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Jahrbuch 2004/2005 | Berndt, Alex; Breitkreuz, Helena; Hennig, Sven; Köster, Stefan; Schulze, Sabrina; Theiss,
Christiane; W olf, Eva; Yildiz, Özkan; W ittinghofer, Alfred | Struktur und molekulare Mechanismen von
Uhrenproteinen
Struktur und molekulare Mechanismen von Uhrenproteinen
Structure and Molecular Mechanisms of Clock Proteins
Berndt, Alex; Breitkreuz, Helena; Hennig, Sven; Köster, Stefan; Schulze, Sabrina; Theiss, Christiane; Wolf, Eva;
Yildiz, Özkan; W ittinghofer, Alfred
Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund
Korrespondierender Autor
E-Mail: eva.w [email protected]
Zusammenfassung
Die meisten Lebew esen besitzen tagesperiodische Aktivitätszyklen, so genannte zirkadiane Rhythmen, die
durch innere Uhren erzeugt und mit dem 24h-Tag-Nacht-Zyklus der Umw elt synchronisiert w erden. Durch die
strukturelle
und proteinbiochemische
Charakterisierung des Uhrenproteins PERIOD aus der Taufliege
Drosophila konnten W issenschaftler am Max-Planck-Institut in Dortmund w ichtige Einblicke in den Mechanismus
der inneren Uhr der Tiere gew innen. Die Röntgenkristallstruktur zeigt neue W ege für biologische, biochemische
und biophysikalische Experimente auf, die zu einem besseren Verständnis der molekularen Prozesse der
inneren Uhr des Menschen beitragen sollen.
Summary
Most organisms exhibit day-time dependent activity cycles, referred to as circadian rhythms, w hich are
generated and synchronized w ith the environmental light-dark cycle by internal biological clocks. By structurally
and biochemically characterizing the clock protein PERIOD of the fruit fly Drosophila, scientists at the Max
Planck Institute in Dortmund w ere able to obtain important insights into animal clock mechanisms. Biological,
biochemical and biophysical experiments proposed by this X-ray crystal structure w ill assist in delineating the
molecular mechanisms underlying the human circadian clockw ork.
Zirkadiane Rhythmen und zirkadiane Uhren
Alle Lebew esen unterliegen biologischen Rhythmen, d. h. biologischen Phänomenen, die sich in regelmäßigen
Zeitabständen w ie zum Beispiel einem Tag, Monat oder Jahr w iederholen. Tagesperiodische (24h-) Rhythmen,
die sich durch Adaptation an den Tag-Nacht-Zyklus auf der Erde entw ickelt haben, w erden als zirkadiane
Rhythmen bezeichnet (circa diem, lat.: ungefähr ein Tag). Viele biochemische und physiologische Prozesse w ie
auch zahlreiche Verhaltensw eisen eines Organismus sind zirkadianen Rhythmen unterw orfen. Beim Menschen
w erden unter anderen der Schlaf- und Wachzustand, die Körpertemperatur, der Blutdruck sow ie Hormon- und
Immunsystem zirkadian reguliert. Als Folge dieser Tagesschw ankungen treten beispielsw eise Asthmaanfälle,
Arthritis-Symptome, Herzinfarkte, Schlaganfälle
oder allergische Reaktionen zu bestimmten Tageszeiten
gehäuft auf. Entsprechend entfalten viele Medikamente nur bei Einnahme zur „richtigen“ Tageszeit ihre
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Uhrenproteinen
optimale W irkung.
Zirkadiane Rhythmen w erden durch innere biologische Uhren (zirkadiane Zeitmesssysteme) erzeugt. Dabei
handelt es sich um tagesperiodisch schw ingende zirkadiane Oszillatoren, die durch externe „Zeitgeber“Signale w ie Licht oder Temperatur mit dem Tag-Nacht-Zyklus der Umgebung synchronisiert w erden und
rhythmische Ausgangssignale erzeugen (Abb. 1). Bei Säugetieren ist der w ichtigste Zeitgeber das Tageslicht,
w elches
durch
spezielle
zirkadiane
Photorezeptoren
w ahrgenommen
w ird.
