Principais patógenos isolados nas glândulas mamárias das

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde
Departamento de Medicina Veterinária
Curso de Medicina Veterinária em Betim
Patrícia Karen da Silva Cunha
Sara Paulino de Oliveira
Principais patógenos isolados nas glândulas mamárias das vacas
da Fazenda Experimental da PUC Minas e sua correlação com a
produção diária de leite e contagem de células somáticas
Betim
2013
Patrícia Karen da Silva Cunha
Sara Paulino de Oliveira
Principais patógenos isolados nas glândulas mamárias das vacas da Fazenda
Experimental da PUC Minas e sua correlação com a produção diária de leite e
contagem de células somáticas
Monografia apresentada ao Curso de Medicina
Veterinária em Betim da Pontifícia Universidade
Católica de Minas Gerais, como requisito parcial
para obtenção do título de Bacharel em Medicina
Veterinária.
Orientador: Hudson Nunes da Costa
Betim
2013
Betim, 18 de julho de 2013.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 -
Mudança na composição do leite associada com elevada contagem
de células somáticas
TABELA 2 -
09
Frequência de microrganismos causadores de mastite encontrados
no cultivo do rebanho e média da CCS e total de amostras
18
analisadas, dentro de cada grupo analisado.
TABELA 3 -
Distinção de vacas saudáveis e não saudáveis de acordo com o
valor da CCS e cultura negativa.
TABELA 4 -
19
Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e
estimativa de perda de produção diária (kg) sobre a CCS
transformada (log10) baseados nos testes semanais de pesagem de
leite e CCS das vacas negativas na microbiologia (CCS>=100 mil),
vacas positivas (CCS <100 mil), vacas positivas (CCS >= 100 mil)
em relação às vacas negativas na microbiologia (CCS <100 mil;
n=21), média e mediana da CCS (x 103)
21
TABELA 5 -
Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e
estimativa de perda de produção diária (kg) sobre a CCS
transformada (log10) baseados nos testes semanais de pesagem de
leite e CCS das vacas negativas na microbiologia (CCS>=100 mil),
vacas positivas (CCS <100 mil), vacas positivas (CCS >= 100 mil)
em relação às vacas negativas na microbiologia (CCS <100 mil;
n=21), média e mediana da CCS (x 103)
22
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
01
2 REVISÃO DA LITERATURA.
01
2.1 MASTITE
01
2.2 Sistema Imune da Glândula Mámaria
04
2.3 Contagem de Células somática
06
2.4 Bactérias
11
3 OBJETIVO
16
4 MATERIAL E MÉTODOS
16
4.1 Caracterização da fazenda
16
4.2 Coleta de amostras
16
4.3 Delineamento e análise estatística
18
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
18
6. CONCLUSÃO
23
7. REFERÊNCIAS
24
RESUMO
Com o objetivo de identificar os principais patógenos causadores de mastite em sistema Freestall
de criação de vacas leiteiras e sua relação com a produção de leite, foi realizado uma pesquisa
em uma fazenda no município de Esmeraldas, Minas Gerais. As amostras de leite foram obtidas
durante a ordenha, semanalmente e durante três meses. Durante a pesquisa, foi coletado leite
para realização de contagem de células somáticas (CCS), para relacionar bactérias isoladas em
laboratório com os níveis de CCS encontrados no rebanho. Pode-se observar que em 21,1% das
amostras, não houve crescimento bacteriano (NHC); 79,2% foram de amostras de leite que
apresentaram crescimento bacteriano, sendo isolados os seguintes patógenos: 4,6% para
coliformes, 42% de Staphylococcus spp., e 32,3 % de Streptococcus spp. Na analise da CCS os
coliformes tiveram a CCS mais alta quando comparada com os outros patógenos. A maior perda
diária de leite observada foi por Streptococcus spp, de -4,4kg/dia de leite.
Palavras-chave: patógenos, mastite, contagem de células somáticas (CCS), microbiologia.
ABSTRACT
In order to identify the major mastitis pathogens in freestall system of dairy cows and its
relationship with milk production, a survey was conducted on a farm located in Esmeraldas, Minas
Gerais. The milk samples were obtained during milking, once a week during a three months period.
During the research, milk was collected to somatic cell count (SCC) analysis, to relate laboratory
isolated bacteria with SCC levels found in the herd. In 21.1% of the samples, no bacterial growth
(NHC); 79.2% of the milk samples that showed bacterial growth were isolated with the following
pathogens: Coliforms: 4.6%; Staphylococcus spp. 42%, and 32.3% of Streptococcus spp. CCS
Analysis of coliforms had higher level when compared to other pathogens. The greatest daily milk
loss was caused by Streptococcus spp, -4.4 kg /day milk.
Keywords: pathogens, mastitis, somatic cell count (SCC), microbiology.
1
1. INTRODUÇÃO
É cada vez mais importante a obtenção de leite de boa qualidade, sendo uma exigência
do mercado consumidor, uma necessidade da indústriade laticínios e uma garantia de
permanência no mercado para os produtores leiteiros (MULLER,2002).
Economicamente, a mastite é a mais importante enfermidade do gado leiteiro,
apresentando alta prevalência em todo o mundo, acometendo não só os bovinos, como
também os caprinos e bubalinos e podendo se manifestar clinicamente com evolução
super-aguda, aguda e crônica (COSTA et al,2008; MULLER, 2002). Agravando o
problema, a enfermidade se apresenta também sob a forma subclínica. Esta é a mais
prejudicial pela falta de sinais ou sintomas, determinando, porém, perdas econômicas
maiores devido à freqüência e persistência do processo (MACKLE et al, 1999).
A alta contagem de células somáticas do leite indica processo infeccioso da glândula
mamária, o que traz perdas consideráveis para os produtores de leite e para a indústria.
(RINALDI, 2010). Como esta é uma medida indireta do processo infeccioso, o uso da
microbiologia na triagem de microrganismos é de extrema relevância para melhor
avaliação da ocorrência de patógenos no rebanho, bem como para a criação de
estratégias de controle para redução da carga bacteriana (SOUZA, 2009).
O objetivo do presente trabalho foi a identificação dos patógenos que causam mastite
subclínica e a dinâmica de infecção dos patógenos associado à contagem de células
somática e perdas de produção.
2. MASTITE
A mastite caracteriza-se por processo inflamatório da glândula mamária. É uma das mais
complexas e dispendiosas doenças da indústria leiteira, devido à sua alta prevalência e
aos prejuízos que acarreta (RINALDI et al, 2010; KANDASAMY et al, 2011). Além disso,
seu efeito é notado, principalmente, pela redução na produção e as alterações na
composição físico–químicas do leite onde as alterações mais comuns observadas são
2
alteração de coloração, aparecimento de coágulos e presença de grande número de
leucócitos (MULLER,2002).
A principal ocorrência da mastite está relacionada, principalmente, com a infecção por
microrganismos invasivos, como bactérias e, possivelmente, fungos, leveduras e
vírus.(RADOSTITS et al., 2002). Dentre as bactérias, um número limitado dos gêneros
Staphylococcus, Streptococcus e do grupo dos coliformes causam a maior parte das
infecções. (SCHVARZ et al, 2012).
