Efeitos do exercício físico associado ao - Pós

Transcrição

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho
Locomotor
Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos:
estudo experimental com ratas ovariectomizadas.
Roberta Carminati Shimano
Orientador: Prof. Dr. João Paulo Mardegan Issa
Ribeirão Preto
2013
ROBERTA CARMINATI SHIMANO
Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos:
estudo experimental com ratas ovariectomizadas
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em Ciência da
Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor.
Área
de
Concentração:
Ciência
da
Saúde
Aplicadas ao Aparelho Locomotor.
Orientador: Prof. Dr. João Paulo Mardegan Issa.
VERSÃO CORRIGIDA
Ribeirão Preto
2013
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO OU PESQUISA DESDE QUE CITADA A FONTE.
NOTA: Versão corrigida da Tese. A versão original se encontra disponível na Unidade que
aloja o Programa.
FICHA CATALOGRÁFICA
Shimano, Roberta Carminati
Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos: estudo
experimental com ratas ovariectomizadas. Ribeirão Preto, 2013.
94p; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/usp. Área de concentração: Ciência Aplicadas ao Aparelho Locomotor. Opção:
Reabilitação.
Orientador: Issa, João Paulo.
1.Osteopenia. 2.Ovariectomia. 3.Exercício Físico. 4.Risedronato.
Obs.: A versão original encontra-se na Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto/USP.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Roberta Carminati Shimano. Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos
osteopênicos: estudo experimental com ratas ovariectomizadas.
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde
Aplicadas ao Aparelho Locomotor.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Aplicadas ao
Aparelho Locomotor. Opção: Reabilitação.
Aprovado em: _____/_____/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr.______________________________________________________________________________________________________
Instituição:___________________________________________________________________________________________________
Julgamento:__________________________________ Assinatura:__________________________________________________
Prof. Dr.______________________________________________________________________________________________________
Instituição:___________________________________________________________________________________________________
Prof. Dr.______________________________________________________________________________________________________
Instituição:___________________________________________________________________________________________________
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus, que sempre esteve ao meu lado, iluminando
minhas decisões, dando-me forças para continuar acreditando que este dia chegaria.
A minha mãe, Maria Aparecida, e minha madrinha “mãe’’, Maria Teresa, pelo
amor incondicional, exemplo de força, com as palavras e gestos que me deram segurança para
seguir o caminho que escolhi.
A minha irmã Renata, o grande apoio na minha vida, aos sorrisos que me alegram,
conselhos, amor, carinho e amizade incomparável.
Ao
meu
querido
namorado,
Bill
Rocha,
pela
compreensão,
amizade,
companheirismo e paciência, oferecendo a mim sua tranquilidade e seu amor, e sonhando
junto comigo os planos do futuro.
Ao meu Professor, Dr. João Paulo Mardegan Issa, meu orientador, exemplo de
ética, competência e serenidade, pela confiança e por seu empenho em ajudar.
Ao professor, Dr. Antônio Carlos Shimano, pela oportunidade, confiança e pela
constante disponibilidade em me ajudar.
Ao professor, Dr. José Batista Volpon, pelo exemplo de dedicação e
profissionalismo, por disponibilizar o acesso ao laboratório e os recursos indispensáveis à
realização do experimento.
Ao professor, Dr. Edilson Ervolino, pelos ensinamentos e ajuda para que a
imunoistoquímica fosse realizada.
Aos funcionários do Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Francisco Mozzocato, Rita Cossalter, Maria Teresinha, Luís Henrique,
Carlos Alberto Moro, Reginaldo Trevilato e a Lu, pelo auxílio, amizade e convívio
agradável.
À iniciação científica, Taiane Paliologo, pelo comprometimento, ajuda e dedicação
para que esse projeto fosse realizado.
Aos meu novos e grandes amigos feitos na pós graduação, Patrícia Moura e Rodrigo
Andraus, por todo carinho, ensinamento e amizade dedicada.
Aos doutorandos e amigos, Ana Paula Macedo, Maurício Falcai e Bruna Kotake,
pela imensa ajuda, apoio e conhecimento que foram fundamentais para o desenvolvimento
deste trabalho.
Ao amigo Rodrigo Okubo, que me incentivou no começo de tudo, pela ajuda e
atenção.
Aos colegas da Pós graduação, Jorge Imori, Vitor, Thiago Rochetti, Bruno Cimatti,
Maria Júlia Paulo, Ariane Zamarioli, Mariana Butezllof, Mariana Fukuda, Débora
Tafarel, Miliane Gonzaga, Hildemberg Santiago, Takae kitabatake, Gabriela Yanagihara e
Aline Goulart pela amizade e agradável convivência durante o curso.
Aos funcionários e colegas do laboratório de Odontologia, sempre atenciosos.
As minhas amigas de coração e toda vida, Laiz Sousa, Gabriela Rosa, Lara
Carneiro, Inaê Ferreira, Bruna Morgado, Bianca Pavan e Juliana Cohen por todos os
conselhos valiosos, apoio, carinho, principalmente dos últimos meses.
Ao Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
À CAPES pelo apoio financeiro.
RESUMO
SHIMANO, R.C. Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos
osteopênicos: Estudo experimental com ratas ovariectomizadas. 2013. 94f. Dissertação
(Mestrado)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2013.
Introdução: Alguns tratamentos já foram desenvolvidos objetivando a prevenção e tratamento
de perda da massa óssea; reposição hormonal, bisfosfanatos e atividades físicas. Há
discussões sobre o melhor método profilático e terapêutico da osteoporose. Com isso,
objetivou-se avaliar os efeitos do exercício físico associado ao medicamento risedronato
como meio profilático e terapêutico em ossos osteopênicos de ratas submetidas à
ovariectomia. Para isso foram utilizadas 48 ratas Wistar, divididas em 8 grupos
experimentais: ovariectomizados e sedentárias por 12 semanas (OVX); ovariectomizado e as
12 semanas seguintes administrado risedronato (OVXM); ovariectomizados e treinamento
físico na esteira durante 12 semanas (OVXC); ovariectomizados e as 12 semanas seguintes
administrado risedronato associado com o treinamento físico na esteira (OVXCM);
submetidos à cirurgia simulada e sedentários por 12 semanas (SHAM); submetidos à cirurgia
simulada, e as 12 semanas seguintes administrado risedronato (SHAMM); submetidos à
cirurgia simulada, seguida de treinamento físico na esteira durante 12 semanas (SHAMC);
submetidos à cirurgia simulada, e as 12 semanas seguintes administrado risedronato associado
com treinamento físico na esteira (SHAMCM). Todos os grupos, após 12 semanas, foram
eutanasiados. Após o procedimento experimental, as tíbias foram dissecadas e submetidas ao
ensaio mecânico de flexão de três pontos, histologia e densitometria óssea. Os dados foram
analisados por testes estatístico com nível de significância 5%. Os resultados em relação ao
peso, os animais ovariectomizados ganharam um aumento de peso significativamente maior
que os dos grupos SHAMs. Obtivemos como resultado do ensaio mecânico em relação a
rigidez, o grupo SHAMM com valores inferiores ao OVXM (p=0,001); na força máxima, os
grupos SHAMM também com valores inferiores ao OVXM e OVXCM (p=0,002), na
densitometria global não apresentou diferença estatística entre os grupos, já na densitometria
proximal, o grupo OVX com valores inferiores a SHAMM e SHAMCM (p<0,000), na análise
histológica de colágeno tipo I o grupo SHAMM com valores inferiores aos grupos OVX e
OVXCM (p=0,001), no colágeno tipo III o grupo OVX teve valores inferiores aos grupos
SHAMC e SHAMCM (p<0,001); na quantificação de microarquitetura de trabeculado ósseo
o grupo OVX obteve valores inferiores aos SHAMC, OVXM, SHAMCM e OVXCM e os
grupos OVXCM e SHAMCM tendo resultados superiores ao SHAM, SHAMM e OVXC
(p<0,001) e a imunoistoquímica, a imunomarcação para OPG, foi maior no grupo SHAMCM,
no RANKL e no TRAP, o grupo OVX se destacou. Conclui-se que o exercício físico e o
medicamento, altera para melhor as propriedades biomecânicas dos ossos de ratas
ovariectomizadas. O medicamento risedronato não tem benefícios na prevenção primária. O
medicamento foi mais eficaz em relação a corrida nos grupos ovariectomizados, e quando
juntos, os tratamentos foram mais eficazes.
Palavra chave: Osteopenia, Osteoporose, Ovariectomia, Risedronato e Exercício Físico.
ABSTRACT
SHIMANO, C.S. Effects of physical exercise associated with risedronate in osteopenic
bone: An experimental study with ovariectomized rats. 2013. 94f. Thesis- Faculty of
Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013
Introduction: Some treatments have been developed aiming at the prevention and treatment of
bone loss, hormone replacement bisfosfanatos and physical activities. There are discussions
about the best prophylactic and therapeutic treatment of osteoporosis. Thus, this study aimed
to evaluate the effects of physical exercise associated with the drug risedronate as a
prophylactic or therapeutic osteopenic bones of rats subjected to ovariectomy. For this we
used 48 Wistar rats were divided into 8 groups: ovariectomized sedentary for 12 weeks
(OVX), ovariectomized and 12 weeks following administered risedronate (OVXM);
ovariectomized and physical training on the treadmill for 12 weeks (OVXC); ovariectomized
and 12 weeks following administered risedronate associated with physical training on the
treadmill (OVXCM); underwent sham surgery and sedentary for 12 weeks (SHAM);
undergoing sham surgery, and 12 weeks following administered risedronate (SHAMM);
undergoing surgery simulated, followed by physical training on the treadmill for 12 weeks
(SHAMC); undergoing sham surgery, and 12 weeks following administered risedronate
associated with physical training on the treadmill (SHAMCM). All groups after 12 weeks
were euthanized. After the experimental procedure, the tibias were dissected and subjected to
mechanical testing of three-point bending, histology and bone densitometry. Data were
analyzed by statistical tests with significance level of 5 %. The results in terms of weight, the
increase ovariectomized animals gained weight significantly higher than the shams groups.
Obtained as a result of mechanical test hardness compared to the group SHAMM with values
lower than the OVXM (p=0.001), in the maximum strength also SHAMM groups with lower
values than the OVXM and OVXCM (p=0.002) in the overall density not statistical difference
between the groups, since the proximal densitometry, the OVX group with lower values and
Shamm SHAMCM (p<0.000), histological analysis of collagen type I group SHAMM with
values lower than OVXCM and OVX groups (p=0.001), type III collagen in the OVX group
had lower values than SHAMC and SHAMCM groups (p<0.001) in the quantification of
trabecular bone microarchitecture of the OVX group obtained lower values than SHAMC,
OVXM, SHAMCM and OVXCM groups, and OVXCM and SHAMCM groups having better
results than the SHAM, SHAMM and OVXC groups (p<0.001); and immunohistochemistry,
immunostaining for OPG was higher in SHAMCM group in RANKL and TRAP, the OVX
group stood out. We conclude that physical exercise and medication changes for the better
biomechanical properties of the bones of ovariectomized rats. The drug risedronate has
benefits in primary prevention. The drug was more effective compared to the ovariectomized
animals race and when together were more effective treatments.
Keyword: Osteopenia, Osteoporosis, Ovariectomy, Risedronate and Exercise.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tricotomia da região ventral......................................................................
33
Figura 2. Incisão reta transversal...............................................................................
33
Figura 3. Localização do Ovário...............................................................................
33
Figura 4. Retirada do Ovário.....................................................................................
33
Figura 5. Sutura.........................................................................................................
33
Figura 6. Animal Ovariectomizado...........................................................................
33
Figura 7. Distribuição dos Grupos Experimentais.....................................................
35
Figura 8. Esteira motorizada Insight (Modelo EP – 131)..........................................
36
Figura 9. Metodologia de preparo do medicamento..................................................
37
Figura 10. Foto do posicionamento do osso para o exame de densitometria............
39
Figura 11. Densitometria e a área de varredura da tíbia............................................
40
Figura 12. Tíbia posicionada na Máquina Universal de ensaio (EMIC® - 10000N).
41
Figura 13. Fotomicrografias evidenciando o aspecto histológico das trabéculas
ósseas nos grupos SHAM (A), OVX (B), SHAMC (C), OVXC (D), SHAMM (E),
OVXM (F), SHAMCM (G), OVXCM (H). Coloração: H&E…………………….
58
Figura 14. Padrão de imunomarcação de TRAP, RANKL e OPG. A:
Fotomicrografia evidenciando um osteoclasto TRAP positivo (seta preta). B:
Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto RANKL positivo (seta azul). C:
Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto OPG positivo (seta vermelha).
Abreviações e símbolos: bt, trabécula óssea………………………………………
59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Protocolo de Treinamento Físico em Esteira..........................................
36
Tabela 2. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da
Rigidez pela análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais:
SHAM,
SHAMC,
SHAMM,
SHAMCM,
OVX,
OVXC,
OVXM,
OVXCM....................................................................................................................
49
Tabela 3. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima da Força
Máxima pela análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais:
SHAM,
SHAMC,
SHAMM,
SHAMCM,
OVX,
OVXC,
OVXM,
OVXCM....................................................................................................................
