Dokument_1. - OPUS Würzburg

Transcrição

Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenflüsse und
ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea
mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
angefertigt am
Institiut für Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik
an der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Patrick Mumm
geboren in Hongkong
Würzburg 2010
EINGEREICHT AM:
M ITGLIEDER DER P ROMOTIONSKOMMISSION:
VORSITZENDER:
GUTACHTER : PROF. DR. IRENE MARTEN
GUTACHTER: PROF. DR. PETRA DIETRICH
TAG DES P ROMOTIONSKOLLOQUIUMS:
DOKTORURKUNDE AUSGEHÄNDIGT AM:
Inhalt
1
Einleitung ............................................................................................................. 1
1.1
Stomata .................................................................................................................. 2
1.2
Turgoränderung bei der Stomabewegung ............................................................. 4
1.3
Ionentransport über biologische Membranen ........................................................ 5
1.3.1 Kaliumtransport während der Stomabewegung .................................................... 7
1.3.2 Anionentransport während der Stomabewegung................................................. 10
1.4
Regulation der Ionenflüsse beim ABA-induzierten Stomaschluss ..................... 14
1.5
Ionenflüsse bei der Stomabewegung bei Zea mays ............................................. 17
1.6
Zielsetzung der Arbeit ......................................................................................... 20
2
Material und Methoden .................................................................................... 22
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
Pflanzenanzucht ................................................................................................... 22
Zea mays .............................................................................................................. 22
Hordeum vulgare ................................................................................................. 23
Arabidopsis thaliana ........................................................................................... 23
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
Protoplastengewinnung ....................................................................................... 23
Mais-Nebenzellprotoplasten ................................................................................ 24
Mais-Schließzellprotoplasten .............................................................................. 25
Arabidopsis-Schließzellprotoplasten ................................................................... 25
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.3.8
Patch-Clamp-Technik .......................................................................................... 26
Messprinzip der Patch-Clamp-Technik ............................................................... 27
Aufbau des Patch-Clamp-Messplatzes ................................................................ 29
Patch-Clamp-Verstärker ...................................................................................... 30
Mess- und Referenzelektroden ............................................................................ 31
Vorzeichenkonvention ......................................................................................... 32
Umkehr- und Nernstpotential .............................................................................. 33
Korrektur von Diffusionspotentialdifferenzen .................................................... 34
Spannungspulsprotokolle und Datenanalyse ....................................................... 34
2.4
Lösungen für Patch-Clamp-Messungen .............................................................. 35
2.4.1 Badlösungen ........................................................................................................ 36
2.4.2 Pipettenlösungen.................................................................................................. 37
2.5
2.5.1
2.5.2
2.5.3
Einstichelektroden-Technik ................................................................................. 38
Messprinzip der Einstichelektroden-Technik ...................................................... 39
Aufbau des Einstichelektroden-Messplatz .......................................................... 40
Einstich- und Referenzelektroden ....................................................................... 41
2.6
Fluoreszenzspektroskopie.................................................................................... 42
2.7
3D Modelle .......................................................................................................... 44
3
Ergebnisse .......................................................................................................... 46
3.1
Fluoreszenz- und elektrophysiologische Messungen an Zellen im intakten
Gewebe ................................................................................................................ 47
Bestimmung der Zellvolumina intakter Zea mays Neben- und Schließzellen .... 47
Stromableitungen von intakten Zea mays Neben- und Schließzellen ................. 49
Änderungen des freilaufenden Membranpotentials während der
Stomabewegung bei Zea mays ............................................................................ 51
Stromableitungen und Änderungen des freilaufenden Membranpotentials
intakter Schließ- und Nebenzellen von Hordeum vulgare .................................. 53
Änderungen des zytosolischen pH-Werts während der Stomabewegung in
Mais Nebenzellen ................................................................................................ 56
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
4
Patch-Clamp-Untersuchungen zu den Anionenströmen von Neben- und
Schließzellprotoplasten von Zea mays ................................................................ 58
Identifikation von S-Typ-Anionenkanäle in Nebenzellen von Zea mays............ 58
Einfluss von Ca2+-Ionen, ABA und des pH-Wertes auf die Anionenströme in
Nebenzellen ......................................................................................................... 60
Identifikation von S-Typ-Anionenkanälen in Schließzellenzellen von Zea
mays ..................................................................................................................... 64
Einfluss von Ca2+-Ionen und des pH-Wertes auf die Anionenströme in
Maisschließzellen ................................................................................................ 65
Patch-Clamp-Untersuchungen zu den S-Typ und R-Typ-Anionenströmen in
Arabidopsis thaliana Schließzellprotoplasten ..................................................... 68
Diskussion ........................................................................................................... 85
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Ionenflüsse während der Stomabewegung in Zea mays ...................................... 85
Zellvolumina von Schließ- und Nebenzellen von Zea mays ............................... 85
Stromableitungen von intakten Zellen des Spaltöffnungsapparates.................... 87
Differentielle Änderung des Membranpotentials in Schließ- und
Nebenzellen während der Stomabewegung......................................................... 88
4.1.4 Identifikation und Regulation der S-Typ-Anionenkanäle in Neben- und
Schließzellen von Zea mays ................................................................................ 90
4.1.5 Änderung des zytosolischen pH-Wertes in Nebenzellen während der
Stomabewegung .................................................................................................. 92
4.1.6 Modell zur Beschreibung der Shuttle-Ionentransport-Hypothese ....................... 93
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
Die molekulare Grundlage der S-Typ-Anionenströme und deren Regulation
in Arabidopsis thaliana ....................................................................................... 97
Die Aktivierung von SLAC1 durch OST1 und CPK23 ...................................... 98
Der Nitrat-permeable Anionenkanal SLAH3 .................................................... 100
Modell zur Regulation derS-Typ-Anionenstromantwort während des
Stomaschlusses in Arabidopsis thaliana ........................................................... 102
Die Malat-aktivierte Komponente ALMT12 des R-Typ-Anionenkanals in
Arabidopsis thaliana ......................................................................................... 103
5
Zusammenfassung ........................................................................................... 106
6
Summary .......................................................................................................... 108
7
Anhang.............................................................................................................. 110
7.1
Literaturliste ...................................................................................................... 110
7.2
Abbildungsverzeichnis ...................................................................................... 126
7.3
Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 128
7.4
Publikationen ..................................................................................................... 131
7.5
Lebenslauf ......................................................................................................... 133
7.6
Danksagung ....................................................................................................... 135
8
Erklärung ......................................................................................................... 137
EINLEITUNG
1
Einleitung
Pflanzen sind phototrophe Organismen die während der Photosynthese unter Ausnutzung
der
Lichtenergie
aus
anorganischen
Verbindungen
den
Energieträger
Adenosintriphophat und das Reduktionsäquivalent NADPH synthetisieren. Diese werden dann genutzt, um Kohlendioxid (CO2) zu reduzieren und anschließend Zucker zu
produzieren, die der Pflanze als Kohlenstoffquelle dienen. Aufgrund des stetigen Verbrauchs von CO2 und dessen relativ geringer Konzentration von 0,04% in der Atmosphäre ist es oft der limitierende Faktor der Photosynthese.
Neben Kohlendioxid ist Wasser das wichtigste Substrat der Photosynthese, da es als
Elektronendonor für die Reduktion des Kohlendioxids benötigt wird. Desweiteren dient
Wasser als intra- und extrazelluläres Lösungsmittel. Wasser wird in der Regel durch die
Wurzeln aus dem Boden aufgenommen und über Verdunstung über die Blätter wieder
abgegeben. Um die Verdunstung zu minimieren sind die oberirdischen Teile der Pflanzen meist mit einer wasser- und gasundurchlässigen, wachsartigen Schicht, der Kutikula, überzogen. Um einen geregelten Gasaustausch und Transpiration zu ermöglichen,
haben Pflanzen Spaltöffnungen entwickelt. Diese stellen eine Pore in der Epidermis dar,
durch die das benötigte CO2 aufgenommen werden kann. Zugleich kann jedoch auch
Wasser die Pflanze durch die Pore verlassen. Da ein übermässiger Wasserverlust aber
unweigerlich zum Welken und damit zum Tod der Pflanze führen würde, muss die Öffnungsweite der Pore reguliert werden. Diese Regulation stellt immer einen Kompromiss
aus größtmöglicher Kohlendioxidaufnahme (um die Photosynthese zu maximieren) und
minimaler Wasserabgabe (um ein Austrocknen zu vermeiden) dar. Gebildet werden die
Poren (Stomata) durch zwei parallel orientierte, spezialisierte Zellen, den Schließzellen.
Bei Gräsern und einigen wenigen Monokotyledonen sind noch spezialisierte Nebenzellen an der Bildung des Spaltöffnungsapparates beteiligt. Die Öffnungsweite der Pore
wird durch den Innendruck, den Turgor, der Schließzellen reguliert. Steigt der Turgor,
bewegen sich die Schließzellen auseinander und die Pore weitet sich. Sinkt der Turgor,
schließen sich die Stomata. Aufgebaut wird der Turgor durch osmotisch wirksame Substanzen wie anorganischen Ionen (K+, Cl-, NO32-, usw.) oder aber auch durch organi1
EINLEITUNG
schen Ionen (Malat), deren Konzentration durch Transport oder Syntheseprozesse verändert werden kann. Der Transport der Osmotika über die Membran erfolgt über integrale Membranproteine, die mehr oder minder selektiv Ionen mit oder auch gegen ihren
Gradienten (unter Energieverbrauch) über die Membran zu transportieren vermögen.
1.1
Stomata
Stomata sind nahezu an allen der Luft ausgesetzten Teilen der Pflanze zu finden: an
Blütenteilen, Früchten, unverholzten Sprossen und natürlich Blättern (Willmer und
Fricker, 1996). Bei Blättern wird zwischen hypo-, hyper- und amphistomatischen Blättern unterschieden. Bei hypostomatischen Blättern kommen die Stomata nur auf der
Blattunterseite (abaxial) vor, während die Stomata bei hyperstomatischen auf der Oberseite des Blattes (adaxial) zu finden sind. Bei amphistomatischen Blättern sind die Stomata auf beiden Blattseiten verteilt. Am weitesten verbreitet ist der amphistomatische
Typ, da er der Pflanze vermutlich die kürzesten Diffusionswege bietet (Willmer und
Fricker, 1996). Hypostomatische Blätter sind häufig bei Bäumen anzutreffen. Wahrscheinlich dient dies dem Verdunstungssschutz, da die Blattunterseite bei intensiver
Sonnenexposition weniger erhitzt wird als die Blattoberseite (Willmer und Fricker,
1996). Hyperstomatische Blätter hingegen sind zumeist bei Wasserpflanzen anzutreffen,
da hier nur die Blattoberseite in Luftkontakt steht (Willmer und Fricker, 1996).
Am häufigsten sind Stomata vom Helleborus- und Gramineen-Typ. Beim HelleborusTyp sind die Schließzellen von bohnenförmiger Gestalt. Stomata dieses Typs sind vor
allem bei dikotylen Pflanzen, wie z.B. der Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana),
der Ackerbohne (Vicia faba) oder an der Tabakpflanze (Nicotiana tabacum bzw.
N. benthamiana) zu finden. Beim Gramineen- oder auch Poaceentyp sind die beiden
Schließzellen hingegen hantelförmig gestaltet, die von zwei spezialisierten Nebenzellen
2
EINLEITUNG
flankiert werden. Diese Stomatypen sind bei Gräsern, wie Mais (Zea mays), Reis (Oryza
sativa), Gerste (Hordeum vulgare) und der Fieder-Zwenke (Brachypodium distachion)
zu finden (Abbildung 1.1).
Abbildung 1.1 Darstellung zweier Stomatypen. Links die nierenförmigen Schließzellen des
Helleborus-Typ anhand des Beispiels von Vicia faba (Gao et al., Plant Cell Reports, 2008).
Rechts die hantelförmigen Schließzellen des Gramineen-Typ, wie sie bei den Gräsern vorkommen, hier am Beispiel von Oryza sativa (Hetherington und Woodward, Nature 2003).
Die Öffnungsweite der Pore ist den Bedürfnissen der Photosynthese und des Wasserhaushaltes angepasst. Bei CO2-Bedarf werden die Stomata weiter geöffnet, während sie
bei drohendem kritischen Wassermangel schließen. Induziert wird die Öffnung der
Stoma durch Licht und niedrigem inter- bzw. intrazellulärem CO2-Partialdruck, wobei
beim Lichtreiz noch zwischen Blaulicht und photosynthetisch aktiver Strahlung (PAR,
photosythetic active radiation) unterschieden werden kann. Der Stomaschluss wird
durch Trockenstress bzw. Abscisinsäure (ABA) und hohem CO2-Partialdruck induziert.
Bei Trockenheit stellt das Schließen der Stomata einen Schutzmechanismus dar, um
potentielle Schäden durch zu großen Wasserverlust zu verhindern.
3
EINLEITUNG
1.2
Turgoränderung bei der Stomabewegung
Zu Beginn des 19. Jahrhunderts wurde davon ausgegangen, dass bei der Stomaöffnung
im Sonnenlicht, die in den Chloroplasten der Schließzellen enthaltene Stärke in Zucker
umgewandelt wird. Die osmotische Aktivität des Zuckers bewirkt wiederum einen Anstieg des Turgordrucks (Strugger and Weber, 1926). Stärke kann in die einzelnen
Glucosebausteinen gespalten werden, aus denen wiederrum Saccharose gebildet wird.
Sowohl Glucose als auch Saccharose besitzen osmotische Aktivität. An Schließzellen
von Vicia faba konnte später tatsächlich gezeigt werden, dass der Stärkegehalt der Chloroplasten invers mit der Öffnungsweite korrelliert ist. Der Saccharosegehalt nimmt also
mit steigender Öffnungsweite bzw. anhaltender Öffnungsdauer zu (Outlaw und Manchester 1979; Olsen et al., 2002; Talbott und Zeiger 1993,1996).
Eine Stärke-abhängige Stomabewegung konnte in der Modellpflanze Arabidopsis allerdings nicht nachgewiesen werden. Bei der „stärkelosen“ Mutantenlinie TC75, der das
Enzym PGM in den Chloroplasten fehlte, (Phosphoglucomutase, ein Schlüsselenzym
der Stärkesynthese) war zwar unter Photosynthese-fördernden Bedingungen eine normale Stomabewegung zu beobachten, die Öffnung unter Blaulicht war jedoch reduziert
(Lascéve et al., 1997). Desweiteren waren Arabidopsis thaliana Schließzellen in der
Lage Stärke bei der Stomaöffnung auf- und beim Stomaschluss abzubauen, wie es
schon für Mesophyllzellen gezeigt wurde (Stadler et al., 2003). Dies widerspricht also
der vormals von Strugger und Weber aufgestellten Hypothese, dass die Stomaöffnung
bei Licht auf die Umwandlung von Stärke in Zucker zurückzuführen ist. Trotzdem
scheinen Schließzellen zur Saccharoseakkumulation fähig zu sein (Reckmann et al.,
1990). Die Aufnahme von Zucker in Schließzellen im Protonensymport wurde bereits
beschrieben (Reddy und Das 1986; Ritte et al., 1999), und auch Chloroplasten vermögen Zucker zur Stärkesynthese zu importieren (Overlach et al., 1993). Molekulargenetisch konnte AtSTP1 als erster Zuckertransporter in der Schließzellmembran lokalisiert
werden, dessen Expression stark durch den diurnalen Rhythmus reguliert wird (Stadler
et al., 2003). Systeme, die selektiv der Zuckerabgabe dienen, sind in Schließzellen bisher jedoch nicht beschrieben worden. Da die Stomabewegung innerhalb weniger Minuten ablaufen kann, sind die notwendigen osmotischen Änderungen auch nicht allein
4
EINLEITUNG
durch Stärkesynthese oder Zuckerakkumulation zu bewerkstelligen (Roelfsema und
Hedrich, 2005).
Im Zusammenhang mit der Stomabewegung stehen seit langem auch anorganische und
organische Ionen im Mittelpunkt wissenschaftlicher Untersuchungen. Bereits 1905 erkannte Maccallum, dass Kalium in den Schließzellen in wesentlich höheren Konzentrationen vorhanden ist, als im restlichen Gewebe. Die Akkumulation von Kalium in den
Schließzellen während der Stomaöffnung konnte in nachfolgenden zahlreichen Untersuchungen weiter bestätigt werden (Outlaw 1983, Willmer und Fricker 1996). Da eine
alleinige Bewegung von Kalium starke Auswirkungen auf das Membranpotential hätte,
findet gleichzeitig eine Akkumulation von Anionen in Form von Chlorid (Penny et al.,
1976; Van Kirk und Raschke 1978; MacRobbie et al., 1980,1984) und Malat statt
(Allaway et al., 1973; Raschke und Dittrich, 1977; Raschke und Schnabl, 1978).
Der steigende Turgordruck, der durch die Aufnahme der Osmotika und des nachströmenden Wassers verursacht wird, führt zu einer Volumenvergrößerung der Schließzellen. Durch radial verlaufende Zellulosefibrillen resultiert die Expansion der Schließzellen in einer longitudinalen Ausdehnung (Sharp et al., 1987; Shope et al., 2003), was
schlussendlich zu einem Auseinanderbiegen der Schließzellen führt, die so den Spalt
vergrößern.
1.3
Ionentransport über biologische Membranen
Pflanzliche wie auch tierische Zellen sind von Phospholipidmembranen umschlossen
und in Kompartimente unterteilt. Mit der Ausnahme von Wasser und wenigen, niedermolekularen Stoffen sind diese ca. 5-10 nm dicken Lipiddoppelschichten relativ undurchlässig für die meisten Moleküle. Der Stofftransport zwischen Zellen kann daher
entweder über Plasmodesmata oder Transportproteine in der Membran erfolgen. Bei
5
EINLEITUNG
Plasmodesmata handelt es sich um dünne, von Plasmamembran umgebene Plasmastränge, die durch die Zellwand hinweg eine Verbindung zu Nachbarzellen etablieren
und so einen Stoffaustausch von Zelle zu Zelle ermöglichen. Schließzellen hingegen
besitzen keine Plasmodesmata zu benachbarten Epidermiszellen und stellen somit elektrisch isolierte Zellen dar (Willmer und Sexton, 1979; Wille und Lucas, 1984). Die Bewegung
von
Metaboliten
und
Mineralien
muss
also
über
integrale
(membrandurchspannende) Transportproteine erfolgen. Auf Homologien-basierende
Vorhersagen gehen von 1800 solcher Transportproteine im Genom von Arabidopsis
thaliana aus (Schwacke, 2003). Diese Transportproteine lassen sich in drei Gruppen
einteilen: Carrier, Kanäle und Pumpen. Bei der Stomabewegung spielen vor allem Ionenkanäle und H+-ATPasen eine entscheidende Rolle. Mit Hilfe der Hydrolyse von
ATP generieren H+-Pumpen (H+-ATPasen über der Plasmamembran und H+-ATPasen
und H+-PPasen über den Tonoplasten) einen elektrochemischen Protonengradienten
über der Membran (Sze et al., 1999; Maeshima, 2001; Palmgren, 2001). Durch die Verschiebung der Protonen aus dem Zytosol in den Apoplasten bzw. in die Vakuole kommt
es aufgrund der positiven Ladung von Protonen neben der Generierung eines chemischen Gradienten auch zu einer Ladungstrennung und damit zur Etablierung der sog.
Protonen-motorischen Kraft. Diese Ladungstrennung hat zur Folge, dass ein
Membranpotential aufgebaut wird. Eine vermehrte Aktivität der H+-ATPasen in der
Plasmamembran (z.B. durch Blaulicht-Stimulation) kann zu einer Hyperpolarisation des
Membranpotentials führen, die eine entscheidende Rolle bei Stomaschluss einnimmt.
Die Intensität und Richtung des Ionenkanal-vemittelten Transports ist vom elektrochemischen Gradienten des jeweiligen Ions abhängig. So ist es z.B. möglich Ionen entgegen ihres chemischen Gradienten mit Hilfe eines elektrischen Gradienten in Form des
aufgebauten Membranpotentials zu akkumulieren. Im Gegensatz zu den relativ langsamen, primär aktiven Pumpen (10 - 103 Moleküle bzw. Ionen pro Sekunde) können Kanäle Transportraten von bis zu 108sek-1 erreichen. Diese schnelle Ladungsverschiebung
hat eine Veränderung des Membranpotentials in Richtung des Nernstpotentials des jeweiligen permeierenden Ions zur Folge. Durch die Aktivierung von Ionenkanälen können also Reize schnell in elektrische Erregung der Membran umgesetzt werden und so
z.B. weitere spannungsabhängige Kanäle aktivieren oder auch deaktivieren.
6
EINLEITUNG
Durch die Ausbildung von hydrophilen Poren erleichtern Ionenkanäle die Diffusion von
Ionen über die Membran. Im Gegensatz zu Ionen kann Wasser durch biologische
Membranen diffundieren. Die reine Diffusion über die Membran spielt aber nur eine
geringe Rolle, da der Transport von Wasser über sog. Aquaporine vermittelt wird.
Aquaporine sind Wasser-durchlässige Proteine, die unter anderem auch in Schließzellen
gefunden wurden (Fraysse et al 2005; Shope und Mott 2006; Sarda et al., 1997) und
eine wichtige Rolle bei der Regulation des Wasserhaushaltes spielen (Tyerman et al.,
2002; Kaldenhoff und Fischer, 2006). Im Tonoplasten können Aquaporine bis zu 40%
der vorhandenen Proteine ausmachen und ihr Anteil in der Plasmamembran kann bis zu
10% betragen (Maeshima et al., 2001). Die Regulation ihrer Aktivität erfolgt über
divalente Kationen (Ca2+, Mg2+) und den pH-Wert (Gerbeau et al., 2002; Chaumont et
al., 2005). Neben ihrer Funktion als „Wasserpore“ können sie auch die Diffusion von
HCO3- über die Plasmamembran erleichtern (Uehlein et al., 2003).
1.3.1
Kaliumtransport während der Stomabewegung
Kalium stellt unter den Kationen das Hauptosmotikum in pflanzlichen Zellen dar. Aufgrund der hohen Konzentration im Zytosol von Schließzellen vermag deshalb nur Kalium die Öffnungsweite der Stomata stark zu beeinflussen (Fischer et al., 1968; Humble
und Raschke, 1971). 1984 konnte der erste K+-Kanal vermittelte Kaliumstrom in
Schließzellen nachgewiesen werden (Schroeder et al., 1984). Die ersten Gene, die für
Kaliumkanäle in Pflanzen kodieren, wurden acht Jahre später identifiziert (Anderson et
al., 1992; Sentenac et al., 1992). Die Kaliumkanäle KAT1 (K+-channel in Arabidopsis
thaliana 1) aus der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana und KST1 (K+-channel in
Solanum tuberosum 1) aus der Kartoffel Solanum tuberosum wurden schließlich erstmals 1995 in Schließzellen beschrieben (Müller und Röber, 1995; Nakamura et al.,
1995). Anhand ihrer elektrischen Eigenschaften teilt man die pflanzlichen Kaliumkanä7
EINLEITUNG
le in drei Gruppen ein: Einwärtsgleichrichter, Auswärtsgleichrichter und schwachspannungsabhängige- bzw. spannungsunabhängige Kaliumkanäle. Patch-Clamp-Studien
an isolierten pflanzlichen Zellen, sowie die funktionelle Charakterisierung in heterologen
Expressionssystemen
haben
gezeigt,
dass
die
gleichrichten-
den/spannungsabhängigen Kanaltypen im Pflanzenreich ubiquitär vorkommen. Dabei
konnte gezeigt werden, dass die Gleichrichtung des Kaliumstroms durch die Spannungsabhängigkeit der entsprechenden Kaliumkanäle zustande kommt. Dabei aktivieren
auswärtsgleichrichtende K+-Kanäle bei depolarisierenden Membranpotentialen während
einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle Hyperpolarisations-aktiviert sind (Roelfsema
und Hedrich, 2005).
Die Plasmamembran-ständigen aus- und einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle der
Schließzelle gehören zur strukturellen Familie der Shaker-Kanäle. Eine Kanaluntereinheit besitzt sechs Transmembrandomänen mit einer konservierten, amphiphilen Porenregion zwischen der fünften und sechsten Domäne (Uozumi et al., 1995, 1998). Positiv
geladene Aminosäuren in der vierten Transmembrandomäne verleihen dieser Domäne
die Funktion eines Spannungssensors (Marthur et al., 1997; Smith-Maxwell et al., 1998;
Marten und Hoshi, 1998; Latorre et al., 2003). Vier Untereinheiten lagern sich in der
Plasmamembran zu Tetrameren zusammen, um eine funktionelle zentrale Pore aus den
amphiphilen Porenschleifen zu bilden (Li et al., 1994). Dabei können sich aus den einzelnen Untereinheiten sowohl Homo- als auch Heterotetramere formen. Für den „Zusammenbau“ der Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal ist offenbar ein
Oligomerisierungsmotiv am C-terminus essentiell (Daram et al 1997; Erhardt 1997).
In Arabidopsis thaliana sind neun Mitglieder der Shaker-Kaliumkanalfamilie bekannt,
von denen sechs in der Schließzelle exprimiert werden: KAT1, KAT2 (K+-channel in
Arabidopsis thaliana 1,2), AKT1 (Arabidopsis thaliana K+-transporter 1), AtKC1
(Arabidopsis thaliana K+-rectifying channel 1), SKOR (Stelar K+ outward rectifier)
und GORK (Guard cell outward rectifying K+ channel) (Pilot et al., 2001; Szyroki et
al., 2001; Ache et al., 2000; Gaymard et al., 1998). KAT1, KAT2 und AKT1 kodieren
für einwärtsgleichrichtende Kanäle, die eine Kaliumaufnahme vermitteln, wobei die
Untereinheiten der verschiedenen Kanäle auch Heteromere bilden können (Dreyer et al.,
1997). Diese Redundanz unter den Kaliumkanaluntereinheiten erklärt, warum bei einer
KAT1 Verlustmutante trotzdem einwärtsgleichrichtende Kaliumströme beobachtet wer8
EINLEITUNG
den konnten (Szyroki
et al., 2001). Im Gegensatz zu den anderen Shaker-
Kanaluntereinheiten kodiert AtKC1 wahrscheinlich nicht für einen funktionellen
homomeren Kanal. Seine Expression übernimmt aber eine regulatorische Funktion in
heterotetrameren Kaliumkanälen, indem die AtKC1-Untereinheit in Interaktion mit
AKT1 einen Bestandteil des Kaliumaufnahmekanals darstellt (Reintanz et al., 2002;
Geiger et al., 2009). Eine Ausnahmestellung innerhalb der Kaliumkanäle aus
Arabidopsis übernimmt die AKT2/3 Kaliumkanaluntereinheit. Die Expression von
AKT2/3 in Xenopus Oozyten resultierte in einem schwach spannungsabhängigen Kanal
mit geringem Gleichrichtungscharakter (Marten et al., 1999; Lacombe et al., 2000). In
Schließzellen konnten jedoch bisher keine endogenen Spannungsunabhängigen Kaliumströme beschrieben werden. Dies könnte mit dem Phosphorylierungszustand in planta
in Zusammenhang stehen, da heterolog exprimierte AKT2-Ströme durch den Phosphorylierungszustand in ihren Charakteristika beeinflusst werden (Dreyer et al., 2001).
Im Gegensatz zu den Einwärtsgleichrichtern werden die Kaliumabgabekanäle in
Arabidopsis nur durch die zwei Gene GORK und SKOR kodiert (Ache et al., 2000;
Gaymard et al., 1998; Johansson et al., 2006; Lacombe et al., 2000). GORK kodiert
dabei für den einzigen Auswärtsgleichrichter in Schließzellen. Die Deletion des Gens
führte zum vollständigen Verlust von auswärtsgerichtenden Kaliumströmen (Hosy et
al., 2003). Der Stomaschluss war bei der GORK Verlustmutante durch ABA und Dunkelheit jedoch weiterhin möglich, auch wenn die Schließgeschwindigkeit im Vergleich
zu Stomata des Wild-Typs reduziert war (Hosy et al., 2003). Dies deutet darauf hin,
dass Schließzellen einen alternativen Weg besitzen, um Kalium während des
Stomaschlusses aus der Zelle zu schleusen.
9
EINLEITUNG
1.3.2
Anionentransport während der Stomabewegung
In Pflanzenzellen herrscht in der Regel ein hoher Turgordruck, der zum großen Teil
durch die Akkumulation von Kalium hervorgerufen wird. Für die Erhaltung der Elektroneutralität sorgen anorganische und organische Anionen. Die in Pflanzengeweben am
häufigsten anorganischen Anionen sind Nitrat, Chlorid, Sulfat und Phosphat. Carbonat
hingegen erfüllt eine wichtige regulatorische Funktion bei der Einstellung des
zytosolischen pH-Wertes. Bei den organischen Anionen kommt dem Malat die größte
Bedeutung zu, da es die Hauptrolle bei der Osmoregulation vieler Pflanzenzellen spielt.