As infecções da glândula mamária podem apresentar-se sob duas formas: a clínica e a
subclínica, sendo a mastite subclínica a forma mais importante, pois
ocorre com maior frequência, não apresenta sintomas aparentes e normalmente antecede
a clínica.( VIANA, 2000; AULDIST E HUBBLE 1998 apud PINTO et al. 2009).
Os microrganismos que comumente causam mastite podem ser divididos em dois grupos,
baseando-se na sua origem: patógenos contagiosos e patógenos
ambientais. Os patógenos contagiosos são aqueles adaptados à sobrevivência no interior
da glândula mamária. Em contraste, os patógenos ambientais são melhores descritos
como invasores oportunistas do úbere, não adaptados a sobreviver no seu interior
(WATTS, 1988).
Os principais patógenos contagiosos são Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiaee Corynebacterium bovis. Dentre os patógenos ambientais destacam-se a
Escherichia
coli,
Streptococcus
uberis
e
outros
estreptococos,
enterobactérias,. (MENDONÇA et al.,1999; COSTA, 1998).
coliformes
e
No grupo dos coliformes
ambientais encontram-se as bactérias gram-negativas como a Escherichia coli, Klebsiella
spp., Citrobacter spp, Enterobacter spp., Enterococcus faecalise, Enterococcus faecium.
(RADOSTITS et al., 2002).
As mastites contagiosas são caracterizadas como infecções de longa duração, onde sua
transmissão se dá de vaca para vaca no momento da ordenha. Os patógenos contagiosos
que se destacam são Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus. As infecções de
curta duração ocorrem nas mastites subclínicas por patógenos ambientais, os principais
são Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, coliformes; e a transmissão
acontece entre as ordenhas.(CHANETON et al 2008; ANDREWS, 2008)
3
Fontes de patógenos ambientais incluem esterco, cama, alimentos, poeira, sujeira, lama
e água (HOGAN, 1989). O esfíncter do teto leva cerca de 30 minutos para fechar após a
ordenha (WOLFE, 1997); portanto, ocorre constante exposição das pontas dos tetos aos
microrganismos ambientais, sendo fonte significativa para a entrada dos patógenos
ambientais.
O diagnóstico da mastite clínica pode ser feito por meio da sintomatologia, como
inflamação do úbere, edema, hipertermia, endurecimento da glândula mamária, dor na
região da glândula mamária, secreção láctea com grumos, sangue e pus entre outras
secreções patológicas (SCHVARZ,2012; PELEJA,L. et al, 2006).
A forma subclínica se caracteriza por alterações na composição do leite, porém não
evidentes. Entre as principais alterações destaca-se o aumento da contagem de células
somáticas, o aumento dos teores de Cl-, Na+, proteínas séricas e diminuição do
percentual de caseína, gordura, sólido total e lactose do leite (PELEJA,L. et al, 2006).
Entretanto, para diagnosticar a mastite subclínica é necessária a utilização de exames
complementares baseados no conteúdo celular do leite. Além disso, existe a necessidade
da cultura e isolamento dos agentes etiológicos envolvidos para a implantação de
métodos de tratamento e estratégias de controle e profilaxia adequados (DIAS, 2007).
O desenvolvimento da mastite pode ser caracterizado em três estágios: invasão, infecção
e inflamação. A invasão é o estágio em que os patógenos passam do meio externo para
as secreções ou leite presente no canal lactífero (RADOSTITS et al., 2002). A infecção é
o estágio onde o microrganismo se fixa no tecido mamário e inicia sua reprodução e
proliferação por todo parênquima mamário ( PRESTES,2002).
A multiplicação de certos microrganismos, como os coliformes, pode resultar na liberação
de endotoxinas, que desencadeiam graves efeitos sistêmicos, como febre, anorexia e
perda de peso, com poucas alterações inflamatórias. O estágio de inflamação é onde se
observam as alterações anormais na glândula mamária e vários efeitos sistêmicos no
animal (RADOSTITS et al,2002).
4
2.1 SISTEMA IMUNE DA GLÂNDULA MAMÁRIA
A glândula mamária saudável é protegida por uma variedade de mecanismos de defesa
naturais. Os mecanismos de defesa do sistema imune (SI) incluem barreiras físicas como
o esfíncter do teto, barreiras químicas, como a queratina do canal do teto e a lactoferrina
e componentes celulares do SI como Macrófagos, Células Dendríticas, Mastócitos,
Neutrófilos, Eosinófilos e Célula Natural Killer (NK) (SCHUKKEN, 2011).
A principal porta de entrada da bactéria é pelo esfíncter do teto. Se essa estrutura for
mantida íntegra, dificilmente ocorrerá crescimento bacteriano (SCHVARZ, 2012).
Normalmente o canal do teto é fechado pelos músculos do esfíncter do teto prevenindo a
entrada de patógenos. Esta invasão progride do canal do teto para a cisterna da glândula
e depois para as extremidades dorsais da glândula mamária (RINALDI et al, 2010).
Um mecanismo adicional de defesa do teto é o seu revestimento por uma camada de
queratina (composta por células epiteliais descamadas, ácidos graxos e proteínas
catiônicas) (PRESTES et al,2002). Associada à queratina há o ácido graxo que obstrui a
migração da bactéria e contém agente antimicrobiano como carboidratos de cadeia longa
que ajudam a combater a infecção (VIGUIER et al, 2009; PRESTES et al,2002).
No entanto, a eficiência da queratina é restrita por fatores que afetam a integridade dessa
camada, tornando o teto susceptível às infecções intramamárias (IIM). A dilatação do
canal do teto e a saída do leite são fatores que diminuem a eficiência da queratina, pois a
mesma é removida quando ocorre a distensão do canal do teto (VIGUIER et al, 2009;
PRESTES et al,2002 ).
Perceber a presença do patógeno é o primeiro passo na defesa imunológica. Receptores
trans-membrana percebem a presença do patógeno devido a seus componentes
moleculares pelo processo de quimiotaxia (SCHUKKEN, 2011). As regiões da cisterna do
teto e cisterna da glândula são mais responsivas às infecções após 12 horas de infecção,
enquanto a região dos lóbulos alveolares é a região com maior resposta imune após 24
horas de infecção bacteriana (RINALDI et al, 2010). Isto sugere que há uma sequência na
resposta da inflamação que difere de acordo com a região do úbere e que isso ocorre
devido a interação da bactéria com a células de defesa do hospedeiro.
Em uma pesquisa realizada por SCHWARZ et al (2011), as porcentagens de leucócitos
secretados pelos quartos mamários saudáveis consistiram de: 58,2% de linfócitos;
5
23,06% de macrófagos e 18,74% de polimorfonucleares (PMN). Analise estatística indicou
significante correlação negativa entre as porcentagens de linfócitos e CCS. Linfócitos e
PMN seguiram em direções contrárias quando a CCS elevava. Neutrófilos aumentaram
de 30% com CCS menor do que 10.000 cel/ml para 63.65% com CCS de 1394.000 cel/ml.
PMN foram as células predominantes (85,27% cel/ml) da população de leucócitos das
glândulas mamárias com mastite.
