481. 26. Wilson SE, Pedroza L, Beuerman R, et al. Herpes simplex virus type-1 infection of corneal epithelial cells induces apoptosis of the underlying keratocytes. Exp Eye Res. 1997;64:775–779. 27. Nagy ZZ, Hiscott P, Seitz B, et al. Ultraviolet-B enhances corneal stromal response to 193-nm excimer laser treatment. Ophthalmology. 1997;104:375– 380. 28. Kuo IC, Seitz B, LaBree L, et al. Can zinc prevent apoptosis of anterior keratocytes after superficial keratectomy? Cornea. 1997;16:550–555. 29. Hahnel C, Somodi S, Weiss DG, et al. The keratocyte network of human cornea: a three-dimensional study using confocal laser scanning fluorescence microscopy. Cornea. 2000;19:185–193. 49 Endothelial cell damage after riboflavin– ultraviolet-A treatment in the rabbit Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Michaela Wilsch, PhD, Theo Seiler, MD, PhD Purpose: To evaluate the possible cytotoxic effect of combined riboflavin– ultraviolet-A (UVA) treatment on the corneal endothelium. Setting: Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden, Dresden, Germany. Methods: The right eyes of 34 New Zealand White rabbits were treated with riboflavin and various endothelial UVA doses ranging from 0.16 to 0.9 J/cm2 (0.09 to 0.5 mW/cm2, 370 nm) and postoperative enucleation times of 4 hours and 24 hours. The endothelial cells were evaluated in histological sections. The terminal deoxynulceotidyl transferase deoxy-UTP-nick-end labeling (TUNEL) technique and transmission electron microscopy were used to detect apoptosis. Results: There was no endothelial damage in the 6 rabbit eyes enucleated at 4 hours. In those enucleated at 24 hours, there was significant necrosis and apoptosis of endothelial cells in the corneas treated with an endothelial dose of ⱖ0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2), which is about twice the endothelial UVA dose used in the treatment of keratoconus patients. Conclusions: In rabbit corneas with a corneal thickness less than 400 m, the endothelial UVA dose reached a cytotoxic level of ⱖ0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2) using the standard surface UVA dose of 5.4 J/cm2 (3 mW/cm2). Pachymetry should be routinely performed before riboflavin–UVA treatment; in thinner corneas, irradiation should not be done because of the cytotoxic risk to the endothelium. J Cataract Refract Surg 2003; 29:1786 –1790 © 2003 ASCRS and ESCRS C ollagen cross-linking in the cornea using combined riboflavin– ultraviolet-A (UVA) treatment leads to a significant increase in mechanical stiffness, as shown in stress-strain measurements1–3 and increased resistance to collagenases.4 The treatment’s main clinical use is in progressive keratoconus,5 corneal ulcers,6 and before laser in situ keratomileusis in eyes with high myopia to Accepted for publication February 13, 2003. From the Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden (Wollensak, Spoerl), and Max-Planck-Institute for Cell Biology and Genetics (Wilsch), Dresden, Germany, and the Department of Ophthalmology, University of Zurich (Seiler), Zurich, Switzerland. None of the authors has a financial interest in any product mentioned. Reprint requests to Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Wollensak, University Eye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany. E-mail: [email protected]. © 2003 ASCRS and ESCRS Published by Elsevier Inc. reduce the risk for postoperative myopic regression or iatrogenic keratectasia. Preservation of the endothelium is crucial for every treatment involving the cornea; 400 to 800 endothelial cells/mm2 is the minimum endothelial cell count for a clear cornea.7 However, the risk involved in the new method of cross-linking is unknown and a major concern that must be clarified before the technique can be applied on a larger scale. In this experimental study, we evaluated the cytotoxic damage to the corneal endothelium after riboflavin–UVA treatment. Materials and Methods Rabbit Eyes In the experiments, 36 right eyes of 36 female New Zealand White rabbits weighing 2.0 to 2.5 kg were used. 0886-3350/03/$–see front matter doi:10.1016/S0886-3350(03)00343-2 LABORATORY SCIENCE: ENDOTHELIAL CELL DAMAGE AFTER CROSS-LINKING The animals were divided into 2 groups: 7 rabbits killed 4 hours postoperatively and 29 rabbits killed 24 hours postoperatively. In the first group, 2 rabbits were irradiated with an endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2 (irradiance 0.36 mW/cm2); 1 with 0.9 J/cm2 (0.5 mW/cm2); 2 with 0.33 J/cm2 (0.18 mW/cm2), which was equivalent to the endothelial UVA intensity used in humans; and 1 with 0.16 J/cm2 (0.09 mW/cm2) (Table 1). These animals (n ⫽ 6) were killed 4 hours postoperatively. One additional rabbit received a corneal abrasion only and was also killed at 4 hours. In the second group, 28 rabbits treated with riboflavin and irradiated with an endothelial UVA dose ranging from 0.16 to 0.9 J/cm2 (irradiance 0.09 to 0.5 mW/cm2) (ie, surface epithelial doses of 1.35, 2.7, 3.4, 4.0, 4.7, 5.4, and 7.2 J/cm2 [irradiance 0.75, 1.5, 1.88, 2.25, 2.62, 3.0, and 4.0 mW/cm2]) (Table 1) were killed 24 hours postoperatively. One additional rabbit received a corneal abrasion only and was also killed at 24 hours. Treatment Procedure General anesthesia was induced with a subcutaneous injection of a mixture of diazepam (1 ampule Faustan威) and atropine (1⁄2 ampule, 1 mg). For premedication, 1.5 mL ketamine hydrochloride 10% (Rompun威) (35 mg/kg) and 0.5 mL xylazine hydrochloride (5 mg/kg) were used. The rabbits were placed on the left side with the left eye closed; the right eye was held open with a lid holder (Figure 1). The central 5.0 mm portion of the epithelium was removed with a blunt hockey knife; 5 minutes before the irradiation, a riboflavin photosensitizer solution containing 0.1% riboflavin-5phosphate and 20% dextranT-500 was placed on the cornea to achieve good corneal penetration of the solution; this was repeated every 5 minutes during the irradiation. The eyes were exposed to a surface UVA (370 nm) irradiance ranging from 0.75 to 4.0 mW/cm2 (Table 1) for 30 minutes using a double UVA diode (Roithner Lasertechnik) 1.0 cm from the cornea (Figure 1). The respective endothelial UVA irradiances Figure 1. (Wollensak) Irradiation procedure showing a double UVA diode 1.0 cm from the riboflavin-treated rabbit cornea. between 0.09 and 0.50 mW/cm2 were calculated according to the equation Idepth ⫽ I surface ⫻ e(⫺d), where depth (d) was 400 m and the UVA-absorption coefficient () was 53 cm⫺1, determined in earlier UVA-transmission measurements following riboflavin treatment.2 Before treatment, the desired irradiance was controlled with a calibrated UVA meter (LaserMate-Q, Laser 2000) at 1.0 cm and, if necessary, regulated with a potentiometer. In the animals killed after 4 hours, anesthesia was maintained with supplemental injections. The other animals were killed under general anesthesia with an overdose of sodium phenobarbital 24 hours postoperatively. All animal procedures were approved by the ethics committee and conformed to the ARVO Statement for Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Tissue Preparation After enucleation, the rabbit eyes were bisected and fixed in neutral buffered 4% formalin for light microscopy Table 1. Treatment groups, surface epithelial and endothelial UVA irradiance, and endothelial cytotoxicity in rabbits (only animals with 24 hours post-mortem). Group Number of Animals Surface Epithelial UVA Irradiance (mW/cm2) Endothelial UVA Irradiance (mW/cm2) Endothelial Cytotoxicity 1 3 4.0 0.50 ⫾ 0.07 ⫹⫹⫹ 2 6 3.0 0.36 ⫾ 0.04 ⫹⫹⫹ 3 5 2.62 0.32 ⫾ 0.04 0 4 3 2.25 0.27 ⫾ 0.03 0 5 3 1.88 0.23 ⫾ 0.03 0 6 5 1.5 0.18 ⫾ 0.02 0 7 3 0.75 0.09 ⫾ 0.01 0 J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 1787 LABORATORY SCIENCE: ENDOTHELIAL CELL DAMAGE AFTER CROSS-LINKING and 2% glutaraldehyde for transmission electron microscopy (TEM). For light microscopy, 4 m paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin. The specimens were analyzed using a Zeiss light microscope (Axiomat) at ⫻20 to ⫻1000 magnification. For electron microscopy, small pieces of central cornea were postfixed in 4% osmium tetroxide, dehydrated, and embedded in Epon resin. Semithin sections were stained with toluidine blue. Ultrathin sections of 50 to 70 nm were contrasted with uranyl acetate and lead citrate and assessed using the Morgagni 268D electron microscope (Philips) at ⫻2800 magnification. TUNEL Assay Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyUTP-nick-end labeling for detecting apoptosis was performed essentially as described by Ihling et al.8 Briefly, after the endogenous peroxidase was quenched, sections were incubated with TdT buffer (30 mN TRIS, 140 mM sodium cacodylate, 1 mM cobalt chloride) at pH 7.2 and incubated with 0.3 eu/mL TdT (Sigma) and biotinylated-dUTP (1:200; Boehringer) in TdT buffer for 60 minutes at 37°C. Labeled nuclei were detected with Vectastain ABC (Vector Labs), and peroxidase activity was visualized by 3-amino-9-ethylcarbazole to yield a reddish-brown reaction product. The sections were lightly counterstained with hematoxylin. As a positive control, tissue sections of follicular hyperplasia of the appendix were used. Negative control slides were also included. Figure 2. (Wollensak) Complete endothelial cell loss in the treatment zone with sharp demarcation toward untreated area (arrow) (endothelial UVA dose of 0.9 J/cm2). Pachymetry The central corneal thickness of the rabbit corneas was determined preoperatively using an ultrasound pachymeter (Pachette, Technomed). Figure 3. (Wollensak) TUNEL-positive apoptotic endothelial cell (arrow) (endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2, original magnification ⫻100, oil immersion). Results Histology In the 6 treated animals killed at 4 hours and the 2 cases with corneal epithelial debridement alone, neither TUNEL-positive endothelial cells nor loss of endothelium was observed. In the animals killed at 24 hours, significant endothelial cell necrosis with complete loss of endothelial cells (Figure 2) and a few remaining apoptotic endothelial cells were observed in the treatment area in the eyes that had an endothelial UVA dose of 0.9 J/cm2 (0.5 mW/cm2) and of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2), which was twice as high as the therapeutic endothelial dose in humans of 0.32 J/cm2 (0.18 mW/cm2) (Table 1). 1788 In the animals exposed to an endothelial UVA dose of 0.16 to 0.58 J/cm2 (0.09 to 0.32 mW/cm2), the endothelial cells were intact. TUNNEL Assay and TEM Using the TUNEL-straining, the few remaining endothelial cells in the 2 groups (0.9 J/cm2 and 0.65 J/cm2) were TUNEL-positive, showing brown nuclear staining (Figure 3). On TEM, apoptotic endothelial cells showed typical features of apoptosis-like chromatin condensation, formation of apoptotic bodies, and cell shrinkage (Figure 4). J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 LABORATORY SCIENCE: ENDOTHELIAL CELL DAMAGE AFTER CROSS-LINKING Figure 4. (Wollensak) Apoptotic endothelial cell with apoptotic bodies and chromatin condensation (TEM, original magnification ⫻2800) (endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2). Pachymetry The mean central corneal thickness was 400 m ⫾ 20 (SD). Discussion This study showed a specific threshold-like cytotoxic effect of combined riboflavin–UVA treatment on corneal endothelium starting at an endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2). Using the absorption coefficient of 53 cm⫺1, which we found in earlier UVA-transmission measurements following riboflavin treatment,2 it can be calculated that in human corneas thinner than 400 m, the cytotoxic endothelial UVA irradiance of 0.36 mW/cm2 is reached using the standard surface irradiance of 3.0 mW/cm2. Fortunately, the cytotoxic threshold is not reached in normal corneas with an average corneal thickness of 540 m or in most keratoconus patients (410 to 470 m).9 However, in corneal ulcers and advanced keratoconus, the corneal thinning may be beyond this limit. In such cases, riboflavin–UVA treatment should be avoided and alternative methods such as amnion transplantation for ulcers or keratoplasty for keratoconus considered. Alternatively, in thinner corneas with at least 350 m corneal thickness, a reduced surface UVA dose of 3.6 J/cm2 (2 mW/cm2), which is the lowest dose to produce a significant mechanical stiffening effect1 and increase resistance to enzymatic digestion,4 might be tried cautiously; the endothelial UVA dose would then be only 0.54 J/cm2 (0.3 mW/cm2). In addition, in keratoconus patients with extreme thinning in a small area only, the treatment might be used because the endothelial cell loss in a small circumscribed area might be compensated for by the migration of adjacent undamaged endothelial cells. The observed cytotoxic effect on the endothelium appeared to be due to the combined effect of UVA and the photosensitizer riboflavin, which increases UVA absorption in the cornea to 95%2 compared to 32% without riboflavin.10 From in vivo irradiation experiments in animal eyes, it is known that UVA irradiation (320 to 400 nm) alone can induce endothelial cell damage only after a relatively high surface UVA dose of 42.5 J/cm2 (5.4 J/cm2 in our experiment).11,12 In addition, in cell culture experiments with combined riboflavin/light treatment, a significant cytotoxic effect on bovine corneal endothelial cells was observed after application of a minimum riboflavin solution of 50 M and 2 hours of white-light irradiation; riboflavin or white light alone produced no damage in the cells.7 Endothelial damage was also reported in cases with solar keratitis13 with a surface ultraviolet-B (UVB) dose between 0.12 and 0.56 J/cm2.14 In rabbit corneas exposed to 310 nm UVB with 0.47 J/cm2, TUNEL-positive endothelial cells were found 24 hours later.15 The extensive damage after exposure to UVB is explained by the shorter UVB wavelength, with a correspondingly higher energy content. In the animals killed at 4 hours, no apoptotic endothelial cells were observed, whereas maximum cytotoxic damage was found at 24 hours, as described after UVA irradiation; this so-called delayed type of apoptosis15–18 is in contrast to the immediate type of apoptosis observed in keratocytes after epithelial scraping.19,20 In conclusion, this study demonstrated that combined riboflavin–UVA treatment should be safe for the endothelium as long as the dose is less than the endothelial cytotoxic dose of 0.65 J/cm2. In human corneas, the endothelial cytotoxic UVA dose is only reached in corneas thinner than 400 m. Therefore, pachymetry measurements should be performed routinely before riboflavin/UVA treatment to identify unsuitable cases. References 1. Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res 1998; 66:97–103 2. Spörl E, Schreiber J, Hellmund K, et al. Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen. Ophthalmologe 2000; 97:203–206 J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 1789 LABORATORY SCIENCE: ENDOTHELIAL CELL DAMAGE AFTER CROSS-LINKING 3. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Stress-strain measurements of human and porcine cornea after riboflavin– ultraviolet-A-induced cross-linking. J Cataract Refract Surg 2003; 29:1780 –1785 4. Spoerl E, Wollensak G, Seiler T. Resistance of riboflavinUVA-treated cornea against enzymatic digestion. In press, Curr Eye Res 5. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T. Riboflavin/ultravioletA-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol 2003; 135:620 –627 6. Schnitzler E, Spörl E, Seiler T. Bestrahlung der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen, erste Ergebnisse bei vier Patienten. Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217:190 –193 7. Cho K-S, Lee EH, Choi J-S, Joo C-K. Reactive oxygen species-induced apoptosis and necrosis in bovine corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 911–919 8. Ihling C, Szombathy T, Nampoothiri K, et al. Cystic medial degeneration of the aorta is associated with p53 accumulation, Bax upregulation, apoptotic cell death, and cell proliferation. Heart 1999; 82:286 –293 9. Watters GA, Owens H. Evaluation of mild, moderate, and advanced keratoconus using ultrasound pachometry and the EyeSys videokeratoscope. Optom Vis Sci 1998; 75:640 –646 10. Michael R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Res 2000; 32(suppl 1) 11. Pitts DG, Cullen AP, Hacker PD. Ocular effects of ul- 1790 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. traviolet radiation from 295 to 365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977; 16:932–939 Ringvold A, Davanger M, Olsen EG. Changes of the cornea endothelium after ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol 1982; 60:41–53 Blumthaler M, Ambach W, Daxecker F. On the threshold radiant exposure for keratitis solaris. Invest Ophthalmol Vis Sci 1987; 28:1713–1716 Olsen EG, Ringvold A. Human cornea endothelium and ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol 1982; 60:54 –56 Podskochy A, Gan L, Fagerholm P. Apoptosis in UVexposed rabbit corneas. Cornea 2000; 19:99 –103 Godar DE, Miller SA, Thomas DP. Immediate and delayed apoptotic cell death mechanisms: UVA versus UVB and UVC radiation. Cell Death Differ 1994; 1:59 –66 Michael R, Vrensen GFJM, van Marle J, et al. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998; 39:2681– 2687 Pourzand C, Tyrrell RM. Apoptosis, the role of oxidative stress and the example of solar UV radiation. Photochem Photobiol 1999; 70:380 –390 Wilson SE, He Y-G, Weng J, et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Exp Eye Res 1996; 62: 325–337 Helena MC, Baerveldt F, Kim W-J, Wilson SE. Keratocyte apoptosis after corneal surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998; 39:276 –283 J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003 Ophthalmologe 2000 · 97:203–206 © Springer-Verlag 2000 Hornhaut: Kurzmitteilung Eberhard Spörl1 · Jana Schreiber1 · Kerstin Hellmund1 · Theo Seiler1 · Peter Knuschke2 1Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde,Universitätsklinikum TU Dresden 2Klinik für Dermatologie,Universitätsklinikum TU Dresden Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen* ** Zusammenfassung Hintergrund: Eine mechanische Stabilisierung der Hornhaut beim Keratokonus könnte das Fortschreiten dieser Erkrankung verzögern.Die an der Hornhaut von enukleierten Schweineaugen optimierten Vernetzungsmethoden zur Erhöhung der Festigkeit wurden im Langzeitversuch am Kaninchenmodell auf Beständigkeit und biologische Verträglichkeit getestet. Methode: Von 28 Kaninchen wurde das rechte Auge behandelt, das linke Auge diente jeweils als Kontrolle.Nach der mechanischen Entfernung des Epithels wurden 19 Augen mit Riboflavin-Dextranlösung getropft und anschließend mit UV-Strahlung (365 nm, Bestrahlungsstärke 2 mW/cm2) für 45 min exponiert.Auf 9 Augen wirkte ein Gemisch aus Methocel und 0,075% Glutaraldehyd für 20 min ein.Die Reaktion der Hornhaut wurde mit der Spaltlampenphotographie dokumentiert.Nach 1 Monat wurden 20 Tiere und nach 3 Monaten 8 Tiere getötet, die Augen enukleiert und von Streifen (Breite 5 mm, Länge 8 mm) der Hornhäute der Spannungs-Dehnungszusammenhang gemessen. Ergebnisse: Vier Wochen nach der Vernetzung konnte eine signifikant höhere Festigkeit in den mit Riboflavin+UV behandelten Hornhäuten nachgewiesen werden.Die vernetzten und unvernetzten Hornhäute unterschieden sich bei einer Dehnung von 6% in der Spannung um den Faktor 1,61±0,75 (p=0,041).Nach 12 Wochen lag diese Festigkeitszunahme noch bei 1,3±0,48 (p=0,07). Es kam zu keiner sichtbaren Entzündungsreaktion oder Beeinträchtigung der Transparenz.Die mit Glutaraldehyd behandelten Hornhäute wiesen zwar auch eine Zunahme der Festigkeit auf (Faktor 1,3±0,66), aber der Effekt war statistisch nicht signifikant (p=0,319), sodass ein Langzeittest dieser Methode nicht gerechtfertigt war. Schlussfolgerungen: Die Kombination von Riboflavin+UV-Strahlung ist geeignet zur Erzeugung von mindestens temporären Vernetzungen in der Hornhaut bei Kaninchen ohne klinische Zeichen für Nebenwirkungen wie Trübung oder Entzündung. Schlüsselwörter Vernetzung · Cornea · Keratokonus · Riboflavin · Ultraviolette Strahlung Beim Keratokonus kommt es infolge der abnehmenden Festigkeit [1] zu einem Hervorwölben der Hornhaut, was erhebliche funktionelle Konsequenzen hat. Eine künstliche in-vivo Vernetzung der Hornhaut mit gesicherter Verfestigung ergäbe eine sinnvolle Prävention von Keratektasien. Nachdem invitro Untersuchungen an enukleierten Schweineaugen eine Zunahme der Festigkeit nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit Glutaraldehyd zeigte [17],sollen beide Vernetzungstechniken am Tiermodell überprüft werden mit dem Ziel der Einschätzung der Biokompatibilität und der Dauer des Vernetzungseffektes. Material und Methoden D ie Funktion von kollagenhaltigen Strukturen besteht meist in der Aufrechterhaltung einer bestimmten Form oder Stabilität, wobei hauptsächlich der Vernetzungsgrad, der unter physiologischen Bedingungen enzymatisch gesteuert wird, die mechanischen Eigenschaften bestimmt. Verstärkt treten Vernetzungen beim Altersprozess [5, 6] oder auch bei Diabetes [9, 14] auf. Diese können aber auch gezielt erzeugt werden, um in vitro kollagene Biomaterialien [10, 13] und Implantate [2, 7] zu stabilisieren. Dieses Verfahren hat sich z.B. bei Epikeratoplasik [18], Herzklappen- [8] und Meniskusersatz [19] sowie bei der Gewebevergrößerung mit kollagenen Biomaterialien [16] bewährt. Erste in vivo Vernetzungen sind in der Augenheilkunde bisher nur bei der Photovernetzung von fibrinogenhaltigen Klebern im Tiermodell bekannt [4]. Hornhautexposition mit Riboflavin Insgesamt 28 Kaninchen (weiße Neuseeländer) wurden entsprechend den “Principles of laboratory animals care” unter Anästhesie (1,5 ml Velonarkon® und 0,5 ml Rompun®) monokular behandelt, wobei jeweils das Partnerauge als Kontrolle diente. Nach der mechanischen Entfernung des Epithels der Hornhaut unter dem OP-Mikroskop wirkte bei 19 Kaninchen eine 0,11%ige *Teile dieser Originalarbeit sind auf der 97. Tagung der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft vorgetragen worden **Gefördert durch die BrunenbuschStein-Stiftung Dr. rer. nat. habil. E. Spörl Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum TU, Fetscherstr.74, 01307 Dresden Der Ophthalmologe 3•2000 203 Ophthalmologe 2000 · 97:203–206 © Springer-Verlag 2000 E. Spörl · J. Schreiber · K. Hellmund · T. Seiler · P. Knuschke Cross-linking effects in the cornea of rabbits Summary Background: The mechanical stabilization of the cornea in keratoconus may delay progression of this disease.The cross-linking techniques optimized in corneas of enucleated porcine eyes were investigated under in vivo conditions in rabbits to estimate the biocompatibility and duration of the stiffening effect. Methods: Twenty-eight rabbits were treated monocularly, the fellow eye serving as control.The epithelium was mechanically removed and 19 eyes were treated with riboflavin plus ultraviolet irradiation (365 nm, 2 mW/cm2) for 45 min and 9 eyes with 0.075% glutaraldehyde for 20 min.After treatment, the eyelids were sutured for 3 days.The healing process was controlled by slit-lamp examination and photographically documented.After 1 month, 20 animals and after 3 months 8 animals were sacrificed, the eyes enucleated, and the stress-strain relation of the corneas measured and compared to the fellow eye. Results: The epithelium was closed after 4-5 days.The transparency of the corneas remained clear during follow-up, and there were no signs of inflammatory reaction. Stress for a strain of 6% was higher in the treated corneas by a factor of 1.3±0.66 (P=0.319) in the glutaraldehyde group and by a factor of 1.6±0.75 (P=0.0408) in the riboflavin group at 1 month, and by 1.3±0.48 (P=0.07) at 3 months after treatment. Conclusions: The cross-linking technique using riboflavin plus UV irradiation is suitable for at least temporarily stiffening the cornea in vivo and seems to be a promising method for conservative treatment of keratectasia. Hornhaut: Kurzmitteilung Riboflavinlösung (10,95 mg Riboflavin5-phosphat in 10 ml 20%iger Dextranlösung) für 5 min auf die Hornhaut ein. Die sich anschließende UV-Bestrahlung erfolgte bei einer Wellenlänge von 365 nm, die mittels einer Quecksilberdampflampe (HQE-40, EMI, Ilmenau) und einem Interferenzfilter für 365 nm mit 25 nm Halbwertsbreite erzeugt wurde. Deren Applikation mit einem Quarzlichtleiter ergab eine kreisförmige Fläche von 7 mm Durchmesser auf der Hornhaut (Abb. 1). Die so erzeugte Bestrahlungsstärke von 2 mW/cm2 (gemessen mit dem UV-Leistungsmesser LASER-MATE, Fa. Coherent, dessen Sensorempfindlichkeit für 365 nm mit einem von der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt kalibrierten Thermopile überprüft wurde) wirkte für die Dauer von 45 min auf die Hornhaut ein, wobei alle 5 Minuten ein Tropfen Riboflavinlösung auf die Hornhaut getropft wurde, um ein Austrocknen zu vermeiden. Anschließend wurde ein Antibiotikum (Ofloxacin, Floxal® Augensalbe, Dr. Mann Pharma) zur antibiotischen Abschirmung aufgetragen und das Lid mit einer U-Naht für 3 Tage vernäht. In Vorversuchen an Schweineaugen wurde der Einfluss der Riboflavinkonzentration und der Bestrahlungszeit auf die Festigkeitszunahme getestet, wobei das Ergebnis unabhängig war von der Riboflavinkonzentration im Bereich von 0,015% bis 0,15%, während Bestrahlungszeiten größer als 30 min einen signifikanten Effekt bewirkten. Um möglichst viel Bestrahlungsenergie in der Hornhaut zu absorbieren (etwa 90%) Abb.1 䉱 Behandlung mit Riboflavin und UV-Bestrahlung, wobei die UV-Strahlung über eine flexible Quarzfaser lokal begrenzt appliziert wird und damit die tiefer liegenden Gewebe zu schützen sowie eine gleichmäßige Vernetzung der Hornhaut zu erreichen, wurde die Konzentration von 0,11% gewählt (Abb. 2). Hornhautexposition mit Glutaraldehyd Bei der zweiten Technik (Abb. 3) kam ein Gemisch aus Methocel und 0,075% Glutaraldehyd bei 9 Kaninchen zur Anwendung, das für die Dauer von 20 min auf die Hornhaut einwirkte. Das Methocel diente dabei nur zur Erhöhung der Viskosität des Gemisches. Um nur den zentralen Teil der Hornhaut zu vernetzen und ein Auslaufen des Gemisches auf den Limbus zu verhindern, diente Key words Cross-links · Cornea · Keratoconus · Riboflavin · Ultraviolet radiation Abb.2 䉱 Transmission der Hornhaut für 365 nm in Abhängigkeit von der Riboflavinkonzentration 204 Der Ophthalmologe 3•2000 ein aufgelegter Silikonring (Ø 7 mm ) als Begrenzung. In Vorversuchen konnte die Dichtheit dieses Ringes mit einem Methocel-Fluoreszeingemisch nachgewiesen werden. Nach der Applikation wurde das Glutaraldehyd entfernt, die Hornhaut mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und die Nachbehandlung wie in der UV-Gruppe durchgeführt. Eine Untersuchung der Hornhaut erfolgte mit der Handspaltlampe am 3., 5. und 6. Tag sowie an der Spaltlampe mit photographischer Dokumentation am 4. Tag, nach 1 und 3 Monaten. Nach 1 bzw. 3 Monaten wurden die Kaninchen getötet, die Augen enukleiert und aus den Hornhäuten vertikale Streifen 5x8 mm geschnitten. Die Dicke der Hornhautstreifen wurde mit einem Ultraschallpachymeter gemessen. Nach einer 5minütigen Vordehnung der Streifen mit einer Spannung von 104 N/m2, was einem intraokularen Druck von etwa 9 mm Hg entspricht, wurden die Spannungs-Dehnungsexperimente mit einem kommerziellen Materialtester (MINIMAT, Polymer Laboratories) mit einer Dehnungsgeschwindigkeit von 1,5 mm/min und bis zu einer Spannung von 5·105 N/m2 (50-faches des physiologischen intraokularen Druckes) durchgeführt. Um die mechanischen Eigenschaften der behandelten und unbehandelten Hornhaut zu vergleichen, wurden die Spannungen, die für eine Dehnung von e=6% notwendig waren, ausgewertet. Das Verhältnis von s (behandelt)/s(unbehandelt) diente als Maß für die Verfestigungszunahme. Die statistische Analyse basiert auf dem WILCOXON-Rangtest, wobei pWerte kleiner als 0,05 als statistisch signifikant galten. Ergebnisse nicht verändert. Die Daten wurden photographisch dokumentiert. Biomechanische Charakterisierung Bei den Hornhäuten, die mit Glutaraldehyd vernetzt wurden, konnte zwar nach 4 Wochen eine Zunahme der Festigkeit um den Faktor 1,3±0,66 nachgewiesen werden. Dieser Effekt war statistisch nicht signifikant (p=0,319). Aus diesem Grund wurden die Versuche mit 12 Wochen Nachbeobachtungszeit nicht durchgeführt. Nach Riboflavin+UV kam es initial zu einer signifikanten Verfestigung, was die s(behandelt)/s(unbehandelt)-Werte (Tabelle 1) zeigen. Nach 1 Monat war das Verhältnis 1,61±0,75 (p=0,041) und nach 3 Monaten 1,3±0,48 (p=0,07). Diskussion Der Keratokonus und andere Formen der Keratektasie sind progressive Erkrankungen, die wahrscheinlich auf einer Abnahme der Festigkeit der Hornhaut basieren [1]. Die morphologischen und biochemischen Ursachen sind nicht bekannt, obwohl Veränderungen der Proteoglycane gefunden wurden [3, 20]. Auch eine erhöhte Menge an proteolytischen Enzymen und weniger Proteasehemmer wurden in Keratokonushornhäuten nachgewiesen [21]. Dabei ist noch nicht klar, ob dies die primäre Ursache des Keratokonus ist oder eine sekundäre Reaktion.Andere morphologische Veränderungen wie Einrisse der Bowman’schen Membran und eine Verdünnung des Stromas werden als sekundäre Effekte während des Prozesses der Ektasie erklärt. Um eine Erhöhung der Festigkeit zu erreichen, wurden die in den in vitroUntersuchungen aussichtsreichsten Methoden Riboflavin+UV Strahlung bzw. Abb.3 䉱 Applikation einer 0,075%igen Glutaraldehydlösung, wobei ein Silikonring eine Vernetzung der Hornhautperipherie verhindert Glutaraldehyd angewendet. Das Hauptergebnis dieser Untersuchungen ist eine temporäre Festigkeitszunahme von etwa 50% nach Riboflavin+UV Behandlung ohne sichtbare Komplikationen wie Trübung, Entzündung oder Katarakt. Bereits nach dem Herausschneiden der Hornhautstreifen konnte man schon makroskopisch einen Unterschied zwischen der behandelten und unbehandelten Hornhaut feststellen, wie Abb. 4a-c zeigt. Während die unbehandelten Hornhautstreifen gerade herunterhingen mit zahlreichen Falten, behielten die behandelten Streifen eine Restkrümmung, was nur mit einer Zunahme der Scherspannung zu erklären ist. Somit ändert sich mit der Vernetzung auch das Biegeverhalten. Die einzelnen Kollagenlamellen sind durch die Vernetzung stärker miteinander verbunden, damit kann ein Auseinandergleiten der Lamellen, was auch bei der Entstehung einer Keratektasie diskutiert wird [12], verhindert werden. Glutaraldehyd brachte bei den kurzen Behandlungszeiten keinen signifikanten Effekt, da es nur eine oberflächliche Hornhautschicht von etwa 200 µm Epithelschluß und Hornhauttransparenz In der Gruppe der UV-bestrahlten Kaninchen war das Epithel nach dem 4. Tag geschlossen. Bei den mit Glutaraldehyd behandelten Hornhäuten konnte ein Epithelschluss erst nach dem 5. Tag beobachtet werden, wobei sich eine geringe subepitheliale Trübung zeigte, die sich aber wieder auflöste. Die Transparenz der Hornhaut war durch beide Behandlungsverfahren nach 4 Wochen Tabelle 1 Festigkeitszunahme bei der Behandlung mit Riboflavin+UV-Bestrahlung und bei Glutaraldehyd Behandlungsverfahren Zahl Glutaraldehyd 0,075%/20 min 9 Riboflavin+UV 45 min 11 Riboflavin+UV 45 min 8 Nachbeobachtung (Monate) Festigkeitszunahme (bei 6% Dehnung) p-Wert (WILCOXON) 1 1 3 1,3±0,66 1,61±0,75 1,3±0,48 0,313 0,041 0,07 Der Ophthalmologe 3•2000 205 Hornhaut: Kurzmitteilung 5. 6. 7. a b c Abb.4a–c 䉱 Demonstration des Biegeverhaltens der Hornhaut. (a) mit Glutaraldehyd behandelt, (b) mit Riboflavin und UV-Strahlung behandelt und (c) unbehandelt vernetzt. Dies konnte an Schweinehornhäuten in-vitro fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden.Aus diesem Grund erwies sich Glutaraldehyd für die in-vivo Vernetzung von Keratokonushornhäuten als nicht geeignet [17]. Implantate könnten aufgrund der erhöhten Einwirkungzeit möglicherweise erfolgversprechend mit Glutaraldehyd vorbehandelt werden [7, 8, 16, 19].Andererseits ist zu erwarten, daß mit längerer Einwirkungszeit die Nebenwirkungen auf das Hornhautendothel größer werden. Um eventuelle Veränderungen des Hornhautendothels, der Linse oder der Retina durch die UV-Strahlung einschätzen zu können, wurde die Strahlenbelastung aus Transmissionsmessungen abgeschätzt. Abbildung 2 zeigt die Transmission der Schweinehornhaut bei unterschiedlichen Riboflavinkonzentrationen.Aus der Hornhautdicke, der verwendeten Riboflavinkonzentration von 0,11% und der Bestrahlungsstärke von 2 mW/cm2 ergibt sich eine Strahlenbelastung des Endothels von 100 µW/cm2.Aus der Transmissionsmessung der unbehandelten Hornhaut und der maximal (für UV-exponierte Arbeitsplätze) zulässigen Bestrahlungsstärke von 1 mW/cm2 [15] können am Endothel etwa 500 µW/cm2 wirksam werden. Damit beträgt die Strahlenbelastung des Endothels bei der UV-Vernetzung nur etwa 20% der zulässigen Grenze, sodaß auch keine Gefahr für Linse oder Retina besteht.Vergleicht man die applizierte Bestrahlungsdosis von 5,4 J/cm2 mit dem Grenzwert der Bestrahlungsdosis von 42,5 J/cm2 für die Hornhaut bei 365 nm [11], so dürften keine Schädigungen zu erwarten sein. Der biomikroskopische Nachweis der Unschädlichkeit für 206 Der Ophthalmologe 3•2000 Endothelzellen muss aber noch erbracht werden. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse scheint die Vernetzung mit Riboflavin und UV-Strahlung eine geeignete Methode zur sicheren Verfestigung der Hornhaut zu sein. Infolge von Um- und Abbauprozessen der Kollagene und Proteoglykane besteht mit der Zeit die Möglichkeit der Abnahme der Festigkeit. Es sind weitere Untersuchungen notwendig, um zu entscheiden, ob eine Wiederholung der Riboflavin und UV-Exposition erforderlich ist. Fazit für die Praxis Experimentelle Untersuchungen an Kaninchenaugen haben gezeigt, daß mittels Exposition der Hornhaut mit Riboflavin in Kombination mit UV-Bestrahlung eine mechanische Stabilisierung der Hornhaut bewirkt werden kann.Weitere Untersuchungen müssen noch zeigen, ob diese Methoden zur Stabilisierung der Hornhaut bei Keratokonus oder zur Vorbehandlung von Spenderhornhäuten geeignet sind. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Literatur 1. 2. 3. 4. Andreassen TT, Simonsen AH, Oxlund H (1980) Biomechanical properties of keratoconus and normal corneas. Exp Eye Res 31: 435-441 Duncan AC, Boughner D (1998) Effect of dynamic glutaraldehyde fixation on the viscoelastic properties of bovine pericardial tissue. Biomaterials 19: 777-783 Funderburgh JL, Hevelone ND (1998) Decorin and biglycan of normal and pathologic human corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 1957-1964 Goins KM, Khadem J, Majmudar P (1998) Relative strength of photodynamic biologic tissue glue in penetrating keratoplasty in cadaver eyes. J Cataract Refract Surg 24: 1566-1570 21. Karwatowski WS, Jeffries TE, Duance VC, Albon J, Bailey AJ, Easty DL (1995) Preparation of Bruch’s membran and analysis of the age-related changes in the structural collagens. Br J Ophthalmol 79: 944-952 Malik SN, Moos SJ, Ahmed N, Furth AJ,Wall RS, Meek KM (1992) Ageing of the human corneal stroma: structural and biochemical changes. Biochim Biophys Acta 1138: 222-228 McPherson JM, Sawamura S, Armstrong R (1986) An examination of the biologic response to injectable, glutaraldehyde cross-linked collagen implants. J Biomedical Material Res 20: 93-107 Nimni ME (1988) The cross-linking and structure modification of the collagen matrix in the design of cardiovascular prothesis. J Cardiac Surgery 3: 523-533 Paul RG, Bailey AJ (1996) Glycation of collagen: the basis of its central role in the late complications of aging and diabetes. Int J Biochem Cell Biol 28: 1297-1310 Petite H, Frei V, Huc A, Herbage D (1994) Use of diphenylphosphorylazide for cross-linking collagen-based biomaterials. J Biomedical Material Res 28: 159-165 Pitts DG, Cullen AP, Hacker PD (1977) Ocular effects of ultraviolet radiation from 295 to 365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci 16: 932-939 Radner W, Zehetmayer M, Skorpik C, Mallinger R (1997) Altered organization of collagen in the apex of keratoconus corneas. Ophthalmic Res 30: 327-332 Remacle M (1995) Treatment of vocal fold immobility by glutaraldehyde-cross-linked collagen injection: long-term results. Ann Otol Rhinol Laryngol 104: 437-444 Sady C, Khosrof S, Nagaraj R (1995) Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem Biophys Res Commun 214: 793-797 Sliney DH (1994) Dosimetry for ultraviolet radiation exposure of the eye. Ultraviolet radiation hazards. SPIE 2134B: 2-11 Smith JJ, Swierzewski JS, Bihrle W, Malone MJ, Libertino JA (1998) Endoscopic injection of glutaraldehyde cross-linked collagen for efferent limb incompetence in the indiana reservoir. J Urol 159: 804-805 Spoerl E, Huhle M, Seiler T (1997) Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut durch Vernetzung. Der Ophthalmologe 94: 902-906 Kaufmann HE (1996) Ophthalmic Procedure Assessment - Epikeratoplasty. Ophthalmology 103: 983-991 Wisnewski PJ, Power DL, Kennedy JM (1988) Glutaraldehyde-cross-linked meniscal allografts: mechanical properties. J Invest Surg 1: 259-266 Wollensak J, Buddecke E (1990) Biochemical studies on human corneal proteoglycans - a comparison of normal and keratoconic eyes. Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol 228: 517-523 Zhou L, Sawaguchi S,Twining SS, Sugar J, Feder RS, Yue BY (1998) Expression of degradative enzymes and protease inhibitors in corneas with keratoconus. Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 1117-1124 Nachtrag bei der Korrektur. Die Technik der UV-Vernetzung wurde erheblich vereinfacht durch den Ersatz der Quecksilberdampflampe, des Interferenzfilters und der Quarzfaser durch zwei UV-Leuchtdioden (370 nm, 750 mW), (Roithner Lasertechnik, Wien). Ophthalmologe 1997 ´ 94:902±906 Springer-Verlag 1997 Hornhaut Eberhard Spörl1 · Michael Huhle1 · Michael Kasper2 · Theo Seiler1 1 Augenklinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden 2 Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut durch Vernetzung* ** Zusammenfassung Hintergrund: Die biomechanische Festigkeit der Hornhaut soll durch künstliche Quervernetzung der Kollagenfibrillen (Strahlenvernetzung, chemische Vernetzung) erhöht werden, um eine evtl. konservative Therapie des Keratokonus zu prüfen. Methode: Von enukleierten Schweineaugen wurde das Epithel entfernt. Je 10 Augen in 8 Testgruppen wurden mit UV-Strahlung (l = 254 nm), einer 0,5 %igen Riboflavinlösung und UV-Strahlung (365 nm), blauem Licht (436 nm) und Sonnenlicht sowie mit chemischen Vernetzern ± Glutaraldehyd (1 % und 0,1 %, 10 min) und KarnovskyLösung (0,1 %, 10 min) ± behandelt. Als Standard dienten jeweils Kontrollgruppen mit 10 unbehandelten Hornhäuten. Aus jeder Hornhaut wurde ein zentraler Streifen von 5 mm Breite und 9 mm Länge geschnitten und die Spannungs-Dehnungs-Kurven gemessen. Ergebnisse: Bei UV-Bestrahlung von mit Riboflavin vorbehandelten Hornhäuten nimmt die Dehnbarkeit signifikant ab (p < 0,05). Auch die mit Glutaraldehyd oder KarnovskyLösung behandelten Hornhäute zeigen eine signifikante Zunahme der Festigkeit (p < 0,05). Schluûfolgerung: UV-Strahlen und Riboflavin sowie niedrigkonzentriertes Glutaraldehyd oder Karnovsky-Lösung führen zu einer Verfestigung der Hornhaut wahrscheinlich aufgrund von Vernetzungen der Kollagene oder der Proteoglykane. Weitere Untersuchungen sind jedoch bezüglich der Optimierung der Dosis-Wirkungs-Beziehung und der In-vivo-Bedingungen erforderlich. Schlüsselwörter Hornhaut · Kollagen · Keratokonus · Proteoglykane · Vernetzung 902 Der Ophthalmologe 12´97 U m die Form der Hornhaut zu verändern, z. B. beim Astigmatismus, bei der Myopie und bei der Hyperopie, stehen dem Augenarzt zahlreiche Therapieverfahren zur Verfügung. ¾ndern sich aber die Hornhautform und -dicke, wie z. B. beim Keratokonus, so bleibt als einzige kurative Therapie die Keratoplastik. Das Krankheitsbild des Keratokonus ist klar umschrieben. Biochemische Untersuchungen zur Ursache des Keratokonus legen Veränderungen der Proteoglykane nahe [22, 23]. Biomechanische Untersuchungen weisen eine geringere Festigkeit der Hornhaut mit Keratokonus nach [2, 14]. Die molekulare Erklärung dieses Festigkeitsverlusts ist noch unbefriedigend: So werden eine Verringerung der Vernetzungen innerhalb der Kollagenmatrix, eine Reduzierung der Kontaktstellen zwischen benachbarten Proteoglykanen der Grundsubstanz oder auch eine erhöhte Aktivität proteolytischer Enzyme diskutiert [23]. Neue elektronenmikroskopische und Röntgenstrahlstreumessungen konnten im vorderen Stoma beim Keratokonus das Fehlen von solchen Lamellen nachweisen, die benachbarte Fibrillenlagen durchkreuzen und miteinander verbinden [4, 16]. Gelänge es, eine biologisch verträgliche Methode zu entwickeln, die Hornhautfestigkeit zu stabilisieren bzw. zu erhöhen, so könnte dies ein Ansatz für eine konservative Therapie des Keratokonus darstellen. Aus Polymerchemie und Biochemie ist bekannt, daû mit energiereicher Strahlung (Infrarot-, Ultraviolett- und Röntgenstrahlung) oder mit bestimmten chemischen Verbindungen Polymere vernetzt werden können. Milne u. Zika [12] fanden eine Erhöhung der Viskosität einer Kollagenlösung nach UVBestrahlung. Die Vernetzung von Bindegewebe nimmt mit dem Alter zu und tritt verstärkt beim Diabetes auf. Die Vernetzung wird auch gezielt zur Erhöhung der Stabilität von kollagenen Biomaterialien für Bioprothesen, wie z. B. Herzklappen, Blutgefäûe und Duraersatz, genutzt. In der Augenheilkunde wurde über die erste Anwendung der künstlichen Vernetzung bei der Herstellung von kollagenen Biomaterialien für die synthetische Epikeratoplastik berichtet. In unseren Untersuchungen prüften wir die Wirkung von chemischen Vernetzern und von UV-Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge bezüglich der Veränderung der biomechanischen Eigenschaften der Hornhaut. Material und Methode Als Untersuchungsobjekte dienten Schweineaugen, die 15±30 min postmortal im Schlachthof enukleiert und in der Kühlbox bei + 10 C transportiert und gelagert wurden. Die Messungen an der Hornhaut erfolgten innerhalb von 8 h postmortal, um evtl. autolytische Veränderungen so gering wie möglich zu halten. Die intakten Bulbi wurden in einer 20 %igen Dextranlösung (Dextran T 500, Pharmacia Biotech, Freiburg) gelagert, um die Hornhaut auf eine Dicke von 0,8 mm zu dehydrieren. Die Dicke der Hornhaut wurde ultraschallpachymetrisch bestimmt (Pachette, Technomed, Baesweiler). * Vortrag gehalten auf der 94. Tagung der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft ** Unterstützt von der Brunenbusch-SteinStiftung, Stuttgart Prof. Dr. Dr. T. Seiler Augenklinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden, Fetscherstraûe 74, D-01307 Dresden Ophthalmologe 1997 ´ 94:902±906 Springer-Verlag 1997 E. Spörl · M. Huhle · M. Kasper · Th. Seiler Artificial stiffening of the cornea by induction of intrastromal cross-links Summary Purpose: To increase the stability of the cornea by artificial cross-linking (radiation or chemical agents) and to investigate a future therapy for keratoconus. Materials and methods: The epithelium of enucleated porcine eyes was removed. Ten eyes in each of eight test groups were treated with UV light (l = 254 nm), 0.5 % riboflavin and UV light (365 nm), blue light (436 nm) and sunlight, and the chemical agents glutaraldehyde (1 % and 0.1 %, 10 min) and Karnovsky's solution (0.1 %, 10 min). Strips of 5 mm in width and 9 mm in length were cut from each cornea and the stress-strain behaviour of the strips was measured. For comparison, eight groups of ten untreated corneas each were measured by the same method. Results: Compared to untreated corneas riboflavin and UV irradiation as well as glutaraldehyde and Karnovsky's solution treatment resulted in significantly increased stiffness of the cornea (p < 0.05). Conclusions: The biomechanical behaviour of the cornea can be altered by low-concentration glutaraldehyde, Karnovsky's solution, and by riboflavin and UV irradiation, which offers potential conservative treatment of keratoconus. To optimize this effect further investigation is necessary regarding the dose-effect relation and the in-vivo conditions. Key words Collagen · Cornea · Cross-linking · Keratoconus · Proteoglycans Interferenzfilter von 365 und 436 nm lieferten eine Intensität von 20 W/m2 durch die Quarzscheibe. Die Sonnenlichtbestrahlung wurde an einem sonnigen Tag (abgeschätzte Intensität 85 W/m2) durchgeführt. Die mit Riboflavin behandelten Kontrollgruppen wurden dem gleichen Zeitablauf unterworfen, blieben jedoch jeweils im Dunklen. Zwei Vernetzungsmethoden kamen zur Anwendung: · Vernetzung mit UV-Strahlung · Vernetzung mit chemischen Vernetzern. Dabei wurden immer gleichzeitig 2 Gruppen zu je 10 intakten Augen untersucht. Bei der einen Gruppe (Testgruppe) wurde die Vernetzungswirkung getestet. Die andere Gruppe diente als Kontrollgruppe. Vernetzung mit UV-Strahlung · UV-Strahlung von 254 nm: Nach der Entfernung des Epithels schloû sich eine UV-Bestrahlung der Augen in einer feuchten Kammer durch eine Quarzscheibe mit einer Wellenlänge von 254 nm für 20 min an. Die Entfernung des Epithels ist wichtig, da es die UV-Strahlung unterhalb von 290 nm fast vollständig absorbiert. Eine Quecksilberlampe (HNU 6, EMI, Ilmenau) diente als Lichtquelle mit einer Intensität von 90 W/m2 durch die Quarzscheibe. · Riboflavin und UV-Strahlung (365 nm), blaues Licht (436 nm) und Sonnenlicht: Eine Lösung von Riboflavin (0,5 %, B2-Inject, Jenapharm, Jena) und 20 % Dextran wirkten für 60 min auf die Hornhaut der intakten Augen der Test- und der Kontrollgruppe ein. Anschlieûend wurde je eine Testgruppe mit Licht der Wellenlänge 365 nm (45 min, ohne Epithel), 436 nm (45 min, ohne Epithel) und eine Testgruppe mit Sonnenlicht für 2 h in der gleichen Anordnung wie bei 254 nm bestrahlt. Eine Xenonlampe (XBO 50, EMI, Ilmenau) und Um zu prüfen, ob Riboflavin allein einen Effekt bewirkt, wurde eine Testgruppe mit Riboflavin behandelt aber nicht bestrahlt. Die dazugehörige Kontrollgruppe lagerte nur in 20 % Dextran. Vernetzung mit chemischen Vernetzern Das Einwirken der Substanzen, die in Tabelle 1 angegeben sind, konnte mit Hilfe einer Augenhalterung realisiert werden, die es ermöglichte, daû nur die Hornhaut in die Flüssigkeit eintauchte. Nach der UV- bzw. chemischen Behandlung lagerten alle Augen (die Testgruppe und die Kontrollgruppe) für 45 min wieder in einer feuchten Kammer in einem dunklen Raum. Aus jeder Hornhaut wurde ein zentraler Streifen von 5 mm Breite und 9 mm Länge herausgeschnitten und die Dicke mit einem Ultraschallpachymeter (Pachette, Technomed, Baesweiler) an 3 Stellen bestimmt. In einem Spannungs-Dehnungs-Meûgerät (MINIMAT, Rheometric Scientific GmbH, Bensheim) wurden die Hornhautstreifen mit einer Spannung von 5 103 N/ m2 für 5 min vorgedehnt, anschlieûend erfolgte die Spannungs-Dehnungs-Messung im Spannungsbereich von 5 103±2 105 N/m2 bei einer Deforma- Tabelle 1 Behandlung der Hornhäute zur Erzeugung von Vernetzungen Gruppe n UV-Bestrahlung Chemische Behandlung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 10 10 10 10 10 10 80 254 nm, 20 min 365 nm, 45 min 436 nm, 45 min Sonnenlicht, 120 min Keine Keine Keine Keine Keine Keine Riboflavin Riboflavin Riboflavin Riboflavin Glutaraldehyd Glutaraldehyd Karnovsky-Lösung Keine 0,5 %, 45 min 0,5 %, 45 min 0,5 %, 45 min 0,5 %, 45 min 1 %, 10 min 0,1 %, 10 min 0,1 %, 10 min Der Ophthalmologe 12´97 903 Hornhaut Diskussion Abb. 1 ~ Einfluû von UV-Strahlung und Riboflavin auf das Spannungs-Dehnungs-Verhalten der Hornhaut (Gruppe 1±4 und 9). Die Behandlung mit UV-Licht (254 nm) allein führte nicht und mit Riboflavin/436 nm nur zu einer schwach signifikanten Verfestigung der behandelten Hornhäute. Riboflavin/Sonnenlicht und Riboflavin/365 nm dagegen zeigten einen hochsignifikanten Effekt tionsgeschwindigkeit von 1,5 mm/min [19]. Die Mittelwerte der Spannung der Testgruppe wurden mit denen der dazugehörigen Kontrollgruppe bei Dehnungen von 4, 6 und 8 % verglichen. Zur Prüfung der statistischen Signifikanz diente der Mann-Whitney-Test aus dem Statistikprogramm SPSS 4.01 für DOS 1993 (SPSS GmbH Software, München). Unterschiede zwischen der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe wurden ab p < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Anhand der Fluoreszenz der chemisch erzeugten Vernetzungen konnte die Eindringtiefe von Glutaraldehyd in das Hornhautgewebe qualitativ bestimmt werden [13]. Drei Hornhäute der Behandlungsgruppen 6±8 und der Kontrollgruppe wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Gefrierschnitte von 5±8 mm Dicke vom Hornhautzentrum wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (PH-2, Olympus, Hamburg) bei einem Anregungsspektrum von 450±490 nm und bei einem Fluoreszenzspektrum von 515±565 nm untersucht. Die Veränderung durch UV-Bestrahlung mit 254 nm bei einer Bestrahlungszeit von 20 min ist nicht signifikant. Ein signifikanter Unterschied trat in allen Fällen der UV-Bestrahlung nach einer Vorbehandlung mit Riboflavin auf (Tabelle 2). In Abb. 2 sind die SpannungsDehnungs-Kurven für die chemischen Vernetzer, die einen signifikanten Unterschied hervorriefen, dargestellt. Abb. 3 zeigt die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen einer unbehandelten und einer mit 0,1 % Glutaraldehyd behandelten Hornhaut. Die Transparenz der Hornhaut blieb in allen Testgruppen erhalten. Die Stabilität des Bindegewebes, natürlich auch der Hornhaut, wird normalerweise durch die enzymatische Vernetzung der Kollagenfibrillen gewährleistet. Des weiteren kommen auch nichtenzymatische Vernetzungen vor, insbesondere die nichtenzymatische Glykosilierung. Darunter versteht man die chemische Reaktion zwischen Glukose bzw. deren Metaboliten und primären Aminogruppen von Proteinen [5, 17, 19, 24, 25]. Die nichtenzymatische Vernetzung des Kollagens nimmt mit dem Alter schwach zu [1, 3, 10]. Besonders stark nimmt sie bei Diabetikern zu, und auch eine Erhöhung der Festigkeit des Kollagens konnte nachgewiesen werden [8, 13, 17]. Dabei kommt es zu Veränderungen der physikochemischen Eigenschaften wie Löslichkeit, thermische Eigenschaften, mechanische Festigkeit, Viskosität, Versteifung, Verdickung und Resistenz gegenüber Kollagenasen [9, 11, 17, 19]. Kent et al. [8] fanden eine Erhöhung der mechanischen Festigkeit und eine Verringerung der Löslichkeit am Bindegewebe von Rattenschwänzen nach Inkubation in Glukose [2]. Die Vernetzung mit UV-Strahlung von 254 nm wurde zwar an einer zirkulierenden Kollagenlösung nachgewiesen [12], aber aufgrund der geringen Eindringtiefe von nur einigen Mikrometern in der Hornhaut ist die Wirkung gering. Gröûere Wellenlängen werden Ergebnisse In Abb. 1 sind die Spannungs-Dehnungs-Kurven der Testgruppen, bei denen die Strahlungsvernetzung angewendet wurde, dargestellt. Zum Vergleich ist die Mittelwertkurve aller Kontrollgruppen ebenfalls eingezeichnet. 