Versuchsprotokoll 1.) Versuch 1a: Chromatographie der
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Versuchsprotokoll 1.) Versuch 1a: Chromatographie der
xxx xxx Versuchsprotokoll 1a- 1c Photosynthese Gruppe xx 07.05.2003 Versuchsprotokoll 1.) Versuch 1a: Chromatographie der Plastidenfarbstoffe 1.1. Einleitung: Die Chromatographie ist ein Analyseverfahren zur Auftrennung von Stoffgemischen. Die Chromatographie hat sich im Laufe der Jahre soweit entwickelt, dass verschiedene Chromatographien entstanden sind. So gibt es die Dünnschichtchromatographie (weiterhin nur noch als DC bezeichnet), Papierchromatographie (PC), sowie die in modernen Labors meist angewandte HochdruckFlüssigkeits-Chromatographie (HPLC). Die beiden erstgenannten sollen uns für den weiteren Versuchsablauf interessieren. Die Prinzipien dieser beiden Chromatographiemethoden liegen bei der Adsorption und der Verteilung der zu trennenden Stoffe (hier: Farbpigmente). Bei diesen Phänomenen spielt die Polarität der Farbpigmente eine große Rolle. Die Farbpigmente, die zur Sammlung des weißen Lichtes genutzt werden und die Energie an das Reaktionszentrum der Lichtreaktion der Photosynthese abgeben, sind für die Photosynthese unerlässlich. Als Photosynthese bezeichnet man „die Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie, die in Glucose oder anderen organischen Verbindungen gespeichert wird“ (Campbell, Biologie, Spektrum Verlag, 1997, Seite 1343, Stichwort „Photosynthese“). 1.2. Material und Methode: Für den Versuch verwenden wir die Blätter der Bohne. Die Blätter werden mit Seesand, Aceton, Kalciumcarbonat vermischt und im Mörtel zerrieben, die breiartige Substanz gefiltert und dann die Chromatographien wie im Skript beschrieben durchgeführt. 1.3. Versuchsergebnisse: Nach einer halben Stunde wird die Papierchromatographie beendet. Ausgehend von dem Auftragepunkt in der Mitte des Papiers sind nacheinander folgende Farbringe zu erkennen. Zwei grünliche Bereiche nahe am Mittelpunkt. Darauf folgend eine gelbe Bande und am äußersten Rand (Fließmittelfront) noch eine gelbe Bande, die jedoch sehr schwach ist. Bei der Dünnschichtchromatographie, die ebenfalls 30 Minuten gelaufen ist, sind von den drei nebeneinander aufgetragenen Punkten nach oben hin 6 Banden zu erkennen. Auf den Startpunkt folgend sind dies zuerst eine leicht gelbe Bande, die zweite eine schwach gelbe Bande und danach eine hellgelbe Bande. Darauf folgen ein dunkles bräunliches grün und ein saftiges 1 xxx xxx Versuchsprotokoll 1a- 1c Photosynthese Gruppe xx 07.05.2003 dunkelgrün. Als letztes und mit einem deutlichen Absatz von ca. 3 cm befindet sich zuletzt eine leicht gelbe Bande. Hält man nun die beiden Chromatographien unter eine UV-Lampe so fluoreszieren die grünen Bereiche rot. 1.4. Auswertung: Nach der Betrachtung der Chromatographien lassen sich anhand von Literatur folgende Pigmente bei unseren Chromatographien feststellen. Dünnschichtchromatographie: Vom Startpunkt ausgehend findet man folgende Stoffe in den unterschiedlichen Banden: Neoxanthin, Violaxanthin, Lutein, Chlorophyll b, Chlorophyll a und β Carotin. Diese Aufteilung lässt sich durch das Prinzip einer Verteilungschromatographie (NERNSTscher Verteilungssatz) erklären. Die Stoffe verteilen sich je nach ihrer Löslichkeit