Os neutrófilos são as células de defesa predominante (> 90%) durante a mastite. Eles
possuem a capacidade de matar a bactéria através da produção de radicais de oxigênios,
proteínas bactericidas e lise através da fagocitose (RINALDI et al, 2010). A principal
função do PMN é a defesa contra a bactéria invasora no começo do processo inflamatório
agudo. Não somente o número de PMN eleva substancialmente como também suas
respostas de defesa também aumentam e há significante correlação positiva entre
porcentagem de PMN e contagem de células somáticas (CCS) (PAAPER et al, 2003). A
elevada proporção de PMN pode ser evidência da fase inicial da inflamação. É possível
que PMN sejam capazes de defender patógenos com sucesso e prevenir a mastite
(SCHWARZ et al, 2011).
O reconhecimento e a resposta imune do animal contra o patógeno são fatores cruciais
para estabelecimento, persistência e gravidade da infecção. Existem diferenças
importantes na resposta às IIM, dependendo da espécie bacteriana. De acordo com
ELAZAR (2010), a resposta do sistema imune inato é significantemente diferente entre
bactérias gram-negativas e gram-positivas (neste caso foram analisadas gram-negativa:E.
coli; gram-positiva : Streptococcus uberis).
Em resposta a uma infecção intramamária por E. coli, os macrófagos não foram capazes
de estabelecer uma resposta imune ao lipopolissacarídeo (LPS) da bactéria gramnegativa. O estudo sugere que os neutrófilos promovem uma defesa essencial contra E.
coli, onde os macrófagos alveolares tem o papel de sinalizar a invasão para os neutrófilos
(ELAZAR, 2009).
Os receptores do tipo Toll (TLR: Toll Like Receptors) são os responsáveis pelo
reconhecimento de várias vias de padrões de reconhecimento de patógenos, os PAMPs pathogen-associated molecular patterns. O TLR4 é o receptor que reconhece o PAMP da
E. coli através de sua camada de lipopolissacarídeo (LPS). (ABBAS, 2003).
6
Entre os moduladores imunes secretados pela glândula mamária, as citocinas merecem
atenção especial (RIOLLET et al., 2000), pois a glândula mamária bovina responde aos
agentes patogênicos estimulando a produção de citocinas e outros mediadores pró –
inflamatórios (CORL et al, 2008)
As principais citocinas do tipo Interleucina (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12) e o Fator de Necrose
Tumoral-α (TNF-α) são considerados como marcadores das defesas da glândula mamária
(CARNEIRO et al, 2009). As citocinas pró- inflamatórias IL-1a, IL-1b , IL-6, IL-8, IL-12, e
TNFa são produzidas principalmente pelas células epiteliais e pelos neutrófilos. Elas
desencadeiam o processo inflamatório por alteração da permeabilidade vascular, e além
de promover recrutamento de leucócitos, estimula as células endoteliais locais a
expressarem adesinas aos neutrófilos, induzindo-os a infiltrarem-se no tecido mamário
(SORDILHO et al 1997). Além disso, ativam a capacidade fagocítica dos neutrófilos
(BANNERMMAN et al 2004).
Uma resposta inflamatória local, exagerada ou aguda, pode causar extensa necrose do
parênquima mamário e perda de produção de leite (CORL et al, 2010).Como os níveis de
citocinas sofrem variações frente ao processo infeccioso, elas são consideradas
promissoras no diagnóstico e na avaliação do prognóstico da saúde do úbere
(ALLUWAIMI, 2004).
A resposta inflamatória pode estar presente mesmo que o microrganismo já tenha sido
eliminado de forma natural pelos processos de cura espontânea, resultando assim em
culturas negativas e CCS elevadas e perdas de produção de leite (RIBEIRO et al,2003;
COSTA, 2012).
2.2 CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS X COMPOSIÇÃO DO LEITE E
PRODUÇÃO
As células somáticas são todas as células presentes no leite, que incluem as células
originárias da corrente sangüínea como leucócitos, macrófagos, polimorfonucleares e
células de descamação do epitélio glandular secretor. No leite do animal sadio, as células
epiteliais representam de 0 a 7%, mas, de acordo com alguns autores, podem
7
corresponder a até 20% do número total de células, dependendo do estágio de lactação.
Em casos de processo inflamatório do úbere há aumento da CCS no leite. As células
somáticas são, portanto, um reflexo da resposta inflamatória da glândula mamaria.
Contagem de células somáticas é frequentemente usada para distinguir entre quartos
mamários infectados e não infectados (MULLER, 2002; PILLAI et al, 2001;BRITO,et al
2007; CASAS, et al, 2012).
BRITO et al (2007), relata que células somáticas estão geralmente presentes em pequeno
número até 50.000 ou mesmo 100.000 por mililitro (mL) no úbere sadio, mas em presença
da inflamação podem alcançar contagens elevadas por mL de leite. A CCS no leite de
animais individuais ou de tanque é uma ferramenta valiosa na avaliação do nível de
mastite subclínica no rebanho (MULLER,2002). As estimativas das perdas de produção
podem variar de 10 a 30% da produção leiteira por lactação.(SANTOS, 2011).
HARMON (2001) afirma que considerando a vaca ou o quarto mamário, a CCS normal
geralmente está abaixo de 200.000 cels/ml, mas pode ser menor do que 100.000 cels/ml
(PELEGRINO et al, 2008). De acordo com SCHUKKEN (2011), contagens normais de
células do sistema imune (CCS) em quartos mamários saudáveis variam entre 20.000 a
100.000 cel/ml de leite.
Entretanto, um elevado número de patógenos causadores de mastite foi encontrado em
CCS ≤ 100 mil cel/ml. Em alguns casos, patógenos foram detectados em amostra de leite
de vacas com CCS de 1000 cel/ml. Baseado nessas informações, os processos
inflamatórios podem ocorrer na glândula mamária mesmo com valor de CCS de glândulas
mamárias classificadas como saudáveis de acordo com as definições atuais (HARMON,
1994). Em 11 de 65 úberes com CCS menor do que 100000 cel/ml, bactéria foi
encontrada, sinalizando mastite latente nesses quartos. Interessantemente, todas essas
bactérias foram Staphylococcus coagulase negativa (SCN) detectados numa faixa de
CCS entre 7 mil – 59 mil cel/ml (SCHWARZ et al, 2011). Entretanto para DOHOO e
LESLIE (1991) e RUEGG (2003) o ponto de corte para definir se o animal é infectado é
acima de 200 mil células, sendo este parâmetro utilizado atualmente.
Além do aumento do número de células, a mastite provoca alterações nos três principais
componentes do leite: gordura, proteína e lactose. (MULLER,2002).A extensão do
aumento da CCS e as mudanças na composição do leite estão diretamente relacionadas
8
com a superfície do tecido mamário atingido pela reação inflamatória. Portanto há uma
relação direta entre a CCS e a concentração dos componentes do leite (SCHÄELLIBAUM,
2000; MULLER, 2002). Quando CCS eleva > 100 mil cel/ml a perda de produção é
elevada (HALASA et al, 2009).
Entre os componentes do leite, as proteínas são as que apresentam a maior variação em
animais com mastite. Pode haver decréscimo significativo nos teores de caseína total e
elevação das proteínas do soro, incluindo grande elevação nas imunoglobulinas. A
proteína total do leite tem pouca variação, mas a concentração de cada tipo de proteína
varia acentuadamente (MULLER, 2002 ; BUENO et al, 2005 ; PELEGRINO et al, 2008).
