Universidade Federal do ABC

Transcrição

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Síntese e Caracterização de Nanoestruturas
Peptídicas: Estudos Espectroscópicos e Aplicações
Michelle da Silva Liberato
DISSERTAÇÃO
APRESENTADA COMO PARTE DOS
REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE
EM
NANOCIÊNCIAS
E
MATERIAIS
AVANÇADOS.
ORIENTADOR:
PROF. DR. WENDEL ANDRADE ALVES
SANTO ANDRÉ
2012
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Síntese e Caracterização de Nanoestruturas
Peptídicas: Estudos Espectroscópicos e Aplicações
ORIENTADOR: PROF. DR. WENDEL ANDRADE ALVES
SANTO ANDRÉ
2012
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iv
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu filho muito
amado que sempre será inesquecível:
"Você foi um anjo que passou e
transformou a minha vida"
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida, caminhos traçados e família maravilhosa;
Aos meus avós, Pedro e Eliza (in memorian), pelos sábios conselhos que guardo comigo até
os momentos de hoje;
Aos meus pais, Vera e Armando, pela oportunidade da vida! Pelo esforço, sacrifício,
paciência, dedicação, carinho e atenção. Por acreditarem em mim mesmo quando a esperança
não estava muito presente. Mas o principal e incontestável: por me amarem!
À minha irmã, cunhado e sobrinhos pelos momentos de alegria;
Ao meu querido esposo Cristiano, que de forma especial e carinhosa me deu força e coragem,
me apoiando nos momentos de dificuldades... ―Só sou tudo o que sou porque você me amou‖
Ao meu orientador, Dr. Wendel Andrade Alves, pela oportunidade concedida, apoio,
dedicação e todo conhecimento transmitido. Obrigada por ter participado efetivamente de
minha formação acadêmica;
Aos professores, Dr. Vani Xavier de Oliveira Junior e Dra. Mariselma Ferreira (ambos
UFABC) pela colaboração e discussões dos resultados;
Aos grandes amigos do grupo (em ordem alfabética): Camila, Clóvis, Emerson, Iorque,
Juliana, Márcia, Roberta, Rondes, Sérgio, Thiago e Wellington. Nunca vou esquecer nossos
momentos no café e risadas! Em especial ao Sérgio, pela grande ajuda nos experimentos de
FTIR, Raman e voltametria cíclica.
A todos os amigos do LEMN;
Ao LNLS pela excelente infra-estrutura;
A FAPESP pela bolsa concedida;
A UFABC pela grande oportunidade de realizar um sonho.
vii
“A fé em Deus nos faz crer no incrível, ver o invisível e realizar o impossível”
Autor desconhecido
viii
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOESTRUTURAS
PEPTÍDICAS: ESTUDOS ESPECTROSCÓPICOS E APLICAÇÕES
Resumo
O trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de materiais nanoestruturados baseados em
processos de automontagem molecular de compostos peptídicos, de modo a obter sistemas de
grande versatilidade estrutural visando possíveis aplicações relacionadas à bionanotecnologia.
Neste sentido, sequências peptídicas baseadas em precursores lineares e cíclicos foram
sintetizadas pelo método em fase sólida na estratégia t-Boc e F-moc, respectivamente. Assim,
as nanoestruturas foram preparadas por processos de automontagem mediante a técnica em
fase sólida-vapor, por meio da variação de solvente (anilina, diclorometano e água),
concentração (50, 100 e 150 mg mL-1) e tempo de exposição ao vapor (12 e 18 horas). Os
materiais nanoestruturados foram caracterizados por MEV, FTIR e TGA, de modo a
investigar suas propriedades morfológicas, estruturais e térmicas. Os resultados experimentais
apresentaram a obtenção de nanofitas para uma concentração de 150 mg mL-1 e tempo de
exposição ao vapor de 18 horas, que revelaram estruturas semelhantes para os três sistemas
estudados, evidenciadas por FTIR e dinâmica molecular. Além disso, foi possível realizar a
eletropolimerização da anilina residual, sendo observados os processos redox característicos
da polianilina (PANI). Para finalizar, preparamos matrizes poliméricas de poli(ɛcaprolactona) com nanotubos de L-difenilalanina (NT-FF) por eletrofiação, de modo a estudar
as variações nas propriedades térmicas e mecânicas dos nanocompósitos obtidos, que
revelaram variações quanto à cristalinidade e deformação elástica e plástica.
Palavras-
Chaves:
nanoestruturas
peptídicas,
supramoleculares, automontagem, eletrofiação.
materiais
biológicos,
sistemas
ix
SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF PEPTIDE
NANOSTRUCTURES: SPECTROSCOPIC STUDIES AND APPLICATIONS
Abstract
The study had as aimed the development of nanostructured materials based on processes of
molecular self-assembly of peptide compounds in order to obtain systems of great structural
versatility seeking possible applications related to bionanotechnology. In this regard, peptide
sequences based on linear and cyclic precursors were synthesized by solid-phase method in
strategy t-Boc and F-moc, respectively. Thus, the nanostructures were prepared by selfassembly process via solid-vapor phase, through variation of solvent (aniline, water and
dichloromethane), concentration (50, 100 and 150 mg mL-1) and exposure time vapor (12 and
18 hours). The nanostructured materials were characterized by SEM, FTIR and TGA in order
to investigate their morphological, structural and thermal. The experimental results presented
nanoribbons to obtain a concentration of 150 mg mL-1 and time of exposure to vapor of 18
hours, showed that similar structures for all systems studied, as evidenced by infrared
spectroscopy and molecular dynamics. Furthermore, it was possible to perform the
electropolymerization of residual aniline, observed redox processes characteristic of
polyaniline (PANI). Finally, we have prepared arrays poly(ɛ-caprolactone) with Ldiphenylalanine nanotubes (NT-FF) by electrospinning, in order to study the changes in the
thermal and mechanical properties of the nanocomposites which showed variation in the
crystallinity and elastic-plastic deformation.
Key Words: peptide nanostructures, biological materials, supramolecular systems, selfassembly, electrospinning.
x
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. xiii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ xix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS .............................................................................. xx
Capítulo 1- Revisão bibliográfica e aspectos teóricos ....................................................... 21
1.1.
Introdução à química supramolecular ........................................................................ 21
1.2.
Estrutura dos peptídeos .............................................................................................. 22
1.2.1.
Síntese química dos peptídeos ............................................................................ 23
1.3.
Nanoestruturas de peptídeos ...................................................................................... 24
1.4.
Mecanismos de automontagem .................................................................................. 25
1.5.
Estudo das propriedades morfológicas e estruturais .................................................. 29
1.6.
Métodos usuais para preparação de nanoestruturas peptídicas .................................. 34
1.6.1.
Fase líquida ......................................................................................................... 34
1.6.2.
Nanoimpressão ................................................................................................... 36
1.6.3.
Deposição física a vapor ..................................................................................... 36
1.6.4.
Fase sólida-vapor ................................................................................................ 37
1.6.5.
Eletrofiação ......................................................................................................... 39
1.6.6.
Dieletroforese ..................................................................................................... 40
1.7.
Aplicações .................................................................................................................. 41
1.7.1.
Biossensores ....................................................................................................... 41
1.7.2.
Biomateriais ........................................................................................................ 42
Capítulo 2- Objetivo .......................................................................................................... 44
2.1.
Objetivos gerais ............................................................................................................. 44
2.2.
Objetivos específicos ..................................................................................................... 44
xi
Capítulo 3- Materiais e Métodos ....................................................................................... 45
3.1.
Técnicas de caracterização empregadas..................................................................... 45
3.1.1.
Cromatografia líquida de alta eficiência- CLAE ................................................ 45
3.1.2.
Espectroscopia de Massa .................................................................................... 46
3.1.3.
Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV .................................................... 47
3.1.4.
Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier ..... 49
3.1.5.
Espectroscopia Raman ........................................................................................ 50
3.1.6.
Voltametria Cíclica ............................................................................................. 51
3.1.7.
Análise Térmica .................................................................................................. 51
3.1.8.
Análise Dinâmica-Mecânica - DMA .................................................................. 52
3.2.
Parte 1 – Síntese dos peptídeos .................................................................................. 54
3.2.1.
Purificação dos Peptídeos ................................................................................... 58
3.3. Parte 2 - Metodologia para obtenção de nanoestruturas peptídicas via fase sólidavapor 59
3.3.1.
Obtenção das nanoestruturas para estudo morfológico e estrutural ................... 59
3.3.2.
Metodologia de preparação dos eletrodos para estudos eletroquímicos............. 61
3.4.
Parte 3 – Metodologia para obtenção de nanoestruturas peptídicas via eletrofiação 64
3.4.1.
Preparo das soluções ........................................................................................... 64
3.4.2.
Montagem do ensaio ........................................................................................... 64
Capítulo 4- Resultados e Discussão .................................................................................. 66
4.1.
Parte 1- Síntese dos peptídeos ................................................................................... 66
4.2. Parte 2- Preparação das nanoestruturas via fase sólida-vapor referente aos peptídeos
linear e cíclico ....................................................................................................................... 74
4.2.1. Estudo morfológico do processo de crescimento das nanoestruturas peptídicas ...
...........................................................................................................................................74
4.2.2. Estudo espectroscópico das nanoestruturas do peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4]
...........................................................................................................................................90
4.2.3.
Estudo eletroquímico: eletropolimerização da anilina residual .......................... 95
xii
4.3.
Parte 3 - Estudo da obtenção de nanoestruturas via eletrofiação ............................. 104
4.3.1.
Estudo da matriz ............................................................................................... 104
Capítulo 5 – Considerações finais ................................................................................... 121
Capítulo 6 - Referências Bibliográficas .......................................................................... 122
SUMULA CURRICULAR .................................................................................................... 134
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação da estrutura de nanotubos de carbono (a) parede simples e (b)
parede múltipla.[6] ..................................................................................................................... 21
Figura 2: Representação da ligação peptídica entre resíduos de aminoácidos ........................ 23
Figura 3: Esquema representativo das morfologias para a molécula de L-difenilalanina e
possíveis aplicações.[35] ............................................................................................................ 24
Figura 4: Ilustração esquemática de nanoestruturas tubulares, esféricas e fibras formadas por
peptídeos [21] ............................................................................................................................. 25
Figura 5: Ilustração esquemática para automontagem molecular ........................................... 26
Figura 6: Esquema de formação de estruturas tubulares e esféricas.[40].................................. 26
Figura 7: Modelo para a construção de NT-FF (a) Estrutura tubular e indicativo de agregados
(b) Interface relativa aos canais (c) Representação dos átomos que constituem a estrutura. [61]
.................................................................................................................................................. 27
Figura 8: Representação esquemática da formação de nanotubos a partir de peptídeos
cíclicos. [68] ............................................................................................................................... 28
Figura 9: Conformação de uma sequência de peptídeo linear (D L).[25] ................................. 29
Figura 10: Molécula de L-difenilalanina (a) Fórmula estrutural. (b) Estrutura tridimensional
[61]
.............................................................................................................................................. 29
Figura 11: Imagens de microscopia (MEV) referente à estabilidade de NT-FF em diferentes
solventes.[75] .............................................................................................................................. 30
Figura 12: Análise das esferas de Boc-Phe-Phe-OH (a) AFM das nanoesferas depositada
sobre mica clivada (b) micrografia das exposições das nanoesferas. [76] .................................. 31
Figura 13: Imagens das variações morfológicas do dipeptídeo de L-difenilalanina em relação
às condições de pH. (a - b) pH= 4 formação de nanotubos, (c - d) pH= 10 formação de
fibrilas [77] ................................................................................................................................. 31
Figura 14: Preparação de nanotubos e nanofios de L-difenilalanina preparados em meio à
titulação. (a) estrutura molecular da L-difenilalanina; (b) precipitado branco formado próximo
ao ponto isoelétrico; (c) nanotubos de peptídeo preparados em baixas concentrações (d)
nanofios de peptídeo preparados em altas concentrações.[78] ................................................... 32
Figura 15: Imagens de microscopia óptica das estruturas nos diferentes solventes.[79] .......... 33
Figura 16: Esquema de preparação de nanoestruturas em fase líquida ................................... 35
xiv
Figura 17: Representação esquemática do crescimento vertical dos NT-FF.[84] ..................... 35
Figura 18: Esquema da Representação de nanotubos de peptídeo via impressão jato de tinta
(a) impressão única (b) imagem de microscopia da área impressa (c) múltiplas impressões (10
vezes) [86]................................................................................................................................... 36
Figura 19: Mecanismo de nanoestruturação vertical utilizando a técnica de deposição física a
vapor. [87]................................................................................................................................... 37
Figura 20: Esquema experimental de obtenção de nanoestruturas utilizando o método de
síntese em fase sólida-vapor. [92] ............................................................................................... 38
Figura 21: Imagens obtidas por microscopia (MEV) de tubos e vesículas de L-difenilalanina
na concentração de 2 mg mL-1: (a) em etanol vaporizado a 25°C; (b) em acetona vaporizada a
25°C, (c) em etanol vaporizado a 80°C e (d) em acetona vaporizada a 80°C.[94] .................... 39
Figura 22: Esquema de eletrofiação para formação de nanofibras. ........................................ 40
Figura 23: Imagens de AFM dos eletrodos de ouro via manipulação dos NT-FF com
aplicação do campo elétrico.[97] ................................................................................................ 41
Figura 24: Microscópio eletrônico de Varredura- FEG do Laboratório Nacional de Luz
Síncrotron. ................................................................................................................................ 49
Figura 25: Representação Esquemática da Síntese de Peptídeos ........................................... 58
Figura 26: Ilustração esquemática do processo de obtenção das nanoestruturas utilizando a
metodologia em fase sólida-vapor ............................................................................................ 61
Figura 27: Processo de obtenção das nanoestruturas utilizando a metodologia de eletrofiação
.................................................................................................................................................. 65
Figura 28: (a) espectro de massa e (b) cromatograma do análogo [(L-ArgL-Phe)4] bruto.
Os perfis em LC/ESI-MS foram obtidos nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak
C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 μm; Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA
em 60% ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30 minutos; Fluxo: 0,4 mL/min; λ = 190-300
nm; Volume de injeção: 30 μL; Concentração da amostra: 1,0 mg/mL e Intervalo de massas:
500-3930 Daltons. .................................................................................................................... 67
Figura 29: Espectro de massas dos materiais obtidos durante a síntese do análogo
[(L-ArgL-Phe)4] referentes aos tempos de retenção apresentados na Figura 36(a). .............. 68
Figura 30: Espectro de massa do análogo linear [(L-ArgL-Phe)4] obtido após purificação.
O perfil em LC/ESI-MS foi obtido nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak C18
(2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 μm; Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA em
60%ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30 minutos; Fluxo: 0,4 mL/min; λ = 190-300 nm;
Volume de injeção: 30 μL; Concentração da amostra: 1,0 mg/mL e Intervalo de massas: 5003930 Daltons. ............................................................................................................................ 69
xv
Figura 31: (a) Espectro de massa e (b) cromatograma do análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4]
bruto. Os perfis em LC/ESI-MS foram obtidos nas seguintes condições: Coluna: Waters
Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 μm; Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B:
0,1% TFA em 60% ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30 minutos; Fluxo: 0,4 mL/min; λ
= 190-300 nm; Volume de injeção: 30 μL; Concentração da amostra: 1,0 mg/mL e Intervalo
de massas: 500-3930 Daltons. .................................................................................................. 70
Figura 32: Espectro de massas dos materiais obtidos durante a síntese do análogo cíclico
[(L-ArgD-Phe)4] dos tempos de retenção apresentados na Figura 39(a). ............................. 71
Figura 33: Cromatograma do Análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] purificado. As condições
cromatográficas foram: Coluna: Supelcosil C18 (4,6 x 150 mm), 60 Å, 5 μm; Sistema de
solventes: A: 0,1%TFA/H2O e B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em
20 minutos. Fluxo: 1,0 mL/min. λ = 220 nm. Volume de injeção: 50 μL e concentração da
amostra 1,0 mg/mL................................................................................................................. 72
Figura 34: Espectro de massa obtido do análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] após purificação.
O perfil em LC/ESI-MS foi obtido nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak C18
(2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 μm; Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA em
60%ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30 minutos; Fluxo: 0,4 mL/min; λ = 190-300 nm;
Volume de injeção: 30 μL; Concentração da amostra: 1,0 mg/mL e Intervalo de massas: 5003930 Daltons. ............................................................................................................................ 73
Figura 35: Geometria otimizada por dinâmica molecular da molécula do peptídeo .............. 75
Figura 36: Imagens de microscopia (MEV) mostrando a morfologia do filme amorfo sobre o
substrato de ITO em Pet. (a) 50 mg mL-1 (b) 100 mg mL-1 e (c) 150 mg mL-1 ....................... 76
Figura 37: Imagens de microscopia (MEV) de nanoestruturas preparadas em fase-sólida
vapor à concentração de 100 mg mL-1 por 12 horas (a) vapor de anilina, (b) vapor de
diclorometano e (c) vapor de água. .......................................................................................... 77
Figura 38: Imagens microscopia (MEV) de nanoestruturas preparadas em fase-sólida vapor à
concentração de 100 mg mL-1 com 18 horas (a) vapor de anilina, (b) vapor de diclorometano e
(c) vapor de água. ..................................................................................................................... 78
Figura 39: Imagens de microscopia (MEV) de nanoestruturas preparadas em fase-sólida
vapor à concentração de 150 mg mL-1 com 18 horas (a) vapor de anilina e (b) vapor de
diclorometano ........................................................................................................................... 80
Figura 40: Imagens de microscopia (MEV) de nanoestruturas por síntese em fase-sólida
vapor à concentração de 150 mg mL-1 com 18 horas para vapor de água. ............................... 82
Figura 41: Estrutura química da nanoestrutura peptídica de [(L-Arg…L-Phe)4] .por dinâmica
molecular .................................................................................................................................. 83
xvi
Figura 42: Gráfico indicativo da quantidade de ligações de hidrogênio em relação ao tempo
de automontagem. ..................................................................................................................... 83
Figura 43: Histogramas relativos às nanoestruturas em vapor de (a) anilina, (b)
diclorometano e (c) água .......................................................................................................... 85
Figura 44: Imagens microscopia relativas a fissura do filme .................................................. 86
Figura 45: Curvas TG/DTG em ar atmosférico, rampa de aquecimento de 5 °C/min, e
temperatura inicial de 25°C a 600 ° .......................................................................................... 87
Figura 46: Estudo da degradação térmica por dinâmica molecular para nanoestrutura em
vapor de anilina ........................................................................................................................ 88
Figura 47: Relação m/z para os fragmentos em vapor de (a) anilina, (b) diclorometano e (c)
água........................................................................................................................................... 90
Figura 48: Espectro de infravermelho do filme amorfo, ou seja, do material sem ser
nanoestruturado. ....................................................................................................................... 91
Figura 49: Espectros de Infravermelho do nanomaterial obtido utilizando vapor de anilina a
98°C por 18 horas. .................................................................................................................... 92
Figura 50: Espectro de Infravermelho do nanomaterial obtido utilizando vapor de água a
98°C por 18 horas. .................................................................................................................... 92
Figura 51: Espectro de infravermelho do nanomaterial obtido utilizando vapor de
diclorometano à 35°C por 18 horas .......................................................................................... 93
Figura 52: Espectros de infravermelho de todos os materiais nanoestruturas obtido
sobrepostos de modo a verificar as variações entre eles. ......................................................... 93
Figura 53: Voltamograma característico da PANI com as respectivas mudanças de cor, de
acordo com suas respectivas reações redox.[157] ....................................................................... 95
Figura 54: a) Voltamograma relativos à eletropolimerização da anilina sobre as
nanoestruturas do peptídeo /[(L-Arg…L-Phe)4] na concentração de 150 mg mL1 crescido em
vapor de anilina por 18 horas a 98 °C, b) imagens de microscopia (MEV) após polimerização
química da anilina; c) perfil do voltamograma após polimerização. VC com a resposta
eletroquímica do filme mostrado no MEV após 100 ciclos em solução de H2SO4 0,5 mol L1 e
v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodo de trabalho Au/SAM/
nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]. ............................................................................................ 97
Figura 55: a) Voltamograma relativos à eletropolimerização da anilina sobre as
nanoestruturas do peptídeo /[(L-Arg…L-Phe)4] na concentração de 150 mg mL1 crescido em
vapor de anilina por 18 horas a 98 °C, b) imagens de microscopia (MEV) após polimerização
química da anilina; c) perfil do voltamograma após polimerização. VC com a resposta
eletroquímica do filme mostrado no MEV após 100 ciclos em solução de H2SO4 0,5 mol L1 e
xvii
v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodo de trabalho ITO/
nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/Nafion®. .............................................................................. 98
Figura 56: Medidas de voltametria cíclica para os eletrodos modificados nas superfícies de
ouro (0,071 cm2) e ITO (1 cm2) na concentração de 150 mg mL1 crescido em vapor de
anilina por 18 horas a 98 °C em solução de H2SO4 0,5 mol L1 e v = 25 mV s1, no potencial
de 200 mV a 1000 mV e eletrodos de trabalho Au/SAM/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/
PANI e ITO/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/Nafion®/PANI. .............................................. 99
Figura 57: a) Voltamogramas relativos a diferentes velocidades de varredura (25, 50, ´75,
100, 150, 175, 200, 225 e 250); b) Corrente de pico referente à oxidação e redução em função
da raiz quadrada. VC com a resposta eletroquímica do filme após 100 ciclos em solução de
H2SO4 0,5 mol L1 e v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodo de
trabalho Au/SAM/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]. ........................................................... 100
Figura 58: a) Voltamogramas relativos a diferentes velocidades de varredura (25, 50, ´75,
100, 150, 175, 200, 225 e 250); b) Corrente de pico referente à oxidação e redução em função
da raiz quadrada; VC com a resposta eletroquímica do filme após 100 ciclos em solução de
H2SO4 0,5 mol L1 e v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodo de
trabalho ITO/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/Nafion. ....................................................... 101
Figura 59: Mecanismo de automontagem proposto para peptídeos cíclicos165..................... 102
Figura 60: Imagens microscopia (MEV) de nanoestruturas de peptídeos cíclicos por síntese
em fase-sólida vapor em concentração de 150 mg mL-1 e tempo de exposição ao vapor de
anilina por 18 horas. ............................................................................................................... 103
Figura 61: Imagens de microscopia das amostras em diferentes concentrações de NT-FF
dispersos na matriz de PCL (a) matriz pura, (b) 2,5% (c) 5,0% (d) 7,5% (e) 10% (f) 15% .. 106
Figura 62: Histogramas referentes às concentrações de NT-FF na matriz de PCL (a) PCL
puro, (b) 2,5% (c) 5,0% (d) 7,5% (e) 10% e (f) 15% ............................................................. 107
Figura 63: Estrutura química referente ao PCL .................................................................... 108
Figura 64: Imagens de microscopia mostrando formação do core-shell (a) amostra 2,5% e (b)
amostra 5,0% .......................................................................................................................... 109
Figura 65: Análise de TGA referente aos NT-FF ................................................................. 110
Figura 66: Imagens de microscopia das amostras eletrofiadas após tratamento térmico de 15
minutos a 70° C, (a)7,5% b) 15% ........................................................................................... 110
Figura 67: Amostras das mantas (a)-(f) (0% – 15% de NT-FF) a 70 °C; amostras (g) – (m):
mantas sem temperatura ......................................................................................................... 111
Figura 68: Curvas de DSC referentes às amostras da Tabela 9 - 100 à 180°C ..................... 112
xviii
Figura 69: Esquema de orientação proposto para o crescimento das nanoestruturas em
diferentes concentrações ......................................................................................................... 114
Figura 70: Representação esquemática do aumento da concentração de nanoestruturas
relativa à matriz ...................................................................................................................... 115
Figura 71: Gráfico tensão versus deformação para as diferentes concentrações de NT-FF .......
