Atherosklerose und Apoptose - Johannes Gutenberg

Transcrição

Atherosklerose und Apoptose:
Identifizierung von freien Fettsäuren aus enzymatisch
verändertem LDL als Auslöser der Apoptose in
humanen Endothelzellen
Dissertation
zur Erlangung des Grades
„Doktor der Naturwissenschaften“
am Fachbereich Pharmazie
der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
von
Katrin Dersch
geb. in Marburg
Mainz, 2005
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ........................................................................................... 7
1.1 Definition und Pathogenese der Atherosklerose .....................................................7
1.2 Oxidationstherorie, Scavenger-Rezeptoren............................................................13
1.3 Das Mainzer Konzept: Entwicklung einer alternativen Hypothese zur
Atherosklerose ........................................................................................................16
1.4 Zusammenhang des Themas dieser Arbeit mit der Atherosklerose ....................19
1.5 Signalübertragung durch MAPK ..............................................................................20
1.5.1 Signalübertragung via Raf-MEK-Erk .................................................................................. 22
1.5.2 Signalübertragung via ASK1 - p38/JNK ............................................................................. 23
1.5.2.1 Aktivierungsmechanismus von ASK1 ......................................................................... 24
1.5.2.2 Weitere antiapoptotische Bindungspartner von ASK1 ................................................ 27
1.5.2.3 Proapoptotische Bindungspartner von ASK1.............................................................. 30
1.6 Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF- κB ................................................................32
1.6.1 AP-1 .................................................................................................................................... 32
1.6.2 NF-κB.................................................................................................................................. 34
2. Fragestellung................................................................................... 37
3. Material und Methoden ................................................................... 38
3.1 Chemikalien ...............................................................................................................38
3.2 Inhibitoren..................................................................................................................39
3.3 Reagenzien für die Behandlung von Zellen ............................................................40
3.4 Puffer und Lösungen ................................................................................................40
3.5 Enzyme.......................................................................................................................42
3.6 Marker.........................................................................................................................42
3.7 Transfektion / Immunpräzipitation...........................................................................42
3.8 Antikörper ..................................................................................................................43
3.9 Kits..............................................................................................................................44
3.10 Plasmide...................................................................................................................45
3.11 siRNA´s ....................................................................................................................46
3.12 Bakterien ..................................................................................................................46
3.13 Laborbedarfsartikel.................................................................................................46
3.14 Laborgeräte..............................................................................................................47
3.15 Materialien und Medien für die Zellkultur..............................................................48
3.16 Allgemeine Durchführung der Proteinbestimmung .............................................50
3.17 LDL-Präparation ......................................................................................................50
3.18 Messung der Cholesterin-Konzentration ..............................................................52
3.19 Enzymatische Modifikation von LDL .....................................................................53
3.20 Flotieren von E-LDL: Herstellung von E-LDL(d4) und E-LDL(d10) .....................54
3.21 Rekonstitution von flotiertem E-LDL(d4)/(d10).....................................................55
3.22 Oxidation von LDL ..................................................................................................55
3
3.23 Zellkulturen ..............................................................................................................58
3.24 Allgemeine Durchführung zur Gewinnung von Proben für Western Blots........59
3.25 Allgemeine Durchführung einer transienten Transfektion..................................59
3.25.1 Transfektion von Plasmid-DNA für Western-Blot bzw. Immunfluoreszenz-Analysen.. 60
3.25.2 Transfektion von Reporterplasmiden ........................................................................... 61
3.25.3 Transfektion von siRNAs.............................................................................................. 61
3.26 Allgemeine Durchführung zur Gewinnung von Proben für
Immunpräzipitationen .............................................................................................62
3.27 Allgemeine Durchführung von Westernblots .......................................................63
3.28 Allgemeine Durchführung der Immunfluoreszenz ...............................................66
3.29 Allgemeine Durchführung der ATP-Messung.......................................................68
3.30 Allgemeine Durchführung der Luciferase-Messung ............................................68
3.31 Caspase-Assay........................................................................................................69
3.32 Caspase-Färbung ....................................................................................................70
3.33 Annexin-V-EGFP Assay ..........................................................................................71
3.34 TUNEL-Assay...........................................................................................................71
3.35 PARP-Fragmentierung ............................................................................................72
3.36 Oil-red O-Färbung ...................................................................................................72
3.37 Messung des oxidative Burst.................................................................................73
3.38 Transformation von Kompetenten Zellen .............................................................73
3.39 Minipräparation von Plasmid-DNA aus einer Bakterienkultur ............................74
3.40 Restriktionsverdau der Minipräps .........................................................................75
3.41 Agarose-Gel-Elektrophorese..................................................................................75
3.43 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA ......................................................................76
3.44 Herstellung des Kontrollvektors pcDNA3 .............................................................77
4. Ergebnisse ....................................................................................... 81
4.1 Enzymatisch Verändertes LDL aktiviert MAP- Kinasen.........................................81
4.1.1 Erste Versuche zur ASK1-Aktivierung................................................................................ 81
4.1.1.1 Endogenes ASK1 ........................................................................................................ 81
4.1.1.2 Transfektion von FlagASK1......................................................................................... 81
4.1.1.3 Nachweis der Transfektion mittels Immunfluoreszenz................................................ 82
4.1.1.4 Nachweis der Transfektion mittels Western-Blot ........................................................ 83
4.1.1.5 Transfektion von FlagASK1 in 293-Zellen und Aktivierung mit H2O2 .......................... 83
4.1.1.6 Transfektion von 293-bzw. HeLa-Zellen mit FlagASK1und Behandlung mit Fettsäuren
und E-LDL ................................................................................................................... 84
4.1.1.7 Nachweis von pp5 in Endothelzellen .......................................................................... 85
4.1.1.8 Hemmung von pp5 mit Fumonisin B1 ......................................................................... 85
4.1.1.9 Detektion von P-ASK1 mittels anti-Phospho-Threonin Antikörper............................. 86
4.1.1.10 Immunpräzipitation von FlagASK1 aus transfizierten 293-Zellen mit anti-Flag
Antikörper nach Behandlung mit H2O2 und Linolsäure ............................................... 87
4.1.2 Aktivierung von MAP-Kinasen durch E-LDL und FFA........................................................ 89
4.1.2.1 E-LDL aktiviert p38-MAP-Kinase und cJun-N-Terminal Kinase (JNK) ....................... 89
4.1.2.2 Die p38-Aktivierung durch E-LDL ist fettsäure-abhängig............................................ 91
4.1.3 E-LDL und FFA aktivieren ASK1 ........................................................................................ 95
4.1.3.1 E-LDL aktiviert ASK1................................................................................................... 95
4.1.3.2 Freie Fettsäuren aktivieren ASK1 ............................................................................... 96
4.1.4 Die Aktivierung von p38-MAP-Kinase durch E-LDL ist abhängig von ASK1 ..................... 97
4
4.1.4.1 siRNA vermittelte Genausschaltung............................................................................ 97
4.1.4.2 Ausschaltung von ASK1 durch siRNAs verhindert die Aktivierung von p38-MAP
Kinase durch E-LDL .................................................................................................... 99
4.2 E-LDL bzw. FFA induzieren Apoptose in Endothelzellen ....................................101
4.2.1 E-LDL ist zytotoxisch ........................................................................................................ 103
4.2.2 Oil-red O Färbung............................................................................................................. 104
4.2.2 Annexin-V-Färbung........................................................................................................... 105
4.2.3 E-LDL aktiviert Caspase-3 und -7 .................................................................................... 106
4.2.3.1 Caspase-Färbung...................................................................................................... 107
4.2.3.2 Caspase-Assay ......................................................................................................... 108
4.2.4 Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL oder FFA führt zu positiver TUNELFärbung............................................................................................................................. 109
4.2.5 Behandlung von Endothelzellen mit freien Fettsäuren führt zur Fragmentierung von
PARP ................................................................................................................................ 111
4.2.6 Hemmung von ASK1 bzw. p38-MAP Kinase verhindert die E-LDL-induzierte Apoptose
in Endothelzellen .............................................................................................................. 112
4.2.6.1 Ausschaltung von ASK1 hemmt die Caspasen-Aktivierung durch E-LDL ................ 112
4.2.6.2 Ausschaltung von ASK1 verhindert PARP-Spaltung durch E-LDL bzw. FFA.......... 113
4.2.6.3 Hemmung von p38-MAP Kinase mit SB203580 führt zu geringerem ATP-Verlust
bzw. verminderter Caspasen-Aktivierung nach E-LDL Behandlung......................... 113
4.3 E-LDL verursacht oxidativen Stress in Endothelzellen .......................................116
4.3.1 Messung des oxidative burst mit Luminol und Cytochrom C ........................................... 117
4.3.2 Messung des oxidative burst mit Dichlorofluorescein (DCF)............................................ 118
4.3.3 NAC inhibiert Aktivierung von MAP-Kinasen durch E-LDL .............................................. 119
4.3.3.1 Vorbehandlung mit NAC verhindert Aktivierung von ASK1 durch E-LDL ................. 120
4.3.3.2 Vorbehandlung mit NAC verhindert Aktivierung von p38-MAP Kinase..................... 121
4.4 Effekt von E-LDL auf AP1 und NF-κB ....................................................................122
4.4.1 Allgemeines zu Reporterplasmiden.................................................................................. 122
4.4.2 E-LDL aktiviert pAP1-Luc und hemmt pNF-κB-Luc.......................................................... 123
4.4.3 Cotransfektion der Reporterplasmide mit FlagASK1........................................................ 125
4.5 Effekte von alpha-Toxin auf MAP-Kinasen ...........................................................128
4.5.1
4.5.2
4.5.3
4.5.4
Eigenschaften von alpha-Toxin ........................................................................................ 128
alpha-Toxin aktiviert die MAP-Kinasen p38, JNK und Erk in HaCat-Zellen ..................... 129
Schwache Aktivierung von ASK1 durch alpha-Toxin ....................................................... 131
Die p38-Aktivierung durch alpha-Toxin ist wahrscheinlich nicht unbedingt ASK1abhängig ........................................................................................................................... 131
4.5.5 Die p38-Aktivierung durch alpha-Toxin ist nicht hemmbar durch Antioxidantien (NAC) .. 132
5. Diskussion ..................................................................................... 134
5.1 Freie Fettsäuren aus E-LDL induzieren Apoptose ...............................................134
5.2 Bedeutung der Apoptose von Endothelzellen für die Pathogenese der
Atherosklerose ......................................................................................................137
5.3 Verbindung der Apoptose mit der MAPK-Kaskade..............................................140
5.4 Vergleich von oxidiertem LDL mit nativem bzw. E-LDL ......................................144
5.5 Die Bedeutung von intrazellulär entstehenden ROS ...........................................147
5.5 Regulation von Transkriptionsfaktoren durch E-LDL..........................................151
5.6 Wirkung von alpha-Toxin auf die MAPK-Kaskade ...............................................152
5.7 Kurzzeitige oder langanhaltende MAPK-Aktivierung...........................................153
6. Zusammenfassung und Ausblick ................................................ 156
7. Veröffentlichung von Ergebnissen dieser Arbeit ....................... 159
8. Literaturverzeichnis ...................................................................... 160
5
Abkürzungsverzeichnis
ACAT
AIP-1
Akt
ASK1
Apaf-1
AP-1
ATF-2
ß-TrCP
bp
CETP
c-PLA2
CRE
CREB
CRP
Daxx
dsRNA
E-LDL
Erk
FACS
Fas
FasL
FFA
FGF
GPCR
Grb
HAoEC
HDL
HMG-CoAReduktase
HRP
HSP
HUVEC
IAP
ICAM
IDL
IκB
IKK
IL
IP
JNK
LCA
LCAT
LDL
LOX-1
LPC
Luc
MAPK
Acetyl-CoA-Cholesterol-Acyltransferase
ASK1-interacting protein 1
AKT8 virus oncogene cellular homolog
apoptosis signal-regulating kinase 1
apoptotic protease activating factor 1
activating protein 1 (Aktivierendes Protein 1)
activating transkription factor 2
Beta-transducin repeat-containing protein
Basenpaar
cholesterol ester transfer protein
cytoplasmic phospholipase A2
cAMP response element
cAMP response element binding protein
C-reaktives Protein
Fas death domain-associated protein
doppelstrang RNA
enzymatisch verändertes LDL
extracellular signal-regulated kinase
fluorescence activated cell sorting
TNF superfamily receptor 6
fasLigand
free fatty acids (freie Fettsäuren)
fibroblast growth factor
G-protein coupled receptor
growth factor receptor-bound protein
human aortic endothelial cells (humane Aorten-Endothelzellen)
high density lipoprotein
Hydroxymethyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase
horseradish peroxidase (Markierung d. Sekundärantikörper)
heat shock protein
human umbilical vein endothelial cells
inhibitor of apoptosis
intracellular adhesion molecule
intermediate density lipoprotein
inhibitory kappa-B
inhibitory kappa-B kinase
interleukin
Immunpräzipitation
c-Jun-N-terminal kinase
lesion complement activator (komplement-aktivierendes Lipid
aus humanen Läsionen)
Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase
low density lipoprotein
lectin like oxidized-LDL receptor 1
Lysophosphatidylcholin
Luciferase
mitogen activated protein kinase
6
MAPKK oder MKK
MAPKKK
MCP-1
M-CSF
MEK
MKK oder MAPKK
Mo
MØ
NAC
NAK
NF-κB
NIK
NO
PARP
PDGF
pp5
RNAi
ROS
SAGE
SCF
siRNA
Smac
SOD
Sos
SR
SREBP
SRF
TAK-1
TF
Thr
TNF
Traf
TRE
Trx
Ub
VCAM
VLDL
WB
mitogen activated protein kinase kinase
mitogen activated protein kinase kinase kinase
macrophage chemoattractant protein 1
macrophage colony-stimulating factor
MAPK/Erk kinase
mitogen activated protein kinase kinase
Monozyten
Makrophagen
N-Acetyl-Cystein
NF-κB-activating kinase
nuclear factor kappa-B
NF-κB-inducing kinase
Nitric oxide (Stickstoffmonoxid)
Poly(ADP-ribose)polymerase
platelet-derived growth factor
Proteinphosphatase 5
RNA-interference
reactive oxygene species
serial analysis of gene expression
Skp-cdc53-F-box ubiquitin ligase komplex
small interfering RNA
second mitochondria-derived activator of caspase
Superoxid-Dismutase
son of sevenless guanine nucleotide exchange factor
scavenger receptor
sterol regulatory element binding protein
serum response factor
Transforming growth factor-ß-activated kinase 1
Transkriptionsfaktor
Threonin
Tumor necrosis factor
TNF-receptor associated factor
Tetradecanoyl phorbol ester response element
Thioredoxin
Ubiquitin
vascular cell adhesion molecule
very low density lipoprotein
Western Blot
1. Einleitung
7
1. Einleitung
1.1 Definition und Pathogenese der Atherosklerose
Atherosklerose ist eine krankhafte Veränderung der Arterien, die mit Verhärtung,
Verdickung, Elastizitätsverlust und Lichtungseinengung einhergeht (Pschyrembel
Klinisches Wörterbuch, 2004). Der Begriff setzt sich aus den griechischen Wörtern
„athero“ (Schleim, Brei) und „sclerosis“ (Verhärtung) zusammen und ist Synonym für
„Arteriosklerose“ mit besonderer Betonung der histopathologischen Veränderungen.
Komplikationen, die im Zusammenhang mit Atherosklerose auftreten, stellen die
häufigste Todesursache in der westlichen Gesellschaft dar.
Atherosklerose kann als Folge einer chronischen Entzündung im subendothelialen
Gewebe angesehen werden, die durch Interaktionen von modifizierten Lipoproteinen,
Makrophagen, T-Zellen und Endothelzellen zustandekommt. Dieser inflammatorische
Prozess kann zur Enstehung von komplexen Läsionen oder zur Bildung von Plaques
führen. Durch Ruptur der Plaques und Thrombose-Bildung kommt es zu akuten
klinischen Komplikationen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall (Navab et al., 1996;
Ross, 1999; Steinberg, 1999).
Ein erhöhter Lipidspiegel im Blut, insbesondere ein erhöhter Cholesterinspiegel ist
der bedeutendste Risikofaktor für die Entstehung der Atherosklerose, der desto
stärker ins Gewicht fällt, je mehr sonstige oder genetische Risikofaktoren vorhanden
sind.
Genetische Risikofaktoren
Erhöhte LDL und VLDLBlutspiegel (besonders
wenn LDL > 160mg/dL)
Geringe Mengen an HDL
Erhöhte Lipoproteinwerte
Bluthochdruck
Diabetes Mellitus
Erhöhte
Homocysteinwerte
Metabolisches Syndrom
Insulinresistenz
Fettleibigkeit
Familiäre Belastung
Sonstige Risikofaktoren
Rauchen
Bewegungsmangel
Fettreiche Nahrung,
Überernährung
1. Einleitung
8
Serum-Cholesterin bzw. Lipide werden, da sie wasserunlöslich sind, im Blut nicht in
freier Form, sondern zusammen mit Phospholipiden gebunden an Trägerproteine als
Lipoproteinpartikel transportiert. Diese Trägerproteine, von denen mehrere Typen
unterschieden werden (z.B. A, B, C und E), bezeichnet man als Apolipoproteine. Die
Lipoproteine werden aufgrund ihres Verhaltens bei der Ultrazentrifugation unterteilt
in:

Chylomikronen

VLDL (very low density lipoprotein)

IDL (intermediate density lipoprotein)

LDL (low density lipoprotein)

HDL (high density lipoprotein)
Während die Chylomikronen hauptsächlich die mit der Nahrung aufgenommenen
Lipide transportieren,
übernehmen VLDL, LDL und HDL den Transport der
endogenen Lipide. Chylomikronen entstehen bei der Fettresorption in der
Darmwand, gelangen dann auf dem Lymphweg ins Blut und geben nach Spaltung
der Triglyceride durch die Lipoproteinlipase die Fettsäuren an das Fettgewebe zur
Speicherung und an die Muskulatur als Brennstoff ab. Die verbleibenden Überreste
der Chylomikronen (Remnants), die einen hohen Gehalt an Cholesterinestern
besitzen, werden nun über Apolipoprotein B an einen speziellen Rezeptor (RemnantRezeptor), der nur in Leberzellen vorkommt, gebunden und in die Leber
aufgenommen.
In der Leberzelle wird das aufgenommene Cholesterin einerseits in Gallensäuren
umgewandelt,
andererseits
werden
triglyceridreiche
VLDL-Partikel,
die
die
Apolipoproteine B-100 und E enthalten, synthetisiert und wieder in den Blutkreislauf
abgegeben. Wie bei den Chylomikronen werden aus VLDL die abgespaltenen
Fettsäuren von Fett- und Muskelgewebe aufgenommen, wodurch IDL entsteht. Ein
Teil des IDL wird von LDL-Rezeptoren in die Leber aufgenommen, ein anderer Teil
geht durch weitere Abspaltung von Triglyceriden in LDL über.
Der Hauptteil des Serum-Cholesterins wird in veresterter Form in LDL-Partikeln
transportiert.
Gewebszellen,
die
Cholesterin
zum
Aufbau
ihrer
Cytoplasmamembranen brauchen, nehmen die Partikel über LDL-Rezeptoren auf.
Diese sog. Rezeptor-vermittelte Endocytose erfolgt über die Erkennung von Apo B100 (Brown 1985). Innerhalb der Zelle kommt es zur Freisetzung des Cholesterins
1. Einleitung
9
durch lysosomale Enzyme (Proteasen, Cholesterinesterasen). Das in der Leber
freigesetzte Cholesterin hemmt durch Blockade der Synthese des Schlüsselenzyms
HMGCoA-Reduktase (Hydroxymethyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase) die zelleigene
Neusynthese von Cholesterin und fördert gleichzeitig durch Aktivierung der ACAT
(Acetyl-CoA-Cholesterin-Acyltransferase)
die
Bildung
von
Cholesterinestern.
Außerdem wird die Neusynthese von LDL-Rezeptoren heruntergeregelt, so dass sie
in verminderter Zahl auf der Zelloberfläche vertreten sind. Dieser Mechanismus stellt
eine negative Rückkopplung dar die verhindert, dass die Zelle mehr Cholesterin
aufnimmt als sie benötigt. Durch die geringere Zahl an LDL-Rezeptoren kann
allerdings weniger LDL aus dem Kreislauf entfernt werden, was einen Anstieg des
LDL-Blutspiegels
zur
Folge
hat
und
die
Entstehung
der
Atherosklerose
beschleunigen kann.
Die zirkulierende Menge an LDL wird also hauptsächlich geregelt durch die
Aufnahmerate über die LDL-Rezeptoren. Ein Mangel an LDL-Rezeptoren ist daher
verantwortlich für die massive Akkumulation von LDL in Patienten mit homozygoter
familiärer Hypercholesterinämie, die bereits im Kindesalter Herzinfarkte erleiden
können (Goldstein and Brown, 1977). Bei diesen Patienten zeigte sich deutlich der
Zusammenhang zwischen zu hohem LDL-Spiegel und Atherosklerose, da sie keine
weiteren Risikofaktoren wie Rauchen oder Überernährung aufweisen (Brown 1985).
Bei zu geringen Serum-Cholesterin Mengen kommt es zur Aktivierung von
Transkriptionsfaktoren wie SREBP (sterol regulatory element binding protein), die die
Transkription von LDL-Rezeptor Genen und anderen an der Cholesterin-Biosynthese
beteiligten Genen führen (Brown and Goldstein, 1997). Die Konzentration des LDLCholesterins beträgt bei der Geburt 25-30mg/dL und kann im Lauf der Zeit auf Grund
von Überernährung bzw. Bewegungsmangel auf bis zu 180mg/dL ansteigen. Als
Grenzwert wird eine Konzentration von 100mg/dL empfohlen (American Heart
Association).
HDL, das in der Leber aus Chylomikronen gebildet wird, kann Cholesterin aus
Körperzellen aufnehmen. Dieses wird durch die LCAT (Lecithin-CholesterinAcyltransferase) verestert und dann entweder auf IDL übertragen, wodurch der
Kreislauf von neuem beginnt. Anderenfalls werden die HDL-Partikel komplett von der
Leber aufgenommen und dort metabolisiert.
1. Einleitung
10
Die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die die Cholesterin Biosynthese und
die Serum-Cholesterinspiegel kontrollieren (Goldstein and Brown, 1977), führte zur
Entwicklung der Statine, einer Klasse an Cholesterin-senkenden Stoffen, die
signifikant die kardiovaskuläre Mortalität von Patienten mit Hypercholesterinämie
senken (Gould et al., 1998). Die Statine reduzieren die Cholesterin-Werte indirekt
durch Hemmung der HMG-CoA-Reduktase, die für die endogene CholesterinBiosynthese benötigt wird. Dies führt zur Abnahme der intrazellulären CholesterinKonzentration, was die Aktivierung des Transkriptionsfaktors SREBP bewirkt und
eine Hochregulation der LDL-Rezeptoren zur Folge hat. Dadurch kann verstärkt LDL
aufgenommen werden, was zur Senkung der zirkulierenden LDL-Level führt (Glass
and Witztum, 2001).
Beginn der Atherosklerose: Schaumzellbildung
An undichten Stellen im Gefäßsystem kommt es vorallem bei einem zu hohen LDLBlutspiegel zum Durchsickern der Partikel aus dem Blut in das subendotheliale
Bindegewebe. Diese Stellen zeichnen sich aus durch hohen Druck bzw. einen
langsamen oder turbulenten Blutfluss. Aus diesem Grund besteht hier eine längere
Kontaktzeit zwischen Blutbestandteilen wie LDL und dem Endothel. An Stellen mit
schneller, laminarer Strömung werden die Partikel rasch wieder weggespült (Glagov
et al., 1988). Die Menge des durchsickernden LDL ist abhängig von der Höhe des
LDL-Plasmaspiegels. Bei Verletzungen des Endothels, die z.B. bei Bluthochdruck
oder durch Nikotinkonsum auftreten, verstärkt sich dieser Vorgang. Hypertonie und
Nikotinkonsum zählen deshalb zu den klassischen Risikofaktoren, die die Entstehung
der Atherosklerose begünstigen.
Eine atherosklerotische Läsion zeigt sich zunächst als „fatty streak“ (Fettstreifen)
unter dem Endothel von großen Arterien. Dieser wird gebildet duch Aufnahme des im
subendothelialen
Bindegewebe
abgelagerten
LDL
von
einwandernden
Makrophagen, die sich daraufhin in Schaumzellen umwandeln. Eine solche
atherosklerotische Frühläsion kann bereits in der ersten Lebensdekade entstehen
und schreitet mit zunehmdendem Alter fort (Stary, 1987).
Die Bildung von Schaumzellen aus Makrophagen, die große Mengen an
Cholesterinestern enthalten, kennzeichnet sowohl die frühen als auch die späten
atherosklerotischen Läsionen. Die aufgenommenen Cholesterinester werden in den
Lysosomen der Makrophagen hydrolysiert. Freies Cholesterin kann durch die ACAT
1. Einleitung
11
wieder verestert werden und lagert sich in Form von Lipidtröpfchen im Cytosol der
Makrophagen ab. Diese Lipidtöpfchen sind charakteristisch für die Schaumzellen und
verleihen ihnen ein gelbliches Aussehen. Die Cholesterinester in diesen Tröpfchen
können wiederum hydrolysiert werden, was freies Cholesterin für einen Einbau in
Membranen zur Verfügung stellt.
Abb. 1: Schaumzellbildung bei Makrophagen (J774-Zellen); Rotfärbung der Lipidtröpfchen mit
Oil-red O.
Die Makrophagen haben zwei Möglichkeiten, überschüssiges Cholesterin wieder
loszuwerden: durch enzymatische Umwandlung in löslichere Formen (Cholesterin27-Hydroxylase) oder durch Übertragung via Membrantransporter auf extrazelluläres
HDL. Die Funktion des HDL, als Akzeptor für Cholesterin zu dienen, ist essentiell für
den revers cholesterol transport und erklärt, warum ein zu niedriger HDL-Spiegel
(weniger als 40mg/dL) zu den Risikofaktoren für Atherosklerose zählt (Tall et al.,
2000).
Nach Aufnahme des freien Cholesterins wird dieses in den HDL-Partikeln durch die
LCAT verestert. HDL kann Cholesterinester durch Triglyceride von anderen
Lipoproteinen via Cholesterinester-Transfer Protein (CETP) austauschen. Alternativ
kann HDL an Rezeptoren der Leber binden und Cholesterinester an die Leber zur
nachfolgenden Exkretion abgeben.
Progression der Läsionen und immunologische Antworten
Bei übermäßiger Schaumzellbildung produzieren die überladenen Makrophagen eine
Reihe von proinflammatorischen Cytokinen wie IL-1ß, TNFα, IL-6, MCP-1
1. Einleitung
12
(macrophage chemoattractant protein 1) und TGF-ß (transforming growth factor ß)
(Reape and Groot, 1999; Peters and Charo, 2001). Auch Wachstumsfaktoren wie
z.B. FGF (fibroblast growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), ein
Mediator der Migration und Differenzierung von glatten Muskelzellen oder M-CSF
(macrophage colony-stimulating factor), ein autokriner Mediator der Differenzierung
von Makrophagen werden synthetisiert. Auf der Oberfläche von Endothelzellen
werden zelladhäsions-Moleküle exprimiert wie z.B. VCAM-1 (vascular cell adhesion
molecule) (Cybulsky und Gimbrone, 1991), E-Selektin (Dong et al., 1998) und ICAM1 (intracellular cell adhesion molecule) (Collins et al., 2000), die für das Anheften von
weiteren Monozyten an das Endothel sorgen und somit eine transendotheliale
Passage ermöglichen.
Die Umwandlung der anfangs entstandenen Fettschicht in komplexere Läsionen ist
charakterisiert durch die Einwanderung von glatten Muskelzellen aus der mittleren
Arterienwand (Media) in den intimalen Raum. Dort können sie proliferieren und
modifizierte Lipoproteine aufnehmen, was zur Schaumzellbildung beiträgt (Shanahan
and Weissberg, 1999). Weiterhin synthetisieren sie extrazelluläre Matrixproteine, die
zur Entwicklung von fibrinösen Kappen um die Läsionen herum führen (Ross, 1999;
Steinberg, 1999). Läsionale T-Zellen können aktiviert werden und produzieren
Cytokine wie IL-4, IL-10 oder INFγ (Hansson, 1997). Diese haben sowohl pro- als
auch anti-atherogene Eigenschaften. Einige Schaumzellen sterben ab, wodurch sich
eine Art Narbe mit nekrotischem, zum Teil verkalktem Kern bildet (Bennett, 1999).
Diese Phase symbolisiert ein chronisches Entzündungsstadium.
Neutrophile Granulozyten, die normalerweise zu den meisten inflammatorischen
Antworten führen, sind in den Läsionen nicht anzutreffen.
Stabilität der Plaques und klinische Komplikationen
Neben dem Auftreten von ischämischen Reaktionen durch die Einengung der
Gefäßwände
kommt
Thrombosebildung
zu
es
hauptsächlich
akuten
klinischen
durch
Rupturen
Ereignissen
wie
der
Plaques
Herzinfarkt
und
oder
Schlaganfall (Davies et al., 1993; Lee and Libby, 1997). Die Plaqueruptur setzt Lipide
und Gewebefaktoren ins Blut frei, was die Blutgerinnungskaskade, die PlättchenAdhäsion und die Thrombosebildung induziert. Häufig reißen Plaques mit dünnen
fibrinösen Kappen, hoher Konzentration an lipidgefüllten Makrophagen und
1. Einleitung
13
nekrotischem Kern ein (Davies et al., 1993; van der Wal et al., 1994; Lee and Libby,
1997). Plaques ohne nekrotischen Kern aber mit dicken fibrinösen Kappen sind
stabiler. Matrix Metalloproteinasen, die von Makrophagen sekretiert werden, wurden
in Regionen von Plaque-Rupturen nachgewiesen und scheinen die Plaque-Stabilität
negativ zu beeinflussen, indem sie extrazelluläre Matrixproteine abbauen (Galis et
al., 1994; Carmeliet, 2000).
1.2 Oxidationstherorie, Scavenger-Rezeptoren
Nach der von Steinberg vor ca. 20 Jahren aufgestellten Theorie sind oxidative
Veränderungen des subendothelial abgelagerten LDL der Auslöser für eine
Umwandlung des Partikels in ein entzündungauslösendes Molekül (Steinberg, 1981).
Die initiale Bildung der Fettschicht, d.h. die Aufnahme des abgelagerten LDL von
Monozyten, wird jener Theorie zufolge ebenfalls durch oxidative Modifikationen der
Lipid- und Apolipoprotein B-Komponenten des LDL beeinflusst (Navab et al., 1996;
Steinberg, 1999). Die Oxidation von LDL kann einerseits nur geringe Ausmaße
haben, bei welchen der Partikel noch von LDL-Rezeptoren erkannt wird (Navab et
al., 1996). Andererseits kommt es durch starke Oxidation zur Fragmentierung der
ApoB Komponente und zur Modifizierung von Lysinresten durch oxidierte Lipide
(Steinberg, 1999). Solche Partikel werden nicht von LDL-Rezeptoren erkannt,
sondern von sog. Scavenger-Rezeptoren, die auf Makrophagen und glatten
Muskelzellen vorkommen, aufgenommen.
Die Scavenger-Rezeptoren (dt: Aasfresser-Rezeptoren) werden definiert über ihre
Fähigkeit, modifiziertes (z.B. acetyliertes oder oxidiertes) LDL per Endocytose
aufzunehmen und wurden erstmalig 1979 von Goldstein beschrieben (Goldstein et
al., 1979). Sie besitzen eine positiv geladene Rezeptordomäne und können ein
breites Spektrum an anionischen Liganden wie z.B. Phospholipide, Fettsäuren,
Bakterien, LPS oder auch oxidiertes LDL binden. Über molecular cloning wurden
bisher mindestens acht verschiedene Scavenger-Rezeptoren entdeckt (CD36, CD68,
LOX1, SR-B1, SR-AI/AII…), die auf Makrophagen exprimiert werden (de Villiers and
Smart, 1999; Greaves et al., 1998). Vorallem die SR-A und CD36 Rezeptoren sind
von hoher Bedeutung für die Entwicklung der Atherosklerose. Da die Expression der
Scavenger-Rezeptoren
nicht
durch
einen
ansteigenden
intrazellulären
1. Einleitung
14
Cholesterinspiegel herunterreguliert wird wie die der LDL-Rezeptoren, kann eine
unbegrenzte LDL-Aufnahme durch die Makrophagen erfolgen.
Oxidiertes LDL konnte tatsächlich in den Läsionen vor der Einwanderung von
Makrophagen immunologisch nachgewiesen werden (Napoli et al., 1997). Weitere
Arbeiten zeigten, dass oxLDL selbst Monozyten anlocken (Steinberg, 1989) und
auch die Expression von chemotaktischen Molekülen wie MCP-1 und zelladhäsionsMolekülen in Endothelzellen induzieren kann (Navab et al., 1996), was in vitro eine
transendotheliale Passage der Monozyten ermöglichte (Berliner et al., 1990; Kume et
al., 1992).
A
B
1. Einleitung
15
C
Abb. 2: Pathogenese der Atherosklerose: (A) Einwanderung von Monozyten, Differenzierung
zu Makrophagen und Aufnahme von modifiziertem LDL unter Bildung von Schaumzellen; (B)
Bildung von komplexen Läsionen durch Einwanderung von glatten Muskelzellen; (C) PlaqueRuptur und Thrombus-Bildung (Quelle: Glass and Witztum, 2001).
Neben diesen für die Oxidationstheroie sprechenden Befunden gibt es auch
Anzeichen, die gegen dieses Konzept gerichtet sind:
1.
oxidiertes LDL kommt nur in sehr geringen Mengen (1%) in den
atherosklerotischen Läsionen vor (Kuhn et al., 1997)
2.
Subendothelial abgelagerte LDL-Partikel bilden nach einiger Zeit größere
Konglomerate, die einen hohen Gehalt an freiem Cholesterol besitzen
(Kruth 1984 und 1985; Chao et al., 1988; Mora et al., 1987; Simionescu et
al., 1986; Simionescu et al., 1990). Oxidiertes LDL enthält hauptsächlich
verestertes Cholesterin und ändert seine Morphologie nicht (Frank and
Fogelman 1989; Seifert et al., 1990; Bhakdi, 1998)
3.
In
atherosklerotischen
Läsionen
findet
eine
Aktivierung
des
Komplementsystems statt (Niculescu et al., 1987; Seifert et al., 1989;
Torzewski et al., 1998). OxLDL kann jedoch kein Komplement aktivieren
(Bhakdi, 1998).
4.
Einige Studien in hypercholesterolämischen Tiermodellen zeigen, dass die
Behandlung mit verschiedenen antioxidativen Agentien die Entwicklung der
Atherosklerose verlangsamen kann (Steinberg and Witztum, 1999).
Epidemiologische Daten unterstützen eine protektive Rolle für antioxidative
Nahrungsergänzung bei Menschen (Jha et al., 1995). Trotzdem waren
bisher alle prospektiven klinischen Versuche mit anitoxidativen Vitaminen
1. Einleitung
16
wie Vitamin E und Betacarotin in Patienten mit bestehender Atherosklerose
enttäuschend (Yusuf et al., 2000).
1.3 Das Mainzer Konzept: Entwicklung einer alternativen
Hypothese zur Atherosklerose
Ausgehend von der Tatsache, dass in atherosklerotischen Läsionen eine
Komplementaktivierung gefunden wurde, entwickelten Bhakdi et al. eine alternative
Hypothese zur Pathogenese der Atherosklerose. Aus aortischen atherosklerotischen
Läsionen wurde ein Lipid isoliert (LCA, lipid complement activator), das sich in der
Morphologie von oxLDL unterschied und den alternativen Komplementweg direkt
aktivieren konnte. Im Gegensatz dazu erfolgte keine Komplementaktivierung durch
natives oder oxLDL (Seifert et al., 1990).
Daraufhin wurde LDL in vitro mit Proteasen (Trypsin) und Cholesterinesterase
behandelt. Das entstandene enzymatisch veränderte LDL (E-LDL) besaß ebenfalls
die Eigenschaft, Komplement zu aktivieren. Andere Lipoproteine wie VLDL oder HDL
konnten bei gleicher Behandlung nicht in komplementaktivierende Moleküle
umgeformt werden (Bhakdi et al., 1995). Nach Aufspaltung der ApoB-Hülle durch
Trypsin kann die Cholesterinesterase die im LDL vorkommenden Cholesterinester in
freie Fettsäuren und freies Cholesterin spalten. Letzteres ist wahrscheinlich für die
komplement-aktivierenden Fähigkeiten des E-LDL verantwortlich, da bekannt ist,
dass freies Cholesterin Komplement aktiviert (Alving et al., 1977).
Eine weitere Ähnlichkeit zum LCA bestand darin, dass E-LDL auch zur Bildung von
größeren Fusionspartikeln fähig war, wie sie in den Läsionen tatsächlich vorkommen.
Ein Nachweis von enzymatisch verändertem LDL in frühen atherosklerotischen
Läsionen gelang mit Hilfe eines Antikörpers, der selektiv E-LDL, nicht aber natives
oder oxLDL erkennt. Weiterhin konnte eine Kolokalisation von E-LDL mit aktiviertem
Komplement gezeigt werden (Torzewski et al., 1998). Die Bindung des CRP an die
Lipoproteinpartikel erfolgt über Phosphocholinreste, die erst durch die enzymatische
Modifikation des LDL freigelegt werden. Mittels Immunhistochemie ergab sich eine
Kolokalisation
von
E-LDL,
CRP
und
C5b-9
in
der
Intima
von
frühen
atherosklerotischen Läsionen (Bhakdi et al., 1999).
Um die Auswirkungen der Komplementaktivierung auf die Entstehung der
Atherosklerose zu untersuchen, wurden zum einen Cholesterin-Fütterungsversuche
1. Einleitung
17
mit Komplement-defizienten Kaninchen durchgeführt, die nach 14 Tagen deutlich
weniger atherosklerotische Veränderungen zeigten als die Kontrolltiere (Schmiedt et
al., 1998). Zum anderen wurde in weiteren Cholesterin-Fütterungsversuchen den
Tieren zusätzlich Endotoxin injiziert, das bekanntlich über Makrophagenaktivierung
zur Bildung von CRP führt. Die Endotoxin-behandelten Tiere entwickelten deutlich
mehr atherosklerotische Läsionen als die Kontrolltiere (Lehr et al., 2001). Aus diesen
beiden
Studien
resultierte
die
Annahme,
dass
jede
Aktivierung
des
Komplementsystems die Entwicklung der Atherosklerose beschleunigen kann.
Nach Inkubation von Zellen mit hohen E-LDL Konzentrationen konnten Anzeichen
der Apoptose festgestellt werden (Klouche et al., 1998). Inkubation von
Endothelzellen mit E-LDL induzierte die Expression von ICAM und P-Selektin, was
zur Anlockung von Monozyten aus dem Blut in die Intima führt (Klouche et al., 1999).
In weiteren Studien wurde eine Aufnahme von E-LDL über den Scavenger-Rezeptor
von Makrophagen gezeigt, was zur Ausschüttung von MCP-1 führte. LDL wurde nicht
über die Scavenger-Rezeptoren aufgenommen (Klouche et al., 1998). Die
Umwandlung von LDL in einen Ligand für den Scavenger-Rezeptor geschieht
wahrscheinlich durch die Behandlung mit Trypsin, die eine Fragmentierung des
Apolipoprotein B erzeugt. Dabei entstehen freie Amino- und Carboxylgruppen. Bei
einem physiologischen pH-Wert von 7,4 sind die Aminogruppen nicht protoniert, d.h.
ungeladen. Die Carboxylgruppen hingegen sind deprotoniert und daher negativ
geladen, was den polyanionischen Charakter des E-LDL begründen würde, der
Voraussetzung für die Bindung an den Scavenger-Rezeptor ist.
In den letzten Jahren wurde mittels serial analyses of gene expression (SAGE) der
mRNAs von LDL- bzw. E-LDL-behandelten Monozyten eine deutliche Induktion der
Cysteinprotease Cathepsin H durch E-LDL gefunden. Weiterhin zeigte sich eine
Kolokalisation von E-LDL mit Cathepsin H in atherosklerotischen Läsionen. Das in
vitro durch Modifizierung von LDL mit Cathepsin H (statt Trypsin) und
Cholesterinesterase
hergestellte
E-LDL
besitzt
ebenfalls
die
Fähigkeit
zur
Schaumzellbildung. Cathepsin H stellt also eine Protease dar, die in vivo zur
enzymatischen Modifizierung von LDL beitragen könnte (Han et al., 2003).
1. Einleitung
18
Die Mainzer Hypothese
Nach der Mainzer Theorie erfolgt keine Oxidation des subendothelial abgelagerten
LDL, sondern ein enzymatischer Umbau. Dieser ist physiologisch sinnvoll und
notwendig, um LDL zum einen in ein CRP-bindendes, also komplementaktivierendes
Molekül umzuwandeln und es zum anderen in ein Substrat für den ScavengerRezeptor zu überführen. Die Aktivierung des Komplementsystems kann sowohl
durch freies Cholesterin als auch durch die Bindung von CRP an das enzymatisch
veränderte LDL (E-LDL) erfolgen. Das E-LDL wird nun durch die über den
Komplementweg angelockten Monozyten via Scavenger-Rezeptor aufgenommen.
Die entstehenden Schaumzellen werden physiologischerweise über den HDLabhängigen reverse cholesterol transport entlastet. Über diesen natürlichen
Mechanismus kann also subendothelial abgelagertes LDL mit seinem unlöslichen
Inhalt (Cholesterin) wieder aus den Gefäßwänden entfernt werden. Erst bei
übermäßigen Mengen an „gestrandetem“ LDL und übermäßiger Schaumzellbildung
ist das HDL-Transportsystem überlastet und es kommt zur Freisetzung von
proinflammatorischen Cytokinen (IL-6) durch die überladenen Makrophagen. Einige
Schaumzellen sterben ab und setzen das Lipid wieder frei, was erneut Komplement
aktiviert. Glatte Muskelzellen wandern in den Subendothelialraum ein und der
Prozess geht in die oben beschriebene chronische Entzündung über.
ox-LDL
Konzept
Mainzer
Hypothese
LDL
LDL
Mo
Mo
Endothelzellen
Oxidation
=> oxLDL
MØ
E-LDL
MØ
ox-LDL
Enzymatische
Modifikation
=> E-LDL
- Abräumen des durchgesickerten LDL
- bei Überlastung => „Stranden“ und Entzündung
proinflammatorische
Signale
Abb. 3: Oxidationstheorie und Mainzer Hypothese
1. Einleitung
19
1.4 Zusammenhang des Themas dieser Arbeit mit der
Atherosklerose
In der Arbeitsgruppe wurden bereits Untersuchungen über die Reaktionen von
verschiedenen Zellen auf enzymatisch verändertes LDL durchgeführt. D. Fenske
zeigte in seiner Arbeit anhand von electrophoretic mobility shift assays (EMSAs),
dass E-LDL in Endothelzellen die Aktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren
beeinflusst. Durch Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL kam es zu einer
spezifischen Hemmung der Aktivierung von NF-κB durch nachfolgende Stimulierung
mit z.B. TNFα bei gleichzeitiger Aktivierung von AP1. Ebenso existierten bereits
Daten, die eine gesteigerte IL-8 Produktion von Endothelzellen nach Behandlung mit
E-LDL im Vergleich zu LDL aufweisen (Suriyaphol et al., 2002).
Der interessante Befund, dass bei gleichzeitiger Hemmung von NF-κB eine erhöhte
AP-1 Aktivität auftritt, konnte bisher nicht einleuchtend begründet werden. Zu einer
Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 kommt es durch Signalübertragung von
extrazellulären Stimuli über die mitogen-aktivierte Protein Kinase-Kaskade (MAPKKaskade). Apoptosis signal-regulating Kinase 1 (ASK1) ist eine der initialen Kinasen,
die zu einer AP-1 Aktivierung führen können. Da ASK1 auch mit einer indirekten
Hemmung von NF-κB in Verbindung gebracht wird (Mochida et al., 2000), lag es
nahe, den Effekt von E-LDL auf dieses Enzym zu untersuchen.
Außerdem wurde in einem Western Blot Screening durch die Firma B&D die Protein
Phosphatase pp5 nach Behandlung von Monozyten mit E-LDL in erhöhten Mengen
gefunden. Da pp5 ein negativ-Feedback-Inhibitor von ASK1 ist (Morita et al., 2001),
deutet dieser Befund auf eine zuvorige Aktivierung von ASK1 hin. Die Tatsache dass
pp5 durch Fettsäuren aktiviert wird (Ramsey and Chinkers, 2002) und E-LDL große
Mengen an freien Fettsäuren (FFA) enthält, ist ein weiterer Hinweis, dass es zu einer
Aktivierung von ASK1 durch E-LDL kommen könnte.
1. Einleitung
20
1.5 Signalübertragung durch MAPK
Mitogen-aktivierte Protein Kinasen (MAPKs) sind eine Familie von Serin/Threonin
Protein Kinasen die in Eukaryoten weitverbreitet und konserviert auftreten. Sie sind
bei vielen Abläufen in der Zelle wie z.B. Zell-Proliferation, Differenzierung und Zelltod
beteiligt. MAPK Signal-Kaskaden sind hierarchisch organisiert in einem dreistufigen
Modell: MAPKs werden phosphoryliert und aktiviert durch MAPK-Kinasen (MAPKKs),
die wiederum durch MAPKK-Kinasen (MAPKKKs) phosphoryliert und aktiviert
werden.
Die Aktivierung der MAPKs und MAPKKs geschieht jeweils auf gleiche Art und
Weise: nach Phosphorylierung im aktiven Zentrum der Enzyme durch die
übergeordnete Kinase kommt es jeweils zu einer Zunahme der katalytischen
Aktivität. Die MAPKKKs können in Antwort auf diverse Stimuli jedoch durch
unterschiedliche Mechanismen aktiviert werden.
Eine Möglichkeit der Aktivierung der MAPKKKs besteht in der Interaktion mit einer
Familie von kleinen GTPasen und/oder anderen Protein-Kinasen, die die MAPKSignal-Kaskade mit Zelloberflächen-Rezeptoren (Wachstumsfaktor-Rezeptoren) oder
extrazellulären Signalen verbinden. Auch durch oxidativen Stress, UV-Strahlen,
osmotischen Schock oder durch Stimulation der Zellen mit Cytokinen wie z.B. IL-1
oder TNF werden die MAPKKKs aktiviert.
Nach
der
Signalübertragung
durch
die
MAPK-Kaskade
kommt
es
zur
Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern, die anschließend je nach
Stimulus die Transkription von verschiedenen Zielgenen modifizieren.
1. Einleitung
21
Wachstumsfaktoren
IL-1, TNFα
Oxidativer Stress,
UV, osmotischer Schock
RezeptorTyrosinkinase
Cytokin-Rezeptor
P
Grb
Sos
Ras
GTP
P
P
GDP
TK
Tyrosinkinaseassoziierter Rezeptor
MAPKKK
P
Aktivierung der
MAPK-Kaskade
MAPKK
P
MAPK
Cytosol
TF
Zellkern
P
P Phosphorylierung von
Transkripitionsfaktoren
P
TF
TF
Transkripition
Wachstum
Differenzierung
Entzündung
Apoptose
Abb. 4: Aktivierung der MAPK-Kaskade durch extrazelluläre Stimulation
Bisher identifizierte man 14 verschiedene MAPKKK in Säugetieren wie z.B. Raf,
MEKKs, TAK1, MTK1, MLKs und ASK1.
Die MAPKs stellen Konvergenzpunkte für eine Vielzahl von der Zellmembran
ausgehenden Signalen dar.