50
Tabela 4. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da
densidade óssea pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos
experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM,
OVXCM....................................................................................................................
52
Tabela 5. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima, da
densidade óssea da área proximal pela análise realizada nas tíbias avaliados nos
grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC,
OVXM, OVXCM.....................................................................................................
53
Tabela 6. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima do
colágeno tipo I pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas
nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX,
OVXC,
OVXM,
55
OVXCM......................................................................................................
Tabela 7. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínimo, máximo do
colágeno tipo III pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas
nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX,
OVXC,
OVXM,
56
OVXCM......................................................................................................
Tabela 8. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima, da
quantificação do trabeculado ósseo, pela análise realizada nas partes proximais
das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM,
SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM....................................................................
57
LISTA DE GRÁFICOS
Grafico 1. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos SHAMs, obtenção da
reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento......
46
Grafico 2. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos OVXs, obtenção da
reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento......
47
Gráfico 3. Análise da Rigidez (N/mm) para os diferentes grupos experimentais.....
48
Gráfico 4. Análise da Força Máxima (N) para os diferentes grupos experimentais.
50
Gráfico 5. Análise da Densitometria óssea total (g/cm2) para os diferentes grupos
experimentais..............................................................................................................
51
Gráfico 6. Análise da Densitometria óssea proximal (g/cm2) para os diferentes
grupos experimentais..................................................................................................
53
2
Gráfico 7. Análise do colágeno tipo I (μm ) para os diferentes grupos
experimentais..............................................................................................................
54
Gráfico 8. Análise do colágeno tipo III (μm2) para os diferentes grupos
experimentais..............................................................................................................
56
Gráfico 9. Análise da quantificação do trabeculado ósseo (μm2) para os diferentes
grupos experimentais..................................................................................................
57
Gráfico 10. Mediana dos valores da Imunomarcação para OPG..............................
59
Gráfico 11. Mediana dos valores da Imunomarcação para RANKL.........................
60
Gráfico 12. Mediana dos valores da Imunomarcação TRAP....................................
61
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ANOVA- Análise de variança
CEUA- Comissão Ética Uso de Animais
cm- Centímetros
DMO- Densidade Mineral Óssea
EDTA- Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
FMRP- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
g- Gramas
GL- Gay Lussac: quantidade em mililitros de álcool absoluto contida em 100 mililitros
de mistura hidro-alcoólica.
m/min- Metros por minutos
ml- Mililitro
mm- Milímetros
N - Newton
o
- Graus
o
C – Temperatura (graus Celsius)
OMS- Organização Mundial de Saúde
OPG- Osteoprotegerina
OVX- Ovariectomia
OVXC- Ovariectomia e corrida
OVXCM- Ovariectomia, corrida e medicamento
OVXM- Ovariectomia e medicamento
PTH- Hormônio da paratireóide
RANK- Receptor ativador do fator nuclear kB
RANKL- Ligante do receptor
SHAM- Cirurgia simulada
SHAMC- Cirurgia simulada e corrida
SHAMCM- Cirurgia simulada, corrida e medicamento
SHAMM- Cirurgia simulada e medicamento
TRAP- Fosfotase ácida resistente ao tartarato
USP- Universidade de São Paulo
μm – Micrômetros
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................
15
1.1 Tecido Ósseo...................................................................................................
16
1.2 Remodelação Óssea.........................................................................................
17
1.3 Osteopenia e Osteoporose ..............................................................................
18
1.4 Modelo Experimental de osteopenia em ratas...............................................
20
1.5 Atividade física................................................................................................
21
1.6 Risedronato......................................................................................................
24
1.7 Medidas de mensuração óssea.......................................................................
25
2. OBJETIVO............................................................................................................
28
2.1Objetivo Primário.............................................................................................
28
2.2Objetivo Secundário.........................................................................................
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................
30
3.1 Animais experimentais....................................................................................
31
3.2 Procedimento experimental.............................................................................
31
3.2.1 Técnica Cirúrgica..................................................................................
31
3.2.1.1 Ovariectomia.............................................................................
32
3.2.1.2 Sham..........................................................................................
34
3.3 Grupos experimentais......................................................................................
34
3.4 Técnica de Treinamento Físico........................................................................
35
3.5 Administração do Risedronato........................................................................
37
3.6 Peso Corpóreo.................................................................................................
38
3.7 Análise da estrutura óssea...............................................................................
38
3.8 Densidade mineral óssea.................................................................................
38
3.9 Análise mecânica.............................................................................................
40
3.10 Histologia......................................................................................................
41
3.10.1 Processamento Histológico.................................................................
41
3.10.2 Análise Microscópica..........................................................................
42
3.10.2.1 Quantificação das fibras colágenas tipo I e III.....................
42
3.10.2.2 Quantificação de trabeculado ósseo.....................................
42
3.11 Técnica imunoistoquímica.............................................................................
43
3.11.1 Análise do padrão de imunomarcação das amostras submetidas à
imunoperoxidase.............................................................................................
43
3.12 Análise Estatística.........................................................................................
44
4. RESULTADOS.....................................................................................................
45
4.1 Avaliação Clínica............................................................................................
46
4.2 Peso corpóreo..................................................................................................
46
4.3 Ensaio Mecânico.............................................................................................
47
4.3.1 Rigidez...................................................................................................
48
4.3.2 Força Máxima........................................................................................
49
4.4 Densitometria..................................................................................................
51
4.4.1. Densitometria Óssea Global.................................................................
51
4.4.2 Densitometria Óssea Área Proximal.....................................................
52
4.5 Análise Histológica.........................................................................................
53
4.5.1.Colágeno tipo I......................................................................................
54
4.5.2 Colágeno tipo III....................................................................................
55
4.5.3 Quantificação da microarquitetura do trabeculado ósseo na região
proximal da tíbia.............................................................................................
56
4.6 Padrão de imunomarcação...............................................................................
58
4.6.1 OPG.......................................................................................................
59
4.6.2 RANKL.................................................................................................
60
4.6.3 TRAP.....................................................................................................
60
5. DISCUSSÃO.........................................................................................................
62
6. CONCLUSÃO.......................................................................................................
70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................
72
ANEXO......................................................................................................................
93
INTRODUÇÃO
Introdução | 16
1. INTRODUÇÃO
1.1 Tecido Ósseo
O tecido ósseo é o principal constituinte do esqueleto, é um tipo especializado de
tecido conjuntivo composto por células e material extracelular mineralizado, a matriz óssea.
As células que constituem esse tecido são os osteócitos que se localizam em cavidades ou
lacunas no interior da matriz, os osteoblastos, produtores de parte orgânica da matriz
responsáveis pela aposição óssea; e os osteoclastos, células gigantes, móveis e
multinucleadas, que reabsorvem o tecido ósseo, tomando parte dos processos de remodelação
dos ossos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). O osso está em constante atividade, não só no
esqueleto imaturo, onde o crescimento e desenvolvimento são rapidamente perceptíveis; mas
também no esqueleto maduro, com os constantes e equilibrados processos de formação e
reabsorção (RESNICK et al., 1995).
Nos indivíduos, a arquitetura dos ossos, em sua maioria, é semelhante, sendo
composta de osso do tipo trabecular e do tipo cortical (MUNDY, 2000). No trabecular, as
trabéculas de tecido ósseo mineralizado se interconectam formando uma rede resistente a
cargas mecânicas, e de maneira contínua são remodeladas nas superficies endosteais, os
espaços vazios entre estas são preenchidos pela medula óssea (KALFAS, 2001), já para o
cortical, a sua forma é compacta circunscrevendo o osso trabecular e ajudando na manutenção
da integridade estrutural (UDDO, 2002). O osso cortical é predominate no esqueleto
apendicular, com distribuição concêntrica em volta de canais centrais que possuem o sistema
harvesiano, sendo constituído por vasos sanguíneos, linfáticos, nervos e tecido conjuntivo
(CORONHO et al., 2001).
O esqueleto é constituído por 80% de tecido cortical e 20% tecido trabecular
(RAMALHO; CASTRO, 1999). O osso trabecular está presente nas vertebras, crânio, pélvis e
epífise de ossos longos; já o cortical é predominante à porção medial dos ossos longos
(CAMPOS, 2003).
O tecido ósseo é multifuncional (DUCY et al., 2000), entre as inúmeras funções
temos a manutenção do nível sanguíneo de cálcio, fornecimento de suporte mecânico para
tecidos moles e de alavanca para a ação muscular, dando abrigo e proteção para o cérebro e a
medula espinhal (HARADA; RODAN, 2003).
Introdução | 17
Conforme Raiz (1999) e Bland (2000), o tecido ósseo pode ser influenciado pela
dieta, estímulos físicos e fatores genéticos. Os hormônios, fatores de crescimento, citocinas e
comunicação celular, são controladores do metabolismo ósseo.
1.2 Remodelação Óssea
O processo de remodelação óssea é contínuo (RIGGS, 2000), explicado pela
deposição e reabsorção de material na estrutura óssea, em taxas relativamente baixas. Na
remodelação, a reabsorção é seguida de formação óssea em ciclos constantes orquestrados
pelas células do tecido ósseo. Em situações fisiológicas normais, a reabsorção e a formação
são fenômenos acoplados e dependentes, e o predomínio de um sobre o outro pode acarretar
ganho ou perda de massa óssea (HANLEY, 2000). A remodelação acontece no osso cortical e
no trabecular, sendo mais intensa no trabecular, pela sua disposição e função de trabéculas
ósseas (SARAIVA; LAZARETTI-CASTRO, 2002).
Há um sistema de comunicações entre as linhagens celulares de osteoclastos e
osteoblastos para uma adequada remodelação óssea. A reabsorção de osso velho pelos
osteoclastos, seguida de formação de osso novo pelos osteoblastos são processos
estreitamente relacionados. (FERNANDES et al., 1996).
Os fatores que controlam a reabsorção óssea não estão totalmente elucidados.
Acredita-se em que a ativação da reabsorção óssea, é um processo controlado por fatores
locais (bioquímicos e físicos) e sistêmicos (hormônio paratireoideo, calcitonina e hormônios
sexuais).
O desequilíbrio das atividades dos osteoblastos e osteoclastos geram alterações
ósseas, levando anormalidades esqueléticas, gerando aumento ou diminuição da massa óssea
(KONG et al., 1999).
Segundo Aires (2008), até a idade aproximada de 40 anos, a homeostase se mantém;
porém, a partir daí, é possível verificar um discreto predomínio de reabsorção sobre a
formação óssea, caracterizando um estado osteopênico fisiológico. Nas mulheres esse estado
desfavorável é mais intenso, pois ocorre redução dos níveis estrogênio que a pós menopausa
gera. O estrogênio controla, nos osteoblastos, a expressão que codifica o colágeno tipo I, a
fosfatase alcalina, a osteopontina, osteocalcina e a osteonectina (OKAZAKI et al., 2002).
Outra função do estrógeno é aumentar a diferenciação dos osteoblastos e estimular a síntese e
Introdução | 18
a mineralização da matriz óssea (TOMKINSON et al., 1998; LIEL et al., 1999; BLAND,
2000), além de estimular a apoptose dos osteoclastos, manter os osteócitos viáveis, ocorrendo
na sua deficiência aumento da taxa de apoptose dessas células (TOMKINSON et al., 1997;
D’AMELIO et al., 2008). Nas mulheres, após a menopausa ocorre um desquilíbrio entre os
processos de reabsorção e remodelação óssea. Os osteoblastos estão ativos; porém, não são
capazes de reconstruir completamente as cavidades ósseas reabsovidas pelos osteoclastos,
com isso, inicia-se o aumento da perda óssea (NECO, 1994).
Acredita-se em que a deficiência do hormônio estrogênio seja o principal risco para
osteoporose em mulheres na menopausa, esse tipo de osteoporose é associado à má absorção
intestinal de cálcio, redução da síntese de vitamina D ativa e balanço negativo de cálcio
graças à redução na secreção de estrogênio (KOBAYASHI et al., 2002; ZHANG et al., 2008).
1.3 Osteopenia e Osteoporose
Segundo alguns autores a osteopenia é a diminuição da massa óssea, causada
pela retirada de cálcio, podendo ter como consequência a osteoporose (VARGAS et al., 2003;
RENA, 2005).
A osteoporose e osteopenia, são diferentes estágios de doença do sistema ósseo,
caracterizadas por redução da massa óssea e deterioração da estrutura do tecido ósseo,
levando a maior fragilidade do osso (OMS).
A Organização Mundial da Saúde, usando a relação entre densidade mineral óssea e
risco de fratura, propôs a definição de osteoporose: “densidade mineral óssea igual ou menor
à 2,5 desvios-padrão da densidade mineral óssea média para mulheres adultas saudáveis”. A
osteopenia pode ser diagnosticada quando a densidade mineral óssea entre 1 e 2,5 desviospadrão abaixo da média para mulheres adultas saudáveis. Porém, a utilização de outros
indicadores para o monitoramento da osteoporose e da osteopenia é recomendado, além da
densidade mineral óssea, como os parâmetros bioquímicos séricos e urinários (OMS).