904 Der Ophthalmologe 12´97 Abb. 2 ~ Einfluû von Glutaraldehyd und Karnovsky-Lösung auf das Spannungs-Dehnungs-Verhalten der Hornhaut (Gruppe 6±9). Trotz der hohen Standardabweichung ist die Zunahme der Festigkeit für alle Behandlungen statistisch signifikant, trotz der kleinen Gruppengröûe (n = 10) Abb. 3 ~ Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer unbehandelten (links) und einer mit Karnovsky-Lösung 10 min behandelten (rechts) Hornhaut, um die Tiefenverteilung der Vernetzungen qualitativ zu zeigen (1 cm = 60 mm). Offensichtlich wird bei der Behandlung nur die vordere Hälfte des Stromas erreicht nur über einen Photosensibilisator wirksam, wobei es sehr wichtig ist, daû die Wellenlänge von diesem absorbiert wird, aber auch genügend tief in die Hornhaut eindringt. Riboflavin ist solch ein nicht-toxischer, wasserlöslicher Photosensibilisator, der auch leicht in das Stroma eindringt. So riefen Wellenlängen von 365 und 436 nm statistisch signifikante Unterschiede hervor. Sogar bei der Testgruppe von Riboflavin und 2 h Sonnenbestrahlung trat ein statistisch signifikanter Unterschied auf. Riboflavin ohne Lichtbestrahlung (Gruppe 5) verursachte keine biomechanischen Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur in 20 % Dextran lagerte. Die Bestrahlungsdauer spielt einen entscheidenden Faktor bei der Vernetzung. Die Vernetzungsreaktion beginnt nicht unmittelbar mit dem Bestrahlungsbeginn, sondern benötigt eine Startphase. Einige Untersucher berichten, daû bei der Photoreaktion mit Riboflavin Sauerstoffradikale entstehen, deren Vernetzungswirkung am Glaskörperkollagen in vitro nachgewiesen werden konnte [7]. Bei den chemischen Vernetzern zeigte Glutaraldehyd die gröûte Wirkung, auch nach einer Verringerung der Konzentration von ursprünglich 1 % für 10 min auf 0,1 % für 10 min. Um das Penetrationsvermögen von Glutaraldehyd zu verbessern, wurde zusätz- lich ein Gemisch von Glutaraldehyd und Formaldehyd + Phosphatpuffer (Karnovsky-Lösung) verwendet. Ungeklärt bleibt dabei, ob sich die Vernetzungen intra- oder interfibrillär bilden. Interfibrilläre Verbindungen kann man sich zwar bei Sehnen vorstellen, in denen die Kollagenfibrillen miteinander verwoben sind. Im Hornhautstroma jedoch liegen die Kollagenfibrillen parallel mit einem relativ konstanten Abstand von 20±40 nm, der mit Proteoglykanen ausgefüllt ist, und es ist nicht klar, wie bei den verschiedenen Vernetzungstechniken interfibrilläre Verbindungen zwischen den Kollagenmolekülen entstehen können. Aber auch die Co- reproteine der Proteoglykane können in der Vernetzungskette beteiligt sein. Nach unseren Kenntnissen liegen in der Literatur keine Hinweise über Proteinvernetzungen im lebenden Gewebe auûer zwischen Kollagenmolekülen vor. Quellungsexperimente an vernetzten Hornhäuten können weitere Erkenntnisse über diesen Prozeû liefern [6]. In geringen Konzentrationen wird Glutaraldehyd bereits zur Stabilisierung von Implantaten, z. B. Herzklappen [15], des Meniskus [21] und bei der Stimmbandbehandlung [18], eingesetzt. Von Kollagen, welches mit geringen Konzentrationen von Glutaraldehyd vernetzt wurde, ist bekannt, daû es widerstandsfähiger gegenüber Kollagenasen ist. Das so vernetzte Kollagen soll gut toleriert werden, da es keine Entzündungsund keine Fremdkörperreaktion verursacht. Eine kurze Glutaraldehydfixierung erhält zahlreiche Enzymaktivitäten und weitgehend auch die immunologische Charakteristik der Proteine [18]. Daneben macht sie das Kollagenmolekül weniger angreifbar für Kollagenasen. Diesen Effekt nutzten wir klinisch in einigen Fällen von einschmelzenden Hornhautulzera, bei denen die konventionelle Therapie versagt hatte. So konnten wir den Einschmelzungsprozeû in allen Fällen durch die Applikation von Karnovsky-Lösung (0,1 %, 10 min) stoppen. Perspektiven Diese In-vitro-Experimente sollen nur als erster Schritt in Richtung auf eine konservative Behandlung der Keratek- Tabelle 2 Signifikanzwerte zur Charakterisierung der Zunahme der Festigkeit der behandelten Hornhäute im Vergleich zur entsprechenden unbehandelten Kontrollgruppe Gruppe 1 2 3 4 5 6 7 8 Behandlung UV (254 nm, 20 min) Riboflavin, 365 nm, 45 min Riboflavin, 436 nm, 45 min Riboflavin, Sonne, 120 min Riboflavin Glutaraldehyd 1 % Glutaraldehyd 0,1 % Karnovsky-Lösung 0,1 % p -Wert bei e = 4% 6% 8% 0,390 0,0001 0,0288 0,0001 0,3932 0,0016 0,0302 0,0185 0,796 0,0001 0,0433 0,0005 0,8534 0,0016 0,0412 0,0185 0,579 0,0003 0,0753 ± 0,7959 0,0164 0,0461 0,0147 Der Ophthalmologe 12´97 905 Hornhaut tasie verstanden werden. Es ist noch unklar, wie lang die Vernetzungen und die dadurch erhöhte Festigkeit in lebenden Geweben bestehen bleiben. Erste Beobachtungen an lebenden Kaninchenaugen, die zentral auf der Hornhaut mit 0,1 % Karnovsky-Lösung behandelt wurden, zeigten nur eine leichte subepitheliale Trübung, die nach 3 Wochen verschwand. Durch die Vernetzungen der Kollagenfibrillen wird die mechanische Stabilität erhöht, jedoch nicht die Anordnung der Fibrillen und damit die Transparenz verändert. Die Kombination von Riboflavin und Lichtenergie sowie Karnovsky-Lösung sind die beiden aussichtsreichsten Methoden für die Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut. Eine biologische Testung muû in weiteren Tierexperimenten erfolgen. Durch UV-Strahlung und Riboflavin sowie niedrigdosiertes Glutaraldehyd oder Karnovsky-Lösung wird eine Verfestigung der Kornea erreicht, wahrscheinlich aufgrund von Vernetzung der Kollagene oder der Proteoglykane. Eine Erhöhung der biomechanischen Festigkeit der Hornhaut könnte eine konservative Therapie des Keratokonus ermöglichen, weitere Untersuchungen sind jedoch noch erforderlich. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 906 Der Ophthalmologe 12´97 13. 14. 15. Literatur Fazit für die Praxis In biomechanischen Untersuchungen weisen Augen mit einem Keratokonus eine geringere Festigkeit der Kornea auf, die molekularen Grundlagen dieses Phänomens sind noch nicht zufriedenstellend bekannt. Ursächlich diskutiert werden eine Verringerung der Vernetzung innerhalb der Kollagenmatrix, eine Reduktion der Kontaktstellen zwischen benachbarten Proteoglykanen der Grundsubstanz oder auch eine erhöhte Aktivität proteolytischer Enzyme. Neue elektronenmikroskopische und Röntgenstrahlenstreumessungen zeigten im vorderen Hornhautstroma von Keratokonuspatienten das Fehlen von Lamellen, die benachbarte Fibrillenlagen durchkreuzen und miteinander verbinden. 12. Albou J, Karwatowski WS, Avery N, Easty D, Duance V (1995) Changes in the collagenous matrix of the aging human lamina cribrosa. Br J Ophthalmol 79: 368±375 Andreassen TT, Seyer-Hauser K (1981) Thermal stability, mechanical properties and reducible cross-links of rat tail tendon in experimental diabetes. Biochim Biophys Acta 677: 313±317 Balisky L, Lee CH, Greenwald DP, Rowsey JJ (1996) Tensile strength as a function of age in human corneal tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci 37: S 3201 Daxer A, Fratzl P (1997) Collagen fibril orientation in the human corneal stroma and its implication in keratoconus. Invest Ophthalmol Vis Sci 38: 121±129 Eyre DR (1984) Cross-linking in collagen and elastin. Ann Rev Biochem 53: 717±748 Hadley JC, Meek KM, Malik NS (1996) The effect of glycation on charge distribution and swelling behaviour of corneal and scleral collagen. Invest Ophthalmol Vis Sci 37: S 1010 Hikichi T, Ueno N, Chakrabarti B, Tremp CL, Yoshida A (1996) Evidence of cross-link formation of vitreous collagen during experimental ocular inflammation. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 234: 47±54 Kent MJC, Light ND, Bailey AJ (1985) Evidence for glucose-mediated cross-linking of collagen after glycosylation in vitro. Biochem J 225: 745±752 Khosrof S, Sady C, Nagaraj RH (1996) Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci 37: S 1010 Malik NS, Moss SJ, Ahmed N, Furth AJ, Wall RS, Meek KM (1992) Ageing of the human corneal stroma: structural and biochemical changes. Biochim Biophys Acta 1138: 222±228 McNamara NA, Brand RJ, Bourne WM, Polse KA, Hodge DO (1996) Hyperglycemic effects on corneal function. Invest Ophthalmol Vis Sci 37: S 315 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Milne PJ, Zika RG (1992) Crosslinking of collagen gels: photochemical measurement. SPIE Ophthalm Technol II 1644: 115±124 Nagaraj RH, Shipanova I, Faust F (1996) Isolation and characterization of a protein crosslink derived from the Maillard reaction: implication in lens aging and cataractogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci 37: S 420 Nash IS, Greene PR, Forster CS (1982) Comparison of mechanical properties of keratoconus and normal corneas. Exp Eye Res 35: 413±423 Nimni ME (1988) The cross-linking and structure modification of the collagen matrix in the design of cardiovascular prothesis. J Card Surg 3: 523±533 Radner W, Zehetmayer M, Skorpik C, Mallinger R (1996) Zur Anordnung der kollagenen Lamellen beim Keratokonus. Spektrum Augenheilkd 10: 156±160 Reiser KM (1991) Nonenzymatic glycation of collagen in aging and diabetes. Proc Soc Exp Biol Med 196: 17±29 Remacle M (1995) Treatment of vocal fold immobility by glutaraldehyde-cross-linked collagen injection: long-term results. Ann Otol Rhinol Laryngol 104: 437±444 Sady C, Khosrof S, Nagarja R (1995) Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem Biophys Res Commun 214: 793±797 Spörl E, Genth U, Schmalfuû K, Seiler T (1996) Thermo-mechanisches Verhalten der Hornhaut. Klin Monatsbl Augenheilkd 208: 112±116 Wisnewski PJ, Power DL, Kennedy JM (1988) Glutaraldehyde-cross-linked meniscal allografts: mechanical properties. J Invest Surg 1: 259±266 Wollensak J, Ihme A, Seiler T (1987) Neue Befunde bei Keratokonus. Fortschr Ophthalmol 84: 28±32 Wollensak J, Buddecke E (1990) Biochemical studies on human corneal proteoclycans ± a comparison of normal and keratoconic eyes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 228: 517±523 Yamauchi M, Chandler GS, Tanzawa H, Katz EP (1996) Cross-linking and the molecular packing of corneal collagen. Biochem Biophys Res Commun 219: 311±315 Zhao HR, Nagaraj RH, Abraham EC (1997) The role of a- and e-amino groups in the glycation-mediated cross-linking of gB-crystallin. J Biol Chem 272: 14 465±14 469 190 KLINISCHE STUDIE nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer Bestrahlung Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen, erste Ergebnisse bei vier Patienten1, 2, 3 Eckbert Schnitzler1, Eberhard Spörl1, Theo Seiler2 1 Augenklinik des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden, Fetscherstr. 74, 01307 Dresden (Dir.: Prof. Dr. A. Frühauf) 2 Augenklinik Zürich, Frauenklinikstraûe 24, CH-8091 Zürich (Dir.: Prof. Dr. T. Seiler) Zusammenfassung Hintergrund: Ulzerationen der Hornhaut stellen Prozesse dar, die in schweren Fällen nur mittels operativer Engriffe erfolgreich behandelt werden können. Die UV-Bestrahlung mit Riboflavin ist ein neues Verfahren, bei dem solche Einschmelzungsprozesse aufgehalten werden können. Patienten und Methode: Es wurden vier Patienten mit einschmelzenden Ulzera der Hornhaut unterschiedlicher Genese behandelt. Die UV-A-Bestrahlung erfolgte einmalig. Es wurden zwei UV-Leuchtdioden, die eine Wellenlänge von 370 nm emittierten mit einer Bestrahlungsstärke von 2,5 mW/cm2 und einer Bestrahlungsdauer von 30 Minuten verwendet. Die mit 2 ± 3 Tropfen 0,11 %-iger Riboflavinlösung betropfte Hornhaut wurde im Abstand von etwa 1 cm Entferung bestrahlt, so dass sich eine bestrahlte Fläche mit einem Durchmesser von 6 ± 7 mm ergab. Ergebnisse: Bei drei von vier Patienten kam es nach der UVVernetzung zum Sistieren des Einschmelzungsprozesses, was ein operatives Vorgehen mindestens zeitweilig erübrigte. Schlussfolgerungen: Insgesamt kann das oben beschriebene Verfahren in desperaten Fällen, wegen des Fehlens von Nebenwirkungen, zumindest als Behandlungsversuch vor eventuellen späteren invasiven Eingriffen empfohlen werden. formed 2 ± 3 drops of 0,11 % Riboflavinsolution were applied to the cornea. The treatment area was 6 ± 7 mm in diameter. Results: After the treatment in three of the four patients the melting process of the cornea stopped. At least temporarily, a surgical procedure could be delayed. Conclusion: Because of the absence of any side-effects in serious cases the method is recommended prior to surgery. Key words: ulcus ± cornea ± UV-radiation ± Riboflavin ± crosslinking of collagen Crosslinking of the corneal collagen by UV-radiation with Riboflavin for the mode of treatment melting ulcera of the cornea, first results of four patients Die Ulzeration von Hornhautstroma ist gekennzeichnet durch den Abbau von Kollagen. Die sterile Einschmelzung wird eingeleitet von Proteinasen, die Proteoglykane andauen, welche die Kollagenfibrillen umgeben. Danach erst können Kollagenasen ansetzen, die die Kollagenfibrillen selber angreifen [1]. Ein weiterer Abbau wird dann von anderen Proteinasen fortgesetzt, die auch von manchen Mikroben hergestellt werden, z. B. Pseudomonas [2]. Der Ursprung der endogenen Kollagenasen bei sterilen einschmelzenden Prozessen der Hornhaut ist allerdings nicht geklärt. Obwohl das Hornhautepithel selber kaum Kollagenasen herstellt, ist es doch in der Lage, die Kollagenaseproduktion in den Keratozyten zu modulieren, z. B. durch Interleukin-1 [3], insbesondere bei Vorliegen eines Epitheldefektes [4]. Möglicherweise wichtiger für die Produktion von Kollagenasen sind allerdings Entzündungszellen. Neutrophile Granulozyten findet man häufig am Ort der aktiven Einschmelzung [5]. Sie enthalten in ihren primären Lysosomen mehrere lytische Enzyme, unter anderem Kollagenasen und Elastasen [6]. Background: Corneal melting is a serious condition and in many cases maybe managed only by surgery. UV-radiation with Riboflavin is a new method that may stop the melting process of the cornea. Patients and method: Four patients suffering from melting ulcera of the cornea of various origin underwent a single UV-radiation. Two ultraviolet diodes were used emitting light with an wavelength of 370 nm with an energy of 2,5 mW/cm2. The radiation time was 30 minutes. Before he radiation was per- Schon seit langem ist bekannt, dass mit Fixativen (z. B. Glutaraldehyd) behandeltes Kollagen von Kollagenasen weniger angreifbar ist [7], was therapeutisch genutzt wird zur mechanischen und chemischen Stabilisierung von kollagenhaltigen Implantaten (z. B. Meniskusersatz) [8]. Dies wird auf eine Quervernetzung des Kollagens zurückgeführt. Daher ist es wenigstens theoretisch möglich, mittels einer Quervernetzung des stromalen Kollagens einem von Kollagenasen vermittelten Einschmelzungsprozess der Hornhaut entgegenzutreten. Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217: 190 ± 193 Georg Thieme Verlag Stuttgart New York ISSN 0023-2165 1 Schlüsselwörter: Ulkus ± Cornea ± UV-Bestrahlung ± Riboflavin ± Kollagenvernetzung · 2 3 Manuskript erstmalig eingereicht am 2. 2. 00 und in der vorliegenden Form angenommen am 10. 5. 00. Herrn Professor G. O. H. Naumann gewidmet. Die Autoren haben kein finanzielles Interesse an der vorgelegten Studie. Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217 191 UV und Riboflavin bei Hornhautulkus Tab. 1 Patienten, die mit UV-Licht und Riboflavin behandelt wurden Nr. Visus vor Bestrahlung Visus nach Bestrahlung Nachbeobachtungszeitraum weitere operative Eingriffe Befund nach Vernetzung Diagnose 1 + HBW 1/2 m 1/5 12 Monate x stabil 2 + HBW + HBW 3 Monate 3 + HBW LP recta 3 Wochen zwischenzeitlich stabil progredient 4 + HBW 1/20 Bindehautdeckung nach 3 Monaten Keratoplastik à chaud x Keratitis unklarer ¾tiologie Hornhautrandulkus bei Rosazea trophisches Hornhautulkus Transplantateinschmelzung 12 Monate stabil (+ HBW = positive Handbewegungen, LP recta = intakte Lichtscheinprojektion) Wir möchten die ersten Ergebnisse eines neuen Verfahrens zur Behandlung von stromalen Einschmelzungen vorstellen, bei dem ein weiteres Fortschreiten durch UV-Bestrahlung unter gleichzeitiger Riboflavingabe verhindert werden soll. Grund für diesen Effekt soll eine erhöhte Kollagenvernetzung sein [9]. Patienten und Methode nung ohne Vaskularisation (tiefe Randfurche/Abb. 1), worauf nach zwei Wochen die UV-Bestrahlung der Hornhaut mit Riboflavin erfolgte. Erst nach diesem Eingriff zeigte sich eine zirkuläre Einsprossung der Gefäûe und eine Stabilisierung der Hornhaut, die im weiteren Beobachtungszeitraum von sieben Monaten bestehen blieb, und es kam auch zum Aufklaren der Hornhaut (Abb. 2). Es wurden vier Patienten mit einschmelzenden Ulzera der Hornhaut unterschiedlicher Genese behandelt (Tab. 1). Die Vernetzung erfolgte zu einem Zeitpunkt, bei dem nur noch ein operativer Eingriff (z. B. Bindehautdeckung oder Keratoplastik à chaud) als Alternative zu unserer Behandlungsmethode in Frage kam. Vor der Behandlung wurden die Patienten über das Verfahren und die fehlenden klinischen Erfahrungen damit sowie theoretisch denkbare Komplikationen ausführlich aufgeklärt. Die UV-A-Bestrahlung erfolgte mit zwei UV-Leuchtdioden, die Licht einer Wellenlänge von 370 nm mit einer Bestrahlungsstärke von 2,5 mW/cm2 emittieren (Roithner Lasertechnik, Wien). Die mit 2 ± 3 Tropfen 0,11 %iger Riboflavinlösung betropfte Hornhaut wurde im Abstand von etwa 1 cm Entfernung bestrahlt, so dass sich eine bestrahlte Fläche mit einem Durchmesser von 6 ± 7 mm ergab. Jeweils im Intervall von 5 Minuten wurden 1 ± 2 Tropfen Riboflavinlösung getropft, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Die Bestrahlungsdauer betrug 30 min. Anschlieûend wurde ein Antibiotikum (Ofloxacin, Floxal-Augensalbe, Dr. Mann Pharma) aufgetragen. Abb. 1 Präoperativer Befund mit Hornhautverdünnung. Es besteht eine progressive tiefe Randfurche von 800 ± 1000 sowie von 200 ± 500 ohne Vaskularisation. Das Zielkriterium war die Verfestigung und das Verhindern einer weiteren Ausdehnung des Ulkus durch Proteolyse. Die gewählten Parameter der Methode (Konzentration der Riboflavinlösung und Bestrahlungsdauer) richteten sich nach den Ergebnissen von Vorversuchen an Schweine- und Kaninchenaugen [9]. Patienten und Methode Erster Patient (Nr. 1): 81-jähriger Patient mit länger bestehender Erosio und fehlender Epithelisierung infolge Keratitis unklarer Genese, der uns mit fast vollständig fehlendem Epithel vorgestellt wurde. Der Patient erhielt eine Bindehautdeckung, da es unter konservativer Therapie zu keiner genügenden Epithelialisierung kam. Drei Monate danach erfolgte die Abtragung der Bindehautdeckung und Säuberung der Hornhaut. Im weiteren Verlauf zeigte sich am Rand der ödematös getrübten Hornhaut von 8 ± 11 h und von 2 ± 3 h eine progressive Verdün- Abb. 2 Befund sieben Monate postoperativ mit feiner Vaskularisation in den verdünnten peripheren Hornhautarealen nasal und temporal, sowie Aufklaren der Hornhaut. 192 Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217 Zweiter Patient (Nr. 2): Eine 47-jährige Patientin mit Rosazea wurde uns nach viermonatiger erfolgloser konservativer Therapie (Oxytetrazyklin 1,5 g oral, Refobacin, Atropin, VitaminA, Floxal sine-Augentropfen) eines Hornhautrandulkus von 3 Uhrzeiten vorgestellt. Das Ulkus erstreckte sich von 6 Uhr bis 9 Uhr. Es erfolgte eine Bindehautdeckung, die nach 6 Monaten wieder eröffnet wurde. Einen Monat später stellte sich die Patientin mit erneuter Befundverschlechterung vor. Die Hornhautoberfläche war unregelmäûig und das Ulkus, nur über eine Strecke von einer Uhrzeit vaskularisiert, war im weiteren Verlauf progredient. Als Alternative zu einer erneuten Bindehautdeckung erfolgte die Vernetzung. Danach kam es zur Stabilisierung des Befundes ohne weitere Progredienz. Es zeigten sich vereinzelte Vaskularisationen der Hornhaut. Dieser Befund war jedoch nicht bleibend und 3 Monate später kam es zur erneuten Verschlechterung mit Bildung eines tiefen Randfurchenulkus von 9 Uhr über 12 bis 4 Uhr, das wieder eine Bindehautdeckung notwendig machte. Dritter Patient (Nr. 3): Ein 61-jähriger Patient zeigte nach zweifacher perforierender Keratoplastik bei Z.n. Hornhautabszess sowie Abstoûungsreaktion im Mai/99 ein trophisches Ulkus, das unter konservativer Therapie keine Besserung zeigte. Es erfolgte eine UV-Bestrahlung mit Riboflavin, die jedoch das Geschehen nicht aufhalten konnte und 3 Wochen nach der Bestrahlung musste eine Keratoplastik à chaud durchgeführt werden. Die lichtmikroskopische Untersuchung des trepanierten Hornhautgewebes bestätigte die chronische Entzündung erbrachte, entsprechend der möglichen Vergröûerung keinen Hinweis auf eine Veränderung der Kollagenstruktur. Vierter Patient (Nr. 4): 44-jähriger Patient mit Z.n. perforierender Rekeratoplastik bei primär vorliegendem Ulcus corneae unklarer Genese und Abstoûungsreaktion der ersten Keratoplastik. Bei diesem Patienten zeigte sich eine erneute Abstoûungsreaktion mit Tansplantateinschmelzung von 900 bis 100 reichend mit diffuser Endotheltrübung. Es erfolgte neben entsprechender konservativer Therapie die UV-Bestrahlung mit Riboflavin, um ein weiteres Einschmelzen der Hornhaut zu verhindern. Nach der Bestrahlung kam es zu einem zirkulären Übergreifen der Bindehaut auf die Peripherie des Transplantates und einem Sistieren der Einschmelzungsreaktion. Ergebnisse Bei drei von vier Patienten kam es nach der UV-Vernetzung zum Sistieren des Einschmelzungsprozesses, was ein operatives Vorgehen mindestens zeitweilig erübrigte. Eine zusätzliche Trübung der Hornhaut war nicht zu beobachten. Nebenwirkungen der UV-Strahlung an der Hornhaut wie z. B. endotheliale, stromale Veränderungen wurden bei den spaltlampenmikroskopischen Kontrollen nicht festgestellt. Ebenfalls wurden keine zusätzlichen Linsentrübungen beobachtet. Diskussion Bei entzündlichen Reaktionen der Hornhaut kommt es zur Leukozyteninfiltration und zur Freisetzung von Kollagenasen und Metalloproteinasen [10]. Diese führen zur Verschiebung des Synthese-Katalysegleichgewichtes in der Hornhaut und können einen gefürchteten Einschmelzungsprozess der Hornhaut bewirken. Durch UV-Bestrahlung der Hornhaut mit Ribo- Schnitzler E et al flavin kann eine Festigkeitszunahme der Hornhaut erzielt werden. Der Effekt soll auf einer verstärkten Vernetzung der Kollagenfibrillen beruhen [11]. Durch die Vernetzung kommt es aber auch zu anderen Veränderungen der Hornhaut wie der Löslichkeit, Versteifung und erhöhten Resistenz gegenüber Kollagenasen, wie es beim Diabetes mellitus und bei der natürlichen Alterung der Hornhaut beschrieben wurde [9,11,12,13,14,15]. Als Vernetzungssubstanz wurde Riboflavin gewählt, da für diese Substanz im Gegensatz zu der anderen vernetzenden Substanz Glutaraldehyd [9,16] bisher keine zellulären Nebenwirkungen bekannt sind. Bisherige Behandlungsansätze der Hornhauteinschmelzung beinhalten eine Reihe von konservativen und chirurgischen Maûnahmen. Die Applikation von EDTA und Steroiden soll die Kollagenasen hemmen und die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten verhindern [17,18], wobei Steroide auch die Kollagenbildung (Vernetzung) hemmen und damit die Hornhaut destabilisieren können. Die Bindehautdeckung gilt als einfaches und potentiell reversibles Verfahren ebenso wie die Amniondeckung [19]. Gröûere Defekte erfordern jedoch eine lamellierende oder perforierende Keratoplastik. Verbandslinsen können die Epithelisierung fördern [20]. Insgesamt kann das oben beschriebene Verfahren in desperaten Fällen, wegen des Fehlens von Nebenwirkungen zumindest als Behandlungsversuch vor eventuellen späteren invasiven Eingriffen, empfohlen werden. Die tatsächliche Erfolgsaussicht der UV-Vernetzung sollte in weiteren Studien mit einer gröûeren Patientenzahl eingeschätzt werden. Literatur 1 Eiferman RA, Carothers DJ, Yankeelor JA. Peripheral rheumatoid ulceration and evidence for conjunctival collagenase production. Am J Ophthalmol 1979; 87: 703 ± 709 2 Kessler E, Mondino BJ, Brown SF. Corneal response to Pseudomonas aeruginosa: histopathological and enzymatic characterisation. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977; 16: 116 ± 125 3 Bureau J, Pouliquen Y, Lorans G. Fibrozytenreaktion auf Interleukin-1-Stimulation bei Keratokonus. Klin Monatsbl Augenheilkd 1993; 203: 269 ± 274 4 Berman M. Regulation of collagenase: therapeutic considerations. Trans Ophthalmol Soc UK 1978; 98: 397 ± 405 5 Snip RC, Kenyon KR. Acute inflammatory cells in melting human corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci 1978; 17 Suppl: 252 6 Löffler G, Petrides PE. Physiologische Chemie, 4. Auflage. Springer Verlag, Berlin Heidelberg New York 1988; 786 7 Schauenstein E, Esterbaum H, Zollner H. Aldehydes in biological systems: their natural occurence and biological activities. Pion, London 1991; p. 140 ± 146 8 Wisnewski PJ, Powers DL, Kennedy JM. Glutaraldehyde-cross-linked meniscal allografts: mechanical properties. J Invest Surg 1988; 1: 259 ± 266 9 Spoerl E, Huhle M, Kasper M, Seiler T. Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut durch Vernetzung. Ophthalmologe 1997; 94: 902 ± 906 10 Fini ME, Cook JR, Mohan R. Proteolytic mechanisms in corneal ulceration and repair. Arch Dermatol Res 1998; 290 Suppl: 12 ± 23 11 Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res 1998; 66: 97 ± 103 12 Khosrof S, Sady C, Nagaraj RH. Advanced Maillard reaction and cross-linking of corneal collagen in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 1010 UV und Riboflavin bei Hornhautulkus 13 Mc Namara NA, Brand RJ, Bourne WM, Polse KA, Hodge DO. Hyperglycemic effects on corneal function. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 31 14 Reiser KM. Nonenzymatic glycation of collagen in aging and diabetes. Proc Soc Exp Biol Med 1991; 196: 17 ± 29 15 Sady C, Khosrof S, Nagarja R. Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem Biophys Res Commun 1995; 214: 793 ± 797 16 Nimmi ME. The cross-linking and structure modification of the collagen matrix in the design of cardiovascular prothesis. Journal Card Surg 1988; 3: 523 ± 533 17 Pfister RR, Haddox JL, Dodson RW, Deshazo WF. Polymorphonuclear leukocytic inhibition by citrate, other metal chelators, and Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217 193 trifluoperazine. Evidence to support calcium protein involvement. Invest Ophthalmol Vis Sci 984; 25: 955 ± 970 18 Forth W, Henschler D, Rummel W. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, 5. Auflage, 2. korrigierter Nachdruck. B. I. Wissenschaftsverlag Mannheim, Wien Zürich 1990; 429 19 Lamtriase A, Rama P, Aloe L, Bomini S. Management of neurotrophic keratopathy. Current Opinion Ophthalmol 1999; 10: 270 ± 276 20 Pfister RR. Clinical measures to promote corneal epithelial healing. Acta Ophthalmol Suppl (Copenh) 1992; 202: 73 ± 83 Ophthalmologe 2003 · 100:44–49 DOI 10.1007/s00347-002-0700-3 Originalien G.Wollensak1 · E. Spörl1 · T. Seiler2 1 Universitäts-Augenklinik Dresden · 2 Universitäts-Augenklinik,Zürich Behandlung von Keratokonus durch Kollagenvernetzung Zusammenfassung Hintergrund. Ziel dieser Studie war der Nachweis, ob sich die Hornhaut bei Keratokonuspatienten mittels photochemischer Riboflavin/UVA-Kollagenvernetzung verfestigen lässt, um so die progressive Hornhautektasie zu stoppen. Patienten und Methode. Wir behandelten 16 Augen von 15 Patienten mit gesicherter Progression und überwiegend moderatem Keratokonus.Nach Epithelabrasio wurde Riboflavinlösung auf die Hornhaut appliziert und mit UVA aus 1 cm Abstand für 30 min bestrahlt.Nachkontrollen, die Visus, Hornhauttopographie und Messung der Endothelzelldichte einschlossen, erfolgten im 1.Jahr alle 3 Monate, danach alle 6 Monate, wobei der Nachbeobachtungszeitraum zwischen 1 und 3 Jahren lag. Ergebnisse. Eine Progression der Keratektasie konnte bei allen Patienten gestoppt werden.Bestkorrigierter Visus und der maximale Keratometerwert besserten sich gering in ca. 50% der Fälle.Bei allen Patienten blieben die Hornhauttransparenz und die Endothelzelldichte stabil. Schlussfolgerungen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass möglicherweise die Quervernetzung des Kollagens eine geeignete konservative Behandlungsmöglichkeit ist, um das Fortschreiten des Keratokonus aufzuhalten. Weitere Studien sind geplant, um Spätkomplikationen auszuschließen und den Langzeiteffekt dieser Methode zu sichern. Schlüsselwörter Keratokonus · Hornhaut · Vernetzung · Riboflavin · UV 44 | Der Ophthalmologe 1•2003 D er Keratokonus ist eine zumeist bilateral auftretende Hornhautdegeneration mit kegelförmiger Hervorwölbung der verdünnten Kornea. Der Begriff „Keratokonus“ wurde durch von Ammon aus Dresden bereits Anfang des 19. Jahrhunderts geprägt. Die Inzidenz beträgt 1/2000 in der Gesamtbevölkerung. Typischerweise beginnt der Keratokonus in der Pubertät und schreitet dann bei ca. 21% aller Keratokonuspatienten so weit voran, dass eine Keratoplastik wegen Vernarbung oder irregulärem Astigmatismus durchgeführt werden muss [10, 16]. Deswegen ist der Keratokonus auch insgesamt gesehen mit bis zu 16% eine der häufigsten Indikationen zur Keratoplastik [7]. Vor der Keratoplastik werden vor allem harte Kontaktlinsen zur Behandlung eingesetzt. Seltener angewandte Verfahren sind Epikeratoplastik und intrakorneale Ringe [4, 10, 13]. Allen diesen Verfahren ist jedoch gemeinsam, dass sie nur die refraktiven Folgen des Keratokonus behandeln, jedoch nicht die Ursache der Hornhautverdünnung und daher das Fortschreiten des Keratokonus nicht aufhalten können bzw. sogar zum Teil beschleunigen. Basierend auf umfangreichen tierexperimentellen Untersuchungen [14, 15], bei denen es uns gelang, mittels photochemischer Vernetzung die Hornhaut signifikant zu verfestigen (Abb. 1, 2, 3), verfolgten wir in der vorliegenden prospektiven Studie einen ganz anderen Ansatz, bei dem es Ziel ist, durch Erhöhung der Kollagenquervernetzung in der Hornhaut die Erkrankung an ihrer Wurzel zu packen und ein Fortschreiten des Keratokonus zu verhindern. Patienten und Methode Nach Zustimmung der Ethikkommission des Universitätsklinikums zum Studiendesign (EK 310499) wurden 15 Patienten (16 Augen) in die prospektive klinische Studie eingeschlossen. Das mittlere Alter der 6 weiblichen und 9 männlichen Patienten betrug 32,18±10,86 Jahre (13–51 Jahre). Es wurden bevorzugt Patienten mit moderatem Keratokonus behandelt, d. h., die Keratometerwerte lagen bei den meisten zwischen 48 und 56 dpt (Tabelle 1). Bei allen Patienten lag anamnestisch eine deutliche Progression des Keratokonus in den letzten 2 Jahren vor, weshalb die Patienten zum Teil auch von weit entfernt überwiesen wurden. Dabei war bei ca. der Hälfte der Patienten die Progression durch Hornhauttopographieaufnahmen gesichert. Die Patienten wurden vor der Behandlung über den experimentellen Charakter der Behandlung und über die regelmäßigen Kontrolluntersuchungen aufgeklärt.Aus Vorsichtsgründen wurde bevorzugt nur ein Auge behandelt, nur im ersten Fall alle beiden Augen, da wegen Leber- Optikusatrophie beidseitige Erblindung bestand. Bei 2 Patienten lag eine Trisomie 21, bei 1 Fall eine Neuro- © Springer-Verlag 2003 Teile des Beitrags wurden auf der 99.Tagung der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft präsentiert. Priv.