1Depto de Bioquímica e Biologia molecular, Universidade

O EFEITO DE TRATAMENTOS
DESNATURANTES SOBRE A ATIVIDADE
ANALGÉSICA DE COMPLEXOS
GLICOPROTÉICOS DA ALGA MARINHA
VERMELHA BRYOTHAMNION
SEAFORTHII
Ana Lúcia P.Freitas1, Lídia A. Pinto1, Draulio C. Silva1, Fábia K. Andrade1, Samya A. Neves1,
Bartolomeu W. souza1 Maria V. Bastos2, Glauce S.B. Viana2.
1
Depto de Bioquímica e Biologia molecular, Universidade Federal do Ceará.
2
Depto de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará.
C.P: 6020 e-mail: [email protected]
The Effect of Denaturing Treatments on The Analgesic Activity of Carbohydrate-Protein Complex from The
Red Marine Alga Bryothamnion Seaforthii
A carbohydrate rich (40%) protein fraction F0/60 obtained by saline precipitation from the aqueous extracts
and the sulfated carbohydrates (CS) isolated from the marine red alga Bryothamnion seaforthii (Bs) were
effective to promote significant analgesic activity in vivo. In order to determine the real active component in
those samples they have been submitted to denaturing treatments. Another carbohydrate rich (26,8%) protein
fraction (PII-DEAE) of BS was heated at 120oC for 15 minutes while the fraction (CS) was desulfated by
treatment with NaOH 1M, 80ºC, and 60min. After treatments the hemagglutinating activity of all samples was
completely abolished, but the analgesic activity was not changed. Swiss mice (20g) were used for studying
antinociception with BS fractions. In the glacial acetic acid induced abdominal contractions 5 mg F (0/60)/kg
IP produced inhibition of writing incidence (89%), CS (20mg/ Kg IP) and PII-DEAE (2mg/Kg IP) produced
96,48 and 87,5 % inhibitions, respectively as compared with appropriate controls. The obtained results allow
us to suggest that a carbohydrate-protein complex of B. seaforthii would be responsible for the biological
effect studied here.
Introdução
O uso medicinal de compostos derivados do mar
data de um longo tempo. Os livros medicinais dos
chineses antigos relatam o uso de algas para o tratamento
de abscessos, desordens menstruais e câncer, já os
romanos usavam o extrato de um animal marinho para
tratar dor de dente. Nos dias de hoje os cientistas estão
novamente voltando ao mar à procura de medicamentos1.
Vários estudos têm sido feitos sobre as
propriedades farmacológicas de diferentes organismos
marinhos 2. O extrato de algumas microalgas apresenta
efeito significativo no sistema nervoso central (SNC) de
camundongos, revelando propriedades tanto
antidopaminérgica como anticolinérgica 3,4; contudo,
poucos estudos foram desenvolvidos com macroalgas 5.
Embora um progresso considerável tenha
ocorrido para o conhecimento da distribuição e
características bioquímicas de lectinas de algas marinhas,
tem-se pouca informação sobre essas proteínas em
relação a outras lectinas de plantas 6. Hoje, centenas de
lectinas são conhecidas e bem caracterizadas. O
conhecimento da diversidade destas proteínas, ligantes de
carboidrato com elevada especificidade, é a cada instante
ampliado, atraindo sempre mais a atenção de cientistas
no mundo inteiro. Muitas funções têm sido propostas
para as lectinas, tais como: mitogenicidade,
imunossupressão, toxicidade, efeito insulinomimético,
proteção contra patógenos e insetos, transporte e
armazenamento de carboidratos, reconhecimento celular
(dentro da célula, entre células ou entre organismos),
proteínas de reserva ou reguladores de crescimento, 7, 8.