1. Einleitung
Stimulus
22
Stress (ROS, UV…)
Inflammatorische Cytokine
(TNFα; IL-1)
Wachstumsfaktoren
Wachstumsfaktoren,
Mitogene, GPCR
Stress,
WachstumsFaktoren, Mitogene
MAPKKK
Raf
MLK3, TAK1
MEKK1,4
MLK3,
ASK1
MEKK2,3
MAPKK
MEK1/2
MKK3/6
MKK4/7
MEK5
MAPK
ERK1/2
p38
JNK
Signalantwort
Wachstum
Differenzierung
Entwicklung
ERK5
Wachstum
Differenzierung
Entwicklung
Entzündung
Apoptose
Wachstum
Differenzierung
Abb. 5: MAP-Kinase Signalwege (Cell Signaling Technology, Katalog 2003)
1.5.1 Signalübertragung via Raf-MEK-Erk
Der
Raf-MEK-Erk
zellspezifischen
Signalweg
Wachstums-
wird
gewöhnlich
bei
der
und
Differenzierungssignalen
Weiterleitung
von
von
Rezeptor-
Tyrosinkinasen und G-protein gekoppelten Rezeptoren angesprochen. Zellwachstum
und -differenzierung werden bei Eukaryoten durch zahlreiche extrazelluläre
Polypeptidhormone
(z.B.
Wachstumshormone,
Cytokine)
gesteuert.
Die
Proteinfaktoren binden als Liganden an die Rezeptoren, die eine Signalkaskade über
eine Proteinphosphorylierung durch Tyrosinkinasen auslösen, wodurch es schließlich
zu Effekten in der Zelle kommt.
1. Einleitung
23
Wachstumsfaktor-Rezeptoren
Die Rezptor-Tyrosinkinasen liegen normalerweise als Monomere vor (z.B. EGFR).
Sie
dimerisieren
nach
Bindung
des
Liganden
und
es
kommt
zu
einer
Konformationsänderung, die es der Tyrosinkinaseaktivität erlaubt, die intrazellulären
Rezeptordomänen an mehreren Tyrosinresten zu autophosphorylieren. Auf diesem
Weg entstehen spezifische Bindungsstellen für die Src-homologen Domänen 2 (SH2)
verschiedener Signalproteine; gleichzeitig erfolgt deren Aktivierung. Zu diesen
Proteinen gehören Grb und Gap, die Protein-Tryosinkinase Src oder ProteinTyrosinphosphatasen.
Das Grb-Protein bindet über seine SH2-Domäne an phosphorylierte Tyrosinreste des
Rezeptors und wirkt als Verknüpfung zum Sos-Protein. Dieser Komplex funktioniert
als GDP/GTP-Austauschfaktor und setzt GDP aus Ras-GDP frei. Somit kann RasGTP abdissoziieren, bindet und aktiviert die MAPKKK Raf, indem es einen Kontakt
zur Membran herstellt, wo Raf durch eine Proteinkinase phosphoryliert werden kann.
Durch Weiterleitung des Signals über die MAPK-Kaskade kommt es dann zur
Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern und zur Modulation der
Genexpression (s. Abb. 4).
1.5.2 Signalübertragung via ASK1 - p38/JNK
Die Signalübertragung via ASK1/p38 vermittelt Stress- und Entzündungsantworten
auf Stimulantien wie Cytokine, FasLigand, ROS (reactive oxygene species) und
TNFα. Der ASK1/JNK Weg überträgt diese Signale ebenso wie auch Wachstumsund Differenzierungssignale (Tibbles and Woodgett, 1999).
Apoptosis signal-regulating Kinase 1 (ASK1/ MAPKKK5) ist eine MAPKKK, der eine
wichtige Rolle in der stress-induzierten Apoptose zukommt (Ichijo et al., 1997; Wang
et al., 1996). ASK1 wird aktiviert in Antwort auf eine Vielzahl an Stress-Signalen und
aktiviert MKK3 und MKK4, welche wiederum zur Phosphorylierung von p38-MAPK
und JNK (c-jun-N-Terminal Kinase) führen (s. Abb. 5) (Matsuzawa and Ichijo, 2001).
Eine Überexpression von ASK1 aktiviert p38 und JNK und induziert Apoptose in
verschiedenen Zelltypen über eine mitochondriale Caspasen-Aktivierung (Ichijo et
al., 1997; Saitoh et al., 1998; Tobiume et al., 2002). Embryonische Fibroblasten aus
1. Einleitung
24
ASK1-/- Mäusen sind resistent gegenüber stress-induzierter (H2O2, TNFα)
Aktivierung von p38 und JNK und Zelltod (Tobiume et al., 2001; Nishitoh et al.,
2002).
1.5.2.1 Aktivierungsmechanismus von ASK1
Humanes ASK1 besteht aus 1375 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht
von 155kD. Im Mittelteil des Moleküls befindet sich die Kinase-Domäne mit langen
flankierenden N-terminalen und C-terminalen Regionen. Innerhalb der KinaseDomäne kommen vier Threonin-Reste vor. Thr845 wurde als aktivierende
Phosphorylierungsstelle von ASK1 identifiziert (Tobiume et al., 2002).
Der C-
Terminale Bereich des Proteins enthält eine coiled-coil Domäne. Über diese
Supersekundärstruktur (Kombination von α-Helices in einer superspiralisierten Helix)
kommt es zur Oligomerisierung von ASK1 (Ichijo et al., 1997; Tobiume et al., 2002).
Am N-Terminus von ASK1 wird durch verschiedene Inhibitoren die katalytische
Aktivität von ASK1 reguliert.
Trx
S
H2N-
SH
747
Thr
845
Thr843
Thr849
N-Terminus
936
coiled-coil
Domäne
C-Terminus
1375
-COOH
Kinase Domäne
homooligomerisierung
Abb. 6: Struktur von ASK1
Durch ein yeast-two hybrid screening wurde Thioredoxin (Trx) als Interaktionspartner
von ASK1 entdeckt (Saitoh et al., 1998). Trx ist ein reduktions/oxidations-reguliertes
Protein und hemmt die Kinase-Aktivität von ASK1 durch direkte Bindung an die Nterminale Region von ASK1. ASK1-Mutanten, denen die N-terminale Region fehlt,
sind konstitutiv aktiv (Saitoh et al., 1998). Das 12kD Protein Trx besitzt eine redoxaktive Region, bei der zwei Cysteine die Sulfhydryl-gruppen zur Verfügung stellen,
die für die Trx-abhängige Reduktionsaktivität entscheidend sind (Haendeler et al.,
2002).
1. Einleitung
25
H2N- Cys-Gly-Pro-Cys
SH
-COOH
Trx-(SH)2
-COOH
Trx-S2
SH
Oxidation
H2N- Cys-Gly-Pro-Cys
S
S
Abb. 7: Redox-Regulation von Thioredoxin
Nur die reduzierte Form Trx-(SH)2 , nicht aber die oxidierte Form Trx-S2 bindet an
ASK1. Daher hängt die Aktivität von ASK1 vom redox-Status des Trx ab (Saitoh et
al., 1998). Überexpression von Trx führt zu ASK1-Ubiquitinylierung und Degradation
(Liu and Min, 2002).
Durch Einwirkung von ROS wie z.B. H2O2 wird Trx oxidiert und dissoziiert von ASK1
ab. Nun kann ASK1 aktiviert werden, indem es zunächst zu einer Oligomerisierung
über die coiled-coil Domäne und darauffolgend zu einer Phosphorylierung des
entscheidenden Threonins 845 in der Kinase Domäne von ASK1 kommt (Tobiume et
al., 2002; Saitoh et al., 1998). Die Phosphorylierung des Thr845 erfolgt
wahrscheinlich initial durch eine Threonin-Kinase. Eine Konformationsänderung des
oligomerisierten ASK1 ermöglicht dann eine Trans-Autophosphorylierung (Tobiume
et al., 2002).
1. Einleitung
26
Oxidativer
Stress
TNF
TNF-Rezeptor
ROS
Aktives ASK1
P
P
ASK1
ASK1
Trx
ASK1
ASK1
ASK1
P
Trx
Inaktives ASK1
S-S
TR
AF
AF
2
2
Thr845-Kinase
ASK1
TR
Trx
TRAF2
Konformationsänderung
und Trans-Autophosphorylierung;
Stabilisierung des aktiven
Zustandes durch TRAF2
Oligomerisierung und
initiale Phosphorylierung
durch Thr845-Kinase
Abb. 8: Aktivierung von ASK1 durch oxidations-bedingte Freisetzung des Inhibitors
Thioredoxin (Takeda et al., 2003)
Das Trx-ASK1 System wird auch im TNF-Signalweg angesprochen. Nisitoh et al.
zeigten, dass die Assoziation von ASK1 mit TNF Rezeptor-assoziierten Faktor 2
(TRAF2) notwendig für die TNF-induzierte Aktivierung von ASK1 ist (Nisitoh et al.,
1998).
TRAF2
ist
ein
Adapterprotein,
das
den
TNF-Rezeptor
mit
der
Signalübertragung durch die MAPK-Kaskade verbindet. Da die Behandlung mit TNF
oder die Überexpression von TRAF2 zur Produktion von ROS führt (Goossens et al.,
1995; Liu et al., 2000), kommt es zur Dissoziation des Trx von ASK1. Das
freigesetzte ASK1 bindet an TRAF2, welches die Oligomerisierung von ASK1
verstärkt und stabilisiert (Liu et al., 2000).
Antioxidantien wie N-Acetyl-Cystein (NAC) können sowohl die durch oxidativen
Stress bedingte als auch die TNF-induzierte Apoptose teilweise hemmen (SchulzeOsthoff et al., 1994; Saitoh et al., 1998).
Das Trx-ASK1 System dient also als molekularer Switch, der redox-Signale, die
durch
verschiedenste
Arten
an
oxidativem
Stress
Signalübertragung durch die MAPK-Kaskade überführt.
entstehen,
in
die
1. Einleitung
27
1.5.2.2 Weitere antiapoptotische Bindungspartner von ASK1
Neben Thioredoxin als Negativ-Regulator gibt es noch weitere Bindungspartner von
ASK1, die durch Hemmung der Kinase antiapoptotisch wirken.
pp5
Die Protein (Serin/Threonin)-Phosphatase 5 (pp5) reguliert die Aktivität von ASK1,
indem sie spezifisch an die aktivierte Form von ASK1 in Antwort auf dessen
Aktivierung durch z.B. oxidativen Stress bindet und für die Dephosphorylierung von
Thr845 sorgt. Folglich kommt es durch diese negativ-Feedback-Hemmung zur
Deaktivierung von ASK1 (Morita et al., 2001).
pp5 ist ein 58kD Protein, das hauptsächlich im Zellkern, aber auch im Cytoplasma
vorkommt. Es besitzt vier Tetratricopeptid-Domänen im N-Terminus, die eine
autoinhibitorische Funktion auf die Phosphatase-Aktivität von pp5 ausüben.
Außerdem können damit Wechselwirkungen zu anderen Molekülen eingegangen
werden. Der C-Terminus besteht aus einer Polypeptid-Kette, die die phosphorylytisch
aktive
Domäne
enthält.
Am
terminalen
Ende
existiert
eine
zusätzliche
autoinhibitorische Sequenz (Sinclair et al., 1999).
autoinhibitorische
Funktion
vier TPRdomänen
H2N-
Glu495
pp5
Phosphatase
Domäne
-COOH
Abb. 9: Struktur von pp5
Auf Grund der autoinhibitorischen Domänen hat pp5 nur eine geringe Grundaktivität,
kann aber durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren (z.B. Linolsäure, Arachidonsäure)
oder langkettige Fettsäure-CoA Ester in vitro bis zu 40fach aktiviert werden. Diese
Aktivierung erfolgt über eine Bindung der FA an die TPR-Domänen (Ramsey and
Chinkers, 2002; Skinner et al., 1997; Kang et al., 2001). Dieser Befund rechtfertigt
1. Einleitung
28
die Annahme, dass freie Fettsäuren aus E-LDL ebenfalls zu einer Aktivierung von
pp5 führen könnten.
Akt
ASK1 kann an Ser83 durch Akt phosphoryliert werden (s. Abb. 10), was zu einer
Hemmung der Kinase-Aktivität von ASK1 führt (Kim et al., 2001). Die Akt- (Protein
Kinase B) Serin/Threonin-Kinasen sind entscheidende Vermittler des zellulären
Überlebens (Dudek et al., 1997; Franke et al, 1997), da sie pro-apoptotische
Proteine, wie z.B. ASK1 oder auch Caspasen und Bad
inhibieren.
Die
Proteine
der
Akt-Familie
werden
phosphorylieren und
aktiviert
durch
Serum,
Wachstumsfaktoren, Insulin oder Ca2+ über einen Signalweg, welcher die
Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K) abhängige Herstellung von Phosphoinositoltriphosphat (PIP3) benötigt. Akt wird durch Bindung von PIP3 und anschließende
zweifache Phosphorylierung aktiviert. Ebenso wie ASK1 wird auch Akt durch ROS
aktiviert, d.h. die Aktivierung von ASK1 durch H2O2 kann durch Akt gehemmt werden
(Kim et al., 2001). Eine Phosphorylierung an Ser83 von ASK1 durch Akt kann erst
nach Abspaltung von Trx erfolgen. Die durch Serumentzug entstehende ASK1Aktivierung kann durch Zugabe von IGF-1 über Stimulierung des PI3-K/AktSignalwegs gehemmt werden.
14-3-3 Proteine
14-3-3 Proteine sind eine hochkonservierte Familie von Proteinen, die bei der
Regulation von zellulärem Überleben, Apoptose oder Proliferation beteiligt sind
(Aitken, 1995). 14-3-3 Proteine binden an Moleküle mit bestimmten PhosphoserinSequenzen wie z.B. bei ASK1 an P-Ser-967.
Nach Behandlung mit TNF kommt es zu einer Konformationsänderung des ASK1interacting protein 1 (AIP-1), welches daraufhin in der Umgebung von Ser-967 an
ASK1 bindet und durch Dephosphorylierung von Ser-967 zu einer Abdissoziation von
14-3-3 führt.
Dadurch wird die ASK1-Aktivität verstärkt, bevor es zu der bereits
erwähnten TNF-vermittelten Bindung von TRAF2 an ASK1 kommt (s. Abb. 10)
(Guicciardi and Gores, 2003; Zhang et al., 2003).
1. Einleitung
29
GSTM1-1
ASK1 kann durch Hitzeschock aktiviert werden. Diese Aktivierung lässt sich im
Gegensatz zur Induktion durch H2O2 nicht durch Antioxidantien wie NAC oder durch
Überexpression von Trx antagonisieren. Hitzeschock verursacht die Dissoziation des
ASK1-Inhibitors GSTM1-1 (Glutathion-S-transferase Mu1-1), führt aber nicht zur
Abspaltung von Trx. Die Abdissoziation der GSTM1-1 läßt sich wie folgt erklären:
GST-Proteine können kleine lipophile Moleküle wie z.B. Steroide binden, die
während des Hitzeschocks freigesetzt werden könnten und mit ASK1 um die
GSTM1-1-Bindung kompetitieren (Dorion et al., 2002).
Park et al. berichten allerdings über eine Hemmung von ASK1 durch Hitzeschock via
Bindung von Heat shock protein 72 (HSP72) an ASK1. Eine Überexpression von
HSP72 kann die H2O2-induzierte Aktivierung von ASK1 und die nachfolgende MAPKAktivierung hemmen (Park et al., 2002).
Raf-1
Die MAPKKK Raf-1 ist ein proto-oncogenes Produkt, das eine zentrale Rolle bei den
am Zellwachstum beteiligten Signalwegen spielt. Raf-1 kann mit ASK1 interagieren,
indem es am N-Terminus von ASK1 bindet (Chen et al., 2001). Diese Interaktion
ermöglicht eine Hemmung der Apoptose durch Raf-1 unabhängig vom oben
beschriebenen MEK-Erk Signalweg. Die Bindung von Raf-1 an ASK1 benötigt keine
vorhergehende Aktivierung von Raf-1, sondern kann auch durch kinase-defekte Raf1 Mutanten erfolgen. Es kommen daher zwei Funktionen von Raf-1 in Betracht: die
unter 1.5.1 genannte Aktivierung des MEK–Erk Signalweges über enzymatische
Aktivität und die Hemmung von ASK1 über Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die
Hemmung der pro-apoptotischen Funktion von ASK1 durch Raf-1 kann Teil des ZellÜberlebens Mechanismus sein. Nach Stimulation von ASK1 durch oxidativen Stress
oder TNF kann es zur Abdissoziation von Raf-1 kommen. Es ist noch unklar, über
welchen Mechanismus Raf-1 ASK1 hemmt. Raf-1, das selbst ebenfalls durch Akt
phosphoryliert werden kann (Zimmermann and Moelling, 1999; Rommel et al., 1999),
könnte zu einer Heranlockung von Akt an ASK1 und damit zur deaktivierenden
Phosphorylierung von ASK1 führen (Kim et al., 2001).
1. Einleitung
30
Interaktion mit TAK-1
ASK1 kann direkt mit der transforming growth factor-ß-activated kinase 1 (TAK1)
interagieren. TAK1 ist ebenfalls eine MAPKKK, die durch verschiedene Stimuli wie
TGFß, TNF, IL-1, UV oder osmotischen Schock aktiviert wird und über MKK7 bzw.
MKK3/6 eine JNK- bzw. p38-Aktivierung auslösen kann (s. Abb. 5) (Yamaguchi et al.,
1995; Shirakabe et al., 1997). TAK1 spielt eine wichtige Rolle bei der IL-1
vermittelten NF-κB Aktivierung (Ninomiya-Tsuji et al., 1999). IL-1 induziert eine
Komplexbildung des Adapterproteins Traf6 mit TAK1. Die dadurch aktivierte TAK1
phosphoryliert und aktiviert die NF-κB-inducing kinase (NIK), eine weitere MAPKKK.
Die Aktivierung von NIK führt schließlich zur Aktivierung von NF-κB (s. Abb. 12).
Überexpression von ASK1 veranlaßt die Abdissoziation von Traf6 aus dem Komplex
mit TAK1 und verhindert somit eine nachfolgende NIK- und NF-κB-Aktivierung. Die
Komplexbildung von NIK mit Traf6 wird allerdings nicht durch ASK1 beeinflußt
(Mochida et al., 2000).
1.5.2.3 Proapoptotische Bindungspartner von ASK1
Signalübertragung durch FasLigand
Auch bei der Signalübertragung durch FasLigand kann ASK1 beteiligt sein. Der FasRezeptor gehört zur Familie der death-Rezeptoren. Diese Rezeptoren besitzen eine
sogenannte
death
domain,
eine
aus
60-80
Aminosäuren
bestehende
cytoplasmatische Sequenz. Bindung des FasLigand an den Rezeptor führt zur
Bildung eines Protein Komplexes, der als death-inducing signaling complex (DISC)
bezeichnet wird. Daraufhin kommt es zur Auslösung der Apoptose über Caspase-8
Aktivierung (Nagata, 1999). Nach Fas-Aktivierung kann es allerdings auch über
einen alternativen Signalweg zur Aktivierung des Fas-bindenden Proteins Daxx
kommen (Yang et al., 1997). Daxx bindet an die N-terminale Region von ASK1 und
aktiviert dadurch p38 und JNK, was zur Apoptose über mitochondriale CaspasenAktivierung führen kann (Chang et al., 1998). Die Fas-induzierte JNK und p38Aktivierung ist in ASK1-/- Zellen gehemmt. Die Aktivierung von JNK und p38 über
Daxx-ASK1 ist allerdings nicht unbedingt notwendig für die FasL-induzierte
Apoptose, da hauptsächlich der Caspase-8-Weg eingeschlagen wird.
Bei der Fas-induzierten Apoptose kommt es nicht zur Generierung von ROS
(Jacobson and Raff, 1995), sie ist also auch nicht hemmbar durch Antioxidantien wie
1. Einleitung
31
NAC. Die Caspase-8 Induktion ist durch TNF geringer als durch FasL bei gleichem
Ausmaß an Apoptose, da TNF die Apoptose über Produktion von ROS induziert
(Tobiume et al., 2002).
Der ASK1-JNK/p38-Signalweg wird also spezifisch benötigt bei ROS-abhängigen,
aber nicht bei Caspase-8-abhängigen pro-apoptotischen Signalen.
Apoptose durch ER-Stress
Bei Ansammlung von un- oder falschgefalteten Proteinen im Lumen des
endoplasmatischen Retikulums (ER) kommt es zur Induktion von ER-Stress. Dies
führt zur Bildung einer Reihe von molekularen Chaperonen, die das zelluläre
Überleben unterstützen sollen, indem sie die Proteine neu falten. Ein übermäßiger
oder langandauernder ER-Stress kann zur Apoptose der Zellen führen (Kaufman,
1999; Mori, 2000). Zu den initialen Vermittlern der ER-Stress-Antwort gehören
transmembrane
ungefalteten
Serin/Threonin
Proteinen
im
Kinasen
ER
wie
induziert
z.B.
eine
IRE1.
Akkumulation
Oligomerisierung
von
und
Autophosphorylierung dieser Kinasen. Kürzlich wurde gezeigt, dass ER-Stress den
ASK1-JNK Signalweg aktiviert durch die Bildung eines IRE1-TRAF2-ASK1
Komplexes. In ASK1-/- Zellen ist Aktivierung von JNK und die Induktion von
Apoptose nicht möglich (Nisitoh et al., 2002).
ER-Stress tritt auf bei Amyloidose, Hypercholesterinämie, Diabetes mellitus sowie
bei neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson).
Wachstumssignale
TNF
Fas-Ligand
H2N-
14-3-3
Thr845
-COOH
ASK1
P
GSTM1-1
HSP72
AF
6
Daxx
TR
Raf-1
AF
2
Trx
AIP-1
TR
ROS
P
pp5
Akt
Heat
shock
IGF-1
Abb. 10: Angriffspunkte einiger Bindungspartner von ASK1; rot: proapoptotische; grün:
antiapoptotische
1. Einleitung
32
1.6 Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF- κB
Viele induzierbare Moleküle in Endothelzellen, die bei der Atherosklerose von
Bedeutung sind, wie z.B. VCAM-1, ICAM-1, E-Selektin oder MCP-1 enthalten AP-1
oder NF-κB Bindungsstellen innerhalb ihrer Promotorregionen (Neish et al., 1992;
Voraberger et al., 1991; Degitz et al., 1991). Sowohl AP-1 als auch NF-κB können
also bei der Regulation dieser Moleküle beteiligt sein (Lin et al., 1996; Roebuck et al.,
1995; Ledebur and Parks, 1995).
1.6.1 AP-1
AP-1 (activating protein-1) setzt sich zusammen aus Proteinen der jun-, fos- und
ATF-Familie. Die Familie der jun-Proteine bestehen aus c-jun, junD und junB; die der
fos-Familie aus c-fos, fosB, fra-1 und fra-2; die der ATF-Familie aus ATF-2, ATF3/LRF1 und BH-ATF (Vogt and Bos, 1990; Angel and Karin 1991; Karin et al. 1997).
Typisch für die AP-1 Proteine ist der Leucin-Zipper, über den die einzelnen Mitglieder
der verschiedenen Proteinfamilien dimerisieren. Es kommt zur Bildung einer Vielzahl
von Homo- bzw. Heterodimeren. Homodimere entstehen aus den Proteinen der junoder ATF-Familie während Heterodimere aus Proteinen der Jun-Familie assoziiert
mit Proteinen der ATF- oder der fos-Familie hervorgehen. fos-Proteine bilden keine
Homodimere. Die Dimerisierung ist Voraussetzung für die Bindung an die DNA
(Vogt, 2002).
Der Leucin-Zipper liegt in einer stark konservierten Region aus 60 Aminosäuren, der
sogenannten bZIP-Region (basic Leucin-Zipper). Diese Region enthält außerdem
eine basische DNA-bindende Domäne (Landschulz et al., 1988), die für die
sequenzspezifische Bindung an die entsprechende AP-1-site verantwortlich ist.
Durch die Möglichkeit verschiedene Dimere zu bilden, ergibt sich eine große Anzahl
verschiedener Kombinationen der AP-1 Mitglieder untereinander. Die Spezifität, mit
der die Dimere an die DNA binden, ist abhängig von ihrer Zusammensetzung (Hai
and Curran, 1991). jun-fos Dimere binden z.B. an eine TRE-site (TPA response
element; TPA=Tetradecanoylphorbolacetat), eine AP-1 consensus site mit der
Sequenz TGACTCA. jun-ATF Dimere binden an eine DNA-Sequenz, in der im
Unterschied zur TRE-site noch eine weitere Base vorkommt: TGACGTCA. Diese AP-
1. Einleitung
33
1 consensus site wird als CRE-site (c-AMP response element) bezeichnet (Karin et
al., 1997).
AP-1 gehört zu den „immediate early genes“, deren mRNAs bereits kurz (Minuten)
nach einem adäquaten Stimulus nachweisbar sind. Allerdings kommen die DNAbindenden Proteine von AP-1 in unstimulierten Zellen nur in geringer Zahl vor und
müssen nach Stimulation erst synthetisiert werden. Durch Aktivierung der MAPKKaskade z.B. nach oxidativem Stress kommt es zur Aktivierung von p38 und JNK
und nachfolgend zur Phosphorylierung von bereits in der Zelle vorhandenem c-jun
und ATF-2. Dadurch wird die transkripitonelle Aktivität dieses Heterodimers
gesteigert und die Neusynthese von c-jun wird angeregt, da im c-jun Promotor eine
CRE-site vorkommt, an die c-jun/ATF-2 bindet. Phosphorylierung des neugebildeten
c-jun erhöht wiederum dessen transkriptionelle Aktivität (Karin, 1995). Die c-jun
vermittelte Transkription wird gestoppt durch Abbau des Proteins im Proteasom nach
Ubiquitinylierung (Pahl and Baeuerle, 1996).
JNK phosphoryliert und aktiviert neben c-jun und ATF-2 bevorzugt auch TCF/Elk1
(Karin, 1995; Karin and Hunter, 1995; van Dam et al., 1995). Die Aktivierung von
TCF-/Elk1, der zusammen mit SRF (serum response faktor) an das SRE-Element im
c-fos Promotor bindet, führt zur transkriptionellen Aktivierung von c-fos.
Allgemein führt die Phosphorylierung durch MAPK zur raschen Expression von c-jun,
junB und c-fos Genen und zur anschließenden Modulation der Transkripition von AP1 Zielgenen (Karin et al., 1997).
1. Einleitung
34
Stress
ASK1
MKK4, MKK7
MKK3, MKK6
P
P
P
p38
P
JNK
Cytoplasma
Zellkern
P P
P
Elk-1
P P
P P
P
CREB
ATF-2
ATF-2
ATF-2
c-Jun
c-Jun
c-Jun
CRE
CRE
CRE
AP-1
Bindungs-site der
Transkriptionsfaktoren: SRE
c-Jun
P
TCF/Elk1
SRF
SRE
Regulation der
Transkription von
Zielgenen mit AP-1
-site im Promotor;
z.B. IL-8, MMPs…
c-Fos
Aktivierung der eigenen
Transkription
Abb. 11: Aktivierung von Transkriptionsfaktoren der AP-1 Familie durch p38 bzw. JNK
Bei der Regulation der Zielgene haben die einzelnen Mitglieder von AP-1,
insbesondere c-jun und JunB, auch gegenläufige Funktionen. So wird beispielsweise
der Zellzyklus durch c-jun positiv und durch JunB negativ reguliert (Schreiber et al.,
1999; Wisdom et al., 1999).
1.6.2 NF-κB
Die
nuclear
factor-κB
(NF-κB)/Rel
Proteine
funktionieren
als
dimere
Transkriptionsfaktoren. Sie kontrollieren Gene, welche eine Vielzahl von biologischen
Prozessen wie angeborene/erworbene Immunität, Entzündungen, Streß-Antworten
1. Einleitung
oder
35
die Entwicklung von B-Zellen regulieren. Die Mitglieder der NF-κB-Familie
werden von fünf verschiedenen Genen codiert: RelA, RelB, c-Rel, NF-κB1 und NFκB2. Die beiden letzteren führen zur Synthese von größeren Vorläuferproteinen, die
dann in die Untereinheiten p50 und p65 gespalten werden (Perkins, 2000; Lang et
al., 2003). NF-κB liegt im Cytosol in inaktivem Zustand vor, d.h. es wird komplexiert
mit den inhibitorischen IκB Proteinen (Baeuerle and Baltimore, 1988; Beg and
Baldwin, 1993; Finco et al., 1994). Die Aktivierung von NF-κB erfolgt über
Phosphorylierung der IκBs, was zur Freisetzung und nukleären Translokation von
aktivem NF-κB führt (Brown et al., 1995; Brockman et al., 1995; Traenckner et al.,
1995; Chen et al., 1996). Die phosphorylierten IκBs werden erkannt und
ubiquitinyliert über den SCF-ß-TrCP Ubiquitin-Ligase-Komplex und anschließend im
Proteasom abgebaut. Eine Aktivierung der JNK induziert die Akkumulation von ßTrCP Proteinen (beta-transducin repeat-containing proteins), was den Prozess der
Ubiquitinylierung erleichtert.
Der entscheidende Schritt bei der IκB-Phosphorylierung liegt in der Aktivierung des
stromaufwärtsliegenden IκB-Kinase (IKK) Komplexes, der aus zwei Untereinheiten
(IKKα und IKKß) besteht. Die Phosphorylierung der IKKs kann je nach Art der
extrazellulären Stimulation und Signalweiterleitung durch mehrere Kinasen erfolgen.
Zu diesen Kinasen gehören die NF-κB-inducing kinase (NIK) (Traencker et al., 1995),
die NF-κB activating kinase (NAK) (Tojima et al., 2000). Letztere kann durch die
transforming growth factor-ß activated kinase 1 (TAK1) reguliert werden (NinomiyaTsuji et al., 1999).
Sowohl pro- als auch anti-apoptotische Gene tragen NF-κB-sites in ihrer
Promotorregion und werden je nach Zusammensetzung des NF-κB-Dimers
entsprechen reguliert.
1. Einleitung
36
IL-1
TNFα
Wachstumsfaktoren etc.
IL-1 Rezeptor
TNFα-Rezeptor
P Grb
Sos
Ras
TRAF6
TRAFs
MAPK/Erk
-Kaskade
TRAF6
NAK
NIK
ASK1
TAK1
P
P
IKKα
IKKß
JNK
IκB
inaktives NF-κB
p50
p65
ß-TrCP
P
P
IκB
p50
p65
SCF-ß-TrCP
P
P
Abbau der IκB
im Proteasom
IκB
Ub
P
Translokation in
den Zellkern
p50
p65
aktives NF-κB
p65
p50
Transkription pro- und
antiapoptotischer Gene
κB-site
Anti-apoptitische
Bcl-2
Bcl-xL
XIAP
IAPs
Pro-apoptotische
Fas
FasL
death-Rez.
Abb. 12: NF-κB Aktivierung durch verschiedene extrazelluläre Faktoren
2. Fragestellung
37
2. Fragestellung
Die enzymatische Modifikation von subendothelial abgelagertem LDL ist nach der
Mainzer Hypothese zur Pathogenese der Atherosklerose die Ursache für die
Generierung eines proatherogenen Stimulus. Bereits bekannt ist, dass es unter
Einwirkung von E-LDL in Endothelzellen zur Modulation der Aktivität von
verschiedenen Transkriptionsfaktoren wie AP-1 und NF-κB kommt.
In der vorliegenden Arbeit sollen stromaufwärts dieser Transkriptionsfaktoren
gelegene Ereignisse nach Behandlung mit E-LDL untersucht werden. Über die
mitogen-aktivierte Protein Kinase ASK1 kann sowohl eine Regulation von AP1 als
auch von NF-κB erfolgen. Daher lag es nahe, den Aktivierungszustand von ASK1
nach Behandlung mit E-LDL zu untersuchen. Es sollte festgestellt werden, ob E-LDL
bzw. die in E-LDL enthaltenen freien Fettsäuren ASK1 aktivieren können.
Eine weitere Erkenntnis unterstützt die Frage nach dem Aktivierungszustand von
ASK1: in einem Western Blot Screening von Monozyten, die 24 Stunden mit E-LDL
behandelt wurden, fanden sich erhöhte Mengen der Proteinphosphatase pp5. pp5 ist
ein Negativ-Feedback Inhibitor von ASK1, d.h. eine Hochregulation von pp5 könnte
auf eine zuvorige ASK1-Aktivierung deuten.
Die Versuche sollen größtenteils in Endothelzellen durchgeführt werden. Diese
Zellen haben Kontakt sowohl zu zirkulierendem LDL als auch zu subendotheliar
abgelagerten LDL bzw. E-LDL. Initiale Ereignisse der Atherosklerose dürften sich
also in Endothelzellen gut beobachten lassen.
3. Material und Methoden
38
3.1 Chemikalien
Agarose
Acrylamid (Rotipherese-Gel)
Ammoniumperoxodisulfat
AP
Ampicillin
Aprotinin
Bacto-Agar
Bacto-Trypton
Roth
Roth
Roth
Kaliumbromid
Kaliumdihydrogenphosphat
Luminol
Roth
Roth
Sigma
Roth
Sigma
BD
BD
Roth
Roth
Roth
Roth
Borsäure
Bromphenolblau
Chloroform
DAPI (4´,6 Diamidino-2Phenylindol)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dichlorofluorescein-diacetat
Ethanol 99,8%
Roth
Methanol
2-Mercaptoethanol
Natriumchlorid
Natriumdodecylsulfat ultra
pure (SDS)
Natriumdihydrogenphosphat
Natrium-deoxycholat
Natriumfluorid
Natrium-orthovanadat
(Na3VO4)
Natriumphosphat
Oil-red O
Phenylmethylsulfonylchlorid
(PMSF)
Ponceau S
Sucrose
Salzsäure 37%
N,N,N´,N´Tetramethylendiamin
(TEMED)
1,1,3,3-Tetramethoxypropan
(Malondialdehyd)
Triton X-100
Trishydroxyaminomethan
(Tris) Ultra Qualität
Tween 20
Roth
Sigma
Roth
Roth
Ethidiumbromid
Ethylendiamintetraessigsäure
Formaldehyd
Fotochemikalien (Entwickler
und Fixierer)
Glycerin wasserfrei
Roth
Merck
Roth
Kodak
Glycin
Humanalbumin fettsäurefrei
Roth
Sigma
Igepal
Isopropanol
ICN
Roth
Hersteller:
Difco Laboratories, Darmstadt
Kodak, Kodak int. Biotechnologies, New Haven, USA
Merck Darmstadt
Sigma Deisenhofen
Roth Karlsruhe
ICN Biomedicals Inc.
Roth
Serva
Roth
Sigma
Roth
Sigma
Roth
Sigma
Roth
Roth
Roth
SigmaAldrich
Roth
Roth
Roth
39
3.2 Inhibitoren
Substanz
Fumonisin
B1
Funktion
pp5-Inhibitor (IC50 =
80µM); induziert Apoptose
OH
COOHO
HOOC
Lösunsmittel /
Stock-Konz.
H2O; 1mg/ml
200µM
DMSO; 1mg/ml
1µM
#420119
Calbiochem
DMSO; 1mg/ml
1µM
#420123
Calbiochem
gelöst in DMSO
1mg/ml
(=2,65mM)
20µM
#559389
Calbiochem
Endkonz.
Artikelnr./
Hersteller
#F-1147
Sigma
OH
O
O
HOOC
NH2
OH
COOHO
JNK/SAPKInhibitor-II
(SP600125)
Zellpermeabler selektiver
Inhibitor für JNK (IC50
=40nM für JNK-1/2, 90nM
für
JNK-3);
verhindert
Phosphorylierung von cJun;
besitzt
300fach
höhere Selektivität für JNK
als für ERK bzw. p38
N
H
N
O
JNKInhibitor
NegativKontrolle
Inhibiert JNK2 bzw. 3 erst
bei viel höherer Konz. (IC50
=18 bzw. 24µM)
N
N
CH3
O
SB203580
(p38Inhibitor)
Bindet an ATPBindungsstelle von p38
und hemmt die KinaseAktivität
N
H
N
O
S
N
CH3
F
NAC (NAcetylcystein)
Antioxidanz
H COOH
N
H
H3C
O
CH2-SH
H2O; 0,9M;
30mM
pH 7,5 mit
NaOH einstellen
#A-8199
Sigma
40
3.3 Reagenzien für die Behandlung von Zellen
Substanz
Arachidonsäure (freie
Säure)
Linolsäure, wasserlöslich
Linolsäure (freie Säure)
Methyl-ß-cyclodextrin
(Cy)
Ölsäure,
wasserlöslich
Sorbitol
Wasserstoffperoxid
Lösungsmittel / Stockkonz.
Ethanol
100mg/ml
H2O
10mg/ml; 30,2mg/g
Methyl-ß-cyclodextrin
Ethanol
H2O; 100mg/ml
H2O; 10mg/ml;
30,4mg/g Methyl-ßcyclodextrin
H2O; 5M
30%
Endkonz.
0,3µM
100µM
Artikelnr./
Hersteller
#181198
Calbiochem
#L-5900
Sigma
0,3µM
3,3µl Cy pro
1µl LA
100µM
Sigma
#C-4555
Sigma
#O-1257
Sigma
0,5M
1-5mM
Serva
Roth
3.4 Puffer und Lösungen
Puffer für
Agarosegele
Agarose-gele
TBE, 5x
Lysis-puffer
RIPA-puffer
Bestandteile
0,8% (m/v) Agarose
5µg/ml Ethidiumbromid
Tris
H3BO3
EDTA 0,5M, pH8
Reduzierender
54g
27,5g
20ml
H20 ad 1l
NaCl
150mM
TrisHCl pH8,0, 50mM
Igepal
1%
Na-deoxycholat 0,5%
SDS
0,1%
+ Inhibitoren:
PMSF
Aprotinin
Na3VO4
NaF
Probenpuffer
Probenpuffer f.
Agarosegel, 6x
Mengenverhältnisse
50mM
40% (v/v) Glycerin
0,25% (m/v)
Bromphenolblau
Tris 1M, pH 6,8
Mengen für 50ml
5ml einer 1,5M-Lsg (4,4g/50ml)
5ml einer 500mM Lsg (6g/100ml)
0,5ml
2,5ml einer 10%-Lsg
0,5ml einer 10%-Lsg
2µl/ml einer 0,1M Isopropanol-Lsg
1,5µl einer 10%-Lsg
10µl/ml einer 100mM Lsg
(0,18g/10ml)
50µl/ml einer 1M-Lsg
13,0ml
41
Probenpuffer f.
WB; 2x
Glycerin 86%
2-Mercaptoethanol
SDS 10%
Bromphenolblau
H2O
11,6ml
5,0ml
20ml
1 Spatelsp.
ad 100,0ml
Reduzierender
Probenpuffer f.
WB; 5x
Glycerin
Tris 1M, pH 6,8
SDS
MercaptoEtOH
Bromphenolblau
10ml
6,2ml
2,0g
3,8ml
1 Spatelsp.
Tris 48mM
Glycin 39mM
SDS 0,0375%
Methanol 20%
11,6g
5,8g
3,75ml 20% SDS
200ml 99% MeOH
H2O ad 1l
SDS-Laufpuffer,
10x
Tris
Glycin
SDS
30g
144g
10g
H2O ad 1l
4xTris-HCl/SDS
pH 6,8
Tris
SDS
4xTris-HCl/SDS
pH 8,8
Tris
SDS
Stripping-puffer
TBS
SDS 2%
ß-Mercaptoethanol 100mM
6,05g
0,4g
H2O ad 100ml, pH 6,8 mit HCl
einstellen
45,5g
1g
H2O ad 250ml, pH 8,8 mit HCl
einstellen
80ml
16ml 10% SDS
0,7ml
Puffer für
Western Blots
Blot-puffer
Waschpuffer
PBS, 10x
TBS, 10x
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
Tris-HCl 100mM, pH7,4
NaCl
2M
80g
2g
14,4g
2,4g
H2O ad 1l; pH7,4 mit NaOH
einstellen
42
3.5 Enzyme
Cholesterin-Esterase
EcoR1
SuRE/Cut Buffer H for Restriction
enzymes
T4-DNA Ligase
5x T4-DNA Ligase Puffer
Trypsin
Trypsin-Inhibitor
Xho I
5mg; #393916; Roche
10U/µl; 92353020;1175084; 10000U;
Roche
10x buffer; 1417991;
Boehringer Mannheim GmbH
1U/µl; Cat# 15224-017; Life Technologies
Part.No.: Y90001; Invitrogen Life Technologies
1mg/ml; Sigma
1mg/ml; Type I-S; from Soybean, #T-9003;
Sigma
10U/µl; cat# 899194; Roche
3.6 Marker
Biotinylated protein ladder
Kit: Cat# 7727; Cell Signaling Technology
Magic marker™ Western
Standard
Magic marker™ XP Western
Standard
# LC5600; Invitrogen
(120;100;80;60;50;40;30;20)
# LC5602; Invitrogen
(220;120;100;80;60;50;40;30;20)
Roti-Mark prestained
1kb DNA Ladder
#T852.1; Roth (245;123;77;42;30;25,4)
1µg/µl; # 15615-016; Invitrogen
3.7 Transfektion / Immunpräzipitation
Lipofektin Reagent
Protein A/G Plus Agarose
#18292-011/-037; 1mg/ml; Invitrogen
#sc-2003; Santa Cruz Biotechnology
43
3.8 Antikörper
Antikörper gegen
Spezies
Eingesetzte
Hersteller
Verdünnung
1:500
# sc-6368; 200µg/ml;
Santa Cruz Biotechnology
ASK1 (N19)
goat
ASK1 C-Terminal
(1356-1375)
rabbit
1:500
# B44221; 100µg/ml;
Calbiochem
mouse
monoclonal
IgG1
mouse
1:500
# sc-5294; Santa Cruz
Biotechnology
1:500
# P75520; 250µg/ml;
Transduction Laboratories
mouse
monoclonal
1:500
# F-3165; Sigma
rat monoclonal
IgG
1:500
# 1867423; 100µg/ml;
Roche
Anti-Phosphothreonine,
clone 1E11 + P-Control
mouse
1:500
# 52750; Biomol
Phospho-SAPK/JNK
(Thr183/Tyr185)
rabbit
1:1000
# 9250 (Kit);Cell Signaling
Technology
SAPK/JNK
rabbit
1:1000
“
Anti-Phospho-p38
MAPK (Thr180/Tyr182)
rabbit
1:1000
# 9211; Cell Signaling
Technology
Anti-p38 MAPK
rabbit
1:1000
# 9212; Cell Signaling
Technology
Anti-active MAPK
(ERK1/2)(pTEpY)
Anti-GAPDH
rabbit
1:5000
# V803A; Promega
mouse
monoclonal
rabbit
1:4000
# 4300; Ambion
1:400
# TB273; Promega
ASK1-F9
ppt/pp5
Anti-Flag M2
Anti-HA clone 3BF10
Anti-PARP p85
Fragment Antikörper
Antikörper für
Immunfluoreszenz
Cy3-conj. Affini Pure F(ab’)2
Fragment
Zweit-Antikörper für
Western Blot
Donkey-anti-goat IgG-HRP
44
Spezies
goat anti
mouse IgG
(H+L)
Eingesetzte
Hersteller
Verdünnung
1:500
Min X: Hu, Bov, Hrs,
Sr, Prot; Code#115166-062; Jackson
Immuno Research
Lab.; Amersham
International
Eingesetzte
Verdünnung
1:500
Anti-mouse IgG-HRP
1:500
Goat-anti-rat IgG-HRP
1:500
Anti-rabbit IgG-HRP
1:2000
HRP-conjugated anti-biotin
antibody
1:1000
Hersteller
sc-2020; 200µg/ml;
Cat# sc-2005;
Cat# sc-2006
Cat#7074; Cell signaling
technology
Cat #7075; Cell signaling
technology
3.9 Kits
Annexin-V
ATP Bioluminescence Assay Kit CLS II
Caspase-Assay
CaspaTag™Caspase-3/7 In situ Assay
Kit
Chemilumineszenz Western-Blot
BD ApoAlert™-Annexin-V-EGFP
Apoptosis Kit; # 630113; BD Biosciences
# 1699695; Roche
Caspase-Glo™ 3/7-Reagenz; Promega
# G8092
# APT423; Chemicon International
BM Chemiluminescence Blotting
Substrate (POD); Roche; #1500708
Luciferase-Assay
# E1501; Promega
Quiaprep Spin Minipräp Kit
# 27106; Quiagen
Endo-Free®Plasmid Maxi Kit
# 12362; Quiagen
QIAEX-II Gel extraction Kit
# 20021; Quiagen
DeadEnd TM Fluorometric TUNEL System # TB235; Promega
Hersteller:
BD Biosciences; Palo Alto; USA
Chemicon International; Temecula; USA
Promega; Madison; USA
Quiagen; Hilden
45
3.10 Plasmide
Maxipräp Ch-3: 2,81µg/µl v. Ichijo
(05.02.03)
Flag-ASK1 in pcDNA3.0
EcoR1
ASK1
Flag
EcoR1
NotI
pcDNA3.0
5.4kb
HA-pp5 in pcDNA3.0
pcDNA3.0 Kontrollvektor
Maxipräp: 1,5µg/ml
(30.06.03)
Maxipräp: 0,98µg/µl
(23.05.03)
v. Ichijo
Selbst hergestellt, aus
Flag-ASK1 mit Xho I
ausgeschnitten
pAP1-Luc
(24.03.03)
# 299078-51;
Stratagene
pNFkB-Luc
(24.03.03)
# 219074-51;
Stratagene
46
3.11 siRNA´s
Zur transienten Ausschaltung von ASK1 wurden chemisch synthetisierte siRNA´s
der Firma Ambion (#16804) verwendet:
siRNA#1: 5´-GGUGGCACAAGCAAGUUCUtt-3´
siRNA#3: 5´-GGUAUACAUGAGUGGAAUUtt-3´
siRNA#5: 5´-GGAAAUAAUUUGCCAGAAGtt-3´
sowie ein Negativ-Kontroll Oligonukleotid gegen eine nonsense-Sequenz (#4611).
Jeweils 40nmol siRNA wurden mit 400µl Wasser auf eine Konzentration von 100µM
eingestellt. Die Negativ-Kontrolle lag bereits in gelöster Form vor in einer
Konzentration von 50µM.
3.12 Bakterien
Subcloning Efficiency DH5α® Chemically Competent Cells E.coli; Invitrogen; #
18265-017
3.13 Laborbedarfsartikel
Eppendorf-gefäße
Flotationsröhrchen
Küvetten
(Halbmikro)
Minisart
Spritzenfilter steril
Multitips
NitrocelluloseMembran
PD-10 desalting
workmate
Probenröhrchen
mit Schraubdeckel
PP-Falconröhrchen
PP-Falconröhrchen
Probenröhrchen
PP
Rotilabo®
Spritzenfilter steril
Spritzen steril
Luer Injekt
Volumen
1,5ml
13x51mm
Artikelnr.
212130
5022
2ml
297872710
Hersteller
Eppendorf
Konrad Beranek
Laborgeräte
MBT
0,8µm
16592
Sartorius
12,5ml
5ml
2,5ml
300mmx3m
Porengrösse:
0,45µm
Equil. Vol. 25ml
Proben-Vol. 2,5ml
Elutions-Vol. 3,5ml
1,5ml
147870347
MBT
10401196
Schleicher &
Schuell
170851-01
Amersham
Biosciences
710005
Biozym
15ml
50ml
14ml
188271
227261
187261
Greiner Bio-one
Greiner Bio-one
Greiner Bio-one
0,22µm
0,45µm
10ml
P664.1
P665.1
4606108V
Roth
B. Braun
UltrazentrifugenRöhrchen/Re-Seal
Whatmanfilterpapier
Zellschaber steril
47
25x89mm
9052
190mmx100m
3030690
24cm
99002
Hersteller der Labormaterialien:
Amersham Biosciences,
Uppsala/Schweden
B. Braun; Melsungen
Biozym
Greiner Bio-one; Frickenhausen
MBT; Gießen
Konrad Beranek
Laborgeräte
Whatman
International Ltd.