Die
tagesrhythmischen
Ausgangssignale erzeugen das mit der Außenw elt synchronisierte zirkadiane Aktivitätsmuster.
Sche m a tische Da rste llung e ine s zirk a dia ne n
Ze itm e sssyste m s. Einga ngssigna le de r Um we lt (Input) wie
Licht und Te m pe ra tur wirk e n a ls so ge na nnte Ze itge be r, die
de n zirk a dia ne n O szilla tor de r inne re n Uhr m it de m Ta gNa cht-Zyk lus de r Um ge bung synchronisie re n. De r O szilla tor
e rze ugt rhythm ische Ausga ngssigna le (Output) und da m it da s
ta ge spe riodische Ak tivitä tsm uste r.
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Proteine in der zirkadianen Zeitmessung
Bei allen bislang untersuchten Organismen der Tier- und Pflanzenw elt und den Cyanobakterien (Blaualgen)
w erden
die
zirkadianen
Oszillatoren
durch
Rückkopplungsschleifen
der Transkription
und
Translation
angetrieben, deren Schw ingungsfrequenz auch ohne äußeren Zeitgeber etw a 24 Stunden beträgt [1]. Dabei
ist die endogene Periodik genetisch determiniert und beträgt beim Menschen etw a 24,5 bis 25 h, bei der Maus
hingegen durchschnittlich nur 23,7 h. Entscheidend für die Erzeugung und Aufrechterhaltung der endogenen
24h-Periode ist ein präzises Zusammenspiel der tagesperiodischen Synthese, der Modifikation und des Abbaus
von zentralen Uhrenproteinen im Rahmen ihrer spezifischen Protein-Protein- und Protein-NukleinsäureW echselw irkungen.
Hauptziel
der
Dortmunder
Forscher
im Bereich
der
zirkadianen
Rhythmik
ist
die
Bestimmung
der
Röntgenkristallstrukturen von zentralen Uhrenproteinen und zirkadianen Photorezeptoren sow ie von deren
höhermolekularen
Komplexen.
Durch
die
Kombination
struktureller
und
biochemisch/biophysikalischer
Untersuchungen erhalten die W issenschaftler Einblick in die molekularen Mechanismen, die der Erzeugung
zirkadianer Rhythmen sow ie deren Synchronisation mit dem Hell-Dunkel-Zyklus der Umgebung zugrunde
liegen. Letztendlich soll dadurch eine strukturelle Basis für die Entw icklung von Medikamenten gegen
Schlafstörungen, Jetlag, Folgen von Schichtarbeit, durch unregelmäßigen Schlaf hervorgerufene Depressionen
sow ie krankhafte Funktionsstörungen der inneren Uhr geschaffen w erden. Ferner ist ein detailliertes
mechanistisches
Verständnis
der
inneren
Uhr
für
die
Chronopharmakologie
(Biorhythmik
der
Arzneimittelw irkungen) und Chronotherapie (Anw endung von Medikamenten zu optimalen Tageszeiten) von
großer Bedeutung.