Por outro lado, os polissacarídeos estão
presentes nas algas marinhas como fucoses sulfatadas e
como galactanas sulfatadas (agar e carragenanas). O
progresso no conhecimento das múltiplas atividades
biológicas dos polissacarídeos sulfatados atraiu a atenção
para esses compostos conforme demonstrado através dos
trabalhos que se seguem: atividade anticoagulante e
antitrombótica, atividade antiaterosclerótica, atividade
antiproliferativa, atividade antiadesiva, atividade
antiangiogenética, atividade antimetastática, atividade
antiinflamatória; , inibição do complemento e efeito
antiviral9.
Experimental
Algas
As algas marinhas Bryothamnion Kütz, 1843
seaforthii (Turner) KÜTZ; Bryothamnion KÜTZ, 1843
triquetrum (S.G. Gmel.) M. Howe foram coletadas
durante marés de sizígia, na praia de Flecheiras,
município de Trairí, litoral cearense. As amostras
coletadas foram transportadas ao laboratório, em
recipiente isotérmico, lavadas em água corrente, livres de
epífitas e estocadas a –20°C para posterior utilização. As
algas estão catalogadas no herbário Prisco Bezerra da
Universidade Federal do Ceará, com os seguintes
números de identificação: Bryothamnion seaforthii EAC:
30850; Bryothamnion triquetrum EAC: 31138
Extração de Proteína
A alga Bryothamnion seaforthii e foi pesada e
reduzida a pó na presença de nitrogênio líquido. Tampão
fosfato de sódio 0,02 M, pH 7,0 contendo NaCl 0,15 M
foi adicionado à farinha de alga, na proporção de 1:3 (p:
v) e a mistura foi deixada em contato por 4 horas a
temperatura ambiente, filtrada em tecido fino e
centrifugada a 10.000 x g 4 ºC por 30 minutos. O
sobrenadante obtido, denominado extrato total, foi então
acidificado a pH 1,0 com HCl concentrado, com o intuito
de precipitar a maior parte dos pigmentos presentes na
alga e, deixado em repouso a 10ºC por 12 horas. Após
esse período, o material foi centrifugado a 10.000 x g 4ºC
por 30 min, o precipitado (pigmentos) foi descartado e o
sobrenadante teve o seu pH ajustado a 7,0 com NaOH 2
N. Após a neutralização, o sobrenadante foi tratado com
sulfato de amônio a 60% de saturação, por um tempo de
contato de 12 horas. Em seguida, a suspensão foi
submetida a uma última centrifugação a 10.000 x g 4ºC
por 30 min e o precipitado obtido ressuspenso em água,
dialisado para retirada do sal. A fração obtida foi então
denominada fração F (0/60).
Extração de Carboidrato Sulfatado
A alga Bryothamnion seaforthii lavada e livre de
epífitas foi cortada em pequenos pedaços, imersa em
solução de hipoclorito de sódio a 10 % por 5 minutos, e
em seguida lavada exaustivamente com água destilada. O
material foi secado em estufa a 35 ºC e colocado em
contato com tampão acetato de sódio 100mM pH 6,0
com CYS 5mM, EDTA e papaína 0,4 %, por 24 horas a
60 ºC. O material digerido foi filtrado em tecido fino,
tendo sido adicionado, ao sobrenadante obtido, cloreto de
cetilpiridina a 10 % (CPC), para que ocorresse a
precipitação dos carboidratos sulfatados. Após 48 horas a
25 ºC o material foi centrifugado a 10.000 x g por 20
minutos a 4 ºC para a recuperação do precipitado (
polissacarídeo sulfatado) que foi em seguida, lavado com
uma solução de CPC a 0,05% e novamente centrifugado
10.000 x g por 20 minutos a 4 ºC. O precipitado obtido
foi dissolvido em 150 mL de uma solução de NaCl 2 M e
etanol absoluto (100:15 v/v) com aquecimento ocasional
a 60 ºC para facilitar a dissolução. Após esta etapa, um
tratamento com etanol absoluto (300 mL) foi realizado
para a precipitação dos carboidratos. Decorrido 24 horas
o material foi centrifugado (10.000 x g 20 min. 4 ºC) e o
precipitado obtido lavado com 600 mL de etanol 80% e
centrifugado (10.000 x g, 20 minutos a 4ºC). O novo
precipitado foi lavado com 600 mL de etanol absoluto e
centrifugado (10.000 x g, 20 minutos a 4 ºC). Em
seguida, o precipitado dessa última centrifugação foi
lavado com 600 mL de acetona, centrifugado (10.000 x
g, 20 minutos a 4 ºC) e o precipitado final foi posto para
secar em temperatura ambiente (25 ºC)
Espectroscopia de Absorção na Região do
Infravermelho.