.................................................................................................................................................116
Figura 72: Identificação das bandas FTIR para a amostra de 15% de NT-FF em PCL ........ 117
Figura 73: Identificação de bandas por espectroscopia Raman referente às matrizes com
NT-FF ..................................................................................................................................... 118
Figura 74: Esquema representativo da interação entre as nanoestruturas e a matriz polimérica
................................................................................................................................................ 119
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Efeito do solvente na automontagem ....................................................................... 38
Tabela 2: Protocolo de Síntese - Estratégia t-Boc ................................................................... 55
Tabela 3: Protocolo de Síntese - Estratégia F-moc ................................................................. 56
Tabela 4: Parâmetros para preparação das nanoestruturas ...................................................... 60
Tabela 5: Parâmetros de preparação das soluções eletrofiadas ............................................... 64
Tabela 6: Resultados de análise quantitativa referente aos diâmetros dos histogramas.......... 85
Tabela 7: Atribuição dos modos vibracionais referentes aos espectros .................................. 94
Tabela 8: Resultados de análise quantitativa referente aos diâmetros dos histogramas........ 107
Tabela 9: Valores de temperaturas de fusão (Tm), de cristalização (Tc), entalpias de fusão
(ΔHm) e grau de cristalinidade (Xm) para os nanocompósitos.............................................. 112
Tabela 10: Resultado do ensaio tensão versus deformação................................................... 114
Tabela 11: Bandas características de FTIR para o PCL205 .................................................... 117
Tabela 12: Bandas características de Raman para o NT-FF 207,208 ........................................ 118
Tabela 13: Resultados comparativos das propriedades mecânicas com a literatura ............. 119
xx
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Arg- L-Arginina
Ac2O – Anidrido acético
ACN – Acetonitrila
CNTs – Nanotubos de carbono
DBU- 1 8-diazabiciclo[5.4.0]undeca-7-eno
DMSO – Dimetilsulfóxido
DCM- Diclorometano
DIC – Diisopropilcarbodiimida
DIPEA- Diisopropiletilamina
DMF - Dimetilformamida
ESI – Ionização por electrospray (do inglês - Electrospray Ionization)
F-moc – Fluorenilmetiloxicarbonila
FTIR- Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier
HA - Hidroxiapatita
HFP- 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol
HOBt – N-hidroxibenzotriazol
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência
ITO- Óxido de estanho dopado com índio
LC – Cromatografia líquida
MeOH- Metanol
MEV - Microscopia eletrônica de varredura
MS – Espectrometria de massa
NMP - N-metílico-pirrolidona
NT-FF- nanotubos de L-difenilalanina
PANI- Polianilina
Phe – L-Fenilalanina
PCL - Poli(ε-caprolactona)
t-Boc – Terc-butiloxicarbonila
TBTU – Tetrafluoroborato de 2-(1-H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio
TFA – Ácido trifluoracético
TFMSA – Ácido trifluormetanosulfônico
21
Capítulo 1- Revisão bibliográfica e aspectos teóricos
1.1.
Introdução à química supramolecular
A química supramolecular visa à organização estrutural de compostos de alta
complexidade, por meio da associação de espécies moleculares, unidas por interações inter
e/ou intramoleculares, de modo a obter materiais com determinadas propriedades e
funcionalidades específicas.1,
2
Logo, a compreensão por mecanismos de auto-organização
molecular auxilia na preparação de materiais em escala nanométrica de forma controlada e
reprodutível, que representa a essência da nanotecnologia moderna.3
Dentre os vários materiais nanoestruturados, os nanotubos de carbono (CNTs)
destacam-se devido à morfologia tubular e dimensões nanométricas, obtidas a partir do
enrolamento das folhas de grafeno, que consiste em arranjo bidimensional hexagonal com
hibridização sp2,4 conforme mostrado esquematicamente na Figura 1. Os CNTs podem ser
divididos em duas categorias: (i) nanotubos de parede única (SWCNTs – ―single-walled
carbon nanotubes‖), constituídos de uma camada cilíndrica de grafeno, Figura 1a, e (ii)
nanotubos de parede múltiplas (MWCNTs – multi-walled carbon nanotubes‖), constituídos
de vários cilindros concêntricos de grafeno, Figura 1b.5, 6
Figura 1: Representação da estrutura de nanotubos de carbono (a) parede simples e (b) parede múltipla.6
Os nanotubos de carbono são considerados materiais estratégicos, devido as suas
excelentes propriedades mecânicas e elétricas, bem como, alta flexibilidade, resistência
térmica.7,
8
Além disso, apresentam alterações quanto ao transporte elétrico, e podem
22
apresentar características metálicas, semicondutoras ou supercondutoras, de acordo com as
variações estruturais e direção do vetor quiral.9, 10 Este conjunto fantástico de propriedades,
decorrentes da escala nanométrica, vem promovendo materiais altamente avançados para
aplicações tecnológicos.4, 11, 12
Em particular, nos últimos anos o estudo por sistemas funcionais promoveu o
desenvolvimento de nanomateriais baseados em compostos orgânicos e inorgânicos para fins
específicos.13-15 Assim, a automontagem de compostos peptídicos têm despertado o interesse
da comunidade científica, devido à grande versatilidade estrutural, biocompatibilidade,
reconhecimento molecular, seletividade, facilidade para modificação química, bem como
habilidade na construção de sistemas com diferentes geometrias (nanofibras, nanotubos,
nanofios, nanoesferas e entre outras), que implicam em grande potencial para aplicações
biotecnológicas.16-19
Dentro deste contexto, os peptídicos formam compostos supramoleculares de estruturas
diversificadas, sendo estabilizados por interações intermoleculares como forças de van der
Waals, eletrostáticas, hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, π-π stacking e/ ou forças
coulombianas, que promovem sistemas nanoestruturados de alta especificidade.20,
21
Diante
disso, a engenharia cristalina permite a auto-organização de arquiteturas com grande
diversidade estrutural, logo que o planejamento e construção desses sistemas baseiam-se no
estudo de compostos moleculares funcionais, que promovam materiais que venham apresentar
propriedades diferenciadas e de interesse tecnológico.20, 22-24
1.2.
Estrutura dos peptídeos
Os peptídeos são biomoléculas constituídas por dois ou mais resíduos de aminoácidos
unidos por meio de ligações covalentes, denominadas ligações amidas ou peptídicas, entre os
grupos N e C terminal pertencente ao carbono-α.25 Deste modo, podem apresentar estruturas
lineares, semi-cíclicas (ligações dissulfeto intra ou intercadeias peptídicas) ou cíclicas (entre
os grupos amino e carboxila dos aminoácidos terminais), e, conformações estruturais do tipo
-hélice e estruturas-, mantidas por interações inter ou intrarmoleculares entre os resíduos
de aminoácidos.25,
26
Ainda, podem ser classificados em classes, ou seja, arquiteturas
anfifílicas, iônicas ou hidrofóbicas, que regem as interações intermoleculares, de modo a
influenciar na organização molecular.16, 27
23
Os compostos peptídicos apresentam dois grupos ionizáveis, sendo na forma protonada
(─COOH, ─NH3+) ou desprotonada (─COO-, ─NH2), de acordo com o pH do meio, ou seja,
para soluções ácidas ambos os grupos apresentam-se protonados, porém, em soluções básicas
apresentam-se desprotonados, e, em soluções neutras apresentam-se como um íon dipolar.26
Logo, o estudo da variação do pH para os compostos peptídicos é de fundamental importância
para obtenção dos materiais nanoestruturados, pois influenciam na conformação molecular
das cadeias, e, promovem sistemas com grande diversidade morfológica estrutural de
propriedades diferenciadas e específicas.28
1.2.1. Síntese química dos peptídeos
Em linhas gerais, os peptídeos podem ser sintetizados quimicamente, via fase líquida ou
via fase sólida, quanto ao tamanho da cadeia peptídica e isolamento dos intermediários.29 A
síntese em fase sólida baseia-se na condensação entre fragmentos peptídicos protegidos em
suas cadeias laterais (doadores de acila) à fragmentos protegidos ligados a um suporte
polimérico (receptores de acila). Ainda, apresentam duas diferentes estratégias: tercButiloxicarbonil/Benzil (Boc/Benzil), lábil em meio ácidos e 9-fluorenilmetoxicarbonila/
t-Butil (Fmoc/t-Butil), lábil em meios básicos. No entanto, para síntese em fase líquida a
ligação amida e formação do peptídeo ocorre em meio à solução.30-32
Deste modo, a síntese envolve mecanismos de substituição nucleofílica, por meio da
ativação do grupo carboxila por reagentes ativadores, as carbodiimidas (DCC ou DIC), e,
posterior formação da ligação amida entre os resíduos de aminoácidos, por meio da indução
de reagentes de acoplamento (HOBt), que influenciam no mecanismo cinético da reação e
previnem a racemização, ou seja, a formação de subprodutos durante as etapas da síntese.
Assim, o crescimento da cadeia peptídica envolve os mecanismos de ativação e acoplamento
entre os resíduos de aminoácidos, de modo a obter a sequência proposta, conforme
apresentado na Figura 2.33, 34
O
R
O
C
R
OH
+
C
+
H3N
O
R
R
X
Figura 2: Representação da ligação peptídica entre resíduos de aminoácidos
C
NH
R
24
1.3.
Nanoestruturas de peptídeos
O fenômeno de automontagem é frequente observado em sistemas biológicos, tendo seu
exemplo mais simples voltado ao processo de cristalização e enrolamento espacial dupla hélice
da molécula de DNA.35 Nessa linha, os peptídeos destacam-se como candidatos promissores à
automontagem, logo que podem promover arquiteturas supramoleculares com diferentes
conformações estruturais.36-38 Sendo assim, nos últimos anos o interesse por materiais
biológicos vem suscitando projetos de engenharia molecular voltados para a construção de
estruturas organizadas e eficientes quanto ao ponto de vista funcional. Dessa forma,
supermoléculas estão sendo projetadas para fins específicos, e, dispositivos nanoestruturados
montados para o reconhecimento molecular, transporte, sinalização, armazenamento e
conversão de energia.39
Nesse sentido, para esta nova classe de materiais o peptídeo de L-difenilalanina vem
sendo amplamente estudado, devido à habilidade de automontagem e eficiência para construir
sistemas com diferentes morfologias (nanotubos, nanoesferas, nanofios e nanofibras)
conforme Figura 3,40-44 e, por se tratar de um material recente muitas de suas propriedades
ainda estão sendo investigadas. Assim, a literatura relata que os primeiros nanotubos de
peptídeos foram obtidos por Ghadiri e colaboradores a partir de compostos cíclicos.45
Contudo, a formação por compostos lineares foi obtida por Gazit e colaboradores ao estudar
a habilidade estrutural de algumas sequências peptídicas aromáticas do tipo nanofibras
amilóides, estruturas responsáveis por doenças como o Alzheimer e Parkinson.[46]
Figura 3: Esquema representativo das morfologias para a molécula de L-difenilalanina e possíveis aplicações.35
25
Assim, possíveis variações morfológicas estão sendo relacionadas às alterações nas
sequências dos resíduos de aminoácidos, bem como no emprego de enântiomeros durante a
síntese, sendo este, um fator de grande importância na construção desses novos sistemas.
Sendo assim, sistemas supramoleculares distintos podem apresentar mudanças nas
propriedades ao empregar variáveis relacionadas aos resíduos de aminoácidos.46-48 A Figura 4
mostra mudanças na morfologia das estruturas preparadas com sequências peptídicas
diferenciadas. Portanto, as nanoestruturas peptídicas apresentam-se como candidatas
promissores para substituírem ou serem uma alternativa aos já existentes nanotubos de
carbono e metais de transição,49-51 uma vez que proporcionam inúmeras vantagens e
funcionalidades quanto a seu emprego em sistemas altamente seletivos, o que favorece sua
aplicação em sistemas de monitoramento.52-55
Figura 4: Ilustração esquemática de nanoestruturas tubulares, esféricas e fibras formadas por peptídeos 21
1.4.
Mecanismos de automontagem
O conceito de automontagem molecular ainda não está bem definido, sendo
atualmente aceito modelos teóricos que sugerem o processo de automontagem aprimorado em
interações intermoleculares não covalentes, como forças de van der Waals, eletrostáticas,
hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e entre outras, que ocorrem entre as moléculas do
26
peptídeo e influenciam na conformação molecular, de modo a promover sistemas
nanoestruturados de propriedades específicas de alta homogeneidade e estabilidade físicoquímica.
56-58
Nesse sentido, a conformação molecular torna-se dependente das classes
estruturais, disposição e resíduos de aminoácidos envolvidos na sequência peptídica, pois
influenciam na organização molecular entre as cadeias, de modo a promover diferentes
morfologias, conforme Figura 5.27, 59
Figura 5: Ilustração esquemática para automontagem molecular
Assim, Reches e colaboradores60 sugerem que a conformação estrutural para a molécula
de L-difenilalanina vem sendo atribuída a interações do tipo π-π stacking, por meio do
empilhamento entre os anéis aromáticos, e, posterior enrolamento das folhas bidimensionais,
de modo a promover sistemas nanoestruturados de forma tubular e esférica, conforme
apresentado na Figura 6.
Figura 6: Esquema de formação de estruturas tubulares e esféricas.40
27
Entretanto, Görbitz61 propôs um modelo experimental para a construção NT-FF baseado
em uma estrutura tubular formada a partir de agregados de nanotubos, conforme Figura 7a,
sendo o diâmetro controlado de acordo o número de agregados. Ainda, a natureza exata da
superfície interna ainda não está totalmente resolvida, mas sugere-se apresentar a parte
externa hidrofóbica (diâmetro de 110 nm) e parte interna hidrofílica (diâmetro interno de 50
nm), de acordo a Figura 7b. O diâmetro referente aos canais foi calculado por meio da
equação de estados de van der Waals, com diâmetro = 10 Å, (Figura 7c). Estes canais, sendo
hidrofílicos, podem acomodar moléculas de atividade catalítica, bem como íons metálicos
hidratados para aplicações em sistemas de reconhecimento.
Figura 7: Modelo para a construção de NT-FF (a) Estrutura tubular e indicativo de agregados (b) Interface
61
relativa aos canais (c) Representação dos átomos que constituem a estrutura.
Outro exemplo de mecanismo sugere a automontagem de peptídeos cíclicos formados
por resíduos de aminoácidos alternandos (D L), que promovem a interação entre os planos
folhas-β estabilizadas por ligações de hidrogênio, de modo a projetar uma estrutura tubular,
demonstrado esquematicamente na Figura 8.62-64 Uma característica importante dos nanotubos
de peptídeos cíclicos é o controle preciso do diâmetro, determinado pelo comprimento da
cadeia, tamanho da cadeia lateral, ângulo de ligação dos monômeros e estereoquímica dos
aminoácidos. O número adequado e a sequência dos aminoácidos definem as propriedades
superficiais dentro e fora dos nanotubos.65-68
28
Figura 8: Representação esquemática da formação de nanotubos a partir de peptídeos cíclicos. 68
Os precursores lineares formados por enântiomeros (D L) conformam-se na forma αhélice, sendo estabilizados por ligações de hidrogênio, devido à quiralidade que promove
inversão do ângulo e interação entre as moléculas,69, 70 conforme Figura 9. Ainda, os anéis
aromáticos presentes nas estruturas dos aminoácidos exercem uma importante função na
conformação das nanoestruturas, pois promovem interações tipo π-π stacking com o
empilhamento de anéis aromáticos, conferem direcionalidade durante a auto-organização
molecular.16, 68 Nesse sentido, diferentes morfologias (tubos, esferas, fios) podem ser obtidas a
partir da automontagem molecular dos precursores, cíclicos e lineares, pois envolvem
interações não-covalentes altamente dinâmicas, que influenciam na estabilidade do sistema e
conferem às moléculas diferentes orientações.71
29
Figura 9: Conformação de uma sequência de peptídeo linear (D L).[25]
1.5.
Estudo das propriedades morfológicas e estruturais
Atualmente, a literatura tem mencionado sistemas nanoestruturados preparados a partir
da molécula de L-difenilalanina, Figura 10, uma vez que exibem diversas propriedades
exclusivas e atrativas. Neste sentido, alguns trabalhos investigam seu controle estrutural
quanto a variações nos parâmetros como: temperatura, solvente, metodologia de obtenção,
substrato e pH.72, 73 Estudos recentes revelaram as excelentes propriedades mecânicas para os
NT-FF com índices em torno de 160 N/m e módulo de Young de 19 GPa, sendo considerado
um material altamente rígido quando comparado as algumas estruturas biológicas.74
Figura 10: Molécula de L-difenilalanina (a) Fórmula estrutural. (b) Estrutura tridimensional 61
30
Adler-Abramovich e colaboradores75 mencionam a estabilidade térmica e química dos
NT-FF quando submetidos a variações de solvente e temperatura. Neste trabalho, as amostras
foram preparadas em solução com diferentes solventes. Assim, os autores observaram a
estabilidade estrutural com baixa perda morfológica referente ao nanomaterial, conforme
apresentado na Figura 11a. Entretanto, apresentam degradação ou perda da morfologia entre
200 e 300 °C, Figura 11b. Neste trabalho, os autores atribuíram a estabilidade térmica às
interações do tipo - stacking entre resíduos aromáticos que mediam a formação das
estruturas.