-Doz. Dr. G.Wollensak Universitäts-Augenklinik Dresden, Fetscherstraße 74, 01307 Dresden E-Mail: [email protected] Ophthalmologe 2003 · 100:44–49 DOI 10.1007/s00347-002-0700-3 G.Wollensak · E. Spörl · T. Seiler Treatment of keratoconus by collagen cross linking Abstract Background. We were able to show a significant increase in corneal stiffness of rabbit and porcine eyes after combined riboflavin/UVA-induced collagen cross-linking.In this study, we tried to treat keratoconus patients with this method to stop the progression of corneal ectasia. Patients and methods. We treated 16 eyes of 15 patients with progressive keratoconus and mostly moderate keratectasia (48–56 dpt).After removal of the epithelium (7 mm ∅), riboflavin solution was applied on the cornea, which was irradiated with UVA (370 nm, 3 mW/cm2) at a distance of 1 cm for 30 min.Post-operative follow-up controls were conducted every 3 months in the first year and then every 6 months, always including visual acuity testing, corneal topography and measurements of endothelial cell density.The follow-up time was between 1 and 3 years. Results. Progression of keratectasia was stopped in all patients.Best corrected visual acuity and the maximal keratometry values improved slightly in about 50% of the cases. In all patients corneal transparency, the degree of keratectasia registered by corneal topography and the density of endothelial cells remained unchanged within the followup time.No negative side-effects were observed. Conclusions. Our results show that collagen cross linking might be a useful conservative treatment modality to stop the progression of keratoconus.By this means the need for keratoplasty might be significantly reduced.Given the simplicity of the technique and minimal costs of the treatment it might also be well suited for developing countries.Further studies are envisaged to exclude long-term side effects and to evaluate the long term durability of the mechanical stiffness effect. Keywords Keratoconus · Cornea · Cross linking · UV · Riboflavin Abb.1 Prinzip der photochemischen Vernetzung von Kollagen mit Riboflavin als Photosensibilisator dermitis vor.Augenbohren war bei Fall 1 anamnestisch bekannt. Folgende Parameter wurden vor der Behandlung im 1.postoperativen Jahr alle 3 Monate, danach zumeist nur noch alle 6 Monate erhoben: der beste korrigierte Visus, Keratometerwerte, Hornhauttopographie mit dem Videokeratoskop (C-Scan,Technomed),Augeninnendruck, Hornhautfoto,Spaltlampen- und Fundusuntersuchung sowie zentrale Endothelzelldichte mit dem Endothelmikroskop (EM-1200, Tomey), wobei die Endothelzelldichte mit der Fixed-frame-Methode bestimmt wurde und jeweils ca. 90–100 Zellen pro Messung erfasst wurden. Eine Pachymetrie (Pachette,Technomed) wurde bei den letzten 4 Patienten (Patient 13–16) durchgeführt.Dabei wurden Werte zwischen 460–540 µm gemessen. Behandlungsprocedere. Die Behandlung erfolgte in lokaler Tropfanästhesie mit Proxymetacainhydrochlorid-AT 0,5%. Im Zentrum der Hornhaut wurde auf einer Fläche von 7 mm Durchmesser eine Epithelabrasio durchgeführt. Diese ist notwendig, weil sonst die Epithelschicht das Eindringen von Riboflavin ins Hornhautstroma verhindert. Als Photosensibilisator wurde eine 0,1%ige Riboflavinlösung (10,95 mg Riboflavin-5-phosphat in 10 ml 20%iger Dextran-T-500-Lösung) auf die Hornhaut getropft und mit ultraviolettem UVA-Licht der Wellenlänge von 370 nm und der Bestrahlungsintensität von 3 mW/cm2 mit einem Abstand von 1 cm für 30 min bestrahlt (Abb. 4).Als UVA-Strahlungsquelle dienten zwei UV-Leuchtdioden mit einer Strahldivergenz von 10 (Roithner Lasertechnik, Wien), bei denen ein Potentiometer zur Spannungsregelung in Reihe geschaltet wird. Als Spannungsversorgung dienten drei 1,3-V-Akkus. Vor der Behandlung wurde die Bestrahlungsintensität von 3 mW/cm2 mit dem UVMessgerät LaserMate-Q (LASER 2000, Wessling, BRD) in 1 cm Abstand kontrolliert. Bei Abweichungen der Bestrahlungsstärke wurde die Spannung der Leuchtdiode mittels Potentiometer auf die Sollbestrahlungsintensität geregelt. Während der Bestrahlung wurden im Intervall von 5 min 1–2 Tropfen Riboflavin auf die Hornhaut getropft. Nach Abschluss der Behandlung wurde antibiotische Augensalbe appliziert. Um die UV-Dosis für die menschliche Linse abschätzen zu können, wurden in einem Vorversuch bei 10 frisch enukleierten,mit Riboflavin vorbehandelten Schweineaugen mit einem UV-Extinktionsmessgerät (Perkin Elmer) die korneale UV-Transmission bei 370 nm gemessen [14] und betrug somit 7% der primären Bestrahlungsintensität, d. h., die verwendete Bestrahlungsintensität wurDer Ophthalmologe 1•2003 | 45 Originalien Abb.2 Deutlicher Versteifungseffekt durch Riboflavin-UVA-Behandlung (oben) behandelte gelbe, (unten) unvernetzte graue Schweinehornhaut de von 3 mW/cm2 durch die korneale Absorption bei einer Hornhautdicke von 500 µm auf 0,21 mW/cm2 (=0,378 Ws/cm2 bei 30 min Bestrahlungszeit) in der Nähe der Linse und auf 10 µW/cm2 (=0,018 mWs/cm2 bei 30 min Bestrahlungszeit) vor der Netzhaut reduziert. Ergebnisse Die maximale Nachkontrollzeit lag bei 3,5 Jahren, die mittlere Nachkontrollzeit bei 23,2±9,4 Monaten. Mit dem Wilcoxon-Test für Paardifferenzen findet sich eine signifikante Verbesserung für den Visus um 1,3 Linien (p<0,01) und für den maximalen Keratometerwert um 1,38 dpt (p<0,01). Leichte Verbesserung des Visus fanden sich in ca. 68% und des Keratometerwertes (Abb. 5) in ca. 50% der Fälle, wobei die restlichen Fälle konstant gegenüber dem präoperativen Befund blieben. Nebenwirkungen wie Endothelzellschäden oder Kataraktbildung wurden bei keinem der Patienten festgestellt. Es kam zu keiner Zunahme der Trübung der Hornhaut, bei 2 Patienten (Patient 1 und 2) wurde sie sogar deutlich besser (s. Tabelle 1). Diskussion Mit der hier vorgestellten Methode der Kollagenvernetzung ist eine Erweite- 46 | Der Ophthalmologe 1•2003 rung des therapeutischen Spektrums bei Keratokonus gegeben, und es scheint zum ersten Mal möglich zu sein, das Fortschreiten des Keratokonus zu stoppen und evtl. in Einzelfällen sogar wieder etwas rückgängig zu machen. Es konnte eine signifikante Abnahme der Keratektasie anhand der Keratometerwerte in 50% und eine Zunahme des Visus um eine Visusstufe in 68% statistisch nachgewiesen werden. Die zahlreichen bisherigen operativen Verfahren zur Behandlung des Keratokonus wie thermale Keratoplastik, intrakorneale Ringe, Epikeratoplastik oder lamelläre Keratoplastik können nur vorübergehend refraktive Sehverbesserungen bringen [4, 10, 13], jedoch das Fortschreiten des Keratokonus nicht aufhalten. Auch bei der Kontaktlinse ist ein positiver Einfluss auf das Fortschreiten des Keratokonus nicht bewiesen [19]. Letztendlich bleibt daher langfristig nur die Hornhauttransplantation, wobei hierbei Probleme wie sekundäre Katarakt oder Glaukom, irregulärer Astigmatismus, Abstoßung und Keratokonusrezidiv möglich sind. Schwierigkeit bei der Einschätzung des Behandlungseffektes Eine Schwierigkeit bei der Einschätzung des Behandlungseffektes ist die Tatsache, dass der Keratokonus schon spontan zum Stillstand kommen kann („forme fruste“). Daher sind die positiven Verläufe unserer Patienten theoretisch auch ohne die vorangegangene Vernetzung möglich.Allerdings war der Keratokonus praktisch bei allen Patienten anamnestisch vor der Behandlung progredient gewesen, in knapp 50% war dies auch durch Topographie belegt.Außerdem ist aus epidemiologischen Studien bekannt, Abb.3 Biomechanischer Materialtester (Minimat) zur Messung des Spannungsdehnungsverhaltens von vernetzter Schweinehornhaut dass ca. 21% der Keratokonuspatienten langfristig eine Keratoplastik brauchen [16], während es in unserer Studie bei keinem zu einer Progression des Befundes kam. Sollten in der Zukunft allerdings negative Verläufe nach Vernetzungsbehandlung beobachtet werden, müssten diese aber umso stärker gewertet werden, da nicht auszuschließen ist, dass einige Fälle auch ohne Behandlung stabil geblieben wären. In unserer Studie gab es aber bisher keinerlei „therapeutische Ausreißer“. Es bleibt auch abzuwarten, ob der Behandlungseffekt auch noch in 5–10 Jahren anhält. Möglicherweise muss die Behandlung alle paar Jahre wegen der Umbauvorgänge im Rahmen des Kollagenstoffwechsels der Hornhaut wiederholt werden, da die biologische Halbwertszeit des kornealen Kollagens ca. 2–3 Jahre beträgt. Behandlungsprinzip Das Prinzip der beschriebenen Behandlung beruht auf der photochemischen Vernetzung der Kollagenfasern der Hornhaut und findet z. B. auch in der Industrie zur Härtung von Lacken und Plastikwerkstoffen in ähnlicher Weise Anwendung. Bei der UV-Bestrahlung der Hornhaut werden Kollagen-Crosslinks durch die bei der Bestrahlung entstehenden Sauerstoffradikale induziert (s.Abb. 1), wobei das Riboflavin als Photosensibilisator wirkt und den Vernetzungseffekt potenziert. Es kommt dabei zu einer Verhärtung der Hornhaut ähnlich wie nach Formalin- oder Glutaraldehydfixation, dessen „Verhärtungseffekt“ jedem Pathologen aus der täglichen Praxis bestens bekannt ist und auch auf der Erhöhung der Crosslinks im Gewebe beruht. In ähnlicher Weise Tabelle 1 Kontrollparameter prä- und postoperativ Patient 1R 1L 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Postoperatives Zeitintervall (Monate) Visus Präoperativ 41 41 29 27 27 25 25 24 23 23 21 19 14 13 13 6 – – HBW 0,4 0,5 0,8 HBW 0,8 0,6 0,3 0,8 0,4 0,3 0,4 0,5 0,2 Endothelzellzahl Maximaler K-Wert Transparenz Postoperativ Präoperativ Postoperativ Präoperativ Postoperativ Postoperativ 1/20 0,9 0,6 1,0 HBW 0,8 0,7 0,6 0,9 0,7 0,5 0,3 0,8 0,3 – – – 2.300 2.400 2.200 1.700 – 2.600 2.580 – 2.450 2.290 2.110 2.360 2.060 2275±211(6) 2413±186(6) 2257±218(6) 1875±197(3) – 2723±169(5) 2668±228(5) 2815±208(4) 2396±196(5) 2257±258(4) 2214±151(4) 2437±217(4) 2139±273(2) – – – 49,69 57,94 49,36 49,10 50,32 50,72 56,49 53,19 55,50 55,17 52,80 45,88 59,00 48,30 58,04 49,41 48,20 45,90 49,04 54,52 51,11 52,61 54,56 – 45,94 57,76 + + + = = = = = = = = = = = = = Der Wert für den postoperativen Visus und den Keratometerwert sind von der letzten Untersuchung; die Zahl in Klammern bei der postoperativen Endothelzellzahl =Anzahl der postoperativen Endothelzellmessungen. kommt es auch bei der Blutgerinnung zum Crosslinking von Fibrin und damit zur Bildung eines festen Thrombus. Der therapeutische Ansatz der Vernetzung wird im übrigen auch in der Medizin bereits vielfältig bei anderen Indikationen verwendet. So wurde die Kollagenvernetzung mittels Glutaraldehyd bzw. Formalin bei Bioherzklappen, bei injizierbarem Kollagen für die Stimmbänder zur Behandlung der Rekurrensparese und periurethral bei Harninkontinenz und zur Härtung von Faszien beim Trommerfellersatz genutzt. In der Zahnheilkunde werden zahlreiche Werkstoffe durch Lichtaktivierung ausgehärtet [8]. In der Ophthalmologie wurden injizierbare Linsenmaterialien durch photochemische Vernetzung verfestigt [6] und ein Riboflavin-Fibrinogen-Gemisch durch Argonlaseraktivierung als Bioklebemittel für die nahtlose Keratoplastik getestet [5]. Interessanterweise wurde passend zu unserem neuen Therapieansatz in biochemischen Untersuchungen bei Keratokonus eine Abnahme der Hydroxylysin-Crosslinks gezeigt [3]. Des Weiteren wurde beim Keratokonus eine Zunahme der Kollagenasen, eine Abnahme von Proteasehemmern [19], eine Zunahme von Kollagenabbauprodukten in der Tränenflüssigkeit [1] und eine Störung des zwischen den Kollagenfibrillen gelegenen Glycosaminoglycangerüstes [18] festgestellt, alles Faktoren, die zur Reduktion der mechanischen Kollagenfaserstabilität führen. In biomechanischen Untersuchungen wurde beim Keratokonus eine signifikant reduzierte mechanische Festigkeit in Spannungs-Dehnungs-Experimenten festgestellt [2]. Auch konnte bei epidemiologischen Studien gezeigt werden, dass bei Patienten mit Diabetes mellitus, bei denen Kollagen-Crosslinks in der Hornhaut durch sog.„advanced glycation end products“ vermehrt sind [11], Keratokonus signifikant seltener auftritt als in der Normalbevölkerung [12]. Nebenwirkungen und Komplikationen Abb.4 Bestrahlungstechnik mit 2 UV-Dioden über der mit Riboflavin getropften, zentral abradierten Hornhaut bei einem Keratokonuspatienten Bemerkenswerterweise wurden nach der Behandlung weder Kurz- noch Langzeitnebenwirkungen beobachtet. Insbesondere wurden keine Endothelzellschäden und keine Katarakt beobachtet. Wir konnten messen, dass durch das hohe Absorptionsvermögen von RiDer Ophthalmologe 1•2003 | 47 Originalien noch nicht nötig ist. Falls sich die Methode langfristig bezüglich Therapieeffekt und Nebenwirkungen bewährt, wollen wir später auch sehr frühe Formen des Keratokonus behandeln, bei denen der Patient noch geringe Beschwerden hat. Insgesamt könnte sich dann die Zahl der Keratoplastiken bei Keratokonus deutlich vermindern, sodass Spenderhornhäute vermehrt für andere Indikationen zur Verfügung stehen würden [7]. Andere denkbare Indikationen für die Behandlung sind neben dem Keratokonus die pelluzidale marginale Randdegeneration, Keratoglobus, Hornhautstablisierung im Rahmen von refraktiven Eingriffen und Hornhautulzera. Da die Behandlung einfach und kostengünstig ist, wäre sie in Zukunft auch in Entwicklungsländern durchführbar, in denen Kontaktlinsen oder Keratoplastik oftmals nicht zur Verfügung stehen. Fazit für die Praxis Abb.5a,b Hornhauttopographie vor (a) und 22 Monate nach (b) Behandlung mit leichter Verbesserung der Keratometerwerte (50,26 dpt→48,32 dpt) boflavin für 370 nm die Energie zu 93% im Hornhautstroma absorbiert wird und das Endothel, die Linse und die Netzhaut weitestgehend vor UV-Schäden geschützt sind [14]. So wird z. B. die Schwellendosis von 70 Ws/cm2 für einen UV-bedingten Linsenschaden bei 370 nm bei einer Bestrahlung von 30 min mit 0,378 Ws/cm2 deutlich unterschritten. Bei der therapeutischen Dosis wurden von uns jedoch im Tierexperiment bei sehr dünnen Hornhäuten (kritische Dicke: 400 µm) massive Endothelschäden beobachtet (noch unveröffentlichte Daten). Eine Behandlung mit der Bestrahlungsstärke von 3 mW/cm2 sollte daher bei einer Hornhaut mit einer Dicke weniger als 400 µm nicht durchgeführt werden. Daher führen wir seit 1 Jahr auch immer vor der Behandlung eine Pachymetrie durch (Patient 13–15).Glücklicherweise werden selbst beim fortgeschritte- 48 | Der Ophthalmologe 1•2003 nen Keratokonus diese Werte in der Regel nicht unterschritten. So fanden Watters und Owen eine durchschnittliche Hornhautdicke von 446±38 µm im Konusbereich bei fortgeschrittenem Keratokonus, wobei jedoch insbesondere die Hornhaut im Bereich unter dem Konusapex noch etwas dünner sein kann [17]. Indikationen der Methode In erster Linie ist die Methode geeignet, die weitere Progression des Keratokonus zu stoppen. Eine minimale Verbesserung der Keratektasie des Keratokonus ist jedoch zum Teil möglich. Daher behandeln wir zurzeit in erster Linie moderat fortgeschrittene Stadien des Keratokonus, bei denen zum einen eine vorangegangene Progression anamnestisch vorlag und zum anderen die Behandlung noch Sinn macht, da eine Keratoplastik Die Induktion von Kollagenquervernetzungen durch Behandlung mit Riboflavin und UVA-Licht scheint eine neue Möglichkeit zu sein, eine Progression von Keratokonus bereits im Frühstadium durch Erhöhung der biomechanischen Festigkeit zu stoppen und damit auch eine Keratoplastik zu vermeiden.Langzeitstudien müssen noch Klarheit über Dauer des Effektes und mögliche Langzeitnebenwirkungen bringen. Aufgrund der geringen Kosten und Unkompliziertheit der Behandlung ist diese auch gut für Entwicklungsländer geeignet. Literatur 1. Abalain J (2000) Levels of collagen degradation products (telopeptides) in the tear film of patients with keratoconus.Cornea 19:474–476 2. Andreassen TT, Simonsen AH, Oxlund H (1980) Biomechanical