Outra definição para osteoporose utilizada pela Organização Mundial da Saúde
(OMS) é, “doença esquelética sistêmica caracterizada por redução de massa e deterioração
microarquitetural do tecido ósseo, como consequência o aumento da fragilidade óssea e
susceptibilidade à fratura.”
Introdução | 19
A osteoporose é uma patologia óssea sistêmica que se caracteriza por um
desequilíbrio entre reabsorção e formação, tendo como consequência o aumento da
fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura (GODDARD; KLEEREKOPER, 1998).
Inicialmente a osteoporose é assintomática, as manifestações clínicas aparecem quando a
perda é de 30% a 40% do conteúdo mineral, por isso alguns autores definem como “doença
traiçoeira”.
Considerada uma doença multifatorial, inúmeras variáveis podem causar a evolução
do quadro osteoporótico (CARNEIRO, 1996; SZEJNFELD, 1997). Classificam-se a
osteoporose em primária, que são as formas senil e pós-menopáusica, consideradas
involucionais (FERNANDES et al., 1996); e a secundária, geralmente relacionada a outras
doenças ou fatores de origem endócrino-metabólicas, reumatológicas, renais, neoplásicas, uso
de medicações e digestivas, que interferem no equilíbrio do cálcio. A incidência menor é na
osteoporose secundária, onde alguma doença é determinante; os casos restantes devem-se a
variedade involucional ou primária (RIGGS, 1987).
É grande a atenção dada a osteoporose da mulher por atingir um terço da população
feminina após a menopausa (GAUMET et al., 1996). A osteoporose em mulheres acima de
quarenta anos pode ser decorrente da privação hormonal pós-menopausa, juntamente com a
diminuição da atividade física praticada nessa faixa etária (SMITH; GILLIGAN, 1989).
Após a menopausa, a perda óssea é predominante trabecular, seguindo-se para
cortical (BANDEIRA et al., 2000). Nota-se que durante toda sua vida, as mulheres perdem
aproximadamente 50% do osso trabecular e 35% do osso cortical obtidos no pico de massa
óssea (TURNER; SIBONGA, 2001). Acredita-se em que entre os 40 anos e a menopausa, as
mulheres diminuem aproximadamente 0,3% a 0,5% de sua massa de osso cortical por ano,
após a menopausa, esse número é de 2% a 3% ao ano (LUCASIN JUNIOR; LIMA, 1994).
Barger-Lux e Recker (2002), afirmam que no osso trabecular a atividade metabólica e a
superfície óssea são maiores; porém, a perda óssea associada à ocorrência de fraturas não é
uma perda desproporcional de osso trabecular, pois sua massa total é apenas de 20%. A
densidade mineral óssea na osteoporose chega a ser 30% menos que em mulheres saudáveis,
mesmo que a perda seja de 50% da massa óssea trabecular, isso significaria apenas 10% de
perda óssea total.
Com a redução na secreção de estrogênios, após a menopausa, é possível observar
por meio de marcadores químicos, que a formação óssea aumenta nas mulheres 40%, contra
um aumento aproximado de 90% na reabsorção. Gaumet-Meunier e colaboradores (2000),
Analisaram o papel da deficiência dos esteroides sexuais na gênese da osteoporose humana,
Introdução | 20
observou-se que a predisposição genética, sedentarismo, a deficiência de vitamina D e as
disfunções tireoidianas constituem fatores de risco para a doença (ROSS, 1996; HEANEY,
1996).
Em decorrência do alto número de pessoas acometidas pela osteoporose por várias
partes do mundo, essa patologia é considerada um problema de saúde pública (ZERBINI,
1998), gerando impacto na qualidade de vida e na independência dos indivíduos acometidos
(FORBACH; SANTOS, 1994). O custo social e familiar em virtude das fraturas
osteoporóticas são altos, sendo que o custo econômico que acompanha essas fraturas também
é elevado. O número de pessoas afetadas é grande, sendo caro e longo o tratamento a que são
submetidas (FERNANDES et al., 1996).
1.4 Modelo experimental de osteopenia em ratas
Há décadas, os ratos têm sido utilizados nas pesquisas experimentais avaliando a
osteoporose, e contribuições relevantes têm sido alcançadas com seu uso como modelo desde
o final da década de 1950 (SZEJNFELD, 2000). Para estudos dos mecanismos reguladores do
metabolismo do cálcio, como a osteoporose, o rato é bastante utilizado, por constituir um
modelo de estudos que é possível verificar a perda de massa óssea (HODGKINSON, 1979).
Kalu (1991), demostrou que em ratas o crescimento até os seis meses de idade é
rápido. Verifica-se o aumento contínuo do comprimento, peso, densidade e quantidade de
cálcio no fêmur de 1 a 3 meses de idade, após esse período, o crescimento se torna mais
gradual.
A ovariectomia é uma cirurgia de retirada dos ovários, muito utilizada para induzir
os efeitos da menopausa em animais por reduzir a secreção do hormônio estrogênio
(BONNET et al., 2007; FUCHS et al., 2007). É um procedimento experimental adotado em
grande frequência nos animais pelos efeitos similares aos humanos, demonstrados pela perda
de massa óssea encontrada nas mulheres pós-menopáusicas (KALU, 1991; THOMPSON et
al., 1995). Autores afirmaram que a ovariectomia resulta em perda óssea tanto nas ratas como
nas mulheres, devido as diversas semelhanças entre os mecanismos patofisiológicos. Nas duas
espécies a perda óssea acontece mais rapidamente após a deficiência de estrógeno e é
caracterizada pelo aumento do turnover ósseo, reabsorção maior que a formação. Em ambas,
a perda óssea é maior no tecido trabecular que no cortical, as alterações na microarquitetura
Introdução | 21
óssea são similares também, caracterizada por danos à arquitetura do tecido trabecular,
gerando perda de minerais. Thompson e seus colaboradores (1995), observaram que após
duas semanas de ovariectomia, é possível verificar diminuição significativa do volume do
osso trabecular da região proximal da tíbia de ratas devido à perda de trabéculas individuais e
afinamento ósseo. Alterações essas que enfraquecem e diminuem a resistência do osso
(MATTILA, 1999; WHO, 1998).
Nesse procedimento, a retirada dos ovários gera a deficiência do hormônio
estrogênio, responsável pelo aumento da atividade osteoblástica (GUYTON, 1991). Da
mesma forma com que os hormônios ovarianos, os íons de cálcio (Ca
2+
) são indispensáveis
na homeostase óssea e exercem grande importância no equilíbrio ósseo (QUEIROZ, 1994).
Kalu (1991) e Turner (2001), salientam que a perda óssea do rato ovariectomizado
deve ser ponderado como uma osteopenia, e não osteoporose. Com a ovariectomia, os ratos
apresentam uma perda óssea bifásica, ou seja, a fase inicial de perda maior é até os 100 dias,
procedida de um período intermediário de relativa estabilização do osso trabecular em um
nível osteopênico, passado 270 dias, uma fase lenta de perda óssea ocorre, com queda da
quantidade de osso trabecular (KALU, 1991; EGGERMANN et al., 2005).
1.5 Atividade física
Estudos afirmam que a prevenção da osteoporose é o melhor tratamento, já que as
condições normais do osso não são recuperadas quando um quadro de osteoporose já está
instalado; porém, a prevenção e o diagnóstico precoce da osteoporose são fundamentais para a
efetividade do tratamento (DRAKE et al., 2005). O objetivo desse tratamento é que se
restaure a massa óssea para que o risco de fratura seja significativamente reduzido
(CARVALHO, 2001).
Um dos métodos profiláticos mais estudados para analisar ou prevenir a atrofia
muscular e perda da massa óssea é o exercício físico (MATHEY et al., 2002; TUKKANEN et
al., 1994; VAN DER WIEL et al., 1995).
A atividade física regular tem consequências na estrutura do osso, no tamanho, forma
e densidade, aumentando assim, a resistência mecânica. Essa melhoria da resistência óssea
está ligada a um aumento na formação óssea (BONNET et al., 2007).
Introdução | 22
Estudos em humanos (CHIEN et al., 2000; BERGSTRÖM et al., 2008) e em animais
(HONDA et al., 2003; HUANG et al., 2008), apresentaram que o exercício aumenta a
densidade mineral, massa e força óssea (HART et al., 2001).
O aumento da atividade contrátil do sistema musculoesquelético leva adaptações no
aparelho locomotor, sendo dependente do tipo de exercício realizado (BOOTH;
THOMASON, 1991). Segundo Topp et al., (2002), o aumento da atividade física regular
melhora a capacidade funcional de todos os sistemas do corpo; porém, a redução ou a
ausência
de
exercício
gera
modificações
estruturais
e
distúrbios
funcionais
(MELLEROWICZ; MELLER, 1979).
Autores afirmam que a tensão mecânica imposta pelo exercício é um estímulo para
formação óssea e possui função importante para minimizar a perda óssea em mulheres pósmenopausa (BARENGOLTS et al., 1994) e em ratas ovariectomizadas (HONDA et al., 2003).
Martin (2007) relata que a remodelação óssea é determinada pela forma com que é
requisitada, ou seja, os ossos que sofrem maiores deformações, impacto ou compressão,
teriam melhor adaptação, adquirindo maior massa óssea.
Diversos tipos de programas de exercícios são investigados em relação aos efeitos no
tecido ósseo. Iwamoto e colaboradores (2005), estudaram o exercício aeróbico, a corrida, que
apresentou vantagens para densidade minral óssea; outros pesquisadores estudaram os
benefícios da natação na massa óssea em animais ovariectomizados, onde houve um aumento
da densidade mineral óssea e mudanças histomorfométricas, sugerindo aumento da atividade
óssea e melhora das propriedades mecânicas em relação ao gurpo não exercitado (HART et
al., 2001; MELTON et al, 2004); Umemura et al., (2008), utilizaram saltos verticais,
observando maior densidade mineral óssea nos grupos treinados.
O exercício aeróbico, como a corrida na esteira, vem sendo estudado afim de definir
melhor os seus efeitos nos ossos (IWAMOTO et al., 1999; IWAMOTO et al., 2005; HUANG
et al., 2008; SIMÕES et al., 2008). Na corrida, a formação óssea acontece de forma
compensatória pela força mecânica sofrida pelos ossos (NOTOMI et al., 2000).
Experimentos apresentam que corrida gera um efeito osteogênico em ratos machos
jovens (BOURRIN et al., 1995; HUANG et al., 2008) e fêmeas (HAGIHARA et al., 2005);
contudo, segundo Barengolts e seus colaboradores (1993) em ratas ovariectomizadas os
efeitos dos exercícios parecem estar diminuídos. Nos estudos de Van der Watiel et al., (1995)
animais que realizaram exercícios com alguma sobrecarga, obtiveram ganhos na massa óssea
quando comparados com os que correram sem sobrecarga.
Introdução | 23
Em contrapartida Peng et al., (1997), relataram que o treinamento em esteira
promoveu uma redução da perda óssea trabecular de -51,7% para -32,2% e melhorou a carga
máxima de 77,1N para 86,5N em ratas ovariectomizadas quando comparadas com as quais
não realizaram exercício. Estudos com ratas ovariectomizadas, utilizando a esteira têm
prevenido a perda de peso do fêmur e da tíbia, levando um aumento dos parâmetros de
formação óssea, como a taxa de aposição óssea e formação, e diminuíndo a reabsorção
(BARENGOLTS et al., 1993; BARENGOLTS et al., 1994).
Alguns autores relataram efeitos sistêmicos de atividade física em ratos (OCARINO
et al., 2007; SAKAKURA et al., 2001). Ocarino et al., (2007) concluíram que atividade física
diária em esteiras sem inclinação, consegue reverter os sinais de osteopenia em todo
esqueleto, além de aumentar a quantidade de osso trabecular e cortical nas vértebras, e
também, aumentou a espessura dos ossos nasais, ou seja, a atividade física repondo a
quantidade de massa óssea, direta ou indiretamente. Sakakura et al., (2001) também
demonstraram os efeitos benéficos da atividade física não apenas na tíbia osteopênica de
ratos, mas também, mudanças diferenciais no processo condilar de mandíbulas destes
animais, propondo haver uma possível ativação osteogênica sistêmica através do exercício
físico.
Inúmeros estudos são apresentados na literatura buscando correlacionar a
osteoporose com mulheres sob deficiência hormonal, dentre esses estudos, destaca-se o de
Genaro et al., (2006), onde através de um estudo clínico realizado com 320 mulheres no
período pós-menopausa, avaliaram a combinação dos seguintes fatores, exercícios físicos,
terapia de reposição hormonal e administração de cálcio. Fazendo-se uma avaliação após 12
semanas, observaram que mulheres submetidas a atividade física e reposição hormonal
apresentaram melhores resultados de densidade óssea.
Muito discutida na literatura é a duração do exercício, que é importante para prevenir
e tratar a osteoporose. Pesquisadores afirmaram que o exercício de intensidade moderada e de
tempo não muito prolongado para mulheres pós-menopausa apresentam maiores benefícios
em relação aos exercícios de longa duranção como a maratona, que podem levar a uma
redução da densidade mineral óssea (HAGIHARA et al., 2005).