Figura 11: Imagens de microscopia (MEV) referente à estabilidade dos NT-FF em diferentes solventes.75
Adler-Abramovich76 estudaram a influência do grupo protetor t-Boc na automontagem
da molécula de L-difenilalanina. Os autores observaram a formação de nanoesferas, as quais
tiveram suas propriedades mecânicas medidas com auxilio de um microscópio de força
atômica (Figura 12) Este dispositivo utiliza um cantilever que mede a força quando
pressionado contra a amostra, e fornece informações úteis para calcular o módulo de
elasticidade (módulo de Young). Os pesquisadores encontrarm um alto módulo de
elasticidade de 275 GPa, valor semelhante ao aço. Além das excelentes propriedades
31
mecânicas, as nanoesferas são transparentes, o que as torna atrativas para o uso como reforço
em biocompositos, tais como implantes dentários.
Figura 12: Análise das esferas de Boc-Phe-Phe-OH (a) AFM das nanoesferas depositada sobre mica clivada (b)
76
micrografia das exposições das nanoesferas.
Entretanto, alguns estudos citam possíveis variações morfológicas quanto à automontagem
das moléculas de L-difenilalanina de acordo a alcalinidade do meio. Deste modo, Han e
colaboradores77 investigaram as variações morfológicas do dipeptídeo em diferentes meios de
pH, condições ácidas e básicas. Os autores observaram que em condições ácidas (pH em torno
de 4-7) as moléculas formam estruturas tubulares de diâmetros e tamanhos variados, porém,
em condições básicas do meio ocorre variações quanto ao tipo de morfologia, que sugere a
formação de fibras, agregadas e irregulares, conforme a Figura 13.
Figura 13: Imagens das variações morfológicas do dipeptídeo de L-difenilalanina em relação às condições de
pH. (a - b) pH= 4 formação de nanotubos, (c - d) pH= 10 formação de fibrilas 77
O estudo proposto por Kim e colaboradores78 propõem variações morfológicas dos
NT-FF por meio da variação da concentração, e, interação com moléculas de água. Deste
modo, os autores promoveram a formação de nanofios por meio da dissolução do peptídeo em
ácido trifluoroacético com posterior titulação com hidróxido de amônia ao atingir o ponto
32
isoelétrico (entre 5 e 4). O estudo para formação dos nanofios sugere a interação eletrostática,
entre as moléculas de L-difenilalanina, promovidas devido à desprotonação do grupo
funcional ácido carboxílico. Já, para preparação dos nanotubos envolve o efeito de sonicação,
e, posterior aquecimento em água deionizada e baixas concentrações de L-difenilalanina, uma
vez que em altas concentrações (> 2,5 mg mL-1) foi observada a formação de nanofios.
Assim, os autores concluíram que a morfologia torna-se dependente das concentrações do
precursor peptídico e água livre no meio reacional, uma vez que altas concentrações de água
promoveram a formação de nanofios, enquanto, a baixas concentrações observou-se a
formação de nanotubos. A Figura 14 apresenta o esquema de variação morfológica referente
às nanoestruturas em baixa e alta concentração do precursor, bem como metodologia de
preparação.
Figura 14: Preparação de nanotubos e nanofios de L-difenilalanina preparados em meio à titulação. (a) estrutura
molecular da L-difenilalanina; (b) precipitado branco formado próximo ao ponto isoelétrico; (c) nanotubos de
peptídeo preparados em baixas concentrações (d) nanofios de peptídeo preparados em altas concentrações.78
Andersen e colaboradores79 estudaram a estabilidade química dos NT-FF quando
dispostos em diferentes solventes. Assim, os autores adicionaram 10 μL da solução de
peptídeo com concentração de 2 mg/mL na superfície de uma microplaca, sendo
posteriormente seca à vácuo e temperatura ambiente. Após, para o teste de estabilidade foi
33
adicionado 1 mL dos solventes sobre as estruturas, sendo monitoradas por microscopia óptica
em intervalos fixos durante o processo de dissolução. Deste modo, os autores observaram a
estabilidade das estruturas frente ao tempo e variação de solvente, conforme apresentado na
Figura 15.
Figura 15: Imagens de microscopia óptica das estruturas nos diferentes solventes.79
34
1.6.
Métodos usuais para preparação de nanoestruturas peptídicas
O desenvolvimento por novas técnicas de preparação de materiais peptídicos em
nanoescala destacam-se no cenário técnico-científico atual, devido à busca por sistemas de
automontagem que promovam morfologias 1-D, 2-D e 3-D, bem como variações nas
propriedades físico-químicas, e amplo potencial em aplicações para as áreas da
bionanotecnologia. Além disso, variações nas condições de temperatura, concentração e
solvente influenciam na automontagem, e logo variação da morfologia do material
nanoestruturado.80
As metodologias de preparação de materiais peptídicos nanoestruturados buscam
estabilidade, controle e reprodutibilidade, sendo mencionadas na literatura as técnicas via:
fase líquida, deposição física a vapor, fase sólida-vapor, eletrofiação, nanoimpressão e
dieletroforese, que permitem obter nanoestruturas por meio de processos de nucleação e
crescimento espontâneo. Algumas das metodologias empregadas para a preparação de
nanoestruturas peptídicas estão descritas a seguir.80, 81
1.6.1. Fase líquida
Recentemente, nanotubos de peptídeos baseados na L-difenilalanina vem sendo
preparados via fase líquida, ou seja, em solução.82,
83
A técnica consiste na dissolução do
precursor em 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFP) com posterior diluição em água na
concentração de 5mg mL-1. Assim, por mecanismo de automontagem e processos de
nucleação e crescimentos as moléculas do peptídeo formam um gel, que indica a formação
das nanoestruturas na ordem de 80 a 300 nm e comprimento de algumas centenas de mícrons
(Figura 16).
Recentemente, nosso grupo de pesquisa na UFABC tem estudado a formação de
espécies nanoestruturadas envolvendo compostos peptídicos derivados da L-difenilalanina,
bem como suas possíveis aplicações em sistemas de detecção. Entretanto, trata-se de um
processo rápido, porém, com baixo controle dimensional relacionada ao fenômeno de
agregação, que promove o aumento relativo do diâmetro.
35
Figura 16: Esquema de preparação de nanoestruturas em fase líquida
Em 2006, Reches e Gazit84 relataram o crescimento vertical de nanotubos de
difenilalanina, sob a superfície de vidro siliconizado, preparados em solução e modificados
com nanopartículas magnéticas. Os resultados revelaram que, após a evaporação do solvente e
aplicação do campo magnético, os nanotubos foram orientados verticalmente sobre a placa de
vidro. Os autores associaram o alinhamento à presença do campo magnético, e, a contribuição
energética obtida pelos acoplamentos entre anéis aromáticos presente na molécula do peptídeo
(Figura 17).
Figura 17:Representação esquemática do crescimento vertical dos NT-FF.84
36
1.6.2. Nanoimpressão
Atualmente, a tecnologia voltada para impressão vem sendo largamente empregada para
deposição de polímeros, resinas e nanoestruturas.85 Adler- Abramovich e Gazit86 preparam
nanotubos de peptídeos e nanoesferas em solução (1:1 etanol/ água) disposta dentro de um
cartucho condicionado em impressora jato de tinta. Os autores foram capazes de promover a
deposição do material nanoestruturado em substrato de ITO. A deposição foi analisada por
microscopia eletrônica de varredura, sendo avaliados parâmetros como área de impressão e
volatilidade do solvente, conforme mostrado na Figura 18. No entanto, a técnica envolve a
deposição física das nanoestruturas, sendo necessário o estudo do solvente utilizado, uma vez
que pode danificar o equipamento de impressão.
Figura 18: Esquema da Representação de nanotubos de peptídeo via impressão jato de tinta (a) impressão única
86
(b) imagem de microscopia da área impressa (c) múltiplas impressões (10 vezes)
1.6.3. Deposição física a vapor
Recentemente, Gazit e colaboradores87 prepararam NT-FF orientados verticalmente
empregando a técnica de deposição física a vapor, por processos físicos de sublimação do
precursor para o substrato. Contudo, os autores mencionaram que o alinhamento vertical foi
possível devido às interações hidrofóbicas, presentes na cadeia, e π-π stacking, entre os anéis
aromáticos da molécula de L-difenilalanina, conforme Figura 19.
A técnica sugere que a formação das nanoestruturas foi possível, devido ao baixo peso
molecular, que sob a influência de temperatura tornam-se voláteis, logo, indica o estudo com
37
peptídeos de baixo peso molecular. Ainda, o tamanho e a quantidade de material são
controlados por parâmetros de deposição como temperatura e constante dielétrica do solvente.
Figura 19: Mecanismo de nanoestruturação vertical utilizando a técnica de deposição física a vapor. 87
1.6.4. Fase sólida-vapor
A preparação de nanotubos de difenilalanina sido reportada por meio do processo em
fase sólida-vapor,88,
89
e consiste na automontagem de moléculas por meio de vapor de
solvente, neste caso são empregados dois solventes, um para solubilizar o peptídeo e outro
para promover a nanoesttuturação. O método baseia-se na estratégia ―bottom-up”,90,
91
e
consiste em sulubilizar o material peptídico em solvente, de modo a formar um filme sobre a
superfície do substrato com posterior evaporação do solvente na ausência de umidade, etapa
denominada de fase sólida.
A fase vapor consiste em manter o filme em atmosfera de vapor de solvente, etapa na
qual ocorre o processo de nanoestruturação, conforme Figura 20.92 Nesse sentido, parâmetros
como: temperatura, pressão de vapor, concentração e tempo de exposição ao vapor favorecem
variações quanto a automontagem, e logo, nas morfolgias das nanoestruturas.93
38
Figura 20: Esquema experimental de obtenção de nanoestruturas utilizando o método de síntese em fase sólida92
vapor.
Demeriel e colaboradores94 estudaram a influência do solvente no processo de
nanoestruturação. Para tanto, o autores prepararam nanoestururas com a concentração da
solução precursora em 2 mg mL-1, e promoveram variações quanto ao solvente. Os resultados
revelaram a relação entre o efeito solvente e as constantes dielétricas para as morfologias das
nanoestrutruras formadas, conforme listado na Tabela 1. Microscopias eletrônicas de
varredura (MEV/FEG) indicando as nanoestruturas obtidas são apresentadas na Figura 21.
Tabela 1. Efeito do solvente na automontagem
Solvente
Constante Dielétrica
Estrutura Formada
Água
80,1
Nanotubo
Metanol
32,6
Nanotubo
Etanol
24,3
Nanotubo
Acetona
20,7
Nanovesícula
39
Figura 21: Imagens obtidas por microscopia (MEV) de tubos e vesículas de L-difenilalanina na concentração de
2 mg mL-1: (a) em etanol vaporizado a 25°C; (b) em acetona vaporizada a 25°C, (c) em etanol vaporizado a 80°C
e (d) em acetona vaporizada a 80°C.94
1.6.5. Eletrofiação
A técnica de eletrofiação consiste na aplicação de um campo elétrico, através do
escoamento de uma solução precursora, para a obtenção de nanoestruturas tipo 1-D. Neste
processo, um eletrodo conectado a uma fonte de alta tensão (5-50kV) é conectado à uma
seringa contendo solução polimérica.
Inicialmente, a solução é mantida pela sua tensão superficial na forma de uma gota na
extremidade do capilar. Com o aumento da tensão elétrica, a superfície da gota se alonga, de
modo a formar um cone, conhecido como ―cone de Taylor‖. Entretanto, quando as forças
eletrostáticas superam a tensão superficial, o jato do material fluído é acelerado através do
campo elétrico. Durante o fluxo do jato, o solvente evapora e o polímero solidifica-se,
formando uma manta nanofibrílica, que se deposita em um coletor (superfície metálica com
aterramento). Porém, algumas variáveis podem influenciar no processo, como por exemplo, a
concentração polímero/solvente, tensão elétrica aplicada na solução, adição de sais na
solução, vazão de alimentação (saída da solução do capilar) e distância de trabalho (entre a
extremidade do capilar até o coletor), conforme Figura 22.95
40
Singh e colaboradores96 estudaram a formação de fibras formadas por NT-FF utilizando
a técnica de eletrofiação. Os autores observaram variações na estrutura das nanofibras
promovidas por modificações nos parâmetros. Contudo, essa técnica ainda esta entre as
menos mencionadas na literatura para a formação de nanoestruturas baseadas em compostos
peptídicos, porém por ser relativamente simples, barata, rápida e acarretar na formação de um
material muito homogêneo pode vir a se tornar uma das mais empregadas no futuro.
Figura 22: Esquema de eletrofiação para formação de nanofibras.i
1.6.6. Dieletroforese
Outro método usado para a manipulação de auto-montagem de nanoestruturas é
dieletroforese. Dieletroforese ocorre quando um objeto polarizável é exposto a uma campo
elétrico não homogêneo, de modo que as forças de coulombianas induzidas sobre sobre o
dipolo, promova uma força resultande. O emprego de NT-FF foi relatado em 2008,97 o qual
foram usados micro-eletrodos de ouro, sendo os nanotubos de peptídeo manipulados, de modo
a ajustar padrões de amplitude e frequência da tensão aplicada, conforme mostrado na Figura
23.
i
Figura adaptada: http://www.centropede.com/UKSB2006/ePoster/background.html - acessado 09/01/2012
41
Figura 23: Imagens de AFM dos eletrodos de ouro via manipulação dos NT-FF com aplicação do campo
97
elétrico.
1.7.
Aplicações
As nanoestruturas peptídicas podem ser empregadas como uma material promissor
com grande potencial em várias aplicações, desde engenharia de tecidos à nanoeletrônica,
devido à biocompatibilidade e propriedades relacionadas à automontagem. 98 Contudo, com o
propósito de obter novas propriedades, bem como aperfeiçoar e potencializar as propriedades
existentes, pesquisas estão sendo realizadas em busca de estratégias que promovam a
interação destes materiais nanoestruturados com outros composto, de modo a promover
sistemas funcionalizados de alta especificidade, sensibilidade e seletividade. Deste modo,
dentre as principais possíveis aplicações destacam-se a construção de biossensores, como
sistemas de detecção, e, materiais biocompatíveis, os biomateriais.
1.7.1. Biossensores
Em 2005, foram reportados os primeiros estudos a cerca das propriedades
eletroquímicas dos nanotubos peptídicos de FF, podendo ser utilizadas como nova plataforma
biocompatível em biosensores e dispositivos eletroquímicos.99Os NT-FF têm sido também
empregados na construção de biossensores amperométricos para detecção de -nicotinamida
adenina dinucleotídeo (NADH), peróxido de hidrogênio e etanol na ausência do mediador
redox.100
La Rica e colaboradores101 desenvolveram um biochip de detecção de patógenos, que
consiste na modificação do substrato de ouro com NT-FF para a incorporação de anticorpos.
42
Os nanotubos de peptídeo foram modificados com anticorpos contra vírus herpes simplex tipo
2 (HSV-2), sendo, a ligação do vírus aos anticorpos monitorados por uma variação da
capacitância entre os eletrodos No entanto, Zhao e colaboradores102 desenvolveram o sistema
de imobilização de anticorpos funcionalizados com nanotubos de peptídeos, uma vez que,
devido a biocompatibilidade, podem se ligar seletivamente ao antígeno. Os nanotubos de
peptídeo agem como matrizes, e, otimizam as interações entre os anticorpos e o sensor via
ligação de hidrogênio.
Em um artigo recente, foi desenvolvido um biossensor utilizando NTPs funcionalizados
com a microperoxidase-11 (MP11), sobre a superfície de um eletrodo de ITO, empregando a
técnica de automontagem Layer-by-Layer (LBL). Para medir a sensibilidade do eletrodo
(MP11/PNTs/PAH)n=4/ITO, foi analisada a resposta amperométrica de H2O2 na solução
tampão fosfato pH 7 sob agitação. Foram feitas adições sucessivas de H2O2 e as correntes de
redução catódica em aproximadamente -300 mV aumentaram linearmente com o aumento da
concentração de H2O2. A sensibilidade do sistema foi estimada em 9,43 Acm-2mmolL-1, e o
limite de detecção foi de 6 mmol L-1 na relação sinal-ruído de 3. Esses valores são expressivos
quando comparados com outros procedimentos que envolvem a imobilização de MP11 em
nanotubos de carbono, nanopartículas de ouro e prata na superfície de eletrodos.103
Outro trabalho, estuda a sensibilidade das nanoestruturas de peptídeos modificadas com
complexo de cobre para a detecção de dopamina.104 No caso a modificação foi realizada em
solução, as nanoestruturas previamente preparadas foram dispersas em solução contendo o
complexo [Cu4(apyhist)4]4+ e membrana Nafion® sob sonicação, e, posteriormente
depositadas na superfície de carbono vítreo. Os resultados de voltametria cíclica e onda
quadrada revelaram o aumento relativo da corrente e maior sensibilidade de detecção, quando
comparados com o eletrodo modificados somente com complexo de cobre.
1.7.2. Biomateriais
Biomateriais construídos por sistemas nanoestruturados vêm sendo empregados com
sucesso na construção de sistemas para aplicação biológica. Nesse sentido, as nanoestruturas
peptídicas abrem novos caminhos para aplicações em sistemas de liberação controlada de
drogas ou engenharia de tecidos, pois apresentam grande afinidade biológica com
organismo.[109]
43
A neurociência abrange a pesquisa principal com grandes perspectivas futuras, uma vez
que estudos relatam o emprego de nanotubos de peptídeos para o crescimento de nervos
ópticos danificados.
105, 106
Sendo, estes resultados promissores à pesquisa, e pode fornecer
base para futuros estudos voltada à engenharia de tecidos.
Recentemente, oligopeptídeos foram investigados em processos de liberação de ativos
em células por endocitose (processo de absorção), seguindo o modelo de transição espontânea
das nanoestruturas peptídicas para vesículas, por meio da variação da concentração das
espécies precursoras.107
44
Capítulo 2- Objetivo
2.1.
Objetivos gerais
Desenvolver um novo nanomaterial baseado na sequência peptídica RF8, cíclica [(LArgD-Phe)4] e linear [(L-ArgL-Phe)4], de modo a estudar as possíveis variações
morfológicas e estruturais mediante às variações nos parâmetros de preparação como
solvente, concentração e tempo de exposição ao vapor. Além disso, estudar o mecanismo de
automontagem via eletrofiação para matriz polimérica de poli(ε-caprolactona) com NT-FF,
bem como analisar as propriedades para o nanocompósito.
2.2.
Objetivos específicos
Primeira parte – Síntese do composto cíclico e linear.

Sintetizar as sequências peptídicas: cíclica [(L-ArgD-Phe)4], via estratégia fmoc , e
linear [(L-ArgL-Phe)4], via estratégia t-Boc, e caracterização por espectroscopia de massa.
Segunda parte – preparação das nanoestruturas.

Preparar as nanoestruturas via fase sólida-vapor;

Promover variações de parâmetros como: concentração, tempo e solvente;

Estudar as propriedades térmicas, espectroscópicas e condutoras do composto linear
nanoestruturado;
Terceira parte – estudo do mecanismo de eletrofiação, bem como das propriedades da matriz
com NT-FF.

Preparar soluções de NT-FF em poli(ε-caprolactona);

Preparar as membranas nanofibrilar via eletrofiação das soluções;

Estudar as propriedades do nanocompósito.
45
Capítulo 3- Materiais e Métodos
Nesse trabalho, foram utilizados reagentes e solventes de graus analíticos e
cromatográficos, das seguintes empresas: Merck e Sigma-Aldrich, sendo eles: diclorometano,
dimetilformamida, metanol, clorofórmio, trietanolamina, anilina, anisol, 4-mercaptopiridina,
acetonitrila,
ácido
acético,
anidrido
acético,
ácido
trifluoroacético
e
ácido
trifluorometanosulfônico. O álcool 1,1,1,3,3,3- hexafluor-2-propanol (HFP) foi adquirido da
Fluka.
Os peptídeos foram sintetizados utilizando-se a resina clorometilada (Merrifield),
adquirida da Advanced Chemtech, com grau de substituição 0,90 mmol/g de resina, já
acoplada ao aminoácido de partida. Os aminoácidos utilizados protegidos foram: [(Boc-PheOH)] e [(Boc-Arg(Tos)-OH)] adquiridos da Sigma-Aldrich, bem como o polímero poli(ɛcaprolactona).