TPP
Sartorius; Göttingen
Schleicher&Schuell
Konrad Beranek Laborgeräte
TPP; Schweiz
Whatman Ltd.
3.14 Laborgeräte
Gerät
ATP-Messgerät/
Lumat LB 9507
BioDoc Analyze
UV-Gerät für
Agarosegele
Brutschrank für
Zellkulturen
Dispenser-Multipette
4780
Elektrophorese-power
supply
Elektrophoresekammer
Für Western Blots
Hersteller
Berthold
Technologies
Biometra
Gerät
Mikroskop
Hersteller
Zeiss
Mikroskop,
Farbkamera
Zeiss
Heraeus
Instruments
Eppendorf
pH-Meter pH320
WTW
Pipettierhilfe
„Pipetus“
Pipetten 10-1000µl
Hirschman
Laborgeräte
Eppendorf
Röntgenfilme
Rotor VT50
Fuji Fotofilm
Super RX;
Fujifilm
Beckman
Rotor SW55
Beckman
Consort 400V400mA AE844
Kreutz Labortechnik
Elektrophoresekammer Renner GmbH
Für Agarosegele
FACScan
Becton
Dickinson
Fluoreszenzmikroskop Zeiss
Filmkassette
Kodak Cassette
BioMax
Gefrierschrank -20°C
Liebherr
Gefrierschrank -70°C
Heraeus
Glasgeräte, flaschen
Schott
Horizontalschüttler KS Edmund Bühler
10
Kühlschrank
Liebherr
Magnetrührer IKAMAG Jankel und
Kunkel, Staufen
Mikro-Lumat LB 96P
Berthold
Schüttelwasserbad
Haake SWB25
Standzentrifuge
Beckman
GPKR
Sterilwerkbank
Cryo-Technik
Thermomixer
Eppendorf
Ultrazentrifuge
Beckman Coulter
UV/Visible SpectroPharmacia
meter Ultrospec 2000 Biotech
Vortex
Heidolph
Waage
Mettler
Waage, digital
Sartorius
Hersteller der Laborgeräte:
Beckmann, München
Biometra, Göttingen
Bosch, Stuttgart
Cryo-Technik, Hamburg
Eppendorff
Heraeus Instruments, Hanau
Kreutz Labortechnik, Reiskirchen
48
Labotec, Wiesbaden
Liebherr, Ochsenhausen
Renner GmbH, Dannstadt
Sartorius, Göttingen
Schott, Mainz
WTW, Weilheim
Zeiss, Oberkochen
3.15 Materialien und Medien für die Zellkultur
Medien für die Kultur von Eahy926, 293, Cos7, HeLa und HaCat-Zellen:
Artikelnr. / Hersteller
D-MEM:F-12 (1:1) + GlutaMAX™I
31331-028 / Gibco
Fetales Kälber Serum (FCS), vor Gebrauch 10106-185 / Gibco
30Min auf 56°C erhitzen um das
Komplementsystem zu inaktivieren
Penicillin 10000U/ml
Streptomycin 10000µg/ml
Trypsin/EDTA 10x
15140-122 / Gibco
T4174 / Sigma
Medium für THP-1 Zellen
RPMI 1640 Medium ohne Glutamin
Glutamin 200mM 100x
Natrium-Pyruvat MEM 100mM
Hepes 1M
P/S; FCS
31570-047; Gibco
25030-024; Gibco
11360-039; Gibco
15630-056; Gibco
s.o.
Medium für primäre Zellen (HAoEC)
Endothelial Cell Growth Medium MV
+ Suppelement-Mix
5% FCS
10ng/ml EGF
1µg/ml Hydrocortison
2ml ECGS/H
Gentamicin/AmphotericinB
Hepes BSS
TNS (Trypsin Neutralizing Solution)
Trypsin-EDTA
C-40000; PromoCell
C-41100; PromoCell
C-41000; PromoCell
Medium für die Transfektion
OptiMEM
31985-047; Gibco
C-22020 ; PromoCell
C-39225; PromoCell
Medien zur Kultivierung von Bakterien
LB (Luria Bertani)-Medium
LB-Agar Platten mit Ampicillin
49
Bacto-Trypton 1% (m/v)
Hefeextrakt 0,5% (m/v)
NaCl
0,5% (m/v)
In Wasser lösen, pH7,5
einst.; autoklavieren
LB-Flüssigmedium mit 1,5%
(m/v) Bacto-Agar versetzen,
autoklavieren. Nach
Abkühlen auf ca. 50°C
100µg/ml Ampicillin
zugeben und in Platten
gießen.
Materialien für die Zellkultur
Gewebekulturflaschen T75
Gewebekulturflaschen klein
Zellkulturplatten 6-well,
24-well, 12-well, 96-well
Chamberslides Kunststoff/ Lab Tek
Permanox 8-well
Chamberslides glas/
Lab Tek
Deckgläschen 24x24mm
Hersteller der Materialien für die Zellkultur:
Gibco Invitrogen
Greiner, Solingen
Menzel-Glaser, Braunschweig
PromoCell, Heidelberg
Nalge Nunc International, USA
Nunc, Dänemark
Hersteller
Greiner Bio-One GmbH
Greiner Bio-One GmbH
Nunc
Nalge Nunc Internatinal
Nalge Nunc International
Menzel-Glaser
50
3.16 Allgemeine Durchführung der Proteinbestimmung
Der Proteingehalt in Zelllysaten bzw. LDL oder oxLDL-Proben wird mit dem RotiNanoquant Reagenz (Art.Nr. K880.1) durchgeführt. Die Methode basiert auf dem
Bradfort-test (Bindung von Coumassie an Proteine, dadurch Erhöhung des
Absorptionsmaximums, Blaufärbung). Das Reagenz liegt in einer 5x konzentrierten
Lösung vor und wird direkt vor Gebrauch 1:5 verdünnt.
BSA-Standardreihe
Als Stammlösung wurde eine wässrige Lösung von bovinem Serum Albumin mit der
Konzentration von 10mg/ml angesetzt. Aus dieser Lösung wurde eine
Verdünnungsreihe hergestellt (2,5; 2; 1,5; 1 und 0,5 mg/ml). Zur Messung der
Absorption wurden jeweils 10µl der Verdünnungen zu 1ml 1xRoti-NanoquantReagenz in Einmal-Plastikküvetten pipettiert und gut geschüttelt. Die Inkubationszeit
beträgt 5 Minuten, dann wird die Absorption bei 595nm gemessen.
Ext. 595nm
BSA-Standardkurve für 10µl Probe
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 0,3431x + 0,0311
0
0,5
1
1,5
2
2,5
BSA-Konz.[mg/ml]
Abb. 13: BSA-Standard Kurve
Der Proteingehalt in Zelllysaten lässt sich ermitteln, in dem 10µl Probe zu 1ml 1x
Roti-Nanoquant Reagenz gegeben werden. Die Proteinkonzentration in der Probe
kann direkt aus der BSA-Standardkurve abgelesen werden.
3.17 LDL-Präparation
Die LDL-Präparationsmethode basiert auf der Methode der sequenziellen
Ultrazentrifugation über einen Kaliumbromid-Gradienten. Das Verfahren wurde
erstmals von Havel et al (Havel, 1955) beschrieben.
Das zu verarbeitende Plasma stammt von nicht-lipämischen Spendern zwischen 18
und 65 Jahren, die frei von Herzkreislauf- sowie Stoffwechselerkrankungen sind und
sich keiner medikamentösen Behandlung unterziehen.
Für die Isolierung von LDL aus Plasma werden ausschließlich autoklavierte Puffer
und Lösungen verwendet. Die Präparation findet unter aseptischen Bedingungen
statt, um eine Kontamination v.a. mit LPS-produzierenden Bakterien zu vermeiden.
51
Das Volumen der frischen Plasmakonserve wird in einem sterilen 500ml
Standzylinder gemessen. Von dieser Menge wird zur Dichtebestimmung eine Probe
von 1ml entnommen (Plasma-Probe).
Dem Plasma wird nun 0,3265g KBr / ml zugefügt und wiederum wird eine 1ml Probe
entnommen (Plasma-KBr-Probe). Das Volumen im Standzylinder wird nochmals
abgelesen und durch 16 dividiert, da die Menge auf 16 Ultrazentrifugen-Röhrchen
verteilt werden soll (z.B.: total 300ml/16=18,7ml pro Röhrchen).
Im nächsten Schritt werden die Ultrazentrifugenröhrchen mit der Light KBr-Lösung
befüllt, deren Volumen wie folgt ausgerechnet wird: Plasma-KBr-Menge pro
Röhrchen wird vom Gesamtvolumen eines Röhrchens subtrahiert (z.B. 40ml-18,7ml
= 21,3ml Light KBr-Lsg.).
Diese Light KBr-Lösung wird nun mit dem schwereren Plasma-KBr unterschichtet.
Die Röhrchen werden anschließend mit einem speziellen Zuschweissgerät
(Beckmann) verschlossen. Bei 45000rpm und 10°C werden die Proben über Nacht
(mind. 16h) zentrifugiert (Ultrazentrifuge L60; Rotor VT 50; Beckmann), wobei sich
die Lipidfraktion am oberen Röhrchenrand ansammelt.
Am nächsten Tag kann die LDL-Fraktion mit einer 5ml Spritze abgenommen werden.
Das Volumen der isolierten Fraktion 1, von dem wieder eine 1ml-Probe (LDL-KBrProbe1) entnommen wird, wird in einem 250ml Standzylinder gemessen.
Die bisher entnommenen 1ml-Proben werden ausgewogen und ergeben die
Dichtewerte in g/ml.
Mit diesen Dichte-Werten ist es nun möglich die KBr-Menge [g] zu berechnen, die
nötig ist um die LDL-Fraktion 1 wieder auf die Dichte von schwererem Plasma
einzustellen.
Rechnung:
Plasma-KBr-Dichte minus Plasma-Dichte = Z
Plasma-KBr-Dichte minus LDL-KBr-Dichte = Y
0,3265 ∗ Y
= .....g / ml ∗ VolumenFraktion1 = KBrMenge[ g ]
Z
Der Wert Z gibt die Dichteerhöhung an, die durch Zugabe von 0,3265g KBr / ml Plasma entsteht.
In 8 Ultrazentrifugenröhrchen wird wie oben beschrieben die Light-KBr Lösung mit
dem schweren LDL-KBr unterschichtet und mindestens 16h zentrifugiert (Zentrifuge
und Rotor wie im Schritt 1). Die Lipidphase sammelt sich wieder am oberen Rand der
Zentrifugenröhrchen.
Aus der gesammelten LDL-Fraktion 2 wird wieder eine 1ml Probe entnommen (LDLKBr-Probe2) und dann die Menge an KBr errechnet, die nötig ist um die Fraktion 2
auf die Dichte von 1,15 einzustellen (Sollwert).
Rechnung:
(1,15 − Dichte LDL − Fraktion 2 ) ∗ 0,3265
= ....g / ml ∗ VolumenFraktion 2 = KBrMenge[ g ]
Z
Z stellt wiederum die Dichteerhöhung dar, die durch Zugabe von 0,3265g KBr / ml Plasma entsteht.
52
In vier Ultrazentrifugenröhrchen wird nun eine KBr-Lösung mit der Dichte von
1,15g/ml mit dem LDL-KBr der Fraktion 2 unterschichtet und mindestens 16h
zentrifugiert.
Nach dieser dritten und letzten Zentrifugation wird die Lipidphase wie gehabt
gesammelt. Sie wird unter sterilen Bedingungen in einen Dialyseschlauch überführt
und in 5l Dialysepuffer gegeben. Zum Schutz gegen oxidative Veränderungen ist im
Dialysepuffer EDTA enthalten. Am selben Tag wird der Dialysepuffer noch einmal
gewechselt.
An den drei folgenden Tagen muss der Dialysepuffer täglich einmal ausgetauscht
werden. Anschließend wird das Dialysat durch einen 0,45µm Filter sterilfiltriert.
Die Bestimmung der Cholesterin-Konzentration des LDL erfolgt photometrisch (s.u.),
das Lipid wird nun bei 4°C gelagert.
Puffer und Lösungen:
Light KBr-Lösung:
9g KBr auf 1l aqua dest.
20 ml verwerfen
20 ml 5% EDTA pH 7.0 hinzufügen
KBr-Lösung (Dichte: 1,15g/ml):
38,4g auf 200ml aqua dest.
5ml verwerfen
5ml 5% EDTA pH 7.0 hinzufügen
Dialysepuffer
44g NaCl
3g Tris-Base
0,465g EDTA * 2 H2O
ca. 4500ml aqua dest. hinzufügen
pH auf 7,3-7,4 mit konzentrierter
HCl einstellen
auf 5l aqua dest. auffüllen
5% EDTA pH 7.0
12,5g EDTA
100ml aqua dest.
pH 7.0 mit NaOH einstellen
Mit aqua dest. auf 250ml auffüllen
3.18 Messung der Cholesterin-Konzentration
Die Messung des Cholesteringehalts in LDL bzw. E-LDL erfolgt mit dem Cholreagenz der Firma Roche (#2016630).
Das Chol-reagenz enthält Cholesterinesterase, -oxidase, Peroxidase, 4Aminophenazon und Phenol. 10µl LDL werden zu 1ml Reagenz pipettiert und 15 Min
inkubiert. Dann folgt Messung der Absorption bei 546nm. Der Cholesteringehalt wird
nach Firmenprotokoll berechnet.
Die Methode basiert auf der Bestimmung von Δ4-Cholestenon nach enzymatischer Spaltung der
Cholesterinester des LDL durch die Cholesterinesterase, Umsetzung des Cholesterins durch die
Cholesterin-oxidase im reaktionsspezifischen Schritt und nachfolgender Bestimmung des hierbei
entstehenden Wasserstoffperoxids.
53
Cholesterolesterase
+
O
R
O
RCOOH
HO
Spaltung der Cholesterinester durch die Cholesterinesterase zu freiem Cholesterin und freien
Fettsäuren
Cholesteroloxidase
+
+
O2
HO
H2O2
O
Die Cholesterinoxidase
Wasserstoffperoxid
setzt
Cholesterin
OH
O
+
Sauerstoff
um
Peroxidase
NH2
N
mit
+
H2O2
N
zu
O
Cholest-4-en-3-on
O
N
N
N
und
+4
H2O
Das gebildete Wasserstoffperoxid reagiert mit 4-Aminophenazon und Phenol zu einem roten Farbstoff
(4-(p-benzochinon-monoimino)-phenazon).
Die Farbintensität ist direkt proportional zur Cholesterin-Konzentration und kann photometrisch
bestimmt werden.
3.19 Enzymatische Modifikation von LDL
Bei der enzymatischen Modifikation wird LDL zu E-LDL umgesetzt. 1ml LDL (Konz.:
3-5mg/ml) wird mit 6,7µl Trypsin (Konz.: 1mg/ml, Sigma) versetzt und über Nacht bei
37°C und leichtem Schütteln inkubiert. Hierbei wird die Proteinhülle des LDL
aufgespalten. Am nächsten Tag wird die Reaktion durch Zugabe von 3,3µl
Trypsininhibitor (Konz.: 1mg/ml, Sigma) gestoppt.
Nun werden 20µl Cholesterinesterase (Konz.: 2mg/ml) zugegeben und wieder über
Nacht bei 37°C inkubiert. Bei dieser Reaktion werden die Cholesterinester in freies
Cholesterin und freie Fettsäuren gespalten. Hierbei soll eine deutliche Trübung der
Probe auftreten. Blieb diese aus, z.B. auf Grund von KBr-Resten im LDL wegen
unzureichender Dialyse, wurden die Proben nicht verwendet. Das entstandene ELDL wird auch als TC-LDL bezeichnet (Trypsin-Cholesterinesterase).
54
3.20 Flotieren von E-LDL: Herstellung von E-LDL(d4) und
E-LDL(d10)
Der hohe Anteil an freien Fettsäuren verleiht dem E-LDL seine starke Toxizität.
Durch Zusatz von fettsäurefreiem Humanalbumin und anschließender Flotation
können die freien Fettsäuren aus E-LDL bzw. LDL entfernt werden. Somit reduziert
sich die cytotoxische Wirkung des E-LDL.
Das Albumin wird in zwei verschiedenen Konzentrationen zugesetzt: 4% (m/v) und
10% (m/v). Bei letzterer Konzentration werden die freien Fettsäuren fast vollständig
entfernt. Die entstehenden Lipoprotein-Präparationen werden als E-LDL(d4) bzw. ELDL(d10) bezeichnet.
Die Inkubation mit Albumin erfolgt über 1Stunde bei 37°C. Um das Albumin mit den
gebundenen Fettsäuren wieder aus dem E-LDL zu entfernen, werden die Proben
flotiert, d.h. es erfolgt eine Zentrifugation in einem Saccharose-Dichtegradient. Dabei
sammelt sich das Lipid auf Grund seiner geringeren Dichte als Albumin an der
Oberfläche der Flüssigkeit und kann dort abpipettiert werden.
Um den Dichtegradient herzustellen werden zunächst 0,6g Saccharose pro ml LDL
zugegeben. Diese fast gesättigte Lösung wird in ein 5ml Ultrazentrifugenröhrchen
gegeben und mit 2,5ml einer 25%-Saccharose/PBS-Lösung überschichtet. Dann wird
nochmals überschichtet mit 500ml PBS. Hierbei ist jeweils darauf zu achten, dass
sich die Schichten nicht mischen, so dass ein dreiphasiges System entsteht.
Zentrifugiert wird für E-LDL 4h bei 20°C und 35.000rpm. Bei höherer
Umdrehungszahl bzw. niedrigerer Temperatur wird die flotierte Lipidphase zu fest
und kann nur schwer abpipettiert werden. Bei der Flotation von LDL beträgt die
Zentrifugationsdauer 16h.
Nach der Zentrifugation wird die Lipidphase, die sich als schmale Schicht an der
Flüssigkeitsoberfläche gesammelt hat, abpipettiert und in ein Eppendorfröhrchen
gegeben. Hierbei ist darauf zu achten, dass nicht zu viel der Saccharoselösung mit
überführt wird. Falls die Lipidphase zu konzentriert abgenommen wurde, kann sie mit
PBS verdünnt werden. Der Cholesteringehalt wird wie oben beschrieben gemessen.
55
3.21 Rekonstitution von flotiertem E-LDL(d4)/(d10)
Um einen Fettsäure-abhängigen Effekt von E-LDL bzw. flotiertem E-LDL(d4)/(d10)
auf Zellkulturen zu verdeutlichen, werden die mittels Albumin entzogenen Fettsäuren
wieder dazugegeben. In diesem Fall wurde nur mit Linolsäure rekonstituiert, da diese
den Hauptanteil der freien Fettsäuren im E-LDL darstellt.
Zunächst wird die Differenz im Linolsäuregehalt zwischen E-LDL und E-LDL(d4) bzw.
(d10) ermittelt. Dann wird ausgerechnet, welche Mengen an Linolsäure (freie Säure,
Sigma) der jeweiligen Probe zugesetzt werden muss, um den Ausgangsgehalt zu
erreichen.
Linolsäure-Gehalt
[nmol LA/mg
Cholesterin]
E-LDL
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
Berechnung:
Differenz
[nmol]
Zusatz
Linolsäure zu
1mg (Chol.)
E-LDL(d4) bzw.
E-LDL(d10)
798
1239
0,25µl
0,39µl
1277
479
38
molekulare Masse LA = 280,4g
1nmol / 280,4ng
798nmol / x
x = 223,76µg
= 0,224mg
d(LA) = 0,9 => 1ml / 900mg
x / 0,224mg
x = 0,00025ml
= 0,25µl
=> zu 1mg (Cholesterin) E-LDL(d4)
geben
Nach Zugabe der jeweiligen Menge Linolsäure werden die Proben 1 Stunde bei 37°C
und leichtem Schütteln im Thermoblock inkubiert.
3.22 Oxidation von LDL
Zur Oxidation von LDL wird zunächst das im LDL enthaltene EDTA entfernt. Hierzu
wird 1ml LDL über eine PD10-Säule gegeben und mit PBS eluiert. Die LDL-Fraktion
soll möglichst konzentriert aufgefangen werden (nur die gelbe Hauptfraktion wird
weiterverwendet), um zu große Verdünnungseffekte zu vermeiden. Diese wird nun in
ein well einer 6-well Zellkulturplatte überführt, um eine große Oberfläche für die
Oxidation zu erhalten. Als Oxidationsmittel wird Kufpersulfat in einer
Endkonzentration von 25µM verwendet. Dazu wird eine 1M Stammlösung hergestellt,
die vor Gebrauch 1:100 verdünnt wird. 2,5µl dieser Verdünnung werden zu 1ml LDL
gegeben.
Inkubiert wird über Nacht bei 37°C im Brutschrank. Am nächsten Tag sollte die Probe
hellgelb bis weißlich und trüb aussehen. Um das Kupfersulfat wieder aus dem LDL
56
zu entfernen wird die Probe nochmals über eine PD10-Säule gereinigt. Wieder wird
nur die trübe Hauptfraktion möglichst konzentriert aufgefangen.
Überprüfung der Oxidation mittels TBAR-Methode
Bei der Oxidation von LDL bzw. Fettsäuren entstehen Malondialdehyd-Bruchstücke,
die mit Thiobarbitursäure zu einem roten Polymethin-Farbstoff kondensieren. Diese
Malondialdehyd-Bruchstücke werden als Thiobarbiturat-reaktive Substanzen
bezeichnet (TBARs). Die Bestimmung der TBARs wurde nach dem Protokoll von
Morel et al. durchgeführt (Morel et al., 1983).
O
H
O
H
+
2
O
N
S
N
+H
+
-2 H2O
O
Malondialdehyd
O
O
in
1,5ml
H
N
S
NH
HN
OH
O
Thiobarbitursäure
Für den TBAR-Assay wird
Reaktionsansatz hergestellt:
H
N
S
roter Farbstoff
Schraubdeckelgefäßen
folgender
60µl Probe (LDL bzw. oxLDL, Standard oder PBS für Blank)
+ 0,6ml 20%ige Trichloressigsäure
+ 0,6ml 1% Thiobarbitursäure (gelöst in 0,5N NaOH)
Durch die Trichloressigsäure werden die vorhandenen Proteine ausgefällt. Die
Proben werden nun 45 Minuten bei 95°C im Thermoblock gekocht. Darauf folgt eine
Zentrifugation bei 10.000rpm für 20 Minuten. Die Absorption der Proben wird bei
532nm bestimmt.
Der Gehalt an Thiobarbiturat-reaktiven Substanzen im LDL bzw. oxLDL wird anhand
einer Malondialdehyd-Standardkurve bestimmt.
Zur Erstellung der Standardkurve wird aus Malondialdehyd (Sigma; M=164,2g; d=
0,997) eine 1M Stammlösung hergestellt: 1,64ml /10ml H2O. Diese wird weiter
verdünnt, um die jeweils benötigte Menge zu 1,2ml Reaktionsansatz (0,6ml TCA +
0,6ml Thiobarbitursäure) zu geben damit die gewünschten Endkonzentrationen von
10µM bis 10nM erreicht werden.
57
Zusatz der
jew.Verdünnung
zu 1,2ml Ansatz
1,2µl
6µl
3µl
1,2µl
6µl
3µl
1,2µl
Endkonz.
10µM
5µM
2,5µM
1µM
0,5µM
0,25µM
0,01µM
Verdünnung
der Stammlsg.
1:100 (=> 10mM)
1:1000 (=> 1mM)
„
„
1:10.000 (=> 100µM)
„
„
MDA-Standard
0,5
y = 0,1843x + 1E-04
Ext. 532nm
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
M DA-Konz. [µM ]
Abb. 14: MDA-Standardkurve
TBAR-gehalt in LDL, oxLDL und E-LDL:
LDL
ox-LDL
E-LDL
Ext.
532nm
MDAKonz. [µM]
Protein
mg/ml
Cholesterin
mg/ml
Tbars
[nmol]/mg
Protein
Tbars
[nmol]/mg
Cholesterin
0,004
0,116
0,008
0,39
12,54
0,82
1,77
1,32
3,09
6,95
1,71
5,6
0,22
9,50
0,27
0,06
7,34
0,15
LDL und E-LDL enthalten keine Thiobarbiturat-reaktiven Substanzen. OxLDL jedoch
weist einen deutlichen Gehalt an TBARs auf (9,5 nmol/mg Protein).
58
3.23 Zellkulturen
Die
Behandlung
von
Zellkulturen
fand
an
einer
mikrobiologischen
Sicherheitswerkbank der Klasse II statt (Lamina Flow). Es wurden nur sterile
Materialien bzw. autoklavierte Flüssigkeiten verwendet.
Eahy926, 293, Cos7, HeLa, HaCat –Zellen:
Die Zellen werden in DMEM kultiviert. Das Medium enthält 10% FCS und Pen/Strep.
Zur Kultur werden T75 Flaschen verwendet. Bei Erreichen von Konfluenz werden die
Zellen im Verhältnis 1:4 bzw. je nach Bedarf geteilt.
Die Zellen werden im Brutschrank kultiviert bei einer Temperatur von 37°C und 5%
CO2.
Passagieren der Zellen
Beim Teilen der Zellen wird zunächst das Medium abpipettiert und die Zellen mit
10ml PBS gewaschen. Dieser Waschschritt muss gründlich durchgeführt werden,
denn verbleibende Mediumreste würden die folgende Tyrpsinreaktion stören. Nach
Entfernen des PBS werden 1-3ml Trypsin/EDTA-Lösung in die Flasche gegeben und
die Zellen kurz im Brutschrank inkubiert. Nach wenigen Minuten lösen sie sich vom
Boden ab. Es werden 10ml FCS-haltiges Medium dazugegeben um das Trypsin zu
inaktivieren.
2,5 ml der Zellsuspension werden in eine neue Zellkulturflasche gegeben. Nach
Zugabe von 15ml Medium werden die Zellen weiterkultiviert. Alle Flüssigkeiten
wurden vor Behandlung der Zellen auf 37°C erwärmt.
Aussäen von Zellen für einen Versuch
Zur Vorbereitung eines Versuches werden die Zellen am Vortag in Zellkulturplatten
ausgesät und adhärierten über Nacht in Medium mit FCS. Um am nächsten Tag 90100% Konfluenz zu erhalten, werden z.B. 6x105 Zellen pro well in eine 6-well Platte
gegeben.
Zellkulturplatte
6-well
24-well
96-well
2-well
Chamberslide
8-well
Chamberslide
Anzahl Zellen
pro well für
100%
Konfluenz
6x105
3x105
2x104
4x105
2-3x105
1-1,5x105
1x104
1-2x105
3ml
500µl
100µl
1ml
5x105
-
250µl
Anzahl Zellen pro well
für 50% Konfluenz
(z.B. für Transfektion)
Volumen
59
THP-1 Zellen
Die THP-1 Zellen werden in RPMI 1640 -Medium (Zusätze: 10% FCS, 20mM Hepes,
2mM Glutamin, Pen/Strep) kultiviert und ca. jeden dritten Tag geteilt. Die
Zellkulturflaschen werden stehend gelagert.
Humane Aorten-Endothelzellen (HAoEC)
Die HAoECs wurden nach Anleitung der Firma PromoCell kultiviert. Kurz vor
Erreichen von Konfluenz wurden die Zellen geteilt.
3.24 Allgemeine Durchführung zur Gewinnung von Proben
für Western Blots
Zur Proteinanalyse mittels Western Blot wurden am Vortag des Experiments 6x105
Zellen in 6-well Platten ausgesät, so dass am Tag der Behandlung 90-100%
Konfluenz vorlag.
Behandlung von Zellen mit Lipoproteinen oder alpha-Toxin
Die Behandlung mit E-LDL, oxLDL und LDL erfolgte in 1ml normalem Medium mit
einer Endkonzentration von 100µg/ml. Alpha-Toxin wurde in einer Konzentration von
200ng/ml zugegeben.
Ernten der Zellen
Nach der Behandlung wurde das Medium abgezogen und die Zellen einmal mit PBS
gewaschen. Dann wurden 100µl 2x Probenpuffer zugegeben, die Zellen mit einem
Zellscraper abgekratzt, in ein beschriftetes Eppendorfröhrchen überführt und 5
Minuten bei 95°C denaturiert. Die Aufbewahrung der Proben erfolgte bei -20°C.
3.25 Allgemeine Durchführung einer transienten Transfektion
Transiente Transfektionen wurden mittels Lipofektin® (Invitrogen) durchgeführt.
Lipofektin ist eine 1:1 Mischung zweier kationischer Lipide. Die negativ geladene
Plasmid-DNA lagert sich in die Fächerstruktur des Liposoms ein und kann so in Form
eines Lipid-DNA Komplexes durch die Zellmembranen transportiert werden.
Die Transfektion wurde zunächst in verschiedenen Zellkulturlinien durchgeführt. Die
Transfektionseffizienzen waren sehr starken Schwankungen unterlegen. Am besten
transfizieren ließen sich 293-, HeLa- und Cos7-Zellen. Bei den 293 Zellen bestand
allerdings das Problem, dass sie sich sehr schnell von der Zellkulturplatte ablösten
und es zu starken Zellverlusten kam. Dies war natürlich keine gute Voraussetzung
für eine Western-Blot Analyse. Infolge dessen wurden nur noch Cos7 Zellen
verwendet, welche während des gesamten Versuchs adhärent blieben.
60
3.25.1 Transfektion von Plasmid-DNA für Western-Blot bzw.
Immunfluoreszenz-Analysen
Bei der Vorbereitung eines Transfektionsversuchs wurden die Zellen so ausgesät,
dass am Tag der Transfektion 50% Konfluenz vorlag. Die Zellen durften nicht dichter
ausgesät werden, da sie erst 48h nach Transfektion behandelt und geerntet wurden.
Zur späteren Analyse in Western-Blots wurde in 6-well Zellkulturplatten transfiziert,
für die Durchführung von Immunfluoresenz-Analysen in 2-well Chamberslides.
Die Transfektion wurde entsprechend dem Firmenprotokoll durchgeführt. Als
serumfreies Medium diente OptiMEM.
Mengenverhältnisse für einen Transfektionsansatz:
6-well
Zellkulturplatte
2-well
Chamberslide
Lösung A
Plasmid-DNA
Lösung B
Lipofektin
Gesamtvolumen
1-2µg in 100µl
OptiMEM
0,5µg in 50µl
OptiMEM
10µl in 100µl
OptiMEM
5µl in 50µl
OptiMEM
1ml
0,5ml
Zunächst wird die entsprechende Menge Plasmid-DNA in 100 bzw. 50µl OptiMEM
gegeben. Für die Durchführung von mehr als einer Transfektion wird ein Vielfaches
dieses Ansatzes hergestellt (Lösung A).
Dann wird die entsprechende Menge Lipofektin in 100 bzw. 50µl OptiMEM gegeben.
Auch hier wird je nach Anzahl der Transfektionen ein Vielfaches dieser Lösung
angesetzt (Lösung B). Diese Mischung muss 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen
bleiben, damit sich das Lipofektin entfalten kann.
Währenddessen werden die zu transfizierenden Zellen einmal mit serumfreiem
Medium (OptiMEM) gewaschen.
Anschließend werden Lösung A und B gemischt und zusammen 15 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. In diesem Schritt lagert sich die Plasmid-DNA in die
Liposomen ein. Zu diesem Transfektionsgemisch werden pro Ansatz 800 bzw. 400µl
OptiMEM gegeben. Nach vorsichtigem Mischen wird jeweils 1ml (6-well Platten) bzw.
0,5ml (Chamberslides) der Mischung pro well auf die Zellen gegeben.
Die Zellen werden nun über Nacht (16-24h) im Brutschrank inkubiert. Am nächsten
Tag wird das Medium gewechselt und 3ml normales DMEM (10% FCS, P/S) pro well
zugegeben. 48h nach Transfektion haben die Zellen genügende Mengen des
Proteins exprimiert, sie können jetzt behandelt bzw. fixiert werden.
61
3.25.2 Transfektion von Reporterplasmiden
Für die Transfektion der Reporterplasmide pNF-κB-Luc und pAP1-Luc wurden 24well Zellkulturplatten verwendet. 1-1,5x105 Zellen (Eahy926 bzw. J774-Zellen)
wurden pro well ausgesät, so dass am Tag der Transfektion 50% Konfluenz vorlag.
Als Transfektionsmittel diente ebenfalls Lipofektin. Transfiziert wurde 400ng
Reporterplasmid pro well unter Verwendung von 1µl Lipofektin in einem
Gesamtvolumen von 300µl. Bei den Cotransfektionsversuchen wurde zusätzlich
80ng FlagASK1, HA-pp5 oder Kontroll-plasmid (pcDNA3) zugegeben. Dadurch
kommt ein Verhältnis von Reporterplasmid zu FlagASK1 von 5:1 zustande. Je nach
Anzahl der Transfektionen wurden Vielfache der Lösung A und B angesetzt. Die
Herstellung des Transfektionsgemisches entspricht der obigen Beschreibung.
Mengenverhältnisse für einen Transfektionsansatz (24-well Platten):
Lösung A
Lösung B
Einfache Transfektion
400ng Reporter
25µl OptiMEM
1µl Lipofektin /
25µl OptiMEM
Cotransfektion
400ng Reporter
+80ng FlagASK1
25µl OptiMEM
1µl Lipofektin
25µl OptiMEM
Gesamtvolumen
300µl
300µl
Die Zellen wurden ebenfalls über Nacht im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag
wurde das Medium gewechselt und 500ml DMEM (10% FCS, P/S) zugeben. 16 oder
48h nach Transfektion konnten die Zellen behandelt werden. Anschließend erfolgte
Luciferase-Messung (s.u.).
3.25.3 Transfektion von siRNAs
A) Cotransfektion mit FlagASK1
Für die transiente Ausschaltung von ASK1 wurden chemisch synthetisierte siRNA´s
der Firma Ambion bestellt. Deren Funktion wurde mittels Cotransfektion mit
FlagASK1 im Western Blot überprüft. Die Transfektion fand in 6-well Zellkulturplatten
statt. Als Transfektionsmittel wurde Lipofektin verwendet.
Transfiziert wurde 100ng FlagASK1 alleine sowie 100ng FlagASK1 mit der jeweiligen
siRNA bzw. Negativ-Kontrolle in einer Endkonzentration von 100nM. Weiterhin wurde
100ng FlagASK1 mit einem Mix der siRNAs #1, 3 und 5 in einer
Gesamtkonzentration von 100nM transfiziert, um zu sehen, ob sich mehrere
gleichzeitig eingesetzte siRNAs in ihrer Wirkung verstärken.
62
Folgende Mengen wurden transfiziert:
FlagASK1
siRNA#1, 3, 5
einzeln
siRNA# 1, 3, 5
zusammen
NegativKontrolle
StockLösung
Transfizierte
Menge
Endkonzentration
in 1ml Volumen
2,81mg/ml
Maxipräp
je 100µM
6µl 1:100 Verd.
100ng/ml
je 1µl
100nM
je 100µM
je 0,33µl
insgesamt 100nM
50µM
2µl
100nM
Lösung A besteht aus 100ng FlagASK1 mit/ohne siRNA´s und 180µl OptiMem. Die
Lösung B setzt sich aus 1µl Lipofektin und 20µl OptiMem zusammen, hiervon wird
ein Vielfaches hergestellt. Das Gesamtvolumen beträgt 1ml.
Der weitere Verlauf der Transfektion entspricht der oben genannten Beschreibung.
Die Zellen werden 48h nach Transfektion geerntet.
B) Transfektion ohne FlagASK1
Western-Blot p38:
Die Transfektion der siRNA´s alleine wurde ebenfalls mit einer Endkonzentration von
100nM durchgeführt. Die drei siRNA´s werden zu gleichen Teilen gemischt, d.h.
0,33µl jeder einzelnen siRNA für einen 1ml Ansatz.
Caspase-Assay:
In einem Volumen von 100µl pro well in 96-well platten wurden die siRNA´s als Mix
mit einer Endkonzentration von 100nM transfiziert.
3.26 Allgemeine Durchführung zur Gewinnung von Proben
für Immunpräzipitationen
Um eine Immunpräzipitation durchzuführen wurden die Zellen in T75Zellkulturflaschen ausgesät, so dass am Tag der Behandlung 90-100% Konfluenz
vorlag. Die Behandlung erfolgte in 10ml Medium. Nach der Behandlung wurde das
Medium abpipettiert und die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Hierbei war es
wichtig, das PBS vollständig wieder zu entfernen, um Verdünnungseffekte
auszuschließen. Nach Zugabe von 600µl Lysispuffer (z.B. RIPA-puffer, s.o.) wurden
die Flaschen 10 Minuten auf Eis gelegt. Die lysierten Zellen wurden sodann in ein
Eppendorfröhrchen überführt und 10 Minuten bei 10000rpm und 4°C zentrifugiert.
600µl des Zellüberstands wurden in neue Eppendorfröhchen pipettiert (Lagerung der
63
Proben während dem Pipettieren auf Eis). Aus diesem Zellüberstand kann nun die
Präzipitation des gewünschten Proteins stattfinden.
Um zu überprüfen, ob jeweils gleiche Mengen des zu präzipitierenden Proteins im
Lysat vorhanden sind, werden 50µl jeder Lysat-probe mit 10µl 5xProbenpuffer
versetzt und 5 Minuten bei 95°C denaturiert. Außerdem kann auch eine
Proteinbestimmung der Lysat-proben erfolgen.
Durchführung der Immunpräzipitation
Nach Lyse der Zellen und Zentrifugation (s.o.) wurde zunächst ein Preclearing
durchgeführt. Dazu wurden 1µg des jeweiligen antigens (beliebiger mouse-oder
rabbit-Antikörper) sowie 10µl Protein A/G Plus Agarose zu 600µl Lysat gegeben und
30Minuten bei 4°C geschüttelt. Dieser Schritt dient dazu, Substanzen aus dem Lysat
zu entfernen, die sich an das Antigen bzw. die Agarose-Matrix binden und die
eigentliche Präzipitation stören würden.
Nach Zentrifugation bei 10000rpm und 4°C werden 550µl Überstand in ein neues
Eppendorfröhrchen überführt. Daraus wird nun das gewünschte Protein präzipitiert.
Zunächst wird 1µg Antikörper gegen das Protein hinzugegeben (eine Probe wird
ohne Zugabe des ersten Antikörpers weiterbehandelt; = negativ-Kontrolle der
Präzipitation). Die Lysate werden 1h bei 4°C unter Schütteln inkubiert.
20µl Protein A/G Plus Agarose werden pro Lysat hinzugefügt. Die Präzipitation
erfolgt nun über Nacht bei 4°C und Schütteln.
Am nächsten Tag werden die Proben für 5 Minuten zentrifugiert bei 5000rpm, 4°C.
Die Pellets werden nun 2x mit Lysis-puffer und 2x mit PBS gewaschen, wobei
zwischendurch die Zentrifugation wie oben wiederholt wird. Nach dem letzten
Zentrifugieren wird das PBS vollständig entfernt und die Pellets in 60µl 2x
Probenpuffer aufgenommen. Nach 5 Minuten denaturieren bei 95°C werden die
Proben bei -20°C gelagert.
3.27 Allgemeine Durchführung von Westernblots
Der Western Blot ist ein spezifischer Nachweis von Antikörpern durch deren Bindung
an elektrophoretisch aufgetrennte Proteine.
Die Proteine werden im elektrischen Feld in Gegenwart des anionischen Detergens
SDS (Natriumdodecyl-Sulfat) nach Molekularmasse aufgetrennt. Dabei binden die
Proteine SDS zu negativ-geladenen SDS-Protein-Komplexen mit konstantem
Ladungs-zu Masse Verhältnis (1,4g SDS/g Protein in 1% SDS-Lösungen). SDS
dentaturiert die Proteine - besonders nach vorheriger Reduktion mit Mercaptoethanol
(Probenpuffer) - und unterbindet Protein-Protein-Wechselwirkungen (Quartärstrukturen). Die Protein-SDS-Komplexe wandern im elektrischen Feld in Richtung
Pluspol.
Als Gelelektrophoresesystem wird ein Polyacrylamid-Gel in Tris-Puffern verwendet.
Polyacrylamid bildet ein Gel, das chemisch inert und ungeladen ist. Ein Sammelgel
(Tris-Puffer pH 6,8; 3% Acrylamid) überschichtet ein Trenngel (Tris-Puffer pH 8,8;
7,5-10% Acrylamid).
64
Für die Analyse von Proteinen bis zu 100kD (z.B. p38, JNK…) wurde ein 10%Acrylamidgel verwendet, für größere Proteine bis 200kD (z.B. ASK1) ein 7,5%Acrylamidgel.
Rezeptur für die Herstellung von Trenn-und Sammelgel:
Sammelgel
Tris-Glycin-Puffer
4x
Acrylamid
Aqua dest.
AP
TEMED
1,25ml (pH 6,8)
0,65ml
3,1ml
30µl
7,5µl
Trenngel
7,5%
10%
1,9ml (pH 8,8)
1,9ml (pH 8,8)
1,9ml
3,75ml
2,5ml
3,1ml
30µl
15µl
Nach Mischen von Puffer, Acrylamid und Wasser wird zunächst das
Ammoniumperoxodisulfat (AP) zugesetzt. AP bildet in Wasser gelöst freie Radikale,
die das Acrylamid aktivieren und auf diese Weise zur Polymerisierung beitragen. Das
im nächsten Schritt zugegebene TEMED funktioniert als Katalysator.
Zuerst wird das Trenngel gegossen und mit einer 50% Isopropanol-lösung
überschichtet, um eine gerade Oberfläche zu bekommen. Nach 20min ist die
Polymerisierung vollendet. Das Isopropanol wird mit Wasser weggewaschen. Auf
gleiche Art wie das Trenngel wird die Sammelgel-Mischung mit AP und TEMED
versetzt und über das Trenngel gegossen. Je nach Anzahl der Proben wird ein
entsprechender Kamm (8, 10, 12 oder 13 Taschen) eingesetzt. Das Sammelgel
sollte mindestens 30 Minuten polymerisieren, bevor der Kamm wieder entfernt wird.
Das Gel wird nun in die Gelelektrophoreseapparatur eingebaut.
Vor dem Auftragen auf das Gel müssen die Proben 5 Minuten bei 95°C aufgekocht
werden. Da die Zellen komplett in Probenpuffer aufgenommen wurden, kommt es zu
einer schleimigen Konsistenz auf Grund von DNA bzw. RNA-Bestandteilen. Durch
das Aufkochen wird diese vermindert und es kommt nicht zu verzerrten Banden.
Eine Zuordnung des Molekulargewichtes erfolgt durch einen Marker wie z.B. MagicMarker (Invitrogen), Roti-Mark (prestained), oder ein biotinylierter Marker (Cell
Signaling Technology).
Nachdem sich alle Proben auf dem Gel befinden wird für ca. 60Min ein elektrisches
Feld von 20mA erzeugt.
Blotten
Die aufgetrennten Proteine werden nun aus dem Gel auf die NitrocelluloseMembran, eine Protein-bindende Membran, transferiert, wobei dieser Transfer
wiederum in einem elektrischen Feld abläuft.
Man tränkt drei Whatman-Filterpapierchen mit dem Blot-Puffer, überschichtet diese
mit der Nitrocellulosemembran, darüber folgt das Gel und schließlich weitere drei
getränkte Whatman-Filterpapiere. Nun wird je nach Größe des zu untersuchenden
Proteins eine Spannung für 60 Minuten angelegt wodurch die getrennten Proteine
aus dem Gel wandern und durch nichtkovalente Kräfte auf der Membran fixiert
werden.
Proteingröße
40-60 kD
65
milliAmpere
(für 1 Membran)
60mA
60 Min
80mA
60 Min
120mA
60 Min
(z.B. p38, JNK, pp5, ERK,)
80-100 kD (p85-PARPFragment)
150 kD
Zeit
(z.B. ASK1)
Wenn zwei Membranen gleichzeitig geblottet wurden, verdoppelt sich die
anzulegende Stromstärke.
Als Kontrolle für den Blot-Vorgang wird eine Ponceau-rot-Färbung durchgeführt, die
alle auf die Membran geblotteten Proteine anfärbt. Dies ist auch eine Kontrolle für
das gleichmäßige Auftragen der Proben bzw. den gleichmäßigen Proteingehalt der
Proben. Die angefärbten Membranen wurden kurzzeitig in Kopierfolie eingeschlagen
und fotokopiert.
Blocken
Bevor nun der Antikörper gegen das zu untersuchende Protein angewendet wird,
müssen erst alle unspezifischen Bindungsstellen auf der Nitrocellulose-Membran
abgesättigt werden. Dies geschieht durch Inkubation der Membran in einer 5%
Milchpulver/TBST-Lösung für 1h unter Schütteln.
Inkubation mit dem Primär-Antikörper
Die Membran wird mit dem spezifischen Antikörper in der jeweils benötigten
Verdünnung (s.o.) in einer 5%-BSA/TBST-Lösung über Nacht bei 4°C und leichtem
Schütteln inkubiert. Darauf folgt 3x waschen für je 10 Minuten in TBST.
Inkubation mit dem Sekundär-Antikörper
Der zweite Antikörper, der sich gegen die jeweilige Spezies des ersten Antikörpers
richtet, wird in der entsprechenden Verdünnung in 0,1% Milchpulver/TBST
hergestellt. Bei Verwendung des biotinylierten Markers wird zusätzlich ein anti-BiotinHRP Antikörper in einer 1:1000 Verdünnung hinzugefügt. Die Inkubation erfolgt 1h
bei Raumtemperatur unter Schütteln. Anschließend wird die Membran wieder 3x für
10 Minuten gewaschen in TBST.
Entwicklung
Für die Entwicklung der Western Blots wurde das BM chemiluminescence Blotting
Substrate (POD) von Roche verwendet. Die Peroxidase des zweiten Antikörpers
katalysiert die Oxidation von Luminol unter Freisetzung von Licht.
66
O
NH2
O
NH
H2O2
O
NH
Peroxidase
O
O
NH2
+ N2 + Licht
O
Abb. 15: Chemilumineszenz-Reaktion
Die Entwicklung der Filme (Kodak) fand unter Rotlicht statt, verwendet wurden
Entwickler und Fixierer ebenfalls von Kodak.
Stripping
Viele der Western-Blots zeigen nach E-LDL Behandlung verschiedene MAP-Kinasen
im aktivierten, d.h. phosphoryliertem Zustand. Um zu beweisen, dass im Vergleich zu
unbehandelten Zellen gleich viel Protein in jeder Probe vorhanden war, wurde ein
Stripping des Blots vorgenommen und die Membran anschließend mit dem
Antikörper gegen die unphosphorylierte MAP-Kinase inkubiert.
Hierfür gab man ca. 30ml Stripping-Puffer auf die Membran, die dann 30Min im 50°C
warmen Wasserbad geschüttelt wurde. Das im Puffer enthaltene Mercaptoethanol
entfernt die Antikörper von der Membran. Nach 2x waschen mit TBST für je 15 Min
wurde die Membran wieder 1Stunde geblockt mit Milchpulver (s.o.). Anschließend
konnte erneut Inkubation mit dem ersten Antikörper – jetzt gegen die
unphosphorylierte MAP-Kinase – stattfinden.
Quantifizierung der Banden in Western Blots
Für die Quantifizierung der Banden wurde das BioDoc Analyze-Programm von
Biometra verwendet.
3.28 Allgemeine Durchführung der Immunfluoreszenz
Die Immunfluoreszenz-Experimente wurden in 2-well oder 8-well chamberslides
durchgeführt.
Die Anzahl der auszusäenden Zellen pro well richtete sich danach, ob die Zellen
transfiziert werden sollten oder nicht (s.o.). Die Zellen adhärierten über Nacht und
wurden am nächsten Tag behandelt/transfiziert. Beim Aussäen war zu beachten, ein
zusätzliches well mitzuberechnen, das als Kontrolle der Färbung nur mit dem zweiten
Antikörper alleine inkubiert werden soll.