A prática regular de exercícios físicos influencia a manutenção das atividades
normais ósseas, sendo assim vem sendo indicada no tratamento da osteoporose (OCARINO,
2006). Gali (2001), afirma que a atividade física mesmo apresentando o benefício primário
que é evitar a perda óssea gerada pela inatividade, que diminui o risco de fraturas, não deve
ser recomendada como substituta do tratamento medicamentoso apropriado. Porém, a relação
Introdução | 24
entre exercícios físicos e osteoporose tem gerado discussões entre os pesquisadores, buscando
melhor conhecimento sobre intensidade, frequência e duração dos exercícios utilizados como
método de prevenção e tratamento da osteoporose.
Há uma carência em protocolos de atividade física bem definidos, determinando tipo,
tempo, frequência e a duração de exercícios específicos, sendo assim a escolha do programa
de condicionamento físico para a prevenção e/ou tratamento se torna difícil (NAVEGA et al.,
2003).
1.6 Risedronato
De acordo com a literatura, terapias farmacológicas para a prevenção e/ou tratamento
da osteoporose, representam importantes pontos a serem avaliados no campo da saúde
pública, em que a meta principal é impedir a perda adicional de tecido ósseo e diminuir a
chance de ocorrer fraturas ósseas. São inúmeras as opções farmacológicas para o tratamento
e/ou prevenção da osteoporose como: calcitonina, raloxifeno, fluoride, bisfosfonatos,
suplementos de cálcio e vitamina D (IQBAL, 2000).
Sambrook e Leong, (1997), afirmam que grande parte das medicações estabelecidas
para a osteoporose agem para prevenir a perda óssea adicional, ou seja, apenas um pequeno
aumento da densidade óssea é observado.
Atualmente, os bisfosfonatos, têm como objetivo inibir a reabsorção óssea.
Acrescentando cadeias laterais ao grupo amino ou por meio de substituições cíclicas,
especificamente aquelas contendo nitrogênio no anel heterocíclico, como no Risedronato, a
atividade antirreabsortiva pode ser melhorada (SZEJNFELD, 2000; CASTRO et al., 2004;
NANCOLLAS et al., 2006).
A farmocinética dos bisfosfonatos possui propriedades comuns entre si. A absorção
intestinal é pequena (<1 a 10%), e é inibida por cálcio ou outros íons bivalentes que capturam
o bisfosfonato. Rapidamente são eliminados da circulação (meia-vida de 1 a 2 horas), e a
ligação ao mineral ósseo é de 20 a 60 %, o restante é eliminado pela urina (COMPSTON,
1994; SZEJNFELD, 2000; RODAN; RESZKA, 2003).
A meia-vida dos bisfosfonatos nos ratos ainda causa discussões e divergências entre
alguns autores. Alguns acreditam em que o tempo de permanência dos bisfosfonatos no
organismo é duradouro, podendo permanecer dez anos ou mais, dependendo da velocidade da
Introdução | 25
remodelação do tecido (SZEJNFELD, 2000; STEPENSKY et al., 2003), outros relatam que a
meia vida é de três a doze meses para os bisfosfonatos (KOIVUKANGAS et al., 2003).
Os bisfosfonados são frequentemente utilizados no tratamento de inúmeras doenças
ósseas, destacando-se entre eles está o risedronato, considerado um dos mais potentes
disponíveis no mercado (SZEJNFELD, 2000). O risedronato pertence a terceira geração de
bisfosfonatos, é um piridil bisfosfonato com potência mil vezes maior que a do etidronato
como agente antirreabsortivo (WOO; ADACHI, 2001), prescrito para prevenção e tratamento
da osteoporose pós-menopausa, osteoporose induzida por corticosteróides em homens e
mulheres e também da Doença de Paget (RISEDRONATE, 2001).
O Ácido Risedrônico (1-hidroxi-2-[3-piridinil] etilideno ácido bisfosfônico) cuja,
fórmula molecular é C7H11NO7P2 e de peso molecular 283,11 g/mol, é uma nova geração de
bisfosfonato piridinil. É um agente altamente antirreabsortivo, que se liga a hidroxiapatita no
osso e inibe a reabsorção óssea mediada por osteoclastos diminuindo a renovação óssea, e a
atividade osteoblástica e a mineralização são preservadas (SIESTSEMA et al., 1989; PIAI,
2005).
Segundo Mortensen et al., (1995) e Watts et al., (2004), o risedronato apresenta um
grande potencial de ação, melhor tolerância em sua administração por via oral e menores
efeitos colaterais quando comparados a outras substâncias da mesma classe. Além disso, esse
medicamento possui alta afinidade pelo tecido ósseo e alta potência de antirreabsorção,
segundo Sietsema e seus colaboradores (1989).
1.7 Medidas de mensuração óssea
A Organização Mundial da Saúde, afima que os estudo com animais devem ser
avaliados com a realização de análises histomorfométricas do osso e resistência óssea, por
meio de ensaios biomecânicos. A análise direta permite quantificação da microarquitetura
óssea e, por ser de caráter invasivo, o uso desta técnica em humanos é limitado (MOTILLA,
2004). Para avaliação clínica de agente usados na prevenção ou no tratamento da osteoporose
pós-menoupasa, Thompson e colaboradores (1995), afirmam que a utilização de modelos
animais específicos é de extrema importância. Ponderando que, estudos realizados
reconhecem que não há modelo animal que imite exatamente as condições humanas de
osteoporose (THOMPSON et al., 1995; THORNDIKE & TURNER, 1998), os modelos
Introdução | 26
experimentais em animais, são essenciais para fornecer informação sobre a qualidade e
estrutura óssea que não seria obtida em pacientes de triagem clínica. Os modelos animais de
osteoporose são, portanto, agentes imprescindíveis para se obter uma mensuração eficaz e
segura da qualidade óssea (THOMPSON et al., 1995).
As propriedades mecânicas dos ossos, na osteoporose, podem ser afetadas e o osso se
rompe com cargas menores (EINHORN, 1992). Os ossos possuem propriedades plásticas e
elásticas. Na primeira, o osso absorve a energia que é imposta sendo reversível, o que
significa que a deformação acontece, mas volta a sua forma normal, a elástica acontece
quando a carga imposta excede a capacidade, e a deformação se torna permanente (SEEMAN
et al., 2008).
Os ensaios mecânicos podem ser destrutivos ou não. Os destrutivos há ruptura ou
inutilização do material, alguns exemplos são os de compressão, flexão, tração, torção e
fadiga (SOUZA, 1974). O ensaio de flexão de 3 pontos em específico é bastante indicado para
testar a região com predominância de osso cortical, sendo assim, o comportamento desse
tecido é refletido nos resultados (MOSEKILDE, et al., 1998).
A OMS considera a densitometria óssea realizada por raio-X de dupla energia padrão
ouro para o diagnóstico da osteoporose, sendo assim, o número de densitometrias cresceu
consideravelmente (WHO, 1994). A densitometria óssea consite em analisar pacientes com
doença metabólica óssea, de verificar a severidade dessa perda óssea, quais são os riscos de
fraturas e de um acompanhamento com evolução dos tratamentos (NECO, 1994).
Pesquisadores concluíram que o risco de fraturas se relaciona com a medida de
densidade mineral óssea, com isso, essa metodologia tem se destacado para aplicação clínica.
Porém, a utilização da densidade mineral óssea como instrumento único de avaliação não é
suficiente, sendo necessária a aplicação de outros parâmetros como qualidade óssea e
propriedades estruturais do osso (DEVAREDDY, 2006). Embora termo “qualidade óssea”
seja vago; é empregado para referir caracteristícas do osso que incluem microarquitetura
óssea, número e volume de trabéculas, espessura do tecido cortical e composição mineral
(HERNANDEZ; KEAVENY, 2006).
A matriz colágena influência as propriedades mecânicas do osso pelo grau de
mineralização, ou seja, pela quantidade de cristais de hidroxiapatita de cálcio depositada entre
as fibras colágenas. A massa do tecido ósseo e sua rigidez são determinantes para resistência
óssea. A rigidez é determinada pela fase mineral, e a matriz de colágeno contribui
especialmente para aumenta a capacidade do osso e absorver energia sem romper
(GUADALUPE-GRAU et al., 2009). Turek (1991) afirma que a alta concentração de
Introdução | 27
colágeno da fase orgânica favorece o osso a resistir a tensões de tração, já na fase inorgânica
dá a capacidade ao osso a resistir as tensões de compressão.
A análise histomorfométrica do osso é imprescindível para estudos ósseos, para
analisar a remodelação óssea e avaliar a qualidade óssea em animais submetidos a algum
tratamento (WHO, 1998). No estudo quantitativo do esqueleto de pacientes com osteoporose,
é importante observar a microarquitetura óssea, que é considerada um fator de risco para
fragilidade óssea podendo ser avaliada parcialmente, por meio das medidas da
ultrassonometria óssea e indiretamente por marcadores bioquímicos da remodelação óssea
(PINHEIRO; SZEJNFELD, 2001).
Receptor ativador do fator nuclear kB (RANK), receptor ativador do fator nuclear
kappa-B ligante (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) são reguladores importantes dos
ostoclastos e no metabolismo ósseo. RANKL interage com seu receptor RANK que se
encontra nos osteoclastos, células indiferenciadas e células dendríticas ativando os sinais
NFkβ e serina/treonina quinase PKB/Akt que estão ligados com o processo de diferenciação,
proliferação e apoptose celular.
Segundo Baud’Huin e colaboradores (2007), a razão RANKL/OPG, podem ser
utilizados como marcador biológico de prognóstico em patologias ósseas, como oteoporose,
espondilite, aquilosante, artite reumatoide, tumores ósseos benignos e fraturas ósseas,
podendo também, a razão ser utizada para avaliação de novas drogas contra doenças ósseas e
terapia para patologias ósseas. Anormalidades na razão RANKL/OPG têm sido observadas na
patogênese da osteoporose pós-menopausa, artrite reumatoide, doença de Paget, doenças
periodontal, metastases óssea entre outras (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001).
Pesquisadores propõem que a concentração de RANKL e OPG no meio ambiente
ósseo pode determinar o potencial osteoclástico local (HUANG et al., 2000), visto que a
expressão de RANKL e OPG é coordenada para regular a reabsorção e densidade óssea, por
controlar o estado de ativação dos osteoclastos (BOYLE; SIMONET; LACEY, 2003;
ANANDARAJAH, 2009). Com isso, é de grande importância, que as pesquisas abordando
reabsorção óssea devam analisar o sitema RANK-RANKL-OPG (GALLAGHER, 2008), já
que essas moléculas são fatores importantes na regulação do metabolismo ósseo (HUANG et
al., 2000; CROTTI et al., 2003; TAY et al., 2004; ANANDARAJAH, 2009).
OBJETIVO
Objetivo | 29
2. OBJETIVO
2.1 Objetivo Primário
O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos do exercício físico (Corrida)
associado ou não ao medicamento risedronato como meio profilático e/ou terapêutico em
ossos osteopênicos de ratas submetidas à ovariectomia.
2.2 Objetivo Secundário
Avaliar os efeitos da ovariectomia no ganho de peso de ratas.
Avaliar a densidade mineral, propriedades mecânicas, colágeno tipo I e tipo III e
microarquitetura óssea dos animais experimentais.
Avaliar os marcadores imunoistoquímicos (RANKL, OPG e TRAP).
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos | 31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais experimentais
Este projeto foi elaborado de acordo com o "Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals" (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1996), e foi aprovado pela Comissão de
Ética em pesquisa com animais da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, protocolo
099/2011.
Foram utilizadas 48 ratas da raça Rattus norvegicus albinus, variedade Wistar, com
massa corpórea de 150 a 180 gramas, que corresponde à fase jovem. Os animais foram
adquiridos junto ao Biotério Central da Coordenadoria do Campus de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo e alojados no Biotério do Laboratório de Bioengenharia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP com período de antecedência à cirurgia para
que ocorra adaptação ao meio.
Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas com ciclos de dia / noite de 12 / 12
horas, com umidade controlada, recebendo água e alimentação padrão. A temperatura foi
controlada (21  1 C).
Os animais foram pesados individualmente todas as semanas do experimento em
balança eletrônica.
Ao final do experimento, as ratas foram submetidas à eutanásia através de uma dose
excessiva (2 ml para cada 100g do animal) de anestésico Hidrato de Cloral, em seguida, as
tíbias foram retiradas, limpas das partes moles.
3.2 Procedimento experimental
3.2.1 Técnica Cirúrgica
Os animais foram submetidos à cirurgia após um período de adaptação.
3.2.1.1 Ovariectomia
A técnica cirúrgica aplicada nesse estudo seguiu a metodologia de Zarrow, Yochim e
MacCarthy, (1964). Foi realizada tricotomia na região ventral entre a reborda costal inferior e
o início da pelve (Figura 1).
Em seguida, realizada antissepsia dessa região com gaze
embebida em polivinil-pirrolidona-iodo. Após esses procedimentos, foi realizada uma incisão
reta transversal, de aproximadamente 1 cm de comprimento da pele e tecido celular
subcutâneo, a cerca de 1 cm da linha mediana (borda medial da incisão) com auxílio de pinça
e tesoura pontiaguda (Figura 2). A parede muscular foi divulsionada até que se tivesse acesso
à cavidade abdominal, localizando o ovário em meio a uma massa gordurosa e, em seguida,
foi realizada a evisceração do corno uterino. A extração dos ovários foram realizadas
posteriormente à ligadura da extremidade da tuba uterina, seccionando entre a ligadura e o
ovário (Figura 3 e 4). Foi suturada a parede muscular e, em seguida, a pele (Figura 5 e 6).