A caseína corresponde a, aproximadamente, 80% das proteínas do leite sintetizadas
inteiramente no interior da glândula mamária e consideradas financeiramente entre as
mais importantes devido à sua relação com a produção de queijos (MACKLE et al., 1999;
ZAFALON et al, 2009).
Existe uma redução das proteínas sintetizadas na glândula mamária (α e β caseína, αlactoalbumina e β-lactoglobulina (MULLER, 2002; ZAFALON et al, 2009; FONSECA;
SANTOS, 2000). Segundo HARMON, 1994; PELEGRINO et al, 2008, ocorre aumento das
proteínas plasmáticas no leite, devido ao aumento da permeabilidade vascular em
decorrência ao processo inflamatório (KITCHEN, 1981; MULLER, 2002).
Dessa forma, a porcentagem de proteína total no leite com elevada CCS reduz apenas
1%, em relação à concentração encontrada no leite de vacas sem mastite. Na mastite
subclínica ocorre um aumento do conteúdo de proteína total do leite pelo aumento da
lactoferrina, de imunoglobulinas e da soroalbumina bovina, proteínas associadas com
respostas inflamatórias da glândula mamária (URECH et al., 1999; ZAFALON et al, 2009).
Normalmente existe tendência de queda na concentração de gordura à medida que
aumenta a CCS. Nos casos em que a produção de leite diminuiu em uma proporção
maior que a síntese da gordura, a percentagem de gordura aumenta em animais com
altas CCS em função do efeito da concentração (KITCHEN, 1981).
A mastite, acompanhada de altas CCS, está associada à diminuição da concentração de
lactose no leite, isso acontece porque alguns microrganismos utilizam a lactose como
fonte de energia. O potássio, mineral predominante no leite, decresce devido ao dano
celular, enquanto há uma elevação nos níveis de sódio e cloro que passam do sangue
para o leite (HARMON, 1994; SCHÄELLIBAUM, 2000; SCHUKKEN, 2011).
9
Na tabela apresentada por SCHAELLIBAUM (2000), observa- se as mudanças que
acontecem na composição do leite à medida que há aumento na contagem de células
somáticas.
Tabela 1. Mudanças na composição do leite associadas com elevada
contagem de células somáticas.
Uma das principais formas de estimar as perdas de produção de leite é pelo uso da CCS
(contagem de células somáticas). Segundo RENEAU (1986), o único fator mais
importante a afetar a contagem de células somáticas é o estado de infecção da glândula
mamária.
As respostas específicas dos patógenos podem ser reconhecidas na CCS do leite relativa
à infecção intramamária, além de notáveis perdas na produção leiteira, risco de descarte
e morte dos animais (SCHUKKEN, 2011).
A mastite subclínica afeta qualidade e
quantidade do leite causando alta perda econômica para os produtores (VIGUIER et al,
2009).
Infecções intra-mamárias próximas ao parto, seja clínica ou subclínica, levará a
consideráveis perdas econômicas para o produtor, e deveriam ser evitadas. Pouca
higiene na área de parto está associada à elevação e prevalência de elevada CCS em
novilhas (DE VLIEGHER, 2004).
10
Segundo estudo canadense de DOHOO et al (1984), para cada incremento de mudança
no nível de CCS acima de 200 mil células , houve perda no rebanho de 1.44kg por vaca.
Em vaca primípara e multípara com CCS de 200 mil células por ml houve perda de 0.31 e
0.58 kg de leite por dia, respectivamente, quando o efeito de diluição não é considerado
(HALASA et al, 2009).
Em um estudo realizado com grupos de diferentes rebanhos de Nova York, foi
determinado que os agentes que causaram maiores perdas de produção em
primíparasforam:S. aureus, E. coli, Klebsiella spp. Já nas multíparas foram Streptococcus
spp. Staphylococcus aureus, Arcanobacteruim pyogenes, Escherichia coli, e Klebsiella
spp.
As
vacas
de
primeira
lactação
que
tiveram
mastite
clínica
causada
por Streptococcus spp. apresentaram uma pequena redução na produção após o início do
caso e na primeira semana atingiram perdas de 2,5 kg/dia (SANTOS,2011).
VIGUIER et al (2009) realizou um estudo em vários países onde analisaram os custos
financeiros causados pela mastite – dados de 2009. Nos EUA, as perdas anuais
projetadas gerada pela mastite são US$2 bilhões.No Reino Unido, mastites causam uma
perda anual de aproximadamente £300 milhões para produtores de leite. Na Irlanda do
Norte, o valor total anual de infecções por mastite é de £14 milhões. Na Holanda o custo
médio por vaca infectada varia entre s164 e s235.
Segundo LOPES et al (2012), quando a CCS está elevada, o número de patógenos de
mastite por ml de amostra de leite foi alto.Quanto maior a intensidade do processo
inflamatório, maior será a liberação de bactérias causadoras de mastite pela glândula
mamária. Desta forma, CCS é um bom indicador de liberação de bactérias pelas
glândulas mamárias, entretanto estas correlações não são suficientes para acessar as
diferenças entre patógenos de mastite com a mesma elevação de CCS.
O agente microbiano pode ainda já ter sido eliminado de forma natural pelos processos
de auto–cura, resultando em cultura negativa. (RIBEIRO et al,2003).
O exame microbiológico é considerado o método padrão para determinação da saúde do
úbere e para o diagnostico da mastite bovina. Análises microbiológicas são
complementares e indispensáveis em um programa de controle desta enfermidade, por
possibilitarem o isolamento e a identificação do seu agente etiológico causadores de
doença no rebanho (BUENO et al., 2003; MARTINS et al, 2010; SCHVARZ et al, 2012).
11
2.3 BACTÉRIAS
Os patógenos maiores, ditos mais freqüentes, são: Staphylococcus aureus (S. aureus),
Streptococcus agalactiae, coliformes e Streptococcus spp. Eles causam a maior elevação
de CCS. Os patógenos menores como Corynebacterium bovis (CB) e Staphylococcus
coagulase negativa (SCN), geralmente causam moderada elevação na CCS (SOUZA,
2009). Dependendo do agente etiológico da mastite e de modificações patológicas da
glândula mamária, ocorrerá variações na CCS (LOPES et al, 2012).
Segundo SCHUKKEN (2011), a adaptação ao hospedeiro por algumas espécies de
bactérias, resultaria em infecções persistentes associadas a um padrão clínico da doença
com menor severidade e maior oportunidade de persistência de infecção subclínica e
transmissão de cepas de espécies bacterianas dominantes no rebanho.
Em experimento realizado por LOPES et al (2012), os patógenos isolados dos quartos
mamários foram S. aureus (10.8%), SCN (10%), Streptococcus agalactiae (7.1%), outros
Streptococcus spp (6.1%); e a média da CCS de acordo com resultados microbiológicos
cresceu nesta ordem: sem crescimento microbiológico, SCN, outros Streptococcus spp, S.
aureus e Streptococcus agalactiae.