3.1.
Técnicas de caracterização empregadas
A caracterização de materiais apresenta grande importância no estudo das propriedades
dos materiais, pois fornece informações quanto às características do sistema e sugere
possíveis aplicações. Logo, a caracterização abrange a avaliação das propriedades físicas e
químicas, uma vez que envolve técnicas mecânicas, elétricas, térmicas, bioatividade, entre
outras.
3.1.1. Cromatografia líquida de alta eficiência- CLAE
A cromatografia é um método físico-químico de separação de compostos,
fundamentada na migração diferencial dos componentes em solução. A migração ocorre por
meio de diferentes interações químicas entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase
estacionária. A grande variedade de combinações entre tais fases faz com que esta técnica seja
extremamente versátil e de grande aplicação.108, 109
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), do inglês High Performance
Liquid Chromatography (HPLC), é uma técnica analítica eficiente na identificação,
quantificação e purificação de componentes individuais em uma mistura. A CLAE utiliza uma
46
fase estacionária finamente dividida, de modo a promover uma interação mais intensa entre a
fase estacionária e a fase móvel, fator responsável pela alta eficiência.109
As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de
oxigênio ou outros gases dissolvidos. A bomba deve proporcionar ao sistema, vazão contínua
sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo
adequado. As colunas utilizadas em CLAE são empacotadas com suportes de alta resolução,
não sendo necessária sua regeneração após cada separação. O detector mais utilizado para
separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de
fluorescência, de índice de refração, eletroquímicos, entre outros.110, 111
Os cromatogramas foram obtidos em um sistema Waters, constituído por um módulo de
separação Alliance – mod. 2695, detector UV-Vis – mod. 2489; detector de fluorescência –
mod. 2475 e injetor automático com capacidade de 120 amostras. O sistema é controlado por
um software Empower Persona Single System Workstation, disponível no laboratório de
orgânica da Universidade Federal do ABC. Os peptídeos brutos foram dissolvidos em uma
solução de 0,1% TFA/H2O, na concentração de 1 mg/mL.
As condições experimentais aplicadas foram:
Coluna:
Supelcosil C18 (4,6 x 150 mm), 60Å, 5 m
Solventes:
A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA - 60% ACN / H2O
Gradiente:
5% a 95% de B em 30 minutos
Fluxo:
1,0 mL/min
Comprimento de onda:
220 nm
3.1.2. Espectroscopia de Massa
A técnica analítica de espectrometria de massa é utilizada com o objetivo de obter
informações sobre o peso molecular e características estruturais da amostra, e consiste na
geração de íons com base em compostos (orgânicos ou inorgânicos) por meio de um método
de ionização apropriado. Sendo, os íons separados por meio de sua relação massa-carga (m/z),
junto ao analisador de massas e detectados qualitativamente, ou quantitativamente por meio
de um detector, que separa os íons. A magnitude do sinal elétrico em função da razão m/z é
convertida por um processador de dados, o qual gera o espectro de massa correspondente.112
47
Inicialmente, a técnica estava restrita a substâncias voláteis, pois as primeiras técnicas
de ionização empregadas (ionização por elétrons e ionização química) são processos nos quais
o analito é primeiramente vaporizado, e a ionização só ocorre quando a molécula está na fase
gasosa. Essa restrição impossibilitava a análise de biomoléculas, como proteínas, carboidratos
e lipídeos, as quais não são voláteis e se degradam em altas temperaturas.
112
O
desenvolvimento de técnicas de ionização mais brandas causou uma revolução na extensão
das aplicações de MS, e dentre as técnicas desenvolvidas as principais foram: ionização por
electrospray, ionização e dessorção a laser assistida por matriz. As técnicas de ionização
branda permitiram, portanto, a produção de íons com base em compostos de alta massa
molecular e não-voláteis, estendendo a aplicação da MS a todos os tipos de moléculas. 112-114
Os peptídeos foram caracterizados por espectrometria de massas em um sistema
LC/ESI-MS Waters, do Departamento de Biofísica da UNIFESP, constituído por um módulo
de separação Alliance modelo 2690, detector photodiode array modelo 996, injetor
automático com capacidade de 120 amostras e um espectrômetro de massas Micromass,
modelo ZMD. O sistema é controlado por uma workstation Compaq modelo AP200. Os
peptídeos foram dissolvidos uma solução de 0,1% TFA/H2O, na concentração de 1 mg/mL.
As condições experimentais foram:
Coluna:
Solventes:
Waters C18 (2,1x150 mm), 60Å, 3,5 m
A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA em 75 ou 90%ACN/H2O
Gradiente:
5% a 95% de B em 20 ou 30 minutos
Fluxo:
0,4 mL/min
190-300 nm
Intervalo de massas:
500-3930 Daltons.
Modo:
―Electrospray‖ Positivo
3.1.3. Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento capaz de produzir
imagens de alta ampliação (até 300.000 x) e resolução. As imagens fornecidas possuem um
caráter virtual, pois o que é visualizado no monitor é a trans-codificação da energia emitida
pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz a qual estamos habitualmente acostumados.115
O MEV é uma ferramenta padrão para inspeção e análise utilizada em diversas áreas de
48
pesquisa desde a área de materiais até a área biológica. Deste modo, o MEV tem se tornado
um instrumento imprescindível no desenvolvimento de novos materiais, pois por meio da
análise e interpretação da imagem gerada consegue-se predizer propriedades importantes de
uma determinada amostra como morfologia, diâmetro, espessura, defeitos e orientação das
fases.116No entanto, os microscópios eletrônicos de varredura são classificados em duas
categorias distintas, sendo os canhões FEG de alto vácuo e maior resolução, e, os canhões LV
de baixo vácuo e menor resolução.
A configuração do MEV consiste de coluna óptico-eletrônica (canhão de elétrons e
sistema de lentes magnéticas), unidade de varredura, câmera de amostra, sistemas de
detectores e sistema de visualização de imagem. A versatilidade da técnica está relacionada às
interações entre o feixe de elétrons e a superfície da amostra, que gera sinais de
espalhamento.116, 117 Sendo, os espalhamentos elásticos, que afetam as trajetórias do feixe de
elétrons dentro da amostra sem alterar a energia cinética do elétron (elétron retro-espalhado),
e, os espalhamentos inelásticos, que resultam da transferência de energia do feixe de elétrons
para os átomos da amostra, e promove a geração de elétrons secundários, elétrons Auger,
raios-X contínuo e característico, pares elétron-buraco em semicondutores e isolantes,
radiação eletromagnética (na região do visível, ultravioleta, infravermelho), vibrações da rede
(fônons) e oscilações eletrônicas em metais (plasmons), conforme Figura 24.
Contudo, os sinais de maior interesse para a formação da imagem referem-se aos
elétrons secundários e os retroespalhados. Os elétrons secundários fornecem imagem de
topografia da superfície da amostra, sendo responsáveis pela obtenção das imagens de alta
resolução, já os retroespalhados fornecem imagem característica de variação de composição
em relação ao número atômico.115-117.
As imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura foram obtidas no Laboratório
Nacional de Luz Síncrotron – LNLS – Brasil sob a proposta de pesquisa SEM-FEG 11235Continuação de: SEM-FEG – 10301. O Equipamento utilizado foi um microscópio eletrônico
de varredura de alta resolução do tipo SEM-FEG (JSM 6330 F), com filamento termo-iônico
de tungstênio, operando com voltagem de 5 kV e modo de varredura selecionado de elétrons
secundários, responsáveis pela formação da imagem. Para a realização das medidas, as
amostras foram recobertas com ouro, de modo a promover condutibilidade.
49
Figura 24: Microscópio eletrônico de Varredura SEM-FEG do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron.
3.1.4. Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier
Em princípio, a espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética com a
matéria, sendo relativas às frequências vibracionais específicas aos níveis de energia
molecular. Neste sentido, os modos vibracionais permitem identificar compostos por meio do
estudo da simetria molecular referente à teoria de grupo, que sugere operações simétricas
vibracionais.118, 119 Na espectroscopia de infravermelho, a probabilidade vibracional depende
da variação do momento do dipolo elétrico, que fornece frequências características para cada
ligação química e define a geometria molecular.
Deste modo, a absorção da radiação infravermelha ocorre devido à variação do
momento de dipolo elétrico da molécula como consequência de seu movimento vibracional
ou rotacional (o momento de dipolo é determinado pela magnitude da diferença de carga e a
distância entre dois centros de carga). Assim, somente nessas circunstâncias, o campo elétrico
alternante da radiação incidente interage com a molécula, originando os espectros. Entretanto,
o sinal fornecido não pode ser interpretado diretamente, tornando-se necessário sua
decodificação para comprimentos de onda, mediante a técnica matemática conhecida como
transformada de Fourier.120, 121
A caracterização por espectroscopia na região do infravermelho das amostras de foram
obtidas utilizando-se um espectrômetro FTIR modelo Varian 660-IR, disponível no
laboratório de eletroquímica e materiais nanoestruturados no campus da Universidade Federal
50
do ABC. As amostras, no estado sólido, foram analisadas à temperatura ambiente. Após, o
background, os espectros foram obtidos empregando 100 ciclos com resolução de 4 cm-1
3.1.5. Espectroscopia Raman
O efeito Raman depende de um momento de dipolo induzido na molécula, devido ao
campo eletromagnético proveniente da radiação incidente, sendo proporcional à polarização
molecular.122 Em nível molecular a radiação pode interagir com a matéria por processos de
absorção ou de espalhamento elástico ou inelástico. O espalhamento inelástico, denominado
espalhamento Rayleigh, não fornece informações vibracionais da molécula, enquanto no
espalhamento elástico de luz, chamado de espalhamento Raman, o campo elétrico do fóton
espalhado perturba a nuvem eletrônica da molécula podendo ser entendido como um processo
de excitação para um estado de energia ―virtual‖, ou seja, a molécula se encontra em algum
estado vibracional e absorve um fóton de energia, que a excita para um estado intermediário
(virtual), imediatamente há a transição para um estado de energia mais alta emitindo um fóton
de energia (espalhamento). Assim, a espectroscopia Raman estuda o fenômeno inelástico de
dispersão da luz, por meio de variações relacionadas aos níveis de energias vibracionais e/ou
rotacionais moleculares. Desta forma, se a energia da radiação incidente coincidir ou se
aproximar de uma transição eletrônica permitida da molécula, ocorrerá uma intensificação do
sinal espalhado, esse fenômeno é conhecido como Raman ressonante.123, 124
Os espectros Raman foram obtidos em um microscópio Raman Renishaw (system 3000)
acoplado a um detector CCD que fica no Laboratório de Espectroscopia Molecular (LEM) do
Instituto de Química da Universidade de São Paulo. A focalização do laser na amostra e a
coleta da radiação espalhada foram realizadas por meio do microscópio metalúrgico Olympus
modelo BH2-UMA. Serão utilizadas linhas de excitação na região do visível em 632,8 nm
com um laser de He-Ne (Spectra Physics, modelo 127). A potência do laser foi mantida
abaixo de 0,7 mW para evitar a degradação das amostras. O Espectro Raman foi utilizado
para conhecer as contribuições espectrais que não são visíveis nos espectro de infravermelho
(vibrações que possuem momento de dipolo elétrico igual a zero), e para avaliar a estrutura
das mantas eletrofiadas.
51
3.1.6. Voltametria Cíclica
A técnica de voltametria cíclica baseia-se em fenômenos de interface que ocorrem entre
a superfície de um eletrodo condutor (eletrodo de trabalho) e o seio da solução. No
experimento, mede-se a corrente elétrica resultante quando um potencial eletroquímico é
aplicado a um sistema constituído por três eletrodos (trabalho, referência e contra eletrodo)
que estão imersos em uma solução eletrolítica.125
O potencial aplicado no eletrodo de trabalho atua como força motriz na reação
eletroquímica. É o controle do potencial que possibilita que o monômero presente no meio
reacional seja oxidado ou reduzido na superfície do eletrodo de trabalho. O valor deste
potencial é mudado continuamente como função linear do tempo e a taxa de variação do
potencial ao longo do tempo é denominada velocidade de varredura de potencial. Um
intervalo de potencial é escolhido em uma direção, revertido num certo ponto e determinado
no potencial final. A técnica é importante para o estudo de mecanismo e velocidades de
processos redox e frequentemente evidencia a presença de intermediários nestas reações. 125
As medidas eletroquímicas foram realizadas no potenciostato Autolab PGSTAT
302N, disponível no laboratório de eletroquímica e materiais nanoestruturados – LEMN da
Universidade Federal do ABC. A célula eletroquímica foi montada com o eletrodos de
trabalho, o ouro (7 mm2) e ITO (1cm2); a platina (fio de platina) como contra eletrodo e o
eletrodo de calomelano saturado como eletrodo de referência.
3.1.7. Análise Térmica
A análise térmica abrange um grupo de técnicas nas quais uma propriedade física ou
química de uma determinada substância, ou seus produtos de reação, é monitorada em função
do tempo e/ou da temperatura. Assim, a análise termogravimétrica é uma técnica
termoanalítica na qual a variação de massa da amostra (perda ou ganho) é determinada em
função da temperatura (T) ou tempo (t), enquanto a amostra é submetida a uma programação
controlada de temperatura. No entanto, a técnica por DTG expressa a derivada primeira da
variação de massa (m) em relação ao tempo (dm/dt) e é registrada em função da temperatura
ou do tempo.Nesse sentido, são técnicas úteis na caracterização para determinação de pureza e
umidade, bem como na avaliação da estabilidade e estudos cinéticos de degradação.126
52
A técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) relaciona a diferença de
energia fornecida à substância e a um material de referência, enquanto ambos são submetidos
a uma variação controlada de temperatura, de modo a fornecer informações de transições de
fase relativas aos processos endotérmicos e exotérmicos. Um gráfico da energia fornecida
pelos aquecedores é formado, possibilitando quantificar as transformações uma vez que a
compensação de calor é proporcional à energia envolvida na reação.127, 128
As medidas foram obtidas utilizando um equipamento DSC modelo Q200 V24.2 Build
107, método aquecimento/resfriamento/aquecimento, em atmosfera de nitrogênio e rampa de
5 °C/min. Entretanto, as análises térmicas referentes às nanoestruturas foram realizadas pela
técnica de TG-DSC-MS, que promove a perda de massa em função da temperatura e registra a
razão massa/carga (m/z) no modo positivo, de modo a propor o fragmento resultante. As
medidas foram realizadas utilizando a termobalança STA 409 PC Luxx para a análise
simultânea de TG-DSC, sendo este equipamento acoplado ao QMS 403C Aëolos para
detecção dos gases liberados da amostra. Ambos os equipamentos foram adquiridos da
NETZSCH. As amostras foram submetidas a uma taxa de aquecimento de 10 K.min-1 no
intervalo de temperatura de 25 a 1000 °C. Um cadinho de alumina foi utilizado nas análises e
o fluxo de gás passando pela amostra foi de 50 mL.min-1 de ar sintético, disponível no
IQ-USP.
3.1.8. Análise Dinâmica-Mecânica - DMA
A análise de DMA relaciona o comportamento visco-elástico com as propriedades
macroscópicas do material. A aplicação de uma tensão promove movimentos de
discordâncias, distorções na rede cristalina, sendo, associada à magnitude do módulo de
elasticidade, ou resistência a separação entre os átomos adjacentes, ou seja, as forças de
ligação interatômicas. À medida que o material é deformado além do regime elástico, a tensão
não é mais proporcional a deformação e ocorre uma deformação permanente, não recuperável,
ou deformação plástica.129
As propriedades mecânicas dos materiais são avaliadas a partir de uma solicitação, na
forma de uma deformação ou na aplicação de uma tensão, com o monitoramento da resposta
do material, expressa como tensão ou como deformação, respectivamente. Ensaios mecânicos
são classificados como estáticos, uma vez que se aplica ao material uma tensão ou
deformação constante, ou a taxas constantes. Estes experimentos são destrutivos, já que uma
53
de suas finalidades é a determinação de propriedades limite do material. Ainda, permite
determinar inúmeros parâmetros como o módulo de elasticidade de armazenamento (E’), as
propriedades elásticas, o módulo de elasticidade de perda (E’’), bem como as propriedades
plásticas. A análise dinâmica-mecânica foi realizada no analisador DMAQ800, no modo
tensão de tração e aplicação de força de 0,5N. As amostras foram submetidas à deformação
tensional de 750 micrometros/minutos até rompimento da membrana.
54
3.2.
Parte 1 – Síntese dos peptídeos
Os peptídeos, linear [(L-ArgL-Phe)4] e cíclico [(L-ArgD-Phe)4], utilizados neste
trabalho foram sintetizados pelo método em fase sólida, na estratégia t-Boc130 e Fmoc131,
respectivamente, sendo o aminoácido de partida acoplado a resina clorometilada Merrifield de
escala 0,9 mmol/g, como suporte sólido.132 Os acoplamentos, foram realizados de 1 a 2 horas,
com 2,5 de excesso de DIC/HOBt em DCM/DMF (1:1, v/v) e monitorados pelo teste de
Kaiser. O teste de Kaiser consiste na transferência de uma pequena alíquota do peptidil-resina
para um tubo de Duran e na adição de duas gotas das seguintes soluções: (A) ninidrina (500
mg)/n-butanol; (B) 10 mL de piridina e (C) fenol (80 g)/n-butanol (20 mL). A ninidrina é um
poderoso agente oxidante que reage com α-aminoácidos, entre pH 4 e 8, originando um
composto púrpura (Complexo de Ruhemmann), que não apresenta sempre a mesma
intensidade de coloração. Os aminoácidos prolina e hidroxiprolina são exceções: esses quando
reagem com a ninidrina apresentam a formação de um composto amarelado.133
Os reacoplamentos, quando necessários, foram realizados usando 2,5 de excesso de
TBTU, em excesso de DIEA (pH aparente entre 8,0-9,0) em DMSO/NMP (1:1, v/v), por 1
hora. Quando se fez necessário, durante a síntese em geral, foram realizados três
reacoplamentos seguidos, monitorados com teste de ninidrina. Mantendo-se positivo, a
peptidil-resina foi submetida a uma reação de acetilação com 25% de Ac2O em DMF, por 20
minutos, conforme metodologia descrita vide Tabela 2 e Tabela 3.
55
Tabela 2: Protocolo de Síntese - Estratégia t-Boc
Passos
Etapa de desproteção
1
2 X MeOH
2
3 X DCM
3
1 X 50% TFA em DCM + 0,5 mL de anisol/g de resina inicial por 20 minutos
Etapa de neutralização
4
2 X 2% anisol em isopropanol
5
2 X 10% TEA em DCM
6
2 X MeOH
7
2 X 10% TEA em DCM
8
2 X MeOH
9
3 X DCM
Teste de Ninidrina [Negativo - passo 3 // Positivo - passo 10]
Etapa de acoplamento
10
2,5 Eq. De Boc-AA e DIC/HOBt em DCM/DMF (1:1; v/v) [duração 1 a 2 horas]
11
2 X MeOH
12
2 X 10% TEA em DCM
13
2 X MeOH
14
3 X DCM
15
Teste de Ninidrina [Negativo - passo 3 // positivo - passo 16]
16
Reacoplamento - 2,5 Eq. Boc-aa + 2,5 TBTU + DIEA (pH 8-9) em DCM/NMP
(1:1;v/v) [duração 1 a 2 horas]
17
2 X MeOH
18
2 x 10% TEA em DCM
19
2 X MeOH
20
3 X DCM
21
56
Tabela 3: Protocolo de Síntese - Estratégia F-moc
Passos
Etapa de Desproteção
1
3 X MeOH
2
3 X DMF
3
1 X 20% piperidina em DMF por 20 min
4
3 X DMF
5
3 X MeOH
6
3 X DCM
7
Teste de Ninidrina [Negativo - passo 3 // positivo - passo 9]
8
5 X DMF
Etapa de acoplamento
9
2,5 eq. de Fmoc-aa + DIC/HOBt em DCM/DMF (1:1; v/v) [duração 1 a 2 horas]
10
3 X DMF
11
3 X MeOH
12
3 X DCM
13
14
Reacoplamento 2,5 eq. Fmoc-aa + 2,5 TBTU + 5,5 Eq. DIEA (pH 8-9) em
DCM/NMP (1:1; v/v) [duração 1 a 2 horas]
15
3 X DMF
16
3 X MeOH
17
3 X DCM
18
57
Os peptídeos foram clivados da resina numa reação com 70% de TFA / 20% TFMSA e
10% de ―scavengers‖ (anisol), perfazendo uma concentração de (10 mL/g de peptidil-resina).