Todo o procedimento foi repetido do lado oposto ao primeiro para a retirada dos dois ovários
(SIMÕES, 2008). Após a cirurgia, os animais receberam injeção de antibiótico (40 000 U/kg
Penicilina G Procaína IM) (Tezini, 2008).
Figura 1. Tricotomia na região ventral.
Figura 2. Incisão reta transversal.
Figura 3. Localização do Ovário.
Figura 4. Retirada do Ovário.
Figura 5. Sutura.
Figura 6. Animal Ovariectomizado.
Após 72 horas da cirurgia foi iniciado o exercício físico (grupos OVXC e OVXCM) e
administração do medicamento (grupos OVXM e OVXCM), para que estes iniciassem antes
da instalação da osteopenia decorrente da ovariectomia, que segundo alguns autores os sinais
da osteopenia se manifestam em um período de 30 a 60 dias após a ovariectomia (KALU,
1991; TOMKINSON et al., 1998; TEZINI, 2008; SIMÕES, 2008).
3.2.1.2 Sham
O procedimento cirúrgico sham consistiu na tricotomia na região ventral entre a
reborda costal inferior e o início da pelve, seguida de antissepsia dessa região com gaze
embebida em polivinil-pirrolidona-iodo. Após esses procedimentos, foi realizada uma incisão
reta transversal, de aproximadamente 1 cm de comprimento da pele e tecido celular
subcutâneo, a cerca de 1 cm da linha mediana, com auxílio de pinça e tesoura pontiaguda. A
parede muscular foi divulsionada até que se tivesse acesso à cavidade abdominal, localizando
o ovário em meio a uma massa gordurosa, após a localização do ovário este foi exposto e
depois reinserido no interior da cavidade abdominal e as camadas musculares e cutâneas
foram suturadas isoladamente.
Obedecendo ao mesmo padrão utilizado nos animais ovariectomizados, o exercício
físico (grupos SHAMC e SHAMCM) e administração do medicamento (grupos SHAMM e
SHAMCM) iniciaram 72 horas após a cirurgia.
3.3 Grupos experimentais
Os animais foram divididos em oito grupos experimentais, sendo seis animais por
grupo (FIGURA 7), as caldas foram identificadas individualmente, com marcador
permanente, por algarismos romanos.
SHAMCMSubmetidos à cirurgia
simulada de
Ovariectmia, e as 12
semanas seguintes
administrado
Risedronato,
associado com o
treinamento físico na
esteira, em seguida
eutanasiados.
OVX- Submetidos à
Ovariectomia,
sedentário por 12
semanas, em seguida
eutanasiados.
SHAMM- Submetidos
à cirurgia simulada
de ovariectomia e as
12 semanas
seguintes,
administrado
Risedronato, em
seguida eutanasiados.
SHAMC- Submetidos
à cirurgia simulada
de Ovariectomia,
seguido de
esteira durante 12
semanas, em seguida
eutanasiados.
OVXC- Submetidos à
Ovariectomia,
seguido de
esteira durante 12
semanas, em seguida
eutanasiados.
OVXM- Submetidos à
Ovariectomia, e as 12
semanas seguintes,
administrado
Risedronato, em
seguida eutanasiados.
48 Ratos 150 a
180 gramas
SHAM- Submetidos à
cirurgia simulada,
sedentários por 12
semanas, em seguida
eutanasiados.
OVXCM- Submetidos
à Ovariectomia, e as
12 semanas seguintes
administrado
Risedronato,
associado com o
esteira, em seguida
eutanasiados.
Figura 7. Distribuição dos Grupos Experimentais.
3.4 Técnica de Treinamento Físico
O treinamento foi realizado em esteira motorizada Insight (Modelo EP – 131), para
ratos, composta por seis baias individuais com a 15 cm, largura interna de 10 cm e
comprimento de 50 cm. Painel de controle com regulador de velocidade, chave liga-desliga,
mostrador digital para o tempo e a distância percorrida, botões para reiniciar o relógio e
odômetro (contador de distância). O exercício foi realizado sem inclinação da esteira.
Figura 8: Esteira motorizada Insight (Modelo EP – 131).
O protocolo de treinamento físico foi baseado no estudo de Simões et al., (2008),
inicialmente de 10 minutos evoluindo gradativamente até 60 minutos por dia, cinco dias por
semana durante 12 semanas (com velocidade de 15m/min nas seis primeiras semanas e 18
m/min, nas demais semanas).
A tabela 1 descreve o treinamento físico proposto:
Tabela 1. Protocolo de Treinamento Físico em Esteira.
Semanas de
Treinamento
1
2
Velocidade
m/min
15
15
10
20
10
20
10
20
15
30
15
30
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
15
15
15
15
18
18
18
18
18
18
40
60
60
60
60
60
60
60
60
60
40
60
60
60
60
60
60
60
60
60
50
60
60
60
60
60
60
60
60
60
50
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
Duração das sessões (minutos)
3.5 Administração do Risedronato
O medicamento risedronato de sódio (Actonel 150mg - Norwich Pharmaceuticals
Inc., Norwich, Estados Unidos) foi administrado nos grupos OVXM, OVXCM, SHAMM e
SHAMCM. A massa inicial do comprimido de risedronato de sódio foi pesada em balança de
precisão (Marte AM- 220) (273 mg). Este foi triturado em cuba de maceração de cerâmica.
91 gramas do comprimido macerado foi pesado em um Becker (100 mL) e neste foi
adicionado 50 mL de água destilada com auxílio de uma barra magnética, em um agitador até
que o risedronato fosse totalmente solubilizado, obtendo um solução com 1mg/mL de
risedronato sódico (Figura 9).
Figura 9. Metodologia de preparo do medicamento.
Foram administradas quatro doses no total, sendo uma dose por mês (30mg/kg/mês
de risedronato de sódio). A administração do medicamento foi realizada na água de beber dos
ratos (PIAI, 2005). Para determinar a quantidade de água a ser colocada junto com o
medicamento, antes de administrar a primeira dose, foi realizado a quantificação de água
ingerida por rato durante 24 horas; determinando assim, a quantidade aproximada de consumo
de 12,5 mL/dia. Com isso, a diluição do medicamento na água de beber dos ratos foi realizada
conforme a necessidade diária. Assim, de acordo com o peso de cada animal, eram diluídos x
mL da solução de risedronato a 1mg/mL em 12,5 mL de água filtrada, para cada animal
presente na gaiola. A primeira administração do medicamento foi realizada 72 horas após a
cirurgia.
Na noite anterior a administração, a comida foi retirada, para que os animais
recebessem o medicamento em jejum. Semanalmente, os animais foram pesados em balança
eletrônica para controle do peso corporal e mensalmente os ratos eram realocados nas caixas,
onde os ratos com pesos mais aproximados eram colocados juntos, com isso a dose do
risedronato era ajustada conforme o peso mensalmente.
Os grupos onde o risedronato não foi administrado, foram submetidos ao mesmos
protocolos dos grupos risedronato, retirada de comida, pesagens semanais e realocação dos
animais pelo peso.
3.6 Peso Corpóreo
Foi realizada avaliação do ganho de peso semanal de cada animal. Para isso, os
animais foram pesados no dia da realização do procedimento cirúrgico, e, posteriormente,
semanalmente até a eutanásia.
3.7 Análise da estrutura óssea
Escolhemos aleatoriamente o lado esquerdo para histologia e o direito para
densitometria e ensaio mecânico, já que de acordo com Battraw et al., (1996), os pares de
tíbia apresentam geometria e comportamento semelhante quando comparados aos seus lados.
3.8 Densidade mineral óssea
As tíbias direitas foram limpas das partes moles e identificadas individualmente, em
seguida foram envoltas em gaze embebida em solução fisiológica e armazenados em
recipientes identificados (grupo e animal) e conservadas a -20°C. Antes da realização da
densitometria, as tíbias foram submetidas a protocolo de descongelamento, permanecendo em
geladeira por 12h, e depois levado a avaliação densitométrica em temperatura ambiente.
Durante a densitometria a tíbia foi posicionada no centro de forma padronizada em
caixa acrílica (10 X 7 x 5 cm), depositado aproximadamente 2 cm de profundidade de água
para submergir o osso, desta maneira a água representa partes moles (músculos, tendões).
Neste caso, utilizado para aumentar a resolução das imagens, assim como melhorar o
contorno ósseo (Figura 10) (FALCAI, 2011).
Figura 10. Foto do posicionamento do osso para o exame
de densitometria.
O exame densitométrico foi realizado em um aparelho de densitometria por raio X
(Hologic, Discovery Wi®, Estados Unidos) do Laboratório de Endocrinologia e Ciências de
Imagens e Física Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, com os ossos (tíbia) separados das partes moles e posicionados dentro da caixa acrílica.
O protocolo utilizado foi específico para pequenos animais, foi utilizada alta resolução (Subregion Hi-Resolution) o programa reconheceu o contorno dos ossos para densidade mineral
óssea global e também foi avaliada a densidade mineral óssea da área proximal da tibia (R1)
(Figura 11). Os resultados foram expressos em g/cm2.
Figura 11. Densitometria e a área de varredura da tíbia
3.9 Análise mecânica
Após a análise densitométrica, utilizou-se os mesmos ossos para avaliar
mecanicamente na máquina universal de ensaio (EMIC® - 10000N), do Laboratório de
Bioengenharia da FMRP – USP, segundo protocolos previamente utilizados (ABRAHÃO et
al., 2006; SIMÕES et al., 2008).
Os ensaios das tíbias foram de flexão de três pontos, com distância entre os apoios de
20 mm e 15 mm, respectivamente. Foi utilizada célula de carga de 500 N e velocidade de
aplicação de carga de 1 mm/min. Foram obtidos os valores de força máxima (N) e rigidez
(N/mm).
Figura 12. Tíbia posicionada na Máquina Universal de ensaio (EMIC® - 10000N).
3.10 Histologia
3.10.1 Processamento Histológico
As tíbias do lado direito foram submetidos à análise histológica qualitativa,
quantitativa e imunoistoquímica. Esses ossos foram imersos em formol 10% por 24 horas. Em
seguida, os espécimes foram descalcificados em EDTA a 0,5M, trocando-se as soluções a
cada 2 dias. Após o período de descalcificação, cerca de 30 dias, a ação do ácido foi
neutralizada por 24 horas em uma solução de sulfato de sódio a 5%. Em seguida, foram
desidratados em série crescente de álcoois: 70% (overnight), 80%, 85%, 90%, 95% e 100% (1
horas em cada concentração). Feito isso, esses blocos ósseos foram colocados em partes
iguais de álcool e xilol (overnight) e diafanizados em xilol, com trocas a cada 1 horas, sendo
executadas 3 trocas; e em seguida, incluídos em parafina.
3.10.2 Análise Microscópica
Para análise microscópica, nas amostras incluídas em parafinas foram realizados
cortes seriados de 5µm de espessura, no plano frontal, em micrótomo Leica RM 2165
(Alemanha).
3.10.2.1 Quantificação das fibras colágenas tipo I e III
Foi realizada a análise histológica quantitativa das fibras colágenas na região da cabeça da
tíbia, sendo que para cada animal foram feitos 50 cortes histológicos por bloco por bloco. As
lâminas foram coradas com a coloração de Picrosirius red que permite verificar as fibras
colágenas do tipo I e III através da birrefringência das fibras no microscópio com luz
polarizada, que capta as fibras colágenas do tipo I com cor vermelha ou alaranjada, e as fibras
do tipo III na cor verde ou amarela (PEREIRA et al., 1998; ARANHA 2009). Foi realizada a
densitometria óptica das fibras colágenas tipo I e III através do programa Axionvision que
capta diferentes tonalidades de vermelho e verde e quantifica a somatória das áreas em pixel2
referentes a diferentes fibras sobre a luz polarizada.
3.10.2.2 Quantificação de trabeculado ósseo
Foi realizada a análise histológica quantitativa do tecido ósseo trabeculado na região
da cabeça da tíbia, sendo que para cada animal foram feitos 50 cortes histológicos por bloco
de modo a captar na lâmina histológica a estrutura do osso por completo. Após as colorações
específicas, digitalizou-se 12 imagens, tendo portanto um total de 72 imagens por grupo.
Após coloração, a análise quantitativa das áreas do osso trabeculado foi realizada
através do programa Axionvision (Zeiss, Germany) que capta a imagem reconhecendo a
tonalidade azul escuro (coloração do osso espojoso) e quantifica a área em pixel2.
