Minos E. Carvalho(Estratégias de Análise Proteônicas)

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Estratégias de análises
proteômicas
Minos E. Carvalho
Setembro de 2012
Proteoma
Genômica
Transcriptômica
Proteômica
Metabolômica
● Proteoma é o equivalente protéico do genoma.
WILKINS et al, 1996
Definições

Expressão protéica;

Proteômica comparativa;
(Paralelo quantitativo com uma proteína padrão ou de um estado
fisiológico)

“snapshots”;

“Spot” de proteínas.
Código genético
Seqüência de 3 nucleotídeos do DNA : códon
A seqüência destes códons no DNA é copiada em RNAm
Codifica um aminoácido, unidade básica da
estrutura das proteínas
A seqüência dos aminoácidos dá origem a diferentes
proteínas
Códons
A importância das Proteínas
Por serem:
Fenômenos biológicos:

Enzimas;

Produção de energia;

Anticorpos;

Defesa imunológica;

Hormônios;

Contração muscular;

Componentes
estruturais;

Atividade
neuroquímica;

Receptores celulares;

Reprodução;

Etc...

Etc...
Sousa et al.,1999.
As proteínas e biomarcadores...
Aplicações
Avaliar proteínas expressas ou reprimidas:

Efeito de fármacos;

Condições patológicas;

Diferenciação celular;

Comparação de variedades da mesma espécie;

Respostas celulares a estímulos externos
diversos; etc...
Introdução
Estudos Proteômicos
Possibilita:

Caracterizar panoramas protéicos;

Identificar modificações de perfis protéicos;

Buscar isoformas de proteínas;

Modificações pós-traducionais.
Bendixen, 2005; Pan et al., 2005.
Modificações Pós-Traducionais

Fosforilação;

Acetilação;

Glicolisação;

Sulfonação;

Etc...
Resíduos de aminoácidos fosforilados.
(A)fosfoserina, (B) fosfotirosina e
(C) fosfotreonina
Proteínas Moonlighting

Apresentam mais de uma função dentro
de uma mesma célula ou do mesmo
organismo...
Não podem ser produtos:
 diferentes processamentos de RNAs;
 de fusões de genes;
 da existência de isoformas.
Fosfoglucose isomerase, uma proteína moonlighting
Catalisa o segundo passo da
glicólise [a interconversão da
glucose-6-fosfato (G6P) em
frutose-6-fosfato (F6P)].
Em
células
tumorais
podem causar o aumento
na mobilidade de células
tumorais.
Mapas protéicos

1o proteoma completo foi reportado por
Ghaemmaghami et al., 2003;
Caracterizações em espécies de produção:



Suínos: Lamestch et al., 2002;
Bovinos: Bouley et al., 2004;
Aves: Doherty et al., 2004.
Análise do mapa “In silico”
Exemplo:
Mapa protéico em suínos
Estudo no pós abate (L. dorsi)
LAMETSCH et al., 2003.
Procedimentos: Avaliação da expressão protéica
Eletroforese Bi-Dimensional:
• 1ª Dimensão
Separação
das
isoelétrico;
-
Focalização isoelétrica
proteínas
por
ponto
Ettan IPGphor (GE Healthcare)
• 2ª Dimensão - Corrida eletroforética
Separação por massa molecular;
Cuba de eletroforese
Avaliação da expressão protéica
Análise do mapa “In silico”:
• Os géis 2-DE são analisados com o auxílio de softwares
Exemplo: ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences);
• Os “spots”: detectados e quantificados;
Procedimentos: Avaliação da expressão protéica
Análise do mapa “In silico”:
• Os géis 2-DE são analisados;
• Os “spots” são: detectados e quantificados;

intensidade dos spots

estado protéico

 coloração

identificação de 500 –
2000 proteínas
BOULEY et al, 2004.
Procedimentos: Avaliação da expressão protéica
Digestão in-gel das proteínas:
Enzimas: Tripsina, Endoproteinase (Lys-C e Arg-C), Elastase, Quimotripsina,
Pepsina e Pronase.
Sequenciamento de peptídeos por LC-MS/MS
Espectros de Sequenciamentos
Inten.(x100,000)
735.94
7.0
642.42
490.96
6.0
5.0
4.0
3.0
428.62
2.0
1.0
485.62
368.47
0.0
300
350
400
450
679.89
577.37
500
550
600
650
700
746.93
750
800
850
900
950m/z
Inten.(x100,000)
893.21
1.75
942.81
1.50
1.25
1.00
848.41
998.16
0.75
1060.50
771.57
0.50
0.25
567.20
1211.69
737.98
1304.95
545.24
0.00
500
1131.10
662.83
600
700
1220.49
800
900
1000
1100
1200
1300
1413.47
1400
1541.66
1500
1600
m/z
Espectro de Sequenciamento interpretado
I/LMGAVGGAI/LQI/LW.....
Bioinformática: Banco de dados e ferramentas
Bancos de Dados de proteínas mais utilizados em
bioinformática

Genbank: www.ncbi.nlm.nih.gov
Banco de dados americano de seqüências de DNA e proteínas.