auf die polare Flüssige stationäre Phase und die unpolare mobile Phase (lipophil). Diese Phasen lassen sich kaum miteinander mischen. Die Stoffe, die sich in der Stationären Phase gelöst haben bewegen sich so gut wie gar nicht (allenfalls sehr langsam) fort. Stoffe die in der mobilen Phase gelöst sind wandern wesentlich weiter und schneller. Die Trägerschicht ist demnach am eigentlichen Trennungsvorgang nicht beteiligt. Sie dient hier nur dazu, die stationäre flüssige Phase aufzunehmen und der Diffusion entgegenzuwirken. Papierchromatographie: Vom Startpunkt ausgehend findet man folgende Stoffe in den unterschiedlichen Banden: Chlorophyll b, Chlorophyll a, Violaxanthin, Lutein, Phaeophytin a und β Carotin. Diese Aufteilung ist folgendermaßen zu erklären: Stoffe (z.B.: Chlorophyll a, b, die einen hydrophoben Schwanz und ein hydrophiles Köpfchen besitzen), die in der polaren stationären Phase löslich sind, wandern langsamer als eher unpolare Stoffe, die im unpolaren Laufmittel (also der mobilen Phase) löslich sind. Daher wandert z.B. β Carotin wesentlich rascher als z.B. die Chlorophylle. Carotinoide bestehen aus konjugierten Isopren Untereinheiten, die unpolar sind. Daher haben Carotinoide auch die Eigenschaften von Lipiden. Xanthophylle (z.B. Violaxanthin) sind Derivate der Carotinoide die zusätzliche OH-Gruppen besitzen. Daher sind diese Stoffe etwas polarer als die Carotinoide und wandern daher langsamer. 2 xxx xxx Versuchsprotokoll 1a- 1c Photosynthese Gruppe xx 07.05.2003 Bei der Betrachtung unter der UV-Lampe leuchtet Chlorophyll a dunkelrot, Chlorophyll b hellrot (und Phaeophytin b rot). Das Phaeophytin befindet sich höchst wahrscheinlich unter dem Chlorophyll und ist somit kaum sichtbar. In Abhängigkeit von der Konzentration könnte kein Unterschied in der Fluoreszenzintensität festgestellt werden. 1.6. Zusammenfassung Die Blätter der Pflanzen besitzen nicht ausschließlich Chlorophyll, sondern auch noch weitere Farbpigmente, die sich in ihren chemischen Eigenschaften unterscheiden. Sie sind für die Photosynthese sehr wichtig. 2.) Versuch 1b: Absorption von Chloroplastenpigmenten 2.1. Einleitung: Absorption im Bezug auf die Photosynthese bezieht sich auf die Aufnahme der Energie des weißen (sichtbaren) Lichtes. Jedes Pigment kann Licht einer bestimmten Wellenlänge am besten absorbieren. Das Chlorophyll nimmt eine ganz besondere Stellung bei der Photosynthese ein. Es ist das Pigment, das das so genannte Reaktionszentrum bildet. Erst durch das Chlorophyll kann die Energie auf NADP übertragen werden. Auch die Carotinoide sind wichtige Bestandteile des Blattes. Sie dienen zwar auch als Lichtsammelpigment und füllen die sog. Grünlücke etwas aus, jedoch kommt ihnen noch eine weitere wichtige Funktion zu. Die Carotionoide dienen als Quencher und machen so Singulettsauerstoff sowie Sauerstoffradikale funktionslos. Sie schützen also den photochemischen Apparat vor photooxidativer Zerstörung. Die Absorptionseigenschaften der Carotinoide sowie einer Rohchlorophyllösung sollen anhand dieses Versuches untersucht werden. 2.2. Material und Methode: Die Herstellung der Pigmentlösungen und die Vorgehensweise bei der Absorptionsmessung sind im Skript ausführlich beschrieben. 