Fixieren der Zellen
Das Fixieren von Zellen kann mit organischen Lösungsmitteln (Methanol, Ethanol)
durchgeführt werden. Hierbei wird den Zellen Wasser entzogen. Eine weitere
Fixiermethode stellt das „cross-linking“ mit Formaldehyd dar, wobei Verknüpfungen
zwischen Proteinen entstehen und somit die Struktur fixiert wird. Hierbei bleibt
normalerweise die Zellstruktur besser erhalten als bei der Fixierung mit Methanol,
67
allerdings müssen die Zellen noch durch Zugabe eines nichtionischen Detergenz
(z.B. TritonX-100) oder durch Methanol permeabilisiert werden.
Es wurden beide Methoden ausprobiert; die besten Ergebnisse lieferte die Fixierung
mit Methanol und anschließender Behandlung der Zellen mit TritonX-100.
Nach der Behandlung der Zellen in normalem Medium wurden die Zellen zunächst
1x mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie für 7 Minuten fixiert in Methanol
bei Raumtemperatur. Nach wiederholtem waschen mit PBS wird eine 0,1% TritonX100/PBS-Lösung für 7 Minuten auf die Zellen gegeben. Anschließend wurde wieder
mit PBS gewaschen.
Blocken der Zellen
Um unspezifische Anlagerung sowohl des ersten als auch des zweiten Antikörpers
an Zellproteine zu minimieren, werden die Zellen 1h in einer 3%-BSA/PBS Lösung
geblockt. 500µl dieser Lösung werden pro well eines 2-well Chamberslides
hinzugegeben. Das Blocken erfolgt bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln.
Inkubation mit erstem Antikörper
Die Zugabe des ersten Antikörpers erfolgt in einer 1:500 Verdünnung in 1%BSA/PBS. Die Zellen wurden 1h unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Zellen, die als Kontrolle der Färbung nur mit dem zweiten Antikörper
alleine behandelt werden sollten, wurden mit 1ml der 1%-BSA/PBS Lösung
versehen. Nach der Inkubation wurde 2x mit je 1ml PBS gewaschen.
Inkubation mit zweitem Antikörper
Der zweite Antikörper wurde in einer 1:500 Verdünnung (in PBS) eingesetzt. Die
Inkubation erfolgte 1h im Dunklen unter leichtem Schütteln. Danach wurde wieder 2x
mit je 1ml PBS gewaschen.
DAPI-Färbung der Zellkerne
Um die Zellkerne anzufärben bzw. den Anteil der transfizierten Zellen zur
Gesamtzellzahl bestimmen zu können, wurde eine DAPI-Färbung durchgeführt.
DAPI (4´, 6-Diamidino-2-Phenylindol) wird in einer Endkonzentration von 1µg/ml (in
PBS) eingesetzt. Dieser Farbstoff lagert sich an die DNA im Zellkern an.
Anschließend werden die Zellen wieder 2x mit PBS gewaschen.
Eindecken der Zellen
Das PBS des letzten Waschschrittes wird vollständig entfernt. Das Plastik-Oberteil
der Chamberslides wird entfernt. Nach kurzem Antrocknen der Zellen wird ein
Tropfen Fluopräp aufgetragen und ein Deckgläschen aufgelegt. Die fertigen
Präparate werden im Dunkeln gelagert, um ein Ausbleichen der Färbung zu
verhindern.
Mikroskopiert wird an einem Fluoreszenz-Mikroskop von Zeiss.
68
3.29 Allgemeine Durchführung der ATP-Messung
ATP-Messungen wurden durchgeführt, um den zytotoxischen Effekt von E-LDL auf
Zellkulturen zu verdeutlichen und zu quantifizieren. Durch Vorinkubation mit dem
p38-Inhibitor SB203580 sollte gezeigt werden, dass der zytotoxische Effekt abhängig
ist von p38.
In 96-well Zellkulturplatten wurden Eahy926-Zellen mit 90-100% Konfluenz ausgesät
(2x104 Zellen pro well). Sie adhärierten über Nacht. Am nächsten Tag wurden die
Zellen zunächst 2h vorinkubiert mit dem p38-Inhibitor SB203580 (20µM). Als
Kontrolle diente die entsprechende Menge DMSO. Dann folgte die Behandlung mit
100µg/ml E-LDL, oxLDL und LDL in serumfreiem Medium für 1h. Als Kontrolle
dienten unbehandelte Zellen. Wiederum erfolgte Zugabe von SB bzw. DMSO.
Anschließend wurde das Medium abgezogen und 100µl DMEM mit 1% FCS pro well
hinzugefügt. Wiederum wurde SB bzw. DMSO zugesetzt und nun 3 Stunden
inkubiert. Es wurden jeweils Doppelwerte angesetzt, die in mindestens 3
Wiederholungen bestätigt wurden.
Nach der Behandlung wurde das Medium abgezogen und die Zellen mit 100µl 1%
TritonX-100 in situ lysiert durch kräftiges Auf-und Niederpipettieren. Der ATP-Gehalt
wurde sofort mittels Luciferase-Assay ermittelt.
Dabei legte man 150µl Wasser in ATP-röhrchen vor und gab 10µl Zelllysat und 10µl
ATP-Substrat (ATP-Bioluminescence Assay Kit; Roche CLS II) hinzu. Nach kurzem
vortexen wurde sofort gemessen (10s Integrations-modus, Berthold-Lumat LB 9507).
Dieser Assay basiert auf der ATP-Abhängigkeit der Luciferase-katalysierten
Oxidation von Luciferin. Mit dieser Methode können schon extrem geringe Mengen
an intrazellulärem ATP detektiert werden.
3.30 Allgemeine Durchführung der Luciferase-Messung
Eahy926- bzw. J774-Zellen wurden wie oben beschrieben mit den
Reporterplasmiden pNFκB-Luc und pAP1-Luc transfiziert. 24h bzw. 48h nach
Transfektion wurden die Zellen über Nacht behandelt mit 75-100µg/ml E-LDL bzw.
LDL.
Nach Absaugen des Mediums mit einer Wasserstrahlpumpe und 1x waschen mit
PBS gab man 200µl Cell Culture Lysis Reagent (aus Kit; 1:5 in Wasser verdünnen)
pro well dazu. Nach 5 Minuten Inkubation auf der Schüttelbank wurden die Lysate in
Eppen-dorfröhrchen überführt und 3 Minuten bei 10000rpm zentrifugiert.
Zur Messung der Luciferaseaktivität wurde in ATP-röhrchen 100µl LuciferaseSubstrat vorgelegt. Dazu wurden 10-20µl des Zelllysats gegeben, kurz gevortext und
sofort gemessen (10s Integrations-modus; Berthold Lumat LB 9507). Es ist wichtig,
die Schüttelzeiten bei jeder Probe gleich zu halten, denn die Luciferaseaktivität lässt
schon nach kurzer Zeit stark nach.
Für einen Blank-wert wurde entsprechend mit 10 oder 20µl Lysispuffer verfahren.
69
Folgende Reaktion läuft bei der Luciferase-Messung ab:
HO
S
N
Luciferin
N
COOH
S
+
ATP
+
O2
Firefly
Luciferase
Mg
2+
O
S
N
Oxyluciferin
N
S
O
+AMP + PPi + CO2 +
Licht
Bei Expression der Reporterplasmide entsteht Luciferase, die die Umsetzung von Luciferin zu
Oxyluciferin katalysiert. Die bei dieser Reaktion freiwerdende Lichtmenge ist proportional zur
exprimierten Luciferase.
Abb. 16: Luciferase-Assay
3.31 Caspase-Assay
Dieser Assay diente dazu, die Aktivierung von Caspase 3/7 in Endothelzellen durch
E-LDL in Abhängigkeit von p38 zu zeigen.
Das Protokoll der Behandlung mit SB, E-LDL und LDL und der anschließenden
Inkubation in DMEM mit 1% FCS entspricht dem der ATP-Messung (s.o.).
Es wurden immer so viele Zellen ausgesät, dass aus der einen Hälfte der CaspaseAssay durchgeführt werden konnte bzw. von der anderen Hälfte der ATP-Gehalt
ermittelt werden konnte.
Nach der 3h-Inkubation in DMEM mit 1%FCS wurden 100µl Caspase-Glo™3/7Reagenz (Promega) pro well zugegeben und 1h bei Raumtemperatur unter Schütteln
inkubiert. Insgesamt befinden sich jetzt 200µl Flüssigkeit in jedem well. Davon
werden zur Chemilumineszenz-Messung 180µl in eine schwarze 96-well
Zellkulturplatte überführt. Die Messung erfolgt im 10s-Integrationsmodus mit einem
Berthold-Luminometer.
Der Caspase-Glo™3/7- Assay mißt die Aktivität der Caspasen 3 und 7, die eine
Tetrapeptid-sequenz Z-DEVD von einem prälumineszierenden Substrat abspalten.
Das freigesetzte Produkt (Aminoluciferin) dient wiederum als Substrat für die
Luciferase, die es in der folgenden Reaktion zu einem chemilumineszierenden
Endprodukt umsetzt. Die Lumineszenz ist proportional zu der Höhe der CaspaseAktivität.
70
H
Z-DEVD N
S
N
N
S
S
N
N
S
COOH
Caspase-3/7
Z-DEVD-
+
H2N
COOH
Aminoluciferin
Luciferase
Mg
2+
+ ATP + O2
Licht
Abb. 17: Caspase-Assay
3.32 Caspase-Färbung
Die Caspase-Färbung wurde mit dem Chemicon CaspaTag Caspase-3/7 in situ
Assay Kit (#APT423) durchgeführt.
Dieser Assay basiert auf Fluorochromen Inhibitoren von Caspasen (FLICA). Diese
Inhibitoren sind zellpermeabel und nicht cytotoxisch. In der Zelle bindet der Inhibitor
kovalent an eine reaktive Cystein-Stelle der aktivierten Caspase und produziert eine
grüne Fluoreszenz. Hierbei wird eine weitere Aktivierung der Caspase verhindert.
Ungebundener Farbstoff wird beim Waschen wieder entfernt. Das grüne
Fluoreszenz-Signal dient als direkter Messwert der Menge an aktivierter Caspase 3
und 7 in der Zelle zum Zeitpunkt der Zugabe des Inhibitors.
Ca. 4x105 HaCat bzw. Eahy926-Zellen wurden in 6-well Zellkulturplatten auf
Deckgläschen ausgesät. Sie adhärierten über Nacht in normalem Medium. Am
nächsten Tag fand die Behandlung statt mit 100µg/ml E-LDL (10 Minuten).
Nach der Behandlung wurden die Zellen 2x mit PBS gewaschen. Daraufhin
verdünnte man das FLICA-Caspase-Substrat 1:150 in Medium und pipettierte 50µl
direkt auf die Deckgläschen. Das Substrat wurde deshalb so sparsam eingesetzt,
weil es sehr teuer ist. Nach 1h Inkubation im Brutschrank wurde 2x gewaschen und
die Zellen in Methanol fixiert.
71
Die folgenden Schritte der Inkubation mit p38-Antikörper bzw. DAPI-Färbung
entsprechen dem Immunfluoreszenz-Protokoll (s.o.).
3.33 Annexin-V-EGFP Assay
Mittels Annexin-V Färbung wird ein früher Schritt zur Apoptose untersucht, in dem
man einen Positionswechsel von Phosphatidylserin (PS) in der Zellmembran
detektiert. In nicht-apoptotischen Zellen ist Phosphatidylserin nur an der Innenseite
der Zellmembran lokalisiert. Kurz nach Induktion der Apoptose wandert PS zur
äußeren Membranschicht. Exponiertes Phosphatidylserin kann nun mittels AnnexinV, einem 35,8-kDa Protein mit hoher Affinität zu PS, detektiert werden. Die
Markierung von Annexin-V mit EGFP erlaubt eine Auswertung mit dem FluoreszenzMikroskop.
5x104 Eahy926-Zellen werden pro well in 8-well Chamberslides ausgesät. Sie
adhärieren über Nacht in normalem Medium. Am nächsten Tag findet die
Behandlung mit E-LDL bzw. LDL (200µg/ml) statt. Die Inkubationsdauer beträgt 10
Minuten. Anschließend wird einmal mit Medium gewaschen. Das Medium wird
abgenommen und die Zellen 1x mit Binding-Puffer (aus dem Kit) gewaschen. 250µl
Binding-Puffer werden anschließend auf die Zellen gegeben. Pro well werden 5µl
Annexin-V-EGFP (BD ApoAlert-Annexin-V) zugesetzt und es erfolgt 15 Minuten
Inkubation im Dunklen bei RT.
Danach werden die Zellen 2x mit Binding-Puffer gewaschen und 5 Minuten in 2%Formaldehyd/PBS fixiert. Durch Behandlung mit 1µg/ml DAPI in PBS (4 Minuten
Inkubation) werden die Zellkerne angefärbt. Es erfolgt noch 1x waschen mit PBS,
dann können die Zellen nach kurzem antrocknen mit Fluopräp eingedeckt werden.
3.34 TUNEL-Assay
Zur Detektion von apoptotischen Zellen nach Behandlung mit E-LDL wurde das
DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System verwendet. Bei diesem Assay wird die
fragmentierte DNA von apoptotischen Zellen gemessen. Hierbei markiert man die 3´OH Enden von DNA-Strangbrüchen mit Fluorescein-12-dUTP. Dieser Schritt wird
katalysiert von der rekombinanten Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdT).
TUNEL bedeutet TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling.
Eahy926-zellen wurden in Chamberslides ausgesät und für 16h mit 75µg/ml E-LDL,
LDL, oxLDL und 0,3µM Linolsäure (freie Säure) behandelt. Die Fixierung der Zellen
und die Markierung der DNA-Fragmente wurden entsprechend dem
Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt. Direkt
nach Durchführung des Assays wurden die Proben mittels Fluoreszenz-Mikroskopie
analysiert.
72
3.35 PARP-Fragmentierung
Ein weiteres Merkmal von apoptotischen Zellen ist die Spaltung der poly (ADPribose) polymerase (PARP) durch Caspasen. PARP ist ein DNA-bindendes protein
welches DNA-Strangbrüche erkennt und zu der Basen-Excision Reparatur beiträgt.
Durch Spaltung kann es nicht mehr seine DNA Reparatur Funktion ausüben. Obwohl
eine PARP-Fragmentierung nicht unbedingt zum Fortschreiten der Apoptose nötig
ist, kann sie zur Irreversibilität der Apoptose beitragen.
In Cos7-Zellen wurde untersucht, ob die Hemmung von ASK1 mit siRNAs die Zellen
vor der Spaltung von PARP durch E-LDL bzw. Linolsäure retten kann.
In 6-well platten wurden 2x105 Zellen ausgesät und mit 100nM siRNA-Mix transfiziert.
48h nach Transfektion wurden die Zellen behandelt mit 100-150µg/ml E-LDL und
0,3µM Linolsäure (freie Säure) für 16h. Anschließend wurden die Zellen geerntet in
100µl 2x Probenpuffer. 25µl Probe wurde mittels Western-Blot analysiert.
Als Kontrolle für gleiches Auftragen wurde nach Stripping der Membran mit GAPDHAntikörper inkubiert.
3.36 Oil-red O-Färbung
Bei der Oil-red O –Färbung handelt es sich um die Einlagerung eines lipidlöslichen
Farbstoffes in intrazelluläre Lipidtröpfchen.
CH3
CH3
N N
CH3
OH
N N
Oil-red O
CH3
Eahy926-Zellen werden in 2-well Chamberslides ausgesät und am folgenden Tag für
10 Minuten behandelt mit 100µg/ml E-LDL(d4) bzw. LDL. Anschließend wird 3x mit
PBS gewaschen und weitere 30 Minuten in normalem Medium inkubiert. Nach
nochmals 3x waschen mit PBS werden die Zellen für 30 Minuten fixiert in 10%
Formaldehyd/PBS. Anschließend erfolgt 1h Färbung mit dem Oil red-O Reagenz
(1 Spatelspitze Oil red-O Pulver in 10ml 60%-Isopropanol-Lösung geben, 15 Minuten im Wasserbad
erwärmen bis eine dunkelrote Lösung mit Bodensatz entsteht. Anschließend 1x filtrieren durch einen
0,8µm Filter, dann ein weiteres Mal durch einen 0,45µm Filter).
Die Zellen werden nun nochmals vorsichtig mit PBS gewaschen, kurz angetrocknet
und dann eingedeckt mit Fluopräp. Die Rotfärbung der Lipidtröpfchen wird mit dem
Farbmikroskop aufgenommen.
73
3.37 Messung des oxidative Burst
Unter Oxidative Burst versteht man die schnelle Produktion von reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) in Zellen. Oxidative Burst -Messungen wurden in
Endothelzellen nach Behandlung mit E-LDL durchgeführt. Hierfür eignete sich der
zellpermeable
Fluorescein-Farbstoff
(2´,7´-Dichlorodihydrofluorescein-diacetat),
welcher sich mittels FACS-Analysen in oxidierter Form nachweisen lies.
O
O
Cl
O
H3C C O
O
O
COOH
Intrazelluläre
Deesterifizierung Cl
Cl
O C CH3
Cl
HO
O
OH
2´,7´-Dichlorodihydrofluorescein-diacetat
nicht-fluoreszierend
Oxidation
COOH
Cl
-O
Cl
O
O
2´,7´-Dichlorofluorescein
stark fluoreszierend
Der nicht-fluoreszierende Farbstoff ist zellpermeabel und wird zunächst intrazellulär deesterifiziert.
Nach Oxidation entsteht das stark fluoreszierde Dichlorofluorescein.
Abb. 18: Dichlorofluorescein (DCF)
FACS-Analyse
Eahy926-Zellen wurden mit 90-100% Konfluenz in 6-well Zellkulturplatten ausgesät.
Am nächsten Tag erfolgte Zugabe des Fluorescein-Farbstoffs. Dieser lag in einer
Konzentration von 25µM vor und wurde in einer 1:5000 Verdünnung eingesetzt
(Endkonzentration 5nM). Nach 5 Minuten Inkubation der Zellen wurde mit E-LDL, ELDL(d4), E-LDL(d10), oxLDL und LDL behandelt für 10 Minuten (50-200µg/ml). Nach
Abnahme des Mediums wurden die Zellen 1x mit PBS gewaschen. Dann erfolgte
Trypsinisierung mit 300µl 1xTrypsin/EDTA-Lösung. Sobald sich die Zellen ablösten
wurden sie in 1ml Medium aufgenommen und 5 Minuten bei 5000rpm abzentrifugiert.
Die Pellets wurden in 2%-Formaldehyd/FACS-Puffer fixiert. Zur Analyse der Proben
im FACS wurde der FL1-H Modus verwendet.
3.38 Transformation von Kompetenten Zellen
Um ein Plasmid zu vervielfältigen wird es zunächst in Bakterien transformiert, diese
dann vermehrt und schließlich das Plasmid wieder aus der Kultur extrahiert (Miniund Maxi-Präp).
74
Für die Transformation werden als kompetente Zellen DH5α™ subcloning
efficiancy™ chemically competent cells, E.coli verwendet (Invitrogen # 44-0098).
Die Transformation wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Die
Bakterien wurden zunächst auf Eis aufgetaut. Dann pipettierte man 25µl der Zellen in
vier Eppendorfröhrchen (auf Eis). Die restlichen Zellen wurden in einem
Ethanol/Trockeneisbad wieder eingefroren.
Das Plasmid wurde in zwei verschiedenen Konzentrationen zugegeben (1ng und
10ng). Weiterhin benötigte man eine negativ-Kontrolle (Wasser) und eine positivKontrolle (pUC19-control DNA; 500pg). Bei der Zugabe von Plasmid bzw. Kontrolle
war es wichtig, sehr vorsichtig zu pipettieren und die Zellen nicht zu schüttlen. Sie
sind kompetent, d.h. haben Poren in der Zellwand und würden sonst zerstört werden.
Die Mischungen inkubierten nun 30 Minuten auf Eis.
Daraufhin folgte ein Hitzeschock für 20 Sekunden in einem 37°C warmen Wasserbad
und anschließend 2 Minuten Inkubation auf Eis. Bei diesem Schritt werden die Poren
in der Zellwand der Bakterien geschlossen.
Je 300µl vorgewärmtes LB-Medium (ohne Ampicillin) wird pro Ansatz hinzugefügt.
Nun erfolgte eine Inkubation im Schüttel-Inkubator bei 37°C für 1 Stunde. Während
dieser Zeit exprimieren die Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, das
Enzym ß-Lactamase, welches für die Selektion auf Ampicillin-haltigen Agarplatten
benötigt wird.
Anschließend werden je 100µl der Bakteriensuspension auf Agarplatten (100µg/ml
Ampicillin) ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Ergebnis der Transformation
Bei beiden Plasmid-Ansätzen sollten viele kleine Kolonien zu beobachten sein. Der
Ansatz mit Wasser darf keine Kolonien enthalten. Bei der Positiv-Kontrolle müssen
Kolonien zu finden sein.
3.39 Minipräparation von Plasmid-DNA aus einer
Bakterienkultur
Die Minipräparation dient zur Überprüfung der Transformation. Mehrere Kolonien
werden untersucht. Ist das gewünschte Plasmid in einer der Kolonien enthalten, so
wird diese anschließend für eine Maxipräparation verwendet.
Die Präparation wurde mit dem Quiapräp Spin Minipräp Kit analog dem
Herstellerprotokoll durchgeführt.
In 2 sterilen Reagenzgläsern wird je 5ml LB-Medium (100µg/ml Ampicillin) gegeben.
Pro Reagenzglas wird eine Kolonie von der Agarplatte zugesetzt. Die Kultivierung
der Bakterien erfolgt über Nacht im Schüttel-Inkubator bei 37°C.
Zur Extraktion der Plasmide aus der Bakterienkultur siehe Herstellerprotokoll.
75
3.40 Restriktionsverdau der Minipräps
Bei der Transformation von FlagASK1 sollte abgesichert werden, dass es sich bei
der extrahierten Plasmid-DNA tatsächlich um FlagASK1 handelt. Deshalb wurde von
den beiden Minipräps ein Restriktionsverdau mit EcoR1 durchgeführt. Laut Karte von
FlagASK1 (s.o.) soll hierbei ein Bruchstück von ca. 3000bp herausschneidbar sein.
Ansatz für den Restriktionsverdau:
Minipräp
Puffer H (10x)
EcoR1
Wasser
10µl
2,5µl
1µl
12,5µl
(=10U)
(ad 25,0)
Die Substanzen werden in Eppendorfröhrchen gemischt und 1 Stunde bei 37°C
inkubiert (Thermoblock). Anschließend erfolgte Deaktivierung des Enzyms bei 60°C
für 20 Minuten.
3.41 Agarose-Gel-Elektrophorese
Ein 0,8% Agarose-Gel wurde hergestellt in dem 0,4g Agarose in 50ml TBE-Puffer
erhitzt wurden. Nach Abkühlen auf ca. 50°C gab man 5µg/ml Ethidiumbromid hinzu.
Das Gel wurde nun in die Kammer gegossen.
Zum Auftragen auf das Gel wurden 15µl des Restriktionsverdaus mit 3µl 6x
Probenpuffer gemischt. Als Marker diente ein 1kb Marker (Invitrogen).
Abb. 19: FlagASK1 Minipräp
Die Auswertung des Gels zeigt, dass der Restriktionsverdau funktioniert hat. Es ist
ein Fragment von ca. 3000bp zu sehen. Bei den Plasmiden handelt es sich also mit
Sicherheit um FlagASK1. Dieses soll nun in größerem Maßstab aus den Bakterien
isoliert werden (Maxi-Präp).
76
3.43 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA
Für die Maxi-Präparation von Plasmiden wurde das Quiagen® Plasmid Purification
Endo-Free™ Plasmid Maxi Kit verwendet. Es gewährleistet eine einfache und
zugleich endotoxinfreie Isolierung.
In einem großen Erlenmeyerkolben werden 100ml LB-Medium (100mg/ml Ampicillin)
gegeben. Dann gibt man 100µl der Minipräp-Kultur hinzu und inkubiert über Nacht
bei 37°C im Schüttelinkubator.
Am nächsten Tag wird von der Kultur 2x 1ml abgenommen und davon eine GlycerinKultur angelegt (800µl Bakterienkultur + 200µl steriles Glycerin). Der Rest der Kultur
wird in zwei 50ml Falcons überführt und 45 Minuten bei 2000rpm zentrifugiert. Aus
den Pellets wird das Maxi-Präp analog dem Firmenprotokoll durchgeführt (siehe
Quiagen-Protokoll).
Im letzen Schritt der Präparation, nach Ausfällen der DNA mit Isopropanol, wurde die
gesamte Flüssigkeitsmenge auf sterile Eppendorfröhrchen verteilt, um keine erneute
Kontamination mit Bakterien zu bekommen. Diese wurden dann 30 Minuten bei 4°C
und 13000rpm zentrifugiert. Beim Waschen mit 70%-Ethanol wurden die Pellets in
einem Röhrchen gesammelt und nochmals 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend
ließ man sie an der Luft trocknen, bevor sie schließlich in 50µl Wasser aufgenommen
wurden.
Hierfür wurde kein TE-Puffer verwendet, da die Proben evtl. sequenziert werden
sollten. Für eine Sequenzierung müssen sie in Wasser gelöst sein.
Gehaltsbestimmung der Maxi-Präps
Um den DNA-Gehalt zu ermitteln werden 2µl Maxi-Präp zu 198µl Wasser gegeben.
Die optische Dichte wird bei 260nm gegen Wasser bestimmt.
Entsprechend der folgenden Formel für doppelsträngige DNA konnte die
Konzentration ermittelt werden:
OD260 ∗ 501) ∗ 100 2)
= ......μg / μl Plasmid-DNA
1000
1)
2)
Multiplikationsfaktor: 50 für doppelstrang DNA
Verdünnungsfaktor für die Messung: 1:100
Die Lagerung der Maxi-Präps erfolgt bei -20°C.
Überprüfung der Maxi-Präps
Um zu kontrollieren, ob die Maxi-Präparation erfolgreich war, kann ebenso wie bei
den Mini-Präps ein Restriktionsverdau bzw. eine Agarose-Gelelektrophorese
erfolgen (s.o.)
77
FlagASK1
Maxipräp
V NV
Minipräp
V NV
V = verdaut mit EcoR1
NV = nicht-verdaut
Abb. 20: FlagASK1 Mini-und Maxipräp
Sequenzierung
Zur zusätzlichen Kontrolle wurde das FlagASK1 Maxipräp zur Sequenzierung (Firma
Genterprise, Mainz) geschickt. Eine „short run“ Ansequenzierung von beiden Seiten
stimmte mit der ASK1 Sequenz überein.
3.44 Herstellung des Kontrollvektors pcDNA3
Als Kontrolle für die Transfektion von FlagASK1 sollte ein leerer Vektor dienen.
Dieser wurde mittels Restriktionsverdau mit Xho I aus FlagASK1 hergestellt.
Xho I schneidet ASK1 bei der Base 217 und am Ende. Der Flag-Terminus sowie der
Anfang von ASK1 bleiben also im Vektor enthalten. Die katalytische Domäne von
ASK1 wird allerdings herausgeschnitten.
Abb. 21: Vektor-Karte von pcDNA3 (Invitrogen)
78
Abb. 22: Restriktionskarte von ASK1 (Quelle: NEBcutter)
Ansatz für den Restriktionsverdau
FlagASK1-Maxipräp
Puffer H
Xho I
Wasser
0,5µl (1,4µg)
2,5µl
1µl (=10U)
21µl (ad 25,0)
Ö 1h bei 37°C inkubieren
(Thermoblock)
Ö 20 Minuten bei 65°C inaktivieren
Agarose-Gelelektrophorese
In einem 0,8% Agarose-Gel werden die herausgeschnittenen Fragmente von dem
offenen Vektor getrennt. Dieser wird herausgeschnitten.
FlagASK1
NV
V
Xho-I
pcDNA3
herausgeschnitten
Abb. 23: Trennung des offenen Vektors vom FlagASK-Insert
79
Extraktion von DNA aus Agarosegel-Banden
Die Extraktion der DNA-Banden aus dem Agarosegel fand mit dem QIAEX-Kit statt.
Die ausgeschnittenen Banden werden in ein Eppendorfröhrchen gegeben und
gewogen. Hinzugefügt wird das 3-fache Volumen an QX1-Puffer und das 2-fache
Volumen an Wasser. Nach Zusatz von 15µl QIAEX-II wird 10 Minuten bei 50°C
inkubiert und alle 2 Minuten gevortext, um das QIAEX-II in Suspension zu halten. Die
Pellets werden abzentrifugiert, gewaschen und kurz an der Luft getrocknet. Nach
Zugabe von 20µl Wasser wird 5 Minuten bei 50°C inkubiert. Hierbei löst sich die DNA
von der Matrix ab. Nach Abzentrifugieren wird der Überstand in ein neues
Eppendorfröhrchen gegeben. Im Überstand enthalten ist jetzt der offene Vektor.
Die Bestimmung der DNA-Konzentration ergibt 0,08µg/µl.
Ligation
Bei der Ligation wird der offene pcDNA3-Vektor geschlossen.
Gelextrakt
5x Ligase-puffer
T4-DNA-Ligase
Wasser
3µl (~240ng)
4µl
2µl
11µl (ad 20,0)
Ö Inkubation über Nacht in
Eiswasser (4-8°C)
Transformation
Die Transformation wird entsprechend der obigen Beschreibung durchgeführt mit 2µl
Ligationsansatz. Am nächsten Tag waren 2 Kolonien zu sehen. Positiv-und NegativKontrolle wurden gleichzeitig durchgeführt und waren in Ordnung.
Minipräparation und Agarosegelelektrophorese von pcDNA3
Von beiden Kolonien wurde je eine Minipräparation durchgeführt, die anschließend
mittels Agarose-gelelektorphorese untersucht wurden. Zur weiteren Kontrolle wurde
nochmals ein Restriktionsverdau der Minipräps mit Xho I durchgeführt. Hierbei durfte
nun kein Fragment mehr rausschneidbar sein.
Minipräps
pcDNA3
1
V
1 2
NV V
Maxipräp
FlagASK1
2
NV V
M
NV 1kb
-12kb
-5kb
-3kb
V = verdaut mit Xho I
NV = nicht-verdaut
Abb. 24: Minipräp pcDNA3
80
Maxi-Präp
Anschließend wurde eine Maxi-Präparation von pcDNA3 durchgeführt.
Der Verdau mit Xho I zeigt, dass es nicht mehr möglich ist, aus pcDNA3 ein
Fragment herauszuschneiden. Die Herstellung des Kontrollvektors ist somit
gelungen.
Abb. 25: Maxipräp pcDNA3
4. Ergebnisse
81
4. Ergebnisse
4.1 Enzymatisch Verändertes LDL aktiviert MAP- Kinasen
4.1.1 Erste Versuche zur ASK1-Aktivierung
4.1.1.1 Endogenes ASK1
Zu Beginn der Arbeit sollte zunächst der Effekt von Fettsäuren auf die MAPKKK
ASK1 untersucht werden. Es ist bekannt, dass ASK1 bereits nach 5 Minuten durch
H2O2 aktiviert wird und dieser Zustand je nach Stärke des Stimulus ca. 15-30 Minuten
anhält, bevor eine Deaktivierung durch den ASK1-Inhibitor pp5 erfolgt (Morita et al.,
2001).
In den ersten Versuchen wurden also Endothelzellen für 10 Minuten mit Linolsäure
(wasserlöslicher Komplex von LA in Methyl-ß-Cyclodextrin) behandelt. H2O2 diente
als Positiv-Kontrolle, Methyl-ß-Cyclodextrin als Negativ-Kontrolle für die Behandlung
mit Linolsäure. Mittels Western Blot sollte eine Aktivierung von ASK1 anhand einer
Bande bei etwas höherem Molekulargewicht (Phospho-ASK1) zu sehen sein, denn
zum Zeitpunkt dieser Versuche war noch kein Antikörper gegen Phospho-ASK1
(Thr845) käuflich zu erwerben.
Es wurden mehrere Antikörper gegen ASK1 getestet (anti-ASK1-N19 goat; antiASK1-CTerminal rabbit; anti-ASK1-F9 mouse; Santa Cruz Biotechnology) und bei
keinem waren überhaupt ASK1-Banden zu sehen. Anscheinend war endogenes
ASK1 also in so geringen Mengen vorhanden, dass man es nicht direkt im Western
Blot oder mittels Immunfluoreszenz detektieren konnte.
4.1.1.2 Transfektion von FlagASK1
Um also eine Aktivierung von ASK1 durch E-LDL bzw. Fettsäuren zeigen zu können
musste ASK1 in Zellen überexprimiert werden. Von der Arbeitsgruppe Ichijo
bekamen wir einen Vektor, der FlagASK1 in pcDNA3.0 enthielt. Das Flag-tag
befindet sich am N-Terminus von ASK1 und besteht aus 7 Aminosäuren. Es stellt
eine Markierung dar, die die zusätzliche Detektion des abgelesenen Proteins mit
einem anti-Flag Antikörper erlaubt.
4. Ergebnisse
82
Um FlagASK1 zu vervielfältigen wurden kompetente Bakterien (DH5α E-coli) mit dem
Vektor transformiert. Aus Über-Nacht-Kulturen dieser Zellen extrahierte man die
Plasmide (Mini-/Maxi-Präparation). Eine Identitätskontrolle für FlagASK1 stellte der
Verdau mit EcoR1 dar. Hierbei ließ sich ein ca. 3kb-Fragment aus dem Vektor
herausschneiden (siehe Material und Methoden). Zusätzlich wurde das Maxi-Präp
zur Sequenzierung (Firma Genterprise) geschickt. Eine „short-run“ Ansequenzierung
des Vektors stimmte mit der ASK1-Sequenz überein.
4.1.1.3 Nachweis der Transfektion mittels Immunfluoreszenz
FlagASK1 wurde zunächst in Endothelzellen (Eahy926) überexprimiert. 48h nach
Transfektion wurde die Effizienz mittels Immunfluoreszenz überprüft. Hierbei zeigte
sich, dass diese bei Endothelzellen sehr gering war. Nur ca. 1% der Zellen waren
transfiziert (Abb. 26A).
Auf gleiche Art transfizierte 293-Zellen zeigten bessere Ergebnisse. Die Effizienz
betrug hier 5-10% (Abb. 26B).
A
B
Abb. 26: Transfektion von Eahy926-Zellen (A) bzw. 293-Zellen (B) mit 2µg/ml FlagASK1;
Immunfluoreszenz 48h nach Transfektion mit anti-Flag-mouse/anti-mouse-Cy3; linke Bilder:
DAPI-Färbung der Zellkerne + Cy3-Filter; rechte Bilder: nur Cy3-Filter.
83
4. Ergebnisse
4.1.1.4 Nachweis der Transfektion mittels Western-Blot
Als weitere Überprüfung der Transfektion wurde von Endothel- und 293-Zellen ein
Western Blot (WB) durchgeführt. Bei den 293-Zellen erkennt man eine deutliche
FlagASK1- Bande (155kD), die bei den Endothelzellen fehlt. Auf Grund der besseren
Transfektionsrate wurden also für die weiteren Transfektions-Experimente 293-Zellen
verwendet.
Eahy926
FlagASK1
293
-245
-123
ASK1 (155kD)
-77
Abb. 27: Eahy926- bzw. 293-Zellen wurden mit 2µg FlagASK1 transfiziert. WB 48h nach
Transfektion: anti-Flag-mouse/anti-mouse-HRP
4.1.1.5 Transfektion von FlagASK1 in 293-Zellen und Aktivierung mit H2O2
Nun sollte in transfizierten 293-Zellen eine ASK1 Aktivierung gezeigt werden.
Zunächst wurde nur H2O2 als Positiv-Kontrolle eingesetzt, die Behandlungsdauer
betrug 10 Minuten. Im Western-Blot ist bei H2O2–Behandlung im Vergleich zu
unbehandelten Zellen eine etwas höhere und auch stärkere ASK1-Bande zu sehen
sowie eine zusätzliche schwache Bande darunter. Nicht-transfizierte Zellen zeigen
keine Banden. Diese höhere Bande auf eine ASK1-Phosphorylierung zurückzuführen
ist allerdings nicht eindeutig möglich, da dieser Befund sich nicht reproduzierbar
darstellen ließ.
FlagASK1
_
+
H2O2 5mM
_
+
-245
ASK1
-123
Abb. 28: +/- FlagASK1-transfizierte 293-Zellen wurden 48h nach Transfektion für 10Min mit H2O2
5mM behandelt; WB: anti-Flag-mouse/anti-mouse-HRP
84
4. Ergebnisse
4.1.1.6 Transfektion von 293-bzw. HeLa-Zellen mit FlagASK1und Behandlung
mit Fettsäuren und E-LDL
In transfizierten 293- bzw. HeLa-Zellen sollte nun der Effekt von Fettsäuren und ELDL auf ASK1 untersucht werden. HeLa-Zellen wiesen eine vergleichbare
Transfektionseffizienz wie 293-Zellen auf und besaßen außerdem den Vorteil, dass
sie sich bei der Transfektion nicht so leicht von den Zellkulturplatten ablösten wie
293-Zellen.
Die Auswertung der Western Blots zeigt, dass nach Behandlung mit E-LDL teilweise
stärkere Banden auftraten (s. Abb. 29A), die sich aber in Wiederholungsversuchen
nicht bestätigen ließen. Auch in der Laufhöhe sah man keine Unterschiede, was auf
eine Phosphorylierung von ASK1 hätte deuten können.
A
B
FlagASK1
245-
LA
control
LDL
AA
E-LDL
LA Cy
H2O2
LDL
AA
E-LDL
LDL
AA
15 Min
5 Min
E-LDL
H2O2
control
FlagASK1
123-
ASK1
77-
Abb. 29: mit FlagASK1 transfizierte HeLa-Zellen (A) bzw. 293-Zellen (B); Behandlung mit H2O2
5mM; FA 10µg/ml; E-LDL bzw. LDL 100µg/ml; WB: anti-ASK1-F9-mouse/anti-mouse-HRP
Aus diesen Western-Blots wurde ersichtlich, dass es auf diese Art nicht möglich war,
eine ASK1-Aktivierung zu zeigen. Weder eine stärkere Bande noch eine höhere
Bande konnten eindeutig einer ASK1-Phosphorylierung zugeordnet werden.
Inflolge dessen sollte nun die Rolle von pp5 im Zusammenhang mit der ASK1 –
Aktivierung näher untersucht werden.
85
4. Ergebnisse
4.1.1.7 Nachweis von pp5 in Endothelzellen
Ein von der Firma B&D durchgeführtes Western Blot Screening ergab eine deutliche
Zunahme der pp5-Menge in Monozyten nach 24h Behandlung mit E-LDL. In
Endothelzellen sollte dieser Befund nun wiederholt gezeigt werden. Hierbei konnte
allerdings
keine
verstärkte
pp5-Bande
nach
FA-
bzw.
E-LDL-Behandlung
nachgewiesen werden.
A
control
FlagASK1
Cy
LA
5´
10´
77-
LA
10´
30´
20´
pp5 (58kD)
control
B
LDL
E-LDL
12,5
25
50
75 12,5
25
60-
50
75
µg/ml
pp5 (58kD)
50-
Abb. 30: Endothelzellen wurden (A) mit LA 20µM bzw. Cy für 5 – 30 Min behandelt; (B) mit 12,575µg/ml E-LDL bzw. LDL für 24h; WB: anti-pp5-mouse/anti-mouse-HRP
4.1.1.8 Hemmung von pp5 mit Fumonisin B1
Da durch Behandlung mit E-LDL bzw. FA alleine keine deutlich verstärkte oder
höhere ASK1-Bande reproduzierbar darzustellen war, sollte nun versucht werden,
durch Hemmung von pp5 einen besseren Erfolg zu erzielen. Wie oben beschrieben
bindet pp5 an aktiviertes ASK1 und funktioniert somit als negativ-Feedback-Inhibitor.
Eine ASK1-Phosphorylierung durch E-LDL bzw. FA könnte also demzufolge im
Western Blot nur sehr kurz bzw. gar nicht zu sehen sein, da pp5 schon nach 5-15
Minuten an ASK1 binden und eine Dephosphorylierung auslösen kann.
86
4. Ergebnisse
Als pp5-Inhibitor fand Fumonisin B1 (FB1) Verwendung. Dieses Pilzgift weist
strukturelle Ähnlichkeiten zu Sphingolipiden auf. Die Hemmung von pp5 kommt
wahrscheinlich durch eine Interaktion von FB1 mit den TPR-Domänen von pp5
zustande (Fukuda et al., 1996). Dadurch wird dessen Phosphatase-Aktivität
vermindert. ASK1 würde also nicht mehr durch pp5 dephosphoryliert werden und
sollte somit länger aktiv sein.
Mit FlagASK1 transfizierte 293-Zellen wurden zunächst für 20 Minuten mit FB1
(200µM) vorbehandelt bevor dann die Inkubation mit H2O2 (5mM, 5Min) erfolgte.
A
B
+
FB1/H2O2
FlagASK1
245-
_
control
FB1/H2O2
H2O2
control
FlagASK1
12312377-
ASK1
7742-
pp5
Abb. 31: Mit FlagASK1 transfizierte 293-Zellen wurden 48h nach Transfektion für 20 Minuten
mit FB1 (200µM) vorbehandelt, dann folgte Behandlung mit H2O2 5mM; (A) WB: anti-Flagmouse; (B) WB: anti-pp5-mouse
Trotz Hemmung von pp5 ist keine verstärkte ASK1-Bande nach Aktivierung mit H2O2
zu sehen, sondern sogar ein schwächeres Signal (s. Abb. 31A, rechte Spur).
Vorbehandlung von 293-Zellen mit FB1 erzeugt eine weitere Bande im Western-Blot
mit pp5 (s. Abb. 31B).
4.1.1.9 Detektion von P-ASK1 mittels anti-Phospho-Threonin Antikörper
Die unter Abb. 31 beschriebenen Proben wurden erneut auf ein Gel aufgetragen und
der Western Blot mit einem anti-Phospho-Threonin Antikörper (Biomol) entwickelt.
Es ist keine Phospho-Threonin Bande bei 155kD zu sehen, die auf phosphoryliertes
ASK1 hätte deuten können. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass der Antikörper
die spezifische Phosphorylierungsstelle von ASK1 nicht erkennt.
87
4. Ergebnisse
control
H2O2
control
H2O2
245-
FB1/ H2O2
FlagASK1
12377-
Abb. 32: mit FlagASK1 transfizierte 293-Zellen; WB: anti-Phospho-Threonin-mouse/anti-mouseHRP
4.1.1.10 Immunpräzipitation von FlagASK1 aus transfizierten 293-Zellen mit
anti-Flag Antikörper nach Behandlung mit H2O2 und Linolsäure
Da der Western Blot in Abb. 32 eine hohe Hintergrund-Färbung zeigt, sollte
FlagASK1 nun durch Präzipitation aus dem Zelllysat extrahiert werden. Dies
ermöglicht, größere Mengen des präzipitierten Proteins im Western Blot aufzutragen
und gleichzeitig einen geringeren Hintergrund zu erhalten. Weiterhin bietet sich
hierbei die Möglichkeit, copräzipitierte Proteine wie z.B. pp5 zu detektieren.
293-Zellen wurden in Zellkulturflaschen mit FlagASK1 transfiziert um genügend
Zelllysat für die Präzipitation zu erhalten. Die Behandlung der Zellen erfolgte mit LA
(10µg/ml). H2O2 und Methyl-ß-Cyclodextrin dienten als Positiv- bzw. NegativKontrollen. Ein weiterer Kontroll-Ansatz wurde ohne 1. Antikörper durchgeführt. Die
Präzipitation erfolgte mit einer Protein A/G Plus Agarose Matrix.
In Abb. 33A zeigt der obere Blot, dass aus jeder Probe gleich viel FlagASK1
präzipitiert wurde und dass auch zuvor relativ gleiche Mengen FlagASK1 in den
Zelllysaten vorhanden war. Die Präzipitation ohne 1. Antikörper ergab wie gewünscht
keine ASK1-Bande.
Nach erneutem Auftragen der Proben auf ein zweites Gel und Inkubation mit dem
Phospho-Threonin-Antikörper
konnten
allerdings
keine
Phospho-spezifischen
Banden bei 155kD, die auf P-ASK1 deuten könnten, nachgewiesen werden. Dass
88
4. Ergebnisse
der Antikörper im Prinzip funktioniert, sieht man an der Phospho-Control Bande einer
Probe der Firma Biomol (Abb. 33A, unterer Blot).
Der pp5-Western-Blot der gleichen Immunpräzipitate zeigte, dass tatsächlich bei
Behandlung mit H2O2 und LA mehr pp5 copräzipitiert wurde (Abb. 33B). D.h. bei
diesen beiden Proben könnte ASK1 aktiviert worden sein und in Folge dessen kam
es zur vermehrter Bindung von pp5 an ASK1.
Cy
LA
_
H2O2
H2O2
WB: anti-ASK1-F9
Lysate
-1.Ak
IP: anti-Flag
A
Cy LA
_
ASK1
123245WB: anti-PThr
12377-
P-control
(Biomol)
_
LA
Cy
Lysate
-1.Ak
WB: anti-pp5
H2O2
IP: anti-Flag
_
H2O2
B
LA
Cy
77pp5
42-
pp5
Abb. 33: IP anti-Flag aus transfizierten 293-Zellen nach Behandlung mit Linolsäure (10µg/ml),
H2O2 5mM und Cy für 15 Minuten. (A) oberer Blot: links präzipitiertes FlagASK1, rechts
FlagASK1-Mengen in den Zelllysaten vor der Präzipitation; unterer Blot: anti-Phospho-Threonin
Ak; (B) links: Co-präzipitiertes pp5; rechts: pp5-Mengen in den Zelllysaten vor der
Präzipitation.
89
4. Ergebnisse
4.1.2 Aktivierung von MAP-Kinasen durch E-LDL und FFA
4.1.2.1 E-LDL aktiviert p38-MAP-Kinase und cJun-N-Terminal Kinase (JNK)
Da es sich als schwierig herausstellte, eine ASK1-Aktivierung mit den verfügbaren
Methoden zu zeigen, wurden stromabwärts von ASK1 liegende MAP-Kinasen als
Untersuchungsobjekt ausgewählt. Es sollte festgestellt werden, ob E-LDL bzw. freie
Fettsäuren (FFA) p38-MAP Kinase bzw. c-Jun-N-Terminal Kinase (JNK) aktivieren
können.
P38-MAP-Kinase und JNK (oder auch SAPK = stress activated protein kinase) sind
sogenannte „Stress induzierte Kinasen“, die durch Zytokine und zellulären Stress wie
osmotischer
Schock,
Hitzeschock,
UV-Bestrahlung,
alkylierende Agenzien aktiviert werden.
oxidativen
Stress
oder
Die Aktivierung von JNK wird von den
stromaufwärts liegenden Kinasen MKK4 und 7 reguliert, wobei MKK4 auch p38
phosphorylieren kann. P38 wird von MKK3 und MKK6 aktiviert (s. Abb.2) (Whitmarsh
and Davis, 1996). Diese MKKs können alle durch ASK1 aktiviert werden.
Um p38 bzw. JNK in den aktiven Zustand zu überführen muss eine zweifache
Phosphorylierung an einer Tripeptidsequenz Thr-X-Tyr im aktiven Zentrum der
Kinasen erfolgen. JNK wird durch drei Gene codiert. Die JNK1 und JNK2-Gene
werden allgegenwärtig exprimiert, JNK3 nur in bestimmten Gebieten wie z.B. im
Gehirn. Durch alternatives Splicing kommt es zur Bildung von zehn verschiedenen
JNK-Isoformen (Gupta et al., 1996). Es werden Proteine mit und ohne C-terminaler
Verlängerung exprimiert (46kD und 54kD Isoformen), die Funktion dieser SpliceVarianten ist jedoch unklar.