So steigt die Malatkonzetration in Vicia faba Schließzellen während der Stomaöffnung
von 38 mM auf 75 mM an (Allaway et al., 1973). In Abwesenheit von externem Chlorid
kann die zytosolische Malatkonzentration sogar auf bis zu 145 mM steigen (Raschke
und Schnabl ,1978). Die Synthese von Malat erfolgt in Schließzellen durch die Reduktion von Oxalacetat, welches bei der Carboxylierung von Phosphoenolpyrovat anfällt
(Asai et al., 2000). Die Reaktion wird durch eine Schließzell-spezifische Isoform der
Phosphoenolpyrovat-Carboxylase (PEPC) katalysiert. Um für die Stomaöffnung ausreichende Malatmengen zur Verfügung stellen zu können, besitzt diese Schließzellspezifische Isoform eine ca. 10fach höhere Aktivität als die PEPC der Mesophyllzellen
(Outlaw et al., 1980). Die Regulation der PEPC-Aktivität erfolgt in den
Mesophyllzellen durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus, d.h. die Aktivität
wird mit steigender Konzentration von Malat gehemmt. Hingegen wird zur Akkumulation hoher Malatkonzentrationen in Schließzellen die PEPC bei der Stomaöffnung durch
Phosphorylierung aktiviert, was dem inhibitorischen Effekt von Malat entgegenwirkt
(Zhang et al., 1994; Cotelle et al., 1999). Im Gegensatz zu Malat werden andere Anionen aus dem Apoplasten in die Schließzelle aufgenommen. Da das Umkehrpotential für
Anionen meist positiv vom Membranpotential pflanzlicher Zellen liegt, muss die
Anionenaufnahme über einen (sekundär) aktiven Transport erfolgen. So wurde in der
Schließzell-Plasmamembran von Arabidopsis ein Carrier identifiziert und charakterisiert - AtNRT1.1-, der Nitrat, nicht aber Chlorid über die Plasmamembran transportiert
(Guo et al., 2003). Geringere Stomaöffnungsweiten und eine reduzierte Transpiration
der Verlustmutante von AtNRT1.1 verdeutlichen die wichtige Rolle des Carriers im
Hinblick auf die Stomaphysiologie (Guo et al., 2003). Tranportproteine, die eine Auf10
EINLEITUNG
nahme von Chlorid in die Schließzelle bewirken, sind aber bis heute weder molekulargenetisch noch elektrophysiologisch identifiziert worden. Eukaryotische Chloridkanäle
wurden bereits im tierischen System als Anionenkanäle beschrieben und sind in der
äußeren Zellmembran lokalisiert (Jentsch et al., 2002). Die sieben putativen Mitglieder
der CLC-Familie (Cl- Channel) in Arabidopsis thaliana sind bisher jedoch nicht funktionell in planta als Chloridkanäle dokumentiert worden (Hechenberger et al., 1996;
Geelen et al., 2000). Vielmehr scheinen die CLCs in Arabidopsis thaliana
Anionencarrier in Endomembranen darzustellen (De Angeli et al., 2007). AtCLCa
konnte elektrophysiologisch als vakuolärer NO3-/H+-Antiporter identifiziert werden, der
NO3- in der Vakuole akkumuliert (De Angeli et al., 2006). Aufgrund der geringen Affinität zu Chlorid ist eine Beteiligung dieses Transporters an der Stomabewegung aber
eher unwahrscheinlich.
Die Mitglieder der (ABC)-Transporter Familie („ATP-binding cassette transporter“)
hingegen könnten eine wichtige Rolle beim Anionentransport über die Schließzellplasmamembran übernehmen. In Arabidopsis thaliana haben Genomanalysen ergeben, dass
120 putative ABC-Transporter kodiert werden (Sanchez-Fernandez et al., 2001). Von
einer Unterfamilie, den sog. „multidrug-resistance associated proteins“ (MRPs), wurden bereits 5 der 16 Mitglieder molekulargenetisch untersucht (Rea et al., 2007). Dabei
werden AtMRP4 und AtMRP5 in der Plasmamembran von Schließzellen exprimiert
und transportieren kleine organische Anionen (Gaedecke et al., 2001; Klein et al.,
2004). Von tierischen Systemen ist bekannt, dass Ionenkanalaktivitäten durch ABCTransporter beeinflusst werden, weshalb auch bei MRPs in Pflanzen eine ähnliche
Funktion vermutet werden kann. AtMRP5 z.B. nimmt Einfluss auf die Regulation der
Stomaweite. So wurde gezeigt, dass mrp5-1-Mutanten nicht für Auxin und ABAStimuli empfänglich sind, die normalerweise eine Stomaöffnung bzw. einen
Stomaschluss induzieren (Klein et al., 2003). Desweiteren weist die mrp5-1 Mutante
eine geringere Aktivierung der Anionenströme auf. Es wird vermutet, dass AtMRP5
indirekt auf die Regulation der Anionenkanäle und NSCCs (non selective cation channels) wirkt (Suh et al., 2007).
Mittels elektrophysiologischer Methoden konnten bereits Ende der 80er Jahre
Anionenkanäle in Pflanzen elektrophysiologisch identifiziert und charakterisiert werden, die einen Efflux von Anionen aus der Schließzelle vermitteln können. Dabei unter11
EINLEITUNG
scheidet man zwischen spannungsgesteuerten und mechanosensitiven Ionenkanälen
(Keller et al., 1989; Schroeder und Hagiwara, 1989; Hedrich et al., 1990; Cosgrove und
Hedrich 1990; Schroeder und Keller, 1992). Im Gegensatz zu den spanungsgesteuerten
Kanälen ist die Rolle der mechanosensitiven Kanäle während der Stomabewegung
weitgehend unerforscht. Es wird vermutet dass diese Kanäle die Schließzelle vor osmotischen Stress schützen (Cosgrove und Hedrich, 1990; Zhang et al., 2007).
Die spannungsabhängigen Kanäle werden in Anlehnung an ihre Aktivierungs- und
Deaktivierungsgeschwindigkeiten als langsamer (Slow) S-Typ (Schroeder und
Hagiwara, 1989; Linder und Raschke, 1990) und als schneller (Rapid) R-Typ oder
QUAC (Quick Activating Anion Channel, Hedrich et al., 1990) bezeichnet. Ihre
Aktivierungskinetiken unterscheiden sich etwa um den Faktor 1000 und liegen beim STyp im Bereich von 5-60 Sekunden (Linder und Raschke, 1992) und beim R-Typ im
Bereich von 10-50 Millisekunden (Keller et al., 1989). Im Gegensatz zum R-Typ zeigen
S-Typ Anionenkanäle kein Inaktivierungsverhalten, jedoch eine langsame, schwach
ausgeprägte
Deaktivierung
nach
10-12
Sekunden
bei
hyperpolarisierenden
Membranpotentialen (Linder und Raschke, 1992; Schroeder und Keller 1992; Dietrich
und Hedrich, 1994). Der nur schwach spannungsabhängige S-Typ Anionenkanal kann
gut anhand seiner fast linearen Strom-Spannungskennlinie erkannt werden (Linder und
Raschke, 1992). Im Gegensatz dazu weist der R-Typ Anionenkanal eine starke Spannungsabhängigkeit auf. Dieser Kanaltyp ist beim Ruhepotential von Schließzellen
(ca. -150 mV bis -240 mV) geschlossen und wird durch Depolarisation des
Membranpotentials aktiviert (Keller et al., 1989; Hedrich et al., 1990). Dabei ist zu beachten, dass das Aktivierungspotential in der Anwesenheit von Auxin, sowie externen
organischen
Ionen
wie
Malat,
Propionat
und
Acetat
stark
zu
negativen
Membranpotentialen verschoben wird (Hedrich und Marten 1993; Dietrich und Hedrich, 1998). Ein weiteres Charakteristikum der R-Typ Anionenkanäle stellt ihre Inaktivierung bei anhaltender Depolarisation dar (Hedrich et al., 1990; Kolb et al., 1995).
In Schließzellen von Vicia faba konnten bisher Anionenströme beider Kanaltypen aufgezeichnet werden, was die Frage aufwarf, ob die Ströme einem Kanal mit verschiedenen Kinetiken oder zwei oder mehr distinkte Kanäle zugrunde liegen. Für die „EinKanal-Hypothese“ spricht, dass beide eine ähnliche Einzelkanalleitfähigkeit aufweisen,
welche in der Regel mit 30-40 pS angegeben wird (Keller et al., 1989; Linder und
12
EINLEITUNG
Raschke, 1992; Dietrich und Hedrich, 1994). Zudem besitzen beide ähnliche
Permeabilitäten für verschiedene Anionen (Hedrich et al., 1990 Dietrich und Hedrich,
1994; Hedrich und Marten, 1993; Schmidt und Schroeder, 1994). Beide Kanäle lassen
sich durch Nukleotide aktivieren, unterscheiden sich jedoch in ihrer Spezifität. Der STyp wird durch Kinasen reguliert und benötigt ATP (Schmidt et al., 1995), wohingegen
der R-Typ auch durch nicht hydrolisierbare Nukleotide aktivierbar ist (Hedrich et al.,
1990).
Desweiteren
zeigt
der
R-Typ
eine
gesteigerte
Einzelkanal-
Offenwahrscheinlichkeit bei saurem zytoplasmatischen pH-Wert (Schulz-Lessdorf et
al., 1996). Zudem erhöht sich die Einzelkanalleitfähigkeit des R-Typ Kanals mit der
Präsenz von extrazellulärem Cl-, was sich durch einen stimulierten Anionenefflux bemerkbar macht (Hedrich und Marten 1993; Lohse und Hedrich 1995; Dietrich und
Hedrich, 1998).
Die kürzliche Identifizierung des Gens SLAC1 (slow anion channel 1) spricht jedoch
gegen die oben angesprochene „Ein-Kanal-Hypothese“. Dieses Gen kodiert für einen
Bestandteil oder eine regulatorische Komponente des S-Typ Anionenkanals in
Arabidopsis thaliana (Vahisalu et al., 2008; Negi et al., 2008). Das Gen wird in der
Plasmamembran von Schließzellen exprimiert und ist schwach homolog zu
Malat/Dicarboxylat-Transportern aus Bakterien und Pilzen (Vahisalu et al., 2008; Negi
et al., 2008). In SLAC1-Verlustmutanten ist die Fähigkeit zum Stomaschluss in intakten
Pflanzen stark reduziert und in Epidermispräparaten gar nicht mehr vorhanden
(Vahisalu et al., 2008; Negi et al., 2008). R-Typ Anionenkanäle bleiben von einer Mutation in SLAC1 jedoch völlig unbeeinflusst (Vahisalu et al., 2008). Eine Mutation, die zu
einem Verschwinden von R-Typ Anionenströmen führt ist bisher noch nicht bekannt.
Es wurde jedoch beschrieben, dass sich bei Mitgliedern der ALMT-Familie (Aluminium
activated Malate Transporter) bei heterologer Expression in Xenopus Oozyten das Umkehrpotentials mit dem Malatgradienten ändert (Hoekenga et al., 2006). Dies führte zu
der Vermutung, dass einige Vertreter der Familie für einen Anionenkanal kodieren
könnten. Da Malat das dominierende osmotisch aktive Anion in den Schließzellen von
Arabidopsis ist (Fernie et al., 2009; Lee et al., 2008), könnten ALMT’s somit eine Rolle
bei der Stomabewegung spielen. Die Familie der ALMT-Kanäle wurde als erstes mit
Hilfe der Patch-Clamp-Technik in Wurzelzellen (Kollmeier et al., 2001; Pineros et al.,
2001) und molekulargenetisch in Triticum aestivum beschrieben (TaALMT1, Sasaki et
13
EINLEITUNG
al., 2004) und Arabidopsis thaliana (AtALMT1, AtALMT9, Hoekenga et al., 2006;
Kovermann 2007). Pineros konnte jedoch 2008 zeigen, dass nicht alle ALMT’s durch
Aluminium aktiviert werden und ZmALMT1 Al3+-unabhängig aktiviert und eher anorganische Anionen, wie Cl-, NO3- und SO42- als Malat transportiert.
1.4
Regulation der Ionenflüsse beim ABA-induzierten Stomaschluss
Bei Trockenheit sorgt das Phytohormon ABA für einen schnellen Schluss der Stomata,
um die Transpiration zu minimieren. Diese Bewegung wird von starken Ionenflüssen
über die Plasmamembran und den Tonoplasten begleitet. Aufgrund elektrophysiologischer Untersuchungen ist bekannt, dass die Applikation von ABA eine starke Depolarisation der Schließzellplasmamembran zur Folge hat. Diese schnelle Depolarisation ist
für den Stomaschluss essentiell, da hierüber die depolarisationsaktivierten Kaliumabgabekanäle aktiviert werden. Erzeugt wird die Depolarisation massgeblich durch die
ABA-induzierte Aktivierung von R- und S-Typ-Anionenkanälen (Roelfsema et al.,
2004; Levchenko et al., 2005).
Die durch ABA ausgelösten Signaltransduktionsketten sind relativ komplex und eine
Vielzahl von Komponenten bzw. Botenstoffe innerhalb dieser Signalkette wurden bislang identifiziert (siehe Übersichtsartikel Schroeder et al., 2001; Roelfsema und Hedrich, 2005; Li et al., 2006; Pandey et al., 2007). Auch wenn noch nicht alle Regulationsmechanismen detailliert dokumentiert sind, wurden zwei Charakteristika häufig in
Zusammenhang mit dem ABA-induzierten Stomaschluss beschrieben: die Alkalisierung
des Cytoplasmas (Irving et al., 1992; Blatt und Armstrong, 1993; Armstrong et al.,
1995) und der Anstieg des zytosolischen Kalziumspiegels (McAinsh et al., 1990; Allen
et al., 1995). Irving et al. (1992) konnten zuerst die Alkalisierung des Zytosols von
Schließzellen der Orchidee Paphiopedilum tonsum als Effekt auf eine ABA-Applikation
14
EINLEITUNG
in Epidermispräparaten dokumentieren. Mehrere Kanäle werden durch den pH in ihrer
Aktivität beeinflusst. So wird der Kaliumabgabekanal GORK durch Alkalisierung aktiviert (Blatt und Armstrong, 1993; Miedema und Assmann, 1996), wobei Kaliumaufnahmekanäle bei intra- (Blatt et al., 1992; Hoshi et al., 1995) und extrazellulärer
Ansäuerung stimuliert werden (Hoth et al., 1997; Hoth et al., 2001). Während die Alkalisierung des Zytosols dem Kalzium-unabhängigen Signaltransduktionweg zugeschrieben wird, stellt die Erhöhung des zytosolischen Kalziumspiegels einen kalziumabhängigen Weg dar. Eine Erhöhung des zytosolischen Ca2+-Spiegels konnten in mehreren Spezies durch den Einsatz des kalziumsensitiven Farbstoffs FURA-2 nach ABAApplikation gezeigt werden. In Commelina communis konnte sie in 70-80% (McAinsh
et al., 1990; McAinsh et al., 1992) bzw 25% (Gilroy et al., 1990) der mit ABA behandelten Schließzellen in Epidermispräparaten nachgewiesen werden. In Vicia faba wurde
von einer ABA-induzierten Erhöhung des zytosolischen Ca2+-Spiegels ([Ca2+]zyt.) in
einem Drittel der behandelten Schließzellprotoplasten berichtet (Schroeder und
Hagiwara, 1990). In intakten Vicia faba Pflanzen war jedoch keine [Ca2+]zyt.-Erhöhung
auf eine ABA-Gabe zu beobachten (Levchenko et al., 2005). Eine [Ca2+]zyt.-Erhöhung
scheint also nicht zwingend erforderlich für eine ABA-Antwort zu sein. Steigt jedoch
der [Ca2+]zyt. nach Applikation von ABA, könnte der Ca2+-Transport durch hyperpolarisationsaktivierte Ca2+-Kanäle, die sog. HACC’s (hyperpolarisation activated calcium
channel), vermittelt werden (Grabov und Blatt, 1998). An Protoplasten von Vicia faba
Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese durch ABA stark aktiviert werden
(Hamilton et al., 2000). Die HACC’s wurden in nachfolgenden Experimenten als nichtselektive Kationenkanäle charakterisiert (NSCC’s, non selective cation channels; siehe
Übersichtsartikel Demidchik et al., 2002; Demidchik und Maathuis, 2007). Eine
[Ca2+]zyt.-Erhöhung kann entweder durch Transport von Ca2+ ins Zytosol von außen
oder durch Freisetzung aus intrazellulären Speichern erreicht werden. Entfernt man jedoch das Ca2+ aus der externen Lösung, bleibt die [Ca2+]zyt.-Erhöhungen aus (Klüsener
et al., 2002).
Phosphorylierungsreaktionen spielen ebenso eine wichtige Rolle beim ABA-induzierten
Stomaschluss. Die ersten am Signalweg beteiligten Proteinphosphatasen waren ABI1
und ABI2 (ABA insensitive), die beide zur Familie der Typ 2C Proteinphosphatasen
(PP2C) gehören. Verlustmutanten mit Punktmutationen in den entsprechenden Genen
15
EINLEITUNG
werden bei Wachstum und Keimung nicht mehr durch ABA inhibiert (Koorneef et al.,
1984). Zudem sind die Stomata weiter geöffnet, da ABA keinen Einfluss mehr auf die
Ionenflüsse der Stomatabewegung besitzt (Roelfsema und Prins, 1995; Armstrong et al.,
1995; Pei et al., 1997; Allen et al., 1999). Inzwischen wurden weitere PP2C’s
identifizert (AHG1, AHG3, HAB1, HAB2), denen eine negativ regulierende Funktion
der ABA-Antwort zugeschrieben wird (Hirayama und Shinozaki, 2007).
Eine weitere Funktion von PP2C‘s scheint die Regulation verschiedener Kinasen zu
sein. So ist in Arabidopsis ABI1 erforderlich, um die Kinase OST1 (open stomata 1,
auch SNF1-related-Kinase SnRK2.6 genannt) während der ABA-Antwort zu aktivieren
(Yoshida et al., 2006). Auch andere SnRK’s sind an der ABA-Signaltransduktion beteiligt, da Verlustmutanten von OST1 und SnRK2 bzw. SnRK3 in entweder ABAhypersensitiven oder ABA-insensitiven Phänotypen resultieren (Guo et al., 2002; Yoshida et al., 2006; Ohta et al., 2003). Ebenso konnten mehrere Ca2+-abhängige
Proteinkinasen (CDPK, calcium dependent protein kinase) als Mitglieder des ABASignaltransduktionweges ausgemacht werden. Die zwei CDPK’s CPK3 und CPK6
scheinen an der Stomaregulation beteiligt, da Verlustmutanten sowohl im ABAaktivierten, als auch im [Ca2+]-aktivierten Stomaschluss ein gestörtes Verhalten zeigten
und auch in ihren S-Typ-Anionenströmen reduziert waren (Mori et al., 2006). CPK3
und CPK6 stellen möglicherweise Positivregulatoren der NSCC’s und des S-TypAnionenkanals beim Stomaschluss dar, ebenso wie CPK4 und CPK11, wobei deren
Zielproteine noch nicht bekannt sind (Zhu et al., 2007). Ferner scheint CPK23 in der
Regulation
des
Stomaschlusses
involviert
zu
sein.
Verlustmutanten
und
Überexprimierer von CPK23 zeigten einen veränderten Stomaphänotyp, ein geändertes
Verhalten auf Trockenstress und eine veränderte Salztoleranz (Ma und Wu, 2007).
CIPK15, eine Calcineurin B-ähnliche (CBL) Proteinkinase, interagiert mit den beiden
Proteinphosphatasen ABI1 und ABI2, die als Negativregulatoren gut dokumentiert sind
(Guo et al., 2002).
16
EINLEITUNG
1.5
Ionenflüsse bei der Stomabewegung bei Zea mays
Obwohl Zea mays als kommerziell genutzte Nutz- und Kulturpflanze weit verbreitet ist,
steht deren Stomaphysiologie im Vergleich zu anderen Spezies selten im Fokus wissenschaftlicher Untersuchungen. Im Gegensatz zur Modellpflanze Arabidopsis thaliana,
anhand derer schon viele regulatorische Komponenten der Stomabewegung identifiziert
werden konnten, ist bei Zea mays sehr wenig bekannt. Da die Stomata der beiden Pflanzen anders aufgebaut sind, stellt sich vor allem die Frage, welche Rolle die spezialisierten Nebenzellen im Zusammenhang mit der Stomabewegung spielen. Wie in Kapitel 1.1
bereits beschrieben, besteht der Stomakomplex von Gräsern, und somit auch von Mais,
aus zwei hantelförmigen Schließzellen, die im Fall von Zea mays seitlich von je einer
triangelförmigen Nebenzelle flankiert werden (Abbildung 1.1). Bis heute ist die Funktion der Nebenzellen allerdings noch nicht eindeutig geklärt. Mehrere Untersuchungen an
isolierten Epidermisstreifen und intakten Blättern legten nahe, dass die Nebenzellen ein
Reservoir für Kaliumionen und Anionen für die Schließzellen darstellen und somit die
Stomabewegung unterstützen (Raschke und Fellows 1971; Pallaghy et al., 1971;
Willmer und Pallas, 1973; Squire und Mansfield 1972, 1974; Itai und Meidner, 1978).
So konnten Raschke und Fellows durch Anfärbung von Kalium mit Cobaltnitrit bzw.
Chlorid mit Silbernitrat zeigen, dass beim Öffnen der Stomata die beiden Elemente in
den Schließzellen akkumulieren und beim Stomaschluss wieder in die Nebenzellen migrieren. Untermauert wurde diese Vermutung durch Experimente von Pallaghy 1971, die
zeigten, dass Mais-Stomata in isolierten Epidermisstreifen schließen konnten, obwohl
nur destilliertes Wasser zur Verfügung stand. Die Stomata von Vicia faba, denen die
spezialisierten Nebenzellen fehlen, waren dazu hingegen nicht in der Lage. Aufgrund
solcher Beobachtungen wurde ein Shuttle-transport von Ionen zwischen Schließ- und
Nebenzellen während der Stomabewegung postuliert (Raschke und Fellows, 1971;
Pallaghy et al., 1971). Demnach werden während der Stomaöffnung Ionen aus den Nebenzellen entlassen und von den Schließzellen aufgenommen. Beim Stomaschluss kehrt
sich die Richtung der Ionenflüsse um. Deshalb kann eine gegenläufige Regulation des
Ionentransports in Schließ- und Nebenzellen angenommen werden.
17
EINLEITUNG
Abbildung 1.2 Spaltöffnungsapparat von Zea mays mit geschlossenen (links) und geöffneten
(rechts) Poren. Die hantelförmigen Schließzellen enthalten Chloroplasten in ihren knolligen
Enden und sind von dreieckförmigen Nebenzellen flankiert.
Mittels molekularbiologische
olekularbiologischer und elektrophysiologische Versuchsansätze
rsuchsansätze konnten bisbi
her mehrere Kaliumkanäle
iumkanäle im Mais identifiziert werden.
werden. Philippar et al.
al beschrieben
1999 erstmals die Gene ZMK1 und ZMK2, die für einen K+-Einwärtsgleichrichter
Einwärtsgleichrichter und
einen schwach-spannungsabhängigen
spannungsabhängigen Kaliumkanal kodieren.
odieren. Es folgten die Identifikation weiterer K+-Einwärtsgleichrichter,
Einwärtsgleichrichter, KZM1 (Philippar et al., 2003) und KZM2, sowie
des Auswärtsgleichrichters
gleichrichters ZORK (Büchsenschütz et al., 2005). Mit der Hilfe von
Transkriptionsstudien wurde festgestellt, dass diese
die
Kaliumkanäle
kanäle differentiell
different
in
Schließ- und Nebenzellen exprimiert werden (Abbildung
(
1.3; Büchsenschütz et al.,
al
2005). So sind Transkripte der Kaliumaufnahmekanäle
Kaliumauf
ausschließlich
lich in Schließzellen
zu finden, während der Kaliumaufnahmekanal ZMK1 nur in den Nebenzellen
exprimiert wird.
ird. Der Kaliumabgabekanal ZORK ist in beiden
beiden Zelltypen vorhanden.
vorhanden
18
EINLEITUNG
Abbildung 1.3 Modell zur Beschreibung des Kaliumkanalexpressionsmusters innerhalb des
Stomakomplexes von Mais. Während KZM2 und KZM1 spezifische Vertreter für Schließzellen
(GC, Guard Cell) sind, exprimiert ZMK1 ausschließlich in den Nebenzellen (SC, Subsidiary
Cell). Der Auswärtsgleichrichter ZORK ist in beiden Zelltypen zu finden (aus Büchsenschütz et
al., 2005).
Bereits 1992 konnten durch die Patch-Clamp-Technik zwei Populationen von Kaliumkanälen in Schließzellprotoplasten von Mais identifiziert werden (Fairley-Grenot und
Assmann, 1992). Während die eine Population einen Hyperpolarisation-aktivierten Kaliumeinstrom vermittelt, kommt es bei der anderen Population bei Depolarisation zu
einem Ausstrom von Kalium. Diese beiden charakteristischen Kaliumkanaltypen konnten auch in den Nebenzellen nachgewiesen werden (Majore et al., 2002). In Analogie zu
Kaliumaufnahmekanälen in Schließzellen anderer Spezies konnte gezeigt werden, dass
die Kaliumaufnahmekanäle in den Nebenzellen von Zea mays erstaunlicherweise auf
die gleiche Weise durch ABA in Abhängigkeit von Ca2+- inhibiert werden (Wolf et al.,
2006). Ebenso verhalten sich die Kaliumeffluxkanäle der Mais Nebenzellen ähnlich wie
die in Schließzellen anderer Spezies: Sie werden durch eine Alkalisierung des Zytosols
und ABA-Applikation stimuliert (Majore et al., 2002; Wolf et al., 2006). Darüber hinaus ist zur Aktivierung der Kaliumaufnahme- und Abgabetypen beider Zelltypen die
Anwesenheit von Nukleotiden in Form von MgATP oder MgADP im Zytosol notwendig (Wolf et al., 2005).
19
EINLEITUNG
1.6
Zielsetzung der Arbeit
Stomata sind durch die Regulationsfähigkeit ihrer Öffnungsweite essentiell für den
pflanzlichen Gasaustausch und die Regulation der Transpiration. Die Reize, die zu ihrer
Öffnung und Schließung führen, können von den beteiligten Zellen wahrgenommen
werden und führen zu Ionenflüssen, die letztendlich in der Bewegung der Stomata resultieren. Wie diese Informationen jedoch im Einzelnen verarbeitet werden, ist zwar Gegenstand intensiver Forschung, jedoch immer noch lückenhaft.
Im Zuge der vorliegenden Dissertation sollten vor allem zwei Schwerpunkte auf dem
Gebiet der Stomaphysiologie bearbeitet werden:
1) Im ersten Teil der Arbeit sollten die Grundlagen des postulierten Shuttle-IonenTransports zwischen Schließ- und Nebenzellen in Mais näher untersucht werden. Da
im Mais zwar Kaliumkanäle, aber noch keine Anionenkanäle identifiziert und charakterisiert wurden, sollten mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik Anionenkanäle in
diesen beiden Zelltypen nachgewiesen und ein Fingerprint bezüglich deren Regulation erstellt werden. Dabei sollte der Fokus auf ABA sowie dem Einfluss von Ca2+Ionen und des pH-Wertes gelegt werden. Um ferner die Funktion potentieller Regulationsfaktoren bei der Regulation des Ionentransports in vivo einschätzen zu können, sollten mit Hilfe der Mikroelektroden-Einstich-Technik im intakten Zellsystem
Änderungen im Membranpotential und pH-Wert. während der Stomabewegung erfasst werden.
2) Im Gegensatz zu Zea mays sind bei Arabidopsis thaliana schon zahlreiche Elemente
innerhalb der Signalkette, die in eine Stomabewegung münden, auf molekularer
Ebene identifiziert und funktionell charakterisiert. Nichtsdestotrotz ist die molekulare Identität der S-Typ- und R-Typ-Anionenkanäle und deren Regulationsfaktoren in
den Schließzellen von Arabidopsis thaliana bislang weitgehend unbekannt. Einen
ersten Einblick gewährte jedoch die kürzliche Identifizierung von SLAC1 als essentieller Bestandteil des S-Typ-Anionenkanals (Negi et al., 2008; Vahisalu et al.,
2008). Ferner wurden die Proteinkinasen CPK23 und OST1 als mögliche Interakti20
EINLEITUNG
onspartner identifiziert (Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich, Universität Würzburg).
Mit Hilfe von A. thaliana Verlustmutanten sollte nun elektrophysiologisch auf Einzelzellebene untersucht werden, welche Auswirkungen der Verlust von SLAC1 und
der Proteinkinasen CPK23, OST1 auf die S-Typ-Anionenströme der Schließzellen
haben. Desweiteren sollte das in der Schließzelle exprimierte SLAC1-Homolog
SLAH3 charakterisiert und hinsichtlich seiner Rolle während der Stomabewegung
studiert werden.
In einer Kooperation von Stephan Meyer (Arbeitsgruppe Prof. E. Martinoia, ETH
Zürich, Schweiz) und Prof. Rainer Hedrich kristallisierte sich das in der
Arabidopsis-Schließzellmembran spezifisch exprimierte Gen AtALMT12 als potentieller Kandidat für die R-Typ-Anionenkanäle heraus. Da bis dato wenig über die
elektrischen Eigenschaften der R-Typ-Anionenkanäle in Arabidopsis thaliana
Schließzellen bekannt war, sollten (1) zunächst die R-Typ-Anionenströme in
Wildtyp-Pflanzen näher elektrophysiologisch charakterisiert und (2) anschließend
der Effekt einer Mutation im ALMT12-Gen auf die R-Typ-Anionenströme untersucht werden.
21
MATERIAL UND METHODEN
2
Material und Methoden
Bei den verwendeten Materialien, wurden - soweit nicht anders angegeben - Chemikalien vom Reinheitsgrad pro analysis verwendet und von den Firmen Sigma (München,
Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Applichem (Darmstadt, Deutschland)
oder Fluka (München, Deutschland) bezogen.
2.1
Pflanzenanzucht
2.1.1
Zea mays
Maissaat (Zea mays L. var. Caraibe, Saaten-Union GmbH, Isernhagen, Germany) wurde vor der Aussaat 24h in Wasser vorgequollen und anschließend in Erde (Fruhstorfer
Topferde Typ 2 mittel, Industrie-Erdenwerk Archut, Lauterbach-Wallenrod, Germany)
ausgebracht. Das Wachstum erfolgte in einer Klimakammer bei einer Photoperiode von
14h, einer relativen Luftfeuchte von 60%, einer Tag-/Nachttemperatur von 26°C/16°C
und einer Photonendichte von ca. 130µM m-2s-1. Die Klimakammer war mit
Leuchtstoffröhren (Philips Master P-PL, Eindhoven, Niederlande) und 25W Glühlampen (Osram, München, Deutschland) bestückt. Zur Gewinnung von Protoplasten wurden ca. 8 Tage alte Pflanzen verwendet. Für den Einstich mit Mikroelektroden wurden
8-14 Tage alte Pflanzen herangezogen.