O tempo de reação foi de 7 horas a 5 oC. Ao término da reação, o peptídeo e a resina foram
tratados com éter dietílico (destilado e armazenado em freezer à 20 oC para evitar a
solubilização do peptídeo durante esta etapa do processo). O peptídeo foi extraído da resina
com uma solução 0,1% TFA em 60% de ACN/H2O e liofilizado (Figura 25). A etapa de
ciclização do composto cíclico [(L-ArgD-Phe)4] foi realizada após a desproteção do grupo
Boc e extração da resina, sendo o peptídeo solubilizado em solução de DCM/DMF (1:1, v/v)
com excesso de HOBt e DIC sob agitação por 24 horas.
1ª ETAPA: Esterificação do Resíduo C-Terminal:
2ª ETAPA: Desproteção do Grupo Protetor (Boc)
3ª ETAPA: Neutralização do Grupo Amino:
58
4ª ETAPA: Acoplamento do Aminoácido Subsequente:
5ª ETAPA: Clivagem do Peptídeo da Resina:
Figura 25: Representação Esquemática da Síntese de Peptídeos
3.2.1. Purificação dos Peptídeosii
A purificação dos peptídeos foi realizada em um sistema de cromatografia semi
preparativo Waters, acoplado a um detector UV-Vis – modelo 2489. Os solventes utilizados
foram todos de grau HPLC e a água utilizada foi purificada em um sistema Milli-Q, da
Millipore, equipado com cartuchos para a retenção de sais e de compostos orgânicos.134 O
sistema é controlado por um software Empower Persona Single System Workstation.
As condições experimentais utilizadas foram:
Coluna:
Phenomenex C18 (21,2 x 250 mm), 300 Å, 15 m
Solventes:
A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O
ii
Gradiente:
Variável (em geral 0,33%B/min)
Fluxo:
10 mL/min
220 nm
As análises de cromatografia e espectroscopia de massa foram realizadas em colaboração com o professor
Dr. Vani Xavier de Oliveira Jr. - UFABC
59
3.3.
Parte 2 - Metodologia para obtenção de nanoestruturas peptídicas via
fase sólida-vapor
3.3.1. Obtenção das nanoestruturas para estudo morfológico e estrutural
Os sistemas nanoestruturados foram caracterizados por microscopia eletrônica de
varredura, de modo a verificar possíveis variações quanto à morfologia dos materiais obtidos.
Assim, estudos de dinâmica molecular foram realizados por meio do programa GROMACS,
modelo de solvente implícito e campo de força GROMOS 96 43a1 e GROMOS 96 43a2 para
um tempo de dinâmica de 2,5 ns, a fim de correlacionar os dados teóricos com os
experimentais obtidos por microscopia.
3.3.1.1.
Limpeza do substrato de ITO em Pet
As placas de ITO em Pet utilizado nos ensaios possuíam uma área de 1 cm2. A limpeza
foi realizada por meio da imersão dos substratos nos solventes: diclorometano, metanol,
etanol e água ultrapura, respectivamente, por 10 minutos em banho ultra-sônico. Sendo, a
secagem realizada por exposição à atmosfera de nitrogênio.
3.3.1.2.
Preparação do filme amorfo
Uma alíquota de 10 µL das soluções recém-preparadas do peptídeo linear
[(L-ArgL-Phe)4] nas concentrações de 50 mg mL-1, 100 mg mL-1 e 150 mg mL-1, e, do
peptídeo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] nas concentrações de 150 mg mL-1 foram solubilizados
em HFP, sendo posteriormente depositadas sobre os substratos de ITO em Pet, sendo os
mesmos armazenados em dessecador até secagem.
60
3.3.1.3.
Parâmetros de preparação das nanoestruturas
Os filmes amorfos preparados do peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4] foram expostos ao
vapor de diferentes solventes (anilina, água e diclorometano), de modo a promover
automontagem e, assim, a obtenção das nanoestruturas. Contudo, o filme amorfo do peptídeo
cíclico foi exposto ao vapor de anilina, uma vez que os estudos referentes às variações dos
parâmetros foram realizados ao peptídeo linear. A Tabela 4 indica os parâmetros definidos na
metodologia, como: temperatura, concentração e tempo de exposição ao vapor do solvente.
Tabela 4: Parâmetros para preparação das nanoestruturas
Temperatura
Vapor de Solvente
Concentrações
Tempo de exposição
(C)
mg/mL
ao vapor
Anilina
98
50, 100 e 150
12 – 18 horas
Água
98
50, 100 e 150
12– 18 horas
Diclorometano
35
50, 100 e 100
12 – 18 horas
3.3.1.4.
Montagem do ensaio
O sistema consiste na montagem de três ambientes equivalente, porém distintos, ou seja,
cada sistema foi preparado de forma individual em placas de petri, sendo depositada uma
alíquota de 10 mL do solvente em estudo.
Entretanto, para evitar o contato entre o substrato e os solventes, e assim promover um
sistema apropriado livre de interferentes, os substratos, com o filme amorfo do peptídeo,
foram alocados em placa de petri, de modo que o substrato permanecesse exposto somente ao
vapor do solvente, sendo posteriormente vedada com sua devida tampa. Ainda, de modo a
evitar qualquer contato com outra atmosfera, optou-se por vedar o sistema com papel
alumínio antes de colocar na estufa.93, 135-137 A Figura 26 mostra o esquema para preparação
nas nanoestruturas via fase sólida-vapor.
61
Figura 26: Ilustração esquemática do processo de obtenção das nanoestruturas utilizando a metodologia em fase
sólida-vapor
3.3.2. Metodologia de preparação dos eletrodos para estudos eletroquímicos
O método de preparação e configuração dos eletrodos influencia diretamente nas suas
propriedades condutoras e morfológicas, sendo estas refletidas na resposta eletroquímica, uma
vez que favorece quanto as aplicações como biossensores eletroquímicos.138
Assim, biossensores representam uma ferramenta promissora, devido as suas
características únicas, tais como: seletividade; baixo custo de construção e estocagem;
potencial para miniaturização; facilidade de automação e construção de equipamentos simples
e portáteis para um monitoramento rápido.139
Para a análise eletroquímica os eletrodos foram preparados com diferentes arquiteturas
em substratos de ouro e ITO. Sendo, o eletrodo de ouro funcionalizado com solução de
mercaptopiridina, de modo, a promover a ligação entre o peptídeo e o substrato de ouro.140 Já,
o eletrodo de ITO foi preparado a partir da ativação da superfície, sendo ambos substratos
seguidos da deposição do filme amorfo e posterior processo de nanoestruturação em fase
sólida-vapor. Entretanto, para o eletrodo de ITO foi depositado 10μL de solução Nafion®
(solução 5% de Nafion em metanol) sob a superfície das nanoestruturas.
62
3.3.2.1.
Limpeza dos eletrodos de ouro e vidro condutor de ITO
Nos eletrodos de ouro foram realizadas a limpeza física (que consistiu no atrito da
superfície do ouro sobre uma lixa com alumina) e posterior limpeza química, utilizando uma
célula eletroquímica (com o eletrodo de ouro como eletrodo de referência, a platina como
contra-eletrodo e o eletrodo de ECS como referência) em solução de H 2SO4 0,5 mol L-1,
aplicando um potencial de -200 mV a 1600 mV a uma velocidade de varredura de 1000 mV s1
por 100 ciclos. A segunda etapa da limpeza eletroquímica consistiu em diminuir a
velocidade de varredura para 100 mV s-1 por 10 ciclos, de modo a verificar se o perfil
eletroquímico do eletrodo de ouro estava de acordo com o relatado na literatura, se não
estivesse, todo o processo era repetido (limpeza física e química) até que conseguíssemos
visualizar o perfil eletroquímico do Au com seus respectivos pares redox.141, 142
Com relação aos eletrodos de ITO a limpeza do substrato foi realizada de forma similar
ao item 3.1.1.1., porém com prévia ativação da superfície com uma solução piranha, que
consiste em NH4OH/H2O2/H2O (1:1:5) em 80°C por 10 minutos, sendo posteriormente lavado
em água ultrapura.141, 142
3.3.2.2.
Preparação da solução de mercaptopiridina- SAM
Os eletrodos de ouro ficaram imersos em 20 mL de uma solução de concentração 100
mmol L-1 de 4-mercaptopiridina (SAM) em etanol, por um período de 12 horas. Após, os
eletrodos foram lavados com etanol e água ultrapura, e, posteriormente seco em atmosfera de
nitrogênio.143
3.3.2.3.
Preparação do filme amorfo do peptídeo para polimerização eletroquímica
Uma alíquota de 10µL de uma solução recém-preparada do peptídeo linear [(L-ArgLPhe)4] solubilizado em HFP na concentração de 150 mg mL-1 foi depositado sobre os
eletrodos de ouro e vidro de ITO, sendo o mesmo armazenado em dessecador até montagem
do ensaio.
63
3.3.2.4.
Montagem do ensaio
Foram seguidas as mesmas considerações do item 3.3.1.4., porém, com a alteração da
placa de petri para erlenmeyer vedados. Contudo, o foco do trabalho foi estudar os processos
de nanoestruturação em atmosfera de anilina, de modo a promover a polimerização da anilina
residual no sistema. A temperatura foi mantida em 98°C e o tempo de reação 18 horas.
3.3.2.5.
Polimerização eletroquímica da anilina residual
A polimerização eletroquímica foi realizada unicamente com a anilina adsorvida na
superfície do nanomaterial. Parâmetros utilizados no ensaio, velocidade de varredura: 25 mV
s-1; potencial: -200 mV a 1000 mV; número de ciclos: 20; eletrodos utilizados: ouro e ITO
(eletrodo de trabalho); platina (contra-eletrodo); ECS (eletrodo de referência); eletrólito de
suporte: H2SO4 0,5 mol L-1.144
64
3.4.
Parte 3 – Metodologia para obtenção de nanoestruturas peptídicas via
eletrofiação
O processo de eletrofiação tem despertado a atenção dos pesquisadores, devido às
vantagens de adicionar nanomateriais aos polímeros e promover melhoras substanciais das
propriedades, bem como a obtenção de fibras de diâmetro nanométrico.145Ainda, a aplicação
das membranas eletrofiadas (mantas) são dependentes do polímero selecionado como matriz,
pois sendo um biomaterial apresentam a capacidade de interagir com o organismo.145, 146
3.4.1. Preparo das soluções
Inicialmente, foram preparadas soluções fracionadas do peptídeo L-difenilalanina em
HFP nas concentrações de 100 mg mL-1, de modo a promover amostras com 2,5%, 5,0%,
7,5%, 10% e 15% de peptídeo pré-diluído em solução de 8% de poli(ε-caprolactona), este présolubilizado em clorofórmio/metanol (1: 3 v/v), perfazendo soluções resultantes de 15 mL. As
amostras foram mantidas sob agitação constante à temperatura de 60°C por 5h, conforme
valores descritos na Tabela 5.
Tabela 5: Parâmetros de preparação das soluções eletrofiadas
Concentrações
(%)
2,50
5,00
7,50
10,00
15,00
Peptídeo
(g)
0,03
0,06
0,09
0,12
0,18
HFP
(μL)
300
600
900
1200
1800
HFP
(mL)
0,30
0,60
0,90
1,20
1,80
PCL
(g)
1,20
1,20
1,20
1,20
1,20
Metanol Clorofórmio Solução
(mL)
(mL)
final
3,68
11,03
15,00
3,60
10,80
15,00
3,53
10,58
15,00
3,45
10,35
15,00
3,30
9,90
15,00
3.4.2. Montagem do ensaio
A eletrofiação (obtenção das nanofibras) foi realizada utilizando-se um sistema
constituído por uma fonte de alta tensão, um coletor constituído por uma placa de aço,
recoberta com folha de alumínio, sob aterramento e um capilar (Figura 27). O capilar consiste
de uma seringa de vidro (sem o êmbolo) de 20 mL, com agulha do tipo Hamilton de diâmetro
de 1,5 mm e comprimento de 30 mm.
65
A eletrofiação foi realizada utilizando-se as soluções de L-difenilalanina em poli(εcaprolactona) nas concentrações estabelecidas. As amostras foram eletrofiadas na tensão de
17 kV, com tempo de processamento (coleta das membranas) de 1 hora, sendo à distância de
trabalho entre a ponta da agulha e o coletor de 15 cm.
Figura 27: Processo de obtenção das nanoestruturas utilizando a metodologia de eletrofiação
66
Capítulo 4- Resultados e Discussão
As análises e discussões dos resultados foram separados em três etapas principais,
conforme capítulo de materiais e métodos, sendo que a primeira etapa voltada à síntese dos
peptídeos: linear [(L-ArgL-Phe)4] e cíclico [(L-ArgD-Phe)4]. A segunda consistiu na
preparação das nanoestruturas via fase sólida-vapor, bem como investigação das propriedades
condutoras do nanomaterial. A terceira etapa abrange o estudo da preparação de
nanocompósitos baseados na matriz polimérica poli(ε-caprolactona) intercalada com NT-FF
via eletrofiação. As caracterizações foram realizadas utilizando as técnicas: cromatografia
líquida espectroscopia de massa, microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia FTIR,
espectroscopia Raman, propriedades mecânica e eletroquímica.
4.1.
Parte 1- Síntese dos peptídeos
A síntese em fase sólida dos análogos linear [(L-ArgL-Phe)4] via estratégia t-Boc e
cíclico [(L-ArgD-Phe)4] via estratégia Fmoc foram bem sucedidas, fazendo-se necessários
25% de reacoplamentos para obtenção da sequência desejada. A purificação dos peptídeos foi
realizada em HPLC semi-preparativo, em única etapa, sendo utilizado o sistema de solventes:
A: 0,1% TFA/H2O e B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O. Na etapa de purificação, os peptídeos
eluídos da coluna cromatográfica foram coletados separadamente em tubos de ensaio
numerados. Para a obtenção de frações com alto teor de pureza, os tubos foram analisados em
HPLC analítico, utilizando um gradiente de 5-95%B/30min e selecionados. Após essa seleção
as amostras, com alto grau de pureza, foram agrupadas e transferidas para um balão de fundo
redondo, sendo concentradas e liofilizadas. A caracterização dos peptídeos foi realizada por
HPLC analítico e por espectrometria de massas (LC/ESI-MS).
A síntese do análogo linear [(L-ArgL-Phe)4] referente à amostra bruta, revelou a
presença de diversos componentes, porém, o pico de retenção observado em 15,98 minutos
indica o peptídeo como componente majoritário, sendo os demais picos correspondentes aos
subprodutos da síntese, para o qual apresentamos o perfil cromatográfico e o espectro de
massas obtido antes da purificação (Figura 28 e Figura 29). No entanto, com base nos dados
apresentados foi selecionada a fração A (maior índice de pureza), correspondente ao pico de
maior intensidade representado o espectro de massa após purificação (Figura 30), que de
67
acordo a relação m/z indica a presença peptídeo referente ao pico em MM+H = 1273 g/mol e
suas respectivas fragmentações. Logo, para a composição da sequência aminoácidos em
questão a massa molar obtidas corrobora com os valores teóricos encontrados, sendo o valor
teórico de MM+H = 1274 g/mol para o composto acetilado.
a)
b)
Figura 28: (a) espectro de massa e (b) cromatograma do análogo [(L-ArgL-Phe)4] bruto. Os perfis em
LC/ESI-MS foram obtidos nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5
μm; Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30
minutos; Fluxo: 0,4 mL/min; λ = 190-300 nm; Volume de injeção: 30 μL; Concentração da amostra: 1,0 mg/mL
e Intervalo de massas: 500-3930 Daltons.
68
Figura 29: Espectro de massas dos materiais obtidos durante a síntese do análogo [(L-ArgL-Phe)4] referentes
aos tempos de retenção apresentados na Figura 36(a).
69
Figura 30:Espectro de massa do análogo linear [(L-ArgL-Phe)4] obtido após purificação. O perfil em LC/ESIMS foi obtido nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 μm; Sistema de
solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA em 60%ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30 minutos; Fluxo:
0,4 mL/min; λ = 190-300 nm; Volume de injeção: 30 μL; Concentração da amostra: 1,0 mg/mL e Intervalo de
massas: 500-3930 Daltons.
A síntese do análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] revelou a presença de diversos
componentes, porém, a análise detalhada mostra dois picos com tempos de retenção de 13,38
e 14,03 minutos relacionados a obtenção de dois compostos, ou seja, indica a formação de
duas sequências, linear e cíclica, respectivamente, para o qual apresentamos o perfil
cromatográfico e o espectro de massas do peptídeo bruto, obtido antes da purificação (Figura
31 e Figura 32). Entretanto, com base nos dados apresentados os compostos foram
purificados, sendo selecionada a fração A (maior índice de pureza) corresponde aos picos de
maior intensidade, vide os perfis cromatográficos e espectro de massa após purificação
70
(Figura 33 e Figura 34), porém, devido os picos estarem com tempo de retenção muito
próximo a alíquota foi separada contendo os dois compostos. Assim de acordo a relação m/z
foi possível confirmar a presença dos peptídeos, linear e cíclico, referente aos picos em
MM+H=1231 e MM+H=1344, respectivamente, sendo que os valores corroboram com os
cálculos teóricos, sendo MM+H=1231 e MM+H=1344, respectivamente. Logo, o que difere
entre os análogos refere-se ao número de hidrogênios e a presença do grupo tosil a cadeia
lateral pertencente à estrutura do peptídeo.
Figura 31: (a) Espectro de massa e (b) cromatograma do análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] bruto. Os perfis em
LC/ESI-MS foram obtidos nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5
μm; Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30
71
.
Figura 32:Espectro de massas dos materiais obtidos durante a síntese do análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] dos
tempos de retenção apresentados na Figura 39(a).
72
Figura 33:Cromatograma do Análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] purificado. As condições cromatográficas
foram: Coluna: Supelcosil C18 (4,6 x 150 mm), 60 Å, 5 μm; Sistema de solventes: A: 0,1%TFA/H2O e B: 0,1%
TFA em 60% ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 20 minutos. Fluxo: 1,0 mL/min. λ = 220 nm. Volume de
injeção: 50 μL e concentração da amostra 1,0 mg/mL.
73
Figura 34:Espectro de massa obtido do análogo cíclico [(L-ArgD-Phe)4] após purificação. O perfil em
LC/ESI-MS foi obtido nas seguintes condições: Coluna: Waters Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 μm;
Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O, B: 0,1% TFA em 60%ACN/H2O; Gradiente: 5-95% de B em 30
74
4.2.
Parte 2- Preparação das nanoestruturas via fase sólida-vapor
referente aos peptídeos linear e cíclico
4.2.1. Estudo morfológico do processo de crescimento das nanoestruturas peptídicas
A busca por mecanismos de automontagem molecular abrange a preparação de novos
sistemas supramoleculares biocompatíveis para aplicação biotecnológica. Assim, o estudo
molecular de compostos peptídicos, bem como o desenvolvimento por sistemas
nanoestruturados vem contribuindo com a pesquisa biomédica, uma vez que são sistemas de
alta reatividade e biocompatíveis. Logo, a investigação por técnicas de preparação são
essenciais, pois podem promover variações morfológicas e diferentes propriedades ao
material. Nesse sentido, o estudo detalhado da técnica empregada torna-se fundamental, uma
vez que variações relativas aos processos de preparação (concentração, pH, presença
temperatura, pressão, e etc) vem demonstrando diferentes morfologias.147, 148
Dentro deste contexto, o presente pesquisa abrange o estudo da variação dos parâmetros
(solvente, concentração da solução precursora do filme amorfo e tempo de exposição ao
vapor) no processo de nanoestruturação do peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4] via metodologia
em fase sólida-vapor, para a partir desses resultados, estabelecer as melhores condições para a
automontagem dos compostos cíclicos [(L-ArgD-Phe)4].
4.2.1.1.