Der zirkadiane Oszillator von Drosophila und Maus
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Uhrenproteinen
Bei Tieren w urde der molekulare Aufbau der zirkadianen Uhr bislang überw iegend in dem Modellorganismus
Drosophila melanogaster (Taufliege) und bei der Maus als Vertreter der Säugetiere untersucht ( Abb. 2). Bei
Drosophila w urden als negative Elemente der Rückkopplungsschleife des zirkadianen Oszillators die Proteine
PERIOD und TIMELESS, bei Säugetieren die Proteine PERIOD 1 und 2 sow ie CRYPTOCHROM 1 und 2
identifiziert. Als positive Elemente w irken bei Drosophila die Transkriptionsfaktoren dCLOCK und CYCLE, bei
den Säugetieren die homologen Proteine mCLOCK und BMAL1. Die Stabilität, zelluläre Lokalisation und
Aktivität der negativen Elemente w ird bei Drosophila und bei Säugetieren durch für die einzelnen
Uhrenproteine spezifische Kinasen reguliert. Allerdings ist ein deutlicher Unterschied in der Funktion der
Cryptochrome von Drosophila und den Säugetieren zu beobachten: W ährend die Säugetier-Cryptochrome eine
zelluläre lichtunabhängige Rolle als negative Elemente der Rückkopplungsschleife spielen, ist das DrosophilaCryptochrom ein zirkadianer Blaulicht-Photorezeptor, der die Synchronisation der inneren Uhr mit dem HellDunkel-Zyklus der Umgebung vermittelt. Die Funktion der Cryptochrome im zentralen Oszillator w ird daher bei
Drosophila von TIMELESS übernommen, w elches im Säugetier keine Rolle zu spielen scheint. Die Veränderung
der Funktion der Cryptochrome im Laufe der Evolution ist dadurch zu erklären, dass die das zirkadiane
Verhalten steuernde „Zentraluhr“ der Säugetiere in dem so genannten Suprachiasmatischen Nukleus im
Hypothalamusbereich des Gehirns angesiedelt und damit dem Licht nicht direkt zugänglich ist. Insgesamt
w eist die zirkadiane Uhr von Drosophila jedoch viele Gemeinsamkeiten mit der Säugetier-Uhr auf. Durch die
molekularbiologische, biochemische und biophysikalische Charakterisierung von Uhrenkomponenten der
Drosophila-Fliege können somit w ertvolle Hinw eise auf die Funktion der homologen Proteine in der inneren Uhr
des Menschen gew onnen w erden.
Die zirk a dia ne n O szilla tore n de r Ta uflie ge Drosophila
melanogaster und de r Ma us a ls Ve rtre te r de r Sä uge tie re
(ve re infa chte s Sche m a ). Die zirk a dia ne n O szilla tore n we rde n
durch R ück k opplungsschle ife n de r Tra nsk ription und
Tra nsla tion a nge trie be n. Ge pa a rte Tra nsk riptionsfa k tore n
(dC LO C K/C YC LE be i Drosophila ; m C LO C K/BMAL1 be i de n
Sä uge tie re n) tre ibe n die Ex pre ssion de r ze ntra le n Uhre nge ne
(period und timeless be i Drosophila ; period1,2 und
cryptochrom1,2 be i de n Sä uge tie re n) a n. Die Uhre nprote ine
re prim ie re n ihre e ige ne Tra nsk ription durch ne ga tive
R ück k opplung. De r 24h-R hythm us wird zusä tzlich durch
P hosphorylie rung (P ) de r Uhre nprote ine re gulie rt.
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Die Struktur der PAS-Region von Drosophila-PERIOD
Kürzlich haben W issenschaftler der Abteilung Strukturelle Biologie des Dortmunder Max-Planck-Instituts die
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Uhrenproteinen
dreidimensionale Struktur eines Fragments des Drosophila-PERIOD-Proteins ermittelt, w elches zw ei so
genannte PAS-Domänen (PAS-A und PAS-B) enthält (Abb. 3), [2]. PAS-Domänen sind in der Natur sehr häufig
vorkommende Signaltransduktionsdomänen, die entw eder sensorische Funktionen erfüllen oder, w ie im Falle
der PERIOD-Proteine, Protein-Protein-Wechselw irkungen vermitteln. Die röntgenkristallografisch ermittelte
Struktur ist die erste Darstellung eines eukaryontischen Uhrenproteins und zeigt erstmalig, w ie eine Struktur
aus zw ei hintereinander liegenden PAS-Domänen aufgebaut ist. Derartige W iederholungen kommen auch in
den Transkriptionsfaktoren der inneren Uhr und einigen biomedizinisch bedeutenden Transkriptionsfaktoren
w ie dem Dioxinrezeptor und dem Hypoxie-Induzierbaren Faktor α vor. In der PERIOD-Struktur bildet sich
zudem ein kompaktes, über die PAS-Domänen vermitteltes Dimer aus. Neben intermolekularen Kontakten
zw ischen den PAS-Domänen w ird das Dimer durch die Wechselw irkung der PAS-A-Domäne von Molekül 1 mit
einer carboxyterminal der PAS-B-Domäne gelegenen α-Helix in Molekül 2 stabilisiert. Die funktionelle
Bedeutung dieses „Kristall“-Dimers konnten die W issenschaftler durch biochemische Charakterisierung von
PERIOD-Mutanten mit veränderten Dimerkontaktflächen nachw eisen.