22
2.1.2
Hordeum vulgare
Gerstensaat der Sorte „Ingrid“ wurde ungequollen auf Erde bei einer Belichtungsdauer
von 14h und einer Tag-/Nachttemperatur von 24°C/22°C im Gewächshaus mit einer
Photonendichte von ca. 100 µM m-2s-1auf Erde (Einheitserde T, stark aufgedüngt,
Nachdüngen alle 2 Wochen mit Wuxal Top N 0,2%, Patzer GmbH & Co.KG, SinntalJossa, Deutschland) angezogen. Für den Einstich mit Mikroelektroden wurden 2-3 Wochen alte Pflanzen herangezogen.
2.1.3
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana Pflanzen, Ecotyp Columbia-0, wurden bei einer Belichtungsdauer
von 8h und einer Tag-/Nachttemperatur von 21°C/16°C in Klimakammern auf Pikiererde (Einheitserde Typ P, Patzer GmbH & Co.KG, Sinntal-Jossa, Deutschland oder
Laterra, Lauterbacher Kultursubstrat, Terreau Horticole, Deutschland) angezogen. Die
relative Luftfeuchte betrug ca. 80%. Die Beleuchtung erfolgte mit Philips Leuchtstoffröhren mit einer Photonendichte von ca. 100 µM m-2s-1. Zur Protoplastengewinnung
wurden ca. 6 Wochen alte Pflanzen verwendet.
2.2
Protoplastengewinnung
Um die Pflanzenzellen für Patch Clamp Experimente zugänglich zu machen, müssen
diese aus dem Zellverband herausgelöst und die Zellwand entfernt werden. Dies ge23
schieht mit Hilfe von Zellwand-abbauenden-Enzymlösungen. Die Enzymlösungen wurden nach der Herstellung für 10 min bei 100 x g zentrifugiert, um evtl. vorhandene
Schwebstoffe zu entfernen, aliquotiert und bei -18°C gelagert.
2.2.1
Mais-Nebenzellprotoplasten
Die Gewinnung von Nebenzell-Protoplasten erfolgte nach Majore et al. (2002) und
Wolf et al. (2005). Dazu wurde die untere Epidermis von ca. 8 Tage alten Maisblättern
in der folgenden Enzymlösung für ca. 110 Minuten bei 30°C inkubiert:
0,6% (w/v) Cellulase Onozuka RS (Serva, Heidelberg, Germany)
0,064% (w/v) Pectolyase Y-23 (Seishin Corp., Japan)
0,4% (w/v) Mazerozym R10 (Serva, Heidelberg, Germany)
0,8% (w/v) BSA (Serva, heidelberg, Germany)
0,4% (w/v) Polyvinylpyrrolidon (Sigma, München, Germany)
0,8 mM CaCl2
π = 530 mosmol kg–1 (D-Mannitol)
pH 6.5 HCl/KOH
Anschließend wurde der Ansatz zu erst durch ein mit Waschlösung (1 mM CaCl2, 5 mM
MES, pH 5,6, π = 530 mosm kg-1) befeuchtetes Nylonnetz mit 300 µM Maschenweite,
dann mit 50 µM Maschenweite mit Waschlösung gespült. Dann wurden die Protoplasten durch Zentrifugation (4°C, 12 min, 700 rpm/100 x g, ohne Bremse und ohne Beschleunigung) und Dekantieren des Überstands angereichert und bis zur Verwendung
auf Eis gelagert.
24
2.2.2
Mais-Schließzellprotoplasten
Zur Gewinnung von Schließzell-Protoplasten wurde die Enzymlösung für Nebenzellprotoplasten (Kapitel 2.2.1) mit folgender Enzymlösung im Verhältnis 1:1 gemischt:
2,5% (w/v) Cellulase Onozuka-RS (Yakult, Tokyo, Japan),
2% (w/v) Macerozyme Onozuka-R10 (Yakult, Tokyo, Japan),
0,026% (w/v) pectolyase Y-23 (Sigma-Aldrich, Deisenhof, Germany),
0,26% (w/v) bovine serum albumine,
1 mM CaCl2,
10 mM Hepes
pH 6,5/Tris
π = 310 mosmol kg–1 (D-Sorbitol)
In dieser Enzymlösung wurde die untere Epidermis von ca. 8 Tage alten Maisblättern
für ca. 180-210 Minuten bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz zu erst
durch ein mit Waschlösung (1 mM CaCl2, 5 mM MES, pH 5,6, π = 400 mosm kg-1) befeuchtetes Nylonnetz mit 300 µM Maschenweite, dann mit 50 µM Maschenweite mit
Waschlösung gespült. Abschließend wurden die Protoplasten wie oben beschrieben
aufkonzentriert.
2.2.3
Arabidopsis-Schließzellprotoplasten
Zur Isolierung von Arabidopsis thaliana-Schließzellprotoplasten wurde ein modifiziertes Übernachtprotokoll aus Pandey et al. (2002) verwendet. Um intakte Schließzellen
ohne intakte Mesophyll- und Epidermiszellen zu erhalten wurden etwa 10 Blätter von 68 Wochen alten Pflanzen für 2x 90 Sekunden in einem Mixer (MX32, Braun, Kronberg,
Deutschland) in eiskaltem Wasser zerkleinert. Durch den osmotischen Schock infolge
der Wasserbehandlung werden die dünnwandigen Mesophyll- und Epidermiszellen zum
25
größten Teil zerstört, während die Schließzellen die Behnadlung weitgehend unbeschadet überstehen. Die Blattfragmente wurden mit Hilfe eines 250 µM Nylonnetzes gesammelt und anschließend in folgende Enzymlösung überführt:
0,65% (w/v) Cellulase R10 (Serva, Heidelberg, Germany)
0,35% (w/v) Mazerozyme R10 (Serva, Heidelberg, Germany)
0,25% (w/v) BSA(Serva, Heidelberg, Germany)
0,4 M Sorbitol
0,05 mM KCl
0,05 CaCl2
5 mM Ascorbic Acid
0,05% (w/v) Kanamycin Sulfate
pH 5,5 (Tris/MES)
Die Lösung wurde 18 h bei 16-18 °C ohne Schütteln inkubiert. Am nächsten Morgen
wurde der Versuchsansatz ca. 60 min bei Raumtemperatur geschüttelt (50 U/min, Kreisschüttler 3005, GFL, Burgwedel Deutschland), um das Herauslösen der Protoplasten
aus den epidermalen Fragmenten zu begünstigen. Der Ansatz wurde mit Waschlösung
(1 bzw. 20 mM CaCl2, 5 mM MES, pH 5,6, π = 400 mosm kg-1) durch ein 50 µM Netz
gespült und anschließend wie unter 2.2.1. beschrieben aufkonzentriert.
2.3
Patch-Clamp-Technik
Die in Kapitel 2.2 gewonnenen Protoplasten wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit für Patch-Clamp-Analysen von Anionenkanälen herangezogen. Die Patch-Clamp
Technik wurde 1976 von Erwin Neher und Bert Sakmann entwickelt (Neher und
Sakmann 1976; Hamill et al., 1981). Für ihre Entdeckungen zur Funktionsweise von
26
Ionenkanälen in einzelnen Zellen erhielten sie 1991 den Nobelpreis für Physiologie oder
Medizin.
Mit Hilfe dieser Technik war es möglich die von Ionenkanälen generierten Ströme direkt zu erfassen. Je nach Messkonfiguration konnten Einzelkanalströme oder Ganzzellströme abgeleitet werden. Das Öffnen und Schließen der Ionenkanäle resultierte in einer
Änderung des über die Membran fließenden Stromes, welche aufgenommen und analysiert werden konnte. Mittlerweile ist nicht nur die Aufzeichnung von Kanalströmen,
sondern auch von Pump- (Hedrich et al., 1989) und Transporterströmen von Pflanzenzellen möglich (Schneider et al., 2008).
2.3.1
Messprinzip der Patch-Clamp-Technik
Bei Verwendung der Patch-Clamp-Technik wird eine Glasmikroelektrode mit einem
Spitzendurchmesser von ca. 1 µM unter optischer Kontrolle und Zuhilfenahme eines
Mikromanipulators auf die Zellmembran aufgesetzt (Abbildung 2.1). Durch leichte und
vorsichtige Unterdruckapplikation auf die Elektrode mittels eines Schlauchs, der mit der
Elektrode verbunden ist, erhöht sich der Abdichtwiderstand zwischen Membran und
Pipette bis in den Giga-Ohm-Bereich. Der Abdichtwiderstand entsteht durch den Anpressdruck der Elektrode gegen die Membran und trennt so das Innenmedium der Pipette vom Außenmedium im Bad. Die Zelle befindet sich nun in der „cell-attached“ Messkonfiguration. In dieser Konfiguration bleibt das Zytoplasma intakt, da die Plasmamembran nicht durchbrochen wird, d.h., alle zytosolischen Regulationsfaktoren und die
intrazellulären Ionenkonzentrationen bleiben weitgehend unbeeinflusst. So können im
Membranfleck unter der Elektrodenöffnung, dem sog. „patch“, Einzelkanalereignisse
aufgezeichnet werden, denen eine zytoplasmatische Signalkette vorausgeht. Ausgehend
von der „cell-attached“-Konfiguration wird bei der „inside-out“-Konfiguration, die Pipette vorsichtig von der Zelle abgezogen. Auf diese Weise lässt sich ein Membranstück
ablösen, ohne den Abdichtwiderstand zu zerstören. Die intrazelluläre Seite der Membran ist der Badlösung zugewandt und zytsolische Bestandteile werden komplett durch
27
die Badlösung ersetzt. Unter diesen Bedingungen lassen sich Einzelkanalströme aufzeichnen, bei denen die intra- und extrazellulären Bedingungen definiert werden können. Da hier die intrazelluläre Seite der Badlösung zugewandt ist, lassen sich deren Bedingungen während des Messvorgangs (durch Perfusion der Badlösung) ändern und
erlauben so z.B. eine Untersuchung der Einzelkanalströme vor und nach Zugabe von
Effektoren auf der cytosolischen Seite. Durch die sachte Applikation zusätzlicher Saugimpulse lässt sich ausgehend von der „cell-attached“-Konfiguration der Membranfleck
unter der Pipette kontrolliert zerstören und so die „whole-cell“ oder auch Ganzzellkonfiguration etablieren. Durch Diffusion kommt es nun zu einer Vermischung des
Pipetteninhaltes mit dem Zytosol, welches durch das wesentlich größere Volumen des
Pipetteninhalts schließlich durch die Pipettenlösung ersetzt wird. In diesem Fall ist die
gesamte Membranoberfläche einer Zelle der elektrischen Ableitung zugänglich, so dass
sich Ganzzellströme unter definierten Lösungsbedingungen aufzeichen lassen. Um in
der „outside-out“-Konfiguration arbeiten zu können, wird ausgehend von der Ganzzellkonfiguration, die Pipette von der Membran abgezogen. Das entfernte Membranstück
verbleibt in seiner ursprünglichen Orientierung und ist mit seiner extrazellulären Seite
der Badlösung zugwandt. Ähnlich der „inside-out“-Konfiguration können auch hier
Einzelkanalströme aufgezeichnet werden, nur dass hier die extrazellulären Bedingungen
während des Experiments geändert werden können. In der vorliegenden Arbeit wurde
ausschließlich in der Ganzzellkonfiguration gearbeitet.
28
Abbildung 2.1 Übersicht der verschiedenen Patch-Clamp-Messkonfigurationen (modifiziert
nach Hamill et al.,1981, Pflügers Archiv)
2.3.2
Aufbau des Patch-Clamp-Messplatzes
Der Patch-Clamp-Messplatz bestand aus einem schwingungsgedämpften Tisch. Dieser
war von einem Faraydayschen Käfig umgeben, um elektrostatische Einflüsse aus der
29
Umgebung größtmöglich zu minimieren. Auf dem Tisch war ein inverses Mikroskop
(IX50, Olympus, Hamburg, Germany) montiert, in dessen Mikroskoptisch eine Halterung für die Patch-Clamp-Messkammer integriert war. Um während der Messung konstante Ionenbedingungen zu gewährleisten wurde die Messkammer permanent mit Badlösung mit Hilfe zweier Peristaltikpumpen (Ismatec, Glattbrugg, Schweiz) durchspült.
Die Patch-Clamp-Elektrode wurde mit Hilfe eines Mikromanipulators von rechts an das
Messobjekt heran geführt. In der Messkammer befand sich zudem eine Referenzelektrode, deren Aufbau unter Kapitel 2.4.4 beschrieben wird. Zur Durchführung der Experimente wurde ein EPC7-Patch-Clamp-Verstärker (HEKA, Lambrecht, Deutschland)
verwendet. Das analoge Signal wurde durch einen low-pass Filter (NPI, Tamm, Germany) bei 2 kHz gefiltert. Das Signal wurde anschließend mit einem AD/DA-Wandler
(ITC-16, Instrutech Corp, Elmont, NY, USA) digitalisiert und mittels der Software
PULSE (HEKA, Lambrecht, Deutschland) auf einem Computer gespeichert. Verstärker,
Filter, Netzteil des Mikromanipulators und Computer befanden sich in einem Turm der
ausserhalb des Faradayschen Käfigs platziert war.
2.3.3
Patch-Clamp-Verstärker
Die Grundlage der Patch-Clamp-Technik war das in den 40er Jahren entwickelte Spannungsklemmverfahren von Kenneth Cole und George Marmount. Mit diesem Verfahren
wurde mit zwei Elektroden und einem Rückkopplungsverstärker das Membranpotential
von Zellen auf eine definierte Spannung gehalten („geklemmt“). Der Patch-ClampVerstärker stellt einen speziellen Typ von Rückkopplungsverstärker dar. Im Spannungsklemmenmodus werden dabei Ströme aufgezeichnet, indem Änderungen der angelegten Kommandospannung (Vcmd) registriert werden. Die Spannungsänderung wird
durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus kompensiert, indem ein entgegengesetzter Strom injiziert wird. Dieser Strom wird in den Messungen im Spannungsklemmenmodus dargestellt und aufgezeichnet. Mit dem Patch-Clamp-Verstärker können im Stromklemmenmodus ebenfalls Änderungen des Membranpotentials (Vm) auf30
gezeichnet werden. Hierfür wird der Verstärker so eingestellt, dass eine Stromklemme
erzeugt wird, damit kein Strom fließt und die Spannungsänderung aufgezeichnet wird.
Ein vereinfachtes Schaltbild eines Patch-Clamp-Vorverstärkers ist in Abbildung 2.3
dargestellt.
Abbildung 2.2 Elektrisches Schaltbild eines Patch Clamp Verstärkers. OPA: Operationsverstärker,
Rf: Rückkopplungswiderstand, Usoll: Kommando- oder Sollspannung, Upip:
Pipettenpotential, Uaus: Ausgangsspannung proportional zum Strom (Numberger Draguhn,
Spektrum Verlag, 1996. Mit freundlicher Genehmigung des Verlages.)
2.3.4
Mess- und Referenzelektroden
Als Mess- und Referenzelektroden wurden Silber/Silberchlorid-Elektroden verwendet.
Zur Herstellung wurde mit einem Silberdraht eine Elektrolysereaktion in 1M KCl
durchgeführt, wobei sich an der der Anode Silberchlorid abscheidet.
Cl‐ + Ag ↔ AgCl + e‐
Die Referenzelektrode wurde in einen gebogenen Polyvinylschlauch eingeführt, mit
3 M KCl befüllt und mit einem Agarpfropfen verschlossen (2% Agarose/3M KCl), um
den Austritt von zytotoxischen Silberionen und der konzentrierten KCl-Lösung zu verhindern. Die Messelektroden wurden aus Borsilikat-Hartglaskapillaren hergestellt (1,531
1,8 x 70 mm, Kimax-51, Kimble Products, Vineland, NJ, USA). Die Kapillaren wurden
an einem vertikalen Pipettenziehgerät (Narishige PP-83, Narishige Scientific Instruments, Tokyo, Japan) zu zwei sich verjüngenden Pipetten ausgezogen. Anschließend
wurden sie mit Hilfe einer Microforge Apparatur (Zeiss ID03, Zeiss, Jena, Deutschland)
bis kurz vor die Spitze mit einer hydrophoben Silikonmasse beschichtet(Sylgard© 184
silicon elastomer kit, Dow Corning Corporation, Midland, MI, USA), dann an einem
Platin-Iridium-Draht hitzepoliert und bis zum Gebrauch staubsicher verwahrt. Die hydrophoben Eigenschaften der Silikonmasse verhinderten einen Kontakt der Messelektrode mit der Badlösung und eliminerten bzw. limitierten so eine wesentliche Rauschquelle. Durch die Hitzepolitur, d.h. das vorsichtige Heranführen der Glaspitze der Elektrode
an einen erhitzten Platin-Iridium-Draht, wurde zum einen die Entgratung der Spitze
erreicht, um eine Penetration der Zellmembran bei Aufsetzen der Elektrodenspitze zu
vermeiden. Zum Anderen konnte durch die Hitzepolitur die Geometrie der
Pipettenspitze optimiert werden, um die Ausbildung eines Giga-Ohm-Widerstandes zu
unterstützen. Zur Befüllung der Messelektroden mit Pipettenlösung wurde zuerst die
Spitze der Elektrode ins Pipettenmedium getaucht und Unterdruck appliziert. Anschließend wurde die Pipette von der Rückseite mit Hilfe einer Einwegspritze mit aufgesetzter Kanüle zu 2/3 mit Pipettenlösung „aufgefüllt“. Vorhandene Luftblasen wurden durch
vorsichtiges „Schnippen“ mit dem Finger gegen die Glaselektrode entfernt.
2.3.5
Vorzeichenkonvention
Die in der Arbeit angegebenen Spannungen und Ströme wurden nach der Konvention
aus Bertl et al. „Electrical measurements on endomembranes“ (1992) durchgeführt. Per
Konvention gibt die Membranspannung (Vm) das elektrische Potential auf der
zytosolischen Membranseite relativ zur extrazellulären Seite an. Dabei wird das extrazelluläre elektrische Potential auf Null gesetzt. Ebenso werden die Ionenströme auf das
Zytosol bezogen. Dabei entspricht ein negativer Strom einem Einstrom von Kationen
32
ins Zytosol bzw. einem Ausstrom von Anionen aus dem Zytosol hinaus. Bei positivem
Strom kehren sich die Ionenflussrichtungen entsprechend um.
.
2.3.6
Umkehr- und Nernstpotential
Die Nernst-Gleichung beschreibt ein Gleichgewichtspotential („Nernst-Potential“),
durch welches der Konzentrationunterschied einer Ionensorte an einer selektiven
Membran exakt elektrisch kompensiert wird. Die quantitative Beziehung zwischen diesem Gleichgewichtspotential und den Konzentrationsverhältnissen der intra- und extrazellulären Ionen wird - in diesem Fall für einwertige Anionen - durch folgende Gleichung beschrieben:
Ex =
 [ X ]innen
R •T
• ln
F • zx
 [ X ]aussen



(Ex = Nernstpotential von x, R = Gaskonstante, zx = Wertigkeit eines Ions, F =
Faradaykonstante, T = absolute Temperatur, c[x] = Konzentration des Anions)
Das Umkehrpotential (Urev) entspricht der experimentell ermittelten Spannung, bei der
sich der Netto-Ein- und -Ausstrom von Ionen ausgleicht und demzufolge kein Strom
fließt. Anhand des Umkehrpotentials können Aussagen über die Selektivität der Membran getroffen werden, indem es mit dem Nernst-Potential des permeierenden Ions verglichen wird. Je näher das gemessene Umkehrpotential am errechneten Nernst-Potential
liegt, desto selektiver ist der Kanal für das entsprechende Ion.
33
2.3.7
Korrektur von Diffusionspotentialdifferenzen
Diffusionpotentiale können auftreten, sobald an Grenzflächen zwischen zwei Lösungen
unterschiedliche
Ionenverhältnisse
vorhanden
sind.
Bei
unterschiedlichen
Ionenmobilitäten führt dies somit zur Ausbildung von Diffusionspotentialen an der
Grenzfläche zwischen Pipetten- und Badlösung, sobald die Messelektrode in die Badlösung eintaucht. Diese Potentialdifferenzen wurden nach dem Eintauchen der Messelektrode in die Badlösung manuell am Verstärker abgeglichen. Da das Diffusionspotential
zwischen Messelektrode und Badlösung nach dem Aufsetzen der Pipette auf die Membran nicht mehr bestand, musste die Membranspannung nach der Messung um diese Differenz (Liquid-Junction-Potental, VLJP) korrigiert werden (Neher, 1992). Das LiquidJunction-Potential wurde experimentell nach Neher (1992) bestimmt und die Kommandospannung nach
Vm = Vcmd - VLJP
bei der Auswertung entsprechend korrigiert.
2.3.8
Spannungspulsprotokolle und Datenanalyse
Zur elektrophysiologischen Analyse der Protoplasten wurden verschiedene Spannungspulsprotokolle verwendet. Bei sog. Einfachspannungspulsprotokollen (Abbildung 2.4a)
wurden ausgehend von der Haltespannung VH verschiedene Testspannungen (VT) angelegt, um die Kanalaktivität sowohl quantitativ, als auch hinsichtlich der Aktivierung in
Abhängigkeit der Membranspannung untersuchen zu können. Bei sog. Doppelspannungspulsprotokollen (Abbildung 2.4b) wurde den verschiedenen Testspannungen ein
Vorpuls (VP) vorgeschaltet, mit dem möglichst viele Kanäle in den offenen Zustand
versetzt werden sollten. Dadurch war es möglich Aussagen bezüglich eines zeitund/oder spannungsabhängigen Deaktivierungsverhaltens des Kanals zu treffen.
34
Abbildung 2.3 (a) Darstellung eines Einfach-Spannungspulsprotokolls und (b) eines Doppelspannungspulsprotokolls (VH: Haltespannung; VT: Testspannung; VP:Vorpuls)
Zur Erstellung von Strom-Spannungskennlinien wurden die Gleichgewichtsströme kurz
vor Ende des Spannungspulses (Iss, steady-state) abgegriffen und gegen die angelegte
Spannung aufgetragen. Um die Ströme der einzelnen Messungen miteinander vergleichen zu können, wurden die Ganzzellströme auf die Membrankapazität (Cm) normiert.
Die Analyse der Rohdaten erfolgte mit dem Programm Pulse (HEKA Elektronik,
Lambrecht, Deutschland). Die Weiterverarbeitung der Daten wurde mit dem Programm
Igor Pro 5.0 (WaveMetrics, USA) durchgeführt.
2.4
Lösungen für Patch-Clamp-Messungen
In der Ganzzellkonfiguration stellt das Badmedium das extrazelluläre Medium und die
Pipettenlösung die intrazelluläre Lösung dar. Alle Badlösungen wurden, wenn nicht
anders angegeben, mit einem digitalen pH-Meter (Digital-pH-Meter 646, Knick) mit
MES/Tris auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt. Die Pipettenlösungen für Versuche an
Maisprotoplasten wurden mit Hepes/Tris auf einen pH-Wert von 7,4, bei Arabidopsis
thaliana auf pH 7,1 eingestellt. Die Osmolarität wurde mit Hilfe eines Osmometers
(Vapor Pressure Osmometer 5520, Wescor, Vapro) bei Zea mays stets mit Mannitol, bei
Arabidopsis mit Sorbitol eingestellt. Die freie zytosolische Kalziumkonzentration wurde
mit
Hilfe
des
Programms
WEBMAXC
STANDARD
(www.stanford.edu/~cpatton/webmaxcS.htm) bestimmt.
35
2.4.1
Badlösungen
Mais Nebenzelle
Mais Schließzelle
40 mM CaCl2
40 mM CaCl2
0,5 mM LaCl3
0,5 mM LaCl3
10 mM MES
10 mM MES
π = 540 mosm kg-1
π = 400 mosm kg-1
Der Anionenkanalblocker NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoic acid) wurde
in Ethanol gelöst und aus einer 100 mM Stocklösung täglich frisch dem Badmedium in
einer Endkonzentration von 50 µM dazugegeben. Die finale Ethanolkonzentration betrug 0,05%.
Arabidopsis Badlösungen:
Die Osmolarität betrug bei allen Badlösungen stets π = 400 mosm kg-1.
“CPK23”
“OST1”
“Slac/Slah Nitrat”
30 mM CsCl
30 mM CsCl
30 mM NaNO3
2 mM MgCl2
2 mM MgCl2
2 mM Mg(NO3)2
1 mM CaCl2
1 mM CaCl2
1 mM Ca(NO3)2
0,5 mM LaCl3
0,5 mM LaCl3
0,5 mM LaCl3
“SLAH3-
“ALMT12”
Nitrataktivierung”
5 mM CaCl2
20 mM Ca(OH)2 + 20 mM Apfelsäure
0,5 mM LaCl3
bzw.
2 mM MgCl2
20 mM Ca(Gluc)2 + 20 mM Cs2SO4
± 3 mM NaNO3
2 mM MgCl2
36
2.4.2
Pipettenlösungen
Die Pipettenlösungen für Patch Clamp Messungen an Maisprotoplasten wurden für Nebenzellen auf π = 560 mosm kg-1 und für Schließzellen auf π = 440 mosm kg-1 eingestellt. Den Pipettenlösungen für Experimente an Maiszellen wurde frisch aus einer
0,5 M Tris-Stocklösung jeweils 5 mM Mg-ATP und 5 mM Tris-GTP zugegeben. Da
sich durch die zusätzliche Tris-Zugabe aus der Stocklösung der pH-Wert ändern kann,
wurde der pH-Wert anschließend nochmals überprüft und gegebenenfalls justiert. ABA
wurde in Isopopanol gelöst und aus einer 10mM Stocklösung hinzugefügt. Kontrollen
enthielten die gleiche Menge Isopropanol (finale Ethanolkonzentration = 0,1%). Zur
Alkalisierung der Pipettenlösung auf pH 8,4 wurde Hepes durch Trizma ersetzt. Alle
Pipettenlösungen wurden vor der Verwendung in Experimenten sterilfiltriert.
„[0 nM]zyt.frei Kalzium“
“[100 nM]zyt.freiKalzium”
“[390 nM]zyt.freiKalzium”
150 mM TEA-Cl
143 mM TEA-Cl
137 mM TEA-Cl
10 mM EGTA
10 mM EGTA
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
2 mM MgCl2
2 mM MgCl2
3,5 mM CaCl2
6,5 mM CaCl2
Pipettenlösungen für Messungen an Arabidopsis Schließzellprotoplasten wurden immer
auf π = 440 mosm kg-1 eingestellt.
„CPK 23“
„OST1“
150 mM TEA-Cl
150 mM TEA-Cl
2 mM MgCl2
2 mM MgCl2
5 mM Mg-ATP
5 mM Mg-ATP
5 mM Tris-GTP
5 mM Tris-GTP
6,7 mM EGTA
10 mM EGTA
5,86 mM CaCl2 ([Ca2+]zyt.frei = 2 µM)
3 mM CaCl2 ([Ca2+]zyt.frei = 110 nM.)
37
„slac/slah Nitrat“
“ALMT12”
150 mM NaNO3
75 mM Cs2SO4
6,7 mM EGTA
5 mM EGTA
2 mM Mg(NO3)2
4,2 mM CaCl2 ([Ca2+]zyt.frei = 1 µM)
2 mM CaCl2 ([Ca2+]zyt.frei = 2 µM)
5 MgATP
3,86 mM Ca(NO3)2
5 mM Mg-ATP
5 mM Tris-GTP
2.5
Einstichelektroden-Technik
Um das Membranpotential und/oder Änderungen im zytosolischen Ca2+-Spiegel und
des pH-Wertes intakter Schließ- und Nebenzellen von Mais- und Gerstenpflanzen zu
untersuchen, wurde die Einstichelektroden-Technik verwendet. Dabei wurde mit einoder zweikapillarigen Mikroelektroden in die intakte Zelle eines Stomakomplexes einer
ganzen Pflanze eingestochen. Hierzu wurde der Pflanztopf mit Hilfe eines Stativs neben
der Messaparatur platziert und die zu untersuchenden Blattareale unter dem Mikroskop
fixiert. Anschließend konnte entweder im Spannungsklemmenmodus Ströme abgeleitet,
oder im Stromklemmenmodus das freilaufende Membranpotential aufgezeichnet werden. Darüber hinaus konnten ionensensitive Fluoreszenzfarbstoffe mittels Iontophorese
ins Zytoplasma injiziert werden.
38
2.5.1
Messprinzip der Einstichelektroden-Technik
Ziel der Spannungsklemmen-Technik ist es, die Spannung konstant zu halten und die
dazu notwendigen Kompensationsströme zu messen. Um dies zu bewerkstelligen, ist im
Vorverstärker ein Schaltkreis eingebaut, der einen so genannten Strom-SpannungsWandler darstellt. Das wichtigste Element des Strom-Spannungs-Wandlers ist der Operationsverstärker OPA (für operational amplifier). Operationsverstärker haben zwei
Eingänge und einen Ausgang, der dazu dient, das elektrische Potential an den beiden
Eingängen immer gleich zu halten.
Der Messverstärker A1 misst das Membranpotential Vm. Aufgrund seines hohen Eingangswiderstandes (Übergangswiderstand Re1 an der Elektrode) erfolgt diese Messung
nahezu stromlos. Die Spannung wird an den Operationsverstärker A2 weitergeleitet, der
Vm mit der vorgegebenen Kommandospannung Vc (für command) vergleicht und die
Differenzspannung Vo (für output) mit der Verstärkung µ in einen Strom umwandelt.
Dieser Strom wird über den Eingangswiderstand Re2 der Elektrode 2 in die Zelle injiziert, wobei durch Aufladen der Membrankapazität Cm solange eine Spannungsänderung induziert wird, bis Vc erreicht ist. Im Stromklemmenmodus wird der Strom durch
die Membran fest vorgegeben, während das Potential variabel gelassen wird. Dazu
nimmt der Messverstärker das Membranpotential Vm auf und gibt dieses an einen Eingang des OPA weiter. Der andere Eingang des OPA ist geerdet (0 mV). Jede Ungleichheit des Potentials am Messverstärker verursacht automatisch eine Ungleichheit der
Potentiale am OPA. Da der OPA dafür sorgt, dass ein Eingang des Messverstärkers
immer das Potential der Messelektrode beibehält, ist gewährleistet, dass immer die
Membranspannung gemessen wird. Strom könnte nur dann durch die Messelektrode
fließen, wenn das Potential der Elektrode einen anderen Wert als das Membranpotential
hätte. Da beide Potentiale des Messverstärkers aber ständig abgeglichen werden, fließt
kein Strom.