3.11 Técnica imunoistoquímica
Os cortes histológicos foram desparafinizados em xilol e hidratados em série
decrescente de etanol (100°- 100°- 100°- 90°- 70° GL). A recuperação antigênica foi realizada
através da imersão das lâminas histológicas em solução tampão (Diva Decloaker®, Biocare
Medical, CA, USA), em câmara pressurizada (Decloaking Chamber®, Biocare Medical, CA,
USA), a 95°C, por 10 minutos. Ao término de cada uma das etapas da reação
imunoistoquímica as lâminas contendo os cortes histológicos foram submetidas a três
lavagens em tampão fosfato salino (PBS) 0,1M, pH 7,4. Os cortes histológicos foram imersos
em 3% de peróxido de hidrogênio por 1 hora e, na sequência, em 3% de soro albumina bovino
por 12 horas, para o bloqueio da peroxidase endógena e bloqueio dos sítios inespecíficos,
respectivamente. Lâminas histológicas contendo amostras de todos os grupos experimentais
foram divididas em três lotes, e cada lote foi submetido à incubação com um dos seguintes
anticorpos primários: anti-OPG do rato gerado em coelho (1:150; Santa Cruz Biotechnology,
CA, USA); anti-RANKL do rato gerado em cabra (1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA,
USA) e; anti-TRAP do rato gerado em coelho (1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).
Os anticorpos primários foram diluídos em PBS acrescido de 0,1% Triton X-100 (PBS-TX),
durante 24 horas, em câmara úmida. As secções histológicas foram incubadas no anticorpo
secundário biotinilado por 2 horas e, na sequência, tratadas com estreptavidina conjugada com
a peroxidase da raiz forte (hemo-enzima extraída da Amoracia Rusticana) (HRP) por 1 hora
(Universal Dako Labeled (HRP) Streptavidin-Biotin Kit®, Dako Laboratories, CA, USA).
Procedeu-se a revelação utilizando-se como cromógeno o 3,3’- tetracloridrato de
diaminobenzidina (DAB chromogen Kit®, Dako Laboratories, CA, USA) e posteriormente
contracoloração com Hematoxilina de Harris. Como controle negativo, amostras foram
submetidas aos procedimentos descritos anteriormente suprimindo-se a utilização dos
anticorpos primários.
3.11.1
Análise
do
padrão
de
imunomarcação
das
amostras
submetidas
à
imunoperoxidase
Os cortes histológicos foram analisados sob iluminação de campo claro em
microscópio óptico (Optiphot-2, Nikon, Japão) por um investigador que desconhecia os
grupos experimentais que estavam sendo analisados. A imunomarcação foi definida como
aquela de coloração acastanhada presente no compartimento citossólico das células. Em cada
espécime foram analisadas seis áreas (cada uma com 300µm x 400µm de dimensão), sendo
elas: uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro da epífise proximal, uma área de
tecido ósseo esponjoso situada no centro da metáfise proximal, duas áreas de tecido ósseo
compacto situadas no centro da diáfise, uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro
da epífise distal, uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro da metáfise distal. As
seis áreas constituíram o campo microscópico de análise. Os critérios para o estabelecimento
da imunomarcação foram modificado de Kim et al., (2007). Para a OPG e RANKL foram
empregados os seguintes escores: (3) alto padrão de imunomarcação ( 3/4 das células
imunorreativas (IR) no campo microscópico), (2) moderado padrão de imunomarcação ( 1/2
das células-IR no campo microscópico), (1) baixo padrão de imunomarcação ( 1/4 das
células-IR no campo microscópico) e (0) padrão de imunomarcação nulo (ausência total de
células-IR no campo microscópico). Para TRAP foram empregados os seguintes escores: (3)
alto padrão de imunomarcação (mais de 15 células imunorreativas (IR) no campo
microscópico), (2) moderado padrão de imunomarcação (5 e 10 células-IR no campo
microscópico), (1) baixo padrão de imunomarcação (menos de 5 células-IR no campo
microscópico) e (0) padrão de imunomarcação nulo (ausência total de células-IR por campo
microscópico). Foram quantificadas apenas as células TRAP-positivas com três ou mais
núcleos. Os dados para cada animal, e consequentemente para cada grupo experimental,
foram estabelecidos como um padrão de imunomarcação (alto, médio, baixo ou ausência de
imunomarcação). Esse padrão de imunomarcação foi comparado entre os grupos
experimentais.
3.12 Análise Estatística
Os resultados foram submetidos ao teste de normalidade para verificar se o
comportamento dos dados foi ou não paramétrico. Como o tamanho da amostra foi inferior a
10, utilizou-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (ANOVA não paramétrica). Quando
houve diferença significativa utilizou-se o teste post hoc de Dunn para especificar as
diferenças. Em todas as análises foi adotado o nível de significância de 5% (p  0,05).
RESULTADOS
Resultados | 46
4. RESULTADOS
4.1 Avaliação Clínica
Todos os grupos experimentais completaram o período proposto sem intercorrências.
4.2 Peso corpóreo
Para os animais submetidos a cirurgia simulada (SHAMs), aplicação da análise de
regressão pelo método dos mínimos quadrados com objetivo de estimar-se um modelo para a
relação peso x semana; foi possível obter a equação que descreve o comportamento do peso
em relação as semanas de experimento, sendo: Psham: 186,40+16,60 x s (1); onde P= peso do
animal e S= semana do experimento. O ajuste da reta ao comportamento do peso é altamente
significativo (p<0,001) com R2=0,70, ou seja 70% da variaçãoo do peso é decorrente do
tempo (semanas), sendo o intervalo de confiança (95%) para o coeficiente angular da reta
(15,38 – 17,81).
Não operados:
500
Peso
400
300
200
100
0
2
4
6
8
10
12
14
Semana
Grafico 1. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos SHAMs, obtenção da
reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento.
Resultados | 47
Para os animais ovariectomizados, aplicação da análise de regressão pelo método dos
mínimos quadrados com objetivo de estimar-se um modelo para a relação peso x semana; foi
possível obter a equação que descreve o comportamento do peso em relação as semanas de
experimento, sendo: Povx: 177,8 + 23,74 x s (2); onde P= peso do animal e S= semana do
experimento. O ajuste da reta ao comportamento do peso é altamente significativo (p<0,001),
com R2=0,76, ou seja, 76% da variação do peso é decorrente do tempo (semanas), sendo o
intervalo de confiança (95%) para o coeficiente angular da reta (22,27 – 25,12).
Operados:
600
500
Peso
400
300
200
100
0
2
4
6
8
10
12
14
Semana
Grafico 2. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos OVXs, obtenção da
reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento.
Ao comparar o intervalo de confiança obtidos para os grupos SHAMs e OVXs,
constatou-se que não há sobreposição destes e assim, pode-se inferir que a taxa de ganho de
peso dos operados é superior a dos não operados.
4.3 Ensaio Mecânico
No ensaio mecânico de flexão de três pontos, realizado na tíbia, foram analisadas
rigidez e força máxima.
Resultados | 48
4.3.1 Rigidez
Em relação aos valores da rigidez, após análise de kruskal-Wallis foi observado
diferença entre os grupos (p=0,012), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, em que os
valores da rigidez obtidos com o ensaio mecânico da tíbia, o grupo SHAMM apresentou
valores significativamente inferiores ao grupo OVXM (p=0,001). Os outros grupos não
apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si (p>0,05). Descritos no
gráfico (Gráfico 3) e na tabela (Tabela 2) os valores obtidos na rigidez (N/mm).
Gráfico 3. Análise da Rigidez (N/mm) para os diferentes grupos experimentais.
Resultados | 49
Tabela 2. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da Rigidez (N/mm), pela
análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM,
SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.
Rigidez ((N/mm)
Desvio
Grupos
Média
Mediana
Mínima
Máxima
Padrão
SHAM α Σ
142,29
139,22
17,39
123,90
171,89
SHAMC α Σ
132,53
128,19
21,20
108,90
164,73
SHAMM α
122,53
123,10
6,79
111,98
132,83
SHAMCM α Σ
146,01
132,88
25,27
126,06
181,59
OVX α Σ
129,80
127,26
15,36
111,05
150,62
OVXC α Σ
145,20
149,43
23,84
111,56
174,53
OVXM Σ
170,40
171,45
11,35
152,01
183,81
OVXCM α Σ
154,46
162,30
22,75
119,53
174,26
α Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p=0,001).
4.3.2 Força Máxima
Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p=0,002),
assim foi realizado teste post hoc de Dunn, em que os valores da força máxima obtidos com o
ensaio mecânico da tíbia, o grupo SHAMM teve valores inferiores significativamente aos
grupos OVXM e OVXCM (p=0,002). Os outros grupos não apresentaram diferenças
significativas quando comparados entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 4) e na
tabela (Tabela 3) os valores da força máxima (N).
Resultados | 50
Gráfico 4. Análise da Força Máxima (N) para os diferentes grupos experimentais.
Tabela 3. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima da Força Máxima (N), pela
análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM,
Força Máxima
Grupos
Média
Mediana
SHAM α Σ
76,35
76,50
Desvio
Padrão
7,05
SHAMC α Σ
76,36
75,09
SHAMM α
69,62
SHAMCM α Σ
Mínima
Máxima
68,87
84,85
8,37
67,53
89,14
69,28
4,32
64,70
74,51
80,96
79,40
9,69
66,86
93,58
OVX α Σ
76,16
76,33
7,81
67,95
87,04
OVXC α Σ
85,97
85,62
3,83
80,22
92,07
OVXM Σ
92,73
92,56
6,96
84,07
100,92
OVXCM Σ
90,37
93,22
13,14
73,99
108,19
α Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p=0,002).
Resultados | 51
4.4 Densitometria
4.4.1. Densitometria Óssea Global
Com análise de kruskal-Wallis não foi observado diferença entre os grupos
(p=0,381). Descritos no gráfico (Gráfico 5) e na tabela (Tabela 4) os valores obtidos da
densidade em g/cm2, da tíbia de todos os grupos experimentais.
Gráfico 5. Análise da Densitometria total (g/cm2) para os diferentes grupos
experimentais.
Resultados | 52
Tabela 4. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da densidade óssea (g/cm2),
pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM,
Densitometria Total (g/cm2)
Grupos
SHAM
SHAMC
SHAMM
SHAMCM
OVX
OVXC
OVXM
OVXCM
Média
Mediana
0,19
0,20
0,20
0,20
0,20
0,19
0,20
0,19
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
0,19
0,20
0,19
Desvio
Padrão
0,01
0,01
0,01
0,02
0,01
0,01
0,01
0,01
Mínima
Máxima
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,17
0,19
0,18
0,20
0,21
0,22
0,23
0,21
0,19
0,21
0,21
4.4.2 Densitometria Óssea Área Proximal
Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p<0,000),
assim foi realizado teste post hoc de Dunn, onde nas análises dos resultados da densitometria
óssea proximal da tíbia, encontrou-se valores diferentes da global. Houve diferença estatística,
o grupo OVX tendo valores inferiores aos grupos SHAMM, SHAMCM (p<0,001). O gráfico
(Gráfico 6) e a tabela (Tabela 5) descrevem os valores obtidos da densidade da área proximal
da tíbia em g/cm2, de todos os grupos experimentais.
Resultados | 53
Gráfico 6. Análise da Densitometria proximal (g/cm2) para os diferentes grupos
experimentais.
Tabela 5. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima, da densidade óssea da área
proximal (g/cm2) pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos experimentais: SHAM,
SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.
Grupos
SHAM α Σ
SHAMC α Σ
SHAMM Σ
SHAMCM Σ
OVX α
OVXC α Σ
OVXM α Σ
OVXCM α Σ
Densitometria Proximal (g/cm2)
Desvio
Média
Mediana
Padrão
0,24
0,24
0,01
0,24
0,24
0,01
0,25
0,25
0,02
0,25
0,25
0,02
0,19
0,19
0,01
0,21
0,21
0,01
0,22
0,23
0,01
0,21
0,22
0,02
Mínima
0,22
0,22
0,22
0,22
0,18
0,19
0,21
0,17
Máxima
0,25
0,25
0,28
0,27
0,22
0,22
0,23
0,24
α, Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p<0,001).
4.5 Análise Histológica
Para a quantificação das fibras colágenas tipo I e III analisadas em luz polarizada, na
região proximal da tíbia, foram encontrados os seguintes resultados:
Resultados | 54
4.5.1.Colágeno tipo I
Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p=0,001),
assim foi realizado teste post hoc de Dunn, em que os valores na quantificação de colágeno
tipo I, o grupo SHAMM teve valores inferiores significativamente aos grupos OVX e
OVXCM (p=0,001). Os outros grupos não apresentaram diferenças significativas quando
comparados entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 7) e na tabela (Tabela 6) os
valores do colágeno tipo I (μm2) da tíbia de todos os grupos experimentais.
Gráfico 7. Análise do colágeno tipo I (μm2), para os diferentes grupos experimentais.
Resultados | 55
Tabela 6. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima do colágeno tipo I (μm2), α
pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM,
Colágeno Tipo I
Grupos
Média
SHAM α Σ
SHAMC α Σ
SHAMM α
SHAMCM α Σ
OVX Σ
OVXC α Σ
OVXM α Σ
OVXCM Σ
3485
4327
0
2260464
128032
21275
324814
112231
Mediana
3461
4589
0
9430
44058
12464
0
58714
Desvio
Padrão
918
3396
0
5296894
196286
29649
533961
147780
Mínima
Máxima
2232
670
0
1344
28295
2637
0
3261
4702
8006
0
13065947
525185
80880
1256862
392979
α, Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p=0,001).