Primäre Aorten-Endothelzellen (HAoEC, Abb. 34A) bzw. Eahy926-Zellen (Abb. 34 B,
C) wurden mit 100µg/ml E-LDL, LDL und oxLDL behandelt. Als Positiv-Kontrolle
wurde Sorbitol (osmotischer Schock) verwendet.
Erstaunlicherweise trat schon nach 10Min Behandlung eine starke p38-Aktivierung
durch E-LDL ein (Abb. 34 A, B). Bei unbehandelten Zellen (control) war keine Bande
zu erkennen. Behandlung mit LDL und oxLDL führte jeweils zu einer gleich
schwachen p38-Aktivierung. Nach E-LDL Behandlung wurde eine 2,5-fach stärkere
p38-Phosphorylierung im Vergleich zu LDL erreicht (Mittelwert der Quantifizierung
von 3 Western Blots).
90
4. Ergebnisse
Eine Aktivierung von JNK durch E-LDL zeigte sich erst nach 30Min, also später als
die p38-Aktivierung (Abb. 34 C). Behandlung mit LDL oder oxLDL führte nicht zu
einer JNK-Aktivierung.
Die Kinetik der p38- bzw. JNK- Phosphorylierung durch E-LDL zeigt, dass das
Maximum jeweils nach 2h erreicht ist. Im Gegensatz zur lang anhaltenden p38Phosphorylierung ist die JNK-Aktivierung nur sehr kurz. Nach 4 und 6h sind hier nur
A
E-LDL
ox-LDL
LDL
control
Sorbitol
noch sehr schwache Banden zu erkennen (Abb. 34 C).
605040-
P-p38 (43kD)
30-
total p38
40-
B
605040-
E-LDL
ox-LDL
LDL
30´
E-LDL
ox-LDL
LDL
control
Sorbitol
10´
E-LDL
2h 4h 6h 24h
P-p38
total p38
C
p54
P-JNK
p46
p54
total JNK
p46
Abb. 34: Behandlung von HAoEC (A) bzw. Eahy926-Zellen (B,C) für 10´ bis 24h mit 100µg/ml
der Lipoproteine; positiv-Kontrolle: Sorbitol 0,5M, 10´;
(A,B): oberer Blot zeigt p38-Phosphorylierung; unterer Blot: gesamtes p38; (C): oberer Blot
zeigt JNK-Phosphorylierung, unterer Blot gesamte JNK.
91
4. Ergebnisse
Die schnelle p38-Aktivierung entsprach zunächst nicht unseren Erwartungen, denn
bisher gingen wir davon aus, dass E-LDL als Partikel von den Zellen aufgenommen
wird. Da dies ein langsamer Vorgang ist, rechneten wir erst zu einem späteren
Zeitpunkt mit der Aktivierung der MAP-Kinasen. Im Folgenden sollte nun der Grund
für diese frühzeitige p38-Phosphorylierung identifiziert werden.
Da die Behandlung von Eahy926-zellen mit E-LDL zu gleichen Ergebnissen führte
wie die der primären Endothelzellen, wurden für die folgenden Experimente nur noch
Eahy926-Zellen verwendet, da diese leichter zu handhaben sind.
4.1.2.2 Die p38-Aktivierung durch E-LDL ist fettsäure-abhängig
Da E-LDL im Vergleich zu LDL einen hohen Anteil an freien Fettsäuren besitzt, lag
es nahe zu überprüfen, ob diese für die schnelle p38-Phosphorylierung zuständig
sind. Durch Flotieren von E-LDL oder LDL nach Inkubation mit 4 bzw. 10% Albumin
kann man die Fettsäuren aus den Partikeln entfernen. Die resultierenden
Lipoprotein-Präparationen werden mit E-LDL(d) oder LDL(d) bezeichnet. Der Zusatz
von 4% Albumin (E-LDL(d4)) reduziert den Fettsäuregehalt von E-LDL um 50%, die
Zugabe von 10% Abumin (E-LDL(d10)) um 90%. Auch in LDL sind geringe Mengen
an freien Fettsäuren vorhanden, diese werden ebenfalls bei der Herstellung von
LDL(d10) entfernt (siehe Material und Methoden).
E-LDL
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
Fettsäure-Gehalt
Die nach Behandlung mit E-LDL auftretende starke p38-Phosphorylierung konnte
durch E-LDL mit reduziertem Fettsäuregehalt verringert werden. Inkubation von
Endothelzellen mit E-LDL(d10) resultierte in einer 40% schwächeren p38-Aktivierung
im Vergleich zu E-LDL. Auf gleiche Art hergestelltes LDL(d10) führte ebenfalls zu
einer geringeren p38-Phosphorylierung als natives LDL. Hier reduzierte sich das Pp38 Signal um 70%. Dies spricht dafür, dass sich die schwache Aktivierung von p38
92
4. Ergebnisse
durch LDL ebenfalls auf die in LDL vorhandenen freien Fettsäuren zurückführen
lässt. Zusätzlich konnte durch Behandlung der Endothelzellen mit Linolsäure (als
wasserlöslicher Komplex in Methyl-ß-Cyclodextrin) alleine eine p38-Aktivierung
gezeigt werden. Als Kontrolle für die Behandlung mit Linolsäure diente der Carrier
E-LDL
E-LDL (d10)
LDL
LDL (d10)
control
Sorbitol
Methyl-ß-Cyclodextrin.
LA
Cy
605040-
P-p38
total p38
Abb. 35: Endothelzellen wurden für 10 Minuten behandelt mit 100µg/ml der entsprechenden
Lipoproteine bzw. 100µM Linolsäure. Positiv-Kontrolle: Sorbitol 0,5M; negativ-Kontrolle:
Methyl-ß-Cyclodextrin. Der obere Blot zeigt p38-Phosphorylierung (anti-Phospho-p38rabbit/anti-rabbit-HRP); der untere Blot zeigt gesamtes p38.
Nun sollten verschiedene im E-LDL enthaltene Fettsäuren auf ihre Fähigkeit, p38 zu
aktivieren, untersucht werden. Neben Linolsäure wurden Arachidonsäure und
Ölsäure getestet. Bei allen FFA ergab sich bereits nach 10Min Behandlung eine
schnelle p38-Phosphorylierung, die nach 1h wieder abklang (s. Abb. 36). Der Grund
für diese im Vergleich zu E-LDL (s. Abb. 34 B) nur kurzzeitige p38-Aktivierung könnte
auf der geringeren Wirkung der Fettsäure/Methyl-ß-Cyclodextrin Komplexe beruhen.
Dass Fettsäuren in ihrer freien Form auch tatsächlich längerfristige Auswirkungen auf
Endothelzellen haben, wird im Folgenden noch gezeigt.
93
4. Ergebnisse
LA
10´
30´ 1h
Cy
10´
OA
AA
30´ 10´ 30´ 1h 10´ 30´ 1h
605040-
P-p38
30-
total p38
Abb. 36: Endothelzellen wurden für 10-60 Minuten behandelt mit 100µM Linolsäure (LA),
Ölsäure (OA) und Arachidonsäure (AA). Als negativ-Kontrolle diente Methyl-ß-cyclodextrin
(Cy). Der obere Blot zeigt die p38-MAP Kinase Phosphorylierung, der untere Blot gesamtes
p38.
Um einen weiteren Beweis dafür zu liefern, dass die Fähigkeit von E-LDL, p38 zu
aktivieren, tatsächlich auf dem Gehalt an freien Fettsäuren beruht, wurden
Rekonstitutions-Experimente durchgeführt. Zu flotiertem E-LDL (d4) und E-LDL d(10)
gab man die entsprechende Menge Linolsäure hinzu, so dass wieder die
ursprüngliche Linolsäure-Konzentration des E-LDL erreicht wurde. Diese Proben
wurden mit R E-LDL (d4 bzw. d10) bezeichnet.
Nach Behandlung von Endothelzellen mit den jeweiligen Lipoproteinen zeigte sich,
dass die Rekonstitution von flotiertem E-LDL sogar zu einer stärkeren p38Phosphorylierung als E-LDL führte.
94
605040-
LDL (d10)
LDL
E-LDL (d10)
E-LDL (d4)
R E-LDL (d10)
R E-LDL (d4)
E-LDL
control
Sorbitol
4. Ergebnisse
P-p38
30-
total p38
Abb. 37: Eahy926-Zellen wurden für 10Min mit 100µg/ml der entsprechenden Lipoproteine
behandelt. Oberer Blot: p38-Phosphorylierung; Unterer Blot: gesamtes p38.
Aus diesen Experimenten wird deutlich, dass nicht die Aufnahme von E-LDL als
Partikel für die schnelle Aktivierung der MAP-Kinasen verantwortlich ist, sondern
dass wahrscheinlich die im E-LDL enthaltenen freien Fettsäuren innerhalb von 10
Minuten durch die Zellmembran „springen“ und Reaktionen in der Zelle auslösen.
95
4. Ergebnisse
4.1.3 E-LDL und FFA aktivieren ASK1
Mittlerweile stellte uns die Arbeitsgruppe Ichijo einen anti-Phospho-ASK1 (Thr845)
Antikörper zur Verfügung, mit dem es nun möglich war, direkt die ASK1
Phosphorylierung zu zeigen. Wiederum musste in transfizierten Zellen gearbeitet
werden, weil auch dieser Antikörper die geringen Mengen an endogenem P-ASK1
nicht erkennt. Da die 293-Zellen den Nachteil hatten, sich sehr schnell von den
Zellkulturplatten abzulösen, was zu ungleichen Konzentrationen in den Proben
führte, wurden für diese Experimente transfizierte Cos7 Zellen verwendet. Hier
konnte ebenfalls eine gute Transfektionseffizienz erreicht werden.
A
B
Abb. 38: Überprüfung der Transfektionsrate von Cos7-Zellen: Cos7-Zellen wurden mit 1µg/ml
HA-pp5 transfiziert. Nach 48h erfolgte Immunfluoreszenz mit anti-HA-rat/anti-rat-FITC
Antikörpern; (A) DAPI + FITC-Färbung; (B) nur FITC-Färbung
4.1.3.1 E-LDL aktiviert ASK1
FlagASK1 wurde in Cos7-Zellen transfiziert und diese für 10 Minuten mit den
verschiedenen Lipoproteinen behandelt. Als Positiv-Kontrolle diente H2O2, welches
zu einer starken ASK1-Aktivierung führt. Auch durch E-LDL ist eine deutliche ASK1
Phosphorylierung zu sehen. Diese ist fast 9mal stärker im Vergleich zu LDL. Mit
abnehmendem Gehalt an Fettsäuren im LDL bzw. E-LDL nimmt auch die Stärke der
ASK1-Phosphorylierung ab. Durch E-LDL(d10) reduziert sich das Signal um ca. 50%
im Vergleich zu E-LDL. Auch durch LDL(d10) wird das ohnehin schon schwache
LDL-Signal weiter vermindert.
96
LDL (d10)
LDL
E-LDL (d10)
E-LDL
control
H2O2
4. Ergebnisse
P-ASK1
total ASK1
Abb. 39: Mit FlagASK1 transfizierte Cos7-Zellen wurden für 10 Minuten mit 100µg/ml der
entsprechenden Lipoproteine behandelt. Positiv-Kontrolle: H2O2 5mM. Oberer Blot: antiPhospho-ASK1-rabbit/anti-rabbit-HRP; Unterer Blot: gesamtes ASK1.
4.1.3.2 Freie Fettsäuren aktivieren ASK1
Mit FlagASK1 transfizierte Cos7-Zellen wurden mit den verschiedenen Fettsäuren
bzw. dem Carrier Methyl-ß-Cyclodextrin als Kontrolle behandelt. Im Western Blot ist
eine deutliche Aktivierung von ASK1 durch die Fettsäuren zu sehen. Die
Quantifizierung der P-ASK1-Banden zeigte eine 3,3fache Zunahme der ASK1Phosphorylierung durch LA und OA und eine 6fache Zunahme durch AA im
Sorbitol
Vergleich zur Kontrolle Methyl-ß-Cyclodextrin.
Cy
LA
AA
OA
Abb. 40: Cos7-Zellen wurden mit 1µg/ml FlagASK1 transfiziert und für 10 Min mit Fettsäuren
(100µM) bzw. Methyl-ß-Cyclodextrin (Cy) behandelt. Positiv-Kontrolle: Sorbitol 0,5M. WB: antiPhospho-ASK1-rabbit/anti-rabbit-HRP
4. Ergebnisse
97
4.1.4 Die Aktivierung von p38-MAP-Kinase durch E-LDL ist
abhängig von ASK1
Nun sollte die Frage geklärt werden, ob die p38-MAP-Kinase Aktivierung durch ELDL eine vorhergehende ASK1-Aktivierung benötigt. Um diese Abhängigkeit von
ASK1 zu zeigen, musste ASK1 ausgeschaltet werden. Daraufhin sollte es nicht mehr
möglich sein, p38 durch Behandlung mit E-LDL zu aktivieren.
4.1.4.1 siRNA vermittelte Genausschaltung
Die transiente Ausschaltung von ASK1 wurde mittels RNA-Interferenz (RNAi)
erreicht. Mit dieser relativ neuen Methode gelingt auf einfache Art und Weise eine
posttranskripitionale Gensuppression durch kurze, zur mRNA des Zielgens
komplementäre doppelsträngige RNA-Stücke (dsRNA). Die Prozesse, die dabei
intrazellulär ablaufen, sind zur Zeit noch nicht vollständig geklärt.
Entdeckt wurde die RNA-Interferenz in Pflanzen (Jorgensen 1990) und nachfolgend
auch in C. elegans (Fire et al., 1998), indem eine unerwartete Suppression von
Genen durch eingeschleuste homologe Gene auftrat. Dieses Phänomen wurde als
PTGS (post-transkriptional gene silencing) bezeichnet. In Insektenzellen identifizierte
man wenig später kurze RNA-Bruchstücke als Auslöser der Gensuppression (Yang
et al., 2000; Elbashir et al., 2001a). Daraufhin gelang dann die Übertragung des
Prozesses auf Säugetierzellen (Caplen et al., 2001; Elbashir et al., 2001b).
Die Zellen werden im ersten Schritt entweder mit kurzen doppelsträngigen RNAStücke, den sog. siRNAs (small interfering RNAs) transfiziert, oder die dsRNA wird
als längeres Molekül eingeschleust und anschließend von einem Dicer (RNAse IIIEnzyme) in kurze Fragmente prozessiert. Diese 19-21 bp-Fragmente sind
komplementär zur mRNA des Zielgens. In der Zelle lagern sie sich in den sog. „RNAinduced silencing complex“ (RISC) ein (Hammond et al., 2000). Dabei kommt es zur
Aktivierung des RISC, der dann wahrscheinlich nur noch einen RNA-Strang enthält.
Dieser Proteinkomplex lagert sich mit Hilfe der einsträngigen siRNA an die mRNA
des Zielgens an und spaltet diese.
Zur Ausschaltung von ASK1 wurden drei chemisch synthetisierte siRNA´s der Firma
Ambion verwendet. Diese bestehen jeweils aus 19bp und liegen bereits in
doppelsträngiger Form vor. Als Kontrolle dient eine unspezifische Negativ-Kontroll
98
4. Ergebnisse
siRNA, die gegen eine Nonsense Sequenz gerichtet ist. Die spezifischen
Oligonukleotide sind zu drei verschiedenen Bereichen der mRNA von ASK1
komplementär:
siRNA
#5 #1
949-967 1147-1165
#3
2153-2171
Abb. 41: Angriffspunkte der spezifischen siRNA´s an der mRNA von ASK1
Um die Funktion der siRNA´s zu überprüfen wurden sie einzeln und als Mix jeweils
zusammen mit FlagASK1 cotransfiziert in Cos7-Zellen. Die Negativ-Kontroll siRNA
wurde ebenfalls mit FlagASK1 cotransfiziert. Hierbei war keine Hemmung von ASK1
zu beobachten. siRNA #3 zeigte eine bessere Hemmung von ASK1 als siRNA #1
und #5. Am besten geeignet schien ein Mix der drei siRNA´s, hier war die ASK1Bande am schwächsten exprimiert.
-
#1
#3
FlagASK1
50ng
#5
Neg.C.
#3
Mix
#1
Mix
-
Neg.C.
siRNA`s:
Neg.C.
FlagASK1 100ng
FlagASK1 400ng
200140-
ASK1
100-
Abb. 42: Hemmung von ASK1 durch siRNA´s; Cotransfektion von FlagASK1 (400, 100 bzw.
50ng) mit den einzelnen siRNA´s (jew. 100nM), Negativ-Kontroll siRNA (100nM) und siRNA-Mix
(insgesamt 100nM). Western Blot: 48h nach Transfektion mit anti-ASK1-F9-mouse/anti-mouseHRP Antikörpern
99
4. Ergebnisse
4.1.4.2 Ausschaltung von ASK1 durch siRNAs verhindert die Aktivierung von
p38-MAP Kinase durch E-LDL
Cos7-Zellen wurden mit einem Mix der drei siRNA´s bzw. der Negativ-Kontroll siRNA
transfiziert. Nach Behandlung mit E-LDL wurde die p38-Phosphorylierung im
Western-Blot untersucht. Es zeigte sich, dass bei Transfektion der Negativ-Kontroll
siRNA eine uneingeschränkte p38-Aktivierung durch E-LDL möglich war. Diese war
bei Transfektion der siRNAs nicht zu sehen. Hierdurch geht hervor, dass bei
Ausschaltung von ASK1 die MAP-Kinase p38 nicht durch E-LDL aktivierbar ist. ASK1
wird also für die p38-Aktivierung benötigt.
E-LDL
-
LDL
UN
E-LDL
-
LDL
SP
siRNAs
605040-
P-p38
30-
40-
total p38
Abb. 43: Transfektion von Cos7-Zellen mit 100nM spezifischem siRNA-Mix (SP) bzw. 100nM
unspezifischer Negativ-Kontroll siRNA (UN). 48h nach Transfektion wurde für 10 Minuten mit
100µg/ml E-LDL bzw. LDL behandelt. Oberer Blot: p38-Phosphorylierung; Unterer Blot:
gesamtes p38.
100
4. Ergebnisse
Folgender Zusammenhang kann nun aus den bisher ermittelten Ergebnissen
hergestellt werden:
E-LDL, FFA
P
MAPKKK
ASK1
siRNAs
MAPKK
MKK3/6
MAPK
P
p38 P
MKK4/7
P
JNK P
Abb. 44: E-LDL und FFA aktivieren die MAP-Kinase Kaskade
Nach Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL bzw. FFA konnte bereits nach 10
Minuten eine ASK1-Aktivierung gezeigt werden. Via MKK3/6 bzw. MKK4/7 kommt es
zu einer Phosphorylierung von p38 bzw. JNK. Die E-LDL induzierte p38-Aktivierung
konnte durch Ausschaltung von ASK1 mittels RNAi verhindert werden.
101
4. Ergebnisse
4.2 E-LDL bzw. FFA induzieren Apoptose in Endothelzellen
Unter 4.1 wurde gezeigt, dass Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL zur
Aktivierung der MAP-Kinase Kaskade (ASK1, p38, JNK) führt. Bei Stimulation dieses
Signalweges kann es zur Apoptose der Zellen kommen (Ichijo et al., 1997; Saitoh et
al., 1998). Im Folgenden sollte daher untersucht werden, ob tatsächlich nach
Behandlung mit E-LDL apoptotische Veränderungen der Endothelzellen auftreten.
Der Zelltod spielt bei der Embryogenese, Weiterentwicklung und
Fortpflanzung
langlebiger mehrzelliger Organismen eine wesentliche Rolle (Gluecksmann, 1951;
Lockshin and Zakeri, 2001). Der Begriff „programmierter Zelltod“ wurde 1964
eingeführt und beinhaltet, dass der während der Entwicklung auftretende Zelltod
nicht zufällig passiert, sondern einer Reihe von kontrollierten Schritten folgt, die zur
lokalen und zeitlich begrenzten Selbstzerstörung führen (Lockshin, 1964).
Der Begriff „Apoptose“ wurde 1972 geprägt um die morphologischen Prozesse, die
zur kontrollierten zellulären Selbstzerstörung führen, zu beschreiben (Kerr et al.,
1972).
Die Apoptose ist die häufigste Form des programmierten Zelltodes und besteht aus
einer Abfolge von biochemischen und morphologischen Veränderungen. Zunächst
schrumpfen die apoptotischen Zellen, zeigen Deformationen und verlieren den
Kontakt zu benachbarten Zellen. Das Chromatin kondensiert und die Zelle wird
schließlich fragmentiert in kompakte, membranumschlossene Strukturen, die
apoptotische Körperchen genannt werden. Sie enthalten das Cytosol, das
kondensierte Chromatin und Zellorganellen. Die apoptotischen Körperchen werden
von Makrophagen phagozytiert, was eine sichere und nicht-entzündliche Entfernung
der zellulären Reste erlaubt (Saraste and Pulkki, 2000).
Im Gegensatz dazu kommt es beim Zelltod durch Nekrose zu einer Zerstörung der
Zellmembran. Die nekrotischen Zellen schwellen an und platzen, was zur
unkontrollierten Freisetzung der Zellbestandteile führt. Dies resultiert in der
Schädigung von benachbarten Zellen und einer starken Entzündung im umliegenden
Gewebe (Leist and Jaattela, 2001).
Die Apoptose kann durch verschiedene extrazelluläre und intrazelluläre Faktoren
ausgelöst werden, wie z.B. durch Bindung von Liganden an ZelloberflächenRezeptoren (FasL, TNFα), durch DNA-Schäden, die durch Defekte im Mechanismus
102
4. Ergebnisse
der DNA-Reparatur zustande kommen können, durch Behandlung der Zellen mit
cytotoxischen Substanzen oder ionisierenden Strahlen, durch einen Mangel an
Überlebens-Signalen (z.B. Wachstumsfaktoren) oder durch entwicklungsbedingte
Zelltod-Signale.
Durch diese Signale wird eine Kaskade von Cystein-abhängigen-Aspartatspezifischen Proteasen (Caspasen) induziert, die die Apoptose einleiten (Bratton,
2000). Nach Aktivierung von Initiator-Caspasen kommt es zur Spaltung und
Aktivierung der stromabwärtsgelegenen Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6 und -7),
die wiederum zur Spaltung von cytoskelett- und nukleären Proteinen (Lamin A,
PARP) führen und die Apoptose induzieren (Earnshaw et al., 1999).
Fas-L, TNFα
TodesSignale
death-Rezeptor
FADD
Caspase-8/10
ER Stress
ROS
Smac/
Diablo
CytC
CytC CytC
Caspase-9
XIAP,
Survivin
Caspase-12
Caspase-3
Caspase-7
Caspase-6
Lamin A
PARP
Apoptose
(Chromatin-Kondensation,
DNA-Fragmentierung, ZellSchrumpfung, Bildung von
Apoptotischen Körperchen)
Abb. 45: Induktion von Apoptose über Caspasen-Aktivierung
Apoptosom
103
4. Ergebnisse
Zur Familie der Inhibitor of Apoptosis Proteinen (IAP) gehören u.a. XIAP (Xchromosome-linked inhibitor of apoptosis protein) und Survivin, die an Caspasen
binden und diese inaktivieren können (Deveraux et al., 1998; Li et al., 1998). IAPs
können ihre eigene und auch nach Bindung an Caspasen deren Ubiquitinylierung
katalysieren, was zur Degaradation durch das Proteasom führt (Huang et al., 2000).
Diese direkte Hemmung der Caspasen durch die IAPs ist von hoher Bedeutung
angesichts der Tatsache, dass die Caspasen-Kaskade irreversibel abläuft, sobald sie
induziert wird. Sie muß also präzise reguliert werden, um unangebrachten Zelltod zu
verhindern. Smac/Diablo ist ein mitochondriales Protein, das nach mitochondrialem
Stress ins Cytoplasma freigesetzt wird und mit den Caspasen um die Bindung von
IAPs konkurriert. Durch Interaktion von Smac/Diablo mit IAPs wird deren
inhibitorischer Effekt auf die Caspasen aufgehoben (Du et al., 2000).
4.2.1 E-LDL ist zytotoxisch
Zunächst wurden ATP-Messungen nach Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL
durchgeführt, um die zytotoxischen Eigenschaften von E-LDL, LDL und oxLDL zu
untersuchen. Sowohl bei primären Endothelzellen (HAoEC, Abb. 46A) als auch bei
Eahy926-Zellen (Abb. 46B) zeigte sich nach Behandlung mit LDL oder oxLDL kein
bemerkenswerter ATP-Verlust. Zu einer deutlichen Abnahme des intrazellulären
ATP-Gehalts kam es jedoch nach Behandlung mit E-LDL.
A
B
Zytotoxizität von E-LDL; Eahy926-Zellen
120
120
100
100
ATP -Gehalt in %
ATP-Gehalt in %
Zytotoxizität von E-LDL; HAoEC
80
60
40
20
80
60
40
20
0
control
LDL
oxLDL
E-LDL
0
control
LDL
oxLDL
E-LDL
Abb. 46: HAoEC (A) bzw. Eahy926-Zellen (B) wurden 1h mit 100µg/ml der entsprechenden
Lipoproteine in serumfreiem Medium behandelt. Dann folgte 3h Inkubation in Medium mit 1%
FCS und anschließend ATP-Messung. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (+/-SE) von 3
unabhängigen Experimenten.
104
4. Ergebnisse
In einem Dose-response Experiment zeigte sich sehr deutlich, dass die Abnahme
des intrazellulären ATP-Gehalts proportional ist zur eingesetzten Dosis E-LDL.
ATP -Gehalt in % bez. auf
unbeh. Zellen
E-LDL: Dosis-Wirkungs-Diagram m
100
80
60
40
20
0
50µg/ml
75µg/ml 100µg/ml 150µg/ml
Abb. 47: Eahy926-Zellen wurden für 1h behandelt mit 50-150µg/ml E-LDL in serumfreiem
Medium. Dann folgte 3h Inkubation in Medium mit 1% FCS und anschließend ATP-Messung.
Angegeben sind die Mittelwerte (+/-SE) von drei unabhängigen Experimenten.
4.2.2 Oil-red O Färbung
Oil-red O ist ein lipidlöslicher Farbstoff, mit dem man Lipidablagerungen in der Zelle
anfärben kann. Diese Methode wurde verwendet um zu untersuchen, welche
intrazellulären Veränderungen nach Behandlung mit E-LDL bzw. LDL auftreten.
Hierfür wurden Endothelzellen mit E-LDL(d4) oder LDL für 10 Minuten behandelt.
Nach dreimaligem Waschen und weiteren 30 Minuten Inkubation in reinem Medium
wurden die Zellen fixiert und anschließend mit dem Farbstoff versetzt.
Es ist deutlich zu erkennen, dass sich bei den Zellen, die mit E-LDL(d4) behandelt
wurden, viele Lipidtröpfchen anfärben lassen (Abb. 48A). Bei LDL-behandelten
Zellen sind nur sehr wenige, kleine Tröpfchen zu erkennen (Abb. 48B), die auch bei
unbehandelten Zellen auftreten. Die Behandlungsdauer betrug nur 10 Minuten, d.h.
innerhalb dieser kurzen Zeit werden Bestandteile des E-LDL von Zellen
aufgenommen.
Bei Zugabe von Fettsäuren (LA, OA oder AA) können ebenfalls schon nach 10 Min
Behandlung viele Lipidtröpfchen angefärbt werden (Daten hier nicht gezeigt). Dies
spricht dafür, dass es die freien Fettsäuren sind, die von E-LDL auf die Zellen
übertragen werden und sich intrazellulär in Lipidtröpfchen ablagern.
4. Ergebnisse
105
A
B
Abb. 48: Eahy926-Zellen wurden für 10 Min mit 100µg/ml E-LDL(d4) (A) und LDL (B) behandelt.
Nach weiteren 30 Min Inkubation in reinem Medium wurden die Zellen fixiert und mit Oil-red O
angefärbt. Fotos: 100x Vergrößerung
4.2.2 Annexin-V-Färbung
Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL führt schon nach 10 Minuten zu einer
positiven Annexin-V-Färbung, d.h. Phosphatidylserin, das bei nicht-apoptotischen
Zellen nur an der Innenseite der Zellmembran lokalisiert ist, ist zur Außenseite der
Membran gewandert, wo es von Annexin-V gebunden wird. Die GFP-Markierung des
Annexin erlaubt eine Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Bei E-LDL behandelten Zellen sieht man deutliche Grünfärbungen entlang der
Zellmembran von an Phosphatidylserin gebundenem Annexin. Diese treten bei
Behandlung mit LDL nicht auf.
106
4. Ergebnisse
A
B
Abb. 49: Eahy926-Zellen wurden für 10 Minuten behandelt mit 200µg/ml E-LDL (A) bzw. LDL (B).
Anschließend wurde die Annexin-V-Färbung inkl. DAPI-Färbung durchgeführt.
4.2.3 E-LDL aktiviert Caspase-3 und -7
Bei der Induktion der Apoptose spielt die Aktivierung von Caspasen eine wichtige
Rolle. Caspasen sind Cystein-Proteasen, die bei Aktivierung durch proapoptotische
Signale zu einer Spaltung von cytoskelett- oder nukleären Proteinen führen. Die
katalytische Aktivität der Caspasen hängt ab von einer bestimmten Cystein-Stelle in
einer hochkonservierten pentapeptid-Sequenz im aktiven Zentrum der Enzyme. Die
Caspasen werden in der Zelle zunächst in ihrer inaktiven Form als pro-Caspasen
synthetisiert, die am N-Terminus eine pro-Domäne gefolgt von einer großen und
kleinen Untereinheit tragen. Bei der Aktivierung kommt es zur Spaltung der proCaspasen zwischen den beiden Untereinheiten und zur Entfernung der pro-Domäne.
Ein Heterotetramer bestehend aus zwei großen und zwei kleinen Untereinheiten
bildet dann die aktive Caspase.
107
4. Ergebnisse
Spaltung
Pro-Domäne
pro-Caspase
aktive Caspase
Abb. 50: Aktivierung der pro-Caspasen
Die pro-apoptotischen Caspasen können in zwei Gruppen eingeteilt werden, die
Initiator-Caspasen (pro-Caspasen-2,-8,-9,-10) und die Effektor-Caspasen (proCaspasen-3,-6,-7). Während die Effektor-Caspasen nur kurze pro-Domänen
besitzen, tragen die Initiator-Caspasen lange pro-Domänen, die entweder death
effektor Domänen (pro-Caspase-8,-10) oder caspase-recruitment Domänen (proCaspase-2,-9) enthalten. Über diese pro-Domänen binden die Initiator-Caspasen an
death inducing signaling Komplexe. Diese entstehen bei der Aktivierung von
Zelloberflächen-Todesrezeptoren
(z.B.
Fas-Rezeptor;
extrinsischer
Apoptose-
Signalweg) oder werden durch intrazelluläre Signale (Störung der mitochondrialen
Funktion; intrinsischer Apoptose-Signalweg) gebildet (Sartorius et al., 2001).
In Endothelzellen sollte nun eine Aktivierung von Effektor-Caspasen-3/-7 nach
Behandlung mit E-LDL festgestellt werden. Als Methoden hierfür kamen zum einen
die
Fluoreszenz-Mikroskopie
von
einzelnen
Zellen
und
zum
anderen
ein
Chemilumineszenz-Assay einer gesamten Zellpopulation in Frage.
4.2.3.1 Caspase-Färbung
Die Caspase-Färbung beruht auf der Bindung eines zellpermeablen, fluoreszenzmarkierten Inhibitors an die bereits aktive Caspase-3/7. Liegen die Caspasen in
nicht-aktiver Form vor, so kann keine Bindung des Inhibitors erfolgen und er wird
beim Waschen wieder entfernt.
Nach Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL ist eine deutliche CaspasenAktivierung zu erkennen (grün fluoreszierende Zellen, Abb. 51A). Bei LDL und
108
4. Ergebnisse
oxLDL- behandelten Zellen trat keine Grünfärbung auf, d.h. hier fand keine
Caspasen-Aktivierung statt und es kam nicht zur Bindung des Inhibitors.
A
B
C
Abb. 51: Eahy926-Zellen wurden für 1h mit 100µg/ml E-LDL (A), LDL (B) und oxLDL (C)
behandelt. Nach 3h Inkubation in normalem Medium wurde die Caspase-Färbung durchgeführt.
Anschließend folgte Fixierung der Zellen und DAPI-Färbung der Zellkerne.
4.2.3.2 Caspase-Assay
Die Caspase 3/7-Aktivierung durch E-LDL konnte mit einem weiteren Assay gezeigt
werden. Hierbei wurde nicht der Zustand von einzelnen Zellen, sondern der der
gesamten Zellpopulation untersucht. Die Behandlung der Zellen mit E-LDL war
identisch zu der bei der Caspase-Färbung. Lyse der Zellen und CheminlumineszenzReaktion (Abspaltung von Luciferin aus einem prälumineszierenden Substrat durch
Caspasen und anschließende Luciferase-Reaktion) fanden in einem Schritt statt.
Mit LDL und oxLDL behandelte Zellen zeigen keine Caspasen-Aktivierung. E-LDL
führt zu einem starken Signal. Auch hier ist die Fettsäure-Abhängigkeit der
Aktivierung zu erkennen: Behandlung der Zellen mit flotiertem E-LDL (d4 bzw. d10)
reduziert das Signal.
109
4. Ergebnisse
20
18
Caspase activation
16
14
12
10
8
6
4
2
0
LDL
oxLDL
E-LDL
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
FFA
Abb. 52: Eahy926-Zellen wurden für 1h mit 100µg/ml der entsprechenden Lipoproteine in
serumfreiem Medium behandelt. Dann folgte 3h Inkubation in Medium mit 1% FCS und
anschließend Durchführung des Caspase-Assays. Angegeben sind die Mittelwerte (+/-SE) von
drei unabhängigen Experimenten in x-facher Aktivierung bezogen auf unbehandelte Zellen.
4.2.4 Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL oder FFA führt zu
positiver TUNEL-Färbung
Zur Detektion von apoptotischen Zellen nach Behandlung mit E-LDL wurde eine
TUNEL-Färbung (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick-End
Labeling) durchgeführt. 3´-OH Enden von DNA-Strangbrüchen, die in apoptotischen
Zellen auftreten, werden mit Fluorescein-12-dUTP markiert. Apoptotische Zellen sind
also anhand einer grünen Fluoreszenz zu erkennen.
Endothelzellen wurden in Chamberslides ausgesät und mit E-LDL, LDL, oxLDL und
Linolsäure (freie Säure) behandelt. Grün fluoreszierende apoptotische Zellen waren
nur nach Behandlung mit E-LDL und Linolsäure zu erkennen. Hier kam es auch zu
morphologischen Veränderungen der Zellkerne, die nach LDL und oxLDLBehandlung ebenfalls nicht in Erscheinung traten.
4. Ergebnisse
110
Abb. 53: Eahy926-Zellen wurden für 16h behandelt mit 75µg/ml E-LDL (A), oxLDL (C), LDL (D)
und 0,3µM Linolsäure, freie Säure (E). Dann folgte Tunel-Färbung inklusive DAPI-Färbung der
Zellkerne.
111
4. Ergebnisse
4.2.5 Behandlung von Endothelzellen mit freien Fettsäuren führt
zur Fragmentierung von PARP
Ein weiteres Merkmal von apoptotischen Zellen ist die Spaltung des Enzyms
poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) durch Caspasen. Dieses Enzym ist für die
Reparatur von DNA-Schäden verantwortlich. Wenn es durch Caspasen gespalten
wird und seine Reparatur-Funktion nicht mehr ausüben kann, trägt dies zur
Irreversibilität der Apoptose bei. Da wie oben gezeigt eine Caspasen-Aktivierung
nach Behandlung mit E-LDL stattfindet, sollte nun untersucht werden, ob es
nachfolgend auch zur Spaltung von PARP kommt. Dies läßt mit einem gegen ein
85kD Fragment des gespaltenen PARP-Enzyms gerichteten Antikörper detektieren.
Zunächst wurden Endothelzellen mit verschiedenen Konzentrationen an Fettsäuren
behandelt. Erst bei einer Konzentration von 0,3µM ist eine deutliche p85-PARP
Fragment Bande zu sehen. Beim Ernten dieser Zellen fiel auf, dass sie schon
morphologisch verändert waren. Sie hatten sich abgerundet, waren aber noch nicht
control
vollständig von der Zellkulturplatte losgelöst.
22012010080-
LA
0,3
0,15
AA
0,3
0,15 µM
p85 PARP
Fragment
Abb. 54: Eahy926-Zellen wurden für 16h mit 0,15 bzw. 0,3µM LA oder AA (freie Säuren)
behandelt. WB: anti-PARP p85 Fragment rabbit Antikörper/anti-rabbit-HRP.
112
4. Ergebnisse
4.2.6 Hemmung von ASK1 bzw. p38-MAP Kinase verhindert die
E-LDL-induzierte Apoptose in Endothelzellen
Die oben gezeigte Induktion der Apoptose durch E-LDL bzw. FFA ist normalerweise
ein irreversibler Schritt für die Zelle. Um herauszufinden, ob es möglich ist, durch
Unterbrechung der Signalkaskade die Zellen vor dem programmierten Zelltod zu
retten, wurde ASK1 mittels RNAi ausgeschaltet bzw. p38-MAP Kinase mit dem
Inhibitor SB203580 blockiert.
4.2.6.1 Ausschaltung von ASK1 hemmt die Caspasen-Aktivierung durch E-LDL
Mittels Transfektion der spezifischen siRNAs gegen ASK1 wurde in Cos7-Zellen eine
transiente Ausschaltung von ASK1 erreicht. Bei Behandlung mit E-LDL kam es
hierbei nicht zu einer Aktivierung der Caspase-3/7. Diese war bei Transfektion der
Negativ-Kontroll siRNA jedoch uneingeschränkt möglich. LDL und oxLDL –
Behandlung führte wie schon gezeigt nicht zu einer Caspasen-Aktivierung.
Caspase Activity [cpm]
7000
6000
5000
4000
Neg. Control siRNA
spezific siRNA-Mix
3000
2000
1000
0
control
E-LDL
ox-LDL
LDL
Abb. 55: Cos7-Zellen wurden mit 100nM spezifischem siRNA-Mix bzw. mit der Negativ-Kontroll
siRNA transfiziert. 48h nach Transfektion wurde 1h mit 100µg/ml der entsprechenden
Lipoproteine behandelt. Dann folgte 3h Inkubation in normalem Medium und anschließend
Caspase-Assay. Die Daten repräsentieren Mittelwerte (+/-SE) von 2 unabhängigen
Experimenten in je 6-facher Ausführung.
113
4. Ergebnisse
4.2.6.2 Ausschaltung von ASK1 verhindert PARP-Spaltung durch E-LDL bzw.
FFA
In Cos7-Zellen konnte weiterhin gezeigt werden, dass es bei Ausschaltung von ASK1
mittels siRNAs zu einer reduzierten PARP-Spaltung kommt.
Bei Transfektion der Negativ-Kontroll siRNA sind starke Banden des p85 PARPFragments zu sehen.
Bei Hemmung von ASK1 durch die spezifischen siRNAs
zeigen sich nur noch schwache p85-PARP Banden. Da die Transfektionseffizienz der
Cos7-Zellen wie oben erwähnt nur 20-40% beträgt, lässt sich das Signal nicht
vollständig unterdrücken. Als Kontrollantikörper für gleiche Beladung des Gels wurde
ein GAPDH-Antikörper (Glycerinaldehyd-phosphat Dehydrogenase) verwendet.
12010080-
150
E-LDL
100
ox-LDL
LA
LDL
150
E-LDL
100
ox-LDL
LDL
220-
UN
SP
siRNAs
LA
PARP p85
Fragment
total GAPDH
Abb. 56: Cos7-Zellen wurden mit 100nM siRNA-Mix bzw. Negativ-Kontroll siRNA transfiziert.
48h nach Transfektion fand für 16h eine Behandlung mit 100-150µg/ml E-LDL, LDL, oxLDL und
0,3µM LA statt. Oberer Blot: anti-PARP p85 Fragment rabbit Antikörper/anti-rabbit-HRP; unterer
Blot: anti-GAPDH-mouse/anti-mouse-HRP.
4.2.6.3 Hemmung von p38-MAP Kinase mit SB203580 führt zu geringerem ATPVerlust bzw. verminderter Caspasen-Aktivierung nach E-LDL
Behandlung
Die Rolle von p38 wurde sowohl bei der Caspase-Aktivierung als auch bei
Cytotoxizitäts-Experimenten (ATP-Messung) nach Behandlung von Endothelzellen
mit E-LDL untersucht. Es stellte sich heraus, dass p38 eine zentrale Bedeutung für
diese beiden Ereignisse zukommt. Bei Hemmung von p38 mit dem Inhibitor
SB203580 zeigte sich, dass sowohl die Caspase-Aktivierung durch E-LDL als auch
114
4. Ergebnisse
der ATP-Verlust reduziert waren. Hemmung von p38-MAP Kinase rettet also die
Zellen vor Apoptose.
120
**
**
arbitrary units
100
80
DMSO
SB 203580
60
40
20
0
caspases
ATP
Abb. 57: Effekt von SB203580 auf ATP-Verlust bzw. Caspasen-Aktivität. Eahy926-Zellen wurden
jeweils 2h mit 20µM SB203580 vorbehandelt. Als Kontrolle diente die entsprechende Menge
DMSO. Die Behandlung mit E-LDL (100µg/ml, 1h) und die anschließende Inkubation in Medium
(3h) erfolgten ebenfalls unter Zusatz von SB bzw. DMSO. Die Daten repräsentieren die
Mittelwerte von 6 unabhängigen Experimenten (Caspase-Activation: p=0,058 für Inhibitor vs.
DMSO; Cytotoxizität: p=0,025 für Inhibitor vs. DMSO).
Es wurde weiterhin versucht, eine Abhängigkeit der Caspasen-Aktivierung von JNK
zu zeigen. Durch Hemmung der JNK mit dem Inhibitor SP600125 konnte allerdings
keine Blockade der Caspasen-Aktivierung festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).
Dies könnte auf die nur kurzzeitige Aktivierung der JNK zurückzuführen sein, der in
diesem Fall anscheinend andere Aufgaben als die Auslösung der Apoptose
zukommen.
115
4. Ergebnisse
Wenn man also die MAP-Kinase Signal Kaskade bei ASK1 oder auch bei p38
unterbricht, können die Zellen vor dem programmierten Zelltod gerettet werden. Bei
Blockade von ASK1 oder p38 kommt es nicht zu ATP-Verlust, Caspasen-Aktivierung
und PARP-Spaltung.
E-LDL, FFA
P
ASK1
siRNAs
MKK3/6
P
p38 P
SB203580
ATPVerlust
CaspasenAktivierung
PARPSpaltung
DNAFragmentierung
Apoptose
Abb. 58: Hemmung der Apoptose bei Blockade von ASK1 bzw. p38
116
4. Ergebnisse
4.3 E-LDL verursacht oxidativen Stress in Endothelzellen
Oxidativer Stress bedeutet die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
nach Einwirkung von bestimmten Substanzen wie z.B. TNFα auf Zellen. Zu den ROS
zählen Superoxidradikal-Anionen (O2·−), H2O2 und Hydroxylradikale (HO·). In
Endothelzellen können bei der Bildung der ROS verschiedene Enzyme beteiligt sein,
wie z.B. die Xanthin Oxidase, die NO-Synthase, die Cyclooxigenase, die
Lipoxigenase oder die NADPH-Oxidoreduktase. Auch durch Autooxidation oder als
Nebenprodukt der Atmungskette können ROS entstehen (Bayraktutan et al., 2000).
Von den oben genannten Enzymen ist hauptsächlich die NADPH-Oxidoreduktase für
die ROS-Bildung verantwortlich. In neutrophilen Granulozyten generiert sie große
Mengen (mM) an Superoxid-radikal Anionen während des oxidative burst.
Entstehendes H2O2 dient z.B. zur Abtötung von Bakterien oder zur Regulation der
Produktion von Cytokinen über NF-κB abhängige Mechanismen. Die NADPHOxidase besteht aus einer membrangebundenen Cytochrom-Einheit und vier
cytosolischen Untereinheiten (Thrasher et al., 1994; Leusen et al., 1996). Erst bei
Stimulierung des Enzyms erfolgt Translokation der cytosolischen Komponenten an
das Cytochrom (=aktiver Zustand). In nicht-stimulierten Zellen ist das Enzym inaktiv.
In Endothelzellen dagegen ist die NADPH-Oxidase konstitutiv aktiv, d.h. auch in
nicht-stimulierten Zellen, aber auf viel geringerem Level (Pagano et al., 1997;
Griendling et al., 1998). Der Grund hierfür beruht wahrscheinlich auf Isoformen der
Untereinheiten, die weniger aktiv sind (Bayraktutan et al., 2000).
Der Effekt der ROS ist ein shift des zellulären Redox-potentials. Ein Indikator hierfür
stellt das Verhältnis von reduziertem bzw. oxidiertem Glutathion dar (GSSG / 2 GSH)
dar. Eine Gemeinsamkeit der neutrophilen und der vaskulären NADPH-Oxidase
besteht in ihrer Aktivierbarkeit durch Arachidonsäure (Griendling et al., 1998).
NADPHoxidase
NADPH + 2 O2
NADP+ H+
+2O2·−
Abb. 59: Generierung von ROS durch die NADPH-oxidase
SOD
H2O2
117
4. Ergebnisse
Die Superoxidradikal-Anionen haben eine sehr geringe steady state Konzentration
(n-pM), deshalb können sie nur lokale Effekte ausüben. Der Hauptteil wird durch
nicht-enzymatische Dismutation außerhalb der Zellen in H2O2 umgewandelt.
Intrazellulär katalysiert die Superoxid-Dismutase, die nur in sehr geringer
Konzentration vorliegt (µM) die Umsetzung von O2·− zu H2O2. Wasserstoffperoxid ist
sehr diffusionsfähig und relativ unreaktiv. Es kann schnell in Zellen eindringen, auch
wenn es außerhalb entsteht. Die Elimination von H2O2 erfolgt durch die Catalase (aus
Peroxysomen) oder durch die GSH-peroxidase (in Cytosol und Mitochondrien).
Als wichtigste Auswirkungen der ROS sind zum einen die oxidative Abspaltung von
redox-empfindlichen
Inhibitoren
wie
z.B.
Thioredoxin
von
proapoptotischen
Enzymen, zum anderen die Effekte von freien Radikalen auf lange FettsäureSeitenketten von Lipiden in der Zellmembran zu nennen. Durch Übertragung von H+Ionen von der Fettsäure auf die freien Radikale und anschließender Anlagerung von
O2 kommt es zur Bildung von Peroxid-radikalen, wodurch z.B. eine Vernetzung von
benachbarten Fettsäure-Seitenketten herbeigeführen werden kann. Infolgedessen
kommt es zur Schädigung der Membranen.
4.3.1 Messung des oxidative burst mit Luminol und Cytochrom C
In Endothelzellen sollte nun gezeigt werden, ob durch Behandlung mit E-LDL ein
oxidativer Stress ausgelöst wird. Die Messung der ROS ist prinzipiell mit Luminol
oder Cytochrom C möglich. Beide Methoden erwiesen sich in diesem Falle jedoch
als ungeeignet.
Bei der Luminol-Methode wird H2O2 detektiert. Dieses oxidiert Luminol und es
entsteht ein chemilumineszierendes Produkt. Anhand einer H2O2 Verdünnungsreihe
konnte allerdings nur eine H2O2-Konzentration oberhalb von 5µM gemessen werden.
Die Methode ist also nicht sensitiv genug, um die geringen Mengen an eventuell
entstehendem H2O2 zu detektieren.
Bei der CytochromC-Methode werden Superoxidradikal-Anionen detektiert. Diese
reduzieren CytochromC (Fe3+CytC + O2·− → Fe2+CytC + O2) und es kommt zu
einer Absorptionszunahme bei 550nm. Man ermittelt dann die Differenz zu
540nm. Es stellte sich jedoch heraus, dass E-LDL selbst bei 550nm eine
eigene Absorption zeigte, die die Messung störte.