39
Abbildung 2.4 Schema des Zwei-Elektroden-Spannungsklemmenverfahrens
Vc: Kommandospannung, V1: gemessene Spannung, Vo: Differenzspannung mit Verstärkung µ,
A1: Eingangsverstärker, A2: Differenzspannungsverstärker, Cm: Membrankapazität, Rm:
Membranwiderstand, Vm: Membranpotential, Re1/2: Elektrodenwiderstände (aus Voltage and
patch clamping with microelectrodes, Finkel & Gage, American Physiological Society, 1985)
2.5.2
Aufbau des Einstichelektroden-Messplatz
Die Einstichelektroden-Messapparatur bestand aus einem aufrechten Mikroskop
(Axioskop 2, Zeiss, Jena, Deutschland), welches auf einem schwingungsgedämpften
Tisch montiert und von einem Faraday-Käfig umgeben war. In den Mikroskoptisch war
eine Halterung für einen Plexiglasschlitten eingearbeitet, an dem vor der Messung ein
Blatt der intakten Pflanze mit doppelseitigem Klebeband aufgeklebt wurde, wobei die
Blattunterseite nach oben zeigte. Der Mikromanipulator (MM3A-LS, Kleindiek Nanotechnik, Reutlingen, Deutschland) war am Mikroskoptisch angebracht, um Verschiebungen zwischen Mikroelektroden und Präparat zu verhindern. Der Mikromanipulator
wurde über einen Nanomotor (Nanocontrol C-2-2-A, Kleindiek Nanotechnik, Reutlingen, Deutschland) bewegt und über zwei Analogsticks (Analogcontroller, Sony, Köln,
Deutschland) angesteuert.
Die Vorverstärker der Strom- und der Spannungselektrode (HS-2 X0.01, Axon Instruments, Foster City, USA) befanden sich in der Nähe des Mikromanipulators und wur40
den durch eine Ag/AgCl-Halbzelle und mit einem dünnen Kupferdraht an die Vorverstärker angeschlossen. Die übrigen Komponenten des Messplatzes setzten sich aus einem Verstärker (Geneclamp 500, Axon Instruments, Foster City, USA), einem Analog/Digital(A/D)-Wandler (ITC-16, Instrutech Corp., Elmont, USA), und einem Schreiber zur analogen Datenausgabe (LKB Bromma 2210 Recorder/2-channel, Stockholm,
Sweden) zusammen und waren ausserhalb des Faradayschen Käfigs platziert. Mit Hilfe
des Analog/Digital-Wandlers wurden die Daten zusätzlich auf einem Computer gespeichert. Auf die Komponenten der Fluoreszenzspektroskopie, die zusätzlich zur EinstichElektroden-Technik eingesetzt wurden, wird im Kapitel 2.6 gesondert eingegangen.
ro-
rker
2.5.3
Einstich- und Referenzelektroden
Ein-,
zweikapillarige
Messelektroden
und
Referenzelektroden
wurden
aus
Borsilikatglaskapillaren von 1 mm Durchmesser (Nr. 1403547, Wandstärke 0,21 mm,
und Nr. 1405201, Wandstärke 0,125; Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Deutschland) hergestellt. Die Messelektroden wurden elektronisch mit den Vorverstärkern und die Referenzelektrode mit dem Erdleiter über sog. Halbzellen verbunden. Diese bestanden aus
einem Polyvinylschlauch in den überstehend ein 30 mm langer Silberdraht mit Zweikomponenten-Epoxidharz-Kleber (UHU plus schnellfest, UHU GmbH, Bühl, Deutschland) fixiert wurde. Das Drahtende wurde mit einem Kupferdraht verlötet, an dem ein
Stecker angebracht war, der in den Vorverstärker eingesteckt werden konnte. Die Chlorierung des Silberdrahtendes erfolgte wie für die Patch-Clamp-Experimente in Kapitel
2.4.4 beschrieben.
Die Referenzelektrode wurde mit 300 mM KCl gefüllt, auslaufsicher mit einem
Agarpropfen (2% Agarose/300 mM KCl) verschlossen und in der Immersionslösung
(5 mM KCl, 5 mM K-Citrat, 100 nM CaCl2, pH 6) platziert, die sich zwischen Präparat
und Objektiv (40x Acroplan, Zeiss, Jena, Deutschland) befand.
Zur Herstellung von einkapillarigen (single-barrelled) Glasmikroelektroden wurden
Borsilikatglaskapillaren in den horizontalen Laserpuller P-2000 (Sutter Instrument Co.,
41
Novato, USA) eingespannt und mittels entsprechender Programme zu stark zugespitzten
Glaskapillaren ausgezogen. Einkapillarige Elektroden wurden für die Aufzeichnung des
Membranpotentials im Stromklemmenmodus eingesetzt. Zweikapillarige (doublebarrelled) Mikroelektroden wurden u.a. für die iontophoretische Applikation von Fluoreszenzfarbstoffen, sowie zur Ableitung von Strömen im Spannungsklemmenmodus
verwendet.
Dafür
wurden
zuerst
zwei
Glaskapillaren
in
einem
vertikalen
Pipettenziehgerät (L/M-3P-A, List-electronic, Darmstadt/Eberstadt, Germany) miteinander verdrillt. Die verdrillten und verjüngten Kapillaren wurden nun in den horizontalen Laserpuller P-2000 (Sutter Instrument Co., Novato, USA) eingespannt, so dass die
dünnste Stelle der Verjüngung im Fokus des Laserstrahls lag. Durch Aktivieren des
Laserstrahls wurden die verdrillten Kapillaren zu Pipetten ausgezogen. Die Messelektroden
wurden
für
Stromableitungen
und
Aufzeichnungen
des
freilaufenden
Membranpotentials mit 300 mM KCl vom hinteren Ende der Kapillare mit Hilfe einer
Spritze und einem dünnen Kunststoffschlauch befüllt. Für fluoreszenzspektroskopische
Experimente wurden zuerst die Spitze der Elektrode mit dem Farbstoff mit Hilfe eines
dünnen Kunststoffschlauchs befüllt und der Rest der Elektrode mit 300 mM KCl aufgefüllt. Die Filamente in den Glaskapillaren gewährleisteten ein luftblasenfreies Befüllen.
Die Analyse der Rohdaten erfolgte mit dem Programm Pulse (HEKA elektronik,
Lambrecht, Deutschland). Die Weiterverarbeitung der Daten wurde mit dem Programm
Excel (Microsoft, Unterschleißheim, Deutschland) durchgeführt.
2.6
Fluoreszenzspektroskopie
Durch den Einsatz fluoreszierender Farbstoffe ist es möglich, intrazelluläre Prozesse
und Strukturen sichtbar zu machen. Die Chromophore der entsprechenden Farbstoffe
sind in der Lage Photonen bestimmter Wellenlängen zu absorbieren und somit in einen
Zustand höherer Energie zu übergehen. Bei der Rückkehr vom angeregten Zustand in
den ursprünglichen energetischen Zustand wird Licht emittiert (Fluoreszenz). Das emit42
tierte Licht ist meist langwelliger als das absorbierte Licht. Aufgrund dieses Unterschiedes im Absorptions- und Emissionsmaximum, lässt sich die emittierte Fluoreszenz
des Indikatormoleküls mit Hilfe eines optischen Filtersystems detektieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde der pH-sensitive Farbstoff BCECF ([2‘,7‘-bis-(2carboxyethyl)-5(and6)carboxyflurescein])
zur
Detektion
zytosolischer
pH-Wert-
Änderungen, verwendet. Der Farbstoff ist fähig reversibel Protonen zu binden und zeigt
infolgedessen eine pH-abhängige Fluoreszenzintensität, wenn er mit Licht der Wellenlänge 470 nm angeregt wird. Wird der Farbstoff mit Licht der Wellenlänge 440 nm angeregt, ist die Fluoreszenzintensität unabhängig vom pH-Wert (Abbildung 2.5). Die
Emissionswellenlänge des Farbstoffs beträgt 535 nm.
Abbildung 2.5 pH-abhängiges Anregungsspektrum des Fluoreszenzfarbstoffs BCECF. Die
zehnfache Vergrößerung des Bereichs unterhalb von 470 nm zeigt den isobestischen Punkt bei
439 nm (Em: Emmissionspektrum).
Für die Anregung des Chromophors wurde ein Visichrome Highspeed PolychromatorSystem (Visitron Systems GmbH, Puchheim, Deutschland) verwendet, der mit einem
Lichtleiter mit dem Mikroskop verbunden war. Die Ansteuerung, sowie die Datenaufnahme des Systems erfolgte mit der Software METAFLUOR (Universal Imaging,
Downington, PA, USA). Der Farbstoff wurde mit 200 ms-langen Lichtblitzen mit einem
Intervall von einer Sekunde bei einer Wellenlänge von 440 nm und 470 nm angeregt.
Die emittierte Fluoreszenz wurde mit einem 495 nm Bandpass-Filter (D510-40M, AF
Analysentechnik, Tübingen, Deutschland) gefiltert und mit einer gekühlten CCD
(Charge-coupled device)-Kamera, welche auf dem Okularstutzen montiert war, aufge43
nommen und auf einem Computer gespeichert. Bei allen Messungen wurde eine
Substraktion der Hintergrundfluoreszenz vorgenommen, indem Regionen in Nähe der
Zellen bei beiden Wellenlängen mit aufgezeichnet wurden. Anschließend wurden die
aufgezeichneten Fluoreszenzsignale ratiometrisch verarbeitet, indem der Quotient aus
den pH-unabhängigen und pH-abhängigen Intensitätswerten des Fluoreszenzsignals
gebildet wurde. Durch das Verhältnis der beiden Fluoreszenzintensitäten ließen sich
Aussagen über Änderungen des zytosolischen pH-Wertes treffen, die unabhängig von
der Konzentration des Farbstoffs in der Zelle waren.
2.7
3D Modelle
Um die Volumenverhältnisse von Schließ- und Nebenzellen im Stomakomplex während
der Stomabewegung berechnen zu können, wurden 3D-Modelle am Computer konstruiert. Dazu wurde die untere Epidermis von Zea mays Blättern mit Hilfe einer Uhrmacherpinzette entfernt und für 10-15 min in 300 µM Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA)
und/oder
20
µM
FM4-64
([N-(3-trieethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-
(diethylamino)phenyl)hexatrienyl) pyridinium dibromide], Invitrogen, Molecular
Probes, USA) inkubiert. Das hydrophile CFDA färbt das Zytosol intakter Zellen an,
während der lipophile Farbstoff FM4-46 nur die Plasmamembranen anfärbt. Der Einsatz
beider Farbstoffe erlaubte eine gute optische Unterscheidung des Zytosols von der
Plasmamembran. Anschließend wurden die Präparate mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen und auf einem Objektträger platziert. Mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop (LSM Pascal 5, Zeiss, Jena, Deutschland) wurden nun sog.
z-Bilderstapel („multiple picture Stacks“) angefertigt, d.h. es wurden Aufnahmen des
Präparates in mehreren Schnittebenen abgelichtet. Diese Bilder wurde mit der Software
AMIRA (Mercury Computer Systems Inc., USA) im Anschluss offline bearbeitet und
so 3D-Modelle des Stomakomplexes zur Abschätzung der Zellvolumina konstruiert.
Um die Stomata in einen geschlossenen oder offenen Zustand zu versetzen, wurden die
44
Epidermisstreifen vor dem Färbevorgang lichtdicht abgedeckt oder mit einer Lampe
belichtet. Als „offen“ wurden Stomata bewertet, wenn die Poren weit offen und der
stomatäre Spalt deutlich zu sehen war (siehe auch Abbildung 1.2, rechtes Bild). Als
„geschlossen“ wurden Aufnahmen gewertet, wenn keine Pore zu erkennen war und der
stomatäre Spalt als Linie erschien (siehe auch Abbildung 1.2, linkes Bild).
45
ERGEBNISSE
3
Ergebnisse
Stomata sind durch die Regulationsfähigkeit ihrer Öffnungsweite essentiell für den
pflanzlichen Gasaustausch und die Regulation der Transpiration. Die Reize, die zu ihrer
Öffnung und Schließung führen, können von den beteiligten Zellen wahrgenommen
werden und führen zu Ionenflüssen, die letztendlich in der Bewegung der Stomata resultieren. Die Forschung der letzten Jahre führte zur Identifikation von vielen Regulationsfaktoren, die an der Reizperzeption und Signalverarbeitung beteiligt sind. Das Zusammenspiel dieser Faktoren ist bis heute aber noch lückenhaft. Vor allem die Rolle der
spezialisierten Nebenzellen im Spaltöffnungsapparat des Gramineentyps ist noch weitgehend ungeklärt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals Plasmamembranständige Anionenkanäle in Neben- und Schließzellen von Zea mays identifiziert und
elektrophysiologisch mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik charakterisiert. Desweiteren
wurde die Einstich-Elektroden-Technik eingesetzt, um die Regulationsmechanismen
eines koordinierten Ionenflusses zwischen Schließ- und Nebenzellen im intakten Gewebe während der Stomabewegung besser verstehen zu können.
Im Gegensatz zu Mais ist in Arabidopsis thaliana vor allem die Erfoschung des ABAinduzierten Stomaschlusses bereits weit vorangeschritten. Einen frühen und essentiellen
Schritt des ABA-induzierten Stomaschlusses stellt die Depolarisation der Plasmamembran dar, die durch S- und R-Typ-Anionenkanäle verursacht wird. Mit Hilfe von PatchClamp-Analysen an isolierten Schließzellprotoplasten wurden daher einerseits die molekularen Mechanismen, die zur Aktivierung der S-Typ-Anionenströme führen, untersucht. Andererseits wurden die Eigenschaften des R-Typ-Anionenkanals in A. thaliana
erstmals elektrophysiologisch heraus gearbeitet, um dann einen tieferen Einblick in zu
Grunde liegenden genetischen Komponenten zu erlangen.
46
ERGEBNISSE
3.1
Fluoreszenz- und elektrophysiologische Messungen an Zellen im
intakten Gewebe
3.1.1
Bestimmung der Zellvolumina intakter Zea mays Neben- und Schließzellen
Frühere Untersuchungen konnten einen entgegengesetzten Kalium- und Anionengehalt
in Schließ- und Nebenzellen bei geschlossenen bzw. geöffneten Stomata aufzeigen. Bei
geöffneten Stomata akkumulieren die Ionen vor allem in der Schließzelle, während sich
die Verhältnisse bei geschlossenen Stomata umkehren und die Ionen vor allem in den
Nebenzellen vorliegen (Raschke und Fellows 1971; Lasceve et al., 1987). Die Dynamik
dieses Prozesses während der Stomabewegung konnte erstmals mit Hilfe kaliumsensitiver Elektroden erfasst werden (Hilgarth, E.M, Diplomarbeit 2005; Uni Würzburg). Dabei änderte sich der zytosolische Kaliumgehalt in den Nebenzellen um ca. 10 mM während der Licht/Dunkel-induzierten Stomabewegung. Dies spricht dafür, dass Nebenzellen während der Stomaöffnung Kaliumionen entlassen, die wiederum von den Schließzellen aufgenommen werden. Während des Stomaschlusses werden die Kaliumionen
von den Schließzellen an den Apoplasten abgegeben und können von dort wieder von
den Nebenzellen aufgenommenwerden.
In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, inwiefern diese Änderungen in
der zytosolischen Nebenzell-Kaliumaktivität in Zusammenhang mit den Volumenänderungen der Schließzellen während der Stomabewegung stehen. Zu diesem Zweck wurden die Volumina von Schließ- und Nebenzellen geöffneter und geschlossener Stomata
ermittelt, indem das Zytosol von den Zellen in Mais-Epidermisstreifen mit Hilfe des
fluoreszierenden, hydrophilen Farbstoffs Carboxyfluoresceindiacetat angefärbt wurde.
Da die normalen Epidermiszellen, nicht aber die Zellen des Stomakomplexes beim Abziehen der Epidermis zerstört werden (Majore et al., 2002), wurden mit
Carboxyfluoresceindiacetat keine Epidermiszellen, wohl aber intakte Neben- und
Schließzellen angefärbt (Abbildung 3.2a). Am konfokalen Laser Scanning Mikroskop
(LSM) wurden die angefärbten Präparate daraufhin in mehreren Schnittebenen abgelichtet und die resultierenden Bilderstapel für die Konstruktion von 3-dimensionalen
Modellen des Zelllumens herangezogen, die nachfolgend eine Abschätzung des Zellvolumens erlaubten. Bei geöffneten Stomata ließ sich so ein Volumen des Zelllumens von
47
ERGEBNISSE
2.69 ± 1.20 pl pro Schließzellpaar (n=7) und 1.95 ± 0.82 pl (n=88) für den geschlossegeschloss
nen Zustand interpolieren. Bei Nebenzellen wurden im geschlossenen (11.27 ± 3.52 pl,
n=88) und im geöffneten (11.29 ± 5.91 pl, n=7) Zustand ähnliche Volumina pro Paar
errechnet. Dadurch ergibt sich ein Volumenverhältnis von
vo Schließ- zu Nebenzellen im
geöffneten Zustand von ca. 1:4 und von ca. 1:6 für geschlossene Stomata. Unter der
Annahme, dass sich die zytosolische Kaliumaktivität in Nebenzellen um 10 mM wähwä
rend der Stomabewegung ändert (Abbildung 3.2) und die entlassenen K+-Ionen von den
Schließzellen aufgenommen bzw. abgegeben werden, würden diese VolumenVolumen
Verhältnisse auf eine Kaliumkonzentrationsänderung von 40-60
40 60 mM in den SchließzelSchließze
len hinweisen.
Abbildung 3.1 Volumenbestimmungen
enbestimmungen von NebenNeben und Schließzellen (a) LSM-Aufnahmen
von geöffneten und geschlossenen Stomata von Zea mays Epidermisstreifen. Das Zytosol wurde
mit Carboxyfluorescindiacetat angefärbt.
angefärbt (b) Repräsentatives 3D-Modell,
Modell, welches auf der Basis
der z-Bilderstapel
derstapel rekonstruiert wurde. Das Zelllumen der Schließzellen ist in rot, das der NeN
benzellen in Ocker dargestellt.
dargestellt
48
ERGEBNISSE
3.1.2
Stromableitungen von intakten Zea mays Neben- und Schließzellen
Mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik wurden in Schließ- und Nebenzellen bereits zwei
Populationen von spannungsabhängigen, K+-selektiven Kanälen nachgewiesen (FairleyGrenot et al., 1992; Majore et al., 2002). Darüber hinaus konnte in der vorliegenden
Arbeit die Anwesenheit von spannungsunabhängigen Anionenkanälen in beiden Zelltypen aufgezeigt werden (Kapitel 3.2.1 und 3.2.2). Um nun Hinweise auf die Regulationsmechanismen des gegenläufigen Transports von K+-Ionen und Anionen in vivo zu
erhalten, wurde die Einstichelektrodentechnik an intakten Neben- und Schließzellen von
Maispflanzen eingesetzt.
Hierzu wurden zweikapillarige Glasmikroelektroden über die geöffneten Stomata im
Licht in den stomatären Spalt eingeführt. Für einen Einstich in die Schließzellen waren
die Elektroden parallel zum Spalt, für einen Einstich in die Nebenzellen im rechten
Winkel zum Porenverlauf orientiert. Durch eine vorsichtige Vorwärtsbewegung der
Elektrodenspitze an und schließlich durch die Zellwand wurde ins Zytosol eingestochen. Um eine tatsächliche Lokalisation der Spitze im Zytosol nachzuweisen, wurde der
Farbstoff BCECF injiziert (Abbildung 3.2a und b). Bei Einstich in die Schließzellen
konnte im Zytosol der hantelförmigen Enden ein Fluoreszenzsignal detektiert werden
(Abbildung 3.2a). Bei Einstich in die Nebenzellen ließ sich ebenfalls gut erkennen, dass
der Farbstoff ausschließlich im Zytosol lokalisiert war, während die Vakuole kein Fluoreszenzsignal erzeugte. Um das elektrische Verhalten von Protoplasten und Zellen im
intakten Gewebe vergleichen zu können, wurden im Spannungsklemmenmodus Ganzzellströme abgeleitet. Das Haltepotential wurde dabei so gewählt, dass bei Anlegen der
Haltespannung kein Strom floss. Anschliessend wurden depolarisierende und hyperpolarisierende Spannungspulse in 20 mV-Schritten von -160 mV bis +40 mV bei Schließzellen bzw. von -180 mV bis +20 mv bei Nebenzellen appliziert, und die Stromantworten aufgezeichnet (Abbildung 3.2c und d). Während bei Schließzellen eine langsame
Stromzunahme mit sigmoidem Verlauf bei depolarisierenden (positiv werdender) Spannungen zu beobachten war (Abbildung 3.2c), wurden bei hyperpolarisierenden Spannungen schnell relaxierende Einwärtsströme induziert. Bei Rückkehr der Spannung zum
Haltepotential war eine exponentielle Stromabnahme zu erkennen, die auf die Deaktivierung der Kanäle zurückzuführen war. Bei Nebenzellen hingegen waren sowohl bei
49
ERGEBNISSE
positiven Spannungen bis +40 mV als auch bei negativen Spannungen bis -160 mV nur
große, instantane Ströme zu beobachten (Abblildung 3.2d), die keine Zeitabhängigkeit
aufwiesen. Bei Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegten Spannungen
ergab sich bei Schließzellen so eine nicht-lineare Stromspannungskennlinie, während
die der Nebenzellen eine lineare Abhängigkeit aufwies (Abbildung 3.2f). Während die
spannungsabhängige Strom-Spannungskennlinie gut die in Schließzellprotoplasten beschriebenen Kaliumkanäle (Fairley-Grenot et al., 1992; Wolf et al. 2005) repräsentiert,
unterscheiden sich die in Nebenzellprotoplasten aufgezeichneten Ströme (Majore et al.,
2002) grundlegend von den Strömen, die hier im intakten Gewebe aufgezeichnet wurden. Da das Anlegen einer Spannungsklemme bei intakten Nebenzellen nicht möglich
war, spricht dies dafür, dass hier keine elektrisch isolierten Zellen vorliegen.
Abbildung 3.2 Einstichelektrodenmessungen an Neben- und Schließzellen im Spannungsklemmenmodus. Fluoreszenzaufnahmen von intakten Schließ- (a) und Nebenzellen (b) von Zea
mays nach Einstich mit einer zweikapillarigen Messelektrode und Beladung des Zytosols mit
dem fluoreszenzfarbstoff BCECF. (c) und (d) Makroskopische Ganzzellströme einer Schließzelle (c) und einer Nebenzelle (d), die im angegeben Spannungsbereich in 20 mV-Schritten aufgezeichnet wurden. (e) und (f) Stromspannungskennlinie der Gleichgewichtsströme aus (c) und
(d) aufgetragen gegen die Spannung.
50
ERGEBNISSE
3.1.3
Änderungen des freilaufenden Membranpotentials während der
Stomabewegung bei Zea mays
Majore et al. (2002) konnten in Patch-Clamp-Experimenten zeigen, dass in Nebenzellprotoplasten spannungsabhängige Kaliumkanäle existieren. Da das Anlegen einer Spannungsklemme in intakten Nebenzellen nicht möglich war, konnten die Ganzzellströme
in intakten Nebenzellen leider nicht abgeleitet und in vivo untersucht werden.
Vorraussetzung, dass diese spannungsabhängigen Kaliumkanäle für die Kaliumbewegungen verantwortlich sein könnten, ist eine Änderung des Membranpotenials während
der Stomabewegung. Daher wurde im Stromklemmenmodus das freilaufende
Membranpotential von Nebenzellen aufgezeichnet, indem mit einkapillarigen Mikroelektroden in intakte Zellen eingestochen wurde. Da der Einstichvorgang immer zu einer Verletzung der Zelle und einer Irritation des Membranpotentials führt, wurde nach
dem Einstich der Messelektrode so lange gewartet, bis sich ein stabiles Ruhepotential
von etwa -70 mV einstellte. Erst danach wurde das Licht als Auslöser für den
Stomaschluss ausgeschaltet und gleichzeitig die Änderung des freilaufenden
Membranpotentials registriert. So führte eine Überführung von Nebenzellen aus dem
Licht in die Dunkelheit zu einer transienten Hyperpolarisation von etwa -25 mV, welche
das Maximum nach etwa 20 Sekunden erreichte (Abbildung 3.3). Anschließend depolarisierte das Membranpotential transient und erreichte seinen Höhepunkt etwa
2,5 Minuten nach dem Dunkelstimulus. Im Gegenzug führte ein Lichtstimulus zu einer
sofortigen transienten Depolarisation, die ihren Maximalwert nach ca. 2 Minuten erlangte. In Schließzellen von Mais sind ebenfalls ähnlich spannungsabhängige Kaliumkanäle in Patch-Clamp-Experimenten nachgewiesen worden (Fairley-Grenot et al.,
1992). Es wurden daher in Analogie zu den Nebenzellen ebenso Einstichelektrodenmessungen an Schließzellen im Stromklemmenmodus durchgeführt. Allerdings befanden
sich die Schließzellen fast ausschließlich im depolarisierten Zustand und reagierten
nicht auf die applizierten Licht/Dunkel-Reize. Dieses Verhalten, das auch bei
Arabidopsis Schließzellen zu finden ist (persönliche Mitteilung von PD Dr. R.
Roelfsema, Universität Würzburg), ist wahrscheinlich auf die geringe Zellgröße und die
damit verbundenen nachhaltige Störung der Zellphysiologie beim Elektrodeneinstich
zurückzuführen. So gelang es leider nur in einem Fall (von insgesamt ca. 45 Experimen51
ERGEBNISSE
ten) das freilaufende Membranpotential während der Stomabewegung von intakten
Maisschließzellen aufzuzeichnen. Dabei wurde eine langanhaltende Hyperpolarisation
als Reaktion auf einen Lichtreiz beobachtet (Abb. 3.3b). Eine ähnliche Licht-induzierte
Änderung im freilaufenden Membranpotential wurde im Rahmen dieser Arbeit bei Experimenten an intakten Gerstenschließzellen festgestellt (Kapitel 3.1.4.1, Abbildung
3.5).
Abbildung 3.3 Änderungen im freilaufenden Membranpotential in intakten Nebenzellen (a) und
Schließzellen (b) von Zea mays als Antwort auf einen Lichtstimulus (weißer Balken) oder eine
Dunkelphase (schwarzer Balken). Die Anzahl der Experimente betrug n=4 bzw. n=6 für (a) und
n=1 für (b). Die Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ± Standardfehler.
52
ERGEBNISSE
3.1.4
Stromableitungen und Änderungen des freilaufenden Membranpotentials
intakter Schließ- und Nebenzellen von Hordeum vulgare
Die Spaltöffnungsapparate der Gerste (lat. Hordeum vulgare), die wie auch Zea mays
zur Familie der Poaceae gehört, bestehen ebenfalls aus spezialisierten Nebenzellen und
einem hantelförmigen Schließzellen-Paar (Abbildung 3.4a und 3.4d). Da in Vorversuchen Gerstenzellen im intakten Gewebe nicht so anfällig auf die Verletzung des Einstichs reagierten, wurden Einstichexperimente in Schließ- und Nebenzellen von Gerste
durchgeführt. Dabei wurde experimentell bei beiden Gersten-Zelltypen in Analogie zu
Mais (Kapitel 3.1.2) vorgegangen. So wurde als Nachweis der zytosolischen Lokalisation der Messelektrode der fluoreszierende Farbstoff BCECF nach Elektrodeneinstich
injiziert (Abbilung 3.5a und d). Eine Fluoreszenz zeigte sich bei den GerstenSchließzellen wie bei Mais im Zytosol der hantelförmigen Endbereiche, während ein
starkes Fluoreszenzsignal im Lumen der Nebenzellen mit Ausnahme der Vakuolen auftrat. Bei den Einstichelektroden-Experimenten zeigten sowohl Gerstenschließzellen, als
auch Gerstennebenzellen ein ähnliches Verhalten wie Zea mays. Im Spannungsklemmenmodus ließen sich in Schließzellen sich sigmoid aktivierende Auswärts- und schnell
aktivierende Einwärtsströme ableiten (Abbildung 3.3.e). Nebenzellen hingegen zeigten
instantane Ströme ohne zeitabhängige Komponenten (Abbildung 3.3b). Die daraus resultierende Strom-Spannungskennlinien waren denen von Mais nahezu identisch (Abbildung 3.3c und f).
53
ERGEBNISSE
Abbildung 3.4 Einstichelektrodenmessungen an intakten Neben- und Schließzellen von
Hordeum vulgare im Spannungsklemmenmodus. Fluoreszenzaufnahmen von intakten Neben(a) und Schließzellen (d) nach Einstich der Messelektrode und Beladung, mit dem Fluoreszenzfarbstoff BCECF. (b) (e) Makroskopische Ganzzellströme einer Schließzelle (e), die im angegebenen Spannungsbreich bei verschiedenen Pulsspannungen registriert wurden. Die Pulsspannungen wurden in 20 mV Schritten ausgehend von der Haltespannung variiert. Die Haltespannung wurde dabei so gewählt, dass bei Anlegen der Haltespannung kein Strom floss. (c) (f)
Strom-Spannungskennlinie der aus (b) und (e) ermittelten Gleichgewichtsströme, die gegen die
geklemmte Membranspannung aufgetragen wurden.