Com as frações de carboidratos sulfatados
obtidas, foram realizados espectros na região do
infravermelho em Espectrômetro PERKIN ELMER
SPECTRUM 100, em pastilha de KBr, na região de 4000
a 400 cm-1.
Eletroforese
A avaliação do grau de desnaturação das
amostras tratadas foi avaliado por eletroforese em gel de
poliacrilamida na presença de SDS e β-mercaptoetanol,
segundo o método de LAEMMLI (1970)10.
Tratamentos realizados com a Fração Protéica F(0/60)
Tratamento Térmico
Consistiu no aquecimento da fração F( 0/60) a
120 ºC por 15 min em autoclave. Em seguida, foi
realizada a determinação da atividade hemaglutinante e
testes de atividade antinociceptiva antes e após esse
tratamento da amostra.
Tratamento Enzimático
Digestibilidade in vitro: A fração F (0/60) foi
colocada em contato com uma solução de tripsina em
HCl 50 mM e papaína em tampão fosfato 10mM, cisteína
1 mM, EDTA 3 mM, pH 6,0 e, incubados por 12 horas a
60 ºC. Após esse período, a amostra foi submetida a um
aquecimento em banho-maria a 100 ºC por 2 min,
finalizando a reação. Em seguida foram feitos os testes
de determinação da atividade hemaglutinante e de
atividade antinociceptiva. Ensaios controles foram
realizados com a fração (0/60) antes do tratamento.
Tratamento Químico
A fração F (0/60) foi tratada com uma solução contendo
dodecil-sulfato de sódio (SDS) 0,1 % e βmercaptoetanol (β) 0,1 % e aquecida a 100 ºC, por
2 minutos. Em seguida foram feitos os testes de
determinação da atividade hemaglutinante e de
atividade antinociceptiva. Ensaios controles foram
realizados com a fração (0/60) antes do
tratamento.
Tratamento do Carboidrato Sulfatado de Bryothamnion
seaforthii.
Uma solução de carboidrato sulfatado 1 % em
NaOH 1 M foi aquecida a 80 ºC por 60 minutos em
autoclave. Em seguida, o material foi exaustivamente
dialisado contra água, filtrado a vácuo e liofilizado.
Teste das Contorções Abdominais Induzidas por Ácido
Acético (“Writhing Test”)
O modelo das contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético 0,6 %, foi desenvolvido segundo o
método originalmente descrito para ratos por VANDER
& MARGOLIN (1956)11 e posteriormente, modificado
para camundongos por KOSTER et al. (1959) 12. Nos
experimentos foram utilizados camundongos Swiss,
fêmeas, pesando entre 20 e 30 g. Os animais foram prétratados com as seguintes amostras de B. seaforthii (BS):
carboidrato sulfatado (BS) 20 mg/kg via intraperitoneal;
carboidrato sulfatado (BS) tratado com NaOH 1 M
aquecido a 80 ºC por 1hora, ( 20 mg/kg via
intraperitoneal); F0/60 (BS) tratada com SDS (0,1 %) +
β-mercaptoetanol (0,1 %) (5 mg/kg i.p.); F0/60 (BS)
aquecida a 120 ºC por 15 minutos (10 mg. kg-1 i.p.); F
(0/60) de B. seaforthii tratada com uma solução de
tripsina e papaína (5 mg/kg i.p); F0/60 (BS) aquecida a
120º C por 15 min (10 mg/kg i.p.); o grupo controle
recebeu água destilada 10 mL/kg i.p (veículo de
dissolução de todas as amostras). Decorridos 60 minutos
após o tratamento por via oral e 30 minutos após o
tratamento por via intraperitoneal, os animais receberam
a injeção de ácido acético (10 mL/kg i.p.). A resposta dos
animais foi registrada 10 minutos após a administração
do ácido acético, quando foi quantificado o número de
“Writhings” (contração da musculatura abdominal
juntamente com a extensão das patas posteriores) durante
20 minutos.