4. Ergebnisse
118
4.3.2 Messung des oxidative burst mit Dichlorofluorescein (DCF)
Mittels DCF war es möglich, entstehende ROS nach Behandlung von Endothelzellen
mit E-LDL zu detektieren. Der Farbstoff liegt zunächst in einer zellpermeablen, nichtfluoreszeirenden Form vor. Nach intrazellulärer Esterspaltung kann er durch ROS zu
einer stark fluoreszeirenden Form oxidiert werden (siehe Material und Methoden).
Durch FACS-Analysen konnte der oxidierte, fluoreszierende Farbstoff als nach rechts
verschobene Kurve von der nicht-oxidierten Form unterschieden werden. Eine
deutliche Zunahme der Fluoreszenz konnte nach Behandlung der Zellen mit E-LDL
gezeigt werden, die bei LDL nicht auftrat (Abb. 60A). Ox-LDL führte zu einer
schwachen Fluoreszenz. Außerdem war es möglich, eine fettsäure-abhängige
Zunahme des oxidierten Farbstoffs festzustellen. E-LDL verursachte eine starke
Oxidation, E-LDL(d4) eine etwas schwächere, während die Kurve von E-LDL(d10)
sich nur wenig von der Kontrolle unterschied (Abb. 60B).
A
4. Ergebnisse
119
B
Abb. 60: Endothelzellen wurden 5 Minuten mit 5nM DCF inkubiert. Dann folgte Behandlung mit
100µg/ml E-LDL, LDL und oxLDL für 10Min. Nach Trypsinisieren und Fixieren der Zellen
wurden die Proben im FACS analysiert.
4.3.3 NAC inhibiert Aktivierung von MAP-Kinasen durch E-LDL
Durch Vorbehandlung von Endothelzellen mit einem Antioxidanz bzw. Radikalfänger
sollte versucht werden, die Aktivierung der MAP-Kinasen Kaskade durch E-LDL zu
verhindern. N-Acetyl-Cystein (NAC) wurde in einer Konzentration von 30mM 1
Stunde vor Behandlung mit E-LDL bzw. LDL zugesetzt. Als Kontrolle für die
antioxidative Wirkung des NAC wurden die Zellen mit 1mM H2O2 behandelt. Hierbei
sollte eine deutliche Reduktion der Phosphorylierung von ASK1 bzw. p38 zu sehen
sein. Als weitere Kontrolle diente Sorbitol. Da die Aktivierung der MAP Kinasen durch
Sorbitol nicht über oxidativen Stress läuft, sollte hier die Phosphorylierung von ASK1
bzw. p38 nicht durch NAC zu reduzieren sein.
120
4. Ergebnisse
4.3.3.1 Vorbehandlung mit NAC verhindert Aktivierung von ASK1 durch E-LDL
Bei Zusatz von NAC ist eine deutliche Reduktion der H2O2 –induzierten ASK1Phosphorylierung zu erkennen. Auch die durch E-LDL bzw. LA verursachte ASK1Aktivierung wird bei Vorinkubation mit NAC unterdrückt.
FlagASK1
E-LDL
LDL
H2O2
Cy LA
control
E-LDL
LDL
H2O2
NAC 30mM
Cy LA
-200
P-ASK1
-140
-100
ASK1
Abb. 61: Cos7-Zellen wurden mit 1µg/ml FlagASK1 transfiziert und 1h mit 30mM NAC (pH7,5)
vorbehandelt. Anschließend folgte Behandlung mit E-LDL und LDL (100µg/ml) bzw. LA
(100µM). Positiv-Kontrolle: H2O2 1mM; Oberer Blot: anti-Phospho-ASK1-rabbit/anti-rabbit-HRP;
Unterer Blot: anti-ASK1-F9-mouse/anti-mouse-HRP
121
4. Ergebnisse
4.3.3.2 Vorbehandlung mit NAC verhindert Aktivierung von p38-MAP Kinase
Wie schon aus Abb.61 ersichtlich reduziert Zusatz von NAC auch die p38Phosphorylierung durch E-LDL. Das durch H2O2 entstehende Signal wird ebenfalls
durch NAC-Vorbehandlung vermindert. Bei Behandlung mit Sorbitol und NAC-Zusatz
ist wie gewünscht ein starkes Signal zu sehen, da die p38-Aktivierung durch Sorbitol
über osmotischen Schock und nicht über oxidativen Stress läuft.
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
LDL
LDL(d10)
H2O2
control
Sorbitol
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
LDL
LDL(d10)
H2O2
control
Sorbitol
NAC 30mM
P-p38
Abb. 62: Eahy926-Zellen wurden 1h mit NAC 30mM (pH 7,5) vorbehandelt. Dann folgte Zugabe
von E-LDL bzw. LDL (100µg/ml). Positiv-Kontrollen: Sorbitol 0,5M und H2O2 1mM. WB: antiPhospho-p38-rabbit/anti-rabbit-HRP
122
4. Ergebnisse
4.4 Effekt von E-LDL auf AP1 und NF-κB
4.4.1 Allgemeines zu Reporterplasmiden
Um den Effekt von E-LDL auf stromabwärts der MAP-Kinase Kaskade gelegene
Ziele wie AP1 bzw. NF-κB zu untersuchen, wurden Reporterplasmide (PathDetect
Cis-Reporting Systems; Stratagene) verwendet.
Sie
enthalten
Luciferase
als
Reportergen,
welches
von
einem
basalen
Promotorelement (TATA-Box) gesteuert wird. Diesem Promotor vorangestellt sind
sich wiederholende Elemente, an die die Transkriptionsfaktoren binden.
Enhancer Element
TATATA
Luciferase
pNF-κB-Luc: NF-κB (5x)
pAP1-Luc: AP1 (7x)
Abb. 63: Struktur der PathDetect Cis-Reporting System Pasmide pNF-κB-Luc und pAP1-Luc
(Quelle: Stratagene)
Durch extrazelluläre Signale wird die Aktivierung verschiedener intrazellulärer
Moleküle wie z.B. Proteinkinasen und Phosphatasen ausgelöst. Viele dieser SignalTransduktionswege enden in der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren die an
spezifische Elemente binden, die in den Promotoren von vielen verschiedenen
Genen gefunden werden. Damit kommt es zur Modulation der Transkription dieser
Gene.
In diesem Fall soll die Bindung von AP1 bzw. NF- κB nach Behandlung der Zellen mit
E-LDL an die in den Reporterplasmiden vorhandenen spezifischen Elemente
untersucht werden. Bei vermehrter Bindung sollte es zu erhöhter LuciferaseExpression kommen, bei verringerter Bindung sollte eine abnehmende LuciferaseAktivität messbar sein.
Weiterhin sollte der Einfluß von ASK1 auf beide Transkriptionsfaktoren untersucht
werden. Hierzu fanden Cotransfektions-Experimente von FlagASK1 mit den
jeweiligen Reporterplasmiden statt.
123
4. Ergebnisse
(Behandlung mit E-LDL)
(FlagASK1)
AP1: cjun-cFos
NF-κB: p50-p65
Luciferase
Abb. 64: Funktionsweise der Reporterplasmide (Quelle: Stratagene)
Die mit diesen Versuchen ermittelten funktionellen Daten sollen in Ergänzung zu
bereits bestehenden Ergebnissen zur AP1-Aktivierung bzw. NF-κB-Hemmung durch
E-LDL durchgeführt werden. D. Fenske zeigte in seiner Arbeit anhand von EMSAExperimenten, dass E-LDL(d4) in Endothelzellen spezifisch die Aktivierung von NFκB durch nachfolgende Stimulierung mit z.B. TNFα hemmt bei gleichzeitiger
Aktivierung von AP1.
4.4.2 E-LDL aktiviert pAP1-Luc und hemmt pNF-κB-Luc
Die Versuche zur Aktivierung bzw. Hemmung der Reporterplasmide wurden sowohl
in Endothelzellen als auch in der Makrophagen-Zelllinie J774 (Maus) durchgeführt.
Letztere besaß den Vorteil, eine bessere Transkriptionseffizienz zu zeigen. Statt ELDL wurde mit flotiertem E-LDL(d4) bzw. E-LDL(d10) gearbeitet, da diese weniger
toxisch sind. Bei der langen Behandlungsdauer von 16h kam es mit unflotiertem ELDL zu starken Zellschäden.
124
4. Ergebnisse
Die Versuche wurden nach folgendem Schema vorbereitet:
Tag1
•Zellen
aussäen
Tag2
•Transfektion mit
400ng Reporterplasmid
Tag3
•Medium wechseln
•behandeln mit
E-LDL(d4;d10)
bzw. LDL
Tag4
•Zellen lysieren
•Luciferase-Assay
•Proteinbestimmung
Die Effekte von E-LDL(d4) auf beide Reporterplasmide waren nicht sehr stark. Beide
Reporterplasmide zeigten zudem relativ hohe Hintergrundwerte, was evt. auf die
Transfektion zurückzuführen ist, ein Ereignis, dass für die Zelle Streß darstellt.
Es kam bei Endothelzellen zu einer Aktivierung von AP1 um 30% im Vergleich zu
LDL (Abb. 65A), bei J774-Zellen war nur eine Aktivierung um 3% feststellbar (Abb.
65B). Behandlung mit E-LDL(d10) zeigte bei Endothelzellen eine vergleichbare AP1Aktivierung wie E-LDL(d4) um ebenfalls 30% (Abb. 65A). In J774 Zellen erfolgte
unter E-LDL(d10)-Behandlung eine stärkere Aktivierung von AP1 als unter ELDL(d4), nämlich um 20% (Abb. 65B).
NF-κB wurde in Endothelzellen durch E-LDL(d4) um 34% gehemmt im Vergleich zu
LDL (Abb. 65A). Mit E-LDL(d10) behandelte Zellen zeigte keine Hemmung. In J774Zellen konnte mit E-LDL(d4) nur 23% Hemmung erreicht werden, E-LDL(d10)
verursachte nur 5% Hemmung (Abb. 65B).
A
Aktivierung/Hemmung von pAP1-Luc bzw.
pNFkB-Luc durch E-LDL in Eahy926-Zellen
180
160
Luciferase
140
120
100
80
pAP1-Luc
60
pNFkB-Luc
40
20
0
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
LDL
125
4. Ergebnisse
B
pNFkB-Luc durch E-LDL in J774-Zellen
140
120
Luciferase
100
80
pAP1-Luc
60
pNFkB-Luc
40
20
0
E-LDL(d4)
E-LDL(d10)
LDL
Abb. 65: Eahy926-Zellen (A) bzw. J774-Zellen (B) wurden mit 400ng der jeweiligen
Reporterplasmide transfiziert. 24h nach Transfektion wurden die Zellen behandelt mit 75µg/ml
(A) bzw. 100µg/ml (B) für 16h. Anschließend folgte Luciferase-Assay und Korrektur der Werte
mittels Division durch den Proteingehalt der Zelllysate. Angegeben sind Mittelwerte von drei
unabhängigen Experimenten als Aktivierung bzw. Hemmung der Reporterplasmide durch ELDL im Vergleich zu LDL (=100%).
Die Unterschiede der NF-κB-Hemmung bzw. AP1-Aktivierung durch E-LDL im
Vergleich zu LDL sind nicht sehr groß, trotzdem unterstützen diese Daten die im
Arbeitskreis bereits vorhandenen Ergebnisse.
4.4.3 Cotransfektion der Reporterplasmide mit FlagASK1
Bei Cotransfektion von FlagASK1 mit dem jeweiligen Reporterplasmid kam es zu
einer AP1-Aktivierung während gleichzeitig NF-κB gehemmt wurde. Die AP1Aktivierung ist dadurch zu erklären, dass ASK1 eine stromaufwärts von AP1
gelegene Kinase ist. Bei Überexpression kommt es dadurch auch zu vermehrter
AP1-Bildung.
pAP1-Luc konnte ca. 2,3fach durch FlagASK1 aktiviert werden im Vergleich zum
Kontrollvektor pcDNA3. Gleichzeitig erfolgte eine Hemmung von pNF-κB durch
FlagASK1 um ca. 60%.
126
4. Ergebnisse
pNFkB-Luc durch FlagASK1 in J774-Zellen
250
Luciferase
200
150
FlagASK1
pcDNA3
100
50
0
pAP1-Luc
pNFkB-Luc
Abb. 66: Cotransfektion von 80ng FlagASK1 bzw. pcDNA3 mit 400ng des jeweiligen
Reporterplasmids (Verhältnis 1:5) in J774-Zellen. Der Luciferase-Assay wurde 48h nach
Transfektion durchgeführt. Angegeben sind die Mittelwerte von drei unabhängigen
Experimenten als Aktivierung bzw. Hemmung der Reporterplasmide durch FlagASK1 im
Vergleich zu pcDNA3 (=100%).
Die Hemmung von NF-κB beruht evtl. auf einer Wechselwirkung von ASK1 mit TAK1,
einer MAPKKK welche unter anderem für eine Phosphorylierung, d.h. Aktivierung der
IKKα/ß zuständig ist. Die in von Mochida et al. beschriebene Hemmung von TAK1
durch ASK1 könnte verantwortlich dafür sein, dass die Aktivierung der IKKα/ß durch
diesen Weg verhindert wird und somit in den weiteren Schritten keine NF-κB
Aktivierung zustande kommt (Mochida et al., 2000).
127
4. Ergebnisse
E-LDL, FFA
TNFα
IL-1
IL-1 Rezeptor
ROS
TNFα-Rezeptor
TRAF6
TRAF6
ASK1
NIK
TAK1
P
P
IKKα
IKKß
IκB
MKK3/6
MKK4/7
p50
p65
P
P
inaktives NF-κB
IκB
p50
p65
P
p38
P
IκB
JNK
Abbau der IκB
im Proteasom
Ub
P
Translokation in
den Zellkern
AP1
P
ATF-2
P cjun
AP1-site
Transkription
p50
p65
p65
p50
κB-site
Abb. 67: Induktion von AP-1 bzw. Hemmung von NF-κB durch E-LDL über ASK1
aktives NF-κB
Transkription
4. Ergebnisse
128
4.5 Effekte von alpha-Toxin auf MAP-Kinasen
Neben der Atherosklerose beschäftigt sich unsere Arbeitsgruppe mit der Wirkung
von alpha-Toxin auf HaCat-Zellen (humane Keratinozyten-Zelllinie). Bei Inkubation
der HaCat-Zellen mit dem Toxin kommt es zunächst zu einem ATP-Verlust mit einem
Tiefpunkt bei 2h, bevor eine Regeneration der Zellen begleitet von einem ATPWiederanstieg bei ca. 6h erfolgt. Die neuesten Befunde sprechen dafür, dass alphaToxin die Zellen zur Teilung anregt, obwohl bei einem Teil der Population die
Apoptose über Caspasen-Aktivierung ausgelöst wird. In diesem Zusammenhang war
es von Interesse zu prüfen, ob alpha-Toxin auch zu einer Aktivierung der MAPKKaskade (ASK1, p38, JNK) führen kann, wie es bei E-LDL der Fall ist.
4.5.1 Eigenschaften von alpha-Toxin
Alpha-Toxin, auch alpha-Hämolysin genannt, wird produziert von Staphylococcus
aureus und kann zu Lyse von kernhaltigen Zellen wie Monozyten, Lymphozyten oder
Endothelzellen sowie von Erythrozyten führen. Alpha-Toxin ist ein hydrophiles
Polypeptid, das aus 293 Aminosäuren besteht und heptamere transmembrane Poren
bildet. Die Membranpermeabilisation ist bedingt durch Konformationsänderungen
des Oligomers, wodurch ein amphiphiler Charakter zustande kommt (Valeva et al.,
1996). Durch die Porenbildung entsteht ein Ungleichgewicht der Ionenkonzentration
in der Zelle, verursacht durch einen Ausstrom von K+-Ionen. Dies führt u.a. zu einem
ATP-Verlust der Zelle. In diesem Zusammenhang sollte zunächst der Effekt von
alpha-Toxin auf die MAP-Kinase p38 untersucht werden. Die Mutante des alphaToxins bindet zwar an die Zellen, führt aber nicht zur Bildung einer Pore.
129
4. Ergebnisse
Abb. 68: Heptamere Form des Alpha-Toxins; der untere Teil entspricht der Pore, die in die
Zellmembran inseriert.
4.5.2 alpha-Toxin aktiviert die MAP-Kinasen p38, JNK und Erk in
HaCat-Zellen
HaCat-Zellen wurden mit alpha-Toxin bzw. der Mutante behandelt und die p38Phosphorylierung im Western Blot untersucht. Es ist eine deutliche Aktivierung von
p38 nach 1 bzw. 2h Behandlung zu sehen. Die Mutante hat keinen Effekt auf die
control
Sorbitol
p38-Aktivierung.
α-Toxin
2h
1h
Mutante
1h
2h
504030-
P-p38
total p38
Abb. 69: Behandlung von HaCat-Zellen mit 200ng/ml α-Toxin bzw. Mutante; Positiv-Kontrolle:
Sorbitol 0,5M, 10Min. Oberer Blot zeigt p38-Phosphorylierung, unterer Blot: gesamtes p38.
130
4. Ergebnisse
Nun wurde eine Kinetik im Bereich von 0-7h durchgeführt. Die gleichen Zelllysate
wurden für Western Blots mit Antikörpern gegen Phospho-p38, Phospho-JNK und
Phospho-Erk verwendet, um vergleichen zu können, welche der MAP-Kinasen zu
welcher Zeit aktiviert wird.
Es stellte sich heraus, dass p38 schon nach 15Minuten aktiviert wird (Abb. 70A). Die
zunächst schwache Bande ist ab 1h deutlich stärker und hält an bis 7h. Die JNKAktivierung setzt etwas später ein als die p38-Aktivierung, doch auch hier sind ab 1h
deutliche Banden zu erkennen, die in ihrer Stärke bis 7h noch etwas zunehmen.
Bei der Phosphorylierung von Erk (extracellular signal-regulated kinase) ist ein
genauer Zeitpunkt nur schwer zu erkennen. Unbehandelte Zellen zeigen hier auch
ein schwaches Signal. Ab 1-3 Stunden verstärkt sich dieses und nimmt bis 7h weiter
A
60504030-
control
Sorbitol
zu.
α-Toxin
5´ 15´ 30´ 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h
P-p38
total p38
B
C
60504030-
p54
p46 P-JNK
P-ERK (42kD)
total ERK
Abb. 70: Behandlung von HaCat-Zellen mit 200ng/ml α-Toxin für 5´-7h. Positiv Kontrolle:
Sorbitol 0,5M, 10´. (A) Western Blot anti-Phospho-p38 (oben) und gesamtes p38 (unten); (B)
Western Blot anti-Phospho-JNK; (C) Western Blot anti-Phospho-ERK (oben) und gesamtes
ERK (unten).
131
4. Ergebnisse
4.5.3 Schwache Aktivierung von ASK1 durch alpha-Toxin
Des Weiteren sollte eine Aktivierung von ASK1 durch alpha-Toxin gezeigt werden.
Hierzu wurde wieder in Cos7-Zellen gearbeitet, da FlagASK1 transfiziert werden
musste. Die transfizierten Zellen wurden mit H2O2 als Positiv-Kontrolle behandelt,
was zu einer starken ASK1-Phosphorylierung führte. Die Behandlung mit alpha-Toxin
jedoch resultierte nur in sehr schwachen Banden mit einem Maximum bei 30 Min.
Man könnte also annehmen, dass ASK1 zwar durch alpha-Toxin aktiviert wird, aber
nicht vergleichbar stark wie durch E-LDL.
control
H2O2
FlagASK1
α-Toxin
10´
30´
1h
2h
P-ASK1
total ASK1
Abb. 71: Transfektion von Cos7-Zellen mit FlagASK1 und Behandlung 48h nach Transfektion
mit 200ng/ml alpha-Toxin (10´-2h) bzw. H2O2 5mM (5Min). Oberer Blot: ASK1-Phosphorylierung,
unterer Blot: gesamtes ASK1.
4.5.4 Die p38-Aktivierung durch alpha-Toxin ist wahrscheinlich
nicht unbedingt ASK1-abhängig
Nun sollte die Frage geklärt werden, ob die p38-Phosphorylierung von einer
vorhergehenden ASK1-Aktivierung abhängig ist. Hierbei wurden Cos7-Zellen mit den
siRNA´s (spezifisch bzw. unspezifisch) gegen ASK1 transfiziert und anschließend mit
alpha-Toxin bzw. E-LDL behandelt. Wie schon unter 4.1.4.2 gezeigt führt auch hier
Behandlung mit E-LDL zu einer deutlichen p38-Phosphorylierung, die bei
Transfektion der spezifischen siRNAs fast vollständig unterdrückt wird (90%
Hemmung). Bei Behandlung mit alpha-Toxin kommt es zu einer doppelt so starken
p38-Phosphorylierung im Vergleich zu E-LDL, die bei Ausschaltung von ASK1 nur
um 18% abnimmt.
132
4. Ergebnisse
Dies lässt darauf schließen, dass im Fall der Aktivierung von p38 durch alpha-Toxin
nicht unbedingt eine vorhergehende ASK1-Aktivierung nötig ist bzw. dass ASK1 nicht
die einzige MAPKKK ist, die zu einer Phosphorylierung von p38 führt. Es wäre
demnach sinnvoll die Aktivierung weiterer MAPKKKs nach Toxin-Behandlung zu
überprüfen.
E-LDL 10´
control
E-LDL 10´
α-Tox 1h
control
P-p38
α-Tox 1h
UN
SP
siRNA´s:
-60
-50
-40
total p38
Abb. 72: Transfektion von Cos7-Zellen mit 100nM spezifischem siRNA-Mix (SP) bzw. NegativKontroll siRNA (UN). Behandlung 48h nach Transfektion mit 200ng/ml alpha-Toxin (2h) bzw.
100µg/ml E-LDL (10Min). Oberer Blot: p38-Phosphorylierung; unterer Blot: gesamtes p38.
4.5.5 Die p38-Aktivierung durch alpha-Toxin ist nicht hemmbar
durch Antioxidantien (NAC)
In HaCat-Zellen sollte untersucht werden, ob nach Behandlung mit alpha-Toxin wie
nach Behandlung mit E-LDL oxidativer Stress entsteht, bzw. ob eine Vorbehandlung
mit dem Radikalfänger NAC eine Aktivierung der MAP-Kinase Kaskade verhindern
kann. HaCat-Zellen wurden mit NAC vobehandelt und anschließend erfolgte Zugabe
von alpha-Toxin und H2O2 bzw. Sorbitol als Positiv- bzw. Negativ-Kontrollen.
Die p38-Phosphorylierung durch H2O2 reduzierte sich unter NAC-Vorbehandlung um
75%. Auf die p38-Aktivierung durch Sorbitol und alpha-Toxin hatte NAC keinen
Einfluß. Dies deutet darauf hin, dass kein oxidativer Stress nach Behandlung mit
alpha-Toxin in HaCat-Zellen auftritt.
133
4. Ergebnisse
α-Toxin
control
Sorbitol
H2O2
α-Toxin
control
Sorbitol
H2O2
NAC 30mM
P-p38
total p38
Abb. 73: Vorbehandlung von HaCat-Zellen für 1h mit 30mM NAC (pH 7,4), dann Zugabe von
200ng/ml alpha-Toxin (2h); Kontrollen: H2O2 1mM, Sorbitol 0,5M (je 10Min). Oberer Blot: p38Phosphorylierung, unterer Blot: gesamtes p38.
5. Diskussion
134
5. Diskussion
Die wichtigste Feststellung, die in dieser Arbeit gemacht wurde, ist die Auslösung der
Apoptose in Endothelzellen durch die in enzymatisch modifiziertem LDL enthaltenen
freien Fettsäuren. Der programmierte Zelltod wird induziert durch Signalübertragung
via ASK1-abhängiger p38- und Caspase-3/-7-Aktivierung, die zu nachfolgender
Fragmentierung der DNA sowie zur Spaltung von nukleären Enzymen (PARP) führt.
Mit freien Fettsäuren alleine konnte derselbe Effekt gezeigt werden. Inkubation mit
der gleichen Konzentration von nativem oder oxLDL führte hingegen nicht zur
Apoptose.
5.1 Freie Fettsäuren aus E-LDL induzieren Apoptose
Der Befund, dass freie Fettsäuren aus E-LDL zur Aulösung der Apoptose führen
können, liefert eine einfache Erklärung dafür, warum übermäßige Ansammlung von
subendothelial abgelagertem LDL eine Gefährdung für die benachbarten Zellen
darstellt. Bei der enzymatischen Umwandlung des Lipoproteins in der Intima kann es
zu einer massiven Freisetzung von freien Fettsäuren kommen. Diese könnten dann
in den angrenzenden Endothelzellen oder auch in anderen benachbarten Zellen den
programmierten Zelltod auslösen.
Freie Fettsäuren können einerseits aus Phospholipiden hervorgehen, indem sie
beispielsweise durch die von Makrophagen sekretierte sPLA2 abgespalten werden.
Dieses Enzym kann durch E-LDL induziert werden (Han et al., 2003) und wurde in
atherosklerotischen Läsionen vorgefunden. Daher könnte es zur Entwicklung der
Atherosklerose beitragen (Murakami and Kudo, 2003). Auch bei der Induktion der
membranassoziierten-PLA2 durch Angiotensin II können freie Fettsäuren entstehen.
(Cui and Douglas, 1997).
Der Hauptteil der Fettsäuren ist im LDL jedoch in Form von Cholesterinestern
gespeichert. Der Cholesterinestergehalt pro LDL-Partikel wird ungefähr auf 1700
Moleküle geschätzt (Baumstark et al., 1991). Bei der in der Intima stattfindenden
enzymatischen Umwandlung kommt es zu einer Aufspaltung der die Cholesterinester
umgebenden Apolipoprotein-B Hülle. Verschiedene Proteasen können hierbei
beteiligt sein. Ein Beispiel ist das Cathepsin H, das in den frühen Läsionen detektiert
5. Diskussion
135
wurde (Han et al., 2003). Dadurch werden die Cholesterinester zugänglich für die
hydrolytische Spaltung der Esterbindung durch die Cholesterinesterase, ein Enzym,
das ebenfalls in den atherosklerotischen Läsionen vorkommt. Hierbei kann eine
massive Freisetzung von freien Fettsäuren erfolgen, die die Apoptose in
benachbarten Zellen, z.B. den Endothelzellen, auslösen können. Die Tatsache, dass
große Mengen an freiem Cholesterin in den frühen atherosklerotischen Läsionen
enthalten sind (Simionescu et al., 1986; Kruth and Fry, 1984; Kruth, 1985; Chao et
al., 1988; Seifert et al., 1990) spricht ebenfalls dafür, dass freie Fettsäuren schon zu
einem frühen Zeitpunkt der Atherosklerose entstehen. Dennoch fanden sie bisher nie
besondere Erwähnung.
Durch in vitro Modifizierung mit Trypsin und Cholesterinesterase erhält man ein dem
läsionalen LDL ähnliches Produkt mit einem hohen Gehalt an freiem Cholesterin und
freien Fettsäuren (FFA). Der Gehalt an FFAs, der in LDL 7,7µg/mg Cholesterin
beträgt, erhöht sich bei der enzymatischen Umsetzung zu E-LDL auf 600µg/mg. Der
Anteil an unverestertem Cholesterin in LDL liegt bei ca. 25% und steigt an auf rund
85% in E-LDL. Der Fettsäure-Anteil des E-LDL besteht hauptsächlich aus Linolsäure.
Ölsäure, Palmitinsäure, Arachidonsäure und Stearinsäure sind in geringeren Mengen
vertreten (Suriyaphol et al., 2002).
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Inkubation von Endothelzellen mit
E-LDL zu einer Aktivierung von ASK1 führt. Eine nachfolgende, ASK1-abhängige
Aktivierung von p38 induzierte die Apoptose über die Aktivierung der Caspase-3/-7,
was zur Fragmentierung der DNA und zur Spaltung von nukleären Enzymen (PARP)
führte. Durch Depletion der Fettsäuren aus E-LDL verringerten sich die cytotoxischen
Eigenschaften des Partikels deutlich. Neben geringeren ATP-Verlusten kam es auch
zu einer stark reduzierten Caspase-3/-7 Aktivierung. Rekonstitution des depletierten
E-LDL(d4) bzw. (d10) mit Linolsäure brachte die ursprünglichen Effekte wieder
zurück.
Freie Fettsäuren alleine führten ebenfalls über ASK1/p38-Aktivierung zur Apoptose in
Endothelzellen. Linolsäure, Ölsäure und Arachidonsäure zeigten ähnlich starke
Auswirkungen bei der ASK1-bzw. p38-Phosphorylierung oder der Fragmentierung
von PARP.
Übereinstimmend mit anderen Arbeiten (Zhu et al., 2001) fand unter Einwirkung von
nativem LDL auf Endothelzellen eine schwache p38-Phosphorylierung statt, die aber
5. Diskussion
136
keine zytotoxischen Auswirkungen hatte und auch nicht zu einer CaspasenAktivierung führte. Nach Inkubation von LDL mit Albumin, also dem Entfernen der
auch in LDL vorhandenen freien Fettsäuren, konnte die p38-Phosphorylierung weiter
supprimiert werden im Vergleich zu nativem LDL. Dies spricht dafür, dass die
schwache p38-Phosphorylierung durch LDL, die auch von mehreren anderen
Arbeitsgruppen gefunden, aber nicht begründet werden konnte (Zhu et al., 2001; Jing
et al., 1999), durch den in LDL vorhandenen, wenn auch geringen, Anteil an freien
Fettsäuren zustande kommt.
Auch die cytotoxischen Eigenschaften des E-LDL sind vom Fettsäure-Gehalt des
Partikels abhängig: je höher der Gehalt an freien Fettsäuren, desto stärker ist die
cytotoxische Wirkung von E-LDL − dies wurde anhand von ATP-Messungen deutlich.
LDL und oxLDL hatten bei gleicher Konzentration wie E-LDL (100µg/ml) keinen
toxischen Effekt, d.h. es kam nicht zu ATP-Verlusten.
In dieser Arbeit wurden freie Fettsäuren (Linolsäure, Ölsäure) zunächst als
wasserlösliche Komplexe in Methyl-ß-Cyclodextrin verwendet. Sie mußten in einer
Konzentration von 100µM eingesetzt werden, um eine ASK1 bzw. p38 Aktivierung zu
erhalten. Dies entspricht in etwa der in E-LDL enthaltenen Linolsäure-Menge bei der
Behandlung der Zellen mit 100µg/ml E-LDL (100µg E-LDL-Cholesterin enthalten ca.
128nmol Linolsäure). Bei Verwendung der reinen Fettsäuren konnte eine wesentlich
niedrigere Dosierung erfolgen um die Apoptose auszulösen. Inkubation von
Endothelzellen mit 0,3µM Linolsäure oder Arachidonsäure über 16h Stunden war
ausreichend, um eine Spaltung des nukleären Enzyms PARP zu erreichen.
Anscheinend ist also die Konstitution, in der die Fettsäuren auf die Zellen treffen, von
ausschlaggebender Bedeutung für den Effekt.
Der Effekt von freien Fettsäuren bzw. E-LDL auf die Proteinphosphatase pp5, einem
negativ-Feedback-Inhibitor von ASK1, konnte mittels Co-Immunpräzipitation gezeigt
werden. In einem Experiment wurden erhöhten Mengen von copräzipitiertem pp5
nach Behandlung mit Linolsäure bei der Präzipitation von FlagASK1 aus
transfizierten 293-Zellen nachgewiesen. Allerdings konnte der Befund, dass in
Monozyten eine Zunahme der pp5-Menge nach 24h Behandlung mit E-LDL erfolgte,
in Endothelzellen nicht reproduziert werden. Eine Bestimmung der pp5-Aktivität nach
Inkubation mit E-LDL könnte über die Dephosphorylierung eines Substrates unter
137
5. Diskussion
Messung der Zunahme der dephosphorylierten Form erfolgen (Ramsey and
Chinkers, 2002). Darauf wurde aber in dieser Arbeit verzichtet, da es von vorrangiger
Bedeutung war, eine Aktivierung der Kinase ASK1 darzustellen.
Die freien Fettsäuren spielen folglich eine essentielle Rolle bei der Auslösung der ELDL-induzierten Apoptose in Endothelzellen. In glatten Muskelzellen scheinen freie
Fettsäuren, insbesondere Linolsäure, jedoch auch mitogenene Effekte zu haben.
Neben der Induktion der DNA-Synthese wurde in einer Arbeitsgruppe eine
Stimulation der Expression von c-fos und c-jun mRNA durch Linolsäure sowie eine
Aktivierung der MAP-Kinase Erk beobachtet (Rao et al., 1995). Eine andere
Arbeitsgruppe fand heraus, dass es durch Angiotensin II-vermittelte Freisetzung von
Arachidonsäure über eine Aktivierung der membran-assoziierten PLA2 zu einer
Aktivierung der MAP-Kinase Erk in Nieren-Epithelzellen kommen kann (Cui and
Douglas, 1997). Die Arachidonsäure funktionierte in diesem Fall als Lipid-second
messager für die Stimulation des Erk-Signalweges, der hauptsächlich zu zellulärem
Wachstum bzw. Differenzierung führt.
Die
Menge
der
freigesetzten
Fettsäuren,
ob
aus
Phospholipiden
oder
Cholesterinestern stammend, ist wahrscheinlich verantwortlich für die Vermittlung
von mitogenen Effekten oder für die Auslösung der Apoptose.
5.2 Bedeutung der Apoptose von Endothelzellen für die
Pathogenese der Atherosklerose
Die Induktion der Apoptose ist ein wichtiger Prozess im Zusammenhang mit der
Atherosklerose und stellt eine der möglichen Reaktionen von Endothelzellen nach
Kontakt mit schädlichen Stoffen dar. Die Endothelzellen bedecken die Gefäßwände
in einer einzelligen Schicht und spielen eine wichtige Rolle bei der Homöostase der
Blutgefäße. Zu den wichtigsten physiologischen Funktionen des Endothels gehören
die Regulation des Gefäßtonus, die Kontrolle des Gefäßwachstums, die Vermittlung
von
leukozytenadhäsiven
Prozessen
und
die
Aufrechterhaltung
eines
antithrombotischen und profibrinolytischen Zustands (Kinlay et al., 1997). Die durch
die Apoptose entstehenden Verletzungen im Endothel tragen zur Pathogenese der
Atherosklerose bei, indem sie die Integrität der Einzelzellschicht aufheben. Es kann
138
5. Diskussion
zu einer Erosion der Plaques und zu Bildung von Thrombosen kommen, was zu
akuten Koronarsyndromen (Herzinfarkt) führt.
Die Apoptose der Endothelzellen kann wesentlich zur endothelialen Dysfunktion
beitragen, welche als eine der initialen pathophysiologischen Veränderungen im
Voranschreiten der Atherosklerose angesehen wird (Cai and Harrison, 2000). Die
endotheliale Dysfunktion ist definiert als gestörte endotheliale NO-Verfügbarkeit. Die
bekannten
klassischen
Nikotinkonsum
oder
kardiovaskulären
Diabetes
mellitus
Risikofaktoren
gehen
mit
wie
einem
Hypertonie,
Verlust
der
endothelvermittelten Vasodilatation einher, die durch verminderte NO-Mengen
begründet wird (Vita et al., 1990; Ross, 1999).
Das vasodilatative Stickstoffmonoxid (NO) wird im intakten Endothel durch die
endotheliale NO-Synthase aus der Aminosäure L-Arginin gebildet. Zu den
wichtigsten Stimuli der NO-Synthese zählt die Exposition des Endothels für
Scherkräfte. Atherosklerotische Läsionen treten bevorzugt an verzweigten Stellen im
Gefäßsystem auf, wo der sich teilende Blutfluß Turbulenzen und reduzierte
Scherkräfte erzeugt. In unverzweigten Gefäßen treten dagegen deutlich höhere
Scherkräfte auf. Diese mechanische Stimulation der Endothelzellen führt zur
Aktivierung einer Vielzahl von intrazellulären Signalwegen (Garcia-Cardena et al.,
2001; Urbich et al., 2000). Auf diese Weise wird z.B. die Genexpression der
endothelialen NO-Synthase über Mechanorezeptoren hochreguliert. Als gasförmiges
Molekül diffundiert NO durch die Zellmembranen und steigert über Aktivierung der
Guanylat-Cyclase die cGMP-Konzentration in den glatten Gefäßmuskelzellen.
Daraufhin sinkt die cytoplasmatische Ca2+-Konzentration, welche für die Kontraktion
der Gefäße notwendig ist, und es kommt zur Dilatation.
Durch Hemmung der Apoptose in Endothelzellen sorgt NO für eine intakte
Gefäßinnenwand (Noris et al., 1995; Dimmeler et al., 1997; Dimmeler et al., 1999).
Die Blockade der Apoptose erfolgt über S-Nitrosylierung von Zielproteinen durch NO.
NO kann z.B. mit dem essentiellen Cystein im reaktiven Zentrum der Caspasen
reagieren, was deren Enzymaktivität bzw. die Apoptose hemmt (Dimmeler et al.,
1997). Auch bei dem ASK1-Inhibitor Thioredoxin kann eine S-Nitrosylierung durch
NO stattfinden, was allerdings dessen enzymatische Aktivität erhöht und intrazellulär
auftretenden oxidativen Stress sowie eine Aktivierung von ASK1 reduziert
(Haendeler et al., 2002).
139
5. Diskussion
Die endotheliale Dysfunktion bzw. die verminderte Produktion von NO kann nun zum
einen
durch
Apoptose
der
Endothelzellen
zustande
kommen.
Aber
auch
verschiedene andere Mechanismen wie z.B. ein Mangel an L-Arginin oder die
Inaktivierung von NO durch freie Radikale (ROS) unter der Bildung von Peroxynitrit
können die Funktion des Endothels schwächen. Neben der Produktion von ROS in
Reaktion auf Stress kann auch eine erhöhte Aktivität des angiotensin converting
enzym (ACE) zur Bildung von freien Radikalen beitragen. Angiotensin I und II sind
essentielle Bestandteile des wesentlich zur Hypertonie beitragenden ReninAngiotensin-Systems.
Zirkulierende
Monozyten
können
Angiotensinogen
synthetisieren; ihre Differenzierung zu Makrophagen induziert eine Zunahme der
ACE-Synthese
(Takahashi
et
al.,
2002).
Angiotensin
II
stimuliert
die
membranassoziierte PLA2 und es kommt zur Freisetzung von Arachidonsäure. Diese
funktioniert als Botenstoff und aktiviert die NADPH-Oxidase, was die Produktion von
Superoxidradikal-Anionen zur Folge hat.
Die Regulation der redox-Balance zwischen ROS-Produktion in Reaktion auf Stress
und der Synthese von NO hat demnach entscheidende Bedeutung für das Überleben
von Endothelzellen. ACE-Hemmer wie z.B. Quinapril bewiesen in verschiedenen
Studien eine generelle Verbesserung der endothelialen Funktion sowie eine
Reduktion von Herzinfarkten. Daher werden sie häufig therapeutisch eingesetzt, um
durch Hemmung der Bildung von Angiotensin II dessen Einfluß auf die ROSProduktion zu reduzieren.
Apoptotische Endothelzellen besitzen zudem prokoagulierende Eigenschaften, die
ebenfalls durch die gehemmte NO-Synthese zustande kommen. NO diffundiert
normalerweise in die Thrombozyten und hemmt deren Aktivierung und Aggregation.
Ist dies bei Schädigung des Endothels nicht mehr der Fall, so kommt es zur Bindung
von Thrombozyten an das Endothel, worauf eine Plättchen-Aktivierung erfolgt
(Bombeli et al., 1997; Bombeli et al., 1999). Die Thrombus-Bildung kann also nicht
nur bei der Ruptur von Plaques, sondern auch direkt durch apoptotische
Endothelzellen ausgelöst werden.
Eine Studie von Boulanger et al. verdeutlicht die Induktion von endothelialer
Dysfunktion durch zirkulierende Mikropartikel, die aus Resten apoptotischer
Endothelzellen entstehen (Boulanger et al., 2001). Diese endothelialen Mikropartikel
140
5. Diskussion
treten in hohem Maße bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom auf (Mallat et al.,
1999). Auch andere Arbeitsgruppen berichten über eine Zunahme von zirkulierenden
Endothelzellen bei Patienten mit Herzinfarkt oder instabiler Angina (Hladovec et al.,
1978; Mutin et al., 1999). Annäherungsweise 5-30 apoptotische Endothelzellen
können pro Mikroliter Blut in Patienten mit akutem Koronarsyndrom gefunden werden
(Dimmeler et al., 2002).
Eine
weitere
Hypothese
besagt,
dass
apoptotische
Endothelzellen
durch
benachbarte Zellen regeneriert werden müssen. In diesem Zusammenhang wurde
festgestellt, dass die regenerierten Endothelzellen in ihrer Funktion beeinträchtigt
sind (Fournet-Bourguignon et al., 2000). Daraus resultiert die Annahme, dass als
Konsequenz der initialen Endothelzell-Apoptose die einzellige Endothelzellschicht
zum Teil durch nicht-funktionierende Zellen ausgetauscht wird. Hierbei geht der
atheroprotektive Schutz des Endothels wie z.B. die Fähigkeit zur NO-Synthese
verloren (Dimmeler et al., 2002).
5.3 Verbindung der Apoptose mit der MAPK-Kaskade
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abhängigkeit der durch E-LDL verursachten
Caspase-3/7 Aktivierung von p38 bzw. ASK1 dargestellt. Bei Hemmung von p38 mit
dem Inhibitor SB203580 konnte die Caspasen-Aktivierung um ca. 50% gesenkt
werden. Die wichtige Rolle von ASK1 bei der Auslösung der Apoptose wurde bei
Ausschaltung des Enzyms durch RNA-Interferenz deutlich: Hemmung von ASK1
mittels siRNAs reduzierte die Caspasen-Aktivierung sogar auf den Level von
unbehandelten Zellen. Der Zusammenhang zwischen der E-LDL induzierten p38MAP-Kinase- und Caspase-Aktivierung besteht wahrscheinlich in der Regulation der
Cytochrom C-Freisetzung aus den Mitochondrien, welche die Aktivierung der
Initiator-Caspase-9 reguliert.
Es ist bekannt, dass eine Aktivierung von ASK1 die Apoptose hauptsächlich über
mitochondriale Caspasen-Aktivierung auslöst. Überexpression einer konstitutiv
aktiven ASK1-Mutante induziert CytC-Freisetzung und aktiviert Caspase-9 sowie
Caspase-3, nicht aber Caspase-8. In Caspase-9 -/- embryonischen MausFibroblasten (MEFs) konnte durch überexprimiertes ASK1 keine Caspase-3
5. Diskussion
141
Aktivierung stattfinden (Hatai et al., 2000). Die Caspase-3 ist also kein direktes
Target von ASK1 oder p38, sondern benötigt zur Aktivierung eine vorhergehende
Caspase-9 Aktivierung.
Die Coexpression von ASK1 und JNK verursacht eine Modifizierung von
antiapoptotischen Proteinen der Bcl-2 Familie, die die CytC-Freisetzung aus den
Mitochondrien kontrollieren. Die Phosphorylierung von Bcl-2 durch JNK führt zu
dessen Inaktivierung und hebt die hemmende Funktion von Bcl-2 auf die CytCFreisetzung auf (Yamamoto et al., 1999).
Zhang et al. zeigen eine Lokalisation von ASK1 sowohl im Cytoplasma als auch in
den Mitochondrien, wo eine Bindung an den Inhibitor Trx1 bzw. Trx2 stattfindet. Eine
Überexpression des mitochondrialen Trx2 konnte die ASK1-induzierte Apoptose
verhindern (Zhang et al., 2004).
Regulation der Cytochrom C-Freisetzung aus den Mitochondrien
Die durch Störung der mitochondrialen Funktion (z.B. Zerstörung des inneren
transmembranen Potentials; Permeabilitätserhöhung der inneren MitochondrienMembran für kleine Proteine) aufkommenden apoptotischen Signale werden durch
das Gleichgewicht der pro- und antiapoptotischen Bcl-2/Bad Proteine erfasst. Aus
einer Verschiebung des Gleichgewichtes in Richtung Todes-Signalen (Bad, Bax)
resultiert die Freisetzung von CytC und kleinen, apoptose-induzierenden Proteinen
wie z.B. Smac/Diablo (Gross et al., 1999; Verhagen, 2000). Das freigesetzte CytC
bindet zusammen mit ATP an Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1), welches
wiederum zur Aktivierung der Initiator-Caspase-9 führt (Li et al., 1997). Dieser
cytosolische death-signalling Protein Komplex wird als Apoptosom bezeichnet
(Salvesen and Renatus, 2002). Caspase-9 aktiviert anschließend die EffektorCaspase-3, die wiederum die Effektor-Caspase-7 aktiviert.
Zusätzlich zur Freisetzung der mitochondrialen Faktoren verursacht eine Zerstörung
der inneren mitochondrialen Membranfunktion einen Verlust der zellulären
Homöostase: die ATP-Synthese wird gestoppt, redox-Moleküle wie z.B. NADH und
Glutathion werden oxidiert und ROS in erhöhtem Maße produziert. ROS verursachen
die Oxidation von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren, was die Zerstörung des
Membranpotentials im Sinne einer positiven Rückkopplung verstärkt.
142
5. Diskussion
Die antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL befinden sich an der äußeren
Mitochondrienmembran und hemmen die CytC-Freisetzung. Die proapoptotischen
Proteine wie z.B. Bad oder Bax sind im Cytosol lokalisiert, wandern aber nach
Todes-Signal Stimulation zu den Mitochondrien, wo sie eine CytC-Freisetzung
induzieren. Dies geschieht mittels Bildung von Kanälen in der MitochondrienMemebran durch Bax (Muchmore et al., 1996) oder durch Bildung eines
proapoptotischen Komplexes von Bad mit Bcl-xL. Letzteres verliert dadurch seine
antiapoptotische Funktion.
Diese Komplexbildung wird über Phosphorylierung von Bad durch Akt verhindert.
Phosphoryliertes Bad wird an 14-3-3 Proteine gebunden und kann demzufolge nicht
mehr an Bcl-2 oder Bcl-xL binden.
p38 kann Translokation von Bax zu den Mitochondrien induzieren
Die Translokation von Bax aus dem Cytosol zu den Mitochondrien könnte in einer
Konformationsänderung,
d.h.
der
Exposition
einer
versteckten
C-terminalen
Transmembrandomäne des Proteins begründet sein (Goping et al., 1998). Diese
kann durch eine p38-vermittelte Phosphorylierung der N- oder C-terminalen
Domänen von Bax zustande kommen. Die Regulation der Bax-Translokation durch
p38 wurde sowohl bei der NO- als auch bei der Cyanid-induzierten Apoptose gezeigt
(Ghatan et al., 2000; Shou et al., 2003). Ob dieser Zusammenhang auch bei der ELDL vermittelten Apoptose besteht, ist noch zu klären.
Phosphorylierung des antiapoptotischen Bcl-xL durch p38
Grethe et al. untersuchten die Rolle von p38 bei der TNF-induzierten Apoptose und
fanden neben einer Aktivierung der Caspase-3 eine Herunterregulation des
antiapoptotischen Bcl-xL, die durch Zusatz des p38-Inhibitors SB203580 gehemmt
wurde. In Immunpräzipitations-Experimenten von TNF-behandelten Zellen zeigte sich
daraufhin eine p38-abhängige Serin-Threonin-Phosphorylierung von Bcl-xL (Grethe
et al., 2004). Auch auf diese Weise wäre die Caspasen-Aktivierung durch E-LDL
denkbar.