Bei Aufzeichnung des freilaufenden Membranpotentials im Stromklemmenmodus
konnte ein gegenläufiges Polarisationsverhalten der Plasmamembran von Schließ- und
Nebenzellen aufgezeigt werden: Während Nebenzellen auf einen Lichtreiz unmittelbar
mit einer transienten Depolarisation (ähnlich den Mais-Nebenzellen) reagierten (Abbildung 3.5a, links), war bei der Schließzelle im selben Zeitfenster eine langanhaltende
Hyperpolarisation zu beobachten (Abbildung 3.5b, links). Bei einer Überführung vom
Licht in die Dunkelheit reagierten Hordeum-Nebenzellen ähnlich wie die von Mais unmittelbar mit einer transienten Hyperpolarisation, der eine Re- und Depolarisationsphase folgte (Abbildung 3.5a, rechts). Schließzellen hingegen reagierten mit einer langan54
ERGEBNISSE
haltenden Depolarisation (Abbildung 3.6b, rechts). Diese Beobachtung konnte von
Sandra Koers (Arbeitsgruppe PD. Dr. R. Roelfsema, Universität Würzburg) wiederholt
und statistisch abgesichert werden.
Abbildung 3.5 Änderungen im freilaufenden Membranpotential in intakten Nebenzellen (a) und
Schließzellen (b) von Hordeum vulgare auf einen Lichtstimulus (weisser Balken) oder eine
Dunkelphase (schwarzer Balken). Die Anzahl der Experimente betrug n=4 für (a) und n=1 für
(b). Die Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ± Standardfehler.
55
ERGEBNISSE
3.1.5
Änderungen des zytosolischen pH-Wertes während der Stomabewegung in
Mais Nebenzellen
Da vor allem die Hyperpolarisationsphase der Nebenzellen beim Stomaschluss nur von
kurzer Dauer war, ergibt sich daraus die Frage, ob diese ausreicht, um genügend Kaliumaufnahmekanäle zu aktivieren. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit weitere mögliche Faktoren analysiert, die zusätzlich regulatorischen Einfluss auf die Ionenflüsse
nehmen könnten. Neben dem Membranpotential ist bekannt, dass auch der zytosolische
pH-Wert sich in Schließzellen während der Stomabewegung ändert (Blatt und
Armstrong 1993; Grabov und Blatt, 1997). Daher wurde mittels des fluoreszierenden
pH-Sensors BCECF die Änderung des zytosolischen pH-Wertes parallel zur Änderung
des freilaufenden Membranpotentials in intakten Nebenzellen aufgezeichnet. Dazu wurde ein Lauf der zweikapillarigen Messelektrode - wie unter Kapitel 2.5.3 beschrieben mit dem pH-Sensor befüllt, während der andere Lauf mit 300 mM KCl befüllt war und
der Aufnahme des Membranpotentials diente. Der Einstichvorgang erfolgte wie unter
Kapitel 3.1.3 beschrieben. Die Injektion des Farbstoffs erfolgte durch einen Strompuls
von ca. -200 pA, der solange appliziert wurde, bis eine ausreichende Akkumulation des
Farbstoffs im Zytosol zu beobachten war und sich die Fluoreszenzintensität deutlich
von der Hintergrundfluoreszenz absetzte. Da der Strompuls auch einen Einfluss auf das
Membranpotential hat, wurde nach Absetzen des Ladestroms so lange gewartet, bis sich
die relative Fluoreszenzintensität des Farbstoffs nicht mehr änderte und sich das
Membranpotential stabilisiert hatte. Erst danach wurden die Licht-Dunkel-Stimuli ausgeführt. Auch beim Einstich mit zweikappilarigen Messelektroden konnte dadurch eine
Änderung des Membranpotentials induziert werden. Diese unterschied sich nicht von
den vorherigen Membranpotentialmessungen (Kapitel 3.1.3), so dass eine Beeinflussung des Membranpotentials durch den injizierten Farbstoff und den Injektionsvorgang
nahzu ausgeschlossen werden konnte. Der zytosolische pH-Wert begann zeitverzögert ca. 2,5 Minuten nach Verdunkelung - mit Einsetzen der Repolarisationsphase zu sinken
und erreichte innerhalb von 3 Minuten ein konstant saueres Niveau. Ein Lichtsignal
führte dagegen unmittelbar zu einem gegenteiligen Effekt. Der zytosolische pH-Wert
wurde basischer, was von der transienten Depolarisation begleitet wurde (Abbildung
56
ERGEBNISSE
3.7). Der zytosolische pH-Wert änderte sich dabei im Mittel um 0.09 ± 0.025 Einheiten
bei insgesamt 4 durchgeführten Messungen
Abbildung 3.6 Simultane Aufnahme der Reaktionen des freilaufenden Membranpotentials und
des zytosolischen pH-Wertes auf eine Dunkelphase (a, schwarzer Balken) und einen Lichtreiz
(b, weisser Balken) von Zea mays Nebenzellen. Die relativen Änderungen im zytosolischen pH
wurden aufgrund ratiometrischer Messungen des Fluoreszenzfarbstoffs BCECF bei einer Anregungswellenlänge von 440/470 nm bestimmt. Ein Anstieg der relativen Fluoreszenz stellt eine
Ansäuerung und Abfall eine Alkalisierung dar.
57
ERGEBNISSE
3.2
Patch-Clamp-Untersuchungen zu den Anionenströmen von Neben- und
Schließzellprotoplasten von Zea mays
3.2.1
Identifikation von S-Typ-Anionenkanäle in Nebenzellen von Zea mays
Anionenkanäle vermitteln während des Stomaschlusses nicht nur den Ausstrom von
Anionen aus Schließzellen, sondern tragen damit auch zu einer Membrandepolarisation
bei. Diese wiederum führt zur Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen, die
zusammen mit den Anionenkanälen letztendlich zum Stomaschluss führen. In Nebenzellen sorgen die Anionenkanäle vermutlich für einen Efflux von Anionen während der
Stomaöffnung, die dann von den Nebenzellen aufgenommen werden. Während verschiedene K+-permeable Kanalpopulationen in Nebenzellen bereits identifiziert wurden
(Majore et al., 2002), wurden Anionenkanäle in Nebenzellen bisher noch nicht beschrieben. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Anionenkanäle in Nebenzellprotoplasten von Zea mays mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik identifiziert werden. Zur
selektiven Beobachtung von Anionenkanälen wurden permeable Anionen (Chlorid) und
impermeable Kationen (TEA+) in den Bad- und Pipettenlösungen verwendet. Unter diesen Lösungsbedingungen wurden Einzelspannungspulsprotokolle im Spannungsbereich
zwischen -196 und +104 mV in 20 mV-Schritten appliziert, wobei die Haltespannung
0 mV betrug. Dabei wurden Anionenströme aufgezeichnet, die keine erkennbare Aktivierungs- oder Deaktivierungskinetiken besaßen (Abbildung 3.7a). Das Auftragen der
Gleichgewichtsströme gegen die angelegte Spannung, resultierte in einer linearen
Strom-Spannungskennlinie, was auf eine Spannungs-unabhängige Regulation dieser
Kanäle hindeutete (Abbildung 3.7.b). In Maiswurzelzellen konnten unter ähnlichen Bedingungen bereits Anionenströme dokumentiert werden (Giliham und Tester, 2005).
Über das Umkehrpotential (Nullstrompotential) können Aussagen darüber getroffen
werden, welches Ion hauptsächlich durch den untersuchten Kanal transportiert wird.
Liegt das im Experiment gemessene Umkehrpotential nahe dem Nernst-Potential eines
Ions in der Versuchslösung, deutet dies darauf hin, dass die Ströme von diesem Ion
vermittelt werden. Unter Kontrollbedingungen wurde bei 82 mM Cl- in der externen
und 154 mM Cl- in der internen Lösung ein Umkehrpotential von +14,9 ± 1,3 mV (n=7)
bestimmt, dass somit sehr nahe am Nernstpotential für Chlorid (ECl- = +16,2 mV) lag.
58
ERGEBNISSE
Desweiteren zeigten die Ströme eine 91%ige Reduktion (bei -96 mV, n=7) bei extrazellulärer Zugabe des Anionenkanalblockers NPPB (50 µM). Zusammengenommen machen es diese Beobachtungen wahrscheinlich, dass die aufgezeichneten Ströme in Nebenzellen einem Transport von Anionen zugrunde liegen.
Abbildung 3.7 Makroskopische Stromaufzeichnungen von Mais-Nebenzellprotoplasten. (a)
Repräsentative Stromantworten ([Ca2+]zyt. = 100 nM) eines Protoplasten auf Pulsspannungen im
Bereich von -196 mV bis +104 mV vor (a, Stromspuren links) und nach (a, Stromspuren rechts)
der extrazellulären Applikation des in Ethanol gelösten Anionenkanalblockers NPPB in einer
Konzentration von 50 µM (finale Ethanolkonzentration = 0,05%). Ausgehend von einem Haltepotential von 0 mV wurde die Spannung in 20 mV-Schritten geändert. Die Messungen wurden
am selben Protoplast durchgeführt. (b) Strom-Spannungskennlinie, erhalten durch Auftragen der
Gleichgewichtsströme gegen die Membranspannung vor (schwarze Symbole, n=7) und nach
(weiße Symbole, n=7) Applikation des Anionenkanalblockers. Deutlich ist die Reduktion der
Ströme durch NPPB zu erkennen. Die Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ±
Standardfehler
59
ERGEBNISSE
3.2.2
Einfluss von Ca2+-Ionen, ABA und des pH-Wertes auf die Anionenströme in
Nebenzellen
Die Aufzeichnung der Anionenströme in Abschnitt 3.2.1 deuten darauf hin, dass
Anionenkanäle in den Maisnebenzellen nicht durch die Spannung reguliert werden.
Aufgrund von Untersuchungen an Schließzellen anderer pflanzlicher Spezies, wie
Arabidopsis thaliana und Vicia faba, ist bekannt, dass deren Anionenkanäle durch eine
Erhöhung der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration aktiviert werden können (Roberts
2006). Aus diesem Grund wurden nun Patch-Clamp-Messungen an Nebenzellen bei
verschiedenen, definierten freien zytosolischen Kalziumkonzentrationen durchgeführt:
So wurden die Anionenstromdichten bei verschiedenen Membranspannungen in Abwesenheit von zytosolischem Kalzium und in Anwesenheit von entweder 100 nM Ca2+
(was nahe dem Ca2+-Spiegel im Ruhezustand der Zelle liegt) oder 390 nM Ca2+ ermittelt. In Mais-Nebenzellprotoplasten war jedoch die Anionenstromdichte bei einer
zytosolischen Kalziumkonzentration von 100 nM höher als bei 390 oder 0 nM (Abbildung 3.9b). Demach wirkt sich sowohl die Abwesenheit von Kalziumionen als auch die
Erhöhung der Kalziumkonzentration von 100 nM auf 390 nM reduzierend auf die
Anionenströme der Nebenzellen aus (Abbildung 3.9a und c).
Das Phytohormon ABA fördert den Stomaschluß über die Stimulation der
Anionenkanäle in Schließzellen (Marten et al., 2007; Blatt and Grabov 1997; Assmann
et al., 1993; Shimazaki et al., 1999; Schroeder et al., 2001, Roelfsema und Hedrich
2005). Da die Wirkung von ABA oft mit einer Erhöhung des zytosolischen Kalziumniveaus in diesen Motorzellen einhergeht (McAinsh et al., 1990; Allen et al., 1999), sollte
der Einfluss von ABA auf die Anionenkanalaktivität in Abhängigkeit der oben genannten zytosolischen Kalziumbedingungen in Nebenzellen analysiert werden. In Abwesenheit von Kalziumionen oder auch in Anwesenheit von 100 nM freiem zytosolischem
Ca2+ war eine leichte Erniedrigung der Anionenströme bei einer zytosolischen Applikation von 10 µM ABA im Vergleich zu den Kontrollen zu beobachten. Dieser leicht
inhibitorische Effekt von ABA ließ sich einerseits durch eine Erhöhung der
zytosolischen Ca2+-Konzentration auf 390 nM (Abbildung 3.8c) verstärken. Andererseits war bei einer intrazellulären ABA-Konzentration von 20 µM bei einer
zytosolischen Ca2+-Konzentration von 100 nM ebenso eine Förderung des
60
ERGEBNISSE
inhibitorischen Effekts zu verzeichnen. Zur Verdeutlichung wurden die in Anwesenheit
von 10 und 20 µM ABA ermittelten Stromdichten bei einer Membranspannung von
-156 mV auf die jeweiligen Kontrollwerte normalisiert und als Balkendiagramm in Abbildung 3.10 dargestellt. Es ist zu sehen, dass bei gleichbleibendem intrazellulärem
Ca2+-Spiegel die Stromdichten mit Zunahme der intrazelluären ABA-Konzentration
stärker abnehmen (Abbildung 3.9).
Abbildung 3.8 Zytosolischer Ca2+-abhängiger Effekt von ABAintern auf die Anionenströme von
Maisnebenzellprotoplasten bei (a) [Ca2+]zyt. = 0 nM, (b) [Ca2+]zyt. = 100 nM und (c) [Ca2+]zyt. =
390 nM. Es wurden zwischen sieben und 16 unabhängige Experimente bei den
unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt. Schwarze Symbole symbolisieren Experimente in
Anwesenheit von 10 µM intrazellulären ABA und weisse Symbole die Kontrollen. Die
Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ± Standardfehler. Experimente in (a) und
zu 25% in (b) wurden von Thomas Wolf, Universität Würzburg, durchgeführt.
61
ERGEBNISSE
Abbildung
3.9
Rückgang
der
Anionströme von Maisnebenzellprotoplasten bei einem zytosolischen Ca2+Spiegel von 100 nM bei einer Spannung von -156 mV als Reaktion auf
die interne Gabe von 10 µM bzw. 20
µM ABA (aus einer 10 mM, in
Isopropanol gelösten Stocklösung) im
Vergleich zur jeweiligen Kontrolle
(control = Abwesenheit von ABA).
Die Kontrollen enthielten dieselbe
Menge
Isopropanol
(finale
Isopropanolkonzentration = 0,1% bzw
0,2%) Die Daten wurden auf die jeweiligen Kontrollen bei -156 mV normiert.
Im Zuge des ABA-induzierten Stomaschlusses werden sowohl Ca2+-abhängige als auch
Ca2+-unabhängige Signaltransduktionwege in den Schließzellen diskutiert (Pandey et
al., 2007). Die zytosolische Alkalisierung, die in Schließzellen während des
Stomaschlusses beschrieben wurde (Blatt und Armstrong, 1993; Irving et al., 1992),
wird in diesem Zusammenhang als Ca2+-unabhängiger Signalweg genannt. Bis heute
war die pH-Sensitivität der Anionenkanäle jedoch nur wenig Gegenstand der Forschungsaktivitäten. Schulz-Lessdorf et al. zeigten 1996, dass die schnell aktivierenden
Anionenkanäle in Schließzellen von Vicia faba, sowie die S-Typ-Anionenkanäle in
Hypokotylzellen von Arabidopsis (Colcombet et al., 2005) infolge einer zytosolischen
Alkalisierung inhibiert werden. Aufgrund der beobachteten Licht-induzierten Zunahme
des intrazellulären pH-Werts in Nebenzellen (Abbildung 3.6) wurde im Folgenden daher untersucht, ob die Aktivität von Nebenzellanionenkanälen durch Protonen beeinflusst werden könnte. Zu diesem Zweck wurde auf der zytosolischen Seite der Plasmamembran der pH-Wert von 7,4 auf 8,4 in Gegenwart von entweder 100 nM oder
390 nM intrazellulärem Ca2+ erhöht. Um einen besseren Vergleich der resultierenden
Stromdichten zu ermöglichen, wurden die Anionenströme der jeweiligen Messungen
bei einem pH-Wert von 7,4 bei einer Spannung von -156 mV normalsiert, und die korrespondierenden Messungen bei pH 8,4 entsprechend angepasst (Abbildung 3.9). Interessanterweise spiegelte sich eine Alkalisierung des pH-Wertes von 7,4 auf 8,4 in einer
62
ERGEBNISSE
starken Zunahme der Anionenstromamplituden wieder. Sowohl bei einer freien
zytosolischen Kalziumkonzentration von 100 nM als auch bei 390 nM nahmen die
Anionenströme bei einem pH-Wert von 8,4 im Vergleich zu 7,4 zu.
Abbildung
3.10
Anstieg
der
Anionenströme durch zytosolische
Alkalisierung bei verschiedenen internen Kalziumkonzentrationen. Die bei
-156 mV aufgezeichneten Gleichgewichtsströme bei pH 8,4 wurden jeweils auf den Wert der bei pH 7,4
erhaltenen Werte bei der gleichen
zytosolischen
Ca2+-Konzentration
normalisiert. Anzahl der Experimente
war bei 100 nM Ca2+ n=6 für pH 7,4
und n=5 für pH 8,4 und bei 390 nM
Ca2+ n=4 für pH 7,4 und pH 8,4. Die
Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ± Standardfehler
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anionenkanäle der Nebenzellen in Mais ein
spannungsun- und kalziumabhängiges Verhalten zeigen. Die höchsten Anionenströme
wurden bei einem zytosolischen Ca2+-Spiegel von 100 nM aufgezeichnet. Die Abwesenheit von Kalzium oder die Erhöhung des zytosolischen Ca2+-Spiegels auf 390 nM
resultierte in einer Reduktion der Anionenströme. Bei intrazellulärer Applikation des
Phytohormons ABA werden die Anionenströme in einer kalziumabhängigen Weise inhibiert, während eine Alkalisierung des Zytosols unabhängig vom zytosolischen Ca2+Spiegel die Anionenströme stimuliert.
63
ERGEBNISSE
3.2.3
Identifikation von S-Typ-Anionenkanälen in Schließzellen von Zea mays
Maisschließzellen zeigen im intakten Gewebe während der Stomatabewegung ein zu
Nebenzellen unterschiedliches Verhalten bezüglich ihres Membranpotentials. Daher
wurde nun an isolierten Schließzellprotoplasten analysiert, ob sich dieser Unterschied
auch bei der Regulation der Anionenströme widerspiegelt. Da Anionenkanäle in der
Plasmamembran von Maisschließzellen bisher nicht beschrieben wurden, wurde in einem zu Mais-Nebenzellen analogem Patch-Clamp-Versuchsansatz (Kapitel 3.2.1) verfahren werden, um Schließzell-Anionenkanäle in Mais zu identifizieren. Bei Anlegen
eines identischen Spannungspulsprotokolls (VH=0) und identischen Lösungsbedingungen (Kapitel 2.4) konnten – wie in Nebenzellen nahezu instantene, nicht-relaxierende
Stromänderungen in Schließzellen registriert werden. Bei Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die Klemmspannung wird die Spannungsunabhängigkeit dieser
Ströme anhand des linaeren Kurven-Verlaufs deutlich (Abbildung 3.12b). Mit Hilfe der
Strom-Spannungskennlinie (Abbildung 3.11) wurde das Umkehrpotential bestimmt,
welches bei -11,1 mV ± 2,6 mV (n=5) und somit auch nahe dem Nernstpotential für
Chlorid lag. Die extrazelluläre Applikation des Anionenkanalblockers NPPB in einer
Konzentration von 50 µM resultierte in einer starken Reduzierung der Ganzzellströme
(Abbildung 3.11). Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass unter diesen Bedingungen - wie in den Nebenzellen - Anionenkanäle aktiv waren.
Abbildung 3.11 Makroskopische Anionenströme eines Mais-Schließzellprotoplasten. Ganzzellstromantworten auf Spannungspulse von -196 mV bis +104 mV, bei einer Haltespannung von
64
ERGEBNISSE
0 mV und einer zytosolischen Ca2+-Konzentration von 100 nM, in Ab- (a, control) und Anwesenheit von 50 µM des extrazellulären Anionenkanalblockers NPPB (b) in der Badlösung. Nach
NPPB-Applikation sind die Anionenströme stark reduziert.
3.2.4
Einfluss von Ca2+-Ionen und des pH-Wertes auf die Anionenströme in
Maisschließzellen
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde analysiert, ob die intrazelluläre freie Kalziumkonzentration - wie bei Nebenzellen beobachtet (Abbildung 3.8) – einen Einfluss auf
die Anionenströme hat. Zu diesem Zweck wurden Patch-Clamp-Datensätze an Maisschliesszellprotoplasten in der Ganzzellkonfiguration bei zytosolischen Kalziumkonzentrationen von 100 nM und 390 nM erstellt (Abbildung 3.12). Im Gegensatz zu Maisnebenzellen resultierte eine Erhöhung des zytosolischen Kalziumspiegels in Schließzellen nicht in einer Abnahme, sondern in einer ca. zweifachen Erhöhung der
Anionenströme (Abbildung 3.12a). Die nahezu linearen Strom-Spannungskennlinien
verdeutlichen den Effekt über den angegeben Spannungsbereich (Abbildung 3.12b).
65
ERGEBNISSE
Abbildung
3.12
Makroskopische
Stromaufzeichnungen
von
einem
MaisSchließzellprotoplasten. (a) Ganzzellstromantwort auf einen Spannungspuls von -176 mV bei
[Ca2+]zyt. = 100 nM (schwarz) und [Ca2+]zyt. = 390 nM (grau) eines Schließzellprotoplasten. (b)
Strom-Spannungskennlinie durch Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegte
Spannung von Mais Schließzellprotoplasten bei [Ca2+]zyt. = 100 nM (schwarze Symbole, n=5)
und [Ca2+]zyt. = 390 nM (weisse Symbole, n=4). Datenpunkte repräsentieren das arithmetische
Mittel ± Standardfehler
Analog zu den Untersuchungen an Nebenzellen wurde der Einfluss des zytosolischen
pH-Werts auf die Anionenströme in Schließzellen analysiert. Dazu wurde der
zytosolische pH-Wert auf den Wert 8,4 eingestellt und mit Kontrollmessungen beim
pH-Wert von 7,4 verglichen. Bei Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegte Spannung wurde ersichtlich, dass eine zytosolische Alkalisierung die
Anionenströme tendenziell inhibierte (Abbildung 3.13a). Zur Verdeutlichung dieses
Resultats wurden die bei -156 mV normalisierten Ströme in einem Balkendiagramm
gegenübergestellt (Abbildung 3.13b). Der Vergleich des Effekts des zytosolischen pHWertes auf die Anionenströme von Schließzellen mit dem von Nebenzellen (Abbildung
3.10) ergibt, dass eine Alkalisierung des Zytosols kaum einen Einfluss hat. In Nebenzellen hingegen werden die Anionenströme durch eine zytosolische Alkalisierung stimuliert (Abbildung 3.10).
66
ERGEBNISSE
Abbildung 3.13 Abfall der Anionenströme durch Erhöhung des zytosolischen pH-Werts in
Maisschließzellen bei einem zytosolischen Ca2+-Spiegel von 100 nM. (a) StromSpannungskennlinie, erhalten durch Auftragen der Gleichgewichtsströme von Maisschließzellprotoplasten bei pH 7,4. (schwarze Symbole, n=6) und pH 8,4 (weisse Symbole, n=6). (b) Abfall der Gleichgewichtsströme bei -156 mV. Die bei pH 8.4 aufgezeichneten Werte wurden auf
die bei pH 7,4 erhaltenen Daten normiert. Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ±
Standardfehler.
Zusammenfassend lassen sich aufgrund der gewonnenen Patch-Clamp-Analysen deutliche Zelltyp-spezifische Unterschiede in den Sensitivitäten der Neben- und SchließzellAnionenkanäle gegenüber dem zytosolischen Ca2+ und pH-Wert feststellen: Während
eine Erhöhung des [Ca2+]zyt. über den Ruhezustand hinaus bei Nebenzellen zu einer Inhibierung der Anionenströme führt, werden die Anionenkanäle der Schließzellen stimuliert. Eine zytosolische Alkalisierung bewirkt in Nebenzellen eine starke Zunahme der
Anionenstromdichte, wohingegen bei den Schließzellen nahezu kein Effekt zu verzeichnen ist. ABA führt bei den Schließzellen anderer Spezies, wie Vicia faba oder
Nicotiana tabacum zu einer Aktivierung der S-typ-Anionenkanäle (Roelfsema et al.,
2004; Levchenko et al., 2005; Marten et al., 2007). Die Anionenkanäle der Nebenzellen
von Mais reagieren hingegen auf ABA mit einer Reduzierung der Anionenströme.
67
ERGEBNISSE
3.2.5
Patch-Clamp-Untersuchungen zu den S-Typ und R-Typ-Anionenströmen
in Arabidopsis thaliana Schließzellprotoplasten
Anionenkanal-kodierende Gene in Mais sind bisher unbekannt. Erst kürzlich konnte
jedoch in Arabidopsis thaliana ein Gen für eine Komponente des S-Typ-Anionenkanals
identifiziert werden (Negi et al., 2008; Vahisalu et al., 2008. Da die heterologe Expression von SLAC1 in Oozyten keine elektrischen Signale erzeugte (Negi et al., 2008;
Vahisalu et al., 2008), wurde nach Interaktionspartnern gesucht. Dabei konnten Dr.
Dietmar Geiger und Sönke Scherzer (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Hedrich, Universität
Würzburg) die Proteinkinasen OST1 (Geiger et al., 2009) und CPK23 als positive Regulatoren der SLAC1-Aktivität identifiziert. Um zu analysieren, wie sich Mutationen
der Kinasen auf die die S-Typ-Anionenkanalaktivität in planta auswirken, wurden
Arabidopsis Schliesszellprotoplasten in den entsprechenden Verlustmutanten mit der
Patch-Clamp-Technik untersucht. Im Gegensatz zu SLAC1existiert für den R-TypAnionenkanal noch kein genetisches Pendant. In Kooperation mit Stefan Meyer (Arbeitsgrupe Prof. E. Martinoia, ETH Zürich) konnte ALMT12 jedoch als potentieller
Kandidat identifizert werden. Um eine Beteiligung dieses Gens an der R-TypAnionstromantwort
zu
klären,
erfolgte
eine
Charakterisierung
des
R-Typ-
Anionenkanals in Wildtyppflanzen und der entsprechenden Mutanenlinie.
3.2.5.1 S-Typ-Anionenströme in Schließzellprotoplasten von CPK23Verlustmutanten
Ma und Wu beschrieben 2007 erstmals CPK23 in Arabidopsis thaliana und demonstrierten dessen Funktion bei Salz- und Trockenstress (Ma et al., 2007). CPK23Verlustmutanten zeigten bei Wasserstress im Vergleich zum Wildtyp keine Verwelkung
und eine niedrigere Stomaöffnungsweite. Bei CPK23-Überexprimierern hingegen wa68
ERGEBNISSE
ren die Stomata weiter geöffnet. Sie diskutierten daher CPK23 als positiven Regulator
der
Stomaöffnung.
Um
eine
mögliche
Funktion
von
CPK23
bei
der
Anionenkanalregulation heraus zu arbeiten und damit weitere Einblicke in den
Signaltransduktionsweg
der
Stomabewegung
zu
erlangen,
wurden
hier
die
Anionenströme von Wildtyp- und cpk23-Schließzellprotoplasten mit der Patch-ClampTechnik vergleichend untersucht. Die Lösungen waren wieder so konzipiert, dass impermeable monovalente Kationen bei einem Chloridgradient von 37,5 mM extern zu
166 mM intern anwesend waren. Die zytosolische freie Kalziumkonzentration wurde
mit Hilfe des Kalziumchelators EGTA auf 2 µM eingestellt. Ferner befand sich in der
Badlösung der Kalziumkanalblocker Lanthanchlorid zur Unterdrückung von Kalziumströmen. Unter diesen Versuchsbedingungen wurden weitgehend spannungunabhängige
Ganzzellströme von Wildtyp-Protoplasten als Anwort auf 7,5 s lange Spannungspulse
im Bereich von +46 mV bis -134 mV registriert (Abbildung 3.15a). Lediglich bei Spannungen negativ von -104 mV zeigte sich eine leichte Deaktivierungskinetik bei
Wildtyp-Pflanzen
(Abbildung
3.15a).
Die
daraus
resultierende
Strom-
Spannungskennlinie zeigt eine nahezu lineare Abhängikeit des Stroms von der Spannung. Im Vergleich zum Wildtyp zeigte die Verlustmutante eine erhebliche Reduktion
in ihrer Anionkanalstromamplitude (70% Reduktion bei -104 mV, Abbildung 3.14). Bei
einer unter diesen Bedingungen analysierte slac1-3-Mutante waren die Anionenströme
nochmals deutlich reduziert (98% Reduktion bei -104 mV), was die von Vahisalu et al.
(2008) gezeigten Daten bestätigt.
69
ERGEBNISSE
a
wt
cpk23
b
Abbildung 3.14 Anionenströme von cpk23-Schließzellprotoplasten Die Experimente wurde bei
[Ca2+]zyt = 2 µM und in Abwesenheit von ABA durchgeführt. Als Hauptanion fungierte Chlorid
.(a) Ganzzellstromantwort eines Arabidopsis Schließzellprotoplasten von Wildtyp- und cpk23Pflanzen. (b) Strom-Spannungskennlinie, erhalten durch Auftragen der Gleichgewichtsströme
gegen die angelegte Spannung (VH = 0 mV). Die Datenpunkte stellen das arithmetische Mittel ±
Standardfehler dar. Anzahl der Experimente war n= 6 für WT, n= 4 für slac1-3 und n= 7 für
cpk23.
3.2.5.2 S-Typ-Anionenströme in Schließzellprotoplasten von OST1Verlustmutanten
Mustilli et al. konnten 2002 OST1 als ein weiteres Element des ABA-abhängigen
Signaltransduktionsweges identifizieren, welches zum ABA-induzierten Stomaschluss
70
ERGEBNISSE
führt. OST1-Verlustmutanten waren nicht in der Lage, ihre Transpiration zu regulieren,
und waren bei ABA-Applikation in ihrer Stomaantwort gestört. Mit Hilfe von PatchClamp-Experimenten an A. thaliana Schließzellprotoplasten sollte herausgefunden werden, wie sich eine Mutation von OST1 auf die Anionströme auswirkt. Die freie
zytosolische Kalziumkonzentration wurde auf 100 nM eingestellt, was ungefähr der
zytosolischen physiologischen Kalziumkonzentration im Ruhezustand entspricht. Zusätzlich befanden sich sowohl in der Pipettenlösung als auch in der Badlösung 50 µM
ABA, das
aus einer 50 mM-Isopropanol-Stocklösung zugegeben wurde (finale
Isopropanolkonzentration = 0,1%). Es wurden 7,5 s langen Spannungspulse von +44
mV bis -136 mV in 30 mV-Schritten (VH = 0 mV) angelegt. Auch hier zeigte die Verlustmutante im Gegensatz zum Wildtyp reduzierte Ganzzellströme (33% bei -106 mV).