O ácido acético induz dor indiretamente, pois
não estimula os receptores nociceptivos peritoneais de
forma direta, age liberando substâncias endógenas que
excitam as terminações nervosas, ou seja, produz
inflamação aguda na área peritoneal 13,14 .
Número de contorções (20 min)
35
30
25
20
15
10
*
5
*
0
Controle
F 0/60 10 mg/Kg
i.p.
F 0/60 10 mg/Kg
i.p.+ 120ºC
Figura 1- Efeito da fração F0/60 de B.seaforthii antes e
apos aquecimento a 120º C por 15 min, no teste das
contorções abdominais induzidas por ácido acético.
* P < 0,05 Student-Newman-Keuls Method
Resultados e Discussão
Observamos que Fração protéica e o carboidrato
sulfatado de Bryothamnion seaforthii apresentavam
atividade analgésica, sendo capazes de inibir o número
de contorções abdominais induzidas por ácido acético a
0,6 %. Constatamos ainda que a fração protéica (F 0/60)
mostrou uma proporção de 40,83% de carboidrato pelo
método do fenol-ácido sulfúrico de DUBOIS et al. (1956)
15
tendo glucose como referência. Devido a essa alta
quantidade de açúcares na fração, fez-se necessária a
desnaturação das proteínas por diversos métodos
(térmico, químico e enzimático) no intuito de esclarecer
se o componente ativo presente nestas amostras era de
natureza unicamente protéica, glicoprotéica ou se seria
um carboidrato. Podemos constatar que a fração
F(0/60), após tratamento térmico, perdeu toda a
atividade hemaglutinante (99,8 %) com relação à fração
F(0/60) não aquecida, revelarando que o tratamento sob
elevada temperatura, ao qual foi submetida a amostra
testada, provocou a desnaturação das proteínas (
lectinas), o que levou à perda da capacidade de ligação
destas às células sanguíneas. Nossos resultados mostram
que a fração F (0/60) na dose de 10 mg/kg i.p., aquecida
e não aquecida (n.o de contorções igual 1,33 ± 0,65 e
0,17 ± 0,15, respectivamente), apresentou uma inibição
das contorções de 95,52% e 99,43%, respectivamente em
relação ao grupo controle (29,7 ± 2,93), onde se usou
água destilada (Figura 1).
Observamos ainda que a fração F (0/60)
perdeu sua capacidade hemaglutinante após tratamento
enzimático (96,87 %), em relação à fração F(0/60) que
apenas foi aquecida por 2 minutos a 100 ºC, mas não
recebeu esse tratamento. No que diz respeito à atividade
analgésica, o teste das contorções abdominais foi
seguido empregando-se quatro grupos distintos de
animais que foram tratados como segue: com a fração
F(0/60) tratada com tripsina e papaína, como descrito
Figura 2- Efeito da fração F0/60 de B.seaforthii antes e
após o tratamento com tripsina e papaína, no teste das
contorções abdominais induzidas por ácido acético.