143
5. Diskussion
E-LDL
ASK1
JNK
p38
Akt
Bax
Bax
P
Bcl-2 P
P
Bad
Bad
Bcl-xL
Bcl-xL P
Cyt C
Freisetzung
Apoptosom
Caspase-9
Caspase-3
Caspase-7
Abb. 74: Die E-LDL induzierte p38-abhängige Caspasen-Aktivierung könnte auf
unterschiedlichen Wegen ablaufen: p38 induziert die Translokation des proapoptotischen Bax
aus dem Cytosol zu den Mitochondrien, was zur Bildung von Kanälen für die CytC-Freisetzung
führt. Außerdem kann durch p38 eine Phosphorylierung des antiapoptotischen Bcl-xL erfolgen,
wodurch dessen hemmende Wirkung auf die CytC-Freisetzung aufgehoben wird. Via JNK ist
eine Phosphorylierung von Bcl-2 möglich, die ebenfalls zu einer CytC-Freisetzung führt. Da die
E-LDL induzierte Caspasen-Aktivierung p38-abhängig ist, tritt vermutlich einer der ersten
beiden Wege ein. Freigesetztes CytC induziert die Aktivierung der Initiator-Caspase-9 am
Apoptosom, was schließlich eine Aktivierung der Effektor-Caspasen-3 und -7zur Folge hat.
144
5. Diskussion
5.4 Vergleich von oxidiertem LDL mit nativem bzw. E-LDL
Um zu überprüfen, ob eine Oxidation von LDL ebenfalls die proapoptotischen Effekte
von E-LDL bewirken kann, wurde zunächst die p38-Phosphorylierung nach
Exposition der Zellen mit LDL, oxLDL und E-LDL verglichen. Erstaunlicherweise
zeigte oxLDL keinen stärkeren Effekt auf die p38-Phosphorylierung als LDL: bei
beiden Lipoproteinpräparationen war diese gleich schwach. Im Gegensatz dazu
erfolgte eine 2,5fach stärkere Aktivierung von p38 durch E-LDL, welches keine
TBARs enthielt. OxLDL hingegen wies einen TBAR-Gehalt von 9,5nmol/mg Protein
auf. Im Vergleich zu anderen Studien mit oxidiertem LDL bedeutet dies einen
mittleren bis starken Oxidationsgrad (Akiba et al., 2003). Im Gegensatz zu E-LDL
konnten gleiche Konzentrationen natives LDL bzw. oxLDL keine Auslösung der
Apoptose bewirken: weder Caspasen-Aktivierung noch DNA-Fragmentierung wurden
beobachtet.
Dies deutet darauf hin, dass die freien Fettsäuren, die mit der Auslösung der
Apoptose in Verbindung gebracht werden, nicht hauptsächlich durch oxidative
Veränderungen des LDL entstehen.
Die Auswirkungen der Oxidation auf die Struktur des LDL wurden von Steinbrecher
et al. beschrieben. Neben einer erhöhten elektorphoretischen Mobilität kommt es bei
der Oxidation von LDL u.a. zur Fragmentierung der ApoB-Komponente, zur
Hydrolyse von Phosphatidylcholin und zur Derivatisierung von Lysin-Resten
(Steinbrecher
et
al.,
1990).
Verschiedene
Arbeitsgruppen
unternahmen
Untersuchungen von oxLDL beladenen Makrophagen, um die Zusammensetzung
der in den Schaumzellen entstehenden Ablagerungen darzustellen. Anscheinend ist
die ApoB-Komponente von oxLDL ungewöhnlich resistent gegenüber lysosomaler
Proteolyse (Jialal and Chait, 1989; Lougheed et al., 1991; Jessup et al., 1992; Hoppe
et al., 1994). Dies könnte auf eine generelle Resistenz von Proteinen mit oxidierten
Aminosäuren
gegenüber
Übereinstimmend
hiermit
lysosomalen
wurde
eine
Proteasen
Akkumulation
zurückzuführen
von
ApoB
sein.
sowohl
in
Makrophagen nach Aufnahme von oxLDL (Mander et al., 1994) als auch in
atherosklerotischen Läsionen gefunden (Rosenfeld et al., 1990).
Einige Studien stellten einen relativ hohen Anteil von unverestertem Cholesterin zum
Gesamt-Cholesterin in Makrophagen nach Aufnahme von oxLDL fest (Jialal and
Chait, 1989; Roma et al., 1990; Maor et al., 1994). Dieser Befund wurde auf eine
145
5. Diskussion
lysosomale Speicherung des oxLDL bzw. des ox-LDL-Cholesterins zurückgeführt, so
dass dieses nicht als Substrat zur Veresterung durch die ACAT im Cytosol zur
Verfügung steht (Maor et al., 1994). Brown et al. zeigten, dass nach Aufnahme von
oxLDL in J774-Zellen (Maus-Makrophagen) zwar eine lysosomale Hydrolyse der
Cholesterylester stattfindet, deren cytoplasmatische Reesterifizierung jedoch durch
die Verfügbarkeit von freien Fettsäuren als Substrate der ACAT limitiert ist. Durch
Zusatz von Ölsäure zusammen mit oxLDL konnte eine deutliche Zunahme der
Cholesteryloleat-Ester nachgewiesen werden (Brown et al., 2000). Neuere
Erkenntnisse belegen, dass oxLDL in Makrophagen anscheinend die Ca²+abhängige cytosolische PLA2 aktivieren kann, was zu einer Hydrolyse von
membranständigen Phospholipiden unter Freisetzung von Ölsäure führt. Die
freigesetzte Fettsäure wird benötigt, um das bei der Endocytose von oxLDL
aufgenommene
Cholesterin
durch
die
ACAT
zu
reesterifizieren
und
als
Cholesteryloleat in Lipidtröpfchen abzulagern (Akiba et al., 2003).
Abgesehen
davon
konnte
eine
große
Menge
an
oxidierten
Sterolestern
nachgewiesen werden, die Cholesterol bzw. 7-Ketocholesterol, verestert mit
oxidierten Fettsäuren, enthalten. Diese oxidierten Sterolester akkumulieren in den
Lysosomen der Makrophagen und sind resistent gegenüber Hydrolyse (Hoppe et al.,
1997; Brown et al., 2000).
Demzufolge könnten theoretisch bei Aufnahme von oxLDL durch Makrophagen nicht
in dem Maße freie Fettsäuren entstehen, wie es bei der enzymatischen Umsetzung
von LDL zu E-LDL der Fall wäre.
Einige oxidierende Enzyme wurden bisher mit der Oxidation von LDL in Verbindung
gebracht, wie z.B. die Myeloperoxidase, NO-Synthase und 15-Lipoxygenase (15-LO)
(Heinecke, 1998; Steinberg, 1999). NO ist ein Oxidationsmittel, das sowohl in
Endothelzellen als auch in Makrophagen produziert wird und abhängig von der Art
der Entstehung unterschiedliche Effekte zeigen kann. Durch die endotheliale NOSynthase (eNOS) produziertes NO hat auf Grund seiner vasodilatatorischen Funktion
einen protektiven Effekt. Im Gegensatz dazu hat NO, das in den Makrophagen durch
die induzierbare
NO-Synthase (iNOS) hergestellt wird, durch seine oxidierenden
Eigenschaften eine antimikrobielle Funktion. Dass die iNOS zur Oxidation von LDL
beitragen kann, zeigte eine Arbeitsgruppe durch Ausschaltung des Enzyms in ApoEdefizienten Mäusen, die dadurch weniger Plaques entwickelten (Behr-Roussel et al.,
5. Diskussion
146
2000). Dieser Zusammenhang wurde in anderen Arbeitsgruppen jedoch nicht
beobachtet (Knowles et al., 2000). Eine proatherogene Funktion der 15-LO wurde in
Experimenten mit knock-out Mäusen bzw. durch Überexpression des Enzyms
gezeigt (Cyrus et al., 1999; Harats et al., 2000). Die Ausschaltung der NADPHOxidase konnte die Plaque-Bildung nicht hemmen, somit wurde dieses Enzym eher
nicht in Verbindung mit einer Oxidation von LDL gebracht (Kirk et al., 2000).
Die Rolle von oxLDL im Zusammenhang mit der Auslösung der Apoptose ist bereits
in mehreren Arbeitsgruppen untersucht worden. Takahashi et al. stellten fest, dass
Lysophosphatidylcholin (lysoPC), ein Bestandteil von odixiertem LDL, über eine
Aktivierung von p38 zur Apoptose führt (Takahashi et al., 2001; Galle et al., 1999).
Lyso-PC entsteht durch die PLA2 aus Phosphatidylcholin während der Oxidation von
LDL (Esterbauer et al., 1992). Zhao et al. zeigten eine p38-Abhängigkeit der
Schaumzellbildung durch oxLDL in J774-Zellen (Zhao et al., 2002).
Kürzlich fand eine weitere Arbeitsgruppe eine erniedrigte Expression der
antiapoptitischen Proteine Bcl-2 und IAP-1 nach Aufnahme von oxLDL über den
Scavenger-Rezeptor LOX-1 (lectin like oxLDL-receptor) von HCAEC-Zellen (human
coronary artery endothelial cells). Dies führte zur Freisetzung von CytC und Smac
und zu einer Caspase-9 Aktivierung (Chen et al., 2004). Eine erhöhte Expression des
LOX-1 Rezeptors in Endothelzellen durch oxLDL und die Hemmung dieses Vorgangs
durch Statine wurde von derselben Arbeitsgruppe zuvor gezeigt (Li and Mehta, 2000;
Li et al., 2001). Über diese Rezeptoren können anscheinend auch RemnantLipoproteinpartikel, die aus VLDL entstehen, von Endothelzellen aufgenommen
werden. Via Stimulation der NADPH-Oxidase und nachfolgender ROS-Produktion
können Remnants die Apoptose auslösen und zur Atherogenese beitragen (Shin et
al., 2004).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wiedersprechen trotzdem nicht denen der
oben genannten Arbeitsgruppen, die cytotoxische bzw. apoptoseauslösende Effekte
von oxLDL zu wesentlich späteren Zeitpunkten mit höheren Konzentrationen ermittelt
haben. In der vorliegenden Arbeit wurden sehr frühe Ereignisse untersucht. Die
Cytotoxizität des E-LDL bzw. die Auslösung der Apoptose durch die freien Fettsäuren
wurde innerhalb von Stunden sichtbar.
147
5. Diskussion
5.5 Die Bedeutung von intrazellulär entstehenden ROS
In Endothelzellen konnte nach Inkubation mit E-LDL oxidativer Stress nachgewiesen
werden,
indem
der
profluoreszierende
Farbstoff
DCF
nach
intrazellulärer
Esterspaltung und Oxidation in ein hoch-fluoreszierendes Molekül umgewandelt
wurde. In FACS-Analysen war eine deutliche Zunahme des fluoreszierenden
Produktes nach Behandlung mit E-LDL zu erkennen. Bei Inkubation mit E-LDL(d4)
kam es zur Reduktion der Fluoreszenz. Mit E-LDL(d10) behandelte Zellen
unterschieden sich geringfügig von der Behandlung mit nativem LDL und zeigten
schwache Fluoreszenz. Auch hier ist also ein fettsäure-abhängiger Anstieg des
fluoreszierenden Signals zu erkennen.
Dieser intrazellulär entstehende oxidative Stress könnte zur Abspaltung des
redoxregulierten ASK1-Inhibitors Thioredoxin führen. Auf diesem Weg wäre eine
Verbindung zwischen dem Stimulus E-LDL und der Aktivierung der MAPK-Kaskade
zu erklären. Die Tatsache, dass sowohl die ASK1- als auch die p38-Aktivierung
durch E-LDL bei Vorbehandlung der Zellen mit dem Radikalfänger N-Acetyl-Cystein
gehemmt werden konnte, spricht ebenfalls für diese Vermutung (s. Abb. 75).
Bei der Produktion der ROS könnte die membran-assoziierte NADPH-Oxidase
involviert sein. Diese kann in Phagozyten und glatten Muskelzellen durch
Arachidonsäure aktiviert werden, was eine Produktion von Superoxidradikal-Anionen
auslöst (Henderson et al., 1993; Sakata et al., 1987; Griendling et al., 1994).
Ausgehend davon fand sich in Nieren-Epithelzellen eine Aktivierung von JNK durch
Arachidonsäure, die durch die ROS-Produktion der NADPH-Oxidase vermittelt wird
und durch NAC hemmbar ist (Cui and Douglas, 1997).
Dieselbe Arbeitsgruppe zeigte in den gleichen Zellen eine durch Arachidonsäure und
Linolsäure vermittelte frühzeitige Aktivierung der MAP-Kinasen p38 und Erk, die nach
15 Min wieder basale Level erreichte (Cui and Douglas, 1997; Alexander et al.,
2001).
148
5. Diskussion
E-LDL, FFA
ROS
Trx
NAC
S SH
ASK1
P
ASK1
Trx
S-S
siRNAs
MKK4/7
MKK3/6
SB203580
ATPVerlust
P
JNK P
P
p38 P
CaspasenAktivierung
PARPSpaltung
?
DNAFragmentierung
Apoptose
Abb. 75: Nach Behandlung von Endothelzellen mit E-LDL ist ein intrazellulärer oxidativer Streß
meßbar. Durch die entstehenden Radikale könnte der ASK1-Inhibitor Thioredoxin, der über
Sulfidbrücken an ASK1 gebunden ist, oxidiert und dabei von ASK1 abgespalten werden. Die
ASK1-Aktivierung ist hemmbar durch Vorinkubation mit dem Radikalfänger NAC. Sobald ASK1
freigesetzt wird, nimmt es einen aktiven Zustand an (Autophosphorylierung) und setzt die
Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade in Gang.
149
5. Diskussion
Prinzipiell können ROS auch in Reaktion auf Streß aus Mitochondrien freigesetzt
weden. Da aber die ASK1-Aktivierung durch NAC hemmbar ist und die Messung der
E-LDL induzierten ROS-Produktion schon nach 10 Minuten Inkubation erfolgte, ist es
wahrscheinlicher, dass die membranständige NADPH-Oxidase hieran beteiligt ist.
Auch die bereits genannte Aktivierbarkeit dieses Enzyms durch Arachidonsäure
spricht für die Beteiligung der NADPH-Oxidase bei der Signalübertragung durch ELDL. Geklärt werden könnte diese Frage durch Hemmung des Enzyms mit DPI
(diphenylene iodonium). Würde in diesem Fall kein oxidativer Stress bzw. keine
ASK1-Aktivierung zustande kommen, so ist die Lage eindeutig.
Eine oxidative
Abspaltung des Trx von ASK1 könnte mittels Co-Immunpräzipitationsexperimenten
gezeigt werden, wie sie auch schon von Saitoh et al. durchgeführt wurden (Saitoh et
al., 1998; Morita et al., 2001).
Bemerkenswert ist, dass oxLDL im Vergleich zu E-LDL nur in sehr geringem Maße
oxidativen Stress in Endothelzellen auslöste. OxLDL-Behandlung führte zu einem
schwachen Fluoreszenz-Signal im Gegensatz zu nativem LDL, das keine Oxidation
von DCF bewirkte.
Eine Zunahme der O2·− Produktion durch oxidiertes LDL im Vergleich zu LDL wurde
auch schon von Galle et al.
in HUVECs (human vascular endothelial cells)
nachgewiesen (Galle et al., 1999). Jene Arbeitsgruppe erkannte Dosis-abhängig
unterschiedliche Effekte von oxLDL in Endothelzellen: geringe Menge oxLDL
(5µg/ml) induzierten Proliferation, höhere Mengen jedoch Apoptose. Die oxLDLabhängige Proliferation der Zellen sowie auch die Apoptose konnten durch
Antioxidantien oder DPI gehemmt werden, was für eine Beteiligung der NADPHOxidase in beiden Fällen sprach. Behandlung der HUVECs mit ROS, die durch die
Xanthin-Oxidase enstanden, führte ebenfalls zur Proliferation der Zellen. Der
Apoptose-auslösende
Effekt
des
oxLDL
wurde
auf
dessen
Gehalt
an
Lysophosphatidylcholin zurückgeführt (Heinloth et al., 2000; Galle et al., 2001).
Die Tatsache, dass E-LDL zu deutlich stärkerer Auslösung von intrazellulärem
oxidativen Streß als oxLDL führt, verdeutlicht die Rolle der Oxidation im
Zusammenhang mit der Apoptose: es muss zwischen einer Oxidation außerhalb und
innerhalb der Zellen unterschieden werden. LDL mag zwar außerhalb der Zellen
oxidiert werden, zur Auslösung der Apoptose ist jedoch eine Produktion von
150
5. Diskussion
intrazellulären ROS erforderlich. Durch oxidative Abspaltung von Inhibitoren
proapoptotischer Enzyme kann folglich der programmierte Zelltod ausgelöst werden.
Die Tatsache, dass eine ASK1- bzw. p38-Aktivierung durch Zusatz eines Antioxidanz
(NAC) gehemmt werden konnte, spricht für die Notwendigkeit der ROS-Produktion
bei der Auslösung der Apoptose durch E-LDL.
Die Menge der produzierten ROS scheint die Entscheidung, ob die Apoptose
ausgelöst werden soll oder nicht, wesentlich zu beeinflussen. Kleine Mengen ROS
(10-50µM H2O2) können sogar die Apoptose in Endothelzellen blockieren, indem es
zur Erhöhung der Thioredoxin-Expression kommt (Haendeler et al., 2004). Auch
Wachstumsfaktoren können zu einer Produktion von ROS führen. So kommt es z.B.
nach Stimulation von glatten Muskelzellen mit PDGF (platelet-derived growth factor)
innerhalb von Minuten zur Entstehung von H2O2 (Sundaresan et al., 1995).
Intrazelluläre Tyrosin-Phosphatasen stellen möglicherweise ein Ziel der ROS dar,
denn sie enthalten redox-sensitive Cysteine im aktiven Zentrum. Eine Funktion der
Wachstumsfaktor-induzierten ROS-Produktion könnte also die Regulation der
Tyrosin-Phosphatase Aktivität beinhalten.
Prävention der Atherosklerose mit Antioxidantien?
Die
Einnahme
von
Vitaminen
und
Mineralstoffen
als
antioxidative
Nahrungsergänzung ist nach wie vor umstritten. Eine Hemmung von oxidativen
Prozessen, die zur Auslösung der Apoptose führen, kann zwar bei Betrachtung
einzelner Signalwege eventuell angebracht sein. Allgemein gesehen aber kann eine
generelle Ausschaltung oxidations-abhängiger Vorgänge durch hohe Dosen
antioxidativer Substanzen nicht sinnvoll sein. Die Tatsache, dass ROS sowohl bei
der Vermittlung von Wachstumssignalen als auch bei der Apoptose beteiligt sein
können, spricht dafür, dass ROS nicht nur schädliche Effekte vermitteln. So dient z.B.
auch der oxidative Burst in Makrophagen zur Abtötung von Bakterien.
Eine Auflistung der bisherigen Studien mit antioxidativen Vitaminen (A, C, E) wurde
kürzlich von Duvall zusammengestellt mit dem Ergebnis, dass diese Therapie einen
geringen bis nicht vorhandenen Nutzen für die Reduktion von Kardialen Ereignissen
darstellt (Duvall, 2005). Auch die American Heart Association empfiehlt eine
ausgewogene Ernährung ohne zusätzliche Ergänzungsmittel mit Ausnahme von
Omega-3-Fettsäuren.
151
5. Diskussion
5.5 Regulation von Transkriptionsfaktoren durch E-LDL
In
dieser
Arbeit
konnte
der
Effekt
von
E-LDL
auf
zwei
verschiedene
Transkriptionsfaktoren (AP-1 und NF-κB) dargestellt werden. Dazu wurden
Reporterplasmide, die aus AP-1 bzw. NF-κB-sites gekoppelt mit einem Luciferasegen
bestehen, in Endothelzellen bzw. Makrophagen (J774-Zellen) transfiziert.
Nach
Behandlung mit E-LDL kam es zu einer Erhöhung der AP-1 abhängigen
Luciferaseexpression bei gleichzeitiger Hemmung von NF-κB-Luc. Die beobachteten
Effekte sind zwar relativ gering, stimmen aber überein mit bereits in der
Arbeitsgruppe bestehenden Daten aus elecrophoretic mobility shift assays
(Dissertation von D. Fenske). Durch Cotransfektion von FlagASK1 mit den jeweiligen
Reporterplasmiden kam es ebenfalls zu einer Aktivierung von AP-1-Luc bzw. zu einer
Hemmung von NF-κB-Luc.
Letzterer Befund wurde allerdings von Hirotani et al. nicht beobachtet: durch
Überexpression von konstitutiv aktivem ASK1 erreichte jene Arbeitsgruppe eine
Aktivierung von NF-κB. Weiterhin untersuchte jene Arbeitsgruppe die Angiotensin II
vermittelte Entstehung von ROS in neonatalen Kardiomyocyten. Demzufolge kam es
zur Aktivierung von ASK1 und zu einer anschließenden Aktivierung von NF-κB, die
die Entstehung einer kardialen Hypertrophie begünstigte (Hirotani et al., 2002).
Obwohl nach Inkubation von Endothelzellen mit E-LDL ebenfalls oxidativer Stress
entsteht, konnte in unserer Arbeitsgruppe keine Aktivierung von NF-κB gefunden
werden. D. Fenske zeigte in seiner Arbeit, dass wahrscheinlich die freien Fettsäuren
des E-LDL für die Hemmung von NF-κB verantwortlich sind, da sich bei Entzug der
FFAs mit Albumin die Hemmung von NF-κB aufhob und der Transkriptionsfaktor sich
wieder durch TNFα stimulieren ließ.
Die in dieser Arbeit beobachtete Hemmung von NF-κB durch ASK1 ließe sich durch
die bereits erwähnte Hemmung der Kinase TAK1 durch ASK1 erklären, wodurch eine
Aktivierung der NF-κB-induzierenden Kinase NIK verhindert wird (Mochida et al.,
2000).
Eine Suppression von NF-κB wurde allerdings auch schon von Heermeier et al.
beschrieben. Diese Arbeitsgruppe fand eine verminderte NF-κB Aktivität nach
Inkubation von Endothelzellen mit oxLDL oder Lysophosphatidylcholin, resultierend
in einer Reduktion der Expression des NF-κB abhängigen, antiapoptitischen Gens
152
5. Diskussion
A20. Somit wurde LPC neben der direkten Auslösung der Apoptose mit einer
Reduktion der antiapoptitischen Schutzfunktion von Endothelzellen in Verbindung
gebracht (Heermeier et al., 2001).
Eine AP-1 Aktivierung wurde bisher im Zusammenhang mit der Atherosklerose bei
der transkriptionellen Regulation von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) beobachtet
(Hall et al., 2003). Auch Bluthochdruck aktiviert MAP-Kinasen in der Gefäßwand, was
eine Erhöhung der c-fos und c-jun Genexpression bzw. eine erhöhte AP-1
Bindungsaktivität zur Folge hat (Xu et al., 1996). Eine verstärkte Expression der
Scavenger-Rezeptoren in glatten Muskelzellen durch freie Radikale wurde ebenfalls
mit einer Beteiligung von AP-1 in Verbindung gebracht (Mietus-Snyder, 1998).
Untersuchungen mit nativem LDL führten Zhu et al. durch; in electrophoretic mobility
shift assays zeigten sie, dass AP-1, nicht aber NF-kB in Endothelzellen durch LDL
induziert wird.
Nach Transfektion von AP-1-Luciferase Konstrukten konnte eine
erhöhte Expression des Reportergens nach Behandlung mit nativem LDL festgestellt
werden, die zwei Maxima, nämlich nach 6 Stunden und nach 48 Stunden enthielt.
Bei der AP-1 Bindung war in diesem Fall nur c-jun, nicht aber c-fos beteiligt (Zhu et
al., 1998).
Die freien Fettsäuren aus E-LDL besitzen eine weitere Funktion: in Depletions- und
Rekonstitutionsexperimente wurden FFAs als Auslöser der E-LDL induzierten IL-8
Produktion entdeckt (Suriyaphol et al., 2002).
Die frühzeitig in den atherosklerotischen Läsionen entstehenden freien Fettsäuren
könnten also zunächst über eine Erhöhung der IL-8 Produktion zu einer Anlockung
von Monozyten beitragen. Die Hemmung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors
NF-κB durch die freien Fettsäuren könnte eventuell mit einer nicht-entzündlichen
Abräumung des subendotheliar abgelagerten LDLs verbunden sein.
5.6 Wirkung von alpha-Toxin auf die MAPK-Kaskade
Durch
Inkubation
von
HaCat-Zellen
mit
alpha-Toxin
kam
es
zu
einer
langanhaltenden, starken p38-Phosphorylierung. Die Mutante des Toxins, die zwar
an die Zellmembran bindet, aber keine Lyse der Zellen auslöst bzw. keine Poren
bildet, konnte keine p38-Phosphorylierung bewirken. Eine maximale Aktivierung von
153
5. Diskussion
p38 durch alpha-Toxin wurde nach 1 Stunde erreicht. Zu demselben Zeitpunkt trat
auch eine JNK-Aktivierung ein, die ebenfalls von langer Dauer war. Die
Phosphorylierung der MAP-Kinase Erk erfolgte schleichend und nahm stetig bis zum
Endpunkt der durchgeführten Kinetik bei 7 Stunden zu.
Im Gegensatz zu der starken, langanhaltenden Aktivierung der MAP-Kinasen p38,
JNK und Erk erfolgte durch alpha-Toxin nur eine schwache ASK1-Phosphorylierung.
Ausschaltung von ASK1 mittels RNA-Interferenz zeigte eine schwache Abhängigkeit
der p38-Aktivierung von ASK1. Dies könnte darauf hindeuten, dass p38 auch durch
andere MAPKKKs aktiviert wird.
Durch Vorbehandlung mit einem Antioxidanz (NAC) konnte die p38-Aktivierung durch
alpha-Toxin nicht gehemmt werden, was gegen die Auslösung von oxidativem Stress
spricht. Dies ist ein wesentlicher Unterschied zur Aktivierung der MAPK-Kaskade
durch E-LDL, die wie schon beschrieben vermutlich durch oxidative Abspaltung des
Inhibitors von ASK1 erfolgt.
5.7 Kurzzeitige oder langanhaltende MAPK-Aktivierung
Bei der Durchführung einer Kinetik der p38 bzw. JNK-Phosphorylierung durch E-LDL
war auffallend, dass es zu einer frühzeitigen, langanhaltenden p38-Aktivierung und
einer späteren, nur kurzzeitigen JNK-Aktivierung kam. In diesem Fall führte die
langanhaltende
p38-Aktivierung,
die
abhängig
von
einer
starken
ASK1-
Phosphorylierung ist, zur Apoptose der Endothelzellen.
Auch in anderen Arbeitsgruppen wurde schon ein ähnlicher Effekt beobachtet.
Tobiume et al. zeigten, dass ASK1 für eine langanhaltende p38/JNK-Aktivierung
benötigt wird, die schließlich zur Apoptose in verschiedenen Zellen führt. In Zellen
aus ASK1-knock out Mäusen (ASK1-/- MEFs) unterschied sich eine kurzzeitige
Aktivierung von JNK oder p38 in Antwort auf H2O2 oder TNF nicht von der in
ASK1+/+
MEFs.
Erst
nach
45
Minuten
verringerte
sich
die
p38/JNK-
Phosphorylierung in den ASK1-/- Zellen deutlich. Diese Zellen waren außerdem
resistent gegen die H2O2- oder TNF- induzierte Apoptose (Tobiume et al., 2001). Die
frühe p38/JNK-Aktivierung erfolgte in diesem Fall wahrscheinlich kompensatorisch
über andere MAPKKKs wie z.B. MEKK1 (Xia et al., 2000; Yujiri et al., 2000).
5. Diskussion
154
Allgemein wurde eine kurze, frühzeitige JNK/p38-Aktivierung durch TNF, UV oder
Serumentzug bisher mit der Tendenz zu zellulärem Überleben in Verbindung
gebracht, wohingegen eine spätere, langanhaltende Aktivierung eher zur Apoptose
führt (Guo et al., 1998; Roulston et al., 1998; Chen et al., 1996; Xia et al., 1995).
Welche Auswirkungen die E-LDL induzierte relativ kurzzeitige JNK-Aktivierung hat,
müsste in weiteren Studien noch geklärt werden. Eine Abhängigkeit der CaspasenAktivierung bzw. der Apoptose von einer JNK-Aktivierung scheint hier nicht zu
bestehen.
Auch bei der MAP-Kinase Erk induziert eine kurzzeitige oder langanhaltende
Aktivierung unterschiedliche Effekte: bei einer transienten Erk-Aktivierung durch EGF
kommt es zur Proliferation von PC12-Zellen, wohingegen eine langanhaltende
Aktivierung durch NGF (neuronal growth factor) eine neuronale Differenzierung
verursacht (Marshall, 1995). Eine schwache bzw. hohe Expression einer konstitutiv
aktiven ASK1-Mutante erzeugte in Keratinozyten Differenzierung oder aber Apoptose
(Marshall, 1994). Andere Studien berichten, dass eine moderate Expression von
konstitutiv aktivem ASK1 über p38 Signale vermittelt, die sowohl zur neuronaler
Differenzierung als auch zum Überleben von PC12-Zellen führen (Takeda et al.,
2000; Kim et al., 2001). Allerdings wird auch in differenzierten PC12-Zellen durch
Überexpression von ASK1 die Apoptose ausgelöst (Kanamoto et al., 2000). ASK1
kommt also nicht nur beim stress-induzierten Zelltod sondern auch in einer weiten
Reihe von biologischen Aktivitäten eine wichtige Rolle zu.
Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass es wegen der schwachen ASK1Aktivierung durch alpha-Toxin nicht in dem Maße wie bei E-LDL zur Apoptose in
HaCat-Zellen kommt, sondern dass alpha-Toxin eventuell über p38 Signale zur
Zellteilung vermittelt.
Die Dauer bzw. das Ausmaß der Aktivierung der einzelnen MAP-Kinasen scheinen
die Entscheidung zwischen dem Überleben der Zelle und Auslösung der Apoptose
wesentlich zu beeinflussen. MAPK-Signalwege funktionieren nicht isoliert, sie sind
integriert in ein zelluläres Signal-Netzwerk. Zellen empfangen ständig eine Vielzahl
von verschiedenen Signalen. Die resultierenden Antworten entstehen durch
Interaktionen der verschiedenen Signalwege. Schon geringfügige Änderungen im
5. Diskussion
155
Gleichgewicht der Stimulation der Zellen kann die Entscheidung zwischen Überleben
der Zelle oder Apoptose beeinflussen. Da die MAPK in so vielen Fällen eine wichtige
Rolle spielen, können Störungen in der Signalübertragung zu schwerwiegenden
pathologischen Konsequenzen führen. Aus diesem Grund sind MAPK zu einem
wichtigen therapeutischen Angriffspunkt geworden.
156
6. Zusammenfassung und Ausblick
Subendothelial
in
den
Arterienwänden
abgelagertes
LDL
unterliegt
einer
enzymatischen Modifikation, die es in einen cytotoxischen Partikel überführt. In vitro
Behandlung von LDL mit Proteasen (Trypsin) und Cholesterinesterase führt zu einem
dem läsionalen LDL ähnlichen Produkt, dem E-LDL. Die Behandlung von
Endothelzellen mit E-LDL, das einen hohen Gehalt an freiem Cholesterin und freien
Fettsäuren
aufweist,
resultiert
in
der
Auslösung
von
Apoptose
durch
Signalübertragung via MAPK-Kaskade (ASK1/p38) und mitochondrialer CaspasenAktivierung. Natives oder oxidiertes LDL konnte bei gleicher Konzentration keinen
programmierten Zelltod induzieren.
Nach Inkubation von Endothelzellen mit E-LDL kommt es zur Entstehung von
oxidativem Stress. Die dabei produzierten reaktiven Sauerstoffspezies sind
wahrscheinlich der Auslöser für eine Aktivierung von ASK1, indem Thioredoxin, ein
redox-sensibler Inhibitor von ASK1, abgespalten wird. Durch Vorbehandlung mit NAC
läßt sich die Aktivierung sowohl von ASK1 als auch von p38 durch E-LDL blockieren.
Die Apoptose wird ausgelöst durch die ASK1-abhängige Phosphorylierung der p38MAP Kinase. Über eine p38-abhängige Aktivierung der Effektor-Caspasen-3/-7
kommt es schließlich zur Fragmentierung der DNA (TUNEL-Assay) und zur Spaltung
von nukleären Enzymen (PARP). Ein weiteres Merkmal der E-LDL induzierten
Apoptose ist neben dem Verlust von zellulärem ATP die Exposition von
Phosphatidylserin auf der äußeren Zellmembran (Annexin-Assay). Behandlung der
Endothelzellen mit nativem oder oxLDL führt jeweils zu einer deutlich schwächeren
ASK1- bzw. p38-Phosphorylierung als E-LDL.
Durch Entfernen der freien Fettsäuren aus E-LDL mittels Albumin wurden weniger
toxische Lipoproteinderivate hergestellt: E-LDL(d4) bzw. E-LDL(d10). Behandlung
von Endothelzellen mit diesen Präparationen führte zu deutlich geringeren ATPVerlusten im Vergleich zu E-LDL. Auch die ASK1- und p38 –Phosphorylierung sowie
die Aktivierung der Caspase-3/-7 verringerte sich mit abnehmender Konzentration
von freien Fettsäuren. Die schwache ASK1-bzw. p38 durch natives LDL konnte durch
Depletion der freien Fettsäuren aus LDL fast komplett reduziert werden. In
Rekonstitutionsexperimenten, d.h. nach Wiederhinzufügen der Fettsäuren, zeigten
157
sich wieder die ursprünglichen Effekte. Die Behandlung von Endothelzellen mit freien
Fettsäuren alleine führt ebenfalls über eine Aktivierung von ASK1 und p38 zur
Apoptose. Den freien Fettsäuren aus E-LDL kommt somit eine Triggerfunktion bei
der Auslösung der Apoptose zu.
Durch Blockade der MAPK-Kaskade (Ausschaltung von ASK1 mit siRNAs;
Hemmung von p38 mit SB203580) konnten die Zellen vor dem programmierten
Zelltod gerettet werden.
Die Rolle der JNK-Aktivierung durch E-LDL im Zusammenhang mit der Auslösung
der Apoptose ist unklar und bleibt ein Gegenstand weiterer Untersuchungen.
In Ergänzung zu bereits in der Arbeitsgruppe bestehenden Daten konnte mittels
Reporterplasmiden eine Aktivierung von AP-1 bzw. eine Hemmung von NF-κB durch
E-LDL in Form einer erhöhten bzw. verminderten Luciferase-Expression gezeigt
werden. Cotransfektion von FlagASK1 mit AP-1-Luc bzw. NF-κB-Luc resultierte in
einer Aktivierung der
AP-1-abhängigen und in einer Hemmung der NF-κB-
abhängigen Luciferaseexpression.
Der Effekt von alpha-Toxin, einem anderen Forschungsgebiet der Arbeitsgruppe, auf
die MAPK-Kaskade zeigte einige Abweichungen zu der durch E-LDL ausgelösten
Signalübertragung. Die Unterschiede bestehen zum einen in der schwächeren
Aktivierung von ASK1 bei gleich starker p38-Phosphorylierung. Andererseits läßt sich
die p38-Phosphorylierung nicht wie bei E-LDL durch Vorbehandlung mit NAC
hemmen. Durch alpha-Toxin erfolgt eine längeranhaltende JNK-Aktivierung als durch
E-LDL. Die Abhängigkeit der p38-Phosphorylierung von ASK1 nach ToxinBehandlung scheint jedoch gegeben zu sein.
Zusammenfassend bietet sich nun ein einfacher, bisher unerkannter Zusammenhang
an zwischen der subendothelialen Ablagerung des LDL und der Apoptose von
benachbarten Zellen. Letztere entsteht, wenn die Menge des abgelagerten Lipids
einen bestimmten Schwellenwert überschreitet, so dass es, verursacht durch lokal
vorhandene Proteasen und Cholesterinesterase, zur Freisetzung von toxischen
Konzentrationen an freien Fettsäuren kommt. Ob der hier dargestellte Signalweg
158
auch in anderen Zellen innerhalb von atherosklerotischen Läsionen bzw. eine
generelle Anwendung findet, sobald hohe Konzentrationen von freien Fettsäuren auf
Zellen treffen, ist ein Gegenstand weiterer Untersuchungen. Der Befund, dass bei
Blockade der MAPK-Kaskade eine Hemmung der Apoptose erfolgt, ist von großer
Bedeutung für mögliche therapeutische Maßnahmen.
7. Veröffentlichung
159
7. Veröffentlichung von Ergebnissen dieser Arbeit
Cell Death and Differentiation advance online publication 22 April 2005; doi:
10.1038/sj.cdd.4401633
Fatty acids liberated from low-density lipoprotein trigger
endothelial apoptosis via mitogen-activated protein
kinases
Edited by P Nicotera
K Dersch1, H Ichijo2, S Bhakdi1 and M Husmann1
1.
1
Institute of Medical Microbiology and Hygiene, Johannes GutenbergUniversity Mainz, Hochhaus am Augustusplatz, 55131 Mainz, Germany
2. 2Laboratory of Cell Signaling Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
The University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan
Correspondence: Dr M Husmann, Institute of Medical Microbiology and Hygiene
Johannes Gutenberg-University Mainz, Hochhaus am Augustusplatz, 55131 Mainz,
Germany. Tel: +49-6131-3933128; Fax: +49-6131-3932359; E-mail:
[email protected]
Received 11 November 2004; Revised 02 March 2005; Accepted 04 March 2005;
Published online 22 April 2005.
Abstract
Enzymatic modification of low-density lipoprotein (LDL) as it probably occurs in the
arterial intima drastically increases its cytotoxicity, which could be relevant for the
progression of atherosclerotic lesions. LDL was treated with a protease and
cholesterylesterase to generate a derivative similar to lesional LDL, with a high
content of free cholesterol and fatty acids. Exposure of endothelial cells to the
enzymatically modified lipoprotein (E-LDL), but not to native or oxidized LDL, resulted
in programmed cell death. Apoptosis was triggered by apoptosis signal-regulating
kinase 1 dependent phosphorylation of p38. Depletion and reconstitution
experiments identified free fatty acids (FFA) as the triggers of this pathway. Levels of
FFA in native LDL are low and the lipoprotein is therefore not cytotoxic; enzymatic
cleavage of cholesterylesters liberates FFA that can rapidly trigger an apoptosis
signaling cascade in neighboring cells. Blockade of this pathway can rescue cells
from death.
Keywords: enzymatically modified LDL, free fatty acids; Endothelial cells, apoptosis;
P38, apoptosis signal-regulating kinase 1
8. Literaturverzeichnis
Aitken, A. (1995) 14-3-3 proteins on the MAP. Trends Biochem Sci, 20, 95-97.
Akiba, S., Yoneda, Y., Ohno, S., Nemoto, M. and Sato, T. (2003) Oxidized LDL
activates phospholipase A2 to supply fatty acids required for cholesterol
esterification. J Lipid Res, 44, 1676-1685.
Alexander, L.D., Cui, X.L., Falck, J.R. and Douglas, J.G. (2001) Arachidonic acid
directly activates members of the mitogen-activated protein kinase superfamily
in rabbit proximal tubule cells. Kidney Int, 59, 2039-2053.
Alving, C.R., Richards, R.L. and Guirguis, A.A. (1977) Cholesterol-dependent human
complement activation resulting in damage to liposomal model membranes. J
Immunol, 118, 342-347.
Angel, P. and Karin, M. (1991) The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cellproliferation and transformation. Biochim Biophys Acta, 1072, 129-157.
Baeuerle, P.A. and Baltimore, D. (1988) I kappa B: a specific inhibitor of the NFkappa B transcription factor. Science, 242, 540-546.
Baker, S.J. and Reddy, E.P. (1998) Modulation of life and death by the TNF receptor
superfamily. Oncogene, 17, 3261-3270.
Baumstark, M.W., Kreutz, W., Berg, A. and Keul, J. (1991) Symmetry of the surface,
and structure of the central core of human LDL particles, analyzed by X-ray
small angle scattering. Adv Exp Med Biol, 285, 123-130.
Bayraktutan, U., Blayney, L. and Shah, A.M. (2000) Molecular characterization and
localization of the NAD(P)H oxidase components gp91-phox and p22-phox in
endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20, 1903-1911.
Beg, A.A. and Baldwin, A.S., Jr. (1993) The I kappa B proteins: multifunctional
regulators of Rel/NF-kappa B transcription factors. Genes Dev, 7, 2064-2070.
Behr-Roussel, D., Rupin, A., Simonet, S., Bonhomme, E., Coumailleau, S., Cordi, A.,
Serkiz, B., Fabiani, J.N. and Verbeuren, T.J. (2000) Effect of chronic treatment
with the inducible nitric oxide synthase inhibitor N-iminoethyl-L-lysine or with Larginine on progression of coronary and aortic atherosclerosis in
hypercholesterolemic rabbits. Circulation, 102, 1033-1038.
Bennett, M.R. (1999) Apoptosis of vascular smooth muscle cells in vascular
remodelling and atherosclerotic plaque rupture. Cardiovasc Res, 41, 361-368.
Bennett, M.R. (2001) Reactive oxygen species and death: oxidative DNA damage in
atherosclerosis. Circ Res, 88, 648-650.
Berliner, J.A., Territo, M.C., Sevanian, A., Ramin, S., Kim, J.A., Bamshad, B.,
Esterson, M. and Fogelman, A.M. (1990) Minimally modified low density
lipoprotein stimulates monocyte endothelial interactions. J Clin Invest, 85,
1260-1266.
Bhakdi, S. (1998) Complement and atherogenesis: the unknown connection. Ann
Med, 30, 503-507.
Bhakdi, S., Dorweiler, B., Kirchmann, R., Torzewski, J., Weise, E., Tranum-Jensen,
J., Walev, I. and Wieland, E. (1995) On the pathogenesis of atherosclerosis:
enzymatic transformation of human low density lipoprotein to an atherogenic
moiety. J Exp Med, 182, 1959-1971.
Bhakdi, S., Torzewski, M., Klouche, M. and Hemmes, M. (1999) Complement and
atherogenesis: binding of CRP to degraded, nonoxidized LDL enhances
complement activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 19, 2348-2354.
Bombeli, T., Karsan, A., Tait, J.F. and Harlan, J.M. (1997) Apoptotic vascular
endothelial cells become procoagulant. Blood, 89, 2429-2442.
Bombeli, T., Schwartz, B.R. and Harlan, J.M. (1999) Endothelial cells undergoing
apoptosis become proadhesive for nonactivated platelets. Blood, 93, 38313838.
Boulanger, C.M., Scoazec, A., Ebrahimian, T., Henry, P., Mathieu, E., Tedgui, A. and
Mallat, Z. (2001) Circulating microparticles from patients with myocardial
infarction cause endothelial dysfunction. Circulation, 104, 2649-2652.
Bratton, S.B., MacFarlane, M., Cain, K. and Cohen, G.M. (2000) Protein complexes
activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced
apoptosis. Exp Cell Res, 256, 27-33.
Brockman, J.A., Scherer, D.C., McKinsey, T.A., Hall, S.M., Qi, X., Lee, W.Y. and
Ballard, D.W. (1995) Coupling of a signal response domain in I kappa B alpha
to multiple pathways for NF-kappa B activation. Mol Cell Biol, 15, 2809-2818.
Brown, A.J., Mander, E.L., Gelissen, I.C., Kritharides, L., Dean, R.T. and Jessup, W.
(2000) Cholesterol and oxysterol metabolism and subcellular distribution in
macrophage foam cells. Accumulation of oxidized esters in lysosomes. J Lipid
Res, 41, 226-237.
Brown, G. (1985) A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Nobel
lecture, 9. December.
Brown, M.S. and Goldstein, J.L. (1997) The SREBP pathway: regulation of
cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription
factor. Cell, 89, 331-340.
Brown, R.T., Ades, I.Z. and Nordan, R.P. (1995) An acute phase response factor/NFkappa B site downstream of the junB gene that mediates responsiveness to
interleukin-6 in a murine plasmacytoma. J Biol Chem, 270, 31129-31135.
Cai, H. and Harrison, D.G. (2000) Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:
the role of oxidant stress. Circ Res, 87, 840-844.
Carmeliet, P. (2000) Proteinases in cardiovascular aneurysms and rupture: targets
for therapy? J Clin Invest, 105, 1519-1520.
Chang, H.Y., Nishitoh, H., Yang, X., Ichijo, H. and Baltimore, D. (1998) Activation of
apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) by the adapter protein Daxx.
Science, 281, 1860-1863.
Chao, F.F., Amende, L.M., Blanchette-Mackie, E.J., Skarlatos, S.I., Gamble, W.,
Resau, J.H., Mergner, W.T. and Kruth, H.S. (1988) Unesterified cholesterolrich lipid particles in atherosclerotic lesions of human and rabbit aortas. Am J
Pathol, 131, 73-83.
Chen, C.G., Malliaros, J., Katerelos, M., d'Apice, A.J. and Pearse, M.J. (1996a)
Mutation at ser32 of I kappa B alpha blocks NF-kappa B activation. Transplant
Proc, 28, 615-616.
Chen, J., Fujii, K., Zhang, L., Roberts, T. and Fu, H. (2001) Raf-1 promotes cell
survival by antagonizing apoptosis signal-regulating kinase 1 through a MEKERK independent mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 7783-7788.
Chen, M., Masaki, T. and Sawamura, T. (2002) LOX-1, the receptor for oxidized lowdensity lipoprotein identified from endothelial cells: implications in endothelial
dysfunction and atherosclerosis. Pharmacol Ther, 95, 89-100.
Chen, Y.R., Wang, X., Templeton, D., Davis, R.J. and Tan, T.H. (1996b) The role of
c-Jun N-terminal kinase (JNK) in apoptosis induced by ultraviolet C and
gamma radiation. Duration of JNK activation may determine cell death and
proliferation. J Biol Chem, 271, 31929-31936.
Chinkers, M. (2001) Protein phosphatase 5 in signal transduction. Trends Endocrinol
Metab, 12, 28-32.
Collins, R.G., Velji, R., Guevara, N.V., Hicks, M.J., Chan, L. and Beaudet, A.L. (2000)
P-Selectin or intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 deficiency substantially
protects against atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. J Exp Med,
191, 189-194.
Cui, X.L. and Douglas, J.G. (1997) Arachidonic acid activates c-jun N-terminal kinase
through NADPH oxidase in rabbit proximal tubular epithelial cells. Proc Natl
Acad Sci U S A, 94, 3771-3776.
Cybulsky, M.I. and Gimbrone, M.A., Jr. (1991) Endothelial expression of a
mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherogenesis. Science,
251, 788-791.
Cyrus, T., Witztum, J.L., Rader, D.J., Tangirala, R., Fazio, S., Linton, M.F. and Funk,
C.D. (1999) Disruption of the 12/15-lipoxygenase gene diminishes
atherosclerosis in apo E-deficient mice. J Clin Invest, 103, 1597-1604.
Das, A.K., Cohen, P.W. and Barford, D. (1998) The structure of the tetratricopeptide
repeats of protein phosphatase 5: implications for TPR-mediated proteinprotein interactions. Embo J, 17, 1192-1199.
Davies, M.J., Richardson, P.D., Woolf, N., Katz, D.R. and Mann, J. (1993) Risk of
thrombosis in human atherosclerotic plaques: role of extracellular lipid,
macrophage, and smooth muscle cell content. Br Heart J, 69, 377-381.
de Villiers, W.J. and Smart, E.J. (1999) Macrophage scavenger receptors and foam
cell formation. J Leukoc Biol, 66, 740-746.
Degitz, K., Li, L.J. and Caughman, S.W. (1991) Cloning and characterization of the
5'-transcriptional regulatory region of the human intercellular adhesion
molecule 1 gene. J Biol Chem, 266, 14024-14030.
Deveraux, Q.L., Roy, N., Stennicke, H.R., Van Arsdale, T., Zhou, Q., Srinivasula,
S.M., Alnemri, E.S., Salvesen, G.S. and Reed, J.C. (1998) IAPs block
apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition
of distinct caspases. Embo J, 17, 2215-2223.