2.3. Versuchsergebnisse: Die Versuchsergebnisse sind auf dem beiliegenden Zettel durch das Spektralphotometer festgehalten worden. In der Auswertung wird auf die dort abgebildeten Graphiken sowie Tabellen Bezug genommen. 3 xxx xxx Versuchsprotokoll 1a- 1c Photosynthese Gruppe xx 07.05.2003 2.4. Auswertung: Rohchlorophylllösung: Bei 428,5 nm und 661 nm weist die Absorptionskurve zwei Maxima auf. Diese Maxima werden hauptsächlich durch das Chlorophyll a hervorgerufen. Die Schultern bei 450,5 nm und 650nm beruhen auf der Absorption des Chlorophyll b, die ja vom Chlorophyll a überlagert ist. Zwischen 500 nm und 600nm befindet sich die sog. Grünlücke. Der Unterschied zu den Lehrbuchabbildungen lieg hier in der Überlagerung der beiden Spektren. Es gibt hier also kein reines Chlorophyll a oder b Spektrum sondern eine Mischform aus beiden. Carotinoide: Bei 451 nm und 478 nm liegen die Maxima der Kurve. Außerdem ist bei 669,5 nm noch eine kleine Schwankung zu erkennen. Sie beruht auf einer Verunreinigung der Lösung mit Chlorophyll. 3.) Versuch 1 c: Eigenschaften des Chlorophylls 3.1. Einleitung: Das sichtbare Licht, auch weißes Licht genannt, setzt sich aus verschiedenen Farben (Spektralfarben) zusammen. Wird das Licht durch ein Prisma geschickt, so werden die einzelnen Farben sichtbar. Wird das Licht dagegen vorher durch eine Lösung geschickt, die Strahlung einer bestimmten Wellenlänge absorbiert, so ist diese Farbe nicht mehr sichtbar. In diesem Versuch sollen die Eigenschaften des Chlorophylls durch verschiedene Versuche aufgezeigt werden. 3.2. Material und Methode: Zur Durchführung der Versuche benötigt man wieder eine Rohchlorophylllösung. Die weiteren Vorgehensweisen sind im Skript näher beschrieben. 3.3. Versuchsergebnisse: Wenn das Licht von einem Diaprojektor (Lichtquelle) durch die Rohchlorophylllösung fällt und dann über das Prisma in die einzelnen Spektralfarben aufgespaltet wird, ist zu erkennen, dass bei den Spektralfarben die Farben rot und blau fehlen. Es ist nur noch ein kleiner roter und ein grüner Streifen zu erkennen. 4 xxx xxx Versuchsprotokoll 1a- 1c Photosynthese Gruppe xx 07.05.2003 Hält man ein quaderförmiges Gefäß mit Chlorophylllösung in weißes Licht und betrachtet die Lösung so, dass man durch die dünne Seite (also eine dünne Schicht der Lösung) hindurchschaut, dann kann man feststellen, dass die Lösung grün ist. Durchschaut man aber die Lösung in der langen Richtung (dicke Chlorophyllschicht) so scheint die Lösung rot. Gibt man zu der Chlorophylllösung destilliertes Wasser hinzu und betrachtet die Lösung währenddessen unter einer UV-Lampe dann verschwindet die Fluoreszenz. Außerdem ist die Lösung trüb geworden. Auch die Temperatur der Lösung hat sich spürbar erhöht. Gibt man jedoch Methanol hinzu, bleibt die Lösung klar und auch die Fluoreszenz bleibt erhalten. Es ist keine Wärmeentwicklung festzustellen. Beim nächsten Teilversuch werden vier Reagenzgläser mit Rohchlorophylllösung befüllt. Eines dient als Vergleichsprobe. Nach Zugabe von 12 % iger HCl Lösung verändert sich die Farbe von grün zu oliv-gelb bis braun. In zwei Reagenzgläser wird nun zur Neutralisation NaOH gegeben. Die Farbe der Lösungen verändert sich jedoch nicht. In eines der beiden Reagenzgläser gibt man nun Fehling-I-Reagenz hinzu. Die Farbe verändert sich von dem beschriebenen oliv-gelb zu einem grünlichen Ton, der sich aber von der ersten Vergleichsprobe unterscheidet. Beim letzten Teilversuch werden nun die chlorophyllhaltigen Pflanzenteile einer säurehaltigen Pflanze (Sauerklee) in kochendes Wasser gegeben. Die Blätter färben sich sofort braun. 