LONGO et al (1994), estudando a mastite subclínica em quatro rebanhos, compostos por
118 vacas leiteiras e 468 quartos mamários, verificaram que o S. aureus, foi isolado de
44,7% dos casos, SCN de 31,6% e Streptococcus spp de 11,4%, sendo o S. aureus o
agente etiológico mais freqüente nas mastites subclínicas.
HARROP et al. (1975), estudando a incidência da mastite bovina em 866 vacas
procedentes do Agreste Meridional de Pernambuco encontraram 338 vacas reagentes ao
CMT (39,0%) e 275 animais (31,2%) estavam com infecções no úbere detectadas pelo
exame bacteriológico, sendo, S. aureus
e Streptococcus spp. as bactérias mais
frequentes.
Em um experimento realizado por BARBALHO et al (2001) demonstrou que as bactérias
do gênero Staphylococcus spp foram isoladas de 50 amostras, correspondendo a 38,76%
do total dos agentes isolados. Estes agentes foram isolados com maior frequência em
vacas com mastite subclínica.
12
Segundo estudos de (SOUZA et al, 2009), observou que 1.139 (30,3%) amostras não
apresentaram crescimento bacteriano e em 2.614 (69,7%) foi identificada a presença de
pelo menos um patógeno da mastite. Entre as amostras de leite que apresentaram
crescimento bacteriano, foram 826 (31,6%) para Corynebacterium spp.; 790 (30,2%) para
S. aureus; 551 (21,1%) Streptococcus agalactiae; 466 (17,8%) SCN; e 351 (13,4%)
Streptococcus spp. que não S. agalactiae.
2.3.1 Staphylococus spp
Staphylococcus coagulase negativa (SCN) são patógenos comuns em rebanhos leiteiros
e estão principalmente associados aos casos subclínicos de mastite, e à presença de
células somáticas no leite, com CCS próximas a 300 a 400 cels/mL de leite. Os SCN
constituem um grupo bastante heterogêneo de microrganismos associados a infecções da
glândula mamária de bovinos, sendo comumente encontrados no ambiente dos
estabelecimentos de ordenha, em equipamentos de ordenha e na pele dos quartos
mamários (SANTOS et al,2011) .
A presença desses microrganismos é maior em propriedades que reduziram o número de
infecções causadas por outros patógenos, sendo mais frequentes em animais de primeira
lactação (SOUZA, 2009; LAFFRANCHI et al, 2001 ; SANTOS et al, 2011).
Apesar de serem considerados menos patogênicos que os S. aureus, as infecções
causadas por SCN têm sido associadas com perdas consideráveis de leite por lactação,
tendem a persistir durante todo o período da produção, com CCS próximas a 1.000.000
cels/mL de leite e os índices de curas espontâneas das infecções causadas são
considerados baixos (HOOGAN, 2003).
Staphylococcus aureus (S. aureus) é importante causa de infecção intramamária no
rebanho leiteiro. A sua transmissão é de vaca a vaca, por animais infectados no rebanho.
No entanto, outras cepas não-contagiosas de S. aureus presentes no ambiente foram
descritos coexistindo com cepas contagiosas de S. aureus (ZADOKS et al, 2002). A
prevalência de S. aureus como causador de mastite bovina pode estar relacionada aos
mecanismos de resistência, tais como a presença do biofilme nos equipamentos de
ordenha, redução da susceptibilidade a antimicrobianos, ao baixo percentual de cura
13
durante a lactação e a presença deles tanto no ambiente (fômites) quanto nos animais e
no homem (MELO, 2008).
S.aureus está tipicamente associado à infecção persistente e duradoura. A contagem
bacteriana é bem menor em comparação a infecções intramamárias causadas por
Escherichia coli e Streptococcus uberis (SCHUKKEN, 2011). A maioria de suas infecções
são subclínicas, geralmente não detectadas. A eficácia dos Programas de Controle difere
bastante entre rebanhos, provavelmente por consequência da patogênese multifatorial da
mastite gerada pelo S. aureus (PICCININI et al, 2012).
O microrganismo entra na glândula mamaria via canal do teto, multiplica-se dentro da
cisterna onde ocorre adesão às células epiteliais, o que representa importante passo no
processo de infecção (PICCININI et al, 2012; DEGO, 2002). As bactérias também podem
estar fagocitadas pelos leucócitos durante a estocagem do leite e antibioticoterapia pode
ter ocorrido antes da coleta da amostra de leite. No ato do exame os patógenos podem
estar fagocitados ou sobrevivendo intracelularmente no hospedeiro (ALLORE, 1998;
SCHWARZ et al, 2011).
Amostras de Staphylococcus aureus foram encontradas em macrófagos e em células
alveolares isolada do leite de vacas com infecção crônica. S. aureus produz vários fatores
de virulência, como proteínas que promovem adesão ao tecido mamário, toxinas que
podem gerar danos ao parênquima e enterotoxinas que interferem na resposta
imunológica do úbere (PICCININI et al, 2012).
De acordo com pesquisa feita por SEARS et al (1990), tanto em vacas infectadas
naturalmente como experimentalmente por S. aureus, foi observado alto e baixo ciclo de
liberação de bactérias. O ciclo de baixa liberação de bactérias foi estabelecido em < 1000
UFC/ml de leite, e o ciclo de alta liberação de bactérias foi definido em >2000 UFC/ ml de
leite. Foram utilizados 21 quartos mamários de sete vacas sadias, e foram coletadas 991
amostras de leite para exame bacteriológico para S aureus. Destarte, para mastite por S.
aureus, pode ser estabelecido um padrão cíclico de liberação desse patógeno no leite.
14
2.3.2 Bactérias gram-negativa: coliformes
As bactérias gram-negativas causadoras de mastite e sua patogenicidade têm sido
estudadas recentemente através de seu principal representante, o coliforme Escherichia
coli (E. coli). A E. coli expressa uma variedade de fatores de virulência, entretanto ainda
não está definida a relação entre a severidade da doença e fatores específicos de
virulência (SCHUKKEN, 2011).
Os coliformes não se aderem aos ductos e alvéolos no úbere, em vez disso, eles se
multiplicam rapidamente no leite e produzem toxinas que são absorvidas na corrente
sanguínea. Como resultado, infecções por coliformes levam à mastite aguda ou super
aguda (QUINN et al, 2005).
A Escherichia coli habita o trato gastrointestinal das vacas leiteiras. É classificada como
patógeno ambiental da mastite, pois sua infecção é primariamente dependente da
exposição ao ambiente (QUINN et al , 2005). Bactérias gram-negativas utilizam a lactose
como fonte de energia através do leite para crescimento e multiplicação (SCHUKKEN,
2011).
A CCS mais elevada identificada entre os patógenos causadores de mastite foi gerado
pela E. coli (DJABRI, 2002). A infecções por essa bactéria são tipicamente caracterizadas
por sintomas agudos seguido de cura espontânea. No entanto, dentre os casos onde a
mastite resultou em morte, aquelas causadas pela E.coli são mais prevalentes (RINALDI
et al, 2010).
A habilidade de crescer em secreções mamárias e de liberar lipopolissacarídeos (LPS) é
crucial na patogênese da mastite causada por bactérias gram-negativas. Quanto mais
rápido o numero de bactérias é elevado na glândula mamária, maior quantidade de LPS
estará presente na glândula, e a resposta inflamatória e doença clínica ocorrerão mais
rápido (MEHZRA et al, 2008).