properties of keratoconus and normal corneas.Exp Eye Res 31:435–441 3. Cannon DJ,Forster CS (1978) Collagen crosslinking in keratoconus.Invest Ophthalmol Vis Sci 17:63–65 4. Colin J, Cochener B, Savary G, Malet F (2000) Correcting keratoconus with intracorneal rings. J Catarat Refract Surg 26:1117–1122 5. Goins KM, Khadem J, Majmudar PA (1998) Relative strength of photodynamic biologic tissue glue in penetrating keratoplasty in cadaver eyes.J Cataract Refract Surg 24:1566-1570 Fachnachrichten 6. Hettlich HJ, Lucke K, Kreiner CF (1992) Light induced endocapsular polymerization of injectable lens refilling materials.Ger J Ophthalmol 1:346–349 7. Maeno A, Naor J, Lee HM, Hunter WS, Rootman DS (2000) Three decades of corneal transplantation: Indications and patient characteristics.Cornea 19:7–11 8. Maffezoli A, Della Pietra A, Rengo S, Nicolais L, Valletta G (1994) Photopolymerization of dental composite matrices.Biomaterials 15:1221–1228 9. Pitts DG, Cullen AP, Hacker PD (1977) Ocular effects of ultraviolet radiation from 295-365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci 16:932–939 10. Rabinowitz YS (1998) Keratoconus. Surv Ophthalmol 42:297–319 11. Sady C, Khosrot S, Nagaraj R (1995) Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem Biophys Res Com 214:793–797 12. Seiler T, Huhle S, Spoerl E, Kunath H (2000) Manifest diabetes and keratoconus: a retrospective case-control study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238:822–825 13. Sekundo W, Stevens JD (2001) Surgical treatment of keratoconus at the turn of the 20th century.J Refr Surg 17:69–73 14. Spörl E, Schreiber J, Hellmund K, Seiler T, Knuschke P (2000) Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen. Ophthalmologe 97:203–206 15. Spoerl E, Huhle M, Seiler T (1998) Induction of cross-links in corneal tissue.Exp Eye Res 66:97–103 16. Tuft SJ, Moodaley LC, Gregory WM, Davison CR, Buckley RJ (1994) Prognostic factors for the progression of keratoconus.Ophthalmology 101:439–447 17. Watters G, Owens H (1998) Evaluation of mild, moderate, and advanced keratoconus using ultrasound pachymetry and the EyeSys videokeratoscope.Optom Vis Sci 75:640–646 18. Wollensak J, Buddecke E (1990) Biochemical studies on human corneal proteoglycans-a comparison of normal and keratoconic eyes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 228:517–523 19. Zhou L, Sawaguchi S,Twining SS, Sugar J, Feder RS,Yue BY (1998) Expression of degradative enzymes and protease inhibitors in corneas with keratoconus.Invest Ophthalmol Vis Sci 39:1117–1124 Springer-Verlag und Die Deutsche Bibliothek kooperieren in der Langzeitarchivierung von Online-Publikationen Der wissenschaftliche Springer-Verlag und Die Deutsche Bibliothek haben die Volltext-Versionen von derzeit 430 Springer-Zeitschriften in über zwei Millionen Einzeldateien zur Langzeiterhaltung auf den Archivserver der Deutschen Bibliothek überführt.Das 1998 begonnene Pilotprojekt mit dem Ziel, die Langzeitarchivierung von Online-Publikationen sicherzustellen, wurde damit für den Zeitschriftenbereich zu einem vorläufigen Abschluss gebracht.Somit können Leserinnen und Leser die archivierten Volltext-Daten in den Räumen der Deutschen Bibliothek bequem nutzen.Darüber hinaus arbeiten der Springer-Verlag und Die Deutsche Bibliothek daran, das Archivierungsverfahren auf die elektronisch verfügbaren Springer-Buchreihen auszudehnen. Bereits im März 2002 hatte der Springer-Verlag gemeinsam mit anderen Verlagen der Arbeitsgruppe “Elektronische Depotbibliothek” mit der Deutschen Bibliothek eine Rahmenvereinbarung über die Archivierung von Online-Publikationen abgeschlossen. Die Bibliothek strebt an, ihrem Auftrag der lückenlosen Archivierung aller deutschen und deutschsprachigen Publikationen auch im elektronischen Bereich gerecht zu werden. Der Springer-Verlag ist mit seinem Internet-basierten Informationsservice einer der führenden internationalen Anbieter wissenschaftlicher Online-Inhalte mit Zugang zu knapp 500 Zeitschriften, 1.600 Büchern, zwei Lernsoftwares und fünf Expertensystemen. Monatlich kann der SpringerOnline-Service im Durchschnitt 55 Millionen Zugriffe verzeichnen. Das inhaltliche Spektrum umfasst elf verschiedene Fachgebiete aus Naturwissenschaft,Technik, Medizin, Psychologie,Wirtschaftswissenschaften und Jura. Die Deutsche Bibliothek ist die deutsche Nationalbibliothek mit den drei Standorten Deutsche Bücherei Leipzig, Deutsche Bibliothek Frankfurt am Main und Deutsches Musikarchiv Berlin. Sie hat die Aufgabe, lückenlos alle deutschen und deutschsprachigen Publikationen ab 1913 zu sammeln. Mit inzwischen etwa 12.000 OnlineDissertationen verfügt sie über die weltweit größte Sammlung an originär digital veröffentlichten Hochschulschriften. Die Deutsche Bibliothek hat im Oktober 2001 eine Anmeldeschnittstelle für Online-Publikationen eingerichtet, die allen Verlagen und verlegenden Stellen die freiwillige Abgabe von Veröffentlichungen zur Archivierung ermöglicht. Henna-Tätowierungen als Ursache für lebenslange Allergien Immer mehr Menschen lassen sich mit dem alten orientalischen Färbemittel Henna temporäre Bilder in die Haut tätowieren. Leider können diese so genannten Temptoos kontaktallergische Hautreaktionen auslösen – oft sogar erst, wenn das Hautbild bereits verblasst ist. Reines Henna wird von den meisten Menschen vertragen. Dem traditionellen Henna wird jedoch häufig Paraphenylendiamin (PPD) beigemengt, um den Farbton augenscheinlich zu verbessern und eine schnellere Trockenzeit zu erreichen. PPD ist ein schwarzer Farbstoff, dessen hohes Sensibilisierungspotenzial als Kontaktallergen belegt ist. Als Haarfärbemittel ist es seit Jahrzehnten in Deutschland verboten und lediglich für bestimmte industrielle Zwecke in einer Konzentration bis zu 6 % zugelassen. Das dekorative Bemalen der Haut mit PPD-haltigen Farbstoffgemischen unterliegt der Kosmetikverordnung. Produkte aus Nicht-EU-Ländern sind an diese Vorgaben aber nicht gebunden und enthalten oft erhebliche Mengen an PPD. Bereits einige Tage nach Tätowierung können erste Hautreaktionen wie Juckreiz, Rötungen, Knötchen- und Bläschenbildung auftreten. Auch über Schwellungen von Haut und Schleimhaut (Angioödeme), Beinödeme, Nesselsucht (Urtikaria) oder Astma bronchiale wurde berichtet. In der Regel lassen sich die Beschwerden erfolgreich mit Kortikosteroiden und zusätzlicher Antihistamingabe behandeln. Zu den Spätreaktionen der Henna-Tätowierungen zählt die kontaktallergische Dermatitis. Oft sind die Temptoos bereits vollständig verblasst, wenn der Patient die ersten Beschwerden angibt. Eine einmal erworbene Allergie begleitet den Patienten häufig lebenslang: Beim Tragen von schwarzer Kleidung etwa können sich juckende und schuppende Hautveränderungen bilden, teilweise mit blasigen Streureaktionen an Händen und Füßen. Noch gravierender sind die Auswirkungen auf das Arbeitsleben: PPD und andere verwandte Stoffe sind in bestimmten Berufen wie Friseur, Drucker,Textilverarbeiter, Schuh- und Lederwarenverkäufer, Chemiewerker oder Arbeiter in der Gummi-, Kunststoff oder Papierindustrie schwer zu meiden. Quelle: Informationsdienst Wissenschaft Weitere Informationen unter: http://link.springer. de und http://www.ddb.de Der Ophthalmologe 1•2003 | 49 Riboflavin/Ultraviolet-A–induced Collagen Crosslinking for the Treatment of Keratoconus GREGOR WOLLENSAK, MD, EBERHARD SPOERL, PHD, AND THEO SEILER, PHD, MD ● PURPOSE: In animal eyes, a significant increase in corneal biomechanical stiffness has been found after collagen crosslinking by combined riboflavin/ultraviolet-A (UVA) treatment. The aim of the present study was to evaluate the clinical usefulness of riboflavin/ UVA-induced collagen crosslinking for bringing the progression of keratoconus to a halt. ● DESIGN: Prospective, nonrandomized clinical pilot study. ● METHODS: Twenty-three eyes of 22 patients with moderate or advanced progressive keratoconus (maximum K value, 48 –72 diopters) were included. After central corneal abrasion, photosensitizing riboflavin drops were applied and the eyes exposed to UVA (370 nm, 3 mW/cm2) in a 1-cm distance for 30 minutes. Postoperative examinations were performed in 6-month intervals, including visual acuity testing, corneal topography, slit-lamp examination, measurement of endothelial cell density, and photographic documentation. The follow-up time was between 3 months and 4 years. ● RESULTS: In all treated eyes, the progression of keratoconus was at least stopped. In 16 eyes (70%) regression with a reduction of the maximal keratometry readings by 2.01 diopters and of the refractive error by 1.14 diopters was found. Corneal and lens transparency, endothelial cell density, and intraocular pressure remained unchanged. Visual acuity improved slightly in 15 eyes (65%). ● CONCLUSIONS: Collagen crosslinking may be a new way for stopping the progression of keratectasia in patients with keratoconus. The need for penetrating keratoplasty might then be significantly reduced in keratoconus. Given the simplicity and minimal costs of the treatment, it might also be well-suited for developing countries. Long-term results are necessary to evaluate the duration of the stiffening effect and to exclude long Accepted for publication Dec 2, 2002. InternetAdvance publication at ajo.com Feb 26, 2002. From the Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden, Dresden, Germany (G.W., E.S), and the Department of Ophthalmology, University of Zurich, Zurich, Switzerland (T.S.). Inquiries to Gregor Wollensak, MD, University Eye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany; fax: (⫹49) 351-4584335; e-mail: [email protected] 620 © 2003 BY term side-effects. (Am J Ophthalmol 2003;135: 620 – 627. © 2003 by Elsevier Inc. All rights reserved.) K ERATOCONUS IS A NONINFLAMMATORY CONELIKE ectasia of the cornea, which is usually bilateral and progresses over time. Its reported frequency is approximately 1 in 2,000 in the general population.1 Usually, the condition starts at puberty, progressing in approximately 20% to such an extent that penetrating keratoplasty becomes necessary.2,3 Besides penetrating keratoplasty, hard contact lenses are the major treatment modality for keratoconus. In rare cases, epikeratoplasty, photorefractive keratectomy, or intracorneal rings can be considered.1,4 –7 However, all of these techniques only correct the refractive errors of keratoconus but do not treat the cause underlying the corneal ectasia and therefore cannot stop the progression of keratoconus. A new technique of collagen crosslinking by the photosensitzer riboflavin and UVA similar to photopolymerization in polymers8 has been developed. In extensive experimental studies in rabbit and porcine eyes, including biomechanical stress–strain measurements,9 –11 we showed a significant increase in corneal rigidity by approximately 70% in untreated vs treated corneas9 (Figure 1) after collagen crosslinking by the combined riboflavin/UVA treatment. The aim of the present pilot study was to evaluate the effect of the new crosslinking method on the progression of keratectasia in patients with keratoconus and to exclude possible serious side effects. DESIGN THIS WAS A PROSPECTIVE, NON-RANDOMIZED PILOT STUDY. METHODS ● SETTING AND PATIENTS: Starting in 1998, 23 eyes of 22 patients (10 females, 12 males) from the University Eye Clinic of Dresden were included in the study. The clinical ELSEVIER INC. ALL RIGHTS RESERVED. 0002-9394/03/$30.00 doi:10.1016/S0002-9394(02)02220-1 FIGURE 2. Treatment of the central 7 mm of the centrally abraded cornea with riboflavin drops and two UVA diodes. ples in the Declaration of Helsinki. Subjects read and signed an institutional ethics committee–approved consent form before participation in the study. FIGURE 1. (Top) Stiffening effect of porcine cornea after crosslinking with preserved curvature in the treated cornea (above) and massive bending of the untreated control cornea (below). (Bottom) Wrinkling of untreated porcine cornea (left) and form stability with impressive smoothness of the centrally crosslinked porcine cornea (right). diagnosis of keratoconus was based on corneal topography (Figure 3) and clinical signs of keratoconus such as stromal thinning, Fleischer ring, Vogt striae, or apical stromal scar. The preoperative progression of keratoconus was confirmed from medical history in all patients, and it was clearly documented by serial corneal topography12 in 12 eyes (52%; Figure 4). The average age of the recruited patients was 31.7 ⫾ 11.9 years and ranged from 13 to 58 years (Tables 1 and 2). Except for patient 1, who had congenital Leber amaurosis and acute bilateral keratoconus, the patients had a moderate to advanced degree of progressive keratoconus13 with maximum keratometer values between 48 and 72 diopters (Tables 1 and 2). For safety reasons, in all cases except patient 1, only one eye was treated; the fellow eye served as a control eye. Patients 11 and 22 wore hard contact lenses in the treated eyes before and after the treatment. The prospective, nonrandomized pilot study was conducted in accordance with the princiVOL. 135, NO. 5 TREATMENT OF ● OBSERVATION PROCEDURES: The preoperative screening and the postoperative examinations included measurement of best-corrected visual acuity, corneal topography using a videokeratoscope (C-scan; Technomed, Baseweile, Germany), intraocular pressure by Goldmann applanation tonometry, central endothelial cell density using an endothelial cell microscope (EM-1200; Tomey, Erlangen, Germany), corneal photography, and slit-lamp and fundus examination. Preoperative pachymetry (Pachette; Technomed, Baseweile, Germany) was performed only in the last eight patients with minimal pachymetry values ranging from 460 to 540 m. ● TREATMENT PROCEDURE: The treatment procedure was conducted under sterile conditions in the operating room. Proxymetacainhydrochloride 0.5% eyedrops were applied for preoperative local anesthesia. The central 7 mm of the corneal epithelium was cautiously removed using a blunt knife. As a photosensitizer, riboflavin 0.1% solution (10 mg riboflavin-5-phosphate in 10 ml dextranT-500 20% solution) was applied 5 minutes before the irradiation and every 5 minutes during the irradiation. After allowing riboflavin to permeate through the cornea for at least 5 minutes, the UVA irradiation was started using two UV diodes (370 nm; Roithner Lasertechnik, Vienna, Austria) with a potentiometer in series to regulate the voltage. Three 1.3-V accumulators were used as a power generator. Before each treatment, the desired irradiance of 3 mW/cm2 was controlled with a UVA meter (LaserMate-Q; LASER 2000, Wessling, Germany) at a 1-cm distance and, if necessary, regulated with the potentiometer. The patient’s cornea was irradiated with the UVA-light diodes (370 nm) at a 1-cm distance for 30 minutes using 3 mW/cm2 irradiance, which corresponds to KERATOCONUS BY CROSSLINKING 621 FIGURE 3. Corneal topography of a treated patient (Top) shortly before and (Bottom) 10 months after crosslinking with slight regression of the maximum K value by 1.06 diopters. 