* P < 0,05 Student-Newman-Keuls Method
1234567
Figura 3- Eletroforese em gel de poliacrilamida na
presença de SDS e β-mercaptoetanol da Fração 0/60 de
BS antes e apos tratamento enzimático e térmico. 1 e 7marcadores; 2 e 3 fração F0/60 de BS; 4- fração F0/60
após tratamento enzimático (tripsina e papaína);525
Número de contorções (20 min)
acima, com a fração F (0/60) que apenas sofreu
aquecimento a 100 ºC por 2 minutos, o controle com
água destilada e, um grupo que recebeu apenas uma
solução de tripsina e papaína. Apesar da grande perda
da atividade hemaglutinante da fração F (0/60) tratada,
esta amostra e a F (0/60) nativa, que apenas sofreu
aquecimento a 100ºC por 2 minutos (ambas na dose de 5
mg/kg i.p.), apresentaram atividade analgésica
semelhantes nos testes das contorções abdominais (4,61
± 2,04 e 2,44 ± 0,66), respectivamente, com uma
porcentagem de inibição das contorções de 90,37 % e
81,81 % respectivamente, em relação ao grupo controle
(25,35 ± 3,08). O grupo que recebeu apenas a solução de
tripsina e papaína, na dose de 10 mL/kg i.p.(18,57 ±
2,39), mostrou uma porcentagem de inibição das
contorções de 26,74 % em relação ao grupo controle,
porém este valor não foi estatisticamente significativo
(Figura 2).
Para evidenciar a desnaturação provocada por
eses dois tratamento, um novo experimento consistiu em
uma eletroforese em SDS-PAGE c/ β-mercaptoetanol das
amostras: fração F (0/60), fração F (0/60) tratada com
tripsina e papaína, um controle correspondendo a uma
solução contendo apenas tripsina e papaína e, por
último, a fração F (0/60) aquecida a 120º C por 15 min.
Os resultados obtidos após a revelação com prata,
mostra um padrão eletroforético de duas bandas
protéicas para a fração F (0/60) não tratada, enquanto a
fração F (0/60) tratada com tripsina e papaína,
apresentou apenas uma discreta banda (4), que
estacionou em posição intermediária, com relação às
bandas correspondentes ao fracionamento da fração não
tratada (2). Este resultado confirma a hidrólise
enzimática das proteínas contidas na
fração F(0/60). Quanto ao controle (tripsina + papaína),
este não revelou a presença de bandas protéicas (5). A
fração F(0/60) aquecida a 120ºC apresentou uma banda
única correspondendo à banda de menor massa
molecular visualizada para a fração F (0/60) não
tratada. Ao que parece a banda protéica de maior
massa, mostrou-se mais
20
15
10
*
5
*
0
Controle
Número de contorções (20 min)
30
F 0/60
5mg/Kg i.p.
F 0/60
5mg/Kg i.p.
+SDS+B (0,1%)
Solução de tripsina e papaina; 6- Fração 0/60 após
tratamento térmico.
25
20
sensível ao calor. Diante destes resultados podemos
concluir que ambos tratamentos causaram a
desnaturação da fração F (0/60) (Figura 3).
Com relação ao tratamento químico, houve
perda de 87,5 % da sua atividade hemaglutinante,
quando comparada à fração F (0/60) não tratada. A
15
*
10
*
5
0
Controle
F 0/60 5mg/Kg i.p.
F 0/60 5mg/Kg
i.p.+ papaína+
tripsina
Papaína + tripsina
10ml/Kg i.p.
SDS+B
(0,1%)
atividade analgésica, no teste das contorções
abdominais, foi testada utilizando-se quatro grupos de
animais tratados: com a fração F (0/60); sem tratamento
químico; com a fração F (0/60) tratada; o controle com
água destilada e, um grupo tratado apenas com a
solução de dodecilsulfato de sódio (SDS) 0,1 % e βmercaptoetanol (0,1 %). Os resultados demonstraram
que as frações F(0/60) tratada e a não tratada de B.
seaforthii (na dose de 5 mg/kg i.p.) apresentaram
resultados semelhantes quanto à atividade analgésica
(2,4 ± 0,67 e 3,44 ± 0, 87) respectivamente, com inibição
das contorções abdominais na ordem de 88,99 % e 84,22
% respectivamente, com relação ao grupo controle. O
controle com água destilada e o grupo que foi submetido
apenas ao tratamento com a solução de SDS e βmercaptoetanol (na dose de 10 mL/kg i.p.), mostrou um
número de contorções de 21,8 ± 2,25 e 22,1 ± 3,08
respectivamente, mostrando que somente a solução SDS
e β-mercaptoetanol não é capaz de alterar o número de
contorções (Figura 4).