Crescimento das nanoestruturas para o peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4] Parâmetros que interferem na nanoestruturação
O crescimento das nanoestruturas foi realizado por automontagem (fase sólida-vapor)
na presença de vapor de água, anilina e diclorometano. Dessa forma, optou-se por tais
solventes devido à influência de sua polaridade e constante dielétrica, que poderiam promover
variações morfológicas do material nanoestruturado ao relacionar com a estrutura molecular
do peptídeo. Ao observar a estrutura molecular do peptídeo carregado positivamente
observamos na cadeia lateral o grupo guanidino, com pKa de 12,48, protonado. No entanto, a
carga positiva encontra-se deslocalizada devido à presença de um sistema de ressonância
entre as ligações duplas e os átomos de nitrogênio. Ainda, o grupo guanidino pode estabelecer
75
ligações de hidrogênio entre as moléculas peptídicas, sendo este um fato predominante para a
conformação molecular.149 A Figura 35 mostra a geometria da molécula do peptídeo
otimizada por dinâmica molecular.
O
NH
+
H3N
NH
O
-
HN
NH
O
NH
NH
NH
O
O
+
NH3
NH
HN
O
+
O
NH3
NH
NH
O
O
HN
+
H3N
NH
NH
HN
+
NH3
iii
Figura 35: Geometria otimizada por dinâmica molecular da molécula do peptídeo
Inicialmente, foram preparados filmes amorfos, de modo a verificar a influência do HFP
na nanoestrutura, bem como a influência da concentração da solução do peptídeo, de modo a
investigar se o aumento da concentração favoreceria o processo de nucleação e crescimento
de nanoestruturas nas concentrações de 50 mg mL1 (Figura 36a.) 100 mg mL1 (Figura 36b) e
150 mg mL1 (Figura 36c). As imagens de microscopia do filme amorfo revelaram a
distribuição homogênea do material na superfície do substrato, que sugere a formação de
nanoestruturas em toda a área recoberta.
iii
Os estudos de dinâmica molecular foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Luiz Scott -UFABC
76
(a)
(b)
(c)
Figura 36: Imagens de microscopia (MEV) mostrando a morfologia do filme amorfo sobre o substrato de ITO
em Pet. (a) 50 mg mL-1 (b) 100 mg mL-1 e (c) 150 mg mL-1
Nesse sentido, a partir desses resultados, iniciou-se o estudo da variação dos parâmetros
referentes à concentração e tempo de exposição ao vapor dos solventes (anilina,
diclorometano e água), de modo a verificar possíveis influências nos processos de
automontagem das nanoestruturas. Desta forma, o ensaio foi realizado com solução
precursora do peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4] na concentração de 50 mg mL1, sendo
exposto ao vapor de diclorometano à 35 °C, vapor de água e anilina à 98 °C por 12 horas.
Neste caso, não foi possível observar a formação de nanoestruturas na superfície do substrato,
devido à baixa concentração do precursor.
Deste modo, promovemos variações referentes à concentração da solução precursora
para concentração de 100 mg mL-1 e tempo de exposição ao vapor fixado por 12 horas para os
três sistemas de solventes. Sendo possível observar para vapor de anilina (Figura 37a), e,
vapor de diclorometano (Figura 37b) pontos de nucleação com princípio de auto-organização
77
do filme amorfo e formação do material nanoestruturado, porém, em vapor de água (Figura
37c) não foi possível observar a formação de nanoestruturas, para o tempo de exposição e
concentração mencionadas, o qual apresentou a formação de aglomerados.
(b)
(a)
(c)
Figura 37: Imagens de microscopia (MEV) de nanoestruturas preparadas em fase-sólida vapor à concentração
de 100 mg mL-1 por 12 horas (a) vapor de anilina, (b) vapor de diclorometano e (c) vapor de água.
No entanto, mantendo-se a concentração constante (100 mg mL-1) e variando o tempo de
exposição ao vapor do solvente para 18 horas foi observado para os três sistemas de solvente
um aumento na quantidade de nanoestruturas formadas na superfície do substratos, bem como
uma maior definição na morfologia material nanoestruturado em vapor de anilina (Figura 38a)
e diclorometano (Figura 38b), com formação de nanoestruturas do tipo fitas com dimensões
nanométricas. Ainda, foi possível observar o princípio da automontagem das nanoestruturas
para o vapor de água. (Figura 38c).
78
(a)
(b)
(c)
Figura 38: Imagens microscopia (MEV) de nanoestruturas preparadas em fase-sólida vapor à concentração de
100 mg mL-1 com 18 horas (a) vapor de anilina, (b) vapor de diclorometano e (c) vapor de água.
Por outro lado, mantendo-se o tempo de exposição ao solvente constante (18 horas) e
variando-se a concentração da solução precursora do peptídeo na superfície do substrato de
ITO em Pet, observamos variações quanto à morfologia dos filmes nanoestruturados para os
três sistemas de solventes. Os resultados revelaram um recobrimento homogêneo da
superfície, bem como uma maior dispersão do material para os três sistemas de solventes.
Sendo para vapor de anilina e diclorometano possível verificar que as nanoestruturas estão
agregadas e entrelaçadas entre si, de modo a formar um tipo de rede que possibilita o
recobrimento total do substrato, e sugere uma morfologia do tipo nanofitas (Figura 39a e
Figura 39b).
79
(a)
(a)
(a)
(a)
(b)
(b)
80
(b)
(b)
Figura 39: Imagens de microscopia (MEV) de nanoestruturas preparadas em fase-sólida vapor à concentração
de 150 mg mL-1 com 18 horas (a) vapor de anilina e (b) vapor de diclorometano
Outro fato importante analisado sugere que o aumento da concentração da solução
precursora favoreceu os processos de automontagem referentes às nanoestruturas em vapor de
água, sendo possível observar a morfologia na forma de nanofitas, porém orientadas em
relação à aplicação de um campo elétrico (devido ao feixe de elétrons - microscópio),
conforme apresentado na Figura 40. Entretanto, podemos associar a morfologia agregada,
para vapor de anilina e diclorometano, e, desagregada, para vapor de água, aos valores de
constantes dielétricas dos solventes, ou seja, o sistema nanoestruturado que apresentou
agregação possui baixos valores de constantes dielétricas, sendo ε = 6,0, para vapor de
anilina, e, ε =9,1, para diclorometano, que sugere este um fator predominante.
No entanto, para o sistema nanoestruturado em vapor de água a desagregação pode ser
relacionada à alta constante dielétrica da água, em torno de 80, bem como a alta polaridade da
molécula, que sugere a influência do solvente sobre as cargas positivas presentes na estrutura
do peptídeo, de modo a promover certa repulsão iônica ao sistema, e assim, reduzir a
intensidade os agregados. Além disso, o fato da molécula de água ser altamente polar
apresenta a capacidade de orientação em relação ao um determinado campo eletromagnético.
Um trabalho que menciona a influência da constante dielétrica foi proposto por Demirel e
colaboradores, os autores observaram variações morfológicas das nanoestruturas de
L-difenilalanina em vapor de etanol (nanotubos) e acetona (esferas), e, relacionaram ao efeito
solvente.94
81
82
Figura 40: Imagens de microscopia (MEV) de nanoestruturas por síntese em fase-sólida vapor à concentração
de 150 mg mL-1 com 18 horas para vapor de água.
Associamos à morfologia (tipo nanofitas) a influência significativa das ligações de
hidrogênio entre as moléculas peptídicas, que com a automontagem promovem um sistema
organizado e altamente ordenado. No entanto, tais resultados contestam os estudos propostos
por Hamley e colaboradores,27 que mencionam a organização estrutural de estruturas
hidrofóbicas e/ou carregadas positivamente de forma desordenada, e não organizada.
Nesse sentido, a organização estrutural, bem como o tipo da morfologia (nanofitas)
corroboram com os estudos preliminares de dinâmica molecular realizados, que revelaram
estruturas análogas às folhas-β, relacionadas à estrutura secundária encontradas em proteínas,
sendo o processo de organização molecular dirigido por meio de interações intermoleculares
do tipo ligações de hidrogênio (Figura 41). Logo, a interação do solvente com a estrutura
molecular deve-se as cargas presentes, ou seja, a polaridade do solvente. Os cálculos
realizados sugeriram um balanço energético para o sistema de 90 ligações de hidrogênio para
que a nanoestrutura torna-se estável (Figura 42).iv
iv
Os estudos de dinâmica molecular foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Luiz Fernando Scott
UFABC
83
Figura 41: Estrutura química da nanoestrutura peptídica de [(L-Arg…L-Phe)4] .por dinâmica molecular
Figura 42:Gráfico indicativo da quantidade de ligações de hidrogênio em relação ao tempo de automontagem.
84
Ainda, as imagens de microscopia mostraram o diâmetro das arquiteturas na escala
nano, em torno de 62,27 nm para vapor de anilina (Figura 43a), 71,03 nm para vapor de
diclorometano (Figura 43b) e 139,50 nm para vapor de água (Figura 43c), que apresenta um
tamanho muito menor quando comparado a mesma metodologia utilizando o peptídeo
L-difenilalanina, que apresenta dimensões na ordem de alguns mícrons. Nesse sentido,
observamos que nos três sistemas de solventes prevalece o tipo de morfologia (nanofitas),
porém com possíveis variações de orientação, provavelmente devido ao processo de
automontagem e interação entre as cadeias orgânicas relacionadas à constante dielétrica, que
promoveu variações quanto à agregação das estruturas na superfície do substrato.
Assim, a partir dos resultados expostos referentes à otimização do sistema, sugere-se a
concentração de 150 mg mL-1 indicada para a fabricação de nanoestruturas baseadas na
metodologia fase sólida-vapor para composto peptídico linear [(L-ArgL-Phe)4], uma vez que
promove maior quantidade de nanoestruturas formadas, escala nanométrica e maior
homogeneidade do filme. Entretanto, foi realizado o estudo relativo à distribuição de tamanho
das nanoestruturas referentes ao diâmetro em relação aos vapores de solvente, sendo
apresentados na Figura 43.
Vapor de anilina
a)
40
Média= 62,27 nm
35
Frequência
30
25
20
15
10
5
0
40
50
60
70
80
Diâmetro - nm
Vapor de Diclorometano
b)
Média= 71,03 nm
25
Frequência
20
15
10
5
0
50
60
70
Diâmetro - nm
80
90
85
Vapor de Agua
c)
35
Média=139,50 nm
30
Frequência
25
20
15
10
5
0
100
120
140
160
180
Diâmetro - nm
Figura 43: Histogramas relativos às nanoestruturas em vapor de (a) anilina, (b) diclorometano e (c) água
A análise estatística referente aos histogramas foi realizada sobre uma população de 100
partículas para cada vapor de solvente (anilina, diclorometano e água). Os resultados
indicaram um baixo desvio padrão relativos à distribuição de valores relacionados à média,
interpretados como boa homogeneidade e baixa variação dos diâmetros das nanoestruturas.
Além disso, analisamos os valores mínimos e máximos referentes aos limites de especificação
para o material preparado nas mesmas condições e parâmetros, Tabela 6.
Ainda, as imagens de microscopia revelaram a configuração do material entre as
fissuras do filme. Sendo observado que o crescimento das nanoestruturas é organizado em
camadas, de modo a promover um sistema livre de defeitos, homogêneo e espessura em torno
de 450 mícrons, conforme apresentado na Figura 44.
Tabela 6: Resultados de análise quantitativa referente aos diâmetros dos histogramas
Análise quantitativa
Vapor de anilina
Vapor de DCM
Vapor de água
Desvio padrão
7,23
8,02
1,46
Média
62,27
71,03
139,50
54,09
63,15
124,74
69,37
79,18
154,06
Valor mínimo especificado
Valor máximo especificado
86
450 μ
Figura 44: Imagens microscopia relativas a fissura do filme
Além disso, foram realizados estudos térmicos para as amostras do material
nanoestruturado pela técnica de TG-DTG-MS de acordo a razão massa/carga. A Figura 45
mostra o termograma das curvas sobrepostas de TGA e sua derivada (DTG) das amostras
após o tratamento térmico para os três sistemas de solventes, sendo os resultados referentes à
perda de massa (expressa em porcentagem) em função da temperatura.
Analisando as curvas fornecidas por TG/DTG (Figura 45) observam-se três pontos de
decomposição térmica, sendo o primeiro ponto analisado no intervalo de temperatura em
240°C, que ocorreu uma diminuição expressiva na massa em relação à porcentagem. No caso
do segundo ponto de decomposição, a 325°C, mostra uma menor perda de massa em relação
ao primeiro ponto. Com relação ao terceiro ponto de decomposição, a 440°C, a perda de
massa foi relativamente menor relacionado ao primeiro e segundo pontos. Assim, sugere-se
que o perfil de degradação térmica para os três sistemas de solventes (anilina diclorometano e
água) estejam relacionados ao número de ligações químicas intermoleculares existentes na
estrutura química da molécula.
87
Figura 45: Curvas TG/DTG em ar atmosférico, rampa de aquecimento de 5 °C/min, e temperatura inicial de
25°C a 600 °
Ainda, os resultados revelaram um patamar de estabilidade térmica à aproximadamente
100°C, e uma leve degradação térmica em aproximadamente 120°C, que poderia estar
relacionada à perda de água relativa às nanoestruturas. Entretanto, estudos teóricos sugerem
como o início da degradação térmica referente ao material nanoestruturado.
Neste contexto, foi realizado o estudo morfológico e térmico microscópico relativo aos
filmes nanoestruturados em vapor de anilina em concentração de 150 mg mL-1 por 18 horas
em substrato de ouro, de modo a avaliar a influência do calor no processo de degradação da
nanoestrutura. Assim, o sistema nanoestruturado foi submetido à temperatura constante de
120°C por um período de 6 horas, sendo posteriormente resfriado. Os resultados de
microscopia mostraram a parcial degradação do filme, sendo que estes corroboram com o
estudo teórico, Figura 46.
88
Figura 46: Estudo da degradação térmica por dinâmica molecular para nanoestrutura em vapor de anilina
A análise dos dados referentes aos gráficos de TG-MS para as nanoestruturas nos três
sistemas de solventes (anilina diclorometano e água) expõem possíveis relações entre os picos
de degradação, a 240°C, e, seus respectivos fragmentos, Figura 47, os quais se notam
processos semelhantes de liberação para os compostos fragmentados. Logo, sugere-se a
relação m/z para os compostos degradados e identificados por MS, sendo atribuídos os
valores de m/z =18 (H2O - água); m/z = 44 (grupo carboxílico); m/z = 48 (grupo dos ácidos
monocarboxílicos); m/z =50 e 51 (C6H6, anel benzeno); e m/z =64 (derivados do ácido
carboxílico) e m/z = 69 (íon C3HO2). Tais compostos corroboram com a estrutura do peptídeo
(vide Figura 38), bem como sugere a interação da nanoestrutura e o solvente.
No entanto, ao analisar os gráficos para os três sistemas de solventes relativos à
TG-MS, Figura 47, e, ao relacionar com o estudo de degradação térmica por dinâmica
molecular (vide Figura 46) para o sistema nanoestruturado em vapor de anilina, observamos
em aproximadamente 120°C um leve pico de degradação térmica, relativa à TG e respectivas
ao MS referentes à hidratação, porém na ausência de liberação de matéria orgânica, ou seja,
sem liberação de fragmentos. Assim, pode-se sugerir a influência da molécula de água no
processo de nanoestruturação, uma vez que a degradação térmica em 120°C proposto
teoricamente refere-se à saída de água, que por sua vez apresenta papel fundamental de
estabilização da nanoestrutura que corrobora com as imagens de microscopia. No entanto,
vale ressaltar para os três sistemas de solventes que os picos relativos às saídas de moléculas
de água, em faixas de temperatura acima de 120°C, referem-se à liberação de moléculas de
CO2 e H2O provenientes da degradação térmica de compostos orgânicos.
89
a)
b)
90
c)
Figura 47: Relação m/z para os fragmentos em vapor de (a) anilina, (b) diclorometano e (c) água
4.2.2. Estudo espectroscópico das nanoestruturas do peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4]
As amostras nanoestruturadas foram estudadas por espectroscopia vibracional (FTIR),
sendo observado um perfil espectral semelhante para cada vapor de solvente (anilina,
diclorometano e água), que indica sistemas de estruturas análogas, e, corroboram com os
resultados de microscopia que revelaram mesma morfologia. No entanto, a atribuição
espectral ao filme amorfo indica bandas intensas na região de 1658 cm-1 relacionada à
deformação angular do grupo guanidino, conforme apresentado na Figura 48. Os espectros do
material nanoestruturados estão apresentados na Figura 49 (vapor de anilina), Figura 50
(vapor de água) e Figura 51 (vapor de diclorometano), sendo as atribuições referentes aos
modos vibracionais apresentados na Tabela 7.
De um modo geral para os três sistemas de solvente (anilina, água e diclorometano), o
estudo vibracional na região referente à banda amida-A (estiramento N-H) ocorre à
diminuição no comprimento de onda de 3290 cm-1 (filme amorfo), para 3276 cm-1 (material
nanoestruturado), que pode ser associado às interações entre as ligações amida.150, 151 Ainda,
nota-se a diminuição da intensidade em 1658 cm-1 relacionado à vibração C=O provenientes
das ligações amidas, e, o aumento da intensidade em 1623 cm-1 relativa à deformação angular
simétrica dos íons guanidino (CN3H5+) presentes na cadeia lateral do aminoácido arginina.152
91
Assim, tais variações podem ser associadas às possíveis mudanças estruturais relativas
ao filme amorfo e o material nanoestruturado, uma vez que ao analisar os espectros
sobrepostos (Figura 52) nota-se que o pico referente ao material amorfo é assimétrico, e,
apresenta um pico por volta de 1623 cm-1, que implica em um aumento de intensidade, já que
ambas as vibrações já estavam presentes. Neste caso, a inversão de intensidade pode estar
relacionada à maior repulsão entre as cadeias laterais da arginina após a formação da
nanoestrutura. 152, 153 Por fim, ocorre a diminuição da intensidade de todos os picos na região
entre 1050 a 1300 cm-1, correspondente a vibração da maioria dos grupos polares referentes
ao íon carboxilato (COO-), a ligação C=O, e, a ligação C-N,154 o qual percebe-se a
diminuição da intensidade relativa as bandas com baixa variação de freqüência.
Filme Amorfo
1178
1658
1099
Absorbância (u.a)
1130
1259
1535
700
1027
684
640
3290
3214 3347
1282
723 840
892
1376
2937
1440
802
500
1000
1500
3000
3500
4000
Número de Onda
Figura 48: Espectro de infravermelho do filme amorfo, ou seja, do material sem ser nanoestruturado.
92
1623
Vapor de Anilina
3276
Absorbância (u.a.)
1658
1180
1132
1199
1249
1029
696
742
721
638
800840 952
916
500
1527
1440
1000
1500
3000
3500
4000
-1
Número de Onda (cm )
Figura 49: Espectros de Infravermelho do nanomaterial obtido utilizando vapor de anilina a 98°C por 18 horas.
Vapor de Água
1621
Absorbância (u.a.)
3276
1658
1184
1133
1201
1535
1278
1247
696
1029
1440
1398
638 721
744
798 840
916
500
1000
1500
3000
3500
4000
-1
Figura 50: Espectro de Infravermelho do nanomaterial obtido utilizando vapor de água a 98°C por 18 horas.
93
Vapor de Diclorometano
1623
3280
Absorbância (u.a.)
1658
1182
1132
1029
1527
1251
1440
696
640 721
800838
914
500
1000
1500
3000
3500
4000
-1
Figura 51: Espectro de infravermelho do nanomaterial obtido utilizando vapor de diclorometano à 35°C por 18
horas
Absorbância (u.a.)
Filme Amorfo
Vapor de Água
Vapor de Anilina
Vapor de DCM
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
Figura 52: Espectros de infravermelho de todos os materiais nanoestruturas obtido sobrepostos de modo a
verificar as variações entre eles.