PDB: www.rcsb.org/pdb
Armazena estruturas tridimensionais resolvidas de proteínas.
PIR: www-nbrf.georgetown.edu
Banco de proteínas anotadas.


SWISS-PROT: www.expasy.ch/spro
Armazena seqüências de proteínas e suas respectivas características
moleculares, anotado manualmente por uma equipe de especialistas.

INTERPRO: www.ebi.ac.uk/interpro
Banco de dados de famílias e domínios.
Objetivos dos dados gerados dos estudos
proteômicos

Esclarecer as proteínas envolvidas nas rotas metabólicas;

Identificar novos alvos farmacológicos e marcadores
biológicos relacionados ao estabelecimento do fenômeno ou
progressão;

Identificação de moléculas bioativas a extratos naturais;

Caracterização de respostas celulares a novas drogas,
doenças e ambientes.
Representação da distribuição funcional das proteínas no
músculo Semitendinosus de bovinos
Metabólicas (25,5%)
Estruturais (17%)
Sistema de Defesa (16%)
Contráteis (14,5%)
Outras (25,5%)
Não identificadas (1,5%)
% de proteínas identificadas
BOULEY et al, 2004.
Dinâmica protéica
Chaze, et al. 2008.
Um potencial marcador
Amostras L. dorsi: biopsia e 1h postmortem
Força de cisalhamento: 7 dias
178 animais
Extremos 13 animais
A peroxiredoxina – 6 pode ser um potencial marcador para
maciez da carne bovina na análise protéica antes e logo
após o abate.
Jia et al, 2009.
Trabalho do Grupo de Biotecnologia Animal
Dep. Zootecnia - ESALQ
Estratégia Experimental: Expressão protéica dos
valores extremos para maciez da carne
4% menor
maciez
(6 animais)
4% maior
maciez
(6 animais)
Informações descritivas dos extremos de força de cisalhamento
Extremos
Menor FC
Maior FC
1
1FC0
Característica
N
MÉDIA
DP6
CV%7
MIN
MAX
FC01
6
6,504
1,07
16,6
4,52
7,75
FC72
6
3,084
0,76
24,9
1,97
4,34
FC143
6
2,014
0,51
25,8
1,65
3,02
Espessura de
Gordura
6
8,175
1,33
16,2
7,00
10,00
pH(24h)
6
5,57
0,16
2,8
5,38
5,85
FC01
6
9,344
1,43
15,4
7,22
11,60
FC72
6
7,584
0,77
10,2
6,30
8,43
FC143
6
5,584
1,55
27,7
3,54
7,49
Espessura de
Gordura
6
6,175
2,40
38,8
4,00
10,00
pH(24h)
6
5,67
0,24
4,2
5,36
5,97
= força cisalhamento 24 horas pos abate, 2FC7 = força cisalhamento com 7
dias de maturação , 3FC14 = força cisalhamento com 14 dias de maturação,
4valores em kgf/cm2, 5valor em milímitros, 6DP=desvio padrão e 7CV=coeficiente
de variação
pI
P
M
pI
pI
SDS-PAGE
2º Dimensão
P
M
P
M
Coomassie G250
Focalização Isoelétrica
Eletroforese
1º Dimensão
2D
-
I
6
Análise
de
Imagem
Extração
Proteínas
Maceração
I
2
Tecido
Análise do mapa “In silico”
Software: ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences)
Análise da expressão diferencial
Grupos comparativos da intensidades dos volumes
(carne com maior maciez versus menor maciez)
Spots diferencialmente expressos
pH
4
176: Complex III subunit 1
241
1: Acyl-CoA binding
domain cantaining
protein 6
122: Alpha-actin-1
236: HSP70-1
7
150: Alpha-actin-1 327: Beta-LG
170
130
255
100
70
135
55
138: uncharacterized
126
40
112: Tropomyosin-1
35
239
matchs
25
15
54: MLC1/MLC3
59: HSPB1
297: MLC2F
50: HSPB1
106: HSPB1
Identificação das proteínas
Digestão in-gel das proteínas:
Enzimas: Tripsina
Sequenciamento de peptídeos MS/MS
Laboratório Max Feffer Genética de
Plantas Departamento de Genética ESALQ-USP, Piracicaba, SP.
SYNAPT G2 HDMS
- Waters
Resultados
Proteínas em maior expressão no grupo de maior maciez
da carne
Spot
Identificação
Score
Massa (KDa)