Die Anionenströme der SLAC1-3-Verlustmutante waren unter physiologischen Kalziumbedingungen und dem Einsatz von ABA nochmals deutlich reduziert (88% bei -106
mV, Abbildung 3.15b). Auffällig sind die deutlich niedrigeren Wildtyp-Anionenströme
unter diesen Bedingungen im Vergleich.zu den erhöhten Anionenströme bei einer
zytosolischen Kalziumkonzentration von 2 µM (Abbildung 3.14). Demnach scheint eine
Erhöhung der zytosolischen kalziumkonzentration die Anionenströme stärker zu aktivieren als ABA.
71
ERGEBNISSE
a
wt
ost1-2
b
Abbildung 3.15 Anionenströme von ost1-2-Schließzellprotoplasten Die Experimente wurde bei
[Ca2+]zyt = 100 nM und in Anwesenheit von 50 µM ABA in Bad- und Pipettenmedium durchgeführt. Chlorid stellte das Hauptanion dar. (a) Ganzzellstromantwort eines Arabidopsis Schliesszellprotoplasten von Wildtyp und ost1-2 Pflanzen. (c) Strom-Spannungskennlinie, erhalten
durch Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegte Spannung (VH = 0 mV). Die
Datenpunkte stellen das arithmetische Mittel ± Standardfehler dar. Anzahl der Experimente war
n= 12 für WT, n= 11 für ost1-2 und n= 5 für slac1-3.
3.2.5.3 S-Typ-Anionenströme in slac1-3- und slah3-1-Schließzellprotoplasten
Wie In Kapitel 3.2.5.1 und 3.2.5.2 ist gezeigt, dass die S-Typ-Anionenströme in slac13-Mutanten in Gegenwart von Chlorid als permeables Anion stark reduziert sind.
Nichtsdestotrotz sind slac1-3-Mutanten in der Lage, ihre Stomata während Tag-NachtRhythmus zu schließen. Da SLAC1 bei der Expression in Oozyten eine hohe Permeabi72
ERGEBNISSE
lität für Nitrat aufwies (Geiger et al., 2009), stellte sich daher die Frage, ob Nitrat an der
Stomabewegung in SLAC1-Verlustmutanten beteiligt sein könnte. Dazu wurde in
Patch-Clamp-Experimenten an Schließzellprotoplasten von slac1-3-Mutanten das Chlorid weitestgehend durch Nitrat ersetzt, so dass ein Nitratgradient von 161 mM intern zu
36 mM extern vorherrschte. Die Pulsprotokolle und Haltespannung entsprachen denen
der Chloridexperimente (Kapitel 3.2.5.1). Ein Vergleich der Nitrat-vermittelten
Anionenströme der slac1-3-Mutanten mit denen von Schließzellprotoplasten von Wildtyppflanzen zeigt nun, dass die Anionenströme nahezu identisch waren (Abbildung
3.16). Der durch Nitrat getragene Anionenstrom scheint also nicht durch SLAC1 generiert zu werden.
Abbildung 3.16 Nitrat-vermittelte
Anionenströme in slac1-3 Schließzellprotoplasten.
StromSpannungskennlinie,
erhalten
durch Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegte
Spannung von. A. thaliana
Schließzellen von Wildtyp (geschlossene Symbole) und slac1-3
(geschlossene Symbole) unter Bedingungen, in denen Nitrat das
Haupt-Anion darstellte. Die Messungen wurden bei [Ca2+]zyt = 2 µM
und in abwesenheit von ABA
durchgeführt. Die Datenpunkte
stellen das arithmetische Mittel ±
Standardfehler dar. Anzahl der
Experimente war n= 6 für WT, und
n= 5 für slac1-3.
Neben SLAC1 sind in Schließzellen von A. thaliana Transkripte eines bisher nicht charakterisierten SLAC1-homologen Kanals, SLAH3 (SLAC1 HOMOLOGUE 3) zu finden (persönliche Kommunikation mit Prof. Dr. Hedrich, Universität Würzburg).
SLAH3 gehört zu einer Gruppe von 4 SLAC1-homologen Genen, die auf Proteinebene
73
ERGEBNISSE
zu 40-50% mit SLAC1 identisch sind (Negi et al., 2008). Das Genprodukt könnte
daherfür die Nitrat-vermittelten Anionenströme in Schließzellen verantwortlich sein.
Bei funktioneller Expression in Oozyten des Kanals konnte Tobias Maierhofer (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Hedrich, Universität Würzburg) eine hohe Permeabilität für Nitrat
aufzeigen, während Chorid nur in geringerem Maße den Kanal passieren konnte. Um zu
überprüfen, ob dies auch in planta der Fall ist, wurden Patch-Clamp-Messungen an
Schließzellprotoplasten einer SLAH3-Verlustmutante durchgeführt. Dabei wurden die
Pulsprotokolle und Lösungen verwendet, unter denen in den Schließzellen der slac1-3Mutanten Nitrat-vermittelte Anionenströme generiert werden konnten. Hier zeigte sich,
dass die Anionenströme der SLAH3-1 slah3-1-Mutante im Vergleich zu WildtypProtoplasten deutlich reduziert waren (Abbildung 3.17). Die in der slac1-3-Mutante
gemessenen Nitrat-vermittelten Anionenströme (Abbildung 3.16) könnten also von
SLAH3 vermittelt werden.
Abbildung 3.17 Nitrat-vermittelte Ganzzellanionenströme von Wildtyp- und slah3-1Schließzellprotoplasten (a) Ganzellstromantworten von Arabidopsis Schließzellprotoplasten von
Wildtyp- und slah- Pflanzen unter Bedingungen, in denen Nitrat das Haupt-Anion darstellte. (c)
Strom-Spannungskennlinie, erhalten durch Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegte Spannung ([Ca2+]zyt = 2 µM, ohne ABA). Die Datenpunkte stellen das arithmetische
Mittel ± Standardfehler dar. Anzahl der Experimente war n = 6 für Wildtyp (geschlossene Symbole) und n = 6 für slah3-1 (offene Symbole).
Wurden die Gleichgewichtsströme bei -106 mV der slac1-3- und der slah3-1-Mutante
auf die jeweiligen im Wildtyp gemessenen Gleichgewichtsströme normalisiert, verdeutlichte sich die Reduktion der Anionenströme bei der SLAH3-1 Verlustmutante (Abbildung 3.18).
74
ERGEBNISSE
Abbildung 3.18 Vergleich der Gleichgewichtsströme bei -106 mV von A. thaliana
Schließzellen von slah3-1 und slac1-3, unter
Bedingungen, in denen Nitrat das HauptAnion darstellte. Die Ströme wurden jeweils
auf die des entsprechenden Wild-Typs normiert. Die Zahl der Experimente betrug n=6
für Wildtyp und n=6 für slah3 im Vergleich
zu n=6 für Wild-Typ und n=5 für slac1-3. Die
Messungen wurden bei [Ca2+]zyt = 2 µM und
ohne ABA durchgeführt. Datenpunkte repräsentieren das arithmetische Mittel ± Standardfehler.
Wie oben bereits erwähnt wurde, zeigt SLAH3 in Oozyten eine geringe Permeabilität
für Chlorid, die sich auch in planta in den stark reduzierten Anionenströmen in
Chloridlösungen von Schließzellprotoplasten der slac1-3-Mutante widerspiegelt (Abbildung 3.14b und 3.15b). Wenn jedoch extrazelluläre Bedingungen simuliert werden,
die dem Nitratstatus vom Xylemsaft entspricht, zeigte sich in SLAH3-exprimierenden
Oozyten eine Aktivierung von SLAH3, die sich in einer Erhöhung der
Anioneneitfähigkeit
der
Plasmamembran
darstellte
(Experimente
von
Tobias
Maierhofer, Arbeitsgruppe Prof. R. Hedrich, Universität Würzburg). Daher wurden solcher Bedingungen für Arabidopsis Schließzellprotoplasten von slac1-3-Mutanten imitiert. In der Pipette befanden sich die identischen Lösungen, wie sie für die Messungen
an der CPK23-Verlustmutante und SLAC1-Verlustmutante ([Ca2+]zyt. = 2 µM) verwendet wurden (Kapitel 3.2.5.1). Im Bad befanden sich anders als in den vorherigen Experimenten 5 mM anstatt 1 mM CaCl2, während die übrigen Bedingungen nicht verändert
wurden. Während der Messung wurden 5 s-Spannungspulse von -190 mV bis +70 mV,
in 20 mV-Schritten appliziert (VH = 0 mV). In Abwesenheit von Nitrat waren die STyp-Anionenströme der slac1-3 Mutante auch hier (Abbildung 3.17), wie schon in Abbildung 3.14 und 3.15 gezeigt, stark reduziert. Die zusätzliche Applikation von externem Nitrat in einer Konzentration von 3 mM führte - wie in Oozyten - zu einer Aktivierung von S-Typ-Anionenströme und resultierte in einer Strom-Spannungskennlinie, die
75
ERGEBNISSE
in etwa dem des S-Typ-Anionenkanals entspricht. Das Umkehrpotential war dabei ins
Negative verschoben, was vermutlich auf die Erhöhung der Nitratleitfähigkeit infolge
der Nitratzugabe zurückzuführen ist.
Zusammenfassend kodieren SLAC1 und SLAH3 für zwei Ionenkanäle, die in der Lage
sind einen S-Typ-Anionenstrom zu vermitteln. Während SLAC1 vermutlich für den
Chloridefflux verantwortlich ist, ist SLAH3 zum Einen fähig einen Nitratefflux zu etablieren, kann andererseits jedoch auch einen Ausstrom von Chlorid generieren, wenn er
duch externen Nitrat aktiviert wird.
Abbildung 3.19 StromSpannungskennlinie durch
Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die
angelegte Spannung unter
Bedingungen, in denen
Chlorid das Haupt-Anion
darstellt von Arabidopsis
Schließzellprotoplasten
von slac1-3 Mutanten in
Abwesenheit (offene Symbole, n=7) und in Anwesenheit
(geschlossenen
Symbole, n=8) von extrazellulären 3 mM NO3([Ca2+]zyt = 2 µM, kein
ABA). Die Datenpunkte
stellen das arithmetische
Mittel ± Standardfehler
dar.
76
ERGEBNISSE
3.2.5.4 R-Typ-Anionenströme in Schließzellprotoplasten von ALMT12Verlustmutanten
Schon seit Ende der 80er Jahre ist bekannt, dass der Anionenefflux aus Schließzellen
von zwei Anionenkanaltypen, dem S- und dem R-Typ, vermittelt werden kann. Während SLAC1 und SLAH3 höchstwahrscheinlich für die S-Typ-Anionenströme verantwortlich sind (Kapitel 3.2.5.3; Negi et al., 2008; Vahisalu et al., 2008), ist ein molekulargenetisches Äquivalent für den R-Typ-Anionenkanal bisher unbekannt. Eine
charakeristische Eigenschaft des R-Typ-Anionenkanals ist, dass Malat den Kanal nicht
nur geringfügig passieren, sondern auch dessen Spannungsabhängigkeit modulieren
kann (Hedrich und Marten, 1993; Raschke 2003). Malatkanäle als Mitglieder der
ALMT-Familie wurden erstmals in Wurzelzellen beschrieben (Kollmeier et al., 2001;
Pineros et al., 2001). Die Arbeitsgruppe von Prof. Enrico Martinoia (ETH Zürich,
Schweiz) identifizierten nun in Arabidopsis thaliana ALMT12 als ein spezifisch in der
Schließzelle exprimierter Vertreter der ALMT-Familie. Es stellte sich daraufhin die
Frage, ob ALMT12 möglicherweise den R-Typ-Anionenkanal repräsentiert. Um hierzu
Aussagen machen zu können, mussten zunächst die elektrischen Basiseigenschaften der
R-Typ-Anionenkanäle in Wildtyp-Schließzellen von A. thaliana erfasst werden, da bisherige Studien zu diesem Kanaltyp hauptsächlich an Vicia faba Schließzellen durchgeführt worden sind (Schroeder und Keller, 1992; Hedrich et al, 1990; Hedrich und Marten, 1993). Mit der Patch-Clamp-Technik wurden deshalb in Arabidopsis Schließzellprotoplasten in Gegenwart von 75 mM Sulfat und 1 µM freiem Kalzium in der intrazellulären Lösung sowie 20 mM Kalziumsulfat im Außenmedium untersucht. Zur Unterbindung von Kaliumströmen fungierte Cäsium als impermeables Kation im intrazellulären Medium. Um die aktivierung der Kanäle aufzeigen zu können wurde ein Haltepotential vin -180 mV gewählt, da die Kanäle sich dann in einem geschlossenen Zustand
befinden Ausgehend vom Haltepotential wurde die Spannung, jeweils sukzessive in
Pulsen von 200 ms von -200 mV bis zu einem Potential von +60 mV schrittweise erhöht. Die Aktivierungskinetik ähnelt stark der, die schon in Vicia faba dokumentiert
wurde (Schroeder und Keller, 1992).
77
ERGEBNISSE
Abbildung 3.20 Aktivierende R-Typ Ganzzellstromantworten eines A. thaliana Schließzellprotoplasten bei einer internen Sulfatkonzentration von 75 mM und einer externen
Sulfatkonzentration von 20 mM. Die Ströme zeigen eine schnelle Aktivierungskinetik bei den
angegebenen Spannungen (VH=-180 mV). Das Nullstromniveau ist durch die gepunktete Linie
gekennzeichnet.
Eine Deaktivierung der Anionenkanäle wurde erfasst, indem dem oben beschriebenen
Spannungspulsprotokoll ein aktivierender Vorpuls bei +60 mV „vorgeschaltet“ wurde.
Dadurch befand sich immer eine gleiche Anzahl von Anionenkanälen in einem offenen
Zustand, wenn verschiedene Pulsspannungen nachfolgend appliziert wurden (Abbildung 3.21). Es ist gut zu erkennen, dass die Deaktivierung der Kanäle mit
hyperpolarisiernder Spannung zunimmt.
78
ERGEBNISSE
Abbildung 3.21 Deaktivierende R-Typ Ganzzellstromantworten eines Arabidopsis Schliesszellprotoplasten bei einer Sulfatkonzentration von 75 mM intern und 20 mM extern ([Ca2+]zyt. =
1 µM). Zusätzlich waren im Bad 20 mM Kalzium vorhanden. Die Ströme zeigen nach einer 50
ms langen Depolarisation bei +60 mV eine schnelle Deaktivierungskinetik bei den angegebenen
Spannungen. Das Haltepotential betrug -180 mV. Das Nullstromniveau ist durch die gepunktete
Linie gekennzeichnet.
.
Im Gegensatz zu den sehr schnellen Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken in Abbildung 3.20 und 3.21, war bei einer anhaltenden Stimulation durch einen 10 sSpannungspuls von -120 mV bei 3 von 9 eine leichte Inaktiverungskinetik zu beobachten (Abbildung 3.22). Obwohl sich ein Teil der Kanäle bei dieser Spannung in einem
offenen Zustand befinden, nimmt die Stromamplitude hier mit der Zeit ab.
79
ERGEBNISSE
Abbildung 3.22 Inaktivierender Anionenstrom eines A. thaliana Schließzellprotoplasten bei
einer Sulfatkonzentration von 75 mM intern und 20 mM extern bei einer Spannung von
-120 mV zeigt (VH = -180 mV). Das Nullstromniveau ist durch die gepunktete Linie gekennzeichnet.
Für einen detaillierten Einblick in die Kinetik des R-Typ-Anionkanals wurden sowohl
die relative Offenwahrscheinlichkeit (Abbildung 3.26a) als auch die Relaxationszeit
(Abbildung 3.26b) bestimmt. Die Offenwahrscheinlichkeit beschreibt die statistische
Verteilung der Kanäle im offenen oder geschlossenen Zustand bei verschiedenen Spannungen. Dazu wurden die deaktivierenden Stromantworten („tail currents“), ausgehend
von Spannungspulsen von -180 mV bis + 80 mV zu einem Spannungspuls von -180 mV
analysiert und auf den Sättigungswert der errechneten Boltzmann-Verteilung normiert.
Die halbmaximale Offenwahrscheinlichkeit V1/2 und die apparenten Elementarladungsäquivalente z („gating charge“) wurden als beschreibende Parameter der Spannungsabhängigkeit und –empfindlichkeit bestimmt, indem die experimentellen Datenpunkte mit
einer einfachen Boltzmann-Funktion beschrieben wurden. Die halbmaximale Offenwahrscheinlichkeit V1/2 betrug -115,5 ± 2,8 und die apparenten Elementarladungsäquivalente z = 1,7 ± 0,2.
Mit Hilfe der Relaxationszeit und der damit bestimmten Zeitkonstante τ (griech. „Tau“)
lassen sich Aussagen treffen, mit welcher „Geschwindigkeit“ ein Kanal vom offenen in
den geschlossenen Zustand konvertiert. Dazu wurde mit einer einfachen Exponentialfunktion die zeitabhängige Deaktivierung nach einem aktivierenden oder deaktivierenden Vorpuls beschrieben. Die Zeitkonstanten τ-80mV = 7,3 ± 0,5 ms und τ-100mV = 21,0 ±
2,0 ms spiegeln die schneller werdende Konversion bei hyperpolarisierender Spannung
in den offenen Zustand wider, während negativ von V1/2 bei -160 mV die entsprechende
80
ERGEBNISSE
Zeitkonstante τ-160mV = 8,4 ± 2,3 ms den schnellen Übergang in den geschlossenen Zustand reflektiert. Auffallend ist, dass V1/2 gut mit dem Maxium der Zeitkonstante korrespondiert.
Abbildung 3.23 Spannungsabhängiges Schaltverhalten des R-Typ-Anionenanals in Arabidopsis
Wildtyp-Schließzellprotoplasten. (a) Auftragung der Relaxationszeit gegen die geklemmte
Spannung. (b) Spannungsabhängige relative Offenwahrscheinlichkeit (P0), die mit Hilfe von
Tail-Strom-Analysen bestimmt wurde. Die halbmaximale Aktivierungsspannung V1/2 betrug 115,5 ± 2,8 mV. Das apparente Elementarladungsäquivalent z betrug 1,7 ± 0,2. Die Datenpunkte stellen das arithmetische Mittel ± Standardfehler dar. Anzahl der Experimente war n=6 für (a)
und n=6 für (b). Die Experimente wurden in Gegenwart von 20 mM externem Malat durchgeführt.
Um die Rolle von ALMT12 bei der Regulation der R-Typ-Anionenstromanwort zu ergründen, wurden Patch-Clamp-Datensätze an Schließzellprotoplasten von Wildtyp- und
almt12-Pflanzen unter identischen Lösungsbedingungen erstellt. Dafür wurden 1 sSpannungspulse von -200 mV bis +80 mV (in 20 mV-Schritten, VH = -180 mV) angelegt. Im Vergleich zum Wildtyp unterschieden sich die Anionenströme der ALMT12Verlustmutante unter diesen Bedingungen weder in der Spannungsabhängigkeit, noch in
der Stromamplitude (Abbildung 3.23).
81
ERGEBNISSE
Abbildung 3.24 R-Typ-Stromantworten von Wildtyp- und almt12-Schließzellprotoplasten unter
Sulfat-Bedingungen. Strom-Spannungskennlinien von A. thaliana Schließzellprotoplasten von
Wildtyp- und almt12-Pflanzen, erhalten durch Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die
angelegte Spannung. Die Sulfatkonzentration betrug 75 mM intern und 20 mM extern und in
der Badlösung waren 20 mM Kalzium enthalten ([Ca2+]zyt. = 1 µM). Die Datenpunkte stellen das
arithmetische Mittel ± Standardfehler dar. Anzahl der Experimente war n=6 für Wildtyp (WT,
geschlossene Symbole) und n=6 für almt12 (offene Symbole).
Von Vicia faba Schließzellen ist dokumentiert, dass die externe Applikation von Malat
einen Einfluss auf die Spannungsabhängigkeit des R-Typ-Anionenkanals hervorruft
(Marten und Hedrich, 1993; Raschke, 2003). Deshalb wurde das externe Sulfat durch
Malat derselben Konzentration ersetzt (20 mM), während die übrigen Bedingungen unverändert blieben. Unter diesen Bedingungen waren die Anionenströme der almt12Mutante im Vergleich zum Wildtyp um etwa die Hälfte reduziert. Allerdings veränderte
sich die Spannungsabhängigkeit durch den extrazellulären Austausch von Sufat gegen
Malat nicht (Abbildung 3.24). Dies deutet darauf hin, dass ALMT12 nur an der
malatselektiven Komponente des R-Typ-Anionenkanals beteiligt ist.
82
ERGEBNISSE
Abbildung 3.25 R-Typ-Stromantworten von Wildtyp- und almt12-Schließzellprotoplasten unter
Malat-Bedingungen. (a) Ganzzellstromantworten von Arabidopsis Schließzellprotoplasten von
Wildtyp-Pflanzen und almt12 Mutanten bei einer Spannung von -80 mV (VH = -180 mV). Die
Messungen wurden in bei einer internen Sulfatkonzentration von 75 mM und in Gegenwart von
20 mM externem Malat durchgeführt. Zusätzlich befanden sich 20 mM Kalzium in der Badlösung. (b) Strom-Spannungskennlinie, erhalten durch Auftragen der Gleichgewichtsströme gegen die angelegte Spannung. Die Datenpunkte stellen das arithmetische Mittel ± Standardfehler
dar. Anzahl der Experimente war n=6 für Wildtyp (WT, geschlossene Symbole) und n=6 für
almt12 (offene Symbole).
An Vicia faba Schließzellprotoplasten wurde bei Anwesenheit von Chlorid im
Pipettemmedium R-Typ-Anionenströme dokumentiert (Schroeder und Keller, 1992;
Marten et al, 1992; Hedrich und Marten, 1993). Wurden bei A. thaliana WildtypSchließzellprotoplasten 75 mM Sulfat durch 75 mM Chlorid substituiert und die sonstigen Parameter wie bei den oben beschriebenen Experimenten beibehalten, waren hier
keine R-Typ-ähnlichen Anionenstrom-Komponenten mehr detektierbar (Abbildung
3.25). Die Anionenströme ähnelten eher dem spannungsunabhängigen S-TypAnionenkanal. Dies deutet auf eine Spezies-spezifische Selektivität des R-TypAnionenkanals hin.
83
ERGEBNISSE
Abbildung
3.26
StromSpannungskennlinie von A. thaliana
Wildtyp-Schließzellprotplasten
bei
internem Chlorid und Sulfat. Die Sulfat- bzw. Chloridkonzentration betrug
75 mM im Zytosol und in der Badlösung waren je 20 mM Sulfat und Kalzium enthalten. Die Datenpunkte stellen das arithmetische Mittel ± Standardfehler dar. Anzahl der Experimente war n=6 für internes Chlorid (offene Symbole) und n=6 für internes
Sulfat (geschlossene Symbole).
84
DISKUSSION
4
Diskussion
4.1
Ionenflüsse während der Stomabewegung in Zea mays
Während Kaliumaufnahme- und Abgabekanäle sowohl elektrophysiologisch (FairleyGrenot, et al., 1992; Majore et al., 2002) als auch molekulargenetisch in Nebenzell- und
Schließzell-Protoplasten identifiziert werden konnten (Büchsenschütz et al., 2005), sind
Anionenkanäle in diesen Zellen bisher unbekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
konnten nun Anionenkanäle erstmals in Schließ- und Nebenzellen von Zea mays identifiziert und charakterisiert werden. Darüber hinaus konnten regulatorische Komponenten
wie das Membranpotential und Änderungen des zytosolischen pH-Werts in intakten
Nebenzellen während der Stomabewegung aufgezeichnet und die Volumina der Zellen
des Spaltöffnungsapparats abgeschätzt werden. Im Folgenden wird diskutiert, inwiefern
die gewonnenen Resultate im Einklang mit dem von Raschke und Fellows (1971) postulierten Shuttle-Ionentransport stehen.
4.1.1
Zellvolumina von Schließ- und Nebenzellen von Zea mays
Unter Berücksichtigung der errechneten Volumenverhältnisse von Schließ- und Nebenzellen (Kapitel 3.1.1) würde die in den Nebenzellen während der Stomabewegung gemessene zytosolische K+-Aktivitätsänderung von 10 mM (bei gleichen Verhältnissen
von Schließzelle und Vakuole in beiden Zelltypen) zu einer K+-Aktivitätsänderung von
etwa 40 - 60 mM im Zytosol der Schließzellen führen. Im Vergleich dazu lag bei der
85
DISKUSSION
dikotylen Pflanze Vicia faba lag die Änderung der K+ Konzentration in den Schließzellen 6-7fach erheblich höher (Roelfsema und Hedrich, 2005). Dies lässt die im Mais
erhaltenen Werte als Grundlage für eine Stomabewegung als zu niedrig erscheinen.
Frühere Schätzungen an Mais deuteten ebenfalls auf eine 2-4fach höhere Lichtinduzierte K+-Aktivitätsänderung im Vergleich zu unseren Daten hin (Raschke und
Fellows 1971; Lasceve et al., 1987). Dieser Unterschied mag in der unterschiedlichen
experimentellen Herangehensweise begründet liegen. Während in den Versuchsansätzen mit Hilfe von Elektronen-Proben-Analysen die K+-Aktivität der ganzen Zelle berücksichtigt wurde, wurde spezifisch die zytosolische Kaliumaktivitätsänderung in den
Nebenzellen während der Stomabewegung (E.M Hilgarth, Diplomarbeit 2005, Universität Würzburg) mit Hilfe von K+-selektiven Mikroelektroden erfasst. Falls ein Teil der
Kaliumionen nach der Aufnahme ins Nebenzellzytosol in die Vakuole oder über
Plasmodesmata in benachbarte Epidermiszellen transportiert werden, würde nach Einstellen eines Gleichgewichts netto mehr Kalium transportiert werden, als es die detektierten 10 mM K+-Änderung vermuten lassen. Mit Hilfe von Prof. J. Fromm (Zentrum
Holzwirtschaft, Universität Hamburg) konnten tatsächlich plasmodesmatische Verbindungen zwischen Nebenzellen und Epidermiszellen nachgewiesen werden (siehe nachfolgendes Kapitel 4.1.2, Abb. 4.1), was die relativ niedrigen K+-Änderungen im Zytosol
der Nebenzellen unter anderem mit erklären könnte. Alternativ könnten auch Kaliumionen teilweise in der Vakuole gespeichert werden und so zu einer Verringerung der aufgezeichneten Kaliumaktivitätswerte führen. Frühere Beobachtungen an Epidermiszellen
die sich in unmittelbarer Nähe zu Nebenzellen befinden, wiesen jedoch einen erhöhten
Kaliumgehalt auf (Raschke et al., 1971). Dies könnte auf einen plasmodesmatischen
Transport von Kalium von den Nebenzellen in die direkt benachbarten Epidermiszellen
hinweisen.
86
DISKUSSION
4.1.2
Stromableitungen von intakten Zellen des Spaltöffnungsapparates
Werden die im intakten Gewebe aufgezeichneten Ganzzellströme mit bekannten Daten
von Zea mays Schließzellprotoplasten verglichen (Fairley-Grenot und Assmann, 1992),
dann gleichen sich die Auswärtsströme hinsichtlich ihrer sigmoiden Aktivierungskinetik
und ihrer ausgeprägten Spannungsabhängigkeit. Die in intakten Zellen abgeleiteteten
Aus- und Einwärtsströme (Abbildung 3.4c) spiegeln gut die in Protoplasten identifizierten Kaliumabgabe und –aufnahmekanäle wider (Majore et al., 2002). In Nebenzellprotoplasten von Zea mays konnten mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik zwei Populationen von K+-Kanälen identifiziert werden (Majore et al., 2002), die ähnliche Spannungsabhängigkeiten wie Maisschließzellprotoplasten aufwiesen (Fairley-Grenot und
Assmann, 1992). Es handelte sich dabei um Depolarisations-aktivierte K+Abgabekanäle und Hyperpolarisations-aktivierten K+-Aufnahmekanäle. Im intakten
Gewebe gelang es in dieserArbeit jedoch nicht (Kapitel 3.1.2), die in Nebenzellprotoplasten identifizierten K+-Kanäle mit der Einstichmethode nachzuweisen (Majore et al.,
2002). Während sowohl bei Schließzellprotoplasten als auch bei intakten Schließzellen
Ströme mit Zeit-abhängigen Kinetiken aufgezeichnet werden konnten, waren bei intakten Nebenzellen nur instantane Ströme zu registrieren (Kapitel 3.1.2, Abbildung 3.4d).
Dieser Unterschied in den Stromantworten zwischen intakten Nebenzellen und isolierten Nebenzellprotoplasten beruht höchstwahrscheinlich auf einer elektrischen Kopplung
der Nebenzellen mit dem umliegenden Gewebe über Plasmodesmata. So belegen
Transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahmen, die von Prof. J. Fromm (Zentrum Holzwirtschaft, Universität Hamburg) im Rahmen einer Zusammenarbeit erstellt
wurden, die Anwesenheit von Plasmodesmata zwischen Nebenzellen und umliegenden
Epidermiszellen (Abbildung 4.1). Im Gegensatz dazu sind Schließzellen elektrisch isoliert und somit zugänglich für Spannungsklemmenexperimente mit der Einstichmethode.
87
DISKUSSION
Abbildung 4.1 Transmissionselektronenmikroskopische
Au
Aufnahme eines stomatären komplexes
von
Zea
mays
mays.
(a)
Die
Plasmodesmat zwischen NebenPlasmodesmata
zellen und Epidermis sind durch
einen schwarzen Rahmen gekenngeken
zeichnet. EC=Epidermal cell (Epi(Ep
dermiszelle), SC=Subsidiary cell
(Nebenzelle),
GC=Guard
cell
(Schließzelle). (b) Vergrößerung
der in (a) hervorgehobenen
Plasmodesmata (von Prof. J.
J
Fromm, Universität Hamburg, im
Rahmen einer Kooperation ere
stellt).