Quanto ao carboidrato sulfatado de BS, o teor
de nitrogênio total, obtido pelo método de MicroKjeldahl foi determinado antes e após tratamento com
NaOH 1 M seguido de aquecimento a 80 oC, por 60 min.
Verificamos que o carboidrato sulfatado de B. seaforthii
apresentou valores de nitrogênio total (Nt)
correspondentes a 1,351 % sem tratamento, e 0,49 %
após tratamento, mostrando que esse tratamento leva a
uma diminuição de 64,03 % no teor de nitrogênio total.
O espectro na região do infravermelho do
carboidrato sulfatado de B. seaforthii mostra o conteúdo
de sulfato, expresso como um grau de substituição (DS),
de 0,071 para o carboidrato sulfatado, 0,018 para o
carboidrato sulfatado tratado com NaOH 1M e aquecido
a 100 ºC por 60 minutos. De acordo com estes
resultados, houve uma significativa diminuição do DS do
carboidrato sulfatado total após o tratamento com
NaOH (73,13 %), com relação à amostra não tratada.
Apesar dessa diminuição significativa, a atividade
analgésica das amostras ( carboidrato sulfatado nativo e
tratado), permaneceu praticamente a mesma. No teste
das contorções abdominais, o carboidrato sulfatado
tratado e a amostra nativa, nas doses de 20 mg/kg i.p.,
apresentou uma diminuição das contorções de 96,48 % e
82,58 %, respectivamente, em relação ao grupo controle.
Estes resultados demonstraram que um alto grau de
sulfatação não parece ser importante para a atividade
analgésica, visto que, no teste das contorções
abdominais, o grupo tratado não mostrou diferença
estatisticamente significativa com o grupo sem
tratamento (Tabela 1).
Figura 4- Efeito da fração F0/60 de B.seaforthii antes e
após tratamento com SDS e β- mercaptoetanol (0,1 %)
no teste das contorções abdominais induzidas por ácido
acético.
* P < 0,05 Student-Newman-Keuls Method
Conclusão
Os resultados obtidos permitem concluir que o
componente responsável pelo efeito analgésico
observado, não é de natureza puramente protéica, e sim,
um conjugado glico-protéico, que ao sofrer os
tratamentos térmico, enzimático e químico conservou sua
aplicabilidade biológica.
Agradecimentos
FUNCAP, CNPq, Capes, Departamento de Bioquímica
da UFC
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Tabela 1: Efeito do carboidrato sulfatado de BS antes e após tratamento com NaOH 1M e aquecimento a 80º
C por 1 hora no teste das contorções abdominais.
Carboidrato Sulfatado
Atividade Analgésica
Grupo
Controle
Carboidrato BS
Carboidrato BS
tratado
com
NaOH
1M+
aquecimento
a
80°C por 1 hora
Grau de
Sulfatação (DS)
Antes do
tratamento
-
Grau de Sulfatação
(DS)
Após tratamento
Diminuição de
DS após
tratamento (%)
Dose/via de
administ.
Número de
contorções
(20 min)
% de
inibição das
contorções
-
-
10mL.kg-1 i.p.
(11)
25,6 ± 3,04
-
0,071
-
-
20 mg.kg-1 i.p.
(24)
4,46 ± 1,19
82,58 *
20 mg.kg-1 i.p.
(08)
1,0 ± 0,33
96,09 *
0,018
-
74,65