Segundo HOGAN (1989), infecções intramamárias por coliformes tendem a ser de curta
duração, mais de 50% duram menos de 10 dias. Em um estudo realizado por
RADOSTITS (2002) as infecções por coliformes ambientais em um rebanho geralmente
fica em torno de 1% a 2%. Sua principal característica é a curta duração, persistindo por
um período de sete dias.
15
Infecções causadas por E. coli são tipicamente, mas não exclusivamente, associadas a
uma resposta imune mais rápida e intensa, onde infecções por S. uberis são
caracterizadas por resposta lenta e menos intensa. Em contrapartida, S aureus é capaz
de burlar a resposta do sistema imune e sua infecção é procedida de resposta moderada
do hospedeiro (RINALDI et al, 2010).
2.3.3 Streptococcus spp:
Streptococcus uberis é uma causa comum de mastite clinica e subclínica; são geralmente
considerados de natureza ambiental, no entanto comportamento contagioso (vaca a vaca)
é frequentemente observado (ZADOKS et al, 2002).
Trato gastrointestinal, pele, solo e material de cama são reservatórios naturais do S.
uberis. As moléculas bacterianas secretadas pelo S. uberis são capazes de inibir a função
bactericida dos neutrófilos, por gerarem falha na produção de pseudópodes, sendo assim
a bactéria permanecerá por mais tempo na glândula mamária (SCHUKKEN, 2011).
Streptococcus dysgalactiae (S. dysgalactiae) parece ocupar uma posição intermediária
dos grupos dos patógenos contagiosos e ambientais da mastite, com amostras adaptadas
aos animais e ao ambiente (AARESTRUP e JENSEN, 1996; CALVINHO et al, 1998).
Como a bactéria pode persistir na glândula mamária, a transmissão pode ocorrer durante
a ordenha e, conseqüentemente, o controle pode ser realizado pela adoção de
procedimentos higiênicos corretos no momento da ordenha (BRAMLEY e DODD, 1984).
Injúrias nas extremidades dos quartos mamários e procedimentos inadequados de
ordenha promovem a disseminação da bactéria dentro do rebanho (CALVINHO et al,
1998). Entretanto, o S. dysgalactiae pode ser encontrado fora da glândula mamária como
no ambiente, tonsilas, boca e vagina das vacas e causa mastite aguda (BRAMLEY e
DODD, 1984).
Streptococcus. agalactiae (S. agalactiae) é patógeno contagioso, localiza-se somente na
glândula mamária, com sobrevivência restrita fora do úbere e, é altamente sensível à
penicilina. Devido a estas características S. agalactiae tem sido erradicado de rebanhos e
até mesmo de alguns países (KEEFE et al, 1997)
16
O curso da infecção do S. agalactiae é semelhante ao da infecção crônica subclínica
causada
por
Staphylococcus.
aureus,
com
ciclos
de
liberação
de
bactérias
acompanhados de altas CCS (KEEFE, 1997)
3 OBJETIVO
O objetivo do trabalho foi identificar os patógenos causadores de mastite subclínica no
rebanho da fazenda experimental PUC – Minas, analisar a dinâmica de infecção desses
patógenos, calcular a perda de produção de leite que cada patógeno ocasiona e analisar
a contagem de células somáticas.
Com a analise microbiológica junto com a contagem de células somáticas pode
determinar se tinha processo bactéria ou se a bactéria já tinha sido fagocitada e o que
prevalecia era o processo inflamatório.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Caracterização da fazenda
O experimento foi conduzido na Fazenda experimental da PUC Minas, que fica na zona
rural de Esmeraldas. O período experimental ocorreu nos meses de Dezembro de 2012 a
Fevereiro de 2013, estação de verão tipicamente brasileiro: época de elevada umidade e
temperatura.
A composição do rebanho era de gado leiteiro mestiço, com graus de sangue de 3/4
holandês-zebu, 7/8 holandês-zebu e holandês pura origem (PO). A média diária de
produção de leite durante o período experimental foi de 23kg/dia. A quantidade de vacas
em lactação no período foi em média 40 cabeças.
O sistema de criação dos animais é o Freestall onde os animais ficavam confinados
durante o ano inteiro e recebiam dieta balanceada de acordo com a produção de leite. Os
animais deitavam em camas de areia a qual era reposta três vezes na semana.
Eram realizadas duas ordenhas diárias, sendo a primeira às seis horas da manhã e a
segunda às três horas da tarde. O equipamento de ordenha era duplo-tres com extração
automática, da marca DeLaval®.
17
4.2 Coleta de amostras
No momento da coleta de amostras, os três primeiros jatos foram utilizados para
realização do teste da caneca de fundo escuro para visualização de grumos no leite que
ocorrem em casos de mastite clínica. Se o animal estivesse com muita matéria orgânica
acumulada na região do teto, era feita a lavagem dessa região.
Foi realizada a antissepsia dos tetos com solução pré–dipping com cloro a 2% e após
trinta segundos de ação dessa solução, os respectivos quartos mamários eram
enxugados com papel-toalha. No momento da coleta, foi realizada antissepsia do
esfíncter do teto, utilizando–se algodão umedecido com álcool a 70%. Esse procedimento
era realizado primeiramente nos tetos mais afastados do ordenhador, e em seguida nos
tetos mais próximos ao ordenhador.
Os jatos foram retirados de cada teto individualmente, seguindo a sequência de
primeiramente, tetos mais próximos do ordenhador, e em seguida, tetos mais afastados
ao ordenhador, formando uma amostra composta de aproximadamente 80 ml,
acondicionados em frascos estéreis e resfriados em caixas térmicas com gelo reciclável.
A temperatura média dentro da caixa térmica era de 5°C, não ultrapassando 7°C até as
amostras serem acondicionadas em freezer para o congelamento e depois serem
enviadas para o laboratório.
As amostras para CCS foram coletadas dos medidores de leite durante a ordenha,
acondicionadas em frasco estéril de 80ml, com conservante Bronopol, refrigeradas em
caixas térmicas com gelo reciclável. A temperatura média dentro da caixa térmica era de
5°C, não ultrapassando 7°C e posteriormente enviadas ao Laboratório de Análise da
Qualidade do Leite da UFMG, utilizando-se equipamento eletrônico BENTLEY® 2300.
Os cultivos foram realizados em 40 vacas em lactação. Para caracterizar melhor a
dinâmica de infecção dos patógenos envolvidos na contagem de células somáticas das
vacas em produção, foram feitos 12 cultivos de cada vaca, com intervalo de sete dias. O
total de amostras para cultura microbiológica foi de 480 amostras (40x 12).
18
Os cultivos foram feitos segundo o padrão proposto pelo Laboratory Handbook on Bovine
Mastitis pelo NMC – National Mastitis Council -, de 1999. As análises foram realizadas no
Laboratório de microbiologia da PUC Minas Betim, onde o leite foi descongelado à
temperatura ambiente e a semeadura foi realizada dentro Capela de Fluxo Laminar. Para
todos os cultivos, o meio de cultura utilizado foi o Ágar Sangue.