teórica/aparente
Acesso
Uniprot
Expressão no
menor força de
cisalhamento
50
Heat shock protein beta 1
178
22,39/21
Q3T149
↑
106
Heat shock protein beta-1
267
22,39/34
Q3T149
↑
122
Actin, alpha skeletical muscle
386
42,05/36
P68138
↑
138
Uncharacterized protein
102
35,35/37
F1MBK8
↑
327
Beta-lactoglobulin
190
19,88/36
P02754
↑
Resultados
Proteínas em menor expressão no grupo de maior maciez
da carne
Spot
1
Identificação
Acyl-CoA-binding domain-cantaining
protein 6
Score
Massa (KDa)
teórica/aparente
Acesso
Uniprot
Expressão na
menor força de
cisalhamento
194
31,27/54
A2VDR2
↓
54
Myosin light chain 1/3, muscle isoform
208
20,93/21
A0JNJ5
↓
59
Heat shock protein beta-1
323
22,39/22
Q3T149
↓
112
Tropomyosin alpha -1 chain
143
32,69/35
Q5KR49
↓
150
Actin, alpha skeletical muscle
335
42,05/38
P68138
↓
270
52,7/44
P31800
↓
265
70,25/65
Q27975
↓
246
19,01/15
Q0P571
↓
176
236
297
Cytochrome b-c1 complex subunit 1,
mitochondrial
Heat shock 70 kDa protein 1A
Myosin regulatory light chain 2,
skeletal muscle isoform
Proteínas HSP –“heat shock proteins”
Características das HSP
- É a forma mais efetiva de proteção ao calor
- Induzidas quando temperatura aumenta 10°C acima da
ótima
- Protegem as proteínas, membranas e organelas durante o
estresse por calor
- HSP são rapidamente transcritas pelo núcleo
- Atuam como chaperonas moleculares (proteínas que
previnem associações impróprias entre proteínas)
Proteínas HSP –“heat shock proteins”
Funções das HSP
- previnem a agregação das proteínas
- ajudam as proteínas desnaturadas a refazerem-se
- auxiliam no dobramento das novas proteínas
Localização
Núcleo-Citoplasma-Cloroplastos-Mitocôndrias-Retículo
endoplasmático
Conclusões
• Primeiro estudo de proteômico do tecido muscular com bovinos de
origem Bos taurus indicus (Nelore);
• Estratégia de comparar extremos para os valores de força de
cisalhamento foi eficiente;
• Os resultados confirmam algumas proteínas já associadas com a
maciez da carne em outras raças;
• Novas proteínas foram identificadas com associação com a maciez
da carne na raça Nelore;
• O processo de amaciamento da carne está envolvido com a
expressão de várias proteínas.
Exercício Bioinformática
Exemplo:
Identifique e caracterize essas amostras através das seqüências
peptídicas obtidas pelos espectros analisados. Ferramentas de
Bioinformática BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ - Protein
Blast) e UNIPROT (http://www.uniprot.org/)
•
•
•
•
•
•
•
•
Amostra A: VAHTVCQTGESTKPSSK
Amostra B: AAVEEGIVPGGGTALAR
Amostra C: IKPYDEYYVWR
Amostra D: GKCYGEDVLQANNLPSSR
Amostra E: RDKRNGIILKKEILK
Amostra F: ASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAI
Amostra G: KKEGIE WTFIDFGMDL AACIELIEKP
Amostra H: FEARK KEEEELIALK ERIEKR
Exercício Bioinformática
Exemplo:
Identifique e caracterize essas amostras através das seqüências
peptídicas obtidas pelos espectros analisados. Ferramentas de
Bioinformática BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ - Protein
Blast) e UNIPROT (http://www.uniprot.org/)
•
•
•
•
•
•
•
•
Amostra A: VAHTVCQTGESTKPSSK
Amostra B: AAVEEGIVPGGGTALAR
Amostra C: IKPYDEYYVWR
Amostra D: GKCYGEDVLQANNLPSSR
Amostra E: RDKRNGIILKKEILK
Amostra F: ASGRTTGIVMDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAI
Amostra G: KKEGIE WTFIDFGMDL AACIELIEKP
Amostra H: FEARK KEEEELIALK ERIEKR
Obrigado....