94
Tabela 7: Atribuição dos modos vibracionais referentes aos espectros
Número de
Número de
-1
-1
Número de Onda
Onda (cm )
Onda (cm )
(cm-1) Vapor de
Vapor de água
Vapor de DCM
Anilina
696
696
696
721
721
721
744
-
742
798/840
800/838
800/840
1029
1029
1029
1133
1132
1132
1184/1247
1182/1251
1180/1249
Deformação angular CO2-
1201/1278
-
1199/1270
Estiramento C=O
1398
-
-
1440
1440
1440
1535
1527
1527
1621
1623
1623
1658
1658
1658
3276
3280
3276
Modo Vibracional
Deformação angular C=C
anel aromático
Deformação angular simétrica
N-H
Deformação angular
assimétrica fora do plano C-H
fora do plano N-H
Deformação angular
simétrica CH2
Estiramento C-N amina
secundária (guanidino)
Deformação axial simétrica
C=O
Deformação angular C-O
Deformação angular N-H
(banda amida II)
N3H5+ (guanidino)
Estiramento C=O
(banda amida I)
Estiramento N+-H
(banda amida A)
95
4.2.3. Estudo eletroquímico: eletropolimerização da anilina residual
As nanoestruturas obtidas a partir de biomoléculas são bastantes atrativas devido à
habilidade para reconhecimento molecular e facilidade para modificação química, fatores
necessários para diversas aplicações de interesse. No entanto, são materiais considerados
isolantes com band gap de 4 eV.89 Deste modo, a funcionalização desses materiais facilita o
estudo em sistemas de biossensoriamento, atividade catalítica e reconhecimento molecular,155
pois aprimoram a preparação de dispositivos de tamanho nanométrico com propriedades
eletrônicas, químicas e físicas sofisticadas.156
Nesse sentido, investigamos o processo redox das nanoestruturas crescidas em vapor de
anilina, de modo a verificar a habilidade de eletropolimerização quanto à anilina residual
adsorvida, bem como promover condutividade ao material isolante, e assim, gerar uma
possibilidade de aplicação ao nanomaterial quanto a sistemas de biossensoriamento. Assim,
estudamos as propriedades de eletroatividade referente à PANI por voltametria cíclica, por ser
um composto relativamente estudado de propriedades conhecidas, uma vez que seu
voltamograma característico apresenta dois pares redox na faixa de 200 mV a 1000 mV (vs
ECS) conforme ilustrado na Figura 53. O primeiro pico na região anódica corresponde à
oxidação da leucoesmeraldina ao sal esmeraldina, o segundo pico corresponde a oxidação da
base esmeraldina à pernigranilina (estado totalmente oxidado da PANI), sendo o processo
redox acompanhado por mudança na coloração.157, 158, 159
Figura 53: Voltamograma característico da PANI com as respectivas mudanças de cor, de acordo com suas
respectivas reações redox.157
Assim, os nanomateriais utilizados nessas caracterizações foram obtidos por meio de
uma solução precursora do peptídeo linear [(L-ArgL-Phe)4] na concentração de 150 mg
96
mL1 em vapor de anilina por 18 horas, a 98 °C. A eletropolimerização foi realizada na
presença de anilina residual adsorvida nas nanoestruturas, de modo a investigar as
propriedades condutoras do material nas duas diferentes arquiteturas: ouro modificado com
monocamada de tiol e ITO com polímero condutor Nafion®.
A eletropolimerização eletroquímica foi realizada em ambos os eletrodos por
voltametria cíclica. Os resultados indicaram os relativos pares redox referentes à oxidação do
monômero, porém, sugere a formação de um possível oligômero de PANI relacionado à
reação de oxi-redução da anilina,160 Figura 54a (eletrodo de ouro) e Figura 55a (eletrodo de
ITO). Ainda, as imagens de microscopia revelaram a deposição homogênea da PANI sobre a
superfície dos eletrodos, bem como estruturas orientadas devido à possível interação do
material com a superfície do substrato, conforme Figura 54b (eletrodo de ouro) e Figura 55b
(eletrodo de ITO). Além disso, podem-se observar os perfis dos voltamogramas apresentados
na Figura 54c (eletrodo de ouro) e Figura 55c (eletrodo de ITO). A Figura 56 apresenta os
perfis sobrepostos dos eletrodos com seu relativo par redox referente à polimerização da
anilina residual, que indicam haver transferência eletrônica em ambas as arquiteturas
relacionadas às áreas geométricas.
97
Polimerizaçao eletroquimica da anilina residual - Eletrodo de ouro
a)
Pico 1
6
20° ciclo
Pico 2
i/A
4
2
1° ciclo
0
-2
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E/V vs ECS
b)
c)
Perfil - eletrodo de ouro
10
i/A
5
0
-5
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E/V vs ECS
Figura 54: a) Voltamograma relativos à eletropolimerização da anilina sobre as nanoestruturas do peptídeo /[(LArg…L-Phe)4] na concentração de 150 mg mL1 crescido em vapor de anilina por 18 horas a 98 °C, b) imagens
de microscopia (MEV) após polimerização química da anilina; c) perfil do voltamograma após polimerização.
VC com a resposta eletroquímica do filme mostrado no MEV após 100 ciclos em solução de H2SO4 0,5 mol L1
e v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodo de trabalho Au/SAM/ nanoestruturas [(LArg…L-Phe)4].
98
Polimerizaçao eletroquimica da anilina residual - Eletrodo de ITO
Pico 2
Pico 1
a)
8
20°ciclo
6
i/A
4
2
0
1°ciclo
-2
-4
-6
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E/ V vs ECS
Perfil - eletrodo de ITO
b)
c)
8
6
4
i/A
2
0
-2
-4
-6
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E/ vs ECS
Figura 55: a) Voltamograma relativos à eletropolimerização da anilina sobre as nanoestruturas do peptídeo /[(LArg…L-Phe)4] na concentração de 150 mg mL1 crescido em vapor de anilina por 18 horas a 98 °C, b) imagens
de microscopia (MEV) após polimerização química da anilina; c) perfil do voltamograma após polimerização.
VC com a resposta eletroquímica do filme mostrado no MEV após 100 ciclos em solução de H 2SO4 0,5 mol L1
e v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodo de trabalho ITO/ nanoestruturas [(L-Arg…LPhe)4]/Nafion®.
99
Voltamogramas dos perfis sobrepostos
i/ A
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
-2
-2
-4
-4
-6
Eletrodo ouro
Eletrodo ITO
-6
-0,5
i/A
10
12
0,0
0,5
-8
1,0
E/V vs ECS
Figura 56: Medidas de voltametria cíclica para os eletrodos modificados nas superfícies de ouro (0,071 cm 2) e
ITO (1 cm2) na concentração de 150 mg mL1 crescido em vapor de anilina por 18 horas a 98 °C em solução de
H2SO4 0,5 mol L1 e v = 25 mV s1, no potencial de 200 mV a 1000 mV e eletrodos de trabalho Au/SAM/
nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/ PANI e ITO/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/Nafion®/PANI.
O estudo eletroquímico descreve os fenômenos que ocorrem na interface de um
condutor eletrônico, o eletrodo, com um condutor iônico, o eletrólito. Deste modo, dois
processos complementares ocorrem durante uma reação eletroquímica: a transferência de
carga elétrica na interface eletrodo/eletrólito e o transporte de massa das espécies redox dentro
do eletrólito, que pode acontecer por difusão, convecção ou migração.161
Logo, os voltamogramas em diferentes velocidades de varredura referentes aos
eletrodos de ouro e ITO (Figura 57a e Figura 58a) indicam o transporte de massa da espécie
eletroativa do seio da solução junto à superfície do eletrodo. Entretanto, em ambos os casos,
notou-se o aumento da corrente em função da velocidade de varredura. Na análise do
comportamento da corrente de pico em função da velocidade de varredura (Figura 57b e
Figura 58b) observa-se que a corrente varia linearmente em função da raiz quadrada da
velocidade de varredura,162 sugerindo que em ambos os casos o transporte de massa ocorre
por processo difusional, uma vez que as análises relativas às correntes de oxidação e redução
indicam o perfil de uma reta, tendo seus pontos dentro da faixa especificada. Ainda, os
voltamogramas indicaram características capacitivas, sendo que o aumento da velocidade
contribuiu com o processo de difusão das espécies ao eletrodo.
100
Diferentes velocidades de varredura - eletrodo de ouro
a)
70
250mVs
-1
60
50
40
30
i/
20
10
25mVs
-1
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E/V vs ECS
70
b)
60
50
40
30
20
i/A
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
0,15
0,20
0,25
0,30
1/2
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
-1 1/2
v /(V s )
Figura 57: a) Voltamogramas relativos a diferentes velocidades de varredura (25, 50, ´75, 100, 150, 175, 200,
225 e 250); b) Corrente de pico referente à oxidação e redução em função da raiz quadrada. VC com a resposta
eletroquímica do filme após 100 ciclos em solução de H 2SO4 0,5 mol L1 e v = 25 mV s1, no potencial de 200
mV a 1000 mV e eletrodo de trabalho Au/SAM/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4].
101
Diferentes velocidades de varredura - Eletrodo de ITO
70
a)
250 mV s
60
-1
50
40
30
20
i/
10
0
-10
25 mV s
-20
-1
-30
-40
-50
-60
-70
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E/V vs ECS
b)
70
60
50
40
30
20
i/
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
0,15
0,20
0,25
0,30
1/2
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
-1 1/2
v /(V s )
Figura 58: a) Voltamogramas relativos a diferentes velocidades de varredura (25, 50, ´75, 100, 150, 175, 200,
225 e 250); b) Corrente de pico referente à oxidação e redução em função da raiz quadrada; VC com a resposta
eletroquímica do filme após 100 ciclos em solução de H2SO4 0,5 mol L1 e v = 25 mV s1, no potencial de 200
mV a 1000 mV e eletrodo de trabalho ITO/ nanoestruturas [(L-Arg…L-Phe)4]/Nafion.
102
4.2.1.2.
Crescimento das nanoestruturas para o peptídeo cíclico [(L-ArgD-Phe)4]
Baseados nos estudos de automontagem, após a otimização do sistema de crescimento
para as nanoestruturas lineares, partimos dos parâmetros ideais para promover a
automontagem do composto cíclico [(L-ArgD-Phe)4] via fase sólida-vapor. Assim, a
solução precursora na concentração de 150 mg mL-1 foi depositada sob a superfície do
substrato promovendo um filme amorfo, similar ao precursor linear, sendo posteriormente
submetido à vapor de anilina por 18 horas.
Deste modo, os resultados de microscopia relevaram a morfologia do material
sugerindo a formação de fibras, bem como a dimensão na escala de mícrons. Além disso,
observa-se baixa homogeneidade, diferentes orientações, relativa dispersão, variações de
tamanho e formação de aglomerados referente ao peptídeo, vide Figura 60. Entretanto, devido
ao baixo rendimento alcançado referente às nanoestruturas cíclicas redirecionamos os estudos
para o composto linear.
A geometria para o material pode ser sugerida mediante o mecanismo de automontagem
baseado na interação intermolecular entre os peptídeos, uma vez que os planos D e L se
reúnem por empilhamento com posterior crescimento tubular, de modo a obter estruturas
relativamente maiores quando comparada ao composto linear.163-165 Neste contexto, a
conformação anti-paralela provenientes dos enântiomeros são mantidas por meio de ligações
de hidrogênio, de modo a promover o crescimento tubular estabilizado, conforme mecanismo
proposto na Figura 59. Entretanto, ainda sugere-se o diâmetro das nanoestruturas controlado
pelo tamanho da cadeia peptídica.166
Figura 59: Mecanismo de automontagem proposto para peptídeos cíclicos
165
103
X 7,500 1μm
Figura 60: Imagens microscopia (MEV) de nanoestruturas de peptídeos cíclicos por síntese em fase-sólida
vapor em concentração de 150 mg mL-1 e tempo de exposição ao vapor de anilina por 18 horas.
104
4.3.
Parte 3 - Estudo da obtenção de nanoestruturas via eletrofiaçãov
4.3.1. Estudo da matriz
O desenvolvimento por nanomateriais funcionais de aplicação biológica apresenta um
papel fundamental no estudo de sistemas biomédicos avançados, voltados a liberação
controlada de drogas e dispositivos de diagnósticos.167-180 Assim, os nanomateriais
poliméricos destacam-se devido as propriedades de flexibilidade e relativo controle físicoquímico, sendo amplamente empregados como suportes e matrizes voltados ao crescimento
celular.181,
182
Entretanto, algumas estruturas poliméricas moleculares, sintéticas e naturais
podem apresentar propriedades fascinantes como a biodegradabilidade e afinidade por
sistemas orgânicos.183
Dessa forma, o polímero poli(ɛ-caprolactona) (PCL) vem sendo amplamente empregado
nas últimas décadas no desenvolvimento de biomateriais pela técnica de eletrofiação, uma vez
que promovem estruturas fibrilares homogêneas em escala nanométrica.184 No entanto, com
relação as suas propriedades, o PCL apresenta importantes características químicas
(solubilidade em solventes orgânicos e lenta taxa de degradação) e biológicas (afinidade
celular, reabsorvível e biocompatível), bem como boa resistência mecânica. Sendo estas as
principais características que levaram a escolha por este material, uma vez que apresenta um
grande potencial de aplicação para a engenharia de tecidos.185-189A partir de tais estudos
pomovemos a combinação de propriedades relativas ao polímero com as nanoestruturas de
L-difenilalanina, de modo a obter um nanocompósito de propriedades diferenciadas com um
maior potencial de aplicação, uma vez que nanoestruturas peptídicas são materiais funcionais
e vem demostrando seletividade biológica.190, 191
Assim, as amostras foram preparados por meio da dispersão das nanoesturutras
peptídicas nas matrizes poliméricas em concentrações relacionadas as variações observadas,
ou seja, relativas ao índice de mudanças nas propriedades, bem como ao limite de percolação
(concentração crítica). Neste caso, preparamos soluções de NT-FF e polímero, conforme
descrito no item 3.4.1., nas concentrações de 2,5%, 5,0%, 7,5%, 10% e 15%, sendo
posteriormente eletrofiadas. Entretanto, alguns autores mencionam o controle do diâmetro
médio da fibra à variação da tensão relacionada à viscosidade da solução precursora.192, 193
v
Os estudos referentes aos nanocompósitos foram realizados em colaboração com a aluna de pós-graduação
Ligia M. M. Costa e professora Dr. Mariselma Ferreira - UFABC
105
A análise morfológica das mantas eletrofiadas (Figura 61) mostraram um sistema
nanofibrilar livre de defeitos (gotas), homogêneo e de boa dispersão, sendo estes fatores
associados a escolha do sistema de solventes, relacionados à constante dielétrica, uma vez que
variações relativas promovem melhor condutividade para a formação das fibras.194 Ainda, o
aumento relativo à concentração das nanoestruturas na matriz tende a promover um maior
recobrimento das fibras na superfície do substrato.
Entretanto, os histogramas de distribuição de tamanho, Figura 62, revelaram a
diminuição do diâmetro das fibras relativa ao aumento da concentração de NT-FF, que
implica em uma maior quantidade de nanoestruturas dispersas na matriz. Desta forma, sugerese um possível aumento das ligações intermoleculares formadas, de modo a contribuir com
uma maior interação, bem como uma maior força de compressão entre as moléculas, sendo
esta refletida no diâmetro da fibra.
(a)
(b)
(c)
(d)
106
(f)
(e)
Figura 61: Imagens de microscopia das amostras em diferentes concentrações de NT-FF dispersos na matriz de
PCL (a) matriz pura, (b) 2,5% (c) 5,0% (d) 7,5% (e) 10% (f) 15%
(a)
30
(b)
PCL puro
Média: 420 nm
2,5% nanotubos de L-difenilalanina
Média 364 nm
30
25
25
Frequência
20
Frequência
35
15
10
20
15
10
5
5
0
0
400
410
420
430
440
320
450
340
(c)
25
360
380
400
Diâmetro - nm
Diâmetro - nm
(d)
5% nanotubos L-difenilalanina
Média 310 nm
40
7,5% nanotubos L-difenilalanina
Média: 289 nm
35
20
25
15
Frequência
Frequência
30
10
20
15
10
5
5
0
300
305
310
Diâmetro - nm
315
320
0
260
270
280
290
Diâmetro - nm
300
310
107
(e)
40
35
(f)45
10% nanotubos L-difenilalanina
Média: 264 nm
35
30
30
Frequência
25
Frequência
15% nanotubos de L-difenilalanina
Média: 228 nm
40
20
15
25
20
15
10
10
5
5
0
220
230
240
250
260
270
280
290
300
0
170
310
Diâmetros - nm
180
190
200
210
220
230
240
250
260
270
280
290
Diâmetro - nm
Figura 62: Histogramas referentes às concentrações de NT-FF na matriz de PCL (a) PCL puro, (b) 2,5% (c)
5,0% (d) 7,5% (e) 10% e (f) 15%
A análise quantitativa, referente aos histogramas, foi realizada para uma população de
100 fibras/concentração de nanoestruturas, sendo observadas variações de diâmetros para
todos os casos, conforme cálculos de desvio padrão, que apontam um sistema de alta
dispersão de tamanho. Entretanto, observou-se que as amostras com concentração de 5% e
7,5% de NT-FF promoveram menores variações de tamanho quando comparada às demais
concentrações, conforme dados da Tabela 8.
Tabela 8: Resultados de análise quantitativa referente aos diâmetros dos histogramas
Análise
quantitativa
Desvio padrão
PCL
puro
13,16
2,5%
5%
7,5%
nanotubos nanotubos nanotubos
14,20
5,09
9,88
10%
nanotubos
16,11
15%
nanotubos
18,25
Média
420,40
364,62
310,08
289,72
264,77
228,15
Valor mínimo
433,57
378,82
315,17
299,59
280,88
246,40
Valor máximo
407,24
350,42
304,98
279,84
248,65
209,89
Além disso, o estudo relativo das estruturas químicas dos NT-FF (vide Figura 10) e o
PCL (Figura 63), sugere um caráter hidrofóbico, bem como a presença de sítios para possíveis
ligações de hidrogênio,52, 195 que podem levar a uma interação entre ambos os materiais. Tais
interações são relativamente fracas, porém efetivas e promovem variações nas propriedades
do material.
108
O
O
n
Figura 63: Estrutura química referente
ao PCL
Os resultados de microscopia revelaram a possível interação entre os compostos, uma
vez que sugere o crescimento dos NT-FF no interior da fibra polimérica, sendo observados
relativos aos pontos de agregação referentes ao aumento do diâmetro da fibra. Sendo, tais
sistemas de agregação característica às possíveis interações hidrofóbicas entre os NT-FF, de
modo a formar uma estrutura agregada de maior cavidade e diâmetro, de acordo mostrado na
Figura 64a, porém, estes pontos de agregação podem ser visualizados de forma dispersa pelo
comprimento da fibra com posterior diminuição de diâmetro, que sugere o crescimento da
nanoestrutura sem interação entre os nanotubos.196 Ainda, outro resultado importante que
sugere o crescimento interno das nanoestruturas relativo ao polímero refere-se à formação da
estrutura tipo core-shell, conforme observado na Figura 64b, que mostra a fissura de uma
fenda formada na fibra.
(a)
109
(b)
Figura 64: Imagens de microscopia mostrando formação do core-shell (a) amostra 2,5% e (b) amostra 5,0%
Com o objetivo de confirmar o crescimento interno das nanoestruturas no interior da
fibra aquecemos as membranas, nas concentrações de 7,5% e 15%, à temperatura de 70°C por
15 minutos, de modo a obter o material resultante, uma vez que a literatura menciona a
temperatura de fusão para o PCL e degradação térmica para o NT-FF nas temperaturas de
65°C e 300°C, respectivamente.75, 197, 198 A Figura 65 apresenta o gráfico de TG para o NTFF.
Assim, os resultados de microscopia confirmaram a presença das nanoestruturas como
material resultante após fusão do polímero, bem como indica a nanoestrutura como suporte
para o crescimento da fibra. Entretanto, notamos somente a presença das nanoestruturas na
amostra com concentração de 15%, possivelmente por ser a concentração ideal que previne a
degradação térmica do filme. Ainda, observamos que o diâmetro relativo ao material
resultante corrobora com o diâmetro para o NT-FF na ordem de 320 nanômetros,199 conforme
apresentado na Figura 66.
110
Figura 65: Análise de TGA referente aos NT-FF
320 nm
(a)
(b)
Figura 66: Imagens de microscopia das amostras eletrofiadas após tratamento térmico de 15 minutos a 70° C,
(a)7,5% b) 15%
Ainda, o estudo térmico macroscópico revelou a influência dos nanotubos nas amostras
(PCL puro, 2,5%, 5%, 7,5%, 10% e 15%) quando submetidas à temperatura de 70 °C por 15
minutos. Sendo observada visualmente que a amostra com concentração de 15% de nanotubos
preservou a porosidade relativa ao nanomaterial formado por eletrofiação, de modo a impedir
a degradabilidade do filme. Assim, pode-se inferir que maiores concentrações de nanotubos
promove maior estabilidade térmica ao material frente à temperatura, Figura 67.
111
Figura 67: Amostras das mantas (a)-(f) (0% – 15% de NT-FF) a 70 °C; amostras (g) – (m): mantas sem
temperatura
O estudo do comportamento térmico por meio da técnica de DSC forneceu os valores de
temperaturas de fusão (Tm), as entalpias de fusão (ΔHm) e as temperaturas de cristalização.