4.1.3
Differentielle Änderung des Membranpotentials in SchließSchließ und
Nebenzellen während der Stomabewegung
Die K+-Aktivitätsänderungen
Aktivitätsänderungen (Dipomarbeit E.M.Hilgarth, Universität Würzburg, 2005)
in den Nebenzellen stehen im Einklang mit einem Shuttle-Ionent
Ionentransports zwischen
Schließ- und Nebenzellen.
Nebenzellen Der Transport zwischen den beiden Zelltypen
elltypen könnte dabei
von spannungsabhängigen KaliumaufnahmeKaliumaufnah
und abgabekanälen bewerkstelligt werden.
Solche Kanalpopulationen
opulationen konnten bereits sowohl in isolierten Schließzellen (Fairley(Fairley
Grenot und Assmann,, 1992) als auch isolierten Nebenzellen (Majore et al., 2002) identiident
fiziert werden. Da jedoch sowohl die Depolarisations-aktivierten
Dep
K+-Abgabekanäle als
auch die Hyperpolarisation-aktivierten
Hyperpolarisation
K+-aufnahmekanäle
aufnahmekanäle ähnliche Spannungsabhängigkeiten besitzen, wäre eine differentielle Änderung des Membranpotentials in beiden
88
DISKUSSION
Zelltypen während der Stomabewegung ein Möglichkeit einen gerichteten K+-Transport
während der Stomabewegung zu etablieren.
Mittels der Einstichelektroden-Technik konnte in intakten Nebenzellen gezeigt werden,
dass das Membranpotential nach einem Lichtreiz depolarisiert, während derselbe Stimulus in Schließzellen eine langanhaltende Hyperpolarisation auslöst (Kapitel 3.1.3, Abbildung 3.3). Bei einer Licht-induzierten Stomaöffnung wäre hier ein gegenläufiges
Membranpotential gegeben, welches in der Lage wäre, zum einen die Depolarisationsaktivierten K+-Abgabekanäle in den Nebenzellen und zum Anderen die Hyperpolarisations-aktivierten K+-Aufnahmekanäle in den Schliesszellen zu aktivieren. Demnach
könnte Kalium aus den Nebenzellen in den Apoplast entlassen werden und dort von den
Schließzellen aufgenommen werden, was wiederum in Einklang mit dem postulierten
Shuttle-Ionentransport steht.
Umgekehrt hyperpolarisiert das Membranpotential der Nebenzellen unmittelbar nach
Wegnahme des Lichtreizes. Bedauerlicherweise konnte die Reaktion der Schließzellen
nach Überführung ins Dunkle nicht aufgezeichnet werden (Kapitel 3.1.3). Im Spaltöffnungsapparat von Hordeum vulgare konnte jedoch ein dem Mais ähnliches Polarisationsverhalten der Membran aufgezeigt werden (Kapitel 3.1.4). Hier reagieren die
Schließzellen der Gerste nach Überführung in Dunkelheit mit einer Depolarisation des
Membranpotentials, während die Nebenzellen unmittelbar nach Reizapplikation eine
Hyperpolarisation der Membran zeigen. Da beide Stomakomplexe ähnlich aufgebaut
sind und bei einem Lichtreiz ähnlich reagieren, ist auch bei Schließzellen von Zea mays
eine Depolarisation des Membranpotentials bei Wegnahme des Lichtreizes zu vermuten. Da die Hyperpolarisationsphase des Membranpotentials der Nebenzellen sehr kurz
ist, scheint es jedoch fraglich, ob diese ausreicht, um genügend K+-Aufnahmekanäle
aktivieren zu können. Möglicherweise könnte eine K+-Aufnahme durch K+/H+Symporter unterstützt werden (Very und Sentenac, 2003).
89
DISKUSSION
4.1.4
Identifikation und Regulation der S-Typ-Anionenkanäle in Neben- und
Schließzellen von Zea mays
Bereits Ende der 80er Jahre wurden in Vicia faba Schliesszellen die ersten
Anionenkanäle mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik elektrophysiologisch charakterisiert
(Keller et al., 1989; Schroeder und Hagiwara 1989; Hedrich et al., 1990).
Anionenkanäle in den Zellen des Spaltöffnungsapparates von Zea mays wurden bisher
allerdings noch nicht beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten erstmals Anionenkanäle in Neben- und Schließzellen von Zea mays elektrophysiologisch
untersucht und charakterisiert werden. Durch den Einsatz nicht-permeabler Kationen
(TEA+) und permeabler Anionen (Cl-) war es möglich selektiv Anionenströme aufzuzeichnen. Bei Zugabe des Anionenkanalblockers NPPB war eine Reduktion der Ströme
zu beobachten. Des Weiteren lag das Umkehrpotential beider Zelltypen nah am
Nernstpotential für Chlorid (Kapitel 3.2.1 und 3.2.3). Im Vergleich zu Nebenzellen wiesen die Anionenströme in Mais-Schließzellen ähnliche Merkmale auf wie die Sensitivität gegenüber NPPB und ein Umkehrpotential nahe dem Chlorid-Nernst-Potential. Darüber hinaus zeigten die erstellten Strom-Spannungkennlinien in beiden Zelltypen eine
lineare Abhängigkeit der Anionenströme von der Spannung, was eine Spannungsunabhängige Regulation dieser Anionenkanäle vermuten lässt. All diese Fakten legen
nahe, dass die aufgezeichneten Ströme in Mais-Neben- und Schließzellen von S-TypAnionenkanälen herrührten, die sowohl in Maiswurzelzellen (Giliham und Tester, 2005)
als auch in anderen Spezies beschrieben wurden (Schmidt und Schroeder, 1994;
Frachisse et al., 2000).
Da das Schaltverhalten der Anionenkanäle nicht von der Membranspannung beeinflusst
wird, muss demzufolge ihre Aktivität bei der Stomabewegung durch andere Faktoren
als dem Membranpotential reguliert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die
Anionenströme bei einem [Ca2+]zyt. von 110 nM, welches sich nahe der physiologischen
Ruhekonzentration befand, am größten war (Abbildung 3.8b). Bei Abwesenheit oder
Erhöhung der freien [Ca2+]zyt. auf 390 nM, nahm die Anionenstromamplitude ab. In
Schließzellen hingegegen wurde bei erhöhten Kalziumkonzentrationen eine Stimulation
der
Anionenkanäle
beobachtet
(Abbildung
3.8c).
Während
die
Nebenzell-
2+
Anionenkänale ähnlich auf eine Ca -Erhöhung reagierten wie die Anionenkanäle der
90
DISKUSSION
Maiswurzel (Giliham und Tester, 2005), verhielten sich die Anionenkanäle der Schließzellen im Mais wie die S-Typ Anionenkanäle in den Schließzellen anderer Spezies (Roberts, 2006).
Eine interne Applikation von 10 µM ABA bei einer [Ca2+]cyt von 0 nM als auch von 110
nM führte nur zu einer geringen Erniedrigung der Stromantwort im Vergleich zu unbehandelten Nebenzellprotoplasten. Diese Tendenz konnte einerseits durch eine Erhöhung des zytosolischen Ca2+-Spiegels auf 390 nM, oder andererseits durch eine Erhöhung der ABA-Konzentration auf 20 µM verstärkt werden. Die Daten sprechen für eine
Ca2+-abhängige Inhibition durch ABA, so wie sie auch von den Anionenkanälen der
Maiswurzeln beschrieben ist (Giliham und Tester, 2005). Die Anionenkanäle der
Schließzellen anderer Spezies werden in der Regel durch ABA aktiviert und zeigen daraufhin erhöhte Anionenströme (Roelfsema et al., 2004; Levchenko et al., 2005; Marten
et al., 2007).
Des
Weiteren
wurde
der
zytosolische
Effekt
von
Protonen
auf
die
Nebenzellanionenkanäle analysiert. Hier führte eine Alkalisierung des Zytosols zu einer
größeren Anionenstromamplitude (Kapitel 3.2.2). Die Nebenzellanionenkanäle zeigen
hier also ein anderes Verhalten, als es von S-Typ Anionenkanälen aus Arabidopsis
Hypokotylzellen bekannt ist (Colcombet et al., 2005). Obwohl die Erhöhung des
[Ca2+]zyt.-Spiegels einen inhibitorischen Effekt auf die Anionenkanäle der Nebenzellen
hatte, war bei einer Erhöhung des intrazellulären pH-Wertes sowohl bei 100 nM, als
auch bei 390 nM [Ca2+]zyt. eine gleich starke Zunahme der Stromantworten zu beobachten. Im Gegensatz zur Regulation der ABA-Antwort scheinen hier intrazelluläre Protonen und Ca2+-Ionen unabhängig voneinander auf die Nebenzellanionenkanäle zu wirken. Eine entsprechende Änderung des pH-Wertes bei Schließzellen zeigte hingegen
keinen merklichen Effekt auf die Anionenströme. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivität der S-Typ Anionenkanäle in den Mais-Schließzellen auf eine andere Art und Weise als in Nebenzellen reguliert wird. R-Typ-Anionenkanäle in Vicia faba Schließzellen
werden durch eine zytosolische Alkalisierung inhibiert (Schulz-Lessdorf et al., 1996)
ebenso wie die S-Typ-Anionenkanäle in Arabidopsis Hypokotylzellen, während die RTyp-Anionenkanäle im selben Zellsystem stimuliert werden (Colcombet et al., 2005).
Dies lässt vermuten, dass die Regulationsmechanismen der Anionenkanäle sich zum
Einen Spezies-spezifisch, und zum Anderen Zelltyp-spezifisch unterscheiden können.
91
DISKUSSION
4.1.5
Änderung des zytosolischen pH-Wertes in Nebenzellen während der
Stomabewegung
Bei der Stomaöffnung sollten Anionen aus den Nebenzellen abgegeben werden, um
dann wiederum von den Schließzellen aus dem Apoplast aufgenommen werden zu können.
Schwach
Spannungs-unabhängige
Anionenkanäle
könnten
eine
solche
Anionenabgabe vermitteln. Beim Stomaschluss müssen die Anionen dann wieder von
den Nebenzellen aufgenommen werden. Bei Schließzellen anderer Spezies wurde gezeigt, dass diese Aufnahme vermutlich über Anionen/H+- Symporter erfolgt, auch wenn
ein Nachweis bisher nicht dokumentiert wurde (Guo et al., 2003). In Mais ist durchaus
denkbar, dass die Anionenaufnahme in Nebenzellen auch von solchen Symportern vermittelt wird. Damit eine Nettoaufnahme von Anionen erfolgt, ist es jedoch erforderlich,
dass die Aktivität der Anionenabgabe-Kanäle beim Stomaschluss herunterreguliert
wird. Aufgrund der schwachen Spannungsabhängigkeit der Anionenkanäle müssen andere regulative Faktoren für die Abschaltung dieser Kanäle Sorge tragen. Dafür kommen das Phytohormon ABA, Ca2+-Ionen oder Protonen in Frage (Kapitel 3.2).
Durch Einsatz eines protonensensitiven Farbstoffes konnte im Rahmen dieser Arbeit
erstmals die Änderung des zytosolischen pH-Wertes in intakten Nebenzellen während
der Stomabewegung aufgezeichnet werden. Hierbei kam es in den Nebenzellen während
des Stomaschlusses zu einer Ansäuerung des Zytosols. Von Schließzellen anderer Spezies ist bekannt, dass deren Zytosol während des ABA-induzierten Stomaschlusses alkalischer wird (Irving et al., 1992; Blatt und Armstrong, 1993). Ein Lichtreiz, welcher die
Stomaöffnung induziert, führte zu einer Alkalisierung des Zytosols der Nebenzellen
(Kapitel 3.1.5, Abbildung 3.6). In Einklang mit den Resultaten der Patch-ClampAnalysen an Mais-Nebenzellprotoplasten (Kapitel 3.2.1, Abbildung 3.10) würde die
Alkalisierung zu einer Stimulation der Anionenabgabe führen, welche wiederum eine
Depolarisation
der
Plasmamembran
nach
sich
ziehen
würde.
Infolge
der
Depolarisierung werden dann K+-Abgabekanäle aktiviert. Da die K+-Abgabekanäle zusätzlich durch Alkalisierung stimuliert und gleichzeitig die K+-Aufnahmekanäle inhibiert (Wolf et al., 2006), bewirkt die Alkalisierung des Zytosols zusammen mit der
Membrandepolarisierung einen gerichteten K+-Efflux aus der Nebenzelle. Im Gegenzug
bewirkt die Ansäuerung des Zytosols bei Wegnahme des Lichtreizes eine
92
DISKUSSION
Herunterregulierung der Anionenkanäle. Die gleichzeitig stattfindende Hyperpolarisation verhindert eine Aktivierung der Depolarisationsaktivierten K+-Abgabekanäle, welche
durch die Ansäuerung zusätzlich unterstützt werden könnte.
4.1.6
Modell zur Beschreibung der Shuttle-Ionentransport-Hypothese
Bisher konnten in der Plasmamembran von Maisnebenzellen verschiedene Ionenkanaltypen identifiziert werden: K+- und nicht-selektive Kationen-Abgabekanäle, die durch
Depolarisation aktiviert werden (Wolf et al., 2005), K+-Aufnahmekanäle, die durch Hyperpolarisation aktiviert werden (Majore et al. 2002; Wolf et al., 2005), und spannungsunabhängige S-Typ-ähnliche Anionenabgabekanäle (Kapitel 3.2.1). Aufgrund der Arbeiten von Wolf et al. (2005,2006) ist bekannt, dass die Aktivität der beiden spannungsabhängigen K+-Kanäle nicht nur durch die Membranspannung, sondern auch durch das
Stresshormon ABA und Änderungen in der zytosolischen Ca2+- und H+-Konzentration
beeinflusst werden kann. Werden diese Erkenntnisse zusammenfassend mit den im
Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten betrachtet, lässt sich folgendes Modell zur
Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea
mays aufstellen:
Um eine Öffnung der Stomata durch einen Lichtreiz ermöglichen zu können, muss ein
Transport von Anionen und Kaliumionen von den Nebenzellen zu den Schließzellen
erfolgen. Die Licht-abhängigen pH-Änderungen (Kapitel 3.1.5) deuten darauf hin, dass
in intakten Nebenzellen die S-Typ-ähnlichen Anionenkanäle und die K+-Abgabekanäle
über den zytosolischen pH-Wert reguliert werden können. Eine zytosolische Alkalisierung kann demnach in vivo eine Stimulation der schwach spannungsabhängigen, pHsensitiven Anionenkanäle bewirken. Infolgedessen strömen Anionen aus den Nebenzellen in den Apoplasten, was wiederum die Depolarisation erklären könnte, die bei der
Applikation eines Lichtimpulses beobachtet wurde (Kapitel 3.1.3). Die Depolarisation
93
DISKUSSION
sorgt einerseits für eine Abschaltung der K+-Aufnahmekanäle, was durch die Alkalisierung zusätzlich unterstützt werden könnte. Anderseits werden die K+-Abgabekanäle
über die Depolarisation aktiviert. Dieser Effekt kann durch die beobachtete Alkalisierung in den Nebenzellen weiter verstärkt werden. Als Folge der erhöhten K+Abgabekanal-Aktivität können K+-Ionen aus den Nebenzellen strömen, was im Einklang mit der in den Nebenzellen beobachtete Verringerung der K+-Aktivität bei Lichtapplikation stehen würde (E.-M. Hilgarth, Diplomarbeit, Universität Würzburg). Somit
können K+- und Anionen während der Licht-induzierten Stomaöffnung aus den Nebenzellen entlassen werden, um von den Schließzellen aus dem Apoplast aufgenommen zu
werden.
Abbildung 4.2 Modell der Ionenflüsse zwischen Mais Schließ- und Nebenzellen bei der Lichtinduzierten Stomaöffnung (Em = Membranpotential, [K+] = Kaliumaktivität, K+out = Kaliumabgabekanal, K+in = Kaliumaufnahmekanal, A-out = Anionenabgabekanal).
94
DISKUSSION
Entfällt der Lichtreiz, schließen sich die Stomata. Hierzu müssen Ionen aus den
Schließzellen in den Apoplast entlassen werden, wo sie wiederum von den Nebenzellen
aufgenommen werden. Um dies zu erreichen, muss gewährleistet werden, dass sowohl
die Aktivität der Anionenkanäle als auch die der K+-Abgabekanäle in den Nebenzellen
herunter reguliert wird. Dies könnte über die beobachtete Ansäuerung des Zytosols sowie über die Hyperpolarisation der Membran erreicht werden. Da die Aktivierung einer
ausreichendenden
Anzahl
von
K+-Aufnahmekanäle
durch
die
sehr
kurze
Hyperpolarisationphase (Abbildung 3.3a) fraglich ist, könnte zusätzlich Kalium durch
K+/H+-Symporter in die Nebenzellen gelangen. Dieses Szenario würde durch die
Ansäuerung des Zytosols während der Depolarisation nach der kurzen Hyperpolarisation gestützt. Da die Anionenkanäle eine tragende Rolle bei der Membrandepolarisierung
spielen, selbst aber nur schwach spannungsabhängig sind, scheint der pH-Wert eine
wichtige Rolle bei der Regulation der Anionenkanalaktivität in den Nebenzellen zu
spielen. Im Gegensatz zu den Nebenzellen muss die Aktivität der Ionenkanäle in den
Schließzellen während der Stomabewegung entgegengesetzt reguliert sein. Da sowohl
die K+-Aufnahme- als auch die K+-Abgabekanäle in Schließ- und Nebenzellen ähnliche
Grundcharakteristika aufweisen (Majore et al., 2002; Wolf et al., 2005, 2006), ist eine
Regulation über die invers verlaufende Membranspannung zwischen Schließ- und Nebenzelle am naheliegendsten. Wie auch in Nebenzellen haben die Anionenkanäle der
Schließzellen maßgeblichen Einfluss auf das Membranpotential. Um eine solche invers
verlaufende Membranspannung zu etablieren, wären daher Unterschiede in den Charakteristika der Anionenkanäle zwischen Schließ- und Nebenzellen erforderlich. Und tatsächlich unterscheiden sich die Anionenkanäle der beiden Zelltypen bezüglich ihrer
Ca2+- und H+-Sensitivität. Sollte beim Licht-induzierten Stomaschluss in den Schließzellen eine Alkalisierung stattfinden, wie sie schon beim ABA-induzierten
Stomaschluss bei anderen Spezies beobachtet worden ist (Blatt und Armstrong, 1993),
könnten die fast pH-unempfindlichen S-Typ- Anionenkanäle der Maisschließzellen einen ausreichenden Ausstrom von Anionen gewährleisten. Im Gegensatz zu den Nebenzellen scheint hier die Stimulation der Anionenkanäle in Analogie zu anderen Spezies
über den zytosolischen Ca2+-Spiegel zu erfolgen (McAinsh et al., 1990; Allen et al.,
1999).
95
DISKUSSION
Abbildung 4.3 Modell der Ionenflüsse zwischen Mais Schließ- und Nebenzelle während des
Stomaschlusses nach Wegfall des Lichtreizes (Em = Membranpotential, [K+] = Kaliumaktivität,
K+out = Kaliumabgabekanal, K+in = Kaliumaufnahmekanal, A-out = Anionenabgabekanal).
96
DISKUSSION
4.2
Die molekulare Grundlage der S-Typ-Anionenströme und deren Regulation
in Arabidopsis thaliana
Schon vor mehreren Jahren wurde vermutet, dass S-Typ Anionenkanäle eine wichtige
Funktion beim Stomaschluss spielen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte durch
Patch-Clamp-Analysen an Arabidopsis thaliana ein weiterer Beitrag zur Aufklärung des
molekularen Ursprungs der S-Typ-Anionenströme und deren Regulationsfaktoren in
Schließzellen geleistet werden. Dem in A. thaliana Schließzellen exprimierte Gen
SLAC1 wurde vor kurzem eine essentielle Rolle beim Stomaschluss zugeschrieben. Untermauert wurde dies durch die nahezu vollständige Reduktion der S-TypAnionenströme in SLAC1-Verlustmutanten (Abbildung 3.14 und 3.15; Vahisalu et al.,
2008). Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten nun die Kinasen OST1 und
CPK23 als Regulatoren der SLAC1-Aktivität identifiziert werden. Zudem zeigten diese
Patch-Clamp-Studien zum ersten Mal, dass die direkte Aktivierung von SLAC1 durch
diese Kinasen der Grund für den Phänotyp dieser Kinase-Verlustmutanten ist (Mustili et
al., 2002; Merlot et al., 2002; Yoshida et al., 2002; Xie et al., 2006; Ma et al., 2007).
Des Weiteren konnte der SLAC1-homologe Anionenkanal SLAH3 als Nitrat-permeable
Komponente der S-Typ-Anionenströme identifiziert werden. Die Expression von
SLAH3 in Schließzellen könnte erklären, wie SLAC1-Verlustmutanten ihre Stomata im
diurnalen Wechsel zu öffnen und zu schließen vermögen. Im Folgenden wird daher diskutiert, wie die Regulation auf molekularer Ebene zu einer Aktivierung von S-TypAnionenkanälen führt, die letztendlich im Stomaschluss endet.
97
DISKUSSION
4.2.1
Die Aktivierung von SLAC1 durch OST1 und CPK23
Um einen direkten Zusammenhang zwischen der Aktivität von SLAC1 und OST1 in
planta zu zeigen, wurden Arabidopsis Schließzellprotoplasten mit ABA behandelt und
eine freie [Ca2+]zyt von 110 nM. eingestellt. Im Gegensatz zu Wildtyp-Protoplasten waren die Anionenstromantworten in der ost1-2 Mutante deutlich reduziert. SLAC1Verlustmutanten zeigten jedoch eine weitaus deutlichere Reduktion der Anionenströme
unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 3.14). Die reduzierte Kanalaktivität könnte
erklären, warum ost1-2-Mutanten in Gaswechselexperimenten ihre Stomata während
Tag/Nacht-Wechseln viel langsamer schließen als Wildtyppflanzen (Geiger et al.,
2009). Im Licht waren die Verlustmutanten zwar in der Lage, ihre Stomata zu öffnen,
konnten ihre Stomaöffnungsweite aber nicht an den Wasser- und Turgorverlust korrekt
anpassen und verwelkten demzufolge schneller. Dieser Phänotyp von OST1Verlustmutanten wurde bereits von Mustili et al. (2002) dokumentiert. Dort erschienen
OST1-Verlustmutanten in Thermografie-Screenings als „kalt“, da diese nicht mehr in
der Lage waren, ihre Transpiration zu regulieren. Das Fehlen von OST1 resultierte
demnach in einer deregulierten Stomafunktion, auch wenn die Stomabewegung an sich
noch möglich war. In Oozyten konnte durch die heterologe Coexpression von SLAC1
und OST1 S-Typ-ähnliche Anionenströme erzeugt werden (Geiger et al. 2009). Da die
alleinige Expression von SLAC1 in Oozyten keine Anionenströme generierte, spricht
die Coexpression für eine direkte Aktivierung von SLAC1 durch OST1. Mittels der
BiFC-Technik (Bimolecular Fluorescence Complementation) konnte eine direkte Interaktion von SLAC1 und OST1 sowohl in Oozyten, als auch in transformierten
Arabidopsis Mesophyllprotoplasten visualisiert werden (Geiger et al., 2009). Desweiteren konnte mit dieser Technik auch eine Interaktion von OST1 und ABI1 nachgewiesen
werden. Frühere Studien zeigten bereits, dass ABI1 bei der Regulation des S-Typ
Anionenkanals involviert ist (Pei et al., 1997Yoshida et al., 2006). Wurden SLAC1,
OST1 und ABI1 in Xenopus Oozyten coexprimiert, waren keine Anionenströme mehr
messbar (Geiger et al., 2009). Die Coexpression von ABI1 führt also entweder zu einer
direkten Deaktivierung von SLAC1 oder aber zu einer Deaktivierung von OST1, so
dass dann SLAC1 von OST1 nicht mehr aktiviert werden kann. Durch in vitro Kinase
Assays konnte gezeigt werden, dass OST1 den N-Terminus von SLAC1 phosphoryliert
98
DISKUSSION
und so eine Kanalaktivierung bewirkt (Geiger et al., 2009). Diese Phosphorylierung
wurde durch die Anwesenheit von ABI1 verhindert. Weitere Versuche zeigten, dass die
Phosphatase ABI1 höchstwahrscheinlich als negativer Regulator von OST1 fungiert und
nicht durch Dephosporylierung von SLAC1 die Anionenströme verhindert (Geiger et
al., 2009).
Die in ost1-2-Mutanten vorhandenen Restanionenströme (Abbildung 3.15), die größer
waren als in SLAC1-Verlustmutanten, deuten neben OST1 auf weitere Interaktionspartner von SLAC1, die der Kanalaktivierung bewirken. Während OST1 meist im Zusammenhang mit dem ABA-induzierten Stomaschluss genannt wird, sind CPKs auch in der
Lage, S-Typ-Anionenkanäle in der Abwesenheit von ABA zu beeinflussen (Mori et al.,
2006). Hier konnte die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Hedrich (Universität Würzburg)
mittels der BIFC-Technik in Froschoozyten als auch in transformierten A. thaliana
Mesophyllprotoplasten CPK23 als weiteren direkten Interaktionspartner von SLAC1
identifizieren (Geiger et al., Manuskript eingereicht). An cpk23-Schließzellprotoplasten
konnte
im
Rahmen
der
vorliegenden
Arbeit
gezeigt
werden,
dass
die
Anionenstromantworten bei einem erhöhten zytosolischen Ca2+-Spiegel (2 µM) im Gegensatz zum Wildtyp erheblich reduziert waren (Kapitel 3.2.5.1, Abbildung 3.14). Die
Reduktion der Ströme unter erhöhten zytosolischen Kalziumkonzentrationen, die für die
Aktivität der Kinase als optimal angesehen werden können, spricht für eine Beteiligung
von CPK23 an der SLAC1-Regulation. Eine Aktivierung von SLAC1 durch OST1 wird
unter diesen Bedingungen durch das Fehlen von ABA verhindert. Die Rolle Kalziumabhängiger Schritte bei der Aktivierung von Anionenkanälen wurde schon vorher vermutet, da die Anionenkanäle von abi1-1 Mutanten zwar nicht auf ABA reagierten, aber
durch Kalzium aktivierbar waren (Allen et al., 1999). Diese Vermutung konnte weiter
durch die Coexpression von CPK23 und SLAC1 in Oozyten gestützt werden. In Oozyten konnten nur S-Typ-artige Anionenströme gemessen werden, wenn SLAC1 mit einer
Ca2+-abhängigen Kinase coexprimiert wurde. Dabei resultierte die Coexpression von
CPK23 zusammen mit SLAC1 in den höchsten Anionenströmen (Geiger et al., Manuskript eingereicht). Wie auch für OST1 gezeigt wurde, konnte eine YFPKomplementation bei Coexpression von ABI1 mit CPK23 erreicht werden, was für eine
direkte Interaktion der Kinase mit der Phosphatase spricht. Analog zu den OST1Experimenten wurden auch hier die Ströme durch die zusätzliche Coexpression von
99
DISKUSSION
ABI1 gehemmt. In vitro Kinase Assays zeigten, dass CPK23 den N-Terminus von
SLAC1 phosphoryliert. ABI1 wiederum fungierte als negativer Regulator der Kinase
CPK23 ähnlich wie es für OST1 gezeigt wurde (Geiger et al., Manuskript eingereicht;
Geiger et al., 2009).
Die Aktivierung von SLAC1 in intakten Pflanzen lässt zwei parallel stattfindende Optionen vermuten: einen Ca2+-unabhängigen und einen Ca2+-abhängigen Weg. Während
die Ca2+-unabhängige Proteinkinase OST1 unter ABA-Einfluss für eine Aktivierung
von SLAC1 verantwortlich ist, kontrolliert die Kinase CPK23 die Aktivität von SLAC1
in einer Ca2+-abhängigen Art und Weise. Beide Signalwege stehen unter der negativen
Kontrolle von ABI1 und gehen bei der Aktivierung von SLAC1 ineinander über.
4.2.2
Der Nitrat-permeable Anionenkanal SLAH3
Nach der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung des S-Typ-Anionenkanals
SLAC1 (Negi et al., 2008; Vahisalu et al., 2008, Geiger et al 2009, Geiger et al eingereicht) stellt sich die Frage, wie slac1-3-Mutanten trotzdem fähig sind, ihre Stomata
während des Tag-/Nacht-Rhythmus zu schließen. Es muss also einen alternativen Weg
für einen Anionenefflux geben, um den Stomaschluss zu ermöglichen. Neben der gut
untersuchten Rolle von Chlorid während der Stomabewegung (Raschke und Schnabl,
1978; Blatt 2000; Assmann und Wang, 2001) gibt es jedoch auch Untersuchungen, die
dem Anion Nitrat eine wichtige Rolle während der Stomabewegung zusprechen
(Humble und Hsiao, 1969). So wurde gezeigt, dass ABA Nitrat-permeable
Anionenkanäle in einer Kalzium-abhängigen Art und Weise aktiviert (Schmidt und
Schroeder 1994; Mori et al., 2006). Des Weiteren ist bekannt, dass AtNRT1.1 (CHL1),
ein
in
der
Plasmamembran
lokalisierter
Nitrattransporter
und
-sensor
die
Stomabewegung beeinflusst (Tsay et al., 1993; Guo et al., 2003).
100
DISKUSSION
So konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit in Schließzellprotoplasten von
slac-1-3-Mutanten S-Typ-artige Ströme aufgezeichnet werden, wenn Chlorid weitestgehend durch Nitrat substituiert wurde (Kapitel 3.2.5.3, Abbildung 3.16). Die
Anionenstromamplitude entsprach in etwa denen von Wildtyp-Pflanzen unter identischen Lösungsbedingungen (Abbildung 3.16). Chlorid-vermittelte Anionenströme ließen sich nur generieren, wenn dem Badmedium 3 mM Nitrat zugesetzt wurden (Abbildung 3.18). Demnach muss der Anionenausstrom von einem anderen Anionenkanal als
SLAC1 vermittelt werden, der einer Aktivierung durch Nitrat bedarf. Quantifizierende
Echtzeit-PCR-Experimente zeigten, dass das SLAC1-Homolog SLAH3 ähnlich hohe
Transkriptraten wie SLAC1 in Schließzellen aufweist. Die übrigen SLAC1-Homologen
SLAH1, 2 und 4 waren in Schließzellen nur sehr niedrig exprimiert oder deren
Transkripte waren gar nicht nachweisbar (Geiger et al., unveröffentlicht, Arbeitsgruppe
Prof. Dr. Hedrich, Universität Würzburg). In Schließzellprotoplasten von SLAH3Verlustmutanten waren die Anionenströme in Nitrat-basierenden Lösungen stark reduziert (Abbildung 3.17). Folglich ist zu vermuten, dass SLAH3 den in den SLAC1Verlustmutanten beobachteten Nitratausstrom bzw. Nitrat-aktivierten Chloridausstrom
vermittelt.