Após a semeadura, todas as placas devidamente identificadas eram levadas para estufa à
37°C durante 48 horas. Depois analisadas a olho nu para observação de crescimento
bacteriano e inicial identificação de bactérias através do aspecto da colônia.
Foi realizado o teste da Catalase, KOH e CAMP dentro da Capela de Fluxo Laminar. O
primeiro teste realizado foi o de Catalase para distinção de Staphylococcus spp de
Streptococcus. spp. Se a Catalase desse positiva, Staphylococcus spp identificado.
Catalase negativa, realizava-se o teste do KOH.
O teste do KOH serve para determinar se a bactéria é Gram-negativa ou Gram-positiva.
Este teste serviu para separarmos bactérias gram-negativas (coliformes) de grampositivas (estreptococos). Resultados positivos de KOH: bactérias gram-negativas
(coliformes). Diante desses resultados, determinamos os coliformes. Resultados
negativos de KOH: bactérias gram-positivas (estreptococos).
Com os resultados negativos de KOH, os estreptococos foram isolados para realização do
teste de CAMP, visto que os estafilococos já haviam sido identificados pelo teste da
Catalase. O teste CAMP resulta em positivo para o patógeno Streptococcus agalactiae,
em negativo para o Streptococcus dysgalactiae, e para o Streptococcus uberis, pode ser
tanto negativo quanto positivo. O teste que sanaria a dúvida para o Streptococcus uberis
seria o CAMP-Esculina. Infelizmente o teste CAMP-Esculina não pode ser executado
neste projeto de pesquisa.
4.3 Delineamento e análise estatística
Para CCS foi feito teste de Tukey para nível de significância de 5%. Coeficiente de
regressão para estimar a perda de produção de leite foram obtidas através de regressões,
utilizou o Excel para estas análises .
19
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As tabelas foram montadas para estabelecer parâmetros de freqüência de patógenos,
distinção de vacas saudáveis e vacas com infecção intramamária; coeficientes de
regressão da produção diária de leite, estimativa de perda de produção diária, baseados
nos dados de CCS e isolamento bacteriano.
Na tabela 2, estão apresentados os resultados do cultivo microbiológico do rebanho em
lactação. Pode-se observar que em 21,1% das amostras, não houve crescimento
bacteriano (NHC); 79,2% foram de amostras de leite que apresentaram crescimento
bacteriano, sendo isolados os seguintes patógenos: 4,6% para coliformes, 42% de
Staphylococcus spp., e 32,3 % de Streptococcus spp. Estudo feito em propriedades rurais
de Teresina, PI, em período de verão também observou maior prevalência para o gênero
Staphylococcus ssp, isolado em 74,60% das culturas e o gênero Streptococcus spp
apareceu na seqüência de ordem de importância.
Tabela 2: Frequência de microrganismos causadores
de mastite encontrados no cultivo do rebanho e média
da CCS e total de amostras analisadas, dentro de
cada grupo analisado no rebanho leiteiro da fazenda
PUC Minas em Esmeraldas-MG, durante os meses de
dezembro de 2012 a fevereiro de 2013.
%
CCS
Amostras Analisadas
NHC
21,1
659
83
Coliformes
4,6
1032
18
Staphylococcus
42
693
165
Streptococcus
32,3
863
127
Média
811,8
Total de Amostras
393
Total de Amostras
399
Na literatura está relatado que os principais patógenos da mastite são Staphylococcus
spp e Streptococcus spp (BARBALHO, et al, 2001). O mesmo foi encontrado neste
experimento, onde o Staphylococcus spp foi encontrado em primeiro lugar, Streptococcus
20
spp em segundo, NHC em terceiro e coliformes em quarto lugar; esse dado é semelhante
ao encontrado por LOPES, 2009.
Os Staphylococcus spp estão presente em maior número, 42%, mas a CCS é a menor
(693 x 10³) quando comparada ao Streptococcus spp e aos coliformes. Isso pode ter
ocorrido por alguns motivos, dos quais: a bactéria pode não ter chegado ainda nas
extremidades mais dorsais da glândula mamária, estando localizada na cisterna do teto
(RINALDI et al, 2010); a bactéria possui mecanismos de resistência que burla o Sistema
Imune (SI) do hospedeiro (MELO, 2008). Para tanto, os mecanismos de defesa da
glândula mamária não detectarão a bactéria, logo, não terá aumento da CCS. Já os
estreptococos possuem CCS de 863 x 10³, pois são identificados com facilidade pelo SI
da glândula.
Dentre a amostra de coliformes apresenta na tabela 2, consta que a prevalência é baixa
mas a CCS é alta (1032 x 10³). Como já foi citado por QUINN(et al 2005), esse fato se
justifica pois os coliformes são eliminados de forma rápida, mostrando que a infecção é de
curta duração, todavia não houve cura da glândula, existindo o processo inflamatório que
vai causar também o aumento das CCS (ALLUWAIMI, 2004).
Nas tabelas 2 e 3, ao analisar as amostras NHC, não há o crescimento bacteriológico,
mas o nível de CCS está elevando. Os resultados de CCS das amostras NHC estavam
elevados (659 x 10³), como mostra a tabela 2, por isso, na tabela 3 as amostras de NHC
foram divididas em dois grupos. As amostras NHC < 100 mil CCS são consideradas vacas
sadias e as amostras NHC ≥ 100 mil CCS são vacas doentes (BRITO et al, 2007). Essa
elevação da CCS, mesmo sem crescimento bacteriano é devido a resposta inflamatória
da glândula mamária (ALLUWAIMI, 2004; RIBEIRO et al, 2003). As bactérias também
podem estar fagocitadas nos leucócitos, não sendo detectadas na microbiologia
(ALLORE, 1998; SCHWARZ et al, 2011).
Tabela 3: Distinção de vacas saudáveis e não
saudáveis de acordo com o valor da CCS e cultura
negativa no rebanho leiteiro da fazenda PUC Minas em
Esmeraldas-MG, durante os meses de dezembro de
2012 a fevereiro de 2013.
%
CCS
Amostras Analisadas
21
NHC (< 100 MIL CCS)
5,3%
46 a
21
CCS)
15,5%
867 b
62
Positivas
79,2%
789 b
316
NHC
(>=
100
MIL
Média
811,8
Na tabela 4, temos que vacas positivas para o exame microbiológico e com elevada CCS
(média de 943 x 103), são as que mais obtiveram perda diária de leite (-5,7kg/dia) com
coeficiente de regressão de -4,35. Trata-se de vacas com infecção intra mamária, o que
justifica o aumento elevado de CCS e a elevada perda de produção (RENEAU, 1986). Em
HALASA et al (2009), as vacas do rebanho com CCS de 200 mil células por ml houve
perda de 0.31 e 0.58kg, valor mais elevado do que o encontrado no atual estudo.
Entretanto, na tabela 4, a perda de produção estimada para vacas com elevada CCS,
porém
negativas
na
microbiologia,
está
separada
das
positivas
para
exame
microbiológico, e estas amostras também mostraram significante perda de produção
diária, -2,1kg/dia, com coeficiente de regressão de -1,67. Esses animais negativos (sem
crescimento
microbiológico)
com
CCS≥100
mil
mostram
que
houve
infecção
anteriormente e ocorreu cura espontânea, visto que a CCS se encontra elevada
(RIBEIRO et al, 2003).