Dre idim e nsiona le Struk tur de r P AS-W ie de rholungs-R e gion von
Drosophila -P ER IO D. Die R öntge nstruk tur we ist e in Dim e r a uf,
da s a us zwe i m ite ina nde r we chse lwirk e nde n P ER IO DMole k üle n ge bilde t wird. In Mole k ül 1 de s Dim e rs sind βFa ltbla ttsträ nge in rot und α-He lice s in gra u da rge ste llt, in
Mole k ül 2 in ge lb (β-Fa ltbla tt) und bla u (α-He lice s). P AS-A
und P AS-B be ze ichne n die a m ino- und ca rbox yte rm ina le P ASDom ä ne de r P AS-W ie de rholungs-R e gion von P ER IO D. P AS
ste ht für P ER IO D AR NT SIM, a lso für dre i P rote ine , die P ASDom ä ne n e ntha lte n.
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Beeinflussung der Tagesperiodik durch Mutation im PERIOD-Protein
Die PERIOD-Struktur hat auch Einblicke in den Mechanismus einer Mutation geliefert, die bei lebenden
Taufliegen zu einem verlängerten Tagesrhythmus von 29 anstelle von 24 Stunden führt. In diesen Mutanten
ist nur ein einziger Aminosäurerest an der Oberfläche der PAS-A-Domäne verändert (Austausch von Valin
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Uhrenproteinen
gegen
Asparaginsäure
an
der
Position
243).
Anhand
der
PERIOD-Struktur
und
komplementärer
Dimerisierungsstudien konnten die Dortmunder W issenschaftler nun zeigen, dass der gravierende Einfluss
dieser Mutation auf die zirkadiane Rhythmik (Tageslänge) der Taufliege durch eine Destabilisierung der
intermolekularen Wechselw irkungen zw ischen der PAS-A-Domäne und der Helix αF von PERIOD hervorgerufen
w ird (Abb. 4). Dadurch könnten neben der Verhinderung der Selbstassoziation von PERIOD- Molekülen zu
Homodimeren auch viele andere Prozesse in der inneren Uhr beeinflusst w erden. Beispiele dafür sind die
Wechselw irkung
von
PERIOD
mit
Transkriptionsfaktorkomplexen,
die
Regulation
von
PERIOD
durch
Phosphorylierung oder auch die tagesperiodische W anderung von PERIOD zw ischen Zellkern und Zytoplasma.
P AS-A-αF-Dim e rk onta k tflä che m it de r Muta tionsste lle
Va lin243. Die be ide n Kopie n ste lle n e in Ste re opa a r da r, da s
da s rä um liche Be tra chte n de r Dom ä ne e rm öglicht. Ge ze igt ist
die P AS-A-Dom ä ne von Mole k ül 1 (rot) m it de r αF-He lix von
Mole k ül 2 (bla u). Am inosä ure n in de r P AS-A-αF-Konta k tflä che
sind m it Se ite nk e tte n und ihre n Ele k trone ndichte n da rge ste llt.
Die Am inosä ure Va lin243 im Ze ntrum de r P AS-A-αFKonta k tflä che , de re n Austa usch zu Aspa ra ginsä ure be i
Ta uflie ge n zu de utlich ve rlä nge rte n 29h-Ta ge n führt, ist durch
e ine n schwa rze n P fe il m a rk ie rt.