622 AMERICAN JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY MAY 2003 FIGURE 4. (Top) Column diagram demonstrating pretreatment progression of maximum K value in the half year before treatment and posttreatment regression as measured at the latest follow-up examination for each patient. y axis: difference in maximum K value in diopters; x axis: patient number; shaded bars ⴝ preoperative change of K value; solid bars ⴝ postoperative change of K value. (Bottom) Biphasic curve illustrating the mean change over time of the maximum K value relative to the K value on the day of treatment with mean preoperative progression by 1.4 diopters and postoperative regression by 2.0 diopters (x axis: time in months; y axis: change of maximum K value in D). VOL. 135, NO. 5 TREATMENT OF KERATOCONUS BY CROSSLINKING 623 TABLE 1. Investigation Parameters Visual Acuity Refractive Correction Maximum K Value Endothelial Cell Density Patient Age Postoperative Interval Preop Postop Preop Postop Preop Postop Preop Postop Corneal and Lens Transparency 1r 1l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 13 13 41 32 19 38 58 49 36 29 36 31 29 39 39 31 19 28 51 32 30 24 22 47 47 35 33 33 31 31 30 29 29 27 27 24 20 19 19 12 9 8 7 6 5 3 no LP no LP HM 20/50 20/40 20/25 HM 20/25 20/33 20/66 20/25 20/40 20/50 20/66 20/50 20/40 20/100 20/66 20/66 20/66 20/33 20/66 20/50 no LP no LP 20/400 20/22 20/33 20/20 HM 20/25 20/28 20/33 20/22 20/33 20/28 20/40 20/66 20/25 20/66 20/33 20/200 20/50 20/20 20/50 20/40 — — — ⫺3 ⫺1.75 ⫺0.75 ⫺3 3.5 ⫺8.25 ⫺13 ⫺4.5 ⫺6 ⫺7 ⫺3 ⫺2.75 ⫺6.75 ⫺10.25 ⫺0.75 0.375 ⫺3.5 ⫺1.0 ⫺3.0 ⫺1.25 — — — ⫺1.5 ⫺1.5 ⫺0.75 ⫺2.75 3.5 ⫺3.5 ⫺13.125 ⫺2.125 ⫺7 ⫺5.5 0 ⫺2.5 ⫺2.125 ⫺4.25 ⫺4 ⫺0.875 ⫺2.5 0.5 ⫺2.5 ⫺0.25 — — — 49.69 57.94 49.36 49.10 50.32 50.94 56.49 53.19 49.85 55.50 55.17 52.80 45.88 59.00 56.00 55.60 67.07 51.06 72.47 46.07 — — — 48.30 57.90 49.32 48.20 44.45 48.20 53.29 51.11 50.13 52.61 54.56 52.00 45.44 57.34 53.81 52.18 62.72 47.08 68.60 45.70 — — — 2,300 2,400 2,200 1,700 — 2,600 2,580 — 2,150 2,450 2,290 2,110 2,360 2,060 2,400 2,100 2,700 2,050 1,850 1,950 — — — 2,300 2,390 2,250 1,700 — 2,640 2,600 2,700 2,130 2,450 2,280 2,090 2,400 2,100 2,420 2,050 2,700 2,050 1,850 1,900 ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ ⫽ The preoperative values for visual acuity and maximum K value were determined on the day of treatment. The postoperative values are given for the last visits. ⫽ indicates unchanged transparency; HM ⫽ hand motion; LP ⫽ light perception; postop ⫽ postoperative; preop ⫽ preoperative. val, 1.23 to 3.07 diopters; P ⫽ .001, paired Student t test), comparing the preoperative values on the day of treatment vs the postoperative values of the last examination (Figure 3). In five patients the K value remained stable, and in one patient a minimal increase of the K value of 0.28 diopters was present. In the fellow control eyes, however, 5 of 23 eyes (22%) showed a continuous progression of the maximum K value by an average of 1.48 diopters in the first year after the crosslinking treatment of the contralateral eye. The postoperative healing process was unremarkable, except for slight transient stromal edema until reepithelialization after 3 days. There were no side effects, such as persistent epithelial defects or scarring. During the first postoperative night, some pain medication was administered. The corneal and lens transparency and the endothelial cell density (P ⫽ .45) remained unchanged (Tables 1 and 2). Contact lens wear for refractive correction in patients 19 and 22 could be continued without tear film stability problems. No statistically significant difference was found between the mean preoperative intraocular pressure of 13.6 ⫾ 2.0 mm Hg on the day of treatment and the mean postoper- a dose of 5.4 J/cm2 (Figure 2). After the treatment, an antibiotic ointment was applied until reepithelialization. RESULTS THE FOLLOW-UP TIME RANGED FROM 3 TO 47 MONTHS, with a mean follow-up time of 23.2 ⫾ 12.9 months (Tables 1 and 2). Best-corrected visual acuity improved statistically significantly in 15 patients (65%) by an average of 1.26 lines (95% confidence interval, ⫺0.68 to 2.21; P ⫽ .026, paired Student t test), comparing the preoperative values on the day of treatment vs the postoperative values of the last examination. The refractive correction improved significantly by an average of 1.14 diopters (95% confidence interval, 0.12 to 2.17; P ⫽ .03) in spherical equivalent (Table 2). The mean preoperative progression of the maximum K value was 1.42 ⫾ 1.18 diopters (Figure 4, bottom) in 12 eyes (52%). Postoperative regression of keratoconus, as measured by the maximum K values (Table 1), was found in 16 patients (70%; Figure 4, top and bottom) with an average reduction of 2.01 diopters (95% confidence inter624 AMERICAN JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY MAY 2003 TABLE 2. Summary of Patient Data and Results Mean ⫾ SD 23.2 ⫾ 12.9 1.42 ⫾ 1.18 2.01 ⫾ 1.74 1.14 ⫾ 2.18 Mean follow-up Preoperative progression in K value Postoperative regression K value Postoperative regression in refractive error (spherical equivalent) Postoperative increase in visual acuity Postoperative intraocular pressure Postoperative transparency of lens and cornea Postoperative density of endothelial cells Number of patients: 22 Number of eyes: 23 Gender: 12 males, 10 females Age: 31.7 ⫾ 11.9 years months D D D 1.26 ⫾ 1.5 lines Unchanged Unchanged Unchanged P Value .0001 .030 .026 .612 .45 The postoperative values were calculated as the difference between the value on the day of treatment and at the last follow-up visit. The preoperative progression K value was calculated as the difference in K value between the value half a year before treatment and the day of treatment. ative intraocular pressure of 13.8 ⫾ 2.5 mm Hg (P ⫽ .615) at the last visit. DISCUSSION THIS STUDY HAS SHOWN THAT COLLAGEN-CROSSLINKING appears to be effective in stopping the progression of keratoconus quasi “freezing” the cornea. This effect is corroborated by the following data of the study1: Postoperative regression was observed in 70% of patients with a decrease of the mean keratometer values by 2.01 diopters postoperatively despite documented preoperative progression by 1.42 diopters in 52%.2 The postoperative refractive corrections could also be reduced by an average of 1.14 ⫾ 2.18 diopters.3 In the untreated fellow control eyes, a postoperative progression of keratectasia by 1.48 diopters was found in 22%.4 In biomechanical measurements of earlier experiments, an increase in biomechanical stability of approximately 70% was measured.9 In contrast to other therapeutic measures for treating keratoconus, such as thermal keratoplasty, intracorneal rings, or epikeratoplasty (which basically are only transient refractive corrections),4 –7 the new minimal invasive method presented here seems to be the first approach to stop or even reduce the progression of keratoconus. An arrest of keratoconus by contact lenses has been described only in anecdotal reports but has never been confirmed in a systematic study.1 The success of crosslinking treatment in keratoconus is not surprising, because a significantly reduced tensile strength has been measured biomechanically14 in keratoconous and a significant increase in corneal rigidity has been measured in porcine and rabbit corneas treated by VOL. 135, NO. 5 TREATMENT OF riboflavin/UVA using quantitative biomechanical stressstrain measurements.9 –11 The impressive stiffening effect after riboflavin/UVA treatment (Figure 1) is similar to formaldehyde-induced tissue stiffening and fixation in pathologic specimens caused by collagen crosslinking. Pathohistologically, we were able to demonstrate a significant increase in collagen fiber diameter as the underlying histopathologic correlate.15 Increased corneal collagen fiber diameters and increased collagen rigidity have also been described in diabetes mellitus and aging, where collagen crosslinking is also increased.16 –18 In these conditions, keratoconus rarely occurs.19 Increased resistance to pepsin digestion after crosslinking has been found,20 which might be important for keratoconus because a significantly elevated activity of collagenases has been found.21,22 The arrest of the progression of keratoconus in our patients could have been spontaneous as a so-called forme fruste of keratoconus.23 In epidemiologic studies, however, 21% of patients with keratoconus progress to a state where keratoplasty is required.2,3 In all our cases a progression of keratoconus was known before the beginning of the treatment at least by clinical history and clearly documented by corneal topography in 12 eyes (52%; Figure 4, top). Moreover, postoperative regression was observed in 16 eyes (70%) after treatment, and this has never been reported in the natural course of the disease. In the two cases with hard contact lens wear (patients 11 and 22), the keratometry readings might have been influenced by an orthokeratoplastic effect,24 but these two cases did not show regression. The contact lenses were still tolerated after crosslinking, and their use did not have to be stopped. KERATOCONUS BY CROSSLINKING 625 In the present study, we treated moderate to advanced keratoconus stages.13 If the good results of the new method are corroborated over time, it would be preferable to treat earlier stages of the disease so that a better visual acuity might be preserved. Earlier stages were not included in this study, because the possible risks involved were not yet known. We did not find an increase of the mean intraocular pressure values postoperatively. Applanation tonometry is not sensitive enough to reflect the increase in corneal rigidity. A slight increase in intraocular pressure measurement might also be masked by the normal slight variability in intraocular pressure. We have not observed any complications or adverse events of the new method, especially no decrease in endothelial cell density or cataract formation. We have previously measured the amount of irradiation intensity transmitted by the porcine cornea using a UVA photometer. With 3 mW/cm2 of UVA irradiance at the surface of the cornea and a riboflavin concentration of 0.1%, there is a massive reduction of the UVA light by 95%, resulting in an irradiance of 0.15 mW/cm2 (⫽ an irradiation dose, 0.27 J/cm2) at the endothelial level in a 500-m-thick cornea.9 Without riboflavin, the UVA light would be reduced in the cornea only by approximately 30%, with approximately 50% UVA absorption in the lens.25 In experiments with rabbit eyes, the cytotoxic threshold irradiance for the endothelial cells after combined riboflavin/UVA treatment is 0.36 mW/cm2 (⫽0.65 J/cm2), which may be reached with a corneal thickness of under 400 m using 3 mW/cm2 irradiance (⫽5.4 J/cm2) at the epithelial level.26 Preoperative pachymetry is essential and was included in the last eight patients of the study. The central corneal thickness in keratoconus usually is not reduced to less than 400 m.27 If so, however, the crosslinking treatment should be avoided. The UVA dose of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2) is far below a cataractogenous level of 70 J/cm2.28 In addition, lens damage is usually induced by UVB light in the wavelength range of 290 to 320 nm, which has a higher energy because of a shorter wavelength than UVA.28,29 The durability of the stiffening effect is unknown. Because the collagen turnover in the cornea is estimated to be between 2 to 3 years,30,31 a repeat treatment may become necessary in the long run. Collagen crosslinking could also be useful for the treatment of iatrogenic keratectasia resulting from laser in situ keratomileusis32,33 either as prophylaxis or as postoperative treatment. The new treatment can also be used for treating corneal melting lesions or superficial ulcers.34 The residual corneal thickness should be at least 400 m to spare the endothelium. We believe that collagen crosslinking might become a standard treatment for progressive keratoconus. Long-term studies must exclude serious late complications and confirm the durability of the stiffening effect. The new method 626 AMERICAN JOURNAL might reduce the need for donor material resulting from keratoconus, which represents approximately 16% of all keratoplasty indications.35 Given the very low costs and the simplicity of the new method, it could be applied in developing countries where access to keratoplasty or contact lenses is a problem. ACKNOWLEDGMENT The authors thank Prof. Josef Wollensak (Berlin) for continuous support and stimulation in the development of the new method. REFERENCES 1. Rabinowitz YS. Keratoconus. Surv Ophthalmol 1998;42: 297–319. 2. Tuft SJ, Moodaley LC, Gregory WM, Davison CR, Buckley RJ. Prognostic factors for the progression of keratoconus. Ophthalmology 1994;101:439 –447. 3. Kennedy RH, Bourne WM, Dyer JA. A 48-year clinical and epidemiologic study of keratoconus. Am J Ophthalmol 1986; 101:267–273. 4. Sekundo W, Stevens JD. Surgical treatment of keratoconus at the turn of the 20th century. J Refract Surg 2001;17:69 – 73. 5. Colin J, Cochener B, Savary G, Malet F. Correcting keratoconus with intracorneal rings. J Cataract Refract Surg 2000; 26:1117–1122. 6. Dana MR, Putz JL, Viana MAG, Sugar J, McMahon TT. Contact lens failure in keratoconus management. Ophthalmology 1992;99:1187–1192. 7. Jaeger MJ, Berson P, Kaufman HE, Green WR. Epikeratoplasty for keratoconus. A clinicopathologic case report. Cornea 1987;6:131–139. 8. Hettlich HJ, Lucke K, Kreiner CF. Light induced endocapsular polymerization of injectable lens refilling materials. Ger J Ophthalmol 1992;1:346 –349. 9. Spoerl E, Schreiber J, Hellmund K, Seiler T, Knuschke P. Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am Kaninchen. Ophthalmologe 2000;97:203–206. 10. Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res 1998;66:97–103. 11. Spoerl E, Huhle M, Seiler T. Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut durch Vernetzung. Ophthalmologe 1997;94:902– 906. 12. Maguire LJ, Lowry JC. Identifying progression of subclinical keratoconus by serial topography analysis. Am J Ophthalmol 1991;112:41–45. 13. Zadnik K, Barr JT, Gordon MO, Edrington TB. Biomicroscopic signs and disease severity in keratoconus. Cornea 1996;15:139 –146. 14. Andreassen TT, Simonsen AH, Oxlund H. Biomechanical properties of keratoconus and normal corneas. Exp Eye Res 1980;31:435–441. 15. Wollensak G, Seiler T, Wilsch M, Spörl E. Collagen fiber diameter after riboflavin/UVA induced collagen-crosslinking in the rabbit cornea. Cornea. Forthcoming. 16. Malik NS, Moss SJ, Ahmed N, Furth AJ, Wall RS, Meek KM. Ageing of the human corneal stroma: structural and biochemical changes. Biochim Biophys Acta 1992;1138: 222–228. 17. Sady C, Khosrot S, Nagaraj R. Advanced Maillard reaction OF OPHTHALMOLOGY MAY 2003 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem Biophys Res Com 1995;214:793–797. Bailey AJ, Paul RG, Knott L. Mechanisms of maturation and ageing of collagen. Mech Ageing Dev 1998;106:1–56. Seiler T, Huhle S, Spoerl E, Kunath H. Manifest diabetes and keratoconus: a retrospective case-control study. Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol 2000;238:822–825. Spoerl E, Seiler T, Wollensak G. Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Br J Ophthalmol, forthcoming. Abalain J. Levels of collagen degradation products (telopeptides) in the tear film of patients with keratoconus. Cornea 2000;19:474 –476. Zhou L, Sawaguchi S, Twining SS, Sugar J, Feder RS, Yue BY. Expression of degradative enzymes and protease inhibitors in corneas with keratoconus. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39:1117–1124. Amsler M. Le kératocône fruste au Javal. Ophthalmologica 1938;96:77–83. Swarbrick HA, Wong G, O’Leary DJ. Corneal response to orthokeratology. Optom Vis Sci 1998;75:791–799. Michael R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Res 2000;32(S1):1–44. Wollensak G, Spoerl E, Seiler T, Wilsch M. Endothelial cell damage after riboflavin-UVA treatment in the rabbit. J Cataract Refract Surg, forthcoming. Watters G, Owens H. Evaluation of mild, moderate, and VOL. 135, NO. 5 TREATMENT OF 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. KERATOCONUS advanced keratoconus using ultrasound pachymetry and the EyeSys videokeratoscope. Optom Vis Sci 1998;75:640 –646. Pitts DG, Cullen AP, Hacker PD. Ocular effects of ultraviolet radiation from 295–365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977;16:932–939. Jose JG, Pitts DG. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Exp Eye Res 1985; 41:545–563. Smelser GK, Polack FM, Ozanics V. Persistence of donor collagen in corneal transplants. Exp Eye Res 1965;4:349 – 354. Nishida T. Basic Science: Cornea. In: Krachmer JH, Mannis MJ, Holland EJ, editors. Cornea, vol. 1. St. Louis: Mosby, 1997:13. Seiler T, Koufala K, Richter G. Iatrogenic keratectasia after laser in situ keratomileusis. J Refract Surg 1998;14:312–317. Argento C, Cosentino MJ, Tytiun A, Rapetti G, Zarate J. Corneal ectasia after laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg 2001;27:1440 –1448. Schnitzler E, Spörl E, Seiler Th. Bestrahlung der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen, erste Ergebnisse mit Patienten. Klin Mbl Augenheilk 2000;217:190 – 193. Maeno A, Naor J, Hunter WS, Rootman DS. Three decades of corneal transplantation: indications and patient characteristics. Cornea 2000;19:7–11. BY CROSSLINKING 627