Para polímeros semicristalinos calcula-se o grau de cristanilidade (Xm) com o valor de ΔHm
da amostra, desde que seja conhecida a ΔHm para o mesmo polímero, quando 100% cristalino
(ΔHm100%, valor teórico).200 Os resultados de DSC (Figura 68) sugerem a diminuição do
grau de cristalinidade para as mantas eletrofiadas com o aumento da porcentagem de
nanoestruturas peptídicas em relação à matriz. Sendo explicado por meio das interações
intermoleculares entre as moléculas de PCL e NT-FF, pois mesmo que sejam ligações mais
fracas que as ligações primárias, podem inibir o movimento relativo das cadeias, bem como
promover desalinhamento da rede.
Assim, a taxa de resfriamento durante a solidificação é dependente da configuração da
cadeia, logo, o desalinhamento nas cadeias contribuem para a diminuição da cristalinidade.200,
201
À medida que aumenta a concentração de nanotubos na matriz simultaneamente aumenta a
quantidade de interações intermoleculares (ligações de hidrogênio e hidrofóbicas), de modo a
desalinhar os arranjos moleculares e promover regiões mais rígidas, sendo fatores que
influenciam para a diminuição da taxa de cristalinidade. A Tabela 9 cita os dados calculados
referentes à curva de DSC.
Entretanto, observa-se que a adição das nanoestruturas contribuiu para o efeito de
nucleação do polímero, ou seja, para formação de esferulitos, relativo ao leve aumento dos
valores da Tc, não sendo necessário um grande resfriamento para que ocorresse a
112
cristalização, porém, ocorreu uma diminuição quanto à taxa de cristalinidade, que sugere o
aumento da Tc para alguns pontos específicos relativos aos pontos de agregação referente às
nanoesturutras peptídicas. Ainda, observamos variações quanto os valores para as
temperaturas de fusão (Tm) em relação às concentrações de 7,5% e 15%, que sugere o
aumento na quantidade de nanoestruturas, bem como o aumento da intensidade de interações
intermoleculares, sendo necessária maior energia térmica para promover as vibrações das
endo
Fluxo de calor (W/g)
moléculas.
PCL puro
L-difenilalanina pura
2,5% nanotubos
7,5% nanotubos
15% nanotubos
50
60
70
Temperatura (°C)
Figura 68: Curvas de DSC referentes às amostras da Tabela 9 - 100 à 180°C
Tabela 9: Valores de temperaturas de fusão (Tm), de cristalização (Tc), entalpias de fusão
(ΔHm) e grau de cristalinidade (Xm) para os nanocompósitos
Concentração de
NT-FF na matriz
Tm(°C)
ΔHm (J/g)
Tc(°C)
Xm(%)
PCL puro
56,47
71,46
30,36
87,51
2,5%
56,47
71,43
30,24
87,48
7,5%
59,90
66,91
31,73
81,94
15%
57,82
59,74
32,20
73,16
Assim, a taxa de cristalinidade e a formação de ligações secundárias influenciam
significativamente nas propriedades mecânicas, uma vez que envolvem variações quanto ao
113
arranjo molecular relativo ao empacotamento das cadeias. Nesse sentido, as propriedades
mecânicas dos materiais são avaliadas a partir de uma solicitação, relacionada à aplicação de
uma tensão com posterior monitoramento de resposta, sendo expressa como tensão ou como
deformação, respectivamente.202 O módulo de elasticidade ou módulo de Young (E) relaciona
as medidas de tensão e deformação, dentro do limite elástico, sendo a deformação totalmente
reversível e proporcional à tensão, sendo relacionado à rigidez do material.203
Nesse sentido, os valores indicados na Tabela 10 mostram uma diminuição e variação
do módulo de Young para as amostras de 2,5%, 5,0% e 7,5%, porém, apresentam um
aumento relativo no (E) referente às amostras de 10% e 15% de nanotubos de peptídeo na
matriz, sendo relacionados à concentração de material disperso, bem como a orientação das
nanoestruturas. Nesse sentido, baixas concentrações apresentam menores quantidades de
nanoestruturas dispersas na matriz, que agem como domínios, pequenos núcleos, que por sua
vez não apresentam um crescimento contínuo pela fibra, bem como falta de orientação, e,
logo agem como sistemas de reforço estrutural relativa ao aumento da tensão, (Figura 69a).
Ainda, pode-se inferir a falta de crescimento contínuo relativo ao desvio da nanoestrutura pela
fibra (Figura 69b).
Entretanto, altas concentrações promovem regiões de maiores domínios, devido à
agregação dos nanotubos, de modo a favorecer o crescimento contínuo das nanoestruturas
pela fibra, bem como promover maior interação intermolecular entre os nanotubos, e assim,
proporcionar o aumento do módulo elástico (Figura 69c). A aplicação da tensão promove o
desdobramento das cadeias, logo, o material nanoestruturado conecta os planos prevenindo o
deslizamento, e assim, gera o aumento do módulo elástico. O modelo de crescimento contínuo
pode ser explicado conforme imagem de microscopia das amostras de casting (moldagem sem
eletrofiação) (Figura 69d), que foram realizadas para visualizar o possível crescimento das
nanoestruturas, Figura 69d.
114
Tabela 10: Resultado do ensaio tensão versus deformação.
Resistência à
Deformação
tração no
no escoamento
escoamento
(%)
(MPa)
Tensão de
Tração na
Ruptura
(MPa)
Deformação
na Ruptura
(%)
94,35
1,52
104,5
7,49
108,9
7,29
111,6
4,71
10,29
143,3
9,62
149,2
7,5%
2,96
16,92
137,6
13,8
145,1
10%
10,82
3,81
123,2
2,66
133,9
15%
14,05
9,51
394,5
7,76
402,99
Concentração de
NT-FF na
matriz
Módulo de
Young
(MPa)
PCL puro
13,54
2,01
2,5%
4,43
5,0%
a)
b)
c)
d)
Figura 69: Esquema de orientação proposto para o crescimento das nanoestruturas em diferentes concentrações
O modelo referente ao aumento da concentração pode ser mais bem visualizado na
Figura 70, que sugere o aumento proporcional da concentração em função da orientação das
nanoestruturas na matriz, ou seja, o aumento da concentração promove regiões de maiores
domínios formados pela coalescência de nanoestruturas de peptídeos, que crescem orientadas.
Sendo o fator principal para as variações nas propriedades mecânicas.
115
Figura 70: Representação esquemática do aumento da concentração de nanoestruturas relativa à matriz
No entanto, analisando a curva tensão deformação (Figura 71) variações referentes à
resistência mecânica ocorrem sempre que qualquer restrição é imposta. Logo, a orientação das
nanoestruturas na matriz, bem como o número de ligações intermoleculares, relativas à
concentração, podem promover variações quanto às propriedades mecânicas, de modo a
influenciar na taxa de cristalinidade, e, logo na região elástica e plástica do material, uma vez
que podem promover uma maior empacotamento atômico.204 Assim, podemos observar que
para os pontos a, b, c e d apresentou um aumento da resistência mecânica relativa ao aumento
da concentração de nanoestruturas, agindo como agente de reforço estrutural, de modo a
promover características de um material duro, porém frágil, sendo este o perfil característico
para materiais semi-cristalinos. Entretanto, vale ressaltar que prevalece a característica semicristalina proveniente da matriz de PCL, uma vez que a diminuição da cristalinidade foi sutil
para estes pontos de concentração de nanoestruturas.
Contudo, para as concentrações referentes aos pontos e e f percebe-se o caimento da
curva e aumento da região plástica, sendo associado ao aumento da concentração de
nanoestruturas na matriz, uma vez proporcional ao numero de interações intermoleculares,
que impedem os planos de deslizamentos entre as cadeias e promovem um material mais
maleável de comportamento dúctil e característica macia.
116
a)
18
16
7,5% nanotubos
Tensao (MPa)
14
12
10
5% nanotubos
8
2,5% nanotubos
6
15% nanotubos
4
10% nanotubos
2
PCL puro
0
0
100
200
300
400
Deformaçao (%)
Figura 71: Gráfico tensão versus deformação para as diferentes concentrações de NT-FF
Deste modo, realizamos análises espectroscópicas de FTIR e Raman, de modo a
verificar a interação entre os NT-FF e a matriz. Os resultados de FTIR indicaram o perfil para
o PCL, bem como os picos característicos referentes à carbonila em torno de 1727 cm-1. A
banda em 1293 cm-1 atribuiu-se aos estiramentos C-C e C-O fase cristalina, logo, varia com o
grau de cristalinidade. A Tabela 11 indica as principais bandas para o PCL.205 Deste modo,
analisando o perfil do espectro observamos a presença de 3 picos característicos para os NTFF referentes a banda amida I e amida II (1558 - 1685 cm-1), que indica os modos
vibracionais de estiramento C=O (amida I) e o modo de estiramento N-H (amida II),206
Figura 72.
117
Absorbância (u.a.)
PCL + 15% nanotubos
PCL puro
1558
1000
1200
1400
1685
1616
1600
1800
-1
n° de Onda (cm )
Figura 72: Identificação das bandas FTIR para a amostra de 15% de NT-FF em PCL
Tabela 11: Bandas características de FTIR para o PCL205
Número de Onda (cm-1)
Modo Vibracional Esperado
1727
Estiramento carbonila C=O
1293
Estiramento C–O e C–C (fase cristalina)
1237
Estiramento assimétrico C-O-C
1170
Estiramento simétrico C-O-C
Com relação aos resultados de espectroscopia Raman (Figura 73) observamos o perfil
para o PCL, bem como seus picos característicos nas regiões entre 1015– 110 cm-1 e 12831470 cm-1. Entretanto, percebe-se o aparecimento de picos relativos ao aumento da
concentração de NT-FF na matriz, que indica os modos vibracionais característicos conforme
Tabela 12.207,
208
Assim, pode-se inferir que o aumento da concentração promoveu o
surgimento de picos, bem como variações de intensidade.
118
1180
1002
1583
1155 1205
1605
Intensidade (u.a.)
15% NT-FF
0% NT-FF
1000
1200
1400
1600
-1
Deslocamento Raman (cm )
Figura 73: Identificação de bandas por espectroscopia Raman referente às matrizes com NT-FF
Tabela 12: Bandas características de Raman para o NT-FF 207, 208
Número de Onda (cm-1)
Modo Vibracional Esperado
1002
Deformação simétrica do anel aromático no plano
1583/ 1605
Deformação assimétrica do anel aromático no plano
1155/ 1180/ 1205
Estiramento da ligação C-N (banda amida III)
Deste modo, o estudo por espectroscopia não revelou possíveis deslocamento de pico,
que poderia mencionar a interação entre os compostos, porém confirma a dispersão dos NTFF na matriz polimérica de PCL por meio do surgimento de picos característicos. Entretanto,
os resultados relativos ao DSC e ensaios mecânicos mostraram variações nas propriedades
quanto à adição de nanoestruturas na matriz, que indica a interação intermolecular entre os
dois compostos, devido ao caráter estrutural hidrofóbico, bem como sítios para promover
ligação de hidrogênio, conforme já mencionado. A Figura 74 sugere o mecanismo de
interação intermolecular entre a matriz e o NT-FF.
119
Figura 74: Esquema representativo da interação entre as nanoestruturas e a matriz polimérica
Entretanto,
estudos
comparativos
referentes
às
propriedades
mecânicas
do
nanocompósito desenvolvido (PCL/NT-FF) e sistemas da literatura revelaram resultados
promissores às membranas. Neste contexto, sistemas biocompatíveis vêm mostrando valores
sutis ao relacionar com o sistema baseado em nanotubos de peptídeos, que apresentam
resultados superiores mesmo em baixas concentrações, conforme apresentado na Tabela 13.
Tabela 13: Resultados comparativos das propriedades mecânicas com a literatura
Matrizes
Tensão - MPa
PCL/NT-FF (7,5%)
16,50
PCL/CaPHO4 (12%)209
1,10
PCL/HA (15%)210
1,07
Outra relação refere-se ao comportamento térmico, uma vez que membranas na
concentração de 15% NT-FF mantiveram a morfologia fibrilar da amostra frente ao calor, ou
seja, o aumento da concentração das nanoestruturas promoveu mudanças quanto às
propriedades térmicas, de modo a prevenir a degradação do material. No entanto, um estudo
proposto por Saeed e colaboradores211 menciona que a incorporação de nanotubos de carbono
no PCL promove um efeito de estabilização térmica no material, uma vez que eleva
sutilmente a tempertura de degradação, e, que pouco oscila com a variação da concentração.
Logo, pode-se inferir a comparação do sistema de PCL/NT-FF às membranas com nanotubos
de carbono, uma vez que promove variações quanto às propriedades térmicas.
Assim,
a
técnica
de
eletrofiação
vem
sendo
amplamente
investigada
no
desenvolvimento de materiais em escala nanométrica, uma vez que apresentam maior
120
superfície de contato e regiões ativas. Sendo amplamente empregada na obtenção de materiais
híbridos, de modo a aprimorar as propriedades da matriz polimérica.212-215
Logo, o estudo relativo à adição de NT-FF mostrou variações significativas quanto às
propriedades do material em relação à matriz, confirmando a obtenção do nanocompósito.
Sendo estes resultados relevantes que oferecem possíveis aplicações voltadas ao estudo de
sistemas bionanotecnológicos, uma vez que os NT-FF apresentam biocompatibilidade e
possibilidade de modificação química69,
79, 216, 217
que unidos as propriedades do polímero
podem potencializar materiais como curativos, bandagens, medicamentos e entre outros.218-221
121
Capítulo 5 – Considerações finais
A obtenção dos análogos peptídicos de sequência cíclica e linear foram satisfatórias,
uma vez que promoveram o estudo de automontagem para os compostos. Os materiais foram
obtidos mediante a técnica em fase sólida-vapor na superfície de ITO em solvente de anilina,
diclorometano e água e tempo de exposição ao vapor de 18 horas. Assim, os resultados de
microscopia (MEV) revelaram a obtenção de estruturas para o composto linear na
concentração de 150 mg mL-1 para os três sistemas de solvente (anilina, diclorometano e
água), bem como uma superfície homogênea de morfologia tipo fitas em nanométrica,
confirmada por dinâmica molecular e espectroscopia vibracional, na ordem de 62,27 nm para
vapor de anilina, 71,03 nm para vapor de diclorometano e 139,50 nm para vapor de água.
A partir dos resultados obtidos para o peptídeo linear, foi proposto o estudo para o
composto cíclico na concentração de 150 mg mL-1, porém, somente para vapor de anilina,
sendo observado por microscopia materiais em escala mícron de baixa homogeneidade. Sendo
estes os motivos para o qual não prosseguimos com os estudos voltados ao composto.
Ainda, os resultados obtidos por voltametria cíclica das nanoestruturas baseadas no
composto linear em superfície de ouro e ITO demonstraram a possibilidade de
funcionalização da polianilina sintetizada a partir do vapor de anilina, de modo a obter um
material híbrido, com propriedades condutoras e com potencial aplicação para sistemas de
detecção.
E por fim, os resultados de eletrofiação revelaram a obtenção do nanocompósito de
PCL/NT-FF por meio de variações nas propriedades térmicas e mecânicas, que foram
estudadas por DMA e DSC, bem como a formação de uma estrutura tipo core shell
apresentada por microscopia (MEV). Ainda, estudos vibracionais mediante as técnicas de
FTIR e Raman mostraram a boa dispersão dos NT-FF na matriz polimérica de PCL.
122
Capítulo 6 - Referências Bibliográficas
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134
SUMULA CURRICULAR
FORMAÇÃO ACADÊMICA
09/2008–02/2012
Mestrado na área de nanociência e materiais avançados baseados em
síntese e caracterização de peptídeos nanoestruturados para aplicações
analíticas voltadas para engenharia de tecidos, pela Universidade
Federal do ABC (UFABC), sob orientação do Prof. Dr. Wendel
Andrade Alves, desenvolvendo o projeto de pesquisa: ―Síntese e
Caracterização de Nanoestruturas Peptíticas: Estudos Espectroscópicos
e Aplicações‖, projeto no qual tive a oportunidade de ser bolsista
FAPESP.
02/2005–12/2008
Graduação em Química - (Bacharelado) pela Faculdade Campo Limpo
Paulista, FACCAMP, Campo Limpo Paulista - SP. (Concluído)
02/2000–12/2001
Técnica em Química, pela Universidade Padre Anchieta – Jundiaí.
(Concluído)
EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL
NATURA COSMÉTICOS S/A - Analista de Pesquisa e Desenvolvimento (P&D)
DOW AGROSCIENCES INDUSTRIAL LTDA - Analista de Laboratório (Controle de
Qualidade)
CONVENÇÃO INDÚSTRIA DE BEBIDAS LTDA - Analista de Laboratório (Controle de
Qualidade)
INCEPA LOUÇAS SANITÁRIAS S/A - Estagiária (Controle de Qualidade)
CURSOS DE ATUALIZAÇÃO
08/2002 - Implantação do SGQ ISO 9000/2000 – Qualidade - (Global Multicursos – 36 horas)
10/ 2008 - Fundamentos e Operação de HPLC - (Shimadzu – 16 horas)
10/ 2008 - Fundamentos e Operação de Cromatografia Gasosa - (Shimadzu – 8 horas)
10/ 2008 - Fundamentos e Operação em Espectroscopia UV-Vis - (Shimadzu – 8 horas)
05/ 2010 - Planejamento de candidatos a novos fármacos (SBQ – 6 horas)
05/ 2010 – Química Analítica de processos (SBQ – 8 horas)
06/ 2010 – Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV (Síncontron – 8 horas)
04/2011- Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos (Racine – 64 horas)
135
PRINCIPAIS PUBLICAÇÕES CIENTIFÍCAS - LIVROS
Alves, W. A., Alves, W., Sousa, C.P., Kogikoski Jr., S., AMARAL, H. R., Liberato, M.S.,
Oliveira Junior, V.X., Martins, T.D., Takahashi, P. M.Biosensors Based on Biological
Nanostructures In: Biosensors for Health, Environment and Biosecurity ed.Vienna : InTech
Open Access Publisher, 2011, v.book 4
PRINCIPAIS PUBLICAÇÕES CIENTÍFICAS – ANAIS DE CONGRESSO E
WORKSHOP
1.
Liberato, M. S.; Toledo, A. C. T.; Fischer, L. M. L.; Oliveira, A. P. Qualidade de nossas
águas: Estudo preliminar sobre os níveis de contaminação dos córregos da bacia do Rio
Jundiaí. In: V Workshop Multidisciplinar sobre Ensino e Aprendizagem, Campo Limpo
Paulista. Diversidade em Questão, 2008. Apresentação Oral.
2.
Liberato, M. S.; Toledo, A. C. T.; Fischer, L. M. L.; Oliveira, A. P. Qualidade de nossas
águas: Estudo preliminar sobre os níveis de contaminação dos córregos da bacia do Rio
Jundiaí. In: 32ª RASBQ (Sociedade Brasileira de Química), Fortaleza. Química Ambiental.
2009. – Apresentação: Pôster.
3.
Michelle S. Liberato; Pedro M. Takahashi; Vani X. Oliveira Jr; Wendel A. Alves:
Influência da Variação do Solvente na Preparação de Novas Nanoestruturas Peptídicas. In:
33ª RASBQ (Sociedade Brasileira de Química). Águas de Lindóia. Química dos Materiais.
2010. – Apresentação: Pôster.
4.
Michelle S. Liberato; Vani X. Oliveira Jr; Wendel A. Alves: Influence of hexafluoro-2-
propanol or acetic acid solvents in the formation of peptide nanostructures. SBP – MAT. Ouro
Preto. Química dos Materiais. 2010. – Apresentação: Pôster.
5.
Michelle S. Liberato; G.E. de Paula; Vani X. Oliveira Jr; Wendel A. Alves: Estudo da
Influência dos Solventes na Nanoestruturação de Compostos Peptídicos. In: I Simpósio em
Nanociências e Materiais Avançados, 2010, Santo André.
6.
Michelle S. Liberato; Vani X. Oliveira Jr; Wendel A. Alves: Estudo Morfológico e
Estrutural do Peptídeo Linear (L-Arg···L-Phe)4. In: 34ª RASBQ (Sociedade Brasileira de
Química). Florianópolis. Química dos Materiais. 2011. – Apresentação: Pôster.

Universidade Federal do ABC

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