Vor einem SLAC/SLAH-freien Hintergrund konnten diese Beobachtungen in Oozyten
bestätigt werden (Geiger et al., unveröffentlicht). Jedoch waren nur S-Typ-artige
Anionenströme in Oozyten detektierbar, wenn SLAH3 mit der Ca2+-abhängigen Kinase
CPK21 coexprimiert wurde. Auch hier führt die Coexpression von ABI1 zur Inhibierung der Anionenströme. Eine Coexpression mit OST1 führte nicht zur Generation von
SLAH3-vermittelten Anionenströmen. Sowohl bei Oozyten als auch bei Schließzellprotoplasten verschob sich das Umkehrpotential nach Nitratzugabe zu negativeren (und
damit physiologischeren) Membranpotentialen, was vermutlich durch eine Erhöhung
der Anionenleitfähigkeit erreicht wurde.
Es kann zusammenfassend festgestellt werden, dass SLAH3 einen Nitrat-permeablen
Anionenkanal in der Schließzelle von A. thaliana darstellt, der durch die Ca2+abhängige Kinase CPK21 reguliert wird.
101
DISKUSSION
4.2.3
Modell zur Regulation derS-Typ-Anionenstromantwort während des
Stomaschlusses in Arabidopsis thaliana
SLAC1 und SLAH3 repräsentieren die lang gesuchten molekularen Komponenten der
S-Typ-Anionenstromantwort, die für einen Stomaschluss essentiell sind. Die Genprodukte unterscheiden sich in ihrer Cl-/NO3--Permeabilität und werden selektiv durch bestimmte Kinasen aktiviert. SLAC1 wird durch die Ca2+-unabhängige Kinase OST1 und
die schwach Ca2+-abhängige Kinase CPK23 aktiviert, während SLAH3 von der Ca2+abhängigen Kinase CPK21 aktiviert wird. Beide befähigen die Schließzellen vielfältige
Ca2+-Signale wahrzunehmen und auf sie spezifisch zu reagieren. Zudem wurde kürzlich
eine ABA-Rezeptor Familie (RCAR1/PYR/PYL; Regulatory Component of ABA
Receptor/Pyrabactin resistent/PYR-Like) identifiziert, die die Aktivität von PP2C
Phosphatasen (z.B. ABI1) reguliert (Ma et al., 2009). Da ABI1 sowohl OST1 als auch
Kinasen der CPK-Familie inhibiert, stehen alle diese SLAC1- und SLAH3aktivierenden Kinasen unter der ABA-abhängigen Kontrolle der ABA-Rezeptoren. In
intakten Pflanzen könnte der ABA-induzierte Stomaschluss demzufolge auf folgender
Abfolge der Ereignisse beruhen:
a) Bei Trockenstress wird das Phytohormon ABA synthetisiert und zu den Stomata
transportiert.
b) In den Schließzellen wird ABA vom RCAR1/PYR/PYL-Komplex erkannt.
c) Diese Aktivierung des ABA-Rezeptors führt einerseits zu einer Inaktivierung
von ABI1 und andererseits zur vermehrten Ausschüttung von Kalzium.
d) Der Wegfall der ABI1-bedingten Inhibition von OST1 führt zur Ca2+unabhängigen und ABA-abhängigen Aktivierung von SLAC1.
e) Die ABI1-bedingte Inhibition von CPK23 und CPK21 wird aufgehoben. Durch
die vermehrte Ca2+-Ausschüttung werden beide Kinasen durch Ca2+-abhängige
Autophosphorylierung aktiviert und phosphorylieren SLAC1 und SLAH3.
f) SLAC1 und SLAH3 werden geöffnet und entlassen Anionen, was wiederum zu
einer Membrandepolarisation führt.
g) Diese Depolarisation führt wiederum zur Aktivierung des Kaliumabgabekanals
GORK.
102
DISKUSSION
h) Der Turgor der Schließzellen sinkt aufgrund der entlassenen Osmotika (Anionen
und K+) und die Pore schließt sich.
Da für die Aktivierung von SLAH3 extrazelluläres Nitrat erforderlich ist, könnte
SLAH3 neben CHL1 (Guo et al., 2003) ein Bindeglied zwischen der Kontrolle des
Wasserhaushaltes durch die Schließzellen und der Wahrnehmung von Nitratsignalen
darstellen.
4.2.4
Die Malat-aktivierte Komponente ALMT12 des R-Typ-Anionenkanals in
Arabidopsis thaliana
Während die Genprodukte SLAC1 und SLAH3 essentielle Komponenten der S-TypAnionenkanäle darstellen, waren die molekulargenetischen Komponenten des R-TypAnionenkanal bisher unbekannt. Der R-Typ Anionenkanal, der auch als GCAC1 (Guard
Cell Anion Channel1) oder QUAC (Quick Activating Anion Channel) bezeichnet wird
(Hedrich et al., 1990; Kolb et al., 1995), zeigt eine schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik und ist stark Spannungs-abhängig. Es wurde kürzlich gezeigt, dass Mitglieder der ALMT-Kanalfamilie (Aluminium Activated Malate Transporter) nicht nur
Malat, sondern auch anorganische Anionen wie Cl-, NO3- und SO42- transportieren. Eine
solche Substratspezifität wurde auch für den R-Typ Kanal aus Schließzellen beschrieben (Pineros et al, 2008). Aus diesem Grund lag die Vermutung nahe, dass ALMTs für
Anionenkanäle kodieren.
Im Rahmen dieses Projektes konnte ALMT12 mit Hilfe von Micro-Arrays in der
Schließzelle identifiziert werden. GUS-Färbungen und ALMT12-GFP-Konstrukte bestätigten die Lokalisation von ALMT12 in der Plasmamembran von Schließzellen (Arbeitsgruppe Prof. E. Martinoia, ETH Zürich; Meyer et al., Manuskript eingereicht).
Aufgrund der Tatsache, dass almt12-Mutanten einen gestörten Stomaphänotyp bei
103
DISKUSSION
Licht/Dunkel-Wechseln, erhöhter CO2-Konzentration und ABA-Applikation aufwiesen(Meyer et al., 2010; Manuskript eingereicht) und einige Mitglieder der ALMTFamile als Anionenkanäle fungieren (Pineros et al., 2008), wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von ALMT12 anhand isolierter Schließzellprotoplasten und
durch Expression in Oozyten untersucht. Im Gegensatz zu Vicia faba (Raschke et al.,
2003, Hedrich et al. 1990; Marten et al., 1991) war das Verhalten des R-TypAnionenkanals in Arabidopsis-Schließzellen bislang noch nicht im Detail beschrieben.
Patch-Clamp-Analysen im Rahmen dieser Dissertation zeigten nun, dass der R-TypAnionenkanal in Arabidopsis-Schließzellprotoplasten ähnliche elektrophysiologische
Eigenschaften hinsichtlich der Spannungsabhängigkeit und der Aktivierungs-, Deaktivierungs- und Inaktivierungskinetik wie GCAC1/QUAC aus Vicia faba aufweist (Kapitel 3.2.5.4, Abbildung 3.20-3.22; Raschke 2003; Kolb et al., 1995; Marten et al., 1991).
Jedoch wurde die Spannungsabhängigkeit des R-Typ-Anionenstroms in den Schließzellprotoplasten von A. thaliana im Gegensatz zu Vicia faba nicht durch Malat moduliert (Abbildung 3.23 und 3.24; Marten et al, 1993). Extrazelluläres Malat hatte aber
einen Einfluss auf die Amplitude der Stromantwort.Es konnten sowohl in WildtypPflanzen als auch in almt12-1-Mutanten R-Typ-Anionenströme beobachtet werden
(Abbildung 3.25), wobei die Ströme in der ALMT12-Verlustmutante in Anwesenheit
von externem Malat um etwa die Hälfte reduziert waren. Nach Substituierung des extrazellulären Malats durch Sulfat waren keinerlei Unterschiede in der Stromamplitude
mehr festzustellen (Abbildung 3.24). Diese Beobachtung weist daraufhin, dass die RTyp-Anionenkanalströme in A. thaliana Schließzellen von mehreren Untereinheiten
und/oder Komponenten vermittelt werden. Es ist daher wahrscheinlich, dass es sich bei
ALMT12 um die Malat-aktivierte Komponente des R-Typ-Anionenkanals in
Arabidopsis Schließzellen handelt. Diese Annahme konnte durch die Untersuchung von
ALMT12 in Oozyten unterstützt werden. Auch in Oozyten zeigt der Kanal ähnliche
Kinetiken und ein Malat-abhängiges Verhalten (Meyer et al., Manuskript eingereicht).
In A. thaliana Schließzellen konnten nur R-Typ-Stromantworten aufgezeichnet werden,
wenn Sulfat in der Pipette vorhanden war. Dies und die Tatsache, dass die Injektion von
Sulfat in ALMT12-exprimierende Oozyten zu einem Anstieg der Einwärtsströme führte, deuten auf Sulfat als bevorzugtes Substrat hin. Dies steht in Einklang mit der Beobachtung, dass sich die Chloridflüsse bei der Ionenbewegung während der
104
DISKUSSION
Stomabewegung verringern, wenn einer Nährlösung Kaliumsulfat zugesetzt wird
(Schnabl und Raschke, 1980).
Die Untersuchung anderer in der Schließzellplasmamembran exprimierter Mitglieder
der ALMT-Familie könnte Aufschluss über weitere Komponenten der R-TypAnionenstromantwort geben. Da GCAC1 in Vicia faba durch ABA beeinflusst werden
kann (Raschke, 2003; Roelfsema et al. 2004), aber die Aktivierung in Oozyten weder
OST1 noch CPKs erfordert, lässt vermuten, dass SLAC1/SLAH3 und ALMT12 von
zwei
verschiedenen
ABA-Signaltransduktionsketten
angesprochen
werden.
105
ZUSAMMENFASSUNG
5
Zusammenfassung
1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenommenen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays
gewonnen werden:
a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche
Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende
zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische
Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen
wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende
zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert.
b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-ElektrodenTechnik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des
Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung
aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein
zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläufig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnliches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend.
c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkalisierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei
Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte.
d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen
konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw.
1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden.
Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewonnenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des ShuttleIonentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten
Stomabewegung eingebunden werden.
106
ZUSAMMENFASSUNG
2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließzellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-TypAnionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-TypAnionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 kodiert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem
durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche
Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion darstellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde,
scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Entlassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen.
3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A.
thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsabhängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana
nicht
durch
externes
Malat
beeinflusst.
Jedoch
war
unter
externen
Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu
Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbedingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszumachen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des RTyp-Anionenkanals verantwortlich zu sein.
107
ZUSAMMENFASSUNG
6
Summary
1. Within this dissertation the following new insights into the coordinated ion
transport between guard and subsidiary cells of Zea mays were gained:
a. Using the patch clamp technique on subsidiary and guard cell protoplasts, S-type-like anion channels were identified in both cell types. In
subsidiary cells they were inhibited by elevated cytosolic calcium concentrations and stimulated by ABA and cytosolic alkalinization. In contrast, the S-type-like guard cell anion channels were hardly influenced by
alkalinization and stimulated upon a rise in the cytosolic free calcium
level.
b. Impaling of subsidiary cells in intact Zea mays plants with microeletrodes revealed a reversed membrane polarization during light-/darknessinduced stomatal movement. Since the membrane potential of Hordeum
vulgare subsidiary cells showed a similar behavior that was, however,
reversed in the surrounding guard cells during stomatal movement, a
similar change in the membrane potential of Zea mays guard cells is
most likely.
c. Furthermore an alkalinization in Zea mays subsidiary cell could be monitored during light-induced stomatal opening, which returned to original
values after stomatal closure.
d. Based on reconstructed 3D-models of intact maize stomatal complexes, a
volume ratio between guard cells and subsidiary cells of 1:6 and 1:4 of
open and closed stomata, respectively, were estimated.
The obtained results could be conclusively embedded in a model that decribes
the shuttle transport of ions between guard and subsidiary cells during lightinduced stomatal movement.
108
ZUSAMMENFASSUNG
2. Patch clamp studies on guard cells of A. thaliana CPK23- and OST1-loss-offunction mutants showed strongly reduced S-type anion currents after stimulation through Ca2+ or ABA compared to wild type. These in vivo data support the
results of the working group of Prof. R. Hedrich (University Würzburg), that
OST1 and CPK23 are directly interacting with the S-type anion channel in A.
thaliana. The SLAC1-homologue gene SLAH3 is encoding for a nitrate permeable S-type anion channel in guard cells. Since SLAC1-loss-of-funtion mutants
generate S-type anion currents when nitrate is the dominating anion or nitrate is
present in chloride-based solutions, SLAH3 seems to represent an alternative
pathway for anion efflux in guard cells.
3. The R-type anion channels from Arabidopsis thaliana guard cells were electrophysiologically characterized and revealed similar electrical characteristics as
those known from Vicia faba guard cells: strong voltage dependence, fast activation- and deactivation kinetics. In contrast to Vicia faba, however, the voltage
dependence was not modulated by external malate. But in the presence of external malate the current response in ALMT12-loss-of-function mutants was
strongly reduced, while similar anion currents were monitored in wild type and
almt12 mutant plants in the absence of external malate. These results indicate
that ALMT12 is likely responsible for the malate-activating component of the Rtype anion channel.
109
ANHANG
7
Anhang
7.1
Literaturliste
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7.2
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Darstellung zweier Stomatypen. .............................................................. 3
Abbildung 1.2 Spaltöffnungsapparat von Zea mays mit geschlossenen und
geöffneten Poren. ................................................................................................ 18
Abbildung 1.3 Modell zur Beschreibung des Kaliumkanalexpressionsmusters
innerhalb des Stomakomplexes von Mais........................................................... 19
Abbildung 2.1 Übersicht der verschiedenen Patch-Clamp-Messkonfigurationen ........ 29
Abbildung 2.2 Elektrisches Schaltbild eines Patch Clamp Verstärkers. ....................... 31
Abbildung 2.3 Darstellung eines Einfach-Spannungspulsprotokolls und eines
Doppelspannungspulsprotokolls ......................................................................... 35
Abbildung 2.4 Schema des Zwei-Elektroden-Spannungsklemmenverfahrens ............. 40
Abbildung 2.5 pH-abhängiges Anregungsspektrum des Fluoreszenzfarbstoffs
BCECF. ............................................................................................................... 43
Abbildung 3.1 Volumenbestimmungen von Neben- und Schließzellen ....................... 48
Abbildung 3.2 Einstichelektrodenmessungen an Neben- und Schließzellen im
Spannungsklemmenmodus.................................................................................. 50
Abbildung 3.3 Änderungen im freilaufenden Membranpotential in intakten
Nebenzellen und Schließzellen von Zea mays als Antwort auf einen
Lichtstimulus oder eine Dunkelphase. ................................................................ 52
Abbildung 3.4 Einstichelektrodenmessungen an intakten Neben- und Schließzellen
von Hordeum vulgare im Spannungsklemmenmodus. ....................................... 54
126
ANHANG
Abbildung 3.5 Änderungen im freilaufenden Membranpotential in intakten
Nebenzellen und Schließzellen von Hordeum vulgare auf einen
Lichtstimulus oder eine Dunkelphase ................................................................. 55
Abbildung 3.6 Simultane Aufnahme der Reaktionen des freilaufenden
Membranpotentials und des zytosolischen pH-Wertes auf eine Dunkelphase
und einen Lichtreiz von Zea mays Nebenzellen. ............................................... 57
Abbildung
3.7
Makroskopische
Stromaufzeichnungen
von
MaisNebenzellprotoplasten......................................................................................... 59
Abbildung 3.8 Zytosolischer Ca2+-abhängiger Effekt von ABAintern auf die
Anionenströme von Maisnebenzellprotoplasten bei [Ca2+]zyt. = 0 nM,
[Ca2+]zyt. = 100 nM und [Ca2+]zyt. = 390 nM........................................................ 61
Abbildung 3.9 Rückgang der Anionströme von Maisnebenzellprotoplasten bei
einem zytosolischen Ca2+-Spiegel von 100 nM bei einer Spannung von -156
mV als Reaktion auf die interne Gabe von 10 µM bzw. 20 µM ABA ............... 62
Abbildung 3.10 Anstieg der Anionenströme durch zytosolische Alkalisierung bei
verschiedenen internen Kalziumkonzentrationen. .............................................. 63
Abbildung
3.11
Makroskopische
Anionenströme
eines
MaisSchließzellprotoplasten. Ganzzellstromantworten auf Spannungspulse von 196 mV bis +104 mV, bei einer Haltespannung von 0 mV und einer
zytosolischen Ca2+-Konzentration von 100 nM .................................................. 64
Abbildung 3.12 Makroskopische Stromaufzeichnungen von einem MaisSchließzellprotoplasten. ...................................................................................... 66
Abbildung 3.13 Abfall der Anionenströme durch Erhöhung des zytosolischen pHWerts in Maisschließzellen bei einem zytosolischen Ca2+-Spiegel von 100
nM. ...................................................................................................................... 67
Abbildung 3.14 Anionenströme von cpk23-Schließzellprotoplasten ............................ 70
Abbildung 3.15 Anionenströme von ost1-2-Schließzellprotoplasten ............................ 72
Abbildung
3.16
Nitrat-vermittelte
Anionenströme
in
slac1-3
Schließzellprotoplasten. ...................................................................................... 73
Abbildung 3.17 Nitrat-vermittelte Ganzzellanionenströme von Wildtyp- und slah31-Schließzellprotoplasten .................................................................................... 74
Abbildung 3.18 Vergleich der Gleichgewichtsströme bei -106 mV von A. thaliana
Schließzellen von slah3-1 und slac1-3, unter Bedingungen, in denen Nitrat
das Haupt-Anion darstellte.................................................................................. 75
Abbildung
3.19
Strom-Spannungskennlinie
durch
Auftragen
der
Gleichgewichtsströme gegen die angelegte Spannung unter Bedingungen, in
denen
Chlorid
das
Haupt-Anion
darstellt
von
Arabidopsis
Schließzellprotoplasten von slac1-3 Mutanten in Abwesenheit und in
Anwesenheit von extrazellulären NO3-. .............................................................. 76
Abbildung 3.20 Aktivierende R-Typ Ganzzellstromantworten eines A. thaliana
Schließzellprotoplasten bei einer internen Sulfatkonzentration von 75 mM
und einer externen Sulfatkonzentration von 20 mM........................................... 78
Abbildung 3.21 Deaktivierende R-Typ Ganzzellstromantworten eines Arabidopsis
Schliesszellprotoplasten bei einer Sulfatkonzentration von 75 mM intern
und 20 mM extern ([Ca2+]zyt. = 1 µM). ............................................................... 79
127
ANHANG
Abbildung
3.22
Inaktivierender
Anionenstrom
eines
A.
thaliana
Schließzellprotoplasten bei einer Sulfatkonzentration von 75 mM intern und
20 mM extern ...................................................................................................... 80
Abbildung 3.23 Spannungsabhängiges Schaltverhalten des R-Typ-Anionenanals in
Arabidopsis Wildtyp-Schließzellprotoplasten. ................................................... 81
Abbildung 3.24 R-Typ-Stromantworten von Wildtyp- und almt12Schließzellprotoplasten unter Sulfat-Bedingungen.. ........................................... 82
Abbildung 3.25 R-Typ-Stromantworten von Wildtyp- und almt12Schließzellprotoplasten unter Malat-Bedingungen. ............................................ 83
Abbildung 3.26 Strom-Spannungskennlinie von A. thaliana WildtypSchließzellprotplasten bei internem Chlorid und Sulfat. .................................... 84
Abbildung 4.1 Transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahme eines
stomatären komplexes von Zea mays.................................................................. 88
Abbildung 4.2 Modell der Ionenflüsse zwischen Mais Schließ- und Nebenzellen
bei der Licht-induzierten Stomaöffnung ............................................................. 94
Abbildung 4.3 Modell der Ionenflüsse zwischen Mais Schließ- und Nebenzelle
während des Stomaschlusses nach Wegfall des Lichtreizes. .............................. 96
7.3
Abkürzungsverzeichnis
[Ca2+]zyt.
zytosolische Kalziumkonzentration
°C
Grad Celsius
µM
Mikrometer
ABA
Abscisinsäure
Abb.
Abbildung
ADP
Adenosindiphosphat
Ag
Silber
ATP
Adenosintriphosphat
BCECF
([2‘,7‘-bis-(2-carboxyethyl)-5(and6)carboxyflurescein])
128
ANHANG
BiFC
Bimolecular Fluorescence Complementation
Br-
Bromid
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
Ca2+
Kalzium-Ion
CFDA
Carboxyfluoresceindiacetat
Cl-
Chlorid
Cm
Membrankapazität
cm2
Quadratcentimeter
CO2
Kohlendioxid
CsCl
Cäsiumchlorid
zyt.
Zytosolisch
ECl
Nernstpotential für Chlorid
EGTA
engl.: ethyleneglycoltetraacetic acid
g
Erdbeschleunigung
GC
Guard cell
GFP
Grün fluoresziierendes Protein
GUS
Β-Glucuronidase
HEPES
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazin-N`-2-Ethansulfonsäure
I
Strom
I-
Iodid
Iss
Gleichgewichtsstrom (engl. Steady-state-current)
K+
Kalium-Ion
KCl
Kaliumchlorid
LaCl3
Lanthanchlorid
129
ANHANG
LJP
Diffusionspotential (engl. Liquid Junction Potential)
LSM
Laser Scanning Mikroskop
MES
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
MgCl2
Magnesiumchlorid
min
Minuten
mm
Millimeter
mosm
Milliosmol
mRNA
Boten-RNA (engl. Messenger ribonucleic acid)
mV
Millivolt
NADPH
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
nm
Nanometer
NO3-
Nitrat
pA
Pikoampere
PAR
Photosynthetisch aktive Strahlung (engl. photosynthetic active
radiation)
pF
Pikofarad
pl
Pikoliter
pS
Pikosiemens
RT-PCR
Real time polymerase chain reaction
s.o.
siehe oben
SC
Subsidiary cell
SO42-
Sulfat
sog.
sogenannt
TEA
Tetraethylamonium
Tris
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol
130
ANHANG
U/min
Umdrehung/Minute
V
Volt
v.a.
vor allem
VLJP
Diffusionspotential
w/v
weight/volume
WT
Wildtyp
YFP
Gelb fluoreszierendes Protein (engl. Yellow fluorescing protein)
z.B.
zum Beispiel.
7.4
Publikationen
Geiger, D., Scherzer, S., Mumm, P., Stange, A., Marten, I., Bauer, H., Ache, P., Matschi, S., Liese, A., Al-Rasheid, K. A. S., Romeis, T., and Hedrich, R. (2009) Activity of guard cell anion channel SLAC1 is controlled by drought-stress signaling kinase-phosphatase pair. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 106, 21425 – 21430
Geiger D., Scherzer S., Mumm P., Marten I., Ache P., Matschi S., Liese A., Wellmann C., Al-Rasheid K. A. S., Grill E., Romeis T., Hedrich R. (2010) Guard cell
anion channel SLAC1 is regulated by CDPK protein kinases with distinct Ca2+
affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America (under review)
Meyer S., Mumm P., Imes D., Endler A., Weder B., Al-Rasheid, K. A. S., Geiger D.,
Marten I., Martionia E., Hedrich R. (2010) AtALMT12 represents an R-type
channel required for stomatal movement in Arabidopsis guard cells. The Journal
of Biological Chemistry (submitted)
131
ANHANG
Geiger D., Maierhofer T., Al-Rasheid K. A. S., Scherzer S., Mumm P., Ache P., Grill
E., Marten I., Hedrich R. (2010) Fast abscisic acid signalling of stomatal closure
via guard cell anion channel SLAH3 and ABA-receptor RCAR1. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America (submitted)
Mumm P., Wolf T., Fromm J., Roelfsema M.R.G., Marten I. (2010) Cell-type specific
regulation of the anion channels within the cells of the maize stomatal complex.
Plant & Cell Physiology (in preparation)
132
ANHANG
7.5
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Andrew Patrick Mumm
Geburtsdatum:
13.04.1979
Geburtsort:
Hongkong
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
verheiratet
Schulbildung
1986 ‐ 1989
Grundschule Karlstein-Dettingen am Main
1989 ‐ 1998
Hanns-Seidel-Gymnasium, Hösbach
22.06.1998
Erwerb der allgemeinen Hochschulreife
Hochschulausbildung
10/1999 ‐ 10/2005 Studium der Biologie (Diplom) an der Julius‐Maximilians-Universität Würzburg mit Vertiefung der Fächer Verhaltensphysiologie & Soziobiologie,
Tierökologie und Tropenbiologie und Molekulare Pflanzenphysiologie & Biophysik;
Abschluss: sehr gut
12/2004 ‐ 10/2005 Anfertigung der Diplomarbeit unter der Anleitung von Prof. Dr.
Irene Marten mit dem Thema: „Molekularbiologische Untersuchungen zur Regulation
des Spaltöffnungsapparats höherer Pflanzen“ am Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik an der Bayerischen Julius‐Maximilians‐Universität Würzburg
133
ANHANG
11/2005 Beginn der experimentellen Arbeiten zur vorliegenden Dissertation; seitdem
wissenschaftliche Mitarbeiter am Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie und
Biophysik der Bayerischen Julius‐Maximilians‐Universität Würzburg unter der Leitung
von Prof. Dr. Irene Marten
Posterpräsentationen:
Mumm P., Hilgarth E., Fromm J., Hedrich R., Roelfsema R., and Marten I. (2006)
“Shuttle transport of potassium ions between subsidiary cells and guard cells in the
maize stomatal complex”
Botanikertagung Hamburg 2006
Vorträge:
Mumm, P. und Marten, I.
„Ion fluxes in the stomatal complex of maize”
Abschlusstreffen des Schwerpunktsprogramms 1108 der “Deutschen Forschungsgemeinschaft” mit dem Thema:
„Dynamik und Regulation des pflanzlichen Membrantransportes“
Hirschberg 2008
134
ANHANG
7.6
Danksagung
Ich danke der Academy und allen die durch Unterstützung jedweder Art zum Gelingen
und erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit beigetragen haben.
Im Besonderen danke ich…
…Prof. Dr. Irene Marten für die spannende und interessante Aufgabenstellung, für die
vorbildliche Betreuung, für ihre Geduld, für die Einführung in die Elektrophysiologie,
für die vielen Diskussionen, für die Freiräume, die ich während der Arbeit hatte, aber
auch für die Motivation, wenn mal wieder kein Licht am Ende des Tunnels zu sehen
war und natürlich für die stete Unterstützung meiner Arbeit.
…Prof. Dr. Hedrich für die Gelegenheit die vorliegende Arbeit am Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik anfertigen zu können, für die Einbeziehung
in aktuelle Forschungsprojekte und nicht zuletzt für die Möglichkeit auch in Zukunft in
seiner Arbeitsgruppe forschen und arbeiten zu können.
…Prof. Dr. Petra Dietrich von der Universität Erlangen, sich als Zweitgutachter dieser
Arbeit zur Verfügung zu stellen.
…Prof. W. Rössler und Dr. Christina Zube für die Möglichkeit die 3D-Modelle am
Lehrstuhl Zoologie II anfertigen zu können.
…Dr. Dietmar Geiger , Dr. Uta Anschütz und Dipl.-Biol. Melanie Baumann für’s Korrekturlesen.
135
ANHANG
…ganz besonders meinen Büromitbewohnern, Badmintonmitstreitern, Feierabendbierkollegen und auch allen anderen, die mich in den letzten Jahren ertragen, aufgebaut,
motiviert und unterstützt haben. („Ihr wisst, wenn ihr gemeint seid….danke, danke,
danke....ohne euch hätte ich das nicht geschafft!“)
…den aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des Instituts für das angenehme Arbeitsklima.
…den sog. „nicht-wissenschaftlichen“ Mitarbeitern: den TA’s fürs Bestellen und das
„Drumherum“, Joachim und seinen Gärtnern für den Überblick über die Vielzahl an
Mutanten, den Werkstattjungs und den Elektrowerkstattjungs fürs Ausleihen allermöglicher Gerätschaften und Reparatur diverser Kollateralschäden, Matze und Karin aus
dem Sekretariat fürs Übernehmen der formaljuristischen Bürokratie, Marlene Barecca
und der Putzmannschaft, Caroline aus der Bibliothek und Dr. Christian Wiese für Beistand in Computer- und Kopierernotfällen.
…meinen Freunden, die zwar keine Ahnung von dem haben, was ich tue, aber mich
stets daran erinnert haben, dass es auch ein Leben außerhalb der Arbeit gibt.
…meinen Schwiegereltern und meinem Schwager für Hilfe, Beistand und Zerstreuung
in stressigen Phasen.
…meiner Familie, deren Unterstützung ich mir immer sicher sein konnte.
…meiner Frau Lena für ihre Liebe, ihren Beistand in allen Lebenslagen und das Durchleben von Höhen und Tiefen („Ohne Dich würde das alles keinen Sinn machen.“).
136
ANHANG
8
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation in allen Teilen selbst angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet
habe.
Ich habe die Dissertation weder in gleicher noch in ähnlicher Form in anderen Prüfungsverfahren vorgelegt. Ich habe bisher außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten Graden weder weitere akademische Grade erworben, noch zu erwerben
versucht.
Würzburg,
.................................
Patrick Mumm
137

Dokument_1. - OPUS Würzburg

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