Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b
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Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b
Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie Durchgeführt vom 27. April bis am 3. Mai 2005 von Sebastian Ahles, Stephan Steinmann und Jörg Duschmalé Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie Einleitung Pflanzen sind in der Lage mittels Photosynthese aus Kohlenstoffdioxid und Wasser mit Hilfe von Sonnenlicht Kohlenhydrate zu synthetisieren. Die zentrale Rolle in diesem Prozess spielt das Chlorophyll. Das Chlorophyll ist ein Magnesium-Komplex mit einem vierzähnigen organischen Liganden. Das Grundgerüst dieses Moleküls bilden vier mit einander verbundene Pyrrolringe, welche durch die Stickstoffatome koordinieren. Chlorophyll wird je nach Rest in Chlorophyll a, Chlorophyll b usw. unterteilt. Im folgenden Versuch soll ein Extrakt aus Kastanienblättern mittels Säulenchromatographie in seine Fraktionen aufgespalten werden. O H CH3 N N N N Mg Mg N N O O O O N N O O O O Phytyl O O Phytyl Chlorophyll b Chlorophyll a Abbildung 1: Chlorophyll a und Chlorophyll b unterscheiden sich durch ihre Reste (rot eingezeichnet) 1 Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie Durchgeführt vom 27. April bis am 3. Mai 2005 von Sebastian Ahles, Stephan Steinmann und Jörg Duschmalé Materialien - 1 Kastanienblatt (3.6g) - Quarzsand - Aceton - Petrolether Durchführung Ein Kastanienblatt wurde mit etwas Quarzsand, wenig Aceton und Petrolether (je 5ml) in einer Porzellanschale mit dem Mörser verrieben. Die tiefgrüne Lösung wurde in einen Scheidetrichter dekantiert und mit etwas Wasser (5ml) extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt. Mittels Dünnschichtchromatographie wurde ein Lösungsmittelgemisch (Aceton/Petrolether) gesucht, welches sich für die Säulenchromatographie eignet. Überraschenderweise konnte keine Auftrennung mit den in der Anleitung angegebenen Mischverhältnissen Petrolether/Aceton (3:1, 4:1, 5:1) erreicht werden. Der auf die DC-Platte aufgetragene Fleck blieb jeweils am Ort. Mit dem Verhältnis 3:2 erfolgte wenigstens eine Auftrennung (wenn auch keine besonders gute), sodass dieses Verhältnis für die Säulenchromatographie verwendet wurde, obwohl wir bereits befürchteten, dass keine optimale Auftrennung möglich sein würde. Gelber Pflanzenfarbstoff (Carotinoid) Gräuliche Fraktion Chlorophyll a Chlorophyll b Gelber Pflanzenfarbstoff (Carotinoid) Abbildung 2: DC-Platte mit dem Laufmittel Petrolether 3:2 Aceton (Farben sind den wirklichen Farben angenähert) 2 Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie Durchgeführt vom 27. April bis am 3. Mai 2005 von Sebastian Ahles, Stephan Steinmann und Jörg Duschmalé Darauf wurden 5 dl vom gefundenen Laufmittel hergestellt. 15g Silicia wurden in einem Erlenmeyerkolben mit etwas Laufmittel aufgeschwemmt und in eine mit Stativklammern senkrecht befestigte Chromatographiesäule gefüllt. Das Laufmittel wurde so lange durch die unten geöffnete Säule gedrückt (mit Hilfe eines Saugballs), bis sich das Silicia nicht mehr weiter absetzte. Nun wurde die Säule geschlossen und auf das Silicia eine Schicht Quarzsand und der Extrakt aus dem Kastanienblatt vorsichtig aufgetragen. Nachdem die Säule wieder geöffnet worden war und sich das Extrakt in den Quarzsand eingedrungen war, wurde mit Laufmittel aufgefüllt. Nun wurde beobachtet wie sich die Fraktionen langsam aufzutrennen begannen und, als die erste gelbe Fraktion im unteren Viertel der Säule angekommen war, mit dem nehmen von Fraktionen (ca 5ml) begonnen. Die Fraktionen wurden auf eine DC-Platte aufgetragen, welche folgendes Resultat lieferte. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Abbildung 3: Dünnschichtchromatographie der einzelnen Fraktionen. Interpretation dieser Ergebnisse Wie in Abbildung 3 zu sehen haben wir keine einzige einheitliche Fraktion erhalten. Durch Vergleich der DC-Platten (Abbildung 2 und Abbildung 3) wird ersichtlich, dass die Auftrennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b durch die Säule noch schlechter war als nach der ersten Dünnschichtchromatographie befürchtet. Wir hätten wohl entweder die von der Anleitung geforderten Spinatblätter nehmen sollen, oder aber mehr Zeit investieren müssen ein geeigneteres Laufmittel zu finden. 3 Trennung von Chlorophyll a und Chlorophyll b mittels Säulenchromatographie Durchgeführt vom 27. April bis am 3. Mai 2005 von Sebastian Ahles, Stephan Steinmann und Jörg Duschmalé Ebenfalls bemerkenswert ist die stets vorhandene gräuliche Fraktion. Diese wurde nämlich erst beobachtet, nachdem das Extrakt über Nacht im Schrank aufbewahrt worden war. Es handelt sich dabei wohl um ein Zerfallsprodukt eines der extrahierten Inhaltsstoffe des Kastanienblattes. So konnten wir keinen einzigen Inhaltsstoff des Blattes isolieren. Trotz dieses ernüchternden Resultates beschlossen wir nach Rücksprache mit dem Assistenten den Versuch nicht zu wiederhohlen. Warum wandert Chlorophyll a schneller auf der Säule? Chlorophyll a und Chlorophyll b unterscheiden sich ausschliesslich durch ihren Rest. Das Chlorophyll a besitzt eine apolare Methylgruppe, wohingegen das Chlorophyll b eine polarisierte Aldehydfunktionalität aufweist. Somit tritt das Chlorophyll b besser mit dem polaren Silicia der Säule in Wechselwirkung und braucht deshalb länger um durch die Säule zu kommen. 4