4.5.2 Colágeno tipo III
assim foi realizado teste post hoc de Dunn, onde os valores da quantificação de colágeno tipo
III, o grupo OVX teve valores inferiores significativamente aos grupos SHAMC e SHAMCM
(p<0,001). Os outros grupos não apresentaram diferenças significativas quando comparados
entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 8) e na tabela (Tabela 7) os valores do
colágeno tipo III (μm2) da tíbia de todos os grupos experimentais.
Resultados | 56
Gráfico 8. Análise do colágeno tipo III (μm2) para os diferentes grupos
experimentais.
Tabela 7. Valores da média, mediana, desvio padrão, mínimo, máximo do colágeno tipo III (μm2),
pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais:, SHAM,
Colágeno Tipo III
Desvio
Grupos
Média
Mediana
Mínima
Máxima
Padrão
SHAM α Σ
1627974
1521431
1370977
139969
3183059
SHAMC Σ
5581075
3805434
4193798
2949933
13913829
SHAMM α Σ
1977632
2172150
1131350
20591
3225864
SHAMCM Σ
5721329
5736397
1283521
4046644
7480982
OVX α
243709
202426
112979
147777
459726
OVXC α Σ
1997874
814574
3193980
211737
8495441
OVXM α Σ
1569412
1191799
35972179
502617
8911734
OVXCM α Σ
1817651
1769806
584231
1012499
2689578
α, Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p<0,001).
4.5.3 Quantificação da microarquitetura do trabeculado ósseo na região proximal da
tíbia
Resultados | 57
assim foi realizado teste post hoc de Dunn, onde os valores obtidos com a quantificação de
trabeculado ósseo foi que, o grupo OVX teve valores inferiores significativamente aos grupos
SHAMC, OVXM, OVXCM e SHAMCM e os grupos OVXCM e SHAMCM tendo valores
superiores a OVXC, SHAM E SHAMM (p<0,001). Descritos no gráfico (Gráfico 8) e na
tabela (Tabela 7) os valores da quantificação de trabeculado ósseo (μm2) da tíbia de todos os
grupos experimentais.
Gráfico 9. Análise da quantificação do trabeculado ósseo (μm2) para os diferentes grupos
experimentais.
Tabela 8. Valores da média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima, da quantificação do
trabeculado ósseo (μm2), pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos
experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.
Quantificação de Trabeculado
Desvio
Grupos
Média
Mediana
Mínima
Máxima
Padrão
SHAM α Σ
2927869
2879457
413725
2415929
3572918
SHAMC Σ Ψ
4187027
4117012
1137359
2814281
5660927
SHAMM α Σ
2883769
2860683
695807
2094341
3877263
SHAMCM Ψ
5010750
5115909
434078
4236362
5430177
OVX α
2089400
2202432
655652
1063527
2751645
OVXC α Σ
3500474
3481697
326891
3129075
3876625
Resultados | 58
OVXM Σ Ψ
4213986
4238707
912047
2862176
5415415
OVXCM Ψ
5334633
5273666
91846955
4050098
6709022
α,Σ,Ψ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p<0,001).
Figura 13. Fotomicrografias evidenciando o aspecto histológico das
trabéculas ósseas nos grupos SHAM (A), OVX (B), SHAMC (C), OVXC
(D), SHAMM (E), OVXM (F), SHAMCM (G), OVXCM (H). Coloração:
H&E.
4.6 Padrão de imunomarcação
A técnica de imunoistoquímica empregada para a detecção de OPG, RANKL e
TRAP mostrou alta especificidade na detecção de tais proteínas, a qual foi comprovada pela
ausência total de marcação no controle negativo da reação imunoistoquímica. As
Resultados | 59
imunomarcações se apresentaram com uma coloração acastanhada confinada ao
compartimento citossólico.
A imunomarcação para OPG e RANKL foi expressa em osteoblastos e para TRAP
foi expressa em osteoclastos (Figura 14).
Figura 14. Padrão de imunomarcação de TRAP, RANKL e OPG. A: Fotomicrografia
evidenciando um osteoclasto TRAP positivo (seta preta). B: Fotomicrografia evidenciando um
osteoblasto RANKL positivo (seta azul). C: Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto OPG
positivo (seta vermelha). Abreviações e símbolos: bt, trabécula óssea.
4.6.1 OPG
A imunomarcação para OPG (Gráfico 10) foi maior no Grupo SHAMCM. Nos grupos
SHAMs prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: moderado em SHAM,
moderado em SHAMC, de moderado a alto em SHAMM e, predominantemente alto em
SHAMCM. Nos grupos OVX prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: de
baixo a moderado em OVX, de baixo a moderado em OVXC, moderado em OVX moderado
em OVXCM.
Resultados | 60
4
3
2
1
0
SHAM
SHAMC SHAMM SHAMCM
OVX
OVXC
OVXM
OVXCM
Gráfico 10. Mediana dos valores da Imunomarcação para OPG.
4.6.2 RANKL
A imunomarcação para RANKL (Gráfico 11) foi maior no grupo OVX. Nos grupos
moderado em SHAMC, baixo em SHAMM e, baixo em SHAMCM. Nos grupos OVX
prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: alto em OVX, de alto a moderado em
OVXC, de baixo a moderado em OVXM e, baixo em OVXCM.
4
3
2
1
0
SHAM
SHAMC SHAMM SHAMCM
OVX
OVXC
OVXM
Gráfico 11. Mediana dos valores da Imunomarcação para RANKL.
OVXCM
Resultados | 61
4.6.3 TRAP
A imunomarcação para TRAP (Gráfico 12) foi maior no Grupo OVX. Nos grupos
moderado em SHAMC, baixo em SHAMM e, baixo em SHAMCM. Nos grupos OVX
prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: alto em OVX, moderado em OVXC,
baixo em OVXM e, baixo em OVXCM. Nos grupos tratados com ácido risedrônico
(SHAMM, SHAMCM, OVXM e OVXCM) a presença de osteoclastos arredondados, não
acoplados a lacunas de reabsorção e distantes da matriz óssea foi muito comum.
4
3
2
1
0
SHAM
SHAMC SHAMM SHAMCM
OVX
OVXC
Gráfico 12. Mediana dos valores da Imunomarcação TRAP.
OVXM
OVXCM
DISCUSSÃO
Discussão | 63
5. DISCUSSÃO
Neste estudo utilizou-se o modelo experimental de indução à osteopenia através da
ovariectomia em ratos Wistar, objetivando avaliar a prevenção e/ou tratamento, com
associação de exercícios físicos e o medicamento Risedronato. Segundo Jerome e seus
colaboradores (1999), com aumento da expectativa de vida, as doenças crônico-degenerativas,
salientam-se como fator limitante de qualidade de vida, entre elas a osteoporose com sua alta
frequência se destaca. A literatura aponta que a condição de perda óssea em humanos mais
conhecida é a osteoporose pós-menopausa. Vários tratamentos já foram desenvolvidos
objetivando a prevenção de perda da massa óssea, como por exemplo a reposição hormonal, o
uso de bisfosfonatos e realização de atividades físicas (KALU, 1991). No presente estudo
optou-se pelo tratamento preventivo com atividade física (corrida) associando ao uso de um
bisfosfonato. O tratamento preventivo da osteoporose é de extrema importância para um
tratamento eficaz, conhecendo as condições normais do osso, sabe-se que não é possível
recuperá-las com o quadro da patologia já instalado (DRIUSSO, 2000). Assim o tratamento
tem objetivo de restaurar a massa óssea de forma que o risco de fraturas seja revertido
(CHESTNUT, 1995). Segundo Dequeker (1994), a prevenção é mais fácil a manutenção da
massa óssea do que a restauração, sendo assim, este trabalho tem como objetivo a prevenção
da osteoporose em ratas susceptíveis. Este estudo, trata-se da prevenção da osteopenia, com
isso não foi preciso a espera da instalação do quadro, realizou-se a ovariectomia, e com 72
horas após a cirurgia foi dado início ao tratamento preventivo de doze semanas.
Realizou-se a ovariectomia para indução do quadro osteopênico, um modelo já
bastante utilizado para estudar mecanismos de ação e terapias aplicáveis no tratamento da
osteoporose (KALU, 1989; THOMPSON et al., 1995). A rata ovariectomizada é um excelente
modelo experimental, pois as principais características clínicas da deficiência de estrogênio
humano nela são encontradas (THOMPSON et al., 1995; GALA et al., 2001; PRIEMEL et al.,
2002). A literatura demonstra que após a realização da Ovariectomia, a instalação da
osteopenia ocorre em um mês ou menos (KALU, 1991; LI; SHEN; WRONSKI, 1997;
THOMPSON et al.; 1995). Quanto a idade dos animais, o início do experimento foi com o
peso de 150 a 180 gramas, um animal considerado jovem, pois segundo Thompson e seus
colaboradores (1995), a idade é um fator importante nas pesquisas da perda óssea, afirmando
que a diminuição óssea que ocorre após a ovariectomia depende da idade do animal, quanto
mais jovem, mais rápida essa perda, nos animais mais idosos mais lenta.
Discussão | 64
A composição corporal tem importante relação com a densidade mineral óssea.
(GNUDI et al., 2007). No presente estudo, todos os animais aumentaram a massa corporal até
o final do experimento; contudo, os animais submetidos à ovariectomia ganharam mais peso
em relação aos grupos SHAMs. Esses valores conferem corroboram com alguns autores que
utilizaram ratas ovariectomizadas e não (LATOUR et al., 2001; RENNO et al., 2007;
TROMP et al., 2006; LESPESSAILLES et al., 2009). O aumento de massa corporal para
Shinoda e colaboradores (2002), é principalmente resultado da ovariectomia, que leva a
baixos níveis hormonais e ao maior acúmulo de gordura pela elevação da ingestão de
alimentar.
Neto e Fernandes (2001), ressaltam que a obesidade é também um protetor de
fraturas, a ação da massa óssea, como fator de energia mecânica aplicada sobre o esqueleto,
teria capacidade de estimular a remodelação óssea. Em contrapartida Premaor et al., (2010),
afirma que o número de obesos com fraturas está aumentando, embora o excesso de tecido
devesse funcionar como “protetor” de fraturas, reduzindo o trauma esquelético após uma
queda, isso não ocorre, pois o elevado peso corporal gera um maior impacto na queda, além
da força muscular e mobilidade diminuída que aumentam o risco de cair.
O modelo e intensidade de exercício a ser utilizado na prevenção da perda da
massa óssea, ainda não estão totalmente elucidados. Como protocolo de treinamento neste
experimento, seguiu-se o sugerido por Simões et al., (2008), inicialmente é de 10 minutos
evoluindo gradativamente até 60 minutos por dia, cinco vezes por semana, durante 12
semanas, a velocidade de 15m/min nas seis primeiras semanas e 18 m/min nas demais.
Em relação a duração do exercício, que é de extrema importância, utilizamos um
período de adaptação com tempos reduzidos, progredindo para um hora de duração.
Pesquisadores têm sugerido que a intensidade moderada e de tempo não prolongado para as
mulheres pós-menopáusicas são mais eficientes para o tecido ósseo quando comparados a
exercícios extenuantes, que geram uma redução da densidade mineral óssea (HAGIHARA et
al., 2005). Gremion et al., (2001) afirma que exercícios de endurance de alto rendimento,
pode levar uma perda óssea prematura, explicada pelos efeitos na homeostrase dos hormônios
sexuais, gerando uma alteração no ciclo menstrual. A tríade da Atleta, é um exemplo, uma
síndrome que consite em distúrbios alimentares, amenorréia e osteoporose, que estão todos
inter-relacionados. Entretanto, essa tríade não ocorre apenas em atletas, mas em mulheres
ativas que participam de uma série de tipos de exercícios (YEAGER et al., 1993).
Alguns autores afirmam que o exercício aeróbico de média intensidade e com
sobrecarga são mais eficientes (TROMP et al., 2006; BONNET et al., 2007), porém outros
Discussão | 65
defendem que o exercício mais efetivo é o de alto impacto (HONDA et al., 2003;
NAGASAWA et al., 2008). Iwamoto e colaboradores (1998), testando diferentes intensidades
na esteira, com ratas adultas ovariectomizadas, o exercício moderado (12m/min. 1 h/dia) foi
mais eficiente, pois observou um aumento na DMO do fêmur e da tíbia dos animais, e esses
ainda apresentaram uma maior força de fratura. Neste estudo, os grupos que utilizaram da
corrida como prevenção, nos protocolos apresentados a cima, apresentou valores positivos em
relação aos outros, alguns com diferença significativa, outros não.
Canali e Kruel (2001) resalta que o exercício leva a formação óssea a longo prazo,
pois a absorção intestinal de cálcio é aumentada juntamente com a diminuição de sua
excreção pela urina e com níveis mais altos de PTH.