3.4. Auswertung: Wenn das Licht durch eine farbige Chlorophylllösung fällt, werden bestimmte Wellenbereiche absorbiert und damit aus dem projezierten Spektrum gelöscht. Aufgrund der oben erwähnten Absorptionsmaxima der Chlorophylle werden die hellrote und die blaue Strahlung sehr stark, die grüne jedoch gar nicht absorbiert. Wenn man jetzt die Chlorophyllkonzentration durch Änderung der dicke der Lösung variiert ändert sich auch das beobachtete Spektrum. Wenn die Chlorophyllschicht dicker wird, wird auch immer mehr grüne Strahlung absorbiert (im Spektrum ist im Bereich der „Grünlücke“ die Absorption ja nicht ganz null). Demnach ist jetzt nur noch der dunkelrote Anteil zu beobachten (über 700 nm und normalerweise von der Intensität der grünen Strahlung überdeckt und daher nicht sichtbar). Gibt man zu der fluoreszierenden Rohchlorophylllösung Wasser, dann wird die Fluoreszenz ausgelöscht. Das Chlorophyll geht aus der echten Lösung in die kolloidale Verteilungsform über. Da die Chlorophyllmoleküle ja einen hydrophilen Kopf und einen hydrophoben Schwanz haben, können sie sich in wässriger Lösung zu so genannten Micellen zusammenlagern, wobei der hydrophile Anteil nach außen zeigt (Hydrathülle). 5 xxx xxx Versuchsprotokoll 1a- 1c Photosynthese Gruppe xx 07.05.2003 Durch diese Aggregatbildung und die damit einhergehende enge Zusammenlagerung der Moleküle wird die Energieübertragung auf die Nachbarmoleküle wesentlich vereinfacht. Dadurch wird die Abgabe der Energie in Form von Wärme ebenfalls vereinfacht und die Fluoreszenz erlischt. Durch die vielen in der Lösung vorhandenen Chlorophyllaggregate wird das einfallende Licht auch stärker gebrochen und die Lösung erscheint trüb. Bei Zugabe von Methanol kommt es zu keiner Löschung der Fluoreszenz, da sich hier keine Micellen bilden können, bzw. können sich die Moleküle nicht so nah zusammenlagern. Bei Zugabe von HCl die Magnesiumatome, die sich als Zentralatom im Porphyrinring des Chlorophylls befinden, herausgelöst und durch zwei Wasserstoffatome ersetzt. Dadurch verliert das „Chlorophyll“ seine typischen Absorptionseigenschaften und die Lösung wird oliv-gelb bis braun. Es hat sich Phaeophytin gebildet. Die NaOH-Lösung dient zur Neutralisation der Säure. Gibt man nun Fehling-I-Lösung hinzu, welche Kupfer besitzt, werden die Wasserstoffatome durch Kupfer ersetzt. Somit entsteht Kupferchlorophyllin, das auch eine grüne Färbung aufweist. Durch das Kochen werden die chlorophyllhaltigen Zellen zerstört und der saure Vakuoleninhalt vermischt sich mit dem Cytoplasma. Durch die Säure kommt es wie oben beschrieben wieder zu einer Phaeophytinbildung und die Blätter braun. 4. Literatur: CAMPELL, Biologie, 5. Auflage, 1997, Spektrum Verlag, Stichwort „Photosynthese“ RICHTER, Biochemie der Pflanzen, 1996, Thieme Verlag BUSCHMANN + KRUMMBACH, Physiologie der Photosynthese, 1985, Springer Verlag LICHTENTHALER + PFISTER, Praktikum der Photosynthese, 1978, Quelle & Meyer HELDT, Pflanzenbiochemie, 2003, Spektrum Verlag 6