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Die PERIOD-Struktur liefert Einblicke in den zirkadianen Oszillator der Säugetiere
Sequenzvergleiche deuten darauf hin, dass die in der PERIOD-Struktur beobachteten Dimerkontaktflächen der
PAS-Domänen strukturell in den PERIOD-PERIOD-Komplexen des Säugetier-Oszillators konserviert sind. Im
Mausoszillator w urde die Rolle der PAS-Domänen bei der Dimerisierung von PERIOD-Proteinen bereits
mehrfach nachgew iesen. Außerdem konnte gezeigt w erden, dass eine Deletion w eiter Teile der PAS-B-Domäne
von PERIOD 2 bei Mäusen zu einer verkürzten Periode von etw a 22 h und einem Verlust der endogenen
zirkadianen Periodik in Dunkelheit führt. Durch biochemische Analyse gereinigter PAS-W iederholungsFragmente von PERIOD 2 und gezielte Mutagenese zeigten die Dortmunder W issenschaftler nun, dass auch
die PAS-W iederholungs-Region von PERIOD 2 in Lösung Dimere bildet, die w ahrscheinlich durch die in der
Drosophila PERIOD-Struktur beobachteten Dimerkontaktflächen der PAS-Domänen vermittelt w erden. Somit
könnte die in der Struktur beobachtete Dimerkontaktfläche auch eine w ichtige Rolle bei der Regulation der
inneren Uhr des Menschen spielen.
Interessanterw eise w urde die biomedizinische Bedeutung des Maus PERIOD2-Moleküls als w esentlicher
Bestandteil der inneren Uhr bereits mehrfach dokumentiert. Beispielsw eise hat eine Punktmutation in dem
analogen humanen Gen, die zur Entfernung einer Phosphorylierungsstelle führt, die Ausprägung des
Familiären Advanced Sleep Phase Syndroms (FASPS) zur Folge. FASPS-Patienten erw achen und ermüden sehr
frühzeitig, da ihre innere Uhr gegenüber dem äußeren Tagesablauf um etw a vier Stunden vorgeht. Des
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Uhrenproteinen
Weiteren unterliegen Mäuse, die in beiden Kopien des Gens für PERIOD 2 die oben genannte PAS-BDeletionsmutation tragen, einem erhöhten Krebsrisiko sow ie einer erhöhten Suchtgefahr für Alkohol und
Kokain.
Mit der Bestimmung der Röntgenstruktur der PAS-W iederholungs-Region von Drosophila-PERIOD und der
darauf basierenden Analyse von Protein-Protein-Wechselw irkungen der Drosophila- und Maus-PERIODProteine gelang es den Dortmundern W issenschaftlern um Alfred W ittinghofer, auf atomarer Ebene Einblicke in
Bereiche der inneren Uhr zu erhalten, die Einfluss auf verschiedenste Krankheitsbilder haben. Durch die
strukturelle und biochemisch/biophysikalische Charakterisierung w eiterer Uhrenproteine sollen in Zukunft noch
w eitreichendere mechanistische Einblicke in das Räderw erk der biologischen Uhr gew onnen w erden.
Originalveröffentlichungen
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Editor)Personenerw eiterungPublikationserw eiterungTeaser
mit
BildTextblockerw eiterungVeranstaltungstickererw eiterungVideoerw eiterungVideolistenerw eiterungYouTubeErw eiterung
[1] Y oung, M. W. and S. A. Kay
Time zones: a comparative genetics of circadian clocks
Nature Review s Genetics 2(9), 702-715 (2001)
[2] Y ildiz, Ö., M. Doi, I. Y ujnovsky, L. Cardone, A. Berndt, S. Hennig, S. Schulze, C. Urbanke, P. SassoneCorsi and E. Wolf
Crystal Structure and Interactions of the PAS Repeat Region of the Drosophila Clock Protein PERIOD
Molecular Cell 17(1), 69-82 (2005)
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