Alguns pesquisadores (LÓPEZ, 2000; DELMAS, 2000; SAHNI et al., 1993 e
MÖNKKÖNEN et al., 1990) afirmam que várias substâncias como cálcio, isoflavonas,
ralozifeno e os bisfosfonatos têm sido utilizados para inibição da atividade reabsortiva óssea
após a menopausa com efeitos adversos reduzidos ao paciente. Pórem, segundo Sagraves
(2003), das substâncias citadas, a diminuição dos riscos de fratura têm sido obtidos somente
com o uso dos bisfosfonatos.
No presente estudo utilizou-se risedronato de sódio (Actonel), que segundo alguns
autores (MORTENSEN et al., 1995; WATTS et al., 2004), têm bom potencial de ação, sua
administração oral é tolerável, e os efeitos colaterais quando comparados com os
medicamentos da mesma classe são reduzidos. Harris et al., (1999) e Reginster et al., (2000),
afirmam que esse medicamento é eficaz no tratamento da osteoporose pós-menopausa,
reduzindo risco de fraturas vertebrais já no primeiro ano de tratamento.
Quanto a dose do risedronato, há discussões sobre o que seria mais viável e mais
eficaz, doses diárias, semanais ou mensais. Segundo Harris et al., (2004), a eficácia e a
tolerância do risedronato uma vez por semana comparado com doses diárias foram
confirmado em estudo randomizado. Também não apresentaram diferença significativa em
relação a efeitos adversos graves ou gastrointestinais; porém, a conveniência da administração
foi muito melhorada com dosagens semanais.
Os tratamentos em que os intervalos são maiores, são mais propícios à aceitação; as
mulheres que utilizam do bisfosfonato semanal têm maiores taxas de adesão e persistência do
que aquelas em regimes diários (CRAMER et al., 2007). Com esse conhecimento, foi
inevitável o desenvolvimento de doses menos frequentes, doses mensais (DELMAS et al.,
2008). Com isso, nesse estudo doses mensais foram administradas, nos valores de
30mg/kg/mês.
Discussão | 66
Nas análises de ensaio mecânico e histologia (colágeno tipo I proximal), o grupo
SHAMM apresentou valores inferiores a alguns grupos ovariectomizados, com diferença
estatística, acredita-se em que a medicação sem a necessidade devida possa ter acarretado
prejuízos. A Associação Médica Brasileira, afirma que a medicação desnecessária possa
trazer algum benefícios; pórem, pode também trazer prejuízos a saúde do indivíduo, como
intoxicação, reações adversas, interações medicamentosas, entre outros.
Pereira e colaboradores (2012), avaliaram a eficácia de um outro bisfosfonato, o
pamidronato, como prevenção e tratamento da osteoporose, observaram a eficácia do
pamidronato em reverter o processo de massa óssea, porém, corroborando com nossos
resultados, na prevenção primária não houve benefícios adicionais, além disso a capacidade
do osso em suportar o esforço mecânico foi reduzida, concluindo assim que o tratamento
preventivo pode prejudicar a resistência óssea.
Ito e colaboradores (2005), realizaram um estudo com ratas ovariectomizadas, e
afirmaram que grande parte da eficácia do risedronato é explicada pelo aumento da densidade
mineral óssea e da massa óssea está ligada também com a capacidade de aumentar a
resistência óssea com a alteração da microarquitetura e aumento da conectividade de
trabéculas, quando administrado em doses superiores a 0,5 mg/kg, correlacionando com a
melhora das propriedades biomecânicas do osso, gerando resultados superiores aos animais
SHAMs.
Seguindo Hogan et al., (2000), para avaliar as propriedades mecânicas da tíbia devese utilizar o ensaio de flexão de três pontos, já que a tíbia é constituída principalmente por
tecido ósseo cortical (BOGLIOLO, 1993), e de acordo com Mosekilde et al., (1998), o ensaio
de flexão de três pontos é o mais propício para testar regiões corticais, sugerindo que ensaio
biomecânico possivelmente reflete o comportamento desse tecido. Observou-se neste estudo,
no ensaio mecânico, com a flexão de três pontos, diferença estatística somente o grupo
SHAMM (não operado com medicamento) tendo valores inferiores aos grupos OVXM
(operado com medicamento). Os outros grupos não apresentaram diferença estatística quando
comparados simultaneamente.
As análises densitométricas e histológicas foram realizadas na parte proximal da
tíbia, pois segundo alguns autores, a fratura proximal tibial tem incidência aumentada com a
idade, com prevalência no sexo feminino (MELTON; RIGGS, (1983); WOOLF; PFLEGER,
2003). Sims e colaboradores (1996), afirmaram que há uma perda óssea considerável na
metáfise da tíbia proximal após a ovariectomia. Thompson et al., (1995), afirmaram que as
ratas têm perda óssea trabecular na tíbia proximal e em vertebras lombares após a
Discussão | 67
ovariectomia por um mecanismos de desequilíbrio da remodelação óssea; em estudos, os
achados com 14 dias após a ovariectomia, foi um aumento da remodelação óssea,
estreitamento e perda de elementos trabeculares. Kalu (1991), apresenta que com a
ovariectomia há uma perda maior no osso trabecular; já no osso cortical as perdas são
pequenas, pois a alta reabsorção na região endosteal é compensada pelo crescimento da área
periosteal (BILEZIKIAN et al., 1996).
Pesquisas mostram que o risco de fratura está diretamente ligado com a medida da
densidade mineral óssea, a densitometria tem sido destaque como metodologia para aplicação
clínica, conhecida como densitometria óssea, e segundo a OMS é um método padrão para o
diagnóstico da osteoporose (WHO, 1994).
Na densitometria óssea total não houve diferença estatística entre os grupos, já na
densitometria óssea proximal, o grupo OVX, teve valores significativamente inferiores aos
grupos SHAMM e SHAMCM, os grupos ovariectomizados em que os tratamentos foram
realizados não apresentaram diferença estatística. Lespessailles et al., (2009), também não
encontraram diferença significativa no conteúdo mineral ósseo em animais ovariectomizados
que treinaram corrida por 12 semanas. Quanto ao medicamento, de acordo com Szejnfeld
(2000), doses reduzidas e padronizadas, juntamente com o tempo limitado de administração
do medicamento, pode se justificar a ineficácia frente ao reparo não almejado. Robbins (1994)
em suas pesquisas, avaliou o efeito do risedronato no reparo ósseo, e também discuti a
possibilidade de que o tempo administrado o medicamento ter sido insuficiente para
sensibilizar o tecido cortical, que tem resposta mais lenta diante a ovariectomia. McClung
(1997), realizou um estudo em humanos, com Risedronato com doses diárias durante dezoito
meses, obteve um aumento significativo da densidade mineral óssea.
Monteagudo et al., (1997) verificaram que o período de privação de estrógeno de 1
mês após a ovariectomia é suficiente para observar sinais de osteopenia e a perda óssea que se
segue por meio da densitometria óssea. Entretanto Søgaard et al., (1997), não observaram
diferenças da densidade mineral óssea nas ratas ovariectomizadas em relação a ratas shams.
O exame histológico é muito utilizado para avaliar os parâmetros estruturais
microscópicos do osso. A utilização dessa ferramenta foi fundamental para determinar as
alterações causadas pela ovariectomia e os efeitos do tratamento preventivo realizado.
Neste estudo quantificou-se colágenos tipo I e III, pois segundo Junqueira e Carneiro
(2004), para a integridade óssea existe uma relação complexa entre o colágeno e os minerais
de hidroxiapatita. Alterações das propriedades e na disposição do colágeno podem influenciar
na disposição dos minerais, modificando assim a mecânica óssea.
Discussão | 68
Conforme Rizk e colaboradores (2008), o estudo do colágeno é importante para
avaliar a qualidade e a resistência óssea. Junqueira e Carneiro (2004), diferenciam os
colágenos tipo I e III, sendo que o tipo I pode ser encontrado em abundância no osso e está
incluído no grupo de fibras colágenas espessas, já o tipo III atribui ao grupo de fibras finas,
localiza-se entre as fibras grossas no osso cortical e está em maior concentração no canal de
Havers.
Na quantificação de colágeno tipo I, o grupo SHAMM apresentou valores inferiores
ao esperado, sugerindo que há um aumento da fragilidade óssea quando o risedronato é
utilizado sem que haja necessidade.
Rizk et al., (2008) afirmam que com a ovariectomia ocorre uma mudança na
proporção dos tipos de fibras, aumentando o colágeno tipo III e diminuindo
consideravelmente o colágeno tipo I, pesquisadores sugerem que essa alteração pode levar a
maior fragilidade óssea. Diferente do que foi encontrado em nosso trabalho, o grupo OVX
teve valores inferiores na avaliação do colágeno tipo III, aos grupos SHAMC e SHAMCM,
podendo indicar que a corrida associada ou não ao medicamento em grupos não operados
aumenta o colágeno tipo III.
De acordo com alguns autores (JUNQUERIA; CARNEIRO, 2004; RESNICK et al.,
1995), a remodelação óssea não está relacionada com o crescimento, o processo é muito mais
lento, ocorre a neoformação óssea no mesmo local da reabsorção, ao contrário da modelação,
onde o osso é removido de um local e formado em um local diferente (MANOLAGAS,
2000). No presente estudo, após a coloração, foi utilizada após a captura de imagens
histológicas em microscópio para avaliação da microarquitetura do trabeculado ósseo na
região proximal da tíbia. Segundo autores (SZEJNFELD, 2000; HARADA; RODAN, 2003),
a fase de reabsorção dura em média duas a três semanas e a neoformadora dura cerca de três
meses, os dois processos de neoformação e reabsorção óssea, ocorrem de maneira conjugada.
Com essa afirmação optamos por um tempo de experimento de três meses, o suficiente para
que se torne possível neoformação óssea.
O grupo OVX teve valores significativamente inferiores quando se refere a
quantificação do trabeculado ósseo, em relação SHAMCM, OVXM, OVXCM e SHAMCM e
o grupo OVXCM e SHAMCM com valores superiores aos grupos OVXC, SHAM e
SHAMM, sugerindo que o grupo que foi ovariectomizado e tratado preventivamente com
corrida e medicamento teve valores positivos, em relação a grupos não ovariectomizados.
A descoberta e caracterização do sistema RANKL, OPG e RANK, têm mudado os
conceitos relativos ao metabolismo ósseo, levando a um melhor entendimento da patogênese
Discussão | 69
das doenças ósseas metabólicas e alavancando novas estratégias terapêuticas. Neste estudo
relizou-se a técnica de imunoistoquímica para a detecção de OPG, RANKL e TRAP,
apresentando alta especificidade na detecção de tais proteínas. Baud’Huin e seus
colaboradores (2007), afirmaram que a razão RANKL/OPG pode ser utilizada como marcador
biológico de prognóstico em patologias ósseas, como por exemplo a osteoporose, cooperando
para avalição de novas drogas e terapias para as patologias ósseas.
Pesquisas apontam que experimentos in vivo demonstraram o RANKL como fator
pró-reabsorção, o aumento na expressão do RANKL está relacionado com o aumento da
atividade osteoclástica, favorecendo assim a reabsorção (HOFBAUER, 2006; BAUD’HUIN
et al., 2007), contudo outros autores afirmam que em condições inflamatórias ocorre maior
liberação de RANKL, nem sempre estas células guiaram o processo de reabsorção óssea,
sendo que muitas vezes a presença do receptor inibitório OPG influencia decisivamente o
processo de reabsorção óssea, sendo assim importante a análise da correlação RANKL e OPG
para melhor entendimento do metabolismo ósseo (MENEZES et al., 2008). No presente
estudo, na imunomarcação para OPG foi maior no grupo SHAMCM, nos grupos SHAMs no
geral foram de alto a moderado; já nos grupos OVXs, de baixo a moderado, já na
imunomarcação para RANKL, a inumomarcação foi maior no grupo OVX, no geral
observou-se o contrário do OPG, nos grupos SHAMs, foram de baixo a moderado, e no
OVXs, de alto a moderado; e por último a imunomarcação para TRAP, onde foi maior no
grupo OVX. Nos grupos em que o medicamento foi administrado, a presença de osteoclastos
arredondados, não acoplados à lacuna de reabsorção e distante da matriz óssea foi muito
comum.
No presente estudo, o grupo SHAMM apresentou um declínio de colágeno tipo III e
nas propriedades mecânicas, concluíndo que a aplicação do medicamento em ratas normais
pode acarretar o desequilibrio ósseo. E nos grupos ovariectomizados observamos melhora dos
grupos tratados, porém em algumas análises não foi possível observar alterações
significativas. De acordo com os parâmetros avaliados nesse trabalho, fica claro a necessidade
de estudos adicionais para a associação exercício físico com um bisfosfonato como tratamento
e/ou prevenção.
CONCLUSÃO
Conclusão | 71
6. CONCLUSÃO
Conclui-se que o uso da corrida associado ao medicamento risedronato nos grupos
ovariectomizados altera para melhor as propriedades biomecânicas do osso em relação ao
grupos SHAMs.
O medicamento não apresentou benefícios na prevenção primária.
O grupo em que o medicamento risedronato foi administrado, apresentou maiores
valores quando comparados com o tratamento corrida, e quando associados os tratamentos os
resultados foram ainda melhores nos grupos ovariectomizados.
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Referências Bibliográficas | 73
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ANEXO
Anexo | 94

Efeitos do exercício físico associado ao - Pós

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