Dimmeler, S., Haendeler, J. and Zeiher, A.M. (2002) Regulation of endothelial cell
apoptosis in atherothrombosis. Curr Opin Lipidol, 13, 531-536.
Dimmeler, S. and Zeiher, A.M. (1997) Nitric oxide and apoptosis: another paradigm
for the double-edged role of nitric oxide. Nitric Oxide, 1, 275-281.
Dimmeler, S. and Zeiher, A.M. (1999) Nitric oxide-an endothelial cell survival factor.
Cell Death Differ, 6, 964-968.
Dong, Z.M., Chapman, S.M., Brown, A.A., Frenette, P.S., Hynes, R.O. and Wagner,
D.D. (1998) The combined role of P- and E-selectins in atherosclerosis. J Clin
Invest, 102, 145-152.
Dorion, S., Lambert, H. and Landry, J. (2002) Activation of the p38 signaling pathway
by heat shock involves the dissociation of glutathione S-transferase Mu from
Ask1. J Biol Chem, 277, 30792-30797.
Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L. and Wang, X. (2000) Smac, a mitochondrial protein
that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP
inhibition. Cell, 102, 33-42.
Dudek, H., Datta, S.R., Franke, T.F., Birnbaum, M.J., Yao, R., Cooper, G.M., Segal,
R.A., Kaplan, D.R. and Greenberg, M.E. (1997) Regulation of neuronal
survival by the serine-threonine protein kinase Akt. Science, 275, 661-665.
Duvall, W.L. (2005) Endothelial dysfunction and antioxidants. Mt Sinai J Med, 72, 7180.
Earnshaw, W.C., Martins, L.M. and Kaufmann, S.H. (1999) Mammalian caspases:
structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev
Biochem, 68, 383-424.
Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T.
(2001a) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in
cultured mammalian cells. Nature, 411, 494-498.
Elbashir, S.M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. and Tuschl, T. (2001b)
Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila
melanogaster embryo lysate. Embo J, 20, 6877-6888.
Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H. and Jurgens, G. (1992) The role of lipid
peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic Biol
Med, 13, 341-390.
Febbraio, M., Podrez, E.A., Smith, J.D., Hajjar, D.P., Hazen, S.L., Hoff, H.F.,
Sharma, K. and Silverstein, R.L. (2000) Targeted disruption of the class B
scavenger receptor CD36 protects against atherosclerotic lesion development
in mice. J Clin Invest, 105, 1049-1056.
Fenske, D. (2001) Enzymatisch modifiziertes LDL induziert IL-8 in Endothelzellen bei
Hemmung von NF-kB und Induktion von AP-1. Dissertation im Fachbereich
Medizin, Joh.Gutenberg Universität Mainz.
Finco, T.S., Beg, A.A. and Baldwin, A.S., Jr. (1994) Inducible phosphorylation of I
kappa B alpha is not sufficient for its dissociation from NF-kappa B and is
inhibited by protease inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 11884-11888.
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E. and Mello, C.C. (1998)
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans. Nature, 391, 806-811.
Forman, H.J. and Torres, M. (2002) Reactive oxygen species and cell signaling:
respiratory burst in macrophage signaling. Am J Respir Crit Care Med, 166,
S4-8.
Fournet-Bourguignon, M.P., Castedo-Delrieu, M., Bidouard, J.P., Leonce, S.,
Saboureau, D., Delescluse, I., Vilaine, J.P. and Vanhoutte, P.M. (2000)
Phenotypic and functional changes in regenerated porcine coronary
endothelial cells : increased uptake of modified LDL and reduced production of
NO. Circ Res, 86, 854-861.
Frank, J.S. and Fogelman, A.M. (1989) Ultrastructure of the intima in WHHL and
cholesterol-fed rabbit aortas prepared by ultra-rapid freezing and freezeetching. J Lipid Res, 30, 967-978.
Franke, T.F., Kaplan, D.R. and Cantley, L.C. (1997) PI3K: downstream AKTion
blocks apoptosis. Cell, 88, 435-437.
Fukuda, H., Shima, H., Vesonder, R.F., Tokuda, H., Nishino, H., Katoh, S., Tamura,
S., Sugimura, T. and Nagao, M. (1996) Inhibition of protein serine/threonine
phosphatases by fumonisin B1, a mycotoxin. Biochem Biophys Res Commun,
220, 160-165.
Galis, Z.S., Sukhova, G.K., Lark, M.W. and Libby, P. (1994) Increased expression of
matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions
of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest, 94, 2493-2503.
Galle, J., Heinloth, A., Wanner, C. and Heermeier, K. (2001) Dual effect of oxidized
LDL on cell cycle in human endothelial cells through oxidative stress. Kidney
Int Suppl, 78, S120-123.
Galle, J., Schneider, R., Heinloth, A., Wanner, C., Galle, P.R., Conzelmann, E.,
Dimmeler, S. and Heermeier, K. (1999) Lp(a) and LDL induce apoptosis in
human endothelial cells and in rabbit aorta: role of oxidative stress. Kidney Int,
55, 1450-1461.
Garcia-Cardena, G., Comander, J.I., Blackman, B.R., Anderson, K.R. and Gimbrone,
M.A. (2001) Mechanosensitive endothelial gene expression profiles: scripts for
the role of hemodynamics in atherogenesis? Ann N Y Acad Sci, 947, 1-6.
Ghatan, S., Larner, S., Kinoshita, Y., Hetman, M., Patel, L., Xia, Z., Youle, R.J. and
Morrison, R.S. (2000) p38 MAP kinase mediates bax translocation in nitric
oxide-induced apoptosis in neurons. J Cell Biol, 150, 335-347.
Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D.P. and Ku, D.N. (1988) Hemodynamics and
atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human
arteries. Arch Pathol Lab Med, 112, 1018-1031.
Glass, C.K. and Witztum, J.L. (2001) Atherosclerosis. the road ahead. Cell, 104, 503516.
Gluecksmann, A. (1951) Cell death in normal vertebrate ontogeny. Biological
Reviews, 26, 59-86.
Goldstein, J.L. and Brown, M.S. (1977) Atherosclerosis: the low-density lipoprotein
receptor hypothesis. Metabolism, 26, 1257-1275.
Goldstein, J.L., Ho, Y.K., Basu, S.K. and Brown, M.S. (1979) Binding site on
macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density
lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proc Natl Acad Sci U S
A, 76, 333-337.
Goossens, V., Grooten, J., De Vos, K. and Fiers, W. (1995) Direct evidence for tumor
necrosis factor-induced mitochondrial reactive oxygen intermediates and their
involvement in cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 8115-8119.
Goping, I.S., Gross, A., Lavoie, J.N., Nguyen, M., Jemmerson, R., Roth, K.,
Korsmeyer, S.J. and Shore, G.C. (1998) Regulated targeting of BAX to
mitochondria. J Cell Biol, 143, 207-215.
Gould, A.L., Rossouw, J.E., Santanello, N.C., Heyse, J.F. and Furberg, C.D. (1998)
Cholesterol reduction yields clinical benefit: impact of statin trials. Circulation,
97, 946-952.
Greaves, D.R., Gough, P.J. and Gordon, S. (1998) Recent progress in defining the
role of scavenger receptors in lipid transport, atherosclerosis and host
defence. Curr Opin Lipidol, 9, 425-432.
Grethe, S., Ares, M.P., Andersson, T. and Porn-Ares, M.I. (2004) p38 MAPK
mediates TNF-induced apoptosis in endothelial cells via phosphorylation and
downregulation of Bcl-x(L). Exp Cell Res, 298, 632-642.
Griendling, K.K., Minieri, C.A., Ollerenshaw, J.D. and Alexander, R.W. (1994)
Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured
vascular smooth muscle cells. Circ Res, 74, 1141-1148.
Griendling, K.K., Sorescu, D. and Ushio-Fukai, M. (2000) NAD(P)H oxidase: role in
cardiovascular biology and disease. Circ Res, 86, 494-501.
Griendling, K.K. and Ushio-Fukai, M. (1998) Redox control of vascular smooth
muscle proliferation. J Lab Clin Med, 132, 9-15.
Guicciardi, M.E. and Gores, G.J. (2003) AIP1: a new player in TNF signaling. J Clin
Invest, 111, 1813-1815.
Guo, J.H., Wang, H.Y. and Malbon, C.C. (1998) Conditional, tissue-specific
expression of Q205L Galphai2 in vivo mimics insulin activation of c-Jun Nterminal kinase and p38 kinase. J Biol Chem, 273, 16487-16493.
Gupta, S., Barrett, T., Whitmarsh, A.J., Cavanagh, J., Sluss, H.K., Derijard, B. and
Davis, R.J. (1996) Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with
transcription factors. Embo J, 15, 2760-2770.
Haendeler, J., Hoffmann, J., Tischler, V., Berk, B.C., Zeiher, A.M. and Dimmeler, S.
(2002) Redox regulatory and anti-apoptotic functions of thioredoxin depend on
S-nitrosylation at cysteine 69. Nat Cell Biol, 4, 743-749.
Haendeler, J., Tischler, V., Hoffmann, J., Zeiher, A.M. and Dimmeler, S. (2004) Low
doses of reactive oxygen species protect endothelial cells from apoptosis by
increasing thioredoxin-1 expression. FEBS Lett, 577, 427-433.
Hai, T. and Curran, T. (1991) Cross-family dimerization of transcription factors
Fos/Jun and ATF/CREB alters DNA binding specificity. Proc Natl Acad Sci U S
A, 88, 3720-3724.
Hall, M.C., Young, D.A., Waters, J.G., Rowan, A.D., Chantry, A., Edwards, D.R. and
Clark, I.M. (2003) The comparative role of activator protein 1 and Smad
factors in the regulation of Timp-1 and MMP-1 gene expression by
transforming growth factor-beta 1. J Biol Chem, 278, 10304-10313.
Hammond, S.M., Bernstein, E., Beach, D. and Hannon, G.J. (2000) An RNA-directed
nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.
Nature, 404, 293-296.
Han, S.R., Momeni, A., Strach, K., Suriyaphol, P., Fenske, D., Paprotka, K.,
Hashimoto, S.I., Torzewski, M., Bhakdi, S. and Husmann, M. (2003)
Enzymatically modified LDL induces cathepsin H in human monocytes:
potential relevance in early atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 23,
661-667.
Hansson, G.K. (1997) Cell-mediated immunity in atherosclerosis. Curr Opin Lipidol,
8, 301-311.
Harats, D., Shaish, A., George, J., Mulkins, M., Kurihara, H., Levkovitz, H. and Sigal,
E. (2000) Overexpression of 15-lipoxygenase in vascular endothelium
accelerates early atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arterioscler
Thromb Vasc Biol, 20, 2100-2105.
Hatai, T., Matsuzawa, A., Inoshita, S., Mochida, Y., Kuroda, T., Sakamaki, K., Kuida,
K., Yonehara, S., Ichijo, H. and Takeda, K. (2000) Execution of apoptosis
signal-regulating kinase 1 (ASK1)-induced apoptosis by the mitochondriadependent caspase activation. J Biol Chem, 275, 26576-26581.
Havel, R.J., Eder, H.A. and Bragdon, J.H. (1955) The distribution and chemical
composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin
Invest, 34, 1345-1353.
Haworth, R., Platt, N., Keshav, S., Hughes, D., Darley, E., Suzuki, H., Kurihara, Y.,
Kodama, T. and Gordon, S. (1997) The macrophage scavenger receptor type
A is expressed by activated macrophages and protects the host against lethal
endotoxic shock. J Exp Med, 186, 1431-1439.
Heermeier, K., Leicht, W., Palmetshofer, A., Ullrich, M., Wanner, C. and Galle, J.
(2001) Oxidized LDL suppresses NF-kappaB and overcomes protection from
apoptosis in activated endothelial cells. J Am Soc Nephrol, 12, 456-463.
Heinecke, J.W. (1998) Oxidants and antioxidants in the pathogenesis of
atherosclerosis: implications for the oxidized low density lipoprotein
hypothesis. Atherosclerosis, 141, 1-15.
Heinloth, A., Heermeier, K., Raff, U., Wanner, C. and Galle, J. (2000) Stimulation of
NADPH oxidase by oxidized low-density lipoprotein induces proliferation of
human vascular endothelial cells. J Am Soc Nephrol, 11, 1819-1825.
Henderson, L.M., Moule, S.K. and Chappell, J.B. (1993) The immediate activator of
the NADPH oxidase is arachidonate not phosphorylation. Eur J Biochem, 211,
157-162.
Hirotani, S., Otsu, K., Nishida, K., Higuchi, Y., Morita, T., Nakayama, H., Yamaguchi,
O., Mano, T., Matsumura, Y., Ueno, H., Tada, M. and Hori, M. (2002)
Involvement of nuclear factor-kappaB and apoptosis signal-regulating kinase 1
in G-protein-coupled receptor agonist-induced cardiomyocyte hypertrophy.
Circulation, 105, 509-515.
Hladovec, J., Prerovsky, I., Stanek, V. and Fabian, J. (1978) Circulating endothelial
cells in acute myocardial infarction and angina pectoris. Klin Wochenschr, 56,
1033-1036.
Hoppe, G., O'Neil, J. and Hoff, H.F. (1994) Inactivation of lysosomal proteases by
oxidized low density lipoprotein is partially responsible for its poor degradation
by mouse peritoneal macrophages. J Clin Invest, 94, 1506-1512.
Hoppe, G., Ravandi, A., Herrera, D., Kuksis, A. and Hoff, H.F. (1997) Oxidation
products of cholesteryl linoleate are resistant to hydrolysis in macrophages,
form complexes with proteins, and are present in human atherosclerotic
lesions. J Lipid Res, 38, 1347-1360.
Huang, H., Joazeiro, C.A., Bonfoco, E., Kamada, S., Leverson, J.D. and Hunter, T.
(2000) The inhibitor of apoptosis, cIAP2, functions as a ubiquitin-protein ligase
and promotes in vitro monoubiquitination of caspases 3 and 7. J Biol Chem,
275, 26661-26664.
Ichijo, H., Nishida, E., Irie, K., ten Dijke, P., Saitoh, M., Moriguchi, T., Takagi, M.,
Matsumoto, K., Miyazono, K. and Gotoh, Y. (1997) Induction of apoptosis by
ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling
pathways. Science, 275, 90-94.
Jacobson, M.D. and Raff, M.C. (1995) Programmed cell death and Bcl-2 protection in
very low oxygen. Nature, 374, 814-816.
Jessup, W., Mander, E.L. and Dean, R.T. (1992) The intracellular storage and
turnover of apolipoprotein B of oxidized LDL in macrophages. Biochim Biophys
Acta, 1126, 167-177.
Jha, P., Flather, M., Lonn, E., Farkouh, M. and Yusuf, S. (1995) The antioxidant
vitamins and cardiovascular disease. A critical review of epidemiologic and
clinical trial data. Ann Intern Med, 123, 860-872.
Jialal, I. and Chait, A. (1989) Differences in the metabolism of oxidatively modified
low density lipoprotein and acetylated low density lipoprotein by human
endothelial cells: inhibition of cholesterol esterification by oxidatively modified
low density lipoprotein. J Lipid Res, 30, 1561-1568.
Jing, Q., Xin, S.M., Cheng, Z.J., Zhang, W.B., Zhang, R., Qin, Y.W. and Pei, G.
(1999) Activation of p38 mitogen-activated protein kinase by oxidized LDL in
vascular smooth muscle cells: mediation via pertussis toxin-sensitive G
proteins and association with oxidized LDL-induced cytotoxicity. Circ Res, 84,
831-839.
Jorgensen, R. (1990) Altered gene expression in plants due to trans interactions
between homologous genes. Trends Biotechnol, 8, 340-344.
Kanamoto, T., Mota, M., Takeda, K., Rubin, L.L., Miyazono, K., Ichijo, H. and
Bazenet, C.E. (2000) Role of apoptosis signal-regulating kinase in regulation
of the c-Jun N-terminal kinase pathway and apoptosis in sympathetic neurons.
Mol Cell Biol, 20, 196-204.
Kang, H., Sayner, S.L., Gross, K.L., Russell, L.C. and Chinkers, M. (2001)
Identification of amino acids in the tetratricopeptide repeat and C-terminal
domains of protein phosphatase 5 involved in autoinhibition and lipid
activation. Biochemistry, 40, 10485-10490.
Karin, M. (1995) The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases.
J Biol Chem, 270, 16483-16486.
Karin, M., Liu, Z. and Zandi, E. (1997) AP-1 function and regulation. Curr Opin Cell
Biol, 9, 240-246.
Kaufman, R.J. (1999) Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum:
coordination of gene transcriptional and translational controls. Genes Dev, 13,
1211-1233.
Kerr, J.F., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological
phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 26,
239-257.
Kim, A.H., Khursigara, G., Sun, X., Franke, T.F. and Chao, M.V. (2001) Akt
phosphorylates and negatively regulates apoptosis signal-regulating kinase 1.
Mol Cell Biol, 21, 893-901.
Kinlay, S. and Ganz, P. (1997) Role of endothelial dysfunction in coronary artery
disease and implications for therapy. Am J Cardiol, 80, 11I-16I.
Kirk, E.A., Dinauer, M.C., Rosen, H., Chait, A., Heinecke, J.W. and LeBoeuf, R.C.
(2000) Impaired superoxide production due to a deficiency in phagocyte
NADPH oxidase fails to inhibit atherosclerosis in mice. Arterioscler Thromb
Vasc Biol, 20, 1529-1535.
Klouche, M., Gottschling, S., Gerl, V., Hell, W., Husmann, M., Dorweiler, B., Messner,
M. and Bhakdi, S. (1998) Atherogenic properties of enzymatically degraded
LDL: selective induction of MCP-1 and cytotoxic effects on human
macrophages. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 18, 1376-1385.
Klouche, M., May, A.E., Hemmes, M., Messner, M., Kanse, S.M., Preissner, K.T. and
Bhakdi, S. (1999) Enzymatically modified, nonoxidized LDL induces selective
adhesion and transmigration of monocytes and T-lymphocytes through human
endothelial cell monolayers. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 19, 784-793.
Knowles, J.W. and Maeda, N. (2000) Genetic modifiers of atherosclerosis in mice.
Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20, 2336-2345.
Kruth, H.S. (1984) Localization of unesterified cholesterol in human atherosclerotic
lesions. Demonstration of filipin-positive, oil-red-O-negative particles. Am J
Pathol, 114, 201-208.
Kruth, H.S. (1985) Subendothelial accumulation of unesterified cholesterol. An early
event in atherosclerotic lesion development. Atherosclerosis, 57, 337-341.
Kuhn, H., Heydeck, D., Hugou, I. and Gniwotta, C. (1997) In vivo action of 15lipoxygenase in early stages of human atherogenesis. J Clin Invest, 99, 888893.
Kume, N., Cybulsky, M.I. and Gimbrone, M.A., Jr. (1992) Lysophosphatidylcholine, a
component of atherogenic lipoproteins, induces mononuclear leukocyte
adhesion molecules in cultured human and rabbit arterial endothelial cells. J
Clin Invest, 90, 1138-1144.
Landschulz, W.H., Johnson, P.F. and McKnight, S.L. (1988) The leucine zipper: a
hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins.
Science, 240, 1759-1764.
Lang, V., Janzen J., Fischer, G.Z., Soneji, Y., Beinke S., Salmeron A., Allen H., Hay
R.T., Ben-Neriah Y., Ley S.C. (2003) ßTrCP-mediated proteolysis of NF-kB1
p105 requires phosphorylation of p105 serines 927 and 932. Mol Cell Biol, 23,
402-413.
Ledebur, H.C. and Parks, T.P. (1995) Transcriptional regulation of the intercellular
adhesion molecule-1 gene by inflammatory cytokines in human endothelial
cells. Essential roles of a variant NF-kappa B site and p65 homodimers. J Biol
Chem, 270, 933-943.
Lee, R.T. and Libby, P. (1997) The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc
Biol, 17, 1859-1867.
Lehr, H.A., Sagban, T.A., Ihling, C., Zahringer, U., Hungerer, K.D., Blumrich, M.,
Reifenberg, K. and Bhakdi, S. (2001) Immunopathogenesis of atherosclerosis:
endotoxin accelerates atherosclerosis in rabbits on hypercholesterolemic diet.
Leist, M. and Jaattela, M. (2001) Four deaths and a funeral: from caspases to
alternative mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol, 2, 589-598.
Leusen, J.H., Verhoeven, A.J. and Roos, D. (1996) Interactions between the
components of the human NADPH oxidase: a review about the intrigues in the
phox family. Front Biosci, 1, d72-90.
Li, D. and Mehta, J.L. (2000) Upregulation of endothelial receptor for oxidized LDL
(LOX-1) by oxidized LDL and implications in apoptosis of human coronary
artery endothelial cells: evidence from use of antisense LOX-1 mRNA and
chemical inhibitors. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20, 1116-1122.
Li, D.Y., Chen, H.J. and Mehta, J.L. (2001) Statins inhibit oxidized-LDL-mediated
LOX-1 expression, uptake of oxidized-LDL and reduction in PKB
phosphorylation. Cardiovasc Res, 52, 130-135.
Li, F., Ambrosini, G., Chu, E.Y., Plescia, J., Tognin, S., Marchisio, P.C. and Altieri,
D.C. (1998) Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin.
Nature, 396, 580-584.
Li, P., Nijhawan, D., Budihardjo, I., Srinivasula, S.M., Ahmad, M., Alnemri, E.S. and
Wang, X. (1997) Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell, 91, 479489.
Lin, J.H. (1996) Induction of vascular cell adhesion molecule-1 by low-density
lipoprotein. Atherosclerosis, 127, 185-194.
Liu, H., Nishitoh, H., Ichijo, H. and Kyriakis, J.M. (2000) Activation of apoptosis
signal-regulating kinase 1 (ASK1) by tumor necrosis factor receptorassociated factor 2 requires prior dissociation of the ASK1 inhibitor
thioredoxin. Mol Cell Biol, 20, 2198-2208.
Liu, Y. and Min, W. (2002) Thioredoxin promotes ASK1 ubiquitination and
degradation to inhibit ASK1-mediated apoptosis in a redox activityindependent manner. Circ Res, 90, 1259-1266.
Lockshin, R.A. and Zakeri, Z. (2001) Programmed cell death and apoptosis: origins of
the theory. Nat Rev Mol Cell Biol, 2, 545-550.
Lockshin, R.A.a.W., C.M. (1964) Programmed cell death. II. Endocrine potentiation of
the breakdown of the intersegmental muscles of silkmoths. Journal of Insect
Physiology, 10, 643-649.
Lougheed, M., Zhang, H.F. and Steinbrecher, U.P. (1991) Oxidized low density
lipoprotein is resistant to cathepsins and accumulates within macrophages. J
Biol Chem, 266, 14519-14525.
Lucas, A.D. and Greaves, D.R. (2001) Atherosclerosis: role of chemokines and
macrophages. Expert Rev Mol Med, 2001, 1-18.
Mallat, Z., Hugel, B., Ohan, J., Leseche, G., Freyssinet, J.M. and Tedgui, A. (1999)
Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human
atherosclerotic plaques: a role for apoptosis in plaque thrombogenicity.
Mander, E.L., Dean, R.T., Stanley, K.K. and Jessup, W. (1994) Apolipoprotein B of
oxidized LDL accumulates in the lysosomes of macrophages. Biochim Biophys
Acta, 1212, 80-92.
Maor, I. and Aviram, M. (1994) Oxidized low density lipoprotein leads to macrophage
accumulation of unesterified cholesterol as a result of lysosomal trapping of
the lipoprotein hydrolyzed cholesteryl ester. J Lipid Res, 35, 803-819.
Marshall, C.J. (1995) Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient
versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell, 80, 179185.
Matsuzawa, A. and Ichijo, H. (2001) Molecular mechanisms of the decision between
life and death: regulation of apoptosis by apoptosis signal-regulating kinase 1.
J Biochem (Tokyo), 130, 1-8.
Mietus-Snyder, M., Glass, C.K. and Pitas, R.E. (1998) Transcriptional activation of
scavenger receptor expression in human smooth muscle cells requires AP1/c-Jun and C/EBPbeta: both AP-1 binding and JNK activation are induced by
phorbol esters and oxidative stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 18, 14401449.
Mochida, Y., Takeda, K., Saitoh, M., Nishitoh, H., Amagasa, T., Ninomiya-Tsuji, J.,
Matsumoto, K. and Ichijo, H. (2000) ASK1 inhibits interleukin-1-induced NFkappa B activity through disruption of TRAF6-TAK1 interaction. J Biol Chem,
275, 32747-32752.
Mora, R., Lupu, F. and Simionescu, N. (1987) Prelesional events in atherogenesis.
Colocalization of apolipoprotein B, unesterified cholesterol and extracellular
phospholipid liposomes in the aorta of hyperlipidemic rabbit. Atherosclerosis,
67, 143-154.
Morel, D.W., Hessler, J.R. and Chisolm, G.M. (1983) Low density lipoprotein
cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. J Lipid Res, 24, 10701076.
Mori, K. (2000) Tripartite management of unfolded proteins in the endoplasmic
reticulum. Cell, 101, 451-454.
Morita, K., Saitoh, M., Tobiume, K., Matsuura, H., Enomoto, S., Nishitoh, H. and
Ichijo, H. (2001) Negative feedback regulation of ASK1 by protein
phosphatase 5 (PP5) in response to oxidative stress. Embo J, 20, 6028-6036.
Muchmore, S.W., Sattler, M., Liang, H., Meadows, R.P., Harlan, J.E., Yoon, H.S.,
Nettesheim, D., Chang, B.S., Thompson, C.B., Wong, S.L., Ng, S.L. and
Fesik, S.W. (1996) X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of
programmed cell death. Nature, 381, 335-341.
Murakami, M. and Kudo, I. (2003) New phospholipase A(2) isozymes with a potential
role in atherosclerosis. Curr Opin Lipidol, 14, 431-436.
Mutin, M., Canavy, I., Blann, A., Bory, M., Sampol, J. and Dignat-George, F. (1999)
Direct evidence of endothelial injury in acute myocardial infarction and
unstable angina by demonstration of circulating endothelial cells. Blood, 93,
2951-2958.
Nagata, S. (1999) Fas ligand-induced apoptosis. Annu Rev Genet, 33, 29-55.
Napoli, C., D'Armiento, F.P., Mancini, F.P., Postiglione, A., Witztum, J.L., Palumbo,
G. and Palinski, W. (1997) Fatty streak formation occurs in human fetal aortas
and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal
accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte
recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest, 100, 2680-2690.
Navab, M., Berliner, J.A., Watson, A.D., Hama, S.Y., Territo, M.C., Lusis, A.J., Shih,
D.M., Van Lenten, B.J., Frank, J.S., Demer, L.L., Edwards, P.A. and
Fogelman, A.M. (1996) The Yin and Yang of oxidation in the development of
the fatty streak. A review based on the 1994 George Lyman Duff Memorial
Lecture. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 16, 831-842.
Neish, A.S., Williams, A.J., Palmer, H.J., Whitley, M.Z. and Collins, T. (1992)
Functional analysis of the human vascular cell adhesion molecule 1 promoter.
J Exp Med, 176, 1583-1593.
Nicoletti, A., Caligiuri, G. and Hansson, G.K. (2000) Immunomodulation of
atherosclerosis: myth and reality. J Intern Med, 247, 397-405.
Niculescu, F., Hugo, F., Rus, H.G., Vlaicu, R. and Bhakdi, S. (1987) Quantitative
evaluation of the terminal C5b-9 complement complex by ELISA in human
atherosclerotic arteries. Clin Exp Immunol, 69, 477-483.
Ninomiya-Tsuji, J., Kishimoto, K., Hiyama, A., Inoue, J., Cao, Z. and Matsumoto, K.
(1999) The kinase TAK1 can activate the NIK-I kappaB as well as the MAP
kinase cascade in the IL-1 signalling pathway. Nature, 398, 252-256.
Nishitoh, H., Matsuzawa, A., Tobiume, K., Saegusa, K., Takeda, K., Inoue, K., Hori,
S., Kakizuka, A. and Ichijo, H. (2002) ASK1 is essential for endoplasmic
reticulum stress-induced neuronal cell death triggered by expanded
polyglutamine repeats. Genes Dev, 16, 1345-1355.
Nishitoh, H., Saitoh, M., Mochida, Y., Takeda, K., Nakano, H., Rothe, M., Miyazono,
K. and Ichijo, H. (1998) ASK1 is essential for JNK/SAPK activation by TRAF2.
Mol Cell, 2, 389-395.
Noris, M., Morigi, M., Donadelli, R., Aiello, S., Foppolo, M., Todeschini, M., Orisio, S.,
Remuzzi, G. and Remuzzi, A. (1995) Nitric oxide synthesis by cultured
endothelial cells is modulated by flow conditions. Circ Res, 76, 536-543.
Pagano, P.J., Clark, J.K., Cifuentes-Pagano, M.E., Clark, S.M., Callis, G.M. and
Quinn, M.T. (1997) Localization of a constitutively active, phagocyte-like
NADPH oxidase in rabbit aortic adventitia: enhancement by angiotensin II.
Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 14483-14488.
Pahl, H.L. and Baeuerle, P.A. (1996) Activation of NF-kappa B by ER stress requires
both Ca2+ and reactive oxygen intermediates as messengers. FEBS Lett,
392, 129-136.
Park, H.S., Cho, S.G., Kim, C.K., Hwang, H.S., Noh, K.T., Kim, M.S., Huh, S.H., Kim,
M.J., Ryoo, K., Kim, E.K., Kang, W.J., Lee, J.S., Seo, J.S., Ko, Y.G., Kim, S.
and Choi, E.J. (2002) Heat shock protein hsp72 is a negative regulator of
apoptosis signal-regulating kinase 1. Mol Cell Biol, 22, 7721-7730.
Perkins, N.D. (2000) The Rel/NF-kB family: friend and foe. Trends Biochem Sci, 25,
434-440.
Peters, W. and Charo, I.F. (2001) Involvement of chemokine receptor 2 and its
ligand, monocyte chemoattractant protein-1, in the development of
atherosclerosis: lessons from knockout mice. Curr Opin Lipidol, 12, 175-180.
Ramsey, A.J. and Chinkers, M. (2002) Identification of potential physiological
activators of protein phosphatase 5. Biochemistry, 41, 5625-5632.
Rao, G.N., Alexander, R.W. Runge, M.S. (1995) Linoleic acid and its metabolits,
Hydroperoxyoctadecadienoic acids, stimulate c-fos, c-jun, and c-myc mRNA
expression, mitogen-activated protein kinase activation, and growth in rat
aortic smooth muscle cells. J Clin Invest, 96, 842-847.
Reape, T.J. and Groot, P.H. (1999) Chemokines and atherosclerosis.
Atherosclerosis, 147, 213-225.
Roebuck, K.A., Rahman, A., Lakshminarayanan, V., Janakidevi, K. and Malik, A.B.
(1995) H2O2 and tumor necrosis factor-alpha activate intercellular adhesion
molecule 1 (ICAM-1) gene transcription through distinct cis-regulatory
elements within the ICAM-1 promoter. J Biol Chem, 270, 18966-18974.
Roma, P., Catapano, A.L., Bertulli, S.M., Varesi, L., Fumagalli, R. and Bernini, F.
(1990) Oxidized LDL increase free cholesterol and fail to stimulate cholesterol
esterification in murine macrophages. Biochem Biophys Res Commun, 171,
123-131.
Rommel, C., Clarke, B.A., Zimmermann, S., Nunez, L., Rossman, R., Reid, K.,
Moelling, K., Yancopoulos, G.D. and Glass, D.J. (1999) Differentiation stagespecific inhibition of the Raf-MEK-ERK pathway by Akt. Science, 286, 17381741.
Rosenfeld, M.E., Palinski, W., Yla-Herttuala, S., Butler, S. and Witztum, J.L. (1990)
Distribution of oxidation specific lipid-protein adducts and apolipoprotein B in
atherosclerotic lesions of varying severity from WHHL rabbits. Arteriosclerosis,
10, 336-349.
Ross, R. (1999) Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am Heart J, 138, S419420.
Roulston, A., Reinhard, C., Amiri, P. and Williams, L.T. (1998) Early activation of cJun N-terminal kinase and p38 kinase regulate cell survival in response to
tumor necrosis factor alpha. J Biol Chem, 273, 10232-10239.
Saitoh, M., Nishitoh, H., Fujii, M., Takeda, K., Tobiume, K., Sawada, Y., Kawabata,
M., Miyazono, K. and Ichijo, H. (1998) Mammalian thioredoxin is a direct
inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. Embo J, 17, 25962606.
Sakata, A., Ida, E., Tominaga, M. and Onoue, K. (1987) Arachidonic acid acts as an
intracellular activator of NADPH-oxidase in Fc gamma receptor-mediated
superoxide generation in macrophages. J Immunol, 138, 4353-4359.
Salvesen, G.S. and Renatus, M. (2002) Apoptosome: the seven-spoked death
machine. Dev Cell, 2, 256-257.
Saraste, A. and Pulkki, K. (2000) Morphologic and biochemical hallmarks of
apoptosis. Cardiovasc Res, 45, 528-537.
Sartorius, U., Schmitz, I. and Krammer, P.H. (2001) Molecular mechanisms of deathreceptor-mediated apoptosis. Chembiochem, 2, 20-29.
Sayama, K., Hanakawa, Y., Shirakata, Y., Yamasaki, K., Sawada, Y., Sun, L.,
Yamanishi, K., Ichijo, H. and Hashimoto, K. (2001) Apoptosis signal-regulating
kinase 1 (ASK1) is an intracellular inducer of keratinocyte differentiation. J Biol
Chem, 276, 999-1004.
Schmiedt, W., Kinscherf, R., Deigner, H.P., Kamencic, H., Nauen, O., Kilo, J., Oelert,
H., Metz, J. and Bhakdi, S. (1998) Complement C6 deficiency protects against
diet-induced atherosclerosis in rabbits. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 18,
1790-1795.
Schreiber, M., Kolbus, A., Piu, F., Szabowski, A., Mohle-Steinlein, U., Tian, J., Karin,
M., Angel, P. and Wagner, E.F. (1999) Control of cell cycle progression by cJun is p53 dependent. Genes Dev, 13, 607-619.
Schulze-Osthoff, K., Krammer, P.H. and Droge, W. (1994) Divergent signalling via
APO-1/Fas and the TNF receptor, two homologous molecules involved in
physiological cell death. Embo J, 13, 4587-4596.
Seifert, P.S., Hugo, F., Hansson, G.K. and Bhakdi, S. (1989) Prelesional complement
activation in experimental atherosclerosis. Terminal C5b-9 complement
deposition coincides with cholesterol accumulation in the aortic intima of
hypercholesterolemic rabbits. Lab Invest, 60, 747-754.
Seifert, P.S., Hugo, F., Tranum-Jensen, J., Zahringer, U., Muhly, M. and Bhakdi, S.
(1990) Isolation and characterization of a complement-activating lipid
extracted from human atherosclerotic lesions. J Exp Med, 172, 547-557.
Shanahan, C.M. and Weissberg, P.L. (1999) Smooth muscle cell phenotypes in
atherosclerotic lesions. Curr Opin Lipidol, 10, 507-513.
Shin, H.K., Kim, Y.K., Kim, K.Y., Lee, J.H. and Hong, K.W. (2004) Remnant
lipoprotein particles induce apoptosis in endothelial cells by NAD(P)H oxidasemediated production of superoxide and cytokines via lectin-like oxidized lowdensity lipoprotein receptor-1 activation: prevention by cilostazol. Circulation,
109, 1022-1028.
Shirakabe, K., Yamaguchi, K., Shibuya, H., Irie, K., Matsuda, S., Moriguchi, T.,
Gotoh, Y., Matsumoto, K. and Nishida, E. (1997) TAK1 mediates the ceramide
signaling to stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase. J Biol
Chem, 272, 8141-8144.
Shou, Y., Li, L., Prabhakaran, K., Borowitz, J.L. and Isom, G.E. (2003) p38 Mitogenactivated protein kinase regulates Bax translocation in cyanide-induced
apoptosis. Toxicol Sci, 75, 99-107.
Simionescu, N., Mora, R., Vasile, E., Lupu, F., Filip, D.A. and Simionescu, M. (1990)
Prelesional modifications of the vessel wall in hyperlipidemic atherogenesis.
Extracellular accumulation of modified and reassembled lipoproteins. Ann N Y
Acad Sci, 598, 1-16.
Simionescu, N., Vasile, E., Lupu, F., Popescu, G. and Simionescu, M. (1986)
Prelesional events in atherogenesis. Accumulation of extracellular cholesterolrich liposomes in the arterial intima and cardiac valves of the hyperlipidemic
rabbit. Am J Pathol, 123, 109-125.
Sinclair, C., Borchers, C., Parker, C., Tomer, K., Charbonneau, H. and Rossie, S.
(1999) The tetratricopeptide repeat domain and a C-terminal region control the
activity of Ser/Thr protein phosphatase 5. J Biol Chem, 274, 23666-23672.
Skinner, J., Sinclair, C., Romeo, C., Armstrong, D., Charbonneau, H. and Rossie, S.
(1997) Purification of a fatty acid-stimulated protein-serine/threonine
phosphatase from bovine brain and its identification as a homolog of protein
phosphatase 5. J Biol Chem, 272, 22464-22471.
Stary, H.C. (1987) Macrophages, macrophage foam cells, and eccentric intimal
thickening in the coronary arteries of young children. Atherosclerosis, 64, 91108.
Steiberg, D., and Witztum, J.L. (1999) Lipoproteins, Lipoprotein Oxidation, and
Atherogenesis. K.R. Chien, ed. (Philadelphia: W.B. Saunders Co.).
Steinberg, D. (1981) Underlying mechanisms in atherosclerosis. J Pathol, 133, 75-87.
Steinberg, D. (1999) At last, direct evidence that lipoxygenases play a role in
atherogenesis. J Clin Invest, 103, 1487-1488.
Steinberg, D., Parthasarathy, S., Carew, T.E., Khoo, J.C. and Witztum, J.L. (1989)
Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its
atherogenicity. N Engl J Med, 320, 915-924.
Steinbrecher, U.P., Zhang, H.F. and Lougheed, M. (1990) Role of oxidatively
modified LDL in atherosclerosis. Free Radic Biol Med, 9, 155-168.
Sundaresan, M., Yu, Z.X., Ferrans, V.J., Irani, K. and Finkel, T. (1995) Requirement
for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction.
Science, 270, 296-299.
Suriyaphol, P., Fenske, D., Zahringer, U., Han, S.R., Bhakdi, S. and Husmann, M.
(2002) Enzymatically modified nonoxidized low-density lipoprotein induces
interleukin-8 in human endothelial cells: role of free fatty acids. Circulation,
106, 2581-2587.
Takahashi, M., Okazaki, H., Ogata, Y., Takeuchi, K., Ikeda, U. and Shimada, K.
(2002) Lysophosphatidylcholine induces apoptosis in human endothelial cells
through a p38-mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism.
Atherosclerosis, 161, 387-394.
Takeda, K., Hatai, T., Hamazaki, T.S., Nishitoh, H., Saitoh, M. and Ichijo, H. (2000)
Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) induces neuronal differentiation
and survival of PC12 cells. J Biol Chem, 275, 9805-9813.
Takeda, K., Matsuzawa, A., Nishitoh, H. and Ichijo, H. (2003) Roles of MAPKKK
ASK1 in stress-induced cell death. Cell Struct Funct, 28, 23-29.
Tall, A.R. and Wang, N. (2000) Tangier disease as a test of the reverse cholesterol
transport hypothesis. J Clin Invest, 106, 1205-1207.
Thrasher, A.J., Keep, N.H., Wientjes, F. and Segal, A.W. (1994) Chronic
granulomatous disease. Biochim Biophys Acta, 1227, 1-24.
Tibbles, L.A. and Woodgett, J.R. (1999) The stress-activated protein kinase
pathways. Cell Mol Life Sci, 55, 1230-1254.
Tobiume, K., Matsuzawa, A., Takahashi, T., Nishitoh, H., Morita, K., Takeda, K.,
Minowa, O., Miyazono, K., Noda, T. and Ichijo, H. (2001) ASK1 is required for
sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis. EMBO Rep, 2,
222-228.
Tobiume, K., Saitoh, M. and Ichijo, H. (2002) Activation of apoptosis signal-regulating
kinase 1 by the stress-induced activating phosphorylation of pre-formed
oligomer. J Cell Physiol, 191, 95-104.
Tojima, Y., Fujimoto, A., Delhase, M., Chen, Y., Hatakeyama, S., Nakayama, K.,
Kaneko, Y., Nimura, Y., Motoyama, N., Ikeda, K., Karin, M. and Nakanishi, M.
(2000) NAK is an IkappaB kinase-activating kinase. Nature, 404, 778-782.
Torzewski, M., Klouche, M., Hock, J., Messner, M., Dorweiler, B., Torzewski, J.,
Gabbert, H.E. and Bhakdi, S. (1998) Immunohistochemical demonstration of
enzymatically modified human LDL and its colocalization with the terminal
complement complex in the early atherosclerotic lesion. Arterioscler Thromb
Vasc Biol, 18, 369-378.
Traenckner, E.B., Pahl, H.L., Henkel, T., Schmidt, K.N., Wilk, S. and Baeuerle, P.A.
(1995) Phosphorylation of human I kappa B-alpha on serines 32 and 36
controls I kappa B-alpha proteolysis and NF-kappa B activation in response to
diverse stimuli. Embo J, 14, 2876-2883.
Urbich, C., Walter, D.H., Zeiher, A.M. and Dimmeler, S. (2000) Laminar shear stress
upregulates integrin expression: role in endothelial cell adhesion and
apoptosis. Circ Res, 87, 683-689.
Valeva, A., Weisser, A., Walker, B., Kehoe, M., Bayley, H., Bhakdi, S. and Palmer, M.
(1996) Molecular architecture of a toxin pore: a 15-residue sequence lines the
transmembrane channel of staphylococcal alpha-toxin. Embo J, 15, 18571864.
van Dam, H., Wilhelm, D., Herr, I., Steffen, A., Herrlich, P. and Angel, P. (1995) ATF2 is preferentially activated by stress-activated protein kinases to mediate cjun induction in response to genotoxic agents. Embo J, 14, 1798-1811.
van der Wal, A.C., Becker, A.E., van der Loos, C.M. and Das, P.K. (1994) Site of
intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is
characterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque
morphology. Circulation, 89, 36-44.
Vita, J.A., Treasure, C.B., Nabel, E.G., McLenachan, J.M., Fish, R.D., Yeung, A.C.,
Vekshtein, V.I., Selwyn, A.P. and Ganz, P. (1990) Coronary vasomotor
response to acetylcholine relates to risk factors for coronary artery disease.
Vlaicu, R., Niculescu, F., Rus, H.G. and Cristea, A. (1985) Immunohistochemical
localization of the terminal C5b-9 complement complex in human aortic fibrous
plaque. Atherosclerosis, 57, 163-177.
Vogt, P.K. (2002) Fortuitous convergences: the beginnings of JUN. Nat Rev Cancer,
2, 465-469.
Vogt, P.K. and Bos, T.J. (1990) jun: oncogene and transcription factor. Adv Cancer
Res, 55, 1-35.
Voraberger, G., Schafer, R. and Stratowa, C. (1991) Cloning of the human gene for
intercellular adhesion molecule 1 and analysis of its 5'-regulatory region.
Induction by cytokines and phorbol ester. J Immunol, 147, 2777-2786.
Wang, X.S., Diener, K., Jannuzzi, D., Trollinger, D., Tan, T.H., Lichenstein, H.,
Zukowski, M. and Yao, Z. (1996) Molecular cloning and characterization of a
novel protein kinase with a catalytic domain homologous to mitogen-activated
protein kinase kinase kinase. J Biol Chem, 271, 31607-31611.
Whitmarsh, A.J. and Davis, R.J. (1996) Transcription factor AP-1 regulation by
mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways. J Mol Med, 74,
589-607.
Wisdom, R., Johnson, R.S. and Moore, C. (1999) c-Jun regulates cell cycle
progression and apoptosis by distinct mechanisms. Embo J, 18, 188-197.
Xia, Y., Makris, C., Su, B., Li, E., Yang, J., Nemerow, G.R. and Karin, M. (2000) MEK
kinase 1 is critically required for c-Jun N-terminal kinase activation by
proinflammatory stimuli and growth factor-induced cell migration. Proc Natl
Acad Sci U S A, 97, 5243-5248.
Xia, Z., Dickens, M., Raingeaud, J., Davis, R.J. and Greenberg, M.E. (1995)
Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science,
270, 1326-1331.
Xu, Q., Liu, Y., Gorospe, M., Udelsman, R. and Holbrook, N.J. (1996) Acute
hypertension activates mitogen-activated protein kinases in arterial wall. J Clin
Invest, 97, 508-514.
Yamaguchi, K., Shirakabe, K., Shibuya, H., Irie, K., Oishi, I., Ueno, N., Taniguchi, T.,
Nishida, E. and Matsumoto, K. (1995) Identification of a member of the
MAPKKK family as a potential mediator of TGF-beta signal transduction.
Science, 270, 2008-2011.
Yamamoto, K., Ichijo, H. and Korsmeyer, S.J. (1999) BCL-2 is phosphorylated and
inactivated by an ASK1/Jun N-terminal protein kinase pathway normally
activated at G(2)/M. Mol Cell Biol, 19, 8469-8478.
Yang, D., Lu, H. and Erickson, J.W. (2000) Evidence that processed small dsRNAs
may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila
embryos. Curr Biol, 10, 1191-1200.
Yang, X., Khosravi-Far, R., Chang, H.Y. and Baltimore, D. (1997) Daxx, a novel Fasbinding protein that activates JNK and apoptosis. Cell, 89, 1067-1076.
Yujiri, T., Ware, M., Widmann, C., Oyer, R., Russell, D., Chan, E., Zaitsu, Y., Clarke,
P., Tyler, K., Oka, Y., Fanger, G.R., Henson, P. and Johnson, G.L. (2000)
MEK kinase 1 gene disruption alters cell migration and c-Jun NH2-terminal
kinase regulation but does not cause a measurable defect in NF-kappa B
activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 7272-7277.
Yusuf, S., Dagenais, G., Pogue, J., Bosch, J. and Sleight, P. (2000) Vitamin E
supplementation and cardiovascular events in high-risk patients. The Heart
Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N Engl J Med, 342, 154160.
Zhang, R., Al-Lamki, R., Bai, L., Streb, J.W., Miano, J.M., Bradley, J. and Min, W.
(2004) Thioredoxin-2 inhibits mitochondria-located ASK1-mediated apoptosis
in a JNK-independent manner. Circ Res, 94, 1483-1491.
Zhang, R., He, X., Liu, W., Lu, M., Hsieh, J.T. and Min, W. (2003) AIP1 mediates
TNF-alpha-induced ASK1 activation by facilitating dissociation of ASK1 from
its inhibitor 14-3-3. J Clin Invest, 111, 1933-1943.
Zhao, M., Liu, Y., Wang, X., New, L., Han, J. and Brunk, U.T. (2002) Activation of the
p38 MAP kinase pathway is required for foam cell formation from
macrophages exposed to oxidized LDL. Apmis, 110, 458-468.
Zhu, Y., Liao, H., Wang, N., Ma, K.S., Verna, L.K., Shyy, J.Y., Chien, S. and
Stemerman, M.B. (2001) LDL-activated p38 in endothelial cells is mediated by
Ras. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21, 1159-1164.
Zhu, Y., Lin, J.H., Liao, H.L., Friedli, O., Jr., Verna, L., Marten, N.W., Straus, D.S. and
Stemerman, M.B. (1998) LDL induces transcription factor activator protein-1 in
human endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 18, 473-480.
Zimmermann, S. and Moelling, K. (1999) Phosphorylation and regulation of Raf by
Akt (protein kinase B). Science, 286, 1741-1744.