Pode-se estipular também que os possíveis patógenos que estavam presente nesta
glândula mamária seriam coliformes, pois estes geram infecção de curta duração
(HOGAN , 1989), e possuem muitos fatores de virulência, com resposta inflamatória mais
rápida (MEHRZAD, 2010). Outra questão é que no ato do exame microbiológico, as
bactérias podem estar fagocitadas ou sobrevivendo intracelularmente no ambiente do
hospedeiro
(ALLORE,
1998;
SCHWARZ
et
al,
2011),
resultando
em
cultura
microbiológica.
Já os animais com crescimento microbiano (positivas) e com CCS <100 mil, não
obtiveram diferença estatística entre os demais grupos. Processos inflamatórios podem
ocorrer em glândulas mamárias com valores de CCS de vacas saudáveis, sinalizando
mastite latente e presença de bactérias (SCHWARZ et al, 2011). Ainda que na atual
22
pesquisa não fossem feitos testes para diagnosicar Staphylococcus coagulase negativa,
sabemos da prevalência desse patógeno em rebanho leiteiros. O mesmo gera mastite
branda e menor perda de leite (DE VLIEGHER, 2004); informações que vão de encontro
ao resultado encontrado – vacas positivas e CCS <100 mil.
Tabela 4: Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e estimativa de perda
de produção diária (kg) sobre a CCS transformada (log10) baseados nos testes semanais
de pesagem de leite e CCS das vacas negativas na microbiologia (CCS>=100 mil), vacas
positivas (CCS <100 mil), vacas positivas (CCS >= 100 mil) em relação às vacas
negativas na microbiologia (CCS <100 mil; n=21), média e mediana da CCS (x 10 3), no
rebanho leiteiro da fazenda PUC Minas em Esmeraldas-MG, durante os meses de
dezembro de 2012 a fevereiro de 2013.
Negativas >= 100 mil CCS
Coeficiente de Regressão
-1,67 **
Positiva CCS < 100 mil
Positiva >=100 mil
1,98
-4,35 *
-5,7*
Estimativa de Perda de Produção (kg/dia)
-2,1**
0,8
N
83
35
Média
867
78
943
Mediana
508
81
646
CCS x 10
3
*p <0,001; **p <0,10
Na tabela 5, estão apresentadas as estimativas de perda de leite de acordo com cada tipo
de patógeno isolado nos cultivos microbiológicos. Os coliformes possuem a média de
CCS mais elevada (1092 x 103 por ml de leite), seguida de Streptococcus spp (867 x 103
por ml de leite) e por último, Staphylococcus spp (706 x 103 por ml de leite). Tal resultado
difere do encontrado por LOPES et al (2012), onde a média de CCS de Staphylococcus
spp foi mais elevada que a de Streptococcus spp. Para as culturas negativas foi
encontrado resultado considerável de CCS, o que pode ter acontecido processo de autocura na glândula mamária, entretanto ainda com processo inflamatório (RIBEIRO et al,
2003); ou a bactéria estava fagocitada por células de defesa, não sendo encontrada no
exame microbiológico (ALLORE, 1998; SCHWARZ et al, 2011).
23
A elevada CCS de coliformes se justifica pelos vários fatores de virulência que esses tipos
de bactérias possuem (SCHUKKEN, 2011). A resposta inflamatória produzida pelo
organismo da vaca é mais intensa, o que pode ser visualizado pela eleva contagem de
células somáticas (RINALDI et al, 2010), o que refletiu em perda de – 1,67 kg de leite.
A maior perda diária de leite observada foi por Streptococcus spp, de -4,4kg/dia de leite,
seguido de culturas negativas com elevada CCS (-2,1kg/dia), Staphylococcus spp (1,9kg/dia) e coliformes (-1,7kg/dia). Não foi detectado Streptococcus agalactiae no
rebanho estudado, portanto, houve infecção intramamária somente por estreptococos
ambientais.
Staphylococcus spp gerou perda menor em comparação ao Streptococcus spp. Isso se
justifica, pois infecções por S. aureus são persistentes e duradouras (SCHUKKEN, 2011);
e esta espécie bacteriana é capaz de burlar o sistema imune do hospedeiro, gerando
resposta moderada do hospedeiro (RINALDI et al, 2010). Ainda comparando essa duas
bactérias, os estreptococos geraram maior perda de leite no rebanho (-4,4kg dia de leite)
pois sua CCS foi mais elevada - 867 x 103 por ml de leite, pois quando mais elevada está
a CCS, maior será a perda de produção (HALASA et al, 2009).
Os animais podem ter se contaminado pelas bactérias de origem ambiental, visto que a
cama do freestall é de areia, sendo fonte de patógenos ambientais geradores de mastite;
por outro lado, patógenos contagiosos são transmitidos vaca-a-vaca através de
equipamentos de ordenha (MELO, 2008; HOGAN, 1989).
24
Tabela 5: Coeficientes de regressão da produção diária de leite (kg) e estimativa de perda
de produção diária (kg) sobre a CCS transformada (log10), baseados nos testes semanais
de pesagem de leite e CCS das vacas negativas (CCS>= 100 mil x 10 3), e de culturas
positivas para coliformes, Staphylococcus sp e Streptococcus ambientais versus vacas
negativas (CCS <100 mil; ; n=21), média e mediana da CCS (x 103 ), no rebanho leiteiro
da fazenda PUC Minas em Esmeraldas-MG, durante os meses de dezembro de 2012 a
fevereiro de 2013.
Negativas >= 100 mil CCS
Coliformes
Sthaphylococcus spp
Streptococcus spp
-1,67***
-1,3
-1,87**
-3,64*
-2,1***
-1,7
-1,9**
-4,4*
83
38
192
148
Média
867
1092
706
867
Mediana
508
564
417
589
Coeficiente de Regressão
Estimativa de Perda de Produção (kg/dia)
N
CCS x 10
3
*p <0,001; **p < 0,01;***p <0,10
5. CONCLUSÃO
Programas de prevenção e controle de mastite estão baseados na higiene dos
equipamentos de ordenha, limpeza do ambiente, antibioticoterapia dos animais doentes,
limpeza e antissepsia dos tetos. A contagem de células somáticas continua sendo a
metodologia padrão para estabelecer o status do rebanho e dos indivíduos. Entretanto,
análise microbiológica é indispensável em um programa de controle desta enfermidade,
porque possibilita o isolamento e a identificação do agente etiológico causador de doença
no rebanho.
Vacas com mastite subclínica possuem perdas, consideráveis, na produção de leite.
Mesmo que a cultura microbiológica não teve crescimento bacteriano, houve aumento da
CCS pelo processo infeccioso que ocorreu.
Ainda que com resultados de CCS seja possível calcular as perdas econômicas geradas
pela mastite, o ideal é acompanhar a saúde do rebanho pela CCS associada ao exame
25
bacteriológico. Assim, será conhecida a dinâmica de infecção e instalação da doença pela
bactéria nos animais, e, a partir deste ponto, saber-se-á de maneira mais apropriada
quais medidas tomar para manter a saúde do